WO2000029373A2 - Derivatisierung von trägeroberflächen - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a method for derivatizing carrier surfaces and carrier surfaces derivatized thereby.
  • biopolymers e.g. nucleic acids
  • glass substrates coated with poly-L-lysine and nylon membranes are used.
  • the biopolymers are bound to the carrier by charge.
  • a disadvantage of using poly-L-lysine-coated glass supports is that there is no covalent connection between the coated surface and the biopolymer.
  • the carrier can only be used once. Furthermore, there are virtually no possibilities for optimizing the distance between the biopolymer and the carrier.
  • nylon membranes A disadvantage of using nylon membranes is that most of the biopolymers are only bound by charge.
  • the carrier can be used several times, but it is also not possible to optimize the distance between the biopolymer and the carrier.
  • linker systems which result from the biopolymer synthesis on porous CPG materials, are used here.
  • the linker molecules used are mostly polyethylene glycol, in particular tetra- or hexaethylene glycol.
  • the linker molecules are usually costly Reagents applied analogously to the phosphoramidite chemistry. Unfortunately, mass production cannot take place and it is not possible to apply loads.
  • the object of the present invention is now to provide a method which allows an optimal connection of a large number of biopolymers to carrier surfaces.
  • the object further consists in providing a carrier surface whose binding capacity has been increased many times over by carrying out a surface modification.
  • this object is achieved by a method in which a functional group on a carrier surface is activated by an activation reagent and subsequently reacted with an amine component.
  • R ⁇ and R 2 may be the same or different.
  • the meanings of R ⁇ and R 2 are not restricted and can be H or any organic radical (for example a straight or branched alkyl radical with 1-30 carbon atoms, a straight or branched alkenyl radical with 2 to 30 carbon atoms, a mono- or polycyclic alkyl radical with 3 to 30 carbon atoms or a mono- or polycyclic alkenyl radical with 4 to 30 carbon atoms or a mono- or polycyclic radical with 6 to 30 carbon atoms, the radicals optionally being substituted by one or more substituents (for example OH, carboxyl, carbonyl, phosphate) can be substituted).
  • the base can be any basic compound, for example diisopropylethylamine.
  • Any straight or branched C 1 . 30 alkyl radical can be used. Examples include methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl and tert. Butyl, n-butyl, n-hexyl, 2-methylpentyl, 2, 3-dimethylbutyl, n-heptyl, 2-methylhexyl, 2, 2-dimethylpentyl, 3, 3-dimethylpentyl, 3-ethylpentyl, n-octyl, 2, 2-dimethylhexyl, 3, 3-dimethylhexyl, 3-methyl-3-ethylpentyl groups. Short alkyl chains such as methyl, ethyl, propyl and isopropyl are preferred.
  • Examples include vinyl, propenyl, isopropenyl, allyl, 2-methylallyl, butenyl or isobutenyl, hexenyl or isohexenyl, heptenyl or isoheptenyl, octenyl or isooctenyl groups.
  • Vinyl, propenyl and isopropenyl are preferred.
  • the cycloalkyl radical having 3 to 30 carbon atoms can be any cycloalkyl radical. Examples include a cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl or cyclohexyl, cycloheptyl, cycloctyl, cyclononyl or cyclodecyl group. Cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl and cyclohexyl are preferred.
  • the cycloalkenyl radical having 4 to 30 carbon atoms can be any cycloalkenyl radical.
  • Examples include a cyclobutenyl, Cyc 1 open t eny1 or Cyc 1 ohexeny1, cycloheptenyl, cyclooctenyl, cyclononenyl or cyclodecenyl groups. Cyclobutenyl, cyclopentenyl or cyclohexenyl are preferred.
  • polycyclic alkyl "or alkenyl radicals examples include, norbornane, adamantane or benzvalene.
  • R : and R 2 can also be any mono- or polycyclic C6-30 aryl radicals.
  • Examples include a carbocyclic, monocyclic radical, for example the phenyl group, a heterocyclic, monocyclic radical, for example the groups thienyl, furyl, pyranyl, pyrrolyl, imidazolyl, pyrazolyl, pyridyl, pyrazinyl, pyrimidinyl, pyrazinyl, thiazolyl, oxazolyl, furazannyl, Pyrrolinyl, imidazolinyl, pyrazolinyl, thiazolinyl, triazolyl, tetrazolyl, and the positional isomers of the hetero atom or atoms, which these groups can include.
  • the method according to the invention produces more or less crosslinked linker systems on the support surface, which allow a possibly large number of biopolymers to be attached to the support surface.
  • Preferred biopolymers are DNA, RNA, nucleic acid analogs, peptides, proteins, antibodies, etc.
  • a chemical grouping such as e.g. an amino group, hydroxyl group, carboxyl group, carbonyl group, thiol, amide or phosphate group.
  • any carrier or matrix customary in this field can be used.
  • These are, in particular, glass, films or membranes made of polypropylene, nylon, cellulose, cellulose derivatives (eg cellulose acetate, cellulose mixed ester), polyether sulfones, polyamides, polyvinyl chloride, polyvinylidene fluoride, polyester, Teflon or polyethylene.
  • an activation reagent is to be understood as a reagent which puts functional groups on the support surface in a state ready for coupling.
  • an amine component is to be understood as meaning monoamines, bisamines or polyamines.
  • Preferred monoamines are 2-aminoethanol, 6-amino-l-hexanol, 2- (4-aminophenyl) -ethanol, 5-amino-n-valeric acid, 2- (2-aminoethoxy) ethanol, 3-amino-1,2 propanediol;
  • positive charges can preferably be implemented in the linker system since these are protonated in the physiological range.
  • the choice of the appropriate amine can be used to control the degree of charge on the surface. Positive charges in turn cause easier approximation of negatively charged biopolymers (eg nucleic acids) and thereby facilitate hybridizations on the support surfaces treated according to the invention.
  • biopolymers eg nucleic acids
  • the chain length ie the L Lengths of the linker system
  • the number of times the synthesis principles given below are repeated.
  • the choice of amine can be used to control the individual character of the linker system, ie whether it is more hydrophobic or hydrophilic.
  • amine By choosing the amine, other functional groups (eg hydroxyl, phosphate, carboxyl, carbonyl) can of course also be presented on the surface in addition to amine groupings.
  • a linker carrying OH groups it is advantageous to carry out the reaction with an amino alcohol.
  • a bifunctional amine the chain is linearly extended. Branches are built into the linker system using polyfunctional amine reagents. This creates so-called dendrimer structures (see FIGS. 1 and 2).
  • a dendrimer structure is to be understood to mean that structures which branch out more than once originate from a defined starting point.
  • a flexible linker system is created by the method according to the invention. Flexible to the extent that ideally prepared carrier surfaces are made available for any application (eg binding of DNA, RNA, proteins, antibodies).
  • the method according to the invention is suitable for providing surfaces (carriers) suitable for DNA / bio-chip technology.
  • the degree of positive charge on the surface can be controlled by the number of protonatable amine functions, especially by the incorporation of polyamines.
  • the goal of increasing the loading density is preferably achieved by installing branching parts (eg polyamines); the positive surface charge can be increased, for example, by incorporating protonatable amino functions; the variation of the distance between the biomolecule and the surface can be controlled by using amines of different chain lengths.
  • branching parts eg polyamines
  • the positive surface charge can be increased, for example, by incorporating protonatable amino functions
  • the variation of the distance between the biomolecule and the surface can be controlled by using amines of different chain lengths.
  • the method for surface modification according to the invention is characterized by the following steps.
  • HMPT HMPT
  • Dichloroethane acetonitrile
  • the reaction is carried out by adding about 0.5 to 5 mmol, preferably 1-3 mmol, very preferably 1 mmol, diisopropylethylamine (or another non-nucleophilic base, such as triethylamine, pyridine, Collidin, Lutidin or Triisopropylamin) started. After 1 to 4 hours, preferably 2 hours, of swirling on a shaker, the carriers are thoroughly washed with an anhydrous solvent (for example dichloroethane, carbon tetrachloride, etc.) washed and allowed to dry, preferably blown dry with nitrogen. A quality control is carried out to check the reaction.
  • anhydrous solvent for example dichloroethane, carbon tetrachloride, etc.
  • the aminated PP control mentioned above is subjected to the bromophenol blue test described below. If there is no blue color in comparison to an unreacted sample, the activation was successful. If there is a blue color, the reaction is repeated.
  • the now activated carrier materials are in about 5-100 ml (depending on the size), preferably 10-50 ml, very preferably 20 ml of an amine and water-free solvent (for example DMF, acetonitrile, THF, DMSO, HMPT (HMPA) or dichloro about 0.5-5 mmol, preferably 1-3 mmol, preferably 1 mmol, of the amine component are added and the mixture is pivoted for about 5 to 20 hours, preferably overnight.
  • an amine and water-free solvent for example DMF, acetonitrile, THF, DMSO, HMPT (HMPA) or dichloro about 0.5-5 mmol, preferably 1-3 mmol, preferably 1 mmol, of the amine component are added and
  • the now derivatized carrier is allowed to dry or is preferably blown dry with nitrogen.
  • a reaction time extended to 1.5 to 2.5 days, preferably 2 days, is recommended.
  • a quality control is carried out, for example the PP control piece mentioned above is subjected to the bromophenol blue test described below. If the blue color can be seen in comparison to an activated sample of the last step, the implementation was successful. If there is no or very weak blue coloring, the reaction is repeated.
  • the carriers which have now been derivatized can already be used in this way or subjected to the cycle described one or more times.
  • a method based on the blue coloration of amino functions by bromophenol blue is suitable, for example, for checking the quality of the carrier derivatization, ie the detection takes place via the disappearance or presence of the blue color when activated or reacted with amines.
  • a piece of aminated polypropylene film (PP control piece) is attached to each reaction vessel in addition to the carrier materials to be derivatized representative of all carrier materials in the reaction vessel, the success of the respective reaction step is checked.
  • a piece of the control strip is removed after each reaction and swirled for 2 minutes in a 1% bromophenol blue solution in amine-free DMF and then washed with ethanol.
  • Amino functions and other basic groups result in an intense adsorptive blue color.
  • the blue coloration disappears.
  • a quantification of the surface loading is possible using UV spectroscopy.
  • the adsorptive blue staining is detached from the carrier, for example with a 10% piperidine solution in DMF, and measured by UV spectroscopy.
  • the linkers on the carrier surface have linear structures or dendrimer structures.
  • the structures have the following structure:
  • NHR X Y, Z can be the same or different and can be selected from
  • NHR X Y, Z can be the same or different and can be selected from
  • the derivatized support surfaces with terminal amino or hydroxyl functions do not require any further modification to connect the first oligonucleotide building block using the phosphoramidite or phosphorotriester method. After the reaction of the 1st nucleotide reagent with the aminated surface, bonds of the phosphoramidate type are generated. Hydroxylated surfaces lead to phosphodiester type bonds. Phosphoramidite methods
  • R x - R 3 analogous to R ⁇ and R 2 above
  • an activation of the carrier surface is preferable to an activation of the biomolecule, since even undesired cross-reactions between the activated biomolecules cannot be ruled out during the activation of the biomolecule - due to the mostly poly-functional character of the biomolecule.
  • This activation of the surface is preferably carried out using a crosslinker.
  • the biopolymer is applied directly to the dendrimeric surface and is permanently fixed.
  • the properties for the permanent immobilization of biopolymers by electrostatic interaction is increased according to the invention by the fact that the dendrimeric surface is previously alkylated, e.g. is methylated.
  • Suitable promotional agents are, for example, reagents of the carbodiimide type, such as diisopropylcarbodiimide, EDC or DCC (dicyclohexylcarbodiimide).
  • the terminal groups on the support and on the biomolecule should preferably be orthogonal to one another, ie they should be able to form a chemical bond in a meaningful way. The following combinations of the end groups to be reacted preferably result:
  • a covalent surface activation is to be understood as one in which crosslinkers are, as an end group, grafted onto the linker system (flexible linker system) previously constructed according to the invention. These are primarily activated ester, aldehyde, imidoester or isothiocyanate functions, which are able to form a covalent bond with biopolymers dissolved in aqueous systems without further chemical intervention.
  • the reagents of choice here are especially di succinimidyl carbonate, succinimidyl oxala, glutaraldehyde, dimethyl suberimidate dihydrochloride or phenylene diisothiocyanate.
  • the reaction is preferably carried out under basic conditions, ie with the addition of diisopropylethylamine or NaC0 3 .
  • Bio-OH / Bio-NH 2 hydroxy / amino biomolecule
  • Example 1 Derivatization of a glass support
  • aminated glass supports 40 x 48 mm
  • aminated glass supports 40 x 48 mm
  • the starting point is aminated glass supports (40 x 48 mm), which are either commercially available; or can be prepared by the usual methods of silanization.
  • the aminated glass slides are placed in 20 ml of anhydrous dichloroethane with 200 mg of 4-nitrophenyl chloroformate (1 mmol) and 171 ⁇ l diisopropylethylamine (1 mmol) and swirled on the shaker for 2 hours.
  • the BPB control test shows no blue color.
  • the glass slides are reacted overnight in 20 ml amine-free DMF with 223 ⁇ l tetraethylene pentamine (1 mmol).
  • the BPB control test shows a blue color.
  • the glass slides are placed in 20 ml of anhydrous dichloroethane with 200 mg of 4-nitro-phenyl-chloroformate (1 mmol) and 171 ⁇ l of diisopropylethylamine (1 mmol) and swirled on the shaker for 2 hours.
  • the BPB control test shows no blue color.
  • the glass slides are reacted overnight in 20 ml of amine-free DMF with 140 ⁇ l of 1,4-bis (3-aminopropyloxy) butane (1 mmol).
  • the BPB test shows a blue color.
  • the glass supports derivatized in this way now have linkers on their surface to which biopolymers (e.g. nucleic acids) can be coupled.
  • biopolymers e.g. nucleic acids
  • Example 2 Derivatization of a glass support
  • the starting point is an aminated glass support (40 x 48 mm), which is either commercially available or can be prepared using the usual methods of silanization.
  • the aminated glass slides are dissolved in 20 ml anhydrous dichloroethane with 81 ⁇ l acryloyl chloride (1 mmol) and 171 ⁇ l of diisopropylethylamine (1 mmol) were placed and swirled on the shaker for 2 hours.
  • the BPB control test shows no blue color.
  • the glass slides are reacted over 2 nights in 20 ml of amine-free DMF with 223 ⁇ l tetraethylene pentamine (1 mmol).
  • the BPB control test shows a blue color.
  • the glass slides are placed in 20 ml of anhydrous dichloroethane with 81 ⁇ l acryloyl chloride (1 mmol) and 171 ⁇ l diisopropylethylamine (1 mmol) and swirled on the shaker for 2 hours.
  • the BPB control test shows no blue color.
  • the glass slides are reacted over 2 nights in 20 ml of amine-free DMF with 140 ⁇ l of 1,4-bis (3-aminopropoxy) butane (1 mmol).
  • the BPB test shows a blue color.
  • the glass supports derivatized in this way now have linkers on their surface to which biopolymers (e.g. nucleic acids) can be coupled.
  • biopolymers e.g. nucleic acids
  • the starting point is a commercially available hydrophilized polypropylene membrane (8 x 12 cm).
  • the membrane is reacted on the vibrator with 324 ⁇ l acryloyl chloride (4 mmol) and 684 ⁇ l diisopropylethylamine (4 mmol) in 30 ml anhydrous dichloroethane. After 2 hours, the reaction solution is decanted off and washed several times carefully with dichloroethane and dried. The bromophenol blue test (BPB test) shows no blue color.
  • the activated membrane is then swirled on the vibrator for 2 days with 892 ⁇ l tetraethylene pentamine (4 mmol) in 30 ml amine-free DMF.
  • the activated membrane is then swung on the vibrator with 560 ⁇ l of 1,6-bis (3-aminopropyloxy) butane (4 mmol) in 30 mol of amine-free DMF for 2 days. Then the reaction solution is decanted off and the membrane is carefully washed several times with DMF and then with dichloroethane and dried.
  • the bromophenol blue test shows blue color.
  • a polypropylene membrane (8 x 12 cm) derivatized according to Example 3 is placed on a Whatman filter paper for 5 minutes with a solution of 54 mg of N- (3-dimethylaminopropyl) -N'-ethyl-carbodiimide hydrochloride and 24 ml of N- Incubated methylimidazole in 10 ml of water.
  • the reaction solution is decanted off.
  • the polypropylene membrane activated in this way which is still moist, can now be used for the covalent application of biopolymers (nucleic acids).
  • biopolymers e.g. by spotting robots or nano-plotters
  • the samples are fixed on the membrane by incubating at 65 ° C for 2 hours; the membrane is then washed carefully with water.
  • a polypropylene membrane (8x12 cm) derivatized analogously to Example 3 is moistened with water on a filter paper.
  • the wet membrane can now be used to apply biopolymers.
  • After applying the Biopolymers eg using a spotting robot, are fixed on the membrane by incubation at 65 ° C for 2 hours. The membrane is then washed thoroughly with water.
  • biopolymers can also be applied directly to a dry membrane.
  • a polypropylene membrane (8 ⁇ 12 cm) derivatized analogously to Example 3 is impregnated on a filter paper with 10 ml denaturing buffer (0.5 M NaOH, 1.5 M NaCl). After 10 minutes of incubation, the supernatant is decanted off on denaturing buffer. The still wet membrane can now be used to immobilize biopolymers. After applying the biopolymers (e.g. using a spotting robot), the membranes are dried overnight at room temperature. The membrane is then washed thoroughly with water.
  • denaturing buffer 0.5 M NaOH, 1.5 M NaCl
  • the PP membrane is again mixed with 200 ⁇ l of 2- (2-aminoethoxy) ethanol (2 mmol) in 30 ml of amine-free DMF and on a shaker overnight pivoted.
  • the reaction solution is decanted off, and the PP membrane is washed twice with 5 ml each time with 50 ml of DMF and then twice with 50 ml of acetone and dried.
  • An amino-functional polypropylene membrane (omnitray size) according to Example 3 is dissolved in 30 ml dry dichloroethane with 400 mg succinic anhydride (4 mmol), 1 ml pyridine (24 mmol) and 488 mg DMAP (4th mmol) reacted overnight on the shaker. Subsequently, the reaction solution is decanted off and the PP membrane successively with 30 ml dichloromethane, 30 ml acetone, 30 ml 1% HCl, 2 x 30 ml water and 2 x with 30 ml acetone each for 5 min. washed and dried.
  • 7 amino-functionalized glass slides are swirled in 30 ml of anhydrous acetonitrile with 256 mg of disuccinimidyl carbonate (2 mmol) and 513 ⁇ l of diisopropylethylamine (3 mmol) for 4 hours on the shaker. It is washed with 50 ml of acetonitrile, then with 50 ml of dichloroethane and dried in a stream of nitrogen.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Derivatisieren von Trägern, wobei eine funktionelle Gruppe auf einer Trägeroberfläche durch Umsetzung mit einem Aktivierungsreagenz aktiviert wird und nachfolgend mit einer Amin-Komponente umgesetzt wird. Weiter betrifft die Erfindung einen Träger mit Dendrimerstruktur an seiner Oberfläche sowie die Verwendung eines erfindungsgemäß hergestellten Trägers zur Anbindung von Biopolymeren.

Description

Derivatisierung von Trägeroberflächen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Derivatisierung von Trägeroberflächen sowie dadurch derivatisierte Trägeroberflächen.
Die Anbindung von Biopolymeren, insbesondere Nukleinsäuren, an feste Trägeroberflächen wird bis heute im allgemeinen durch folgende Alternativen erreicht:
1) Aufbringen von Biopolymeren (z.B. Nukleinsäuren) auf Oberflächen: Hier finden vor allem poly-L-Lysin gecoatete Glasträger und Nylon-Membranen Verwendung. Dabei werden die Biopolymere durch Ladung an den Träger gebunden. Nachteilig bei der Verwendung poly-L-Lysin gecoateter Glasträger ist, daß keine kovalente Anknüpfung zwischen der beschichteten Oberfläche und dem Biopolymer stattfindet. Der Träger kann nur einmalig verwendet werden. Weiter gibt es so gut wie keine Möglichkeiten zur Optimierung des Abstandes zwischen Biopolymer und Träger. Nachteilig bei der Verwendung von Nylonmembranen ist, daß die Biopolymere größtenteils auch nur durch Ladung gebunden werden. Der Träger kann zwar mehrmalig verwendet werden, aber es ist auch keine Optimierung des Abstandes zwischen Biopolymer und Träger möglich.
2) In-situ Aufbau von Biopolymere (z.B. Nukleinsäuren) auf Oberflächen: Hier finden gebräuchliche Linkersysteme, die von der Biopolymersynthese an porösen CPG-Materialien herrühren, Verwendung. Bei den verwendeten Linker- Molekülen handelt es sich meist um Polyethylenglykol, insbesondere Tetra- oder Hexaethylenglykol . Die Linkermoleküle werden üblicherweise durch kostenintensive Reagenzien analog der Phosphoramidit-Chemie aufgebracht. Es kann leider keine Massenherstellung stattfinden und das Aufbringen von Ladungen ist nicht möglich.
Weiter haben diese Verfahren alle den Nachteil, daß es ihnen an Flexibilität mangelt, und die Biopolymere können auf der Oberfläche nur in einer sehr begrenzten Anzahl aufgebracht werden.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht nun darin, ein Verfahren bereitzstellen, das eine optimale Anbindung von einer großen Anzahl Biopolymeren an Trägeroberflächen erlaubt. Die Aufgabe besteht weiter darin, eine Trägeroberfläche bereitzustellen, deren Bindungskapazität auf ein Vielfaches durch Durchführen einer Oberflächenmodifikation gesteigert worden ist.
Diese Aufgaben werden durch die Gegenstände der Patentansprüche gelöst.
Insbesondere wird diese Aufgabe durch ein Verfahren gelöst, bei dem eine funktioneile Gruppe auf einer Trägeroberfläche durch ein Aktivierungsreagenz aktiviert und nachfolgend mit einer Amin-Komponente umgesetzt wird.
Dem erfindungsgemäßen Verfahren liegen bevorzugt folgende Synthese-Prinzipien zugrunde:
Aktiviemπgsreagenz
Figure imgf000004_0001
Aktivierungsreagenz
HNRaR!
Figure imgf000004_0002
Figure imgf000004_0003
Aktivierungsreagenz
Figure imgf000004_0004
wobei Rλ und R2 gleich oder verschieden sein können. Die Bedeutungen von Rλ und R2 unterliegen keiner Beschränkung und können H oder jeglicher organischer Rest sein (z.B. ein gerader oder verzweigter Alkylrest mit 1-30 Kohlenstoffatomen, ein gerader oder verzweigter Alkenylrest mit 2 bis 30 Kohlenstoffatomen, ein mono- oder polyzyklischer Alkylrest mit 3 bis 30 Kohlenstoffatomen oder ein mono- oder polyzyklischer Alkenylrest mit 4 bis 30 Kohlenstoffatomen oder einen mono- oder polyzyklischen Rest mit 6 bis 30 Kohlenstoffatomen, wobei die Reste ggf. durch einen oder mehrere Substituenten (z.B. OH, Carboxyl, Carbonyl , Phosphat-) substituiert sein können). Die Base kann jegliche basische Verbindung sein, z.B. Diisopropylethylamin.
Es kann jeder beliebige gerade oder verzweigte C1.30-Alkylrest verwendet werden. Beispiele hierfür sind Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Isopropyl-, Butyl-, Isobutyl-, tert . -Butyl- , n-Butyl- , n-Hexyl-, 2-Methylpentyl-, 2 , 3-Dimethylbutyl- , n-Heptyl-, 2- Methylhexyl-, 2 , 2-Dimethylpentyl- , 3 , 3-Dimethylpentyl- , 3- Ethylpentyl-, n-Octyl-, 2 , 2-Dimethylhexyl-, 3 , 3-Dimethylhexyl- , 3 -Methyl-3 -ethylpentylgruppen . Bevorzugt sind kurze Alkylketten, wie Methyl-, Ethyl-, Propyl- und Isopropyl-.
Es kann jeder beliebige gerade oder verzweigte C2-30-Alkenylrest verwendet werden. Beispiele hierfür sind Vinyl-, Propenyl-, Isopropenyl- , Allyl-, 2 -Methylallyl - , Butenyl- oder Isobutenyl-, Hexenyl- oder Isohexenyl-, heptenyl- oder Isohep- tenyl-, Octenyl- oder Isooctenylgruppen. Bevorzugt sind Vinyl- , Propenyl- und Isopropenyl-.
Der Cycloalkylrest mit 3 bis 30 Kohlenstoffatomen kann jeder beliebige Cycloalkylrest sein. Beispiele hierfür sind eine Cyclopropyl-, Cyclobutyl-, Cyclopentyl- oder Cyclohexyl-, Cycloheptyl-, Cxclooctyl-, Cyclononyl- oder Cyclodecylgruppen. Bevorzugt sind Cyclopropyl-, Cyclobutyl-, Cyclopentyl- und Cyclohexyl- . Der Cycloalkenylrest mit 4 bis 30 Kohlenstoffatomen kann jeder beliebige Cycloalkenylrest sein. Beispiele hierfür sind eine Cyclobutenyl - , Cyc 1 open t eny1 - oder Cyc 1 ohexeny1 - , Cycloheptenyl-, Cxclooctenyl-, Cyclononenyl- oder Cyclode- cenylgruppen. Bevorzugt sind Cyclobutenyl-, Cyclopentenyl- oder Cyclohexenyl .
Beispiele für polyzyklische Alkyl- "bzw. Alkenylreste umfassen Norbornan, Adamantan oder Benzvalen.
R: und R2 können ferner beliebige mono- oder polycyclische C6- 30- Arylreste sein. Beispiele hierfür sind ein carbocyclischer , monocyclischer Rest, beispielsweise die Phenylgruppe, ein heterocyclischer , monocyclischer Rest, beispielsweise die Gruppen Thienyl, Furyl , Pyranyl , Pyrrolyl, Imidazolyl, Pyrazolyl, Pyridyl, Pyrazinyl, Pyrimidinyl, Py- razinyl, Thiazolyl, Oxazolyl, Furazannyl, Pyrrolinyl, Imidazolinyl , Pyrazolinyl, Thiazolinyl, Triazolyl, Tetrazolyl, sowie die Positionsisomeren des oder der Heteroatome, die diese Gruppen umfassen können.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren entstehen an der Trägeroberfläche mehr oder weniger vernetzte Linkersysteme, die die Anbindung einer ggf. großen Anzahl von Biopolymeren an die Trägeroberfläche erlauben. Bevorzugte Biopolymere sind DNA, RNA, Nucleinsäureanaloga, Peptide, Proteine, Antikörper etc .
Erfindungsgemäß soll unter einer funktioneilen Gruppe eine auf einer Trägeroberfläche befindliche chemische Gruppierung, wie z.B. eine Amino-Gruppe, Hydroxyl-Gruppe, Carboxyl-Gruppe, Carbonyl-Gruppe, Thiol-, Amid- oder Phosphat-Gruppe verstanden werde .
Erfindungsgemäß ist jegliche (r) auf diesem Gebiet übliche Träger bzw. Matrix einsetzbar. Dies sind insbesondere Glas, Folien bzw. Membranen aus Polypropylen, Nylon, Cellulose, Cellulosederivate (z.B. Celluloseacetat , Cellulose-Misch- ester) , Polyethersulfonen, Polyamiden, Polyvinylchlorid, Polyvinylidenfluorid, Polyester, Teflon oder Polyethylen. Erfindungsgemäß soll unter einem Aktivierungsreagenz ein Reagenz verstanden werden, das auf der Trägeroberfläche befindliche funktioneile Gruppen in einen ankopplungsbereiten Zustand versetzt. Bevorzugte Aktivierungsreagenzien sind 4- Ni trophenyl -Chlorof ormiat (= Chlorame i s ensäur e- 4 - nitrophenylester) , Carbonyldiimidazol , Acryloylchlorid (Acrylsäurechlorid) , Phenylchlorof oxmiat , Phosgen, Diphosgen, Triphosgen, EDC ( N- ( 3 -dime thylaminopropyl ) -N ' -ethyl - carbodiimid-hydrochlorid) , N, N ' -Diisopropyl-carbodiimid, Dicylohexyl-carbodiimid, Disuccinimidyl-carbonat, Disuccinimidyl-oxalat, Dimethylsuberimidatdihydrochlorid oder Phenylendiisothiocyanat, wobei die drei erstgenannten am bevorzugtesten sind.
Erf indungs gemäß sollen unter einer Amin-Komponente Monoamine, Bis-Amine oder Polyamine verstanden werden. Bevorzugte Monoamine sind 2-Aminoethanol , 6-Amino-l-hexanol , 2- (4- Aminophenyl ) -ethanol , 5 -Amino-n-valer iansäure , 2- (2- Aminoethoxy) ethanol, 3-Amino-l , 2-propandiol ; bevorzugte Bis- Amine sind 1 , 4-Bis ( 3 -aminopropoxy ) butan, 0,0'-Bis(2- aminopropyDpolyethylenglykol 500 (= Jeffamin 500), 0,0'- Bis (2-aminopropyl)polyethylenglykol 130 (= Jeffamin 130), 4 , 7 , 10 -Trioxa-1.13 - tridecanamin , E thy 1 endiamin , N- Methylimidazol, Diisopropylethylamin; und bevorzugte Polyamine sind Tetraethylenpentamin, Spermin, Spermidin, 4, 7, 10-Trioxa- 1.13-tridecandiamin, 4-Aminomethyl-l , 8-octandiamin. Durch den Einbau von Aminen können bevorzugt positive Ladungen in das Linkersystem implementiert werden, da diese im physiologischen Bereich protoniert vorliegen. Durch die Wahl des entsprechenden Amins läßt sich der Grad der Ladung der Oberfläche steuern. Postive Ladungen ihrerseits bewirken eine leichtere Annäherung von negativ geladenen Biopolymeren (z.B. Nukleinsäuren) und erleichtern dadurch Hybridisierungen auf den erf indungs gemäß behandelten Trägeroberflächen. Bei der Verwendung von Bis -Aminen oder Polyaminen kann die Kettenlänge, d.h. die Länge des Linker-Systems, durch die Länge des Amins und die Anzahl des wiederholten Durchlaufens der nachfolgend angegebenen Synthese-Prinzipien gesteuert werden. Durch die Wahl des Amins kann der inviduelle Charakter des Linker- Systems gesteuert werden, d.h. ob es eher hydrophob oder hydrophil ist. Durch die Wahl des Amins können neben Amingrupperierungen natürlich auch andere funktioneile Gruppen (z.B. Hydroxyl-, Phosphat-, Carboxyl-, Carbonyl-) auf der Oberfläche präsentiert werden. So ist es beispielsweise für die Einführung eines OH-Gruppen tragenden Linkers vorteilhaft die Umsetzung mit einem Aminalkohol durchzuführen. Bei Verwendung eines bifunktionellen Amins erfolgt eine lineare Verlängerung der Kette. Durch polyfunktionelle Amin-Reagentien werden in das Linkersystem Verzweigungen eingebaut. Dadurch werden sogenannte Dendrimer-Strukturen aufgebaut (s. Fig. 1 und 2). Unter einer Dendrimer-Struktur soll erfindungsgemäß verstanden werden, daß von einem definierten Startpunkt ausgehende mehr als einmal verzweigte Strukturen entstehen. Dies hat vor allem den Vorteil, daß bei Trägermaterialien mit ansonsten geringer Beladungskapazität (z.B. Glas) die Beladung gezielt erhöht werden kann und somit größere Mengen an Biopolymeren aufgebracht werden können. So können bei der Verwendung von polyfunktionellen Aminen (m = Anzahl der Amino- Funktionen) nach n Runden (1 Runde = Zyklus aus Aktivierung und Umsetzung mit Amin) x Positionen (Funktionen) für eine Anbindung von Biopolymeren genutzt werden:
x = (m-l)n (im Falle der Aktivierung mit 4- i t r op h e ny 1 - C h 1 o r o f o r m i a t oder Carbonyldiimidazol )
x = mn (im Falle der Aktivierung mit
Acryloylchlorid)
Rechenbeispiel: Tetraethylenpentamin (m = 5), 3 Runden (n =
3), Acryloylchlorid als Aktivierungsmittel > 53 = 125, d.h. 125-fache Beladungskapazität des Trägers
Um auf der Trägeroberfläche zu einem mehr oder weniger vernetzten Linkersystem zu kommen, werden die obigen Reaktionen gezielt wiederholt. Hierdurch wird der Abstand zwischen Trägermaterial und dem anzubindenden Biopolymer gesteuert und auch die physikalischen Eigenschaften des Linkers bestimmt. Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird ein flexibles Linkersystem geschaffen. Flexibel insofern, daß für jegliche Anwendung (z.B. Anbindung von DNA, RNA, Proteine, Antikörper) ideal vorbereitete Trägeroberflächen zur Verfügung gestellt werden. Insbesondere eignet sieh das erfindungsgemäße Verfahren dazu, für die DNA-/Bio-Chip-Technologie geeignete Oberflächen (Träger) bereitzustellen. Der Grad der positiven Ladung auf der Oberfläche läßt sich durch die Anzahl der protonierbaren Amin-Funktionen, vor allem durch den Einbau von Polyaminen, steuern. So wird das Ziel der Erhöhung der Beladungsdichte vorzugsweise durch den Einbau von Verzweigungssteilen (z.B. Polyaminen) realisiert; die Erhöhung der positiven Oberflächenladung kann beispielsweise durch den Einbau protonierbarer Amino-Funktionen geschehen; die Variation der Distanz zwischen Biomolekül und Oberfläche kann durch die Verwendung Amine verschiedener Kettenlänge gesteuert werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Oberflächenmodifizierung zeichnet sich durch folgende Schritte aus. Die zu derivatisierenden Trägermaterialien werden in einem Reaktionsgefäß mit 5-100 ml (je nach Größe) , bevorzugt 10-30 ml, ganz bevorzugt 20 ml, wasserfreiem Lösungsmittel (z.B. Dichlorethan, Tetrachlorkohlenstoff, THF, DMF, DMSO, HMPT (=HMPA) , Dichlorethan, Acetonitril) mit ca. 0,5 bis 5 mmol, bevorzugt 1-3 mmol, ganz bevorzugt 1 mmol, Aktivierungsreagenz (z.B. Acryloylchlorid, 4-Nitrophenylchloroformiat , Carbo- nyldiimidazol) versetzt. Die Umsetzung wird im Falle von Acryloylchlorid und 4-Nitrophenyl-chloroformiat durch Zugabe von ca. 0,5 bis 5 mmol, bevorzugt 1-3 mmol, ganz bevorzugt 1 mmol, Diisopropylethylamin (oder einer anderen nicht nukleophilen Base, wie Triethylamin, Pyridin, Collidin, Lutidin oder Triisopropylamin) gestartet. Nach 1 bis 4 Stunden, bevorzugt 2 Stunden, Schwenken auf einem Schüttler werden die Träger gründlich mit einem wasserfreien Lösungsmittel (z.B. Dichlorethan, Tetrachlorkohlenstoff, etc.) gewaschen und trocknen gelassen, vorzugsweise mit Stickstoff trockengeblasen. Zur Überprüfung der Reaktion wird eine Qualitätskontrolle durchgeführt. Beispielsweise wird das oben erwähnte aminierte PP-Kontrolls tück dem nachfolgend beschriebenen Bromphenolblau-Test unterzogen. Ist keine Blaufärbung im Vergleich zu einer nicht umgesetzten Probe zu erkennen, ist die Aktivierung erfolgreich verlaufen. Tritt eine Blaufärbung auf, wird die Umsetzung wiederholt. Die nun aktivierten Trägermaterialien werden in ca. 5-100 ml (je nach Größe) , bevorzugt 10-50 ml, ganz bevorzugt 20 ml eines amin- und wasserfreien Lösungsmittels (z.B. DMF, Acetonitril, THF, DMSO, HMPT (HMPA) oder Dichlor ethan) mit ca. 0,5-5 mmol, bevorzugt 1-3 mmol, bevorzugt 1 mmol, Amin-Komponente versetzt und ca. 5 - 20 Stunden, bevorzugt über Nacht, geschwenkt. Man wäscht gründlich, z.B. nacheinander mit DMF, Methanol und Dichlorethan, und läßt die nun derivatisierten Träger trocknen bzw. bläst vorzugsweise mit Stickstoff trocken. Im Falle von mit Acryloylchlorid aktivierten Trägern empfiehlt sich eine auf 1,5 bis 2,5 Tage, bevorzugt 2 Tage, verlängerte Reaktionszeit. Zur Überprüfung der Reaktion wird eine Qualitätskontrolle durchgeführt, beispielsweise wird das oben erwähnte PP-Kontrollstück dem nachfolgend beschriebenen Bromophenolblau-Test unterzogen. Ist die Blaufärbung im Vergleich zu einer aktivierten Probe des letzten Schritts zu erkennen, ist die Umsetzung erfolgreich verlaufen. Bei keiner oder sehr schwacher Blaufärbung wird die Umsetzung wiederholt. Die nun einmal derivatisierten Träger können bereits so verwendet werden oder noch ein- oder mehrmals dem beschriebenen Zyklus unterzogen werden.
Zur Qualitätsüberprüfung der Trägerderivatisierung eignet sich beispielsweise ein Verfahren basierend auf der Blaufärbung von A inofunktionen durch Bromphenolblau, d.h. die Detektion erfolgt über das Verschwinden bzw. Vorhandensein der Blaufärbung bei Aktivierung bzw. Umsetzung mit Aminen. Dazu wird jedem Re akt i ons ge f äß zusätzlich zu den zu derivatisierenden Trägermaterialien ein Stück aminierte Polypropylen-Folie (PP-Kontrollstück) beigefügt, an der stellvertretend für alle in dem Reaktionsgefäß befindlichen Trägermatierialien der Erfolg des jeweiligen Reaktionsschritts überprüft wird. Hierzu wird nach jeder Reaktion ein Stück des Kontrollstreifens entnommen und 2 Minuten in einer 1% Bromp- henolblau-Lösung in aminfreiem DMF geschwenkt und dann mit Ethanol gewaschen. Amino-Funktionen und andere basische Gruppen ergeben hierbei eine intensive adsorptive Blaufärbung. Nach der Durchführung der Aktivierungsreaktionen (z.B. mit Acryloylchlorid, 4-Nitrophenylchloroformiat , Carbonyldiimida- zol) wird auf Verschwinden der Blaufärbung detektiert. Eine Quantifizierung der Oberflächenbeladung ist über UV- Spektroskopie möglich. Hierbei wird die adsorptive Blaufärbung z.B. mit einer 10%-igen Piperidin-Lösung in DMF von Träger abgelöst und UV-spektroskopisch vermessen.
Die Linker an der Trägeroberfläche weisen lineare Strukturen oder Dendrimer-Strukturen auf. Die Strukturen haben folgenden Aufbau :
bevorzugte Struktur nach Aktivierung mit Acryloylchlorid
Figure imgf000011_0001
X = 0, NHRX Y, Z können gleich oder verschieden sein und können ausgewählt sein aus
-(CH2)n -
-(CH2CH20)n-CH2CH2
-(CH2CH2CH20)n-CH2CH2CH2- usw.
R1-R5 können gleich oder verschieden sein analog Rx und R2 vorstehend n = 1-50, bevorzugt 1-20, ganz bevorzugt 1-10
oder bevorzugte Struktur nach Aktivierung mit
Chlorameisensäure-nitrophenylester bzw .
Figure imgf000012_0001
X = 0, NHRX Y, Z können gleich oder verschieden sein und können ausgewählt sein aus
-(CH2)n -
-(CH2CH20)n-CH2CH2
-(CH2CH2CH20)n-CH2CH2CH2- usw.
R1-R5 können gleich oder verschieden sein analog Rx und R2 vorstehend n = 1-50, bevorzugt 1-20, ganz bevorzugt 1-10
Bei der Fixierung von Biopolymeren an die mit dem Linkersystem derivatisierten Trägeroberfläche können prinzipiell 2 Fälle (a) und (b) unterschieden werden :
(a) In situ-Synthese von Biopolymeren (am Beispiel der Oligonukleotidsynthese) :
Die derivatisierten Träger-Oberflächen mit endständigen Amino- oder Hydroxyl -Funkt ionen bedürfen keiner weiteren Modifizierung zur Anbindung des 1. Oligonucleotidbausteins nach der Phosphoramidit- oder auch Phosphortriester-Methode. Es werden nach der Reaktion des 1. Nucleotid-Reagenzes mit der aminierten Oberfläche Bindungen vom Phosphoramidat-Typ erzeugt. Hydroxylierte Oberflächen führen zu Bindungen vom Phosphodiester-Typ . Phosphoramidit-Mβthods
Figure imgf000013_0001
Phosphoramidat
Figure imgf000013_0002
Phosphordiester
Phosphortriester-Methode :
Figure imgf000013_0003
Phosphoramidat
Figure imgf000013_0004
Phosphordiester
Nuc = Nucleosid
Rx - R3 = analog Rλ und R2 vorstehend
Werden Bindungen vom Phosphodiester-Typ angestrebt, genügt es beim letzten Schritt innerhalb der Linker-System-Synthese kein Bis-Amin, sondern einen Amino-Alkohol zur Reaktion zu bringen.
(b) Anbindung von "vorgefertigten" Biopolymeren: Die Anbindung des Biopolymeren sieht entweder die Generierung einer kovalenten (dauerhaften) chemischen Verknüpfung des Biomoleküls mit der Trägeroberfläche oder auch eine dauerhafte Verknüpfung über elektrostatische Wechselwirkung vor. Bei ersterer Möglichkeit muß eine chemische Bindung zwischen dem Biomolekül und der Oberfläche erzeugt werden. Um diese Bindung zu erzeugen, kommt beispielsweise folgendes Vorgehen in Frage:
(A) Zugabe eines Förderungsmittels
(B) Aktivierung einer der beiden Reaktanden
(Biomolekül oder Oberfläche) . Allerdings ist eine Aktivierung der Trägeroberfläche gegenüber einer Aktivierung des Biomoleküls vorzuziehen, da bei der Aktivierung des Biomoleküls selbst unerwünschte Kreuzreaktionen zwischen den aktivierten Biomolekülen - aufgrund des meist poly-funktioneilen Charakters des Biomoleküls - nicht auszuschliessen sind. Diese Aktivierung der Oberfläche erfolgt vorzugsweise mittels Crosslinker .
Bei der Anbindung des Biopolymeren durch elektrostatische Wechselwirkung läßt die positive Ladung, welche durch das beschriebene Linker-System unter Verwendung von Aminen erzeugten dendrimeren Oberflächen entsteht, insbesondere durch die Inkorporation der Amine (bevorzugt Bis- und Polyamine) , erzeugt wird, eine permanente Immobilisierung von negativ geladenen Biopolymeren (z.B. Nukleinsäuren) zu. Hierzu ist keine weitere Aktivierung der Oberfläche notwendig. Das Biopolymer wird erfindungsgemäß direkt auf die dendrimere Oberfläche aufgebracht und wird dauerhaft fixiert. Die Eigenschaften zur dauerhaften Immobilisierung von Biopolymeren durch elektrostatische Wechselwirkung wird erfindungsgemäß nach dadurch gesteigert, daß die dendrimere Oberfläche vorher noch alkyliert, z.B. methyliert, wird.
(A) Anbindung des Biopolymeren unter Zuhilfenahme eines Förderunqsmittels
Die Möglichkeit ein Förderungsmittel (Katalysator) zur Erzeugung der kovalenten Bindung zwischen Oberfläche und Biomolekül zu benutzen, stellt im wesentlichen eine 3 -Komponenten-Reaktion dar. Werden wie in der vorliegenden Erfindung Möglichkeiten angestrebt, die es erlauben sollen, hochparallel eine grosse Anzahl von Biopolymeren an exakt vor- bestimmten Positionen auf einem Träger zu fixieren, kann dies aufgrund von Kreuz-Kontamination nur erschwert mit einem 3-Komponenten-System an ebenen Oberflächen (Folien, Glas o.a.) gelingen. Daher stellt die Förderungsmittel-Methode einen Spezial-Fall zur kovalenten Anknüpfung von Biopolymeren auf Oberflächen vom Membran-Typ dar. Einzig hier kann das Förderungsmittel in den Poren der Membran lokal dem zu bindenden Biomolekül zur Verfügung gestellt werden, ohne daß mit Kreuz-Kontamination zu rechnen ist (vgl. Beispiel 4). Als Förderungsmittelmittel eignen sich beispielsweise Reagentien vom Carbodiimid-Typ, wie Diisopropylcarbodiimid, EDC oder DCC (Dicyclohexylcarbodiimid) . Desweiteren sollten die endständigen Gruppen auf dem Träger und am Biomolekül bevorzugt orthogonal zueinander sein, d.h. diese sollten sinnvoll eine chemische Bindung eingehen können. Hierbei ergeben sich vorzugsweise folgende Kombinationen der zu reagierenden Endgruppen :
Träger-Oberfläche Biomolekül resultierender Bindungs-Typ
Amino (-NHR) Carboxy (-COOH) Amid-Bindung Amino (-NHR) Phosphat (-PO42-) Phosporamidat Hydroxyl (-OH) Carboxy (-COOH) Ester Hydroxyl (-OH) Phosphat (-PO42-) Phosphordiester Carboxy (-COOH) Amino (-NHR) Amid-Bindung Carboxy (-COOH) Hydroxyl (-OH) Ester Phosphat (-PO42-) Amino (-NHR) Phosporamidat Phosphat (-PO42-) Hydroxyl (-OH) Phosphordiester
Da die reaktiven Gruppen (Amin-, Hydroxyl-, Phosphat- oder Carboxyl-) mehr oder weniger vom Biomolekül vorgegeben sind, empfiehlt es sich daher für jeden Biomolekül-Typ einen entsprechenden orthogonalen Oberflächen-Typ zur Verfügung zu haben. Um die Träger-Oberflächen-Derivatisierung mit dem Linkersystem für alle oben aufgeführten Kombination von Endgruppen verfügbar zu machen, wurden Methoden zur Um-Derivatisierung der Oberfläche von endständigen Amino-Funktionen (oder auch Hydroxyl) auf endständige Hydroxyl-, Carboxyl- und Phosphat-Gruppen entwickelt (vgl. Beispiele 5, 6, 7) .
Um-Derivatisierung auf End-Hydroxyl :
Figure imgf000016_0001
Um-Derivatisierung auf End-Carboxyl
Figure imgf000016_0002
Um-Derivatisierung auf End-Phosphat :
Figure imgf000016_0003
A Pyridin NEt3, H2O 9 C) -CH + POCb *- *~ Λ- ςy—p- 2 HNEt3 + (B) Anbindung des Biooolvmeren mittels Crosslinker Unter einer kovalenten Oberflächen-Aktivierung ist eine solche zu verstehen, bei der Crosslinker quasi als End-Gruppe auf das erfindungsgemäß vorher aufgebaute Linker-System (Flexible Linker-System) aufgepropft wurden. Bei diesen handelt es sich vor allem um aktivierte Ester-, Aldehyd-, Imidoester- oder Isothiocyanat-Funktionen, die in der Lage sind, ohne weitere chemische Eingriffe, mit in wässrigen Systemen gelösten Biopolymeren eine kovalente Bindung einzugehen. Als Reagentien der Wahl sind hier v.a. Di s succ inimidyl - carbonat, Di s succ inimidyl -oxala , Glutaraldehyd, Dimethylsuberimidat-Dihydrochlorid oder Phenylendiisothiocyanat zu nennen. Die Umsetzung erfolgt bevorzugt unter basischen Bedingungen, d.h. unter Zusatz von Diisopropylethylamin oder NaC03.
Prinzip:
Figure imgf000017_0001
Bio-OH/Bio-NH2 = hydroxy- / amino-Biomolekül
Die Erfindung wird weiter anhand der Figuren beschrieben, welche zeigen:
Fig. 1 Generierung von Dendri ers trukturen nach Aktivierung mit Acryloylchlorid
Fig. 2; Generierung von Dendrimers trukturen nach Aktivierung mit 4-Nitrophenylchloroformiat Die Erfindung wird weiter anhand der Beispiele beschrieben.
Beispiel 1: Derivatisierung eines Glasträgers
Ausgegangen wird von aminierten Glasträgern (40 x 48 mm) , der entweder kommerziell erhältlich ist; oder nach den üblichen Methoden der Silanisierung darstellbar ist. Zur Aktivierung der Aminofunktionen werden die aminierten Glasträger in 20 ml wasserfreies Dichlorethan mit 200 mg 4-Nitrophenyl-chloro- formiat (1 mmol) und 171 μl Diisopropylethylamin (1 mmol) gelegt und für 2 Stunden auf dem Schüttler geschwenkt. Der BPB-Kontrolltest zeigt keine Blaufärbung. Die Glasträger werden über Nacht in 20 ml amin-freiem DMF mit 223 μl Tetraethylenpentamin (1 mmol) umgesetzt. Der BPB-Kontrolltest zeigt eine Blaufärbung. Zum Starten eines neuen Zyklus' werden die Glasträger in 20 ml wasserfreies Dichlorethan mit 200 mg 4 -Ni t rophenyl - chloro f ormiat (1 mmol) und 171 μl Diisopropylethylamin (1 mmol) gelegt und für 2 Stunden auf dem Schüttler geschwenkt. Der BPB-Kontrolltest zeigt keine Blaufärbung. Die Glasträger werden über Nacht in 20 ml amin- freiem DMF mit 140 μl 1 , 4-Bis (3-aminopropyloxy) -butan (1 mmol) umgesetzt. Der BPB-Test zeigt eine Blaufärbung.
Die so derivatisierten Glasträger verfügen an ihrer Oberfläche jetzt über Linker an die Biopolymere (z.B. Nukleinsäuren) gekoppelt werden können.
Beispiel 2: Derivatisierung eines Glasträgers
Ausgegangen wird von einem aminierten Glasträger (40 x 48 mm) , der entweder kommerziell erhältlich oder nach den üblichen Methoden über Silanisierung darstellbar ist. Zur Aktivierung der Aminofunktionen werden die aminierten Glasträger in 20 ml wasserfreies Dichlorethan mit 81 μl Acryloylchlorid (1 mmol) und 171 μl Diisopropylethylamin (1 mmol) gelegt und für 2 Stunden auf dem Schüttler geschwenkt. Der BPB-Kontrolltest zeigt keine Blaufärbung. Die Glasträger werden über 2 Nächte in 20 ml amin-freiem DMF mit 223 μl Tetraethylenpentamin (1 mmol) umgesetzt. Der BPB-Kontrolltest zeigt eine Blaufärbung. Zum Starten eines neuen Zyklus' werden die Glasträger in 20 ml wasserfreies Dichlorethan mit 81 μϊ Acryloylchlorid (1 mmol) und 171 μl Diisopropylethylamin (1 mmol) gelegt und für 2 Stunden auf dem Schüttler geschwenkt. Der BPB-Kontrolltest zeigt keine Blaufärbung. Die Glasträger werden über 2 Nächte in 20 ml amin-freiem DMF mit 140 μl 1 , 4-Bis (3-aminopropoxy) - butan (1 mmol) umgesetzt. Der BPB-Test zeigt eine Blaufärbung.
Die so derivatisierten Glasträger verfügen an ihrer Oberfläche jetzt über Linker an die Biopolymere (z.B. Nukleinsäuren) gekoppelt werden können.
Beispiel 3: Derivatisierung von Polypropylenmembranen
Ausgegangen wird von einer käuflichen hydrophilisierten Polypropylenmembran (8 x 12 cm) . Zur Aktivierung wird die Membran mit 324 μl Acryloylchlorid (4 mmol) und 684 μl Diisopropylethylamin (4 mmol) in 30 ml wasserfreiem Dichlorethan auf dem Rüttler zur Reaktion gebracht. Nach 2 Std. wird von der Reaktionslösung abdekantiert und mehrmals sorgfältig mit Dichlorethan gewaschen und getrocknet. Der Bromphenolblau-Test (BPB-Test) zeigt keine Blaufärbung. Nachfolgend wird die aktivierte Membran 2 Tage mit 892 μl Tetraethylenpentamin (4 mmol) in 30 ml aminfreiem DMF auf dem Rüttler geschwenkt. Dann wird die Reaktionslösung abdekantiert und die Membran mehrmals sorgfältig mit DMF und dann mit Dichlorethan gewaschen und getrocknet. Der Bromphenolblau-Test zeigt Blaufärbung. Zur weiteren Aktivierung wird die nun aminierte Membran erneut mit 324 μl Acryloylchlorid (4 mmol) und 684 μl Diisopropylethylamin (4 mmol) in 30 ml wasserfreiem Dichlorethan auf dem Rüttler zur Reaktion gebracht. Nach 2 Std. wird von der Reaktionslösung dekantiert und mehrmals sorgfältig mit Dichlorethan gewaschen und getrocknet. Der Bromphenolblau-Test (BPB-Test) zeigt keine Blaufärbung. Nachfolgend wird die aktivierte Membran 2 Tage mit 560 μl 1,6- Bis (3-aminopropyloxy) -butan (4 mmol) in 30 mol aminfreiem DMF auf dem Rüttler geschwenkt. Dann wird die Reaktionslösung abdekantiert und die Membran mehrmals sorgfältig mit DMF und dann mit Dichlorethan gewaschen und getrocknet. Der Bromphenolblau-Test (BPB-Test) zeigt Blaufärbung.
Beispiel 4: Anbindung von Nu leinsäuren auf
Polypropylenmembranen
a) Anbindung unter Zuhilfenahme eines Aktivierungsmittels
Eine gemäß Beispiel 3 derivatisierte Polypropylenmembran (8 x 12 cm) wird auf einem What- man-Filterpapier 5 Min. mit einer Lösung aus 54 mg N- ( 3 -Dimethylaminopropyl ) -N ' -ethyl-carbodiimidhy- drochlorid und 24 ml N-Methylimidazol in 10 ml Wasser inkubiert. Die Reaktionslösung wird abdekantiert. Die so aktivierte, noch feuchte Polypropylen-Membran kann nun zum kovalenten Aufbringen von Biopolymeren (Nukleinsäuren) verwendet werden. Nach dem Aufbringen der Biopolymere (z.B. durch Spotting-Robotter oder Nano-Plotter) werden die Proben durch 2 hr Inkubieren bei 65 °C auf der Membran fixiert ; anschliessend wird die Membran sorgfältig mit Wasser gewaschen.
b) Anbindung mittels elektrostatischer Wechselwirkung unter nicht-denaturierenden Bedingungen
Eine analog Beispiel 3 derivatisierte Polypropylenmembran (8x12 cm) wird auf einem Filterpapier mit Wasser befeuchtet. Die feuchte Membran kann direkt nun zum Aufbringen von Biopolymeren verwendet werden. Nach dem Aufbringen der Biopolymere (z.B. mittels eines Spotting-Roboters) werden die Proben durch 2 stündige Inkubation bei 65°C auf der Membran fixiert. Anschließend wird die Membran gründlich mit Wasser gewaschen.
Alternativ können die Biopolymere auch direkt auf eine trockene Membran aufgebracht werden.
c) Anbindung mittels elektrostatischer Wechselwirkung unter denaturierenden Bedingungen
Eine analog Beispiel 3 derivatisierte Polypropylenmembran (8x12 cm) wird auf einem Filterpapier mit 10 ml Denaturierungspuffer (0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl) getränkt. Nach 10 Min. Inkubation wird der Überstand an Denaturierungspuf fer abdekantiert. Die noch feuchte Membran kann nun zum Immobilisieren von Biopolymeren verwendet werden. Nach dem Aufbringen der Biopolymere (z.B. mittels Spotting- Roboter) werden die Membranen über Nacht bei Raumtemperatur getrocknet. Anschließend wird die Membran gründlich mit Wasser gewaschen.
Beispiel 5: Synthese endständiger Hydroxyl-Gruppen
a) Aktivierung mit Chlorameisensäure-4-nitrophenylester : Eine amino - funkt i onal i s i er te Polypropylen-Membran
(Omnitray-Grösse) gemäß Beispiel 3 wird in 30 ml wasserfreiem Dichlorethan mit 400 mg Chlorameisensäure-4-nitrophenylester
(2 mmol) und 342 μl Diisopropylethylamin (2 mmol) für 2 hr auf dem Schüttler geschwenkt. Man wäscht 2 x je 5 min mit 50 ml Dichlormethan und trocknet im Stickstoffström. Die so aktivierte PP-Membran wird nun mit 200 ml 2-(2-Amino- ethoxy) ethanol (2 mmol) in 30 ml aminfreiem DMF 30 min auf dem Schüttler geschwenkt, worauf die Reaktionslösung abdekantiert wird. Nach kurzem Waschem mit DMF wird die PP-Membran erneut mit 200 μl 2- (2-Aminoethoxy) ethanol (2 mmol) in 30 ml aminfreiem DMF versetzt und über Nacht auf dem Schüttler geschwenkt. Von der Reaktionslösung wird abdekantiert, und die PP-Membran 2x je 5 min mit 50 ml DMF und dann 2 x mit 50 ml Aceton gewaschen und getrocknet.
b) Aktivierung mit Acryloylchlorid :
Eine amino - funkt ional i s i er te Polypropylen-Membran
(Omnitray-Grösse) gemäß Beispiel 3 wird in 30 ml wasserfreiem Dichlorethan mit 162 μl Acryloylchlorid (2 mmol) und 342 μl Diisopropylethylamin (2 mmol) für 2 hr auf dem Schüttler geschwenkt. Man wäscht 2 x je 5 min mit 50 ml Dichlormethan und trocknet im Stickstoffström. Die so aktivierte PP-Membran wird nun mit 200 μl 2- (2-Aminoethoxy) ethanol (2 mmol) in 30 ml aminfreiem DMF 30 min auf dem Schüttler geschwenkt, worauf die Reaktionslösung abdekantiert wird. Nach kurzem Wäschern mit DMF wird die PP-Membran erneut mit 200 μl 2- (2-Aminoethoxy) ethanol
(2 mmol) in 30 ml aminfreiem DMF versetzt und über Nacht auf dem Schüttler geschwenkt. Von der Reaktionslösung wird abdekantiert, und die PP-Membran 2x je 5 min mit 50 ml DMF und dann 2 x mit 50 ml Aceton gewaschen und getrocknet.
Beispiel 6: Synthese endständiger Carboxyl-Gruppen
Eine ami no - funkt i ona 1 i s i er te Polypropylen-Membran (Omnitray-Grösse) gemäß Beispiel 3 wird in 30 ml trockenem Dichlorethan mit 400 mg Bernsteinsäureanhydrid (4 mmol) , 1 ml Pyridin (24 mmol) und 488 mg DMAP (4 mmol) über Nacht auf dem Schüttler zur Reaktion gebracht. Nachfolgend wird die Reaktionslösung abdekantiert und die PP-Membran nacheinander mit 30 ml Dichlormethan, 30 ml Aceton, 30 ml 1 % HCl, 2 x 30 ml Wasser und 2 x mit 30 ml Aceton jeweils 5 min. gewaschen und getrocknet.
Beispiel 7: Synthese endständiger Phosphat-Gruppen
Unter Eisbadkühlung werden 0.42 ml POCl3 (4 mmol) in 40 ml trockenem Pyridin gelöst. Nachfolgend werden 828 mg 1, 2 , 4-Triazol (12 mmol) zugefügt. Nach 10 min wird die hydroxyl-funtionalisierte Polypropylen-Membran gemäß Beispiel 4 zugefügt und weitere 10 min unter Eisbadkühlung auf dem Rüttler geschwenkt. Anschliessend wird das Eisbad entfernt und noch 45 min geschwenkt. Die Reaktionslösung wird abdekantiert und vorsichtig mit 50 ml eines Gemisch aus Triethylamin / Dioxan / Wasser hydrolisiert . • Man wäscht sorgfältig nacheinander 2 x mit 50 ml Wasser, kurz mit 50 ml 1 % HC1, 2 x mit 50 ml Wasser und 2x 5 min mit 50 ml Aceton und trocknet im Stickstoff-Strom.
Beispiel 8 : O b e r f l ä c h e n - A k t i v i e r u n g m i t
Disuccinimidylcarbonat
7 amino-funktionalisierte Glas-Objektträger werden in 30 ml wasserfreiem Acetonitril mit 256 mg Disuccinimidylcarbonat (2 mmol) und 513 μl Diisopropylethylamin (3 mmol) für 4 hr auf dem Schüttler geschwenkt. Man wäscht mit 50 ml Acetonitril, dann mit 50 ml Dichlorethan und trocknet im Stickstoffström.
Beispiel 9: Methylierung eines Glasträgers zur
Verbesserung der Eigenschaften für die Immobilisierung von Biomolekülen durch elektrotstatische Wechselwirkung
7 Stück derivatisierte Glasträger (derivatisiert analog Beispiel 2) werden für 1,5 Stunden mit einer Lösung aus 0,125 ml Trifluormethansulfonsäuremethylester (1,1 mmol) in 40 ml Dichlorethan inkubiert. Danach wird gründlich mit Dichlorethan und Aceton gewaschen und die Träger getrocknet.

Claims

Patentansprüche
1) Verfahren zum Derivatisieren von Trägern, wobei eine funktioneile Gruppe auf einer Trägeroberfläche durch Umsetzung mit einem Aktivierungsreagenz aktiviert wird und nachfolgend mit einer "Amin-Komponente umgesetzt wird.
2) Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Träger ausgewählt sind aus Glas, Folien bzw. Membranen aus Polypropylen, Nylon, Cellulose, C e 11 u 1 o s e de r i va t e (z.B. Celluloseacetat , Cel lulos e-Mi s ches ter ) , Poly- ethersulfonen, Polyamiden, Polyvinylchlorid, Polyviny- lidenf luorid, Polyester, Polyethylen oder Teflon.
3) Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die funktioneile Gruppe eine Amin- , Hydroxyl-, Phosphat-, Carboxyl-, Carbonyl-, Thiol- oder Amid-Gruppe ist.
4) Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, wobei das Ak t i i e rungs r eage z Acryloylchlorid, 4- Nitrophenylchloroformiat , Carbonyldiimidazol , Phenyl- chloroformiat, Phosgen, Diphosgen, Triphosgen, EDC (N- ( 3 -dime thy laminopr opy 1 ) -N ' - ethyl -carbodiimid- hydrochlorid) , N , N ' -Di i s opr opy 1 - carbodi imi d , Dicylohexyl-carbodiimid, Di succ inimidyl -carbonat, Disuccinimidyl-oxalat , Dimethylsuberimidat- Dihydrochlorid oder Phenylendiisothiocyanat ist.
5) Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, wobei die Amin-Komponente ausgewählt ist aus Monoaminen, Bis- Aminen oder Polyaminen.
6) Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Mono-Amin 2- Aminoethanol, 6-Amino-l-hexanol , 2- (4-Aminophenyl) - ethanol , 5 - Am i n o - n - v a 1 e r i an s ä u r e , 2- (2- Aminoethoxy) ethanol oder 3-Amino-l , 2-propandiol ist. 7) Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Bis-Amin 1,4- Bis (3-aminopropoxy)butan, 0,0' -Bis (2-aminopropyl)poly- ethylenglykol 500 (= Jeffamin 500), 0,0'-Bis(2- aminopropyDpolyethylenglykol 130 (= Jeffamin 130), 4, 7, 10-Trioxa-l .13-tridecanamin, oder Ethylendiamin is .
8) Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Polyamin Tetraethylenpentamin, Spermin, Spermidin, 4,7,10- Trioxa-1.13-tridecandiamin oder 4-Aminomethyl-l , 8- octandiamin ist.
9) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Schritte der Umsetzung mit einem Aktivierungsreagenz und einer Amin-Komponente mehrmals durchgeführt werden.
10) Verfahren nach Anspruch 9, wobei es zum Aufbau von Dendrimer-Strukturen an der Trägeroberfläche kommt.
11) Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es zum gesteuerten Aufbau von positiver Ladung an der Trägeroberfläche kommt.
12) Verfahren nach einem der Ansprüche 1-11, wobei zusätzlich die gemäß einem Ansprüche 1-11 derivatisierte Trägeroberfläche vor dem Anbinden von Biopolymeren aktiviert wird.
13) Verf ahren nach Anspruch 12 , wobei als Aktivierungsmittel Disuccinimidylcarbonat , Di succ inimidyl oxalat , Glutaraldehyd , Dimethylsuberimidat-Dihydrochlorid oder Phenylendiisothiocyanat verwendet wird.
14) Träger geeignet zur Anbindung von Biopolymeren, wobei der Träger an seiner Oberfläche Linker mit folgender Struktur aufweist:
Figure imgf000026_0001
X = 0, NHRX
Y, Z können gleich oder verschieden sein und ausgewählt sein aus
"(CH2)n -
-(CH2CH20)n-CH2CH2
-(CH2CH2CH20)n-CH2CH2CH2- usw.
R1 -R5 = können gleich oder verschieden sein und ausgewählt sein aus gerader oder verzweigter Alkylrest mit 1-30 Kohlen- stoffatomen, gerader oder verzweigter
Alkenylrest mit 2 bis 30 Kohlenstoff- atomen, mono- oder polyzykl i scher
Alkylrest mit 3 bis 30 Kohlenstoffatomen oder mono- oder polyzyklischer Alkenylrest mit 4 bis 30 Kohlenstoffatomen oder mono- oder polyzyklischen Rest mit 6 bis 30
Kohlenstoffatomen, wobei die Reste ggf. durch einen oder mehrere Substituenten
(z.B. OH, Carboxyl , Carbonyl , Phosphat- ) substituiert sein können) n = 1-50
oder
Figure imgf000026_0002
X = 0 , NHRX
Y, Z = können gleich oder verschieden sein und ausgewählt sein aus "(CH2)n -
-(CH2CH20)n-CH2CH2 -(CH2CH2CH20)n-CH2CH2CH2- usw.
Ri-R5 = können gleich öder verschieden sein und können ausgewählt sein aus gerader oder verzweigter Alkylrest mit 1-30 Kohlenstoffatomen, gerader oder verzweigter Alkenylrest mit 2 bis 30 Kohlenstoffatomen, mono- oder po ly zykl i s eher Alkylrest mit 3 bis 30 Kohlenstoffatomen oder mono- oder polyzyklischer Alkenylrest mit 4 bis 30 Kohlenstoffatomen oder mono- oder polyzyklischen Rest mit 6 bis 30 Kohlenstoffatomen, wobei die Reste ggf. durch einen oder mehrere Substituenten (z.B. OH, Carboxyl, Carbonyl , Phosphat-) substituiert sein können) n = 1-50
15) Träger geeignet zur Anbindung von Biopolymeren, wobei dieser an seiner Oberfläche Linker in Form von Dendrimer-Strukturen aufweist.
16) Verwendung eines nach einem der Ansprüche 1-11 hergestellten Trägers oder eines Trägers nach Anspruch 14 oder 15 zur Anbindung von Biopolymeren.
17) Verwendung nach Anspruch 16, wobei die Biopolymere aus DNA, RNA, Nukleotidanaloga, Peptiden, Proteinen oder Antikörpern ausgewählt sind.
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Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002033412A1 (en) * 2000-10-14 2002-04-25 Macrogen Inc. Bio-support and preparing method of the same
WO2002014558A3 (en) * 2000-08-11 2002-05-02 Nanogen Inc New hydrazide building blocks and hydrazide modified biomolecules
EP1317422A4 (de) * 2000-09-05 2004-06-30 Posco Substrat mit kontrollierter amin-dichtheit und regelmässiger räumlicher anordnung und verfahren zu dessen herstellung
US7129229B2 (en) 2000-08-11 2006-10-31 Nanogen Recognomics Gmbh Hydrazide building blocks and hydrazide modified biomolecules
US7186813B1 (en) 2000-01-11 2007-03-06 Nanogen Recognomics Gmbh Biomolecules having multiple attachment moieties for binding to a substrate surface
US7358417B2 (en) 2001-10-16 2008-04-15 Posco Transgenic organism expressing fungal MRP-like ABC transporters
US7556858B2 (en) 2004-09-30 2009-07-07 3M Innovative Properties Company Substrate with attached dendrimers
US10898113B2 (en) 2003-12-09 2021-01-26 Dexcom, Inc. Signal processing for continuous analyte sensor

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6756492B1 (en) 1999-04-08 2004-06-29 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftund Des Offentlichen Rechts Nucleoside derivatives with photo-unstable protective groups
CA2563168A1 (en) * 2004-04-14 2005-11-17 President And Fellows Of Harvard College Nucleic-acid programmable protein arrays
US8178316B2 (en) * 2006-06-29 2012-05-15 President And Fellows Of Harvard College Evaluating proteins

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1221307A (en) * 1982-12-02 1987-05-05 Nobutaka Tani Adsorbent and process for preparing the same
US4693985A (en) * 1984-08-21 1987-09-15 Pall Corporation Methods of concentrating ligands and active membranes used therefor
US4837348A (en) 1986-04-30 1989-06-06 Varian Associates, Inc. Bonded phase chromatographic supports
US5624711A (en) 1995-04-27 1997-04-29 Affymax Technologies, N.V. Derivatization of solid supports and methods for oligomer synthesis
US5607475A (en) * 1995-08-22 1997-03-04 Medtronic, Inc. Biocompatible medical article and method
US5672638A (en) * 1995-08-22 1997-09-30 Medtronic, Inc. Biocompatability for solid surfaces
DE69923690T2 (de) * 1998-07-10 2006-04-06 Dupont Canada Inc., Mississauga Geträgerter dendrimer-katalysator und seine verwendung in der hydroformylierung oder bei der kohlenstoff-kohlenstoff verbindung herstellung
US6326083B1 (en) * 1999-03-08 2001-12-04 Calipher Technologies Corp. Surface coating for microfluidic devices that incorporate a biopolymer resistant moiety

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7186813B1 (en) 2000-01-11 2007-03-06 Nanogen Recognomics Gmbh Biomolecules having multiple attachment moieties for binding to a substrate surface
WO2002014558A3 (en) * 2000-08-11 2002-05-02 Nanogen Inc New hydrazide building blocks and hydrazide modified biomolecules
JP2004517043A (ja) * 2000-08-11 2004-06-10 ナノジェン・レコグノミクス・ゲーエムベーハー ヒドラジド結合部分を有する巨大分子およびそれらの製造用試剤
US7129229B2 (en) 2000-08-11 2006-10-31 Nanogen Recognomics Gmbh Hydrazide building blocks and hydrazide modified biomolecules
EP1317422A4 (de) * 2000-09-05 2004-06-30 Posco Substrat mit kontrollierter amin-dichtheit und regelmässiger räumlicher anordnung und verfahren zu dessen herstellung
WO2002033412A1 (en) * 2000-10-14 2002-04-25 Macrogen Inc. Bio-support and preparing method of the same
US7358417B2 (en) 2001-10-16 2008-04-15 Posco Transgenic organism expressing fungal MRP-like ABC transporters
US10898113B2 (en) 2003-12-09 2021-01-26 Dexcom, Inc. Signal processing for continuous analyte sensor
US7556858B2 (en) 2004-09-30 2009-07-07 3M Innovative Properties Company Substrate with attached dendrimers

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