WO2000053789A2 - Retrovirale expressionsvektoren auf der basis von herv-ltr-sequenzen - Google Patents

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    • C12N2740/13043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the present invention relates to retroviral expression vectors with cell-specifically regulable promoters.
  • the vectors can be used, for example, for cell-specific expression of therapeutically valuable genes in the context of gene therapy.
  • Retroviruses are RNA viruses in which the viral genes are encoded by a single-stranded RNA molecule. After the viruses have entered the cell, the viral RNA is converted into a double-stranded DNA molecule by reverse transcription. The DNA penetrates into the nucleus and integrates into the cellular chromosome. The integrated viral DNA form, the so-called provirus, forms the template for the expression of the viral genes.
  • the integration of the viral genome into the cellular chromosome is a mandatory part of viral replication and is mediated by virally encoded enzymes. It appears that, with a few exceptions, the presence of the retroviral genome in the cell, the expression of its genes, and the formation of virus particles do not or hardly affect the viability of the infected cell.
  • Retroviraier gene transfer is used to introduce functional genes, especially therapeutically valuable genes, into the cells without affecting the proliferation ability of the host cell. Because of their replication mode, retroviruses are suitable for such a gene transfer. In the simplest embodiment, at least some of the viral genes are replaced by a gene of interest and, with the aid of the efficient viral infection process, this gene of interest is transferred to the target cell.
  • Retroviral vectors are suitable for gene therapy because the infection by retroviruses is highly efficient and the retroviral vectors can be modified in such a way that they take up heterologous DNA and can integrate it stably into the host cell genome.
  • retroviral vectors have been developed in recent years, and only for example is the review article by Günzburg et al. (1996) and Robbins et al. (1998).
  • a possible preferred embodiment for retroviral vectors are so-called ProCon vectors, which were first described in WO 96/07748. For the purposes of disclosure, reference is made in full to this publication.
  • ProCon vectors carry heterologous promoter and optionally other regulatory elements in the 3'LTR, which, after infection, are duplicated and translocated to the 5'LTR in the target cell and which are able to regulate the expression of marker genes or therapeutic genes. These heterologous genes are not directly linked to the promoter, but are inserted into the interior of the vector.
  • ProCon vectors comprise a 5'LTR section of the structure U3, R, U5 and at least one coding and / or non-coding sequence and a 3'LTR area which comprises a completely or partially deleted U3 section, the deleted one U3 section was replaced by a polylinker sequence, followed by the R and U5 section.
  • helper cell line which produces large amounts of the viral proteins which are no longer synthesized by the expression vector itself.
  • helper cell line is no longer able to produce a replication-competent virus.
  • This cell line is also referred to as a packaging cell line and comprises a cell line transfected with at least one second plasmid which carries those genes which enable packaging of the modified retroviral vector.
  • W092 / 10564 we refer here e.g. to W092 / 10564, to which reference is made here in full.
  • the DNA coding for the modified retrovirus is transfected into the packaging cell line.
  • the modified retroviral genome including the inserted therapeutic genes or marker genes is transcribed and packaged into the retroviral particles (recombinant viral particles).
  • This recombinant virus is then used to infect the target cells; the genome of the modified retrovirus, ie the expression vector, is integrated into the genome of the target cells, together with the marker genes or the therapeutic genes.
  • a cell infected with the recombinant viral particles generated in this way can no longer produce a new vector virus since there are no further viral proteins in these cells.
  • the in the hosts « cell-integrated DNA of the expression vector with the therapeutically valuable genes or the marker genes is integrated in the cellular DNA and can now be expressed in the cell.
  • cell-specific regulatory sequences are used in the LTR sequence of the expression vector.
  • These cell-specific regulatory sequences include, for example, cell-specifically regulatable promoter sections, cell-specific enhancer sequences and transcription factor binding sites.
  • the promoters are in the U3 section of the LTR.
  • Cellular promoter sequences or promoter sequences of exogenous retroviruses are currently used in retroviral vectors.
  • Cellular promoters are often dependent on additional signal structures that can be located at a great distance upstream or downstream of the promoter. It has therefore repeatedly proven difficult to isolate strong, tissue-specific cellular promoter sequences and to clone them in retroviral vectors. Promoters of exogenous retroviruses have the advantage that they contain all the necessary regulatory elements in a small space in the retroviral LTR and are therefore largely transcribed independently of the neighboring DNA sequences of the integration site. A serious disadvantage, however, is that, although they are very strong, they are not tissue-specific and are usually expressed equally strongly in all cell types.
  • a cell-specifically regulatable promoter section from a human endogenous retroviral DNA nucleotide sequence is used in retroviral expression vectors.
  • HERV human endogenous retroviral DNA nucleotide sequence
  • Endogenous retroviruses can be found in the genome of all cells in an organism. They are transmitted vertically via germline cells and can be reactivated by environmental influences.
  • the human genome consists of approximately 2% endogenous retroviruses and retroviral sequences, with solitary HERV-LTRs with 20,000-40,000 copies per genome being represented (Tab. 1) (Leib-Mösch et al., 1993; Wilkinson et al., 1994 , Patience et al., 1997).
  • Retroviral vectors that are constructed from such sequences have the advantage over vectors from animal viruses that no new viral sequences have to be introduced into the genome. Even by recombination with HERV sequences already present in the genome, no new types of retroviruses can arise, e.g. the case would be if retroviruses of other species are used as vectors. For this reason, the use of these sequences to construct retroviral vectors can minimize the security risk. Furthermore, homologous regions contained in the genome could be used for tissue-specific integration of the retroviral vectors into specific locations of a chromosome.
  • HERV elements have taken on a number of cellular functions during evolution.
  • promoter and enhancer elements of HERV LTRs are used to control the transcription of cellular genes (Kato et al., Feuchter-Murthy et al., 1993; Di Christofano et al., 1995).
  • An example of the use of LTR regulatory elements for tissue-specific expression of a cellular gene is the human amylase gene. This gene is controlled by the LTR of a HERV-E element and is therefore only specifically expressed in the salivary glands (Ting et al., 1992).
  • retroviral promoters have persisted in the primate genome for millions of years, they have adapted in the course of evolution so that, like cellular promoters, they are cell type-specific, thus combining the advantages of cellular and retroviral promoters.
  • HERV-LTRs also contain a large number of different binding sites for transcription factors (Seifarth et al., 1998), which are responsible for the tissue specificity of the expression.
  • HERV sequences and especially promoters of HERVs have never been considered as possible candidates for the development of retroviral expression vectors.
  • they have so far only been regarded as disruptive factors in connection with gene therapy (Patience et al., 1997). It was feared that they could interfere with the therapeutic vector in the target cell by recombinations due to sequence homologies. So far, these fears have not been confirmed experimentally, but with the development of very efficient human packaging cell lines, the problem of co-packaging and the unwanted transmission of potentially infectious HERV sequences has arisen.
  • HERV genes have a sequence homology to MLV genes of 50-65%, the areas essential for packaging and infection, in particular the packaging signal located between the 5 'LTR and the gag region and the LTR itself, do not have any recognizable sequence homology to the corresponding MLV sequences.
  • Efficient HERV packaging systems are also currently unimaginable, since no cell lines are known to date that produce HERV particles in sufficient quantities.
  • the present invention thus solves the problem of retroviral expression vectors which control cell and tissue-specific expression of foreign genes (gene of interest) by providing expression vectors which, in a functional arrangement, contain at least the following elements:
  • DNA sequences for cell-specific expression are characterized in that they comprise a cell-specifically regulatable promoter region which originate from a human endogenous retroviral virus, in particular the LTR sequence of this virus;
  • the promoter region from a HERV sequence can encompass the entire LTR region of the HERV. In further embodiments of the invention, however, the promoter region only comprises the U3 region or the R-U3 region of the HERV-LTR. In a further preferred embodiment of the invention, in addition to these regions, the untranslated region between the 5 'LTR and the gag genes is also included in the promoter section. According to the invention it was found that sequences are also located in this area which control cell-specific expression of proteins or peptides, ie are at least partly responsible for this cell-specific expression.
  • the promoters are sections of the DNA which are necessary for the start of the transcription of the assigned structural genes.
  • the promoter contains the starting point of the transcription, the recognition and binding site for the RNA polymerase.
  • the promoter can also comprise further sequences to which regulatory proteins can bind and thereby specifically regulate the initiation of transcription. Examples of such proteins are transcription factors and repressors. Examples of these regulatory elements of transcription activity are the CAAT box, the GC box and the TATA box.
  • the promoters are recognized by a type II polymerase.
  • the promoter sections for cell-specific expression of foreign proteins from HERVs can optionally be combined with further sequences which originate from exogenous retroviruses and which promote cell-specific expression.
  • a combination with regulatory sequences from cellular genes is also conceivable to support cell-specific expression.
  • the retroviral expression vector according to the invention further contains at least DNA sequences for packaging the vector by a packaging helper cell line.
  • the packaging DNA sequences are located between the 5 'LTR and the gag gene.
  • packaging signals are present in all retroviral vectors and are therefore known to the person skilled in the art. Examples of packaging sequences are listed in Mann et al., 1985, and Rein, 1994, and the literature cited therein. Full reference is made to this literature.
  • the retroviral expression vector of the present invention contains one or more transcription units that code for an amino acid sequence.
  • the amino acid sequence stands for a protein or peptide. Any sequence that encodes any protein or peptide of interest can be inserted into the expression vector. Such proteins or peptides can be encoded, for example, by marker genes, therapeutically valuable genes, genes with an antiviral effect, antitumor genes and / or cytokine genes. This list could be supplemented as desired.
  • the inserted into the retroviral expression vector The genes are known to the person skilled in the art. The type of genes used depends on the intended use of the vector according to the invention.
  • the vectors according to the invention can be used, for example, in gene therapy to transfer heterologous DNA into target cells in order to make diseases accessible to a specific therapy.
  • the vector DNA is introduced into the selected target cells so that the heterologous DNA is expressed in the target cell and the product encoded by the DNA is produced.
  • These include in particular those genes for the expression of proteins which are not produced in the target cell or are no longer produced or are produced in insufficient quantities, so that a disease state arises.
  • the invention includes not only those proteins or peptides that occur naturally, but also those that have been modified in such a way that a desired effect is achieved, for example a higher activity of an enzyme, the blocking of the binding site of viruses, destruction of tumor cells through suicide genes etc.
  • the DNA nucleotide sequences coding for a protein or a peptide are generally heterologous DNA which codes for RNA and proteins which are normally not produced in vivo by the cell in which the proteins or peptides are expressed. It can also be called foreign DNA. Any proteins, for example enzymes, hormones and antibodies, are included.
  • the retroviral expression vectors provided according to the invention are therefore designed such that they can express proteins of interest in human cells.
  • the promoter regions used according to the invention are selected from HERV sequences which come from the known HERV families. Examples include HERV-K, HERV-H, HERV-E, HERV-L, HERV-T, HERV-R, HERV-I, HERV-P, ERV9, HERV-W.
  • HERV families which are not yet known can of course also be screened in order to find as yet unknown promoter sequences which control cell-specific expression.
  • LTR sequences from HERVs which are preferred according to the invention and which can be used for the tissue-specific expression of proteins and peptides of interest are set out in the appendix disclosed. They can be used in retroviral expression vectors in order to achieve the object of the invention. Of course, only parts of these LTRs can be selected by methods known per se in order to keep the sequences used in the vector as small as possible. The appropriate fragments can be selected using various deletion mutants. Further modifications of these LTR sequences are also possible, for example point mutations, insertions, additions, exchange of several nucleotides etc. in order to increase the efficiency of the tissue-specific expression and to adapt it to the desired function.
  • the ProCon vectors described at the outset are used.
  • Such ProCon vectors include a 5 'LTR portion of structure U3-R-U5, one or more sequences encoding a protein or peptide, and optionally non-coding sequences, and a 3' LTR portion comprising a partial or Completely deleted U3 section, the deleted U3 section comprising at least the HERV-LTR sequences used according to the invention, followed by the R-U5 section. Further details are described, for example, in WO96 / 07748 and WO96 / 28564. Full reference is made here to these writings.
  • the retroviral expression vectors according to the invention are packaging-deficient, ie they are unable to produce virus particles without the aid of a packaging helper cell line.
  • the invention therefore also comprises a retroviral vector system which contains a retroviral expression vector as described in the present invention and a packaging cell line with at least one retroviral or recombinant retroviral construct which codes for the packaging proteins of the retroviral expression vector.
  • packaging cell lines are known and described per se. For example, reference is made here to the murine packaging cell line PA317 (Salier et al., 1998). In the following, the invention is first described in general and then using exemplary embodiments.
  • the suitability of human endogenous retroviruses for the development of tissue-specific vectors for gene therapy was investigated.
  • tissue specificity of the HERV pol transcription in various cell lines such as T cells, keratinocytes and breast cancer cells was first checked in a "reverse dot blof" procedure.
  • the expression patterns of the various HERV families were found to be entirely dependent on the cell type
  • primers were developed with which the U3 / R regions from mRNA preparations can be specifically amplified. The isolated LTR sequences and individual representatives of already known LTRs were incorporated into expression vectors.
  • the activity of the LTR promoters was tested after transient transfection of the reporter plasmids via luciferase activity or via eGFP fluorescence in different cell lines, and it was found that the promoter activities of the individual HERV LTRs vary significantly depending on the cell line tested -H LTR, which from A Strocytes and liver cells had been isolated and had proven to be particularly active in lung fibroblast cells (LC5) in several experiments, were inserted into two retroviral promoter conversion vectors (pLESN and PLX), tested in packaging cell lines, the packaging efficiency examined and checked to see if Infection of the target cells a promoter conversion has taken place. FACS analyzes were carried out to demonstrate the transcription activity in the target cells.
  • HERV promoter sequences U3 / R region
  • tissue specificity and promoter activity of these sequences was then tested in a transient transfection assay in various human cell lines.
  • suitable sequences were selected, cloned into a promoter conversion vector (ProCon vector) and their suitability for the construction of tissue-specific vectors for gene therapy was checked.
  • the retroviral expression vectors according to the invention are produced by recombinant techniques known per se. Such techniques are described, for example, in Sambrook et al., 1989, and Perbai, 1984. tion of the ProCon vectors, reference is made to WO 96/07748 already mentioned at the outset and the literature associated therewith.
  • tissue-specific expression of a retrovirus is primarily determined by its U3 region. All regulatory sequences such as promoter, enhancer and the binding sites for various cellular transcription factors are located in this area. For this reason, primers were developed with which these HERV sequences could be isolated from mRNA of different cell lines by RT-PCR (Tab. 2; Fig.1). About 30 different HERV-LTRs were cloned in this way. Part of these sequences were tested in a reporter plasmid for promoter activity and tissue specificity.
  • a polydT primer was combined for the PCR with a primer that is complementary to the polypurine tract (PPT) of the retroviral RNA (Fig. 1).
  • PPT polypurine tract
  • the PPT tract is a conserved region in the untranslated area between the env gene and the U3 Region of the 3'-LTR.
  • the PPT region is used as the primer binding site for the synthesis of the plus strand during the reverse transcription of the retrovirus (Sorge and Hughes, 1982).
  • epithelial cells HeLa, HaCaT
  • fibroblast cells LC5
  • T cells H9, HUT78
  • lymphoblasts CML
  • gnome cells 85HG66, U373
  • pancreatic cells MiaPaCa2, Pand
  • liver cells Chang Liver
  • breast cancer cell lines T47-D, MCF7
  • cDNA gene banks (Clontech) from various human tissues (brain, heart, liver, kidney, lung, pancreas, placenta, Skeiett muscle) were used for the RT-PCR.
  • the fragments obtained were then cloned, sequenced and analyzed using database comparisons. From the PCR fragments obtained with the PPT and polydT primers, two LTRs could be assigned to the HERV-H and HERV-K families via homology comparisons. By using polydT primers in these PCR approaches, numerous sequences were amplified that did not contain any homologies to known retroviral LTRs and, furthermore, did not contain any promoter structural elements. For this reason, further sequences from conserved areas of the U3 region and from the R region of HERV-K and HERV-H families were selected for primer synthesis (Mold et al., 1997), (Fig. 1, Tab. 1).
  • HERV-LTRs HERV-K-pl167, HERV-H-H6, HERV-E, HERV-L
  • the hybridizing fragments were then cloned into a vector (pZE-RO, Invitrogen) and sequenced.
  • HERV-LTRs which are listed in Table 3, were isolated using this method.
  • the HERV-K-LTRs which were isolated from human brain and heart tissue as well as from T47-D cells, show very high sequence homologies to the 3 ' LTR of HERV-K10.
  • the HERV-H LTRs show much higher sequence variabilities.
  • HERV-H31, HERVHS, HERV-HCM1, HERV-HCM4, HERV-HMP23 are homologous to that of Mager et al. isolated HERV-H-H6 LTR, the other HERV-H sequences show homologies to that of Anderssen et al. (1997) isolated HERV-H LTRs from monkeys, marmosets and humans.
  • the HERV-W LTRs isolated from T47-D cells are related to the LTR of clone CL6 (Komurian-Pradel, 1999).
  • HERV-LTRs To analyze the promoter activity and the tissue specificity of the isolated HERV-LTRs, these were first cloned into a luciferase reporter plasmid (pBL, Butz, K., DKFZ, Heidelberg). This vector contains the Photinus pyralis luciferase gene fused to the SV40 polyA signal from pBLCAT2 (Hoppe-Seyler et al., 1991).
  • the individual vector constructs were transiently transfected into different cell lines. After 48 hours, the luciferase activity from the cell lysate was measured with the luciferase assay kit from Promega and, after comparing the ⁇ -galactosidase activity or the Renilla luciferase activity, determined as relative luciferase activity.
  • the promoter activities of the LTRs were in epithelial cells (HeLa, HaCaT), fibroblast cells (LC5), T cells (H9, HUT78), glioma cells (85HG66, U373), liver cells (Chang Liver), pancreatic cells (MiaPaCa2, Pand) and breast cancer cell lines (T47 -D, MCF7).
  • the results are shown in Figures 2a - 2f.
  • the HERV-H-H6 LTR therefore has the strongest promoter of all endogenous LTRs examined.
  • the HERV-K LTR from placenta is particularly active in HeLa cells. This LTR is only very weakly active in all other cell lines.
  • HERV-K-T47-D also showed a strong activity in HeLa cells, this LTR was also active in HaCat cells and pancreatic cells.
  • the HERV-L LTR has strong promoter activity in liver cells and is weakly active in T cells and pancreatic cells.
  • the HERV-T-S71A and HERV-E LTRs were not active in any celline tested. So far, no activity of a HERV-LTR has been observed in CML cells.
  • HERV-H LTRs (HERV-H1, HERV-H8, HERV-H13, HERV-H19, HERV-H-H6, Table 3) were almost all active in 85HG66 lines, with HERV-H 1 and HERV-H8 showed the highest activity in this cell line (without figure).
  • HERV-H19 was very active in HeLa cells.
  • the HERV-HCM1 LTR showed the highest promoter activity in all cell lines and was particularly active in lung fibroblasts (LC5) (Fig. 3).
  • Hybrid HERV / MLV vectors were constructed using two MLV-based vectors pLESN-MMTV (Fig. 7) and pLX-MMTV (Fig. 8). These vectors contain the EGFP gene as reporter gene, which is expressed from the 5 'LTR (different, depending on whether before or after the promoter conversion), and a neomycin gene, which is expressed from an SV40 promoter.
  • the vector pLX-MMTV contains a prokaryotic replication original, which allows the provirus to be recloned for further molecular characterization.
  • the MMTV-LTR was replaced by the HERV-HCM1 LTR (Fig. 7).
  • the LTR was first amplified by means of PCR from the vector pBL-HERV-H with specific primers which contained additional sequences for the restriction enzymes Mlul and Sacll. These fragments were then inserted into the 3 ' U3 deleted vectors.
  • the reporter gene EGFP is first expressed from the MLV promoter after transfection into the packaging cell line. (Fig. 9a) After infection of the target cells and successful promoter conversion by reverse transcription in the target lines, the reporter gene is under the transcription control of the HERV LTR.
  • the HERV-Hybrid vector constructs pLESN-HERV-H (Fig. 7) and pLX-HERV-H (Fig.8), as well as the origin vectors pLESN-MMTV and pLX-MMTV were transfected into the amphotrophic packaging cell line PA317.
  • the resulting retroviral vector particles were then used to infect the CrfK and LC5 cell lines.
  • the infected cell lines were cloned and the selected cell clones were examined to determine whether they contained the vector constructs and whether the promoter conversion had taken place.
  • chromosomal DNA was prepared from infected and uninfected cells and analyzed by PCR.
  • the primers were selected from the MLV U3 (P5) and R (P2) region and from the HERV-H region (P1) and used in combination with a primer from the EGFP region for a PCR (Fig. 9a).
  • the PCR products were hybridized with HERV-H specific probes (Fig. 9b).
  • the promoter activity of the HERV LTR in the retroviral vectors was determined after integration into the DNA of the target cells by means of FACS analyzes by measuring the EGFP fluorescence (FIG. 10).
  • the activity of the starting vector pLX-MMTV was compared with the HERV vector pLX-HERV-H (H6) before and after induction with dexamethasone.
  • the vector with the MMTV LTR can be activated by dexamethasone.
  • the HERV LTR vector is not activated by dexamethasone, but it is approximately 10 times more active than the dexamethasone-stimulated MMTV hybrid vector.
  • the presence of R sequences leads to a significant increase in the pro- motor activity (Fig.4a).
  • group 2 LTRs L20 / L49
  • the activity of the HERV promoter is reduced by the R region (FIG. 4b).
  • the HERV-K-T47D promoter (Fig. 5) and the L48 promoter are not significantly influenced by the corresponding R sequences.
  • sequence regions that are located downstream of the U3-R region and include the U5 region, as well as the 3 ′ untranslated region and the beginning of the gag gene have a clear activating effect (Fig. 5).
  • Group 1 LTRs in the R region have a binding site for the transcription factor SP1 that is missing in the Group 2 R region LTR (FIG. 6).
  • the group 2 R region contains a potential binding part for the factor TFS3, which acts as a transcription repressor. This shows that the activity of HERV promoters can be modified by incorporating additional regulatory elements such as transcription factor binding sites, enhancer sequences or negatively regulating elements.
  • Human proviral mRNAs down-regulated in choriocarcinoma encodes zinc finger protein related to Krüppel. Mol. Cell.
  • Patience, C Takeuchi, Y., Cosset, F.-L, Weiss, R.A. (1998). Packaging of endogenous retroviral sequences in retroviral vectors produced by murine and human packaging cells. J. Virol. 72, 2671-2676.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft retrovirale Expressionsvektoren mit zellspezifisch regulierbaren Promotoren. Die Vektoren sind beispielsweise zur zellspezifischen Expression therapeutisch wertvoller Gene im Rahmen einer Gentherapie einsetzbar. Die Erfindung beschreibt retrovirale Expressionsvektoren, enthaltend zumindest die nachfolgenden Elemente in funktioneller Anordnung: a) DNA-Sequenzen zur Verpackung der Vektor-RNA und zur zellspezifischen Expression von Proteinen oder Peptiden, die von heterologen DNA-Nukleotidsequenzen kodiert werden; b) eine oder mehrere für ein Protein oder Peptid kodierende DNA-Nukleotidsequenzen, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenzen zur zellspezifischen Expression eine zellspezifisch regulierbare Promotorregion aus einer humanen endogenen retroviralen DNA-Nukleotidsequenz (HERV) enthalten.

Description

Retrovirale Expressionsvektoren auf der Basis von HERV-LTR-Sequenzen
Die vorliegende Erfindung betrifft retrovirale Expressionsvektoren mit zellspezifisch regulierbaren Promotoren. Die Vektoren sind beispielsweise zur zellspezifischen Expression therapeutisch wertvoller Gene im Rahmen einer Gentherapie einsetzbar.
Retroviren sind RNA-Viren, bei denen die viralen Gene von einem einzelsträngigen RNA- Molekül kodiert werden. Nach Eindringen der Viren in die Zelle wird die virale RNA in ein doppelsträngiges DNA Molekül durch die reverse Transkription umgewandelt. Die DNA dringt in den Kern ein und integriert in das zelluläre Chromosom. Die integrierte virale DNA-Form, das sogenannte Provirus, bildet die Matrize zur Expression der viralen Gene.
Die Integration des viralen Genoms in das zelluläre Chromosom ist ein obligatorischer Teil der viralen Replikation und wird durch viral kodierte Enzyme vermittelt. Es scheint, daß, mit wenigen Ausnahmen, das Vorliegen des retroviralen Genoms in der Zelle, die Expression seiner Gene und die Bildung von Viruspartikeln die Lebensfähigkeit der infizierten Zelle nicht oder kaum beeinträchtigt.
Retroviraier Gentransfer wird dazu benutzt, funktioneile Gene, insbesondere therapeutisch wertvolle Gene, in die Zellen einzuführen, ohne die Proliferationsfähigkeit der Wirtszelle zu beeinflussen. Aufgrund ihres Replikationsmodus eignen sich Retroviren für eine derartigen Gentransfer. In der einfachsten Ausgestaltungsform wird zumindest ein Teil der viralen Gene durch ein Gen von Interesse ersetzt und, unter Zuhilfenahme des effizienten viralen Infektionsprozesses, wird dieses Gen von Interesse in die Zielzelle transferiert.
Retrovirale Vektoren eignen sich deshalb zur Gentherapie, weil die Infektion durch Retroviren hocheffizient verläuft und die retroviralen Vektoren so modifizierbar sind, daß sie heterologe DNA aufnehmen und stabil in das Wirtszellgenom integrieren können. Eine Vielzahl von retroviralen Vektoren wurde in den letzten Jahren entwickelt, und nur beispielsweise wird hier auf die Übersichtsartikei von Günzburg et al. (1996) und Robbins et al. (1998) hingewiesen. Eine mögliche bevorzugte Ausgestaltungsform für retrovirale Vektoren sind sogenannte Pro- Con-Vektoren, die zum ersten Mal in der WO 96/07748 beschrieben wurden. Zur Offenbarung wird vollständig auf diese Druckschrift Bezug genommen.
ProCon-Vektoren tragen heterologe Promotor- und wahlweise weitere Regulationselemente in der 3'LTR, die, nach Infektion, dupliziert und an die 5'LTR in der Zielzelle transloziert werden und die befähigt sind, die Expression von Markergenen oder therapeutischen Genen zu regulieren. Diese heterologen Gene sind nicht direkt mit dem Promotor verbunden, sondern werden in das Innere des Vektors inseriert.
ProCon-Vektoren umfassen einen 5'LTR-Abschnitt der Struktur U3, R, U5 sowie zumindest eine kodierende und/oder nicht-kodierende Sequenz sowie einen 3'LTR-Bereich, der einen vollständig oder teilweise deletierten U3-Abschnitt umfaßt, wobei der deletierte U3-Abschnitt durch eine Polylinker-Sequenz ersetzt wurde, worauf sich der R- und U5-Abschnitt anschließt.
Die Vermehrung dieser Vektoren erfolgt mit Hilfe einer Helferzellinie, die große Mengen der viralen Proteine produziert, die vom Expressionsvektor selbst nicht mehr synthetisiert werden. Die Helferzellinie ist jedoch nicht mehr in der Lage, ein replikationskompetentes Virus zu produzieren. Diese Zellinie wird auch als Verpackungszellinie bezeichnet und umfaßt eine mit mindestens einem zweiten Plasmid transfizierte Zellinie, das diejenigen Gene trägt, die eine Verpackung des modifizierten retroviralen Vektors ermöglichen. Wir verweisen hier z.B. auf die W092/10564, auf die hier vollinhaltlich Bezug genommen wird.
Die für das modifizierte Retrovirus (Expressionsvektor) kodierende DNA wird in die Verpackungszellinie transfiziert. Unter diesen Bedingungen wird das modifizierte retrovirale Genom einschließlich der inserierten therapeutischen Gene bzw. Markergene transkribiert und in die retroviralen Partikel verpackt (rekombinate virale Partikel). Dieses rekombinante Virus wird dann zur Infektion der Zielzellen eingesetzt; das Genom des modifizierten Retrovirus, d.h. des Expressionsvektors, wird in das Genom der Zielzellen integriert, und zwar zusammen mit den Markergenen bzw. den therapeutischen Genen. Eine mit den so erzeugten rekombinan- ten viralen Teilchen infizierte Zelle kann ein neues Vektorvirus nicht mehr produzieren, da in diesen Zellen keine weiteren viralen Proteine mehr vorliegen. Die in die Wirts « zelle integrierte DNA des Expressionsvektors mit den therapeutisch wertvollen Genen bzw. den Markergenen liegt in der zellulären DNA integriert vor und kann nunmehr in der Zelle exprimiert werden.
Therapeutisch wertvolle Gene, die über derartige retrovirale Expressionsvektoren zur Expression gebracht werden, sollen bevorzugt in zell- und gewebespezifischer Form exprimiert werden. Hierzu werden zellspezifische Regulationssequenzen in der LTR-Sequenz des Expressionsvektors eingesetzt. Diese zellspezifischen Regulationssequenzen umfassen beispielsweise zellspezifisch regulierbare Promotorabschnitte, zelispezifische Enhancersequen- zen sowie Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen. Die Promotoren liegen im U3-Abschnitt der LTR.
Zur Zeit werden in retrovirale Vektoren zelluläre Promotorsequenzen oder Promotorsequenzen exogener Retroviren eingesetzt.
Zelluläre Promotoren sind häufig auf zusätzliche Signalstrukturen angewiesen, die in großer Distanz stromaufwärts oder stromabwärts des Promotors liegen können. Es hat sich deshalb immer wieder als schwierig erwiesen, starke, gewebespezifische zelluläre Promotorsequenzen zu isolieren und in retrovirale Vektoren zu klonieren. Promotoren exogener Retroviren haben den Vorteil, daß sie in der retroviralen LTR auf kleinem Raum alle benötigten regulativen Elemente enthalten und daher weitgehend unabhängig von den benachbarten DNA- Sequenzen des Integrationsortes transkribiert werden. Ein schwerwiegender Nachteil ist jedoch, daß sie zwar sehr stark, aber nicht gewebespezifisch sind und in der Regel in allen Zelltypen gleich stark exprimiert werden.
Es ist deshalb eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue retrovirale Expressionsvektoren bereitzustellen, die zwar die Vorteile der retroviralen Promotoren nutzen, alle für die Transkription erforderlichen Signalstrukturen auf engem Raum innerhalb der U3 und R- Region zu konzentrieren, die damit verbundenen Nachteile jedoch vermeiden.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß in retrovirale Expressionsvektoren ein zellspezifisch regulierbarer Promotorabschnitt aus einer humanen endogenen retroviralen DNA-Nukleotidsequenz (HERV) eingesetzt wird. Diese Promotorsequenzen humaner endogener retroviraler Viren liegen bereits in der Wirtszelle vor, und es wurde erfindungs- gemäß gefunden, daß sie sich in hervorragender Weise zur Regulation der zellspezifischen Expression von Markergenen und therapeutisch wertvollen Genen eignen.
Endogene Retroviren (ERV) sind im Genom aller Zellen eines Organismus zu finden. Sie werden vertikal über Keimbahnzellen übertragen und können durch Umwelteinflüsse reaktiviert werden. Das menschliche Genom besteht zu etwa 2% aus endogenen Retroviren und retroviralen Sequenzen, wobei solitäre HERV-LTRs mit 20000 - 40000 Kopien pro Genom vertreten sind (Tab. 1) (Leib-Mösch et al., 1993; Wilkinson et al., 1994, Patience et al., 1997).
Da HERV-Sequenzen bereits vor 30 - 40 Millionen Jahren in das Genom von Primaten integriert sind, kann davon ausgegangen werden, daß im Verlauf der Evolution die meisten pa- thogenen Sequenzen durch Mutationen und Rearrangements aus dem Provirus eliminiert bzw. so verändert wurden, daß sie für den Organismus nicht mehr von Nachteil sind. Retrovirale Vektoren, die aus derartigen Sequenzen konstruiert werden, haben gegenüber Vektoren aus animalen Viren den Vorteil, daß keine neuen viralen Sequenzen in das Genom eingebracht werden müssen. Auch durch Rekombination mit bereits im Genom vorhandenen HERV-Sequenzen können keine neuartigen Retroviren entstehen, wie das z.B. der Fall wäre, wenn Retroviren anderer Spezies als Vektoren eingesetzt werden. Aus diesem Grund kann die Verwendung dieser Sequenzen zur Konstruktion retroviraier Vektoren das Sicherheitsrisiko minimieren. Desweiteren könnten im Genom enthaltene homologe Regionen für eine gewebespezifische Integration der retroviralen Vektoren in bestimme Stellen eines Chromosoms genutzt werden.
HERV-Elemente haben während der Evolution eine Reihe zellulärer Funktionen übernommen. So werden Promotor- und Enhancer-Elemente von HERV-LTRs zur Steuerung der Transkription zellulärer Gene benutzt (Kato et al., Feuchter-Murthy et al., 1993; Di Christofa- no et al., 1995). Ein Beispiel für die Verwendung von LTR-Regulationselementen zur gewebespezifischen Expression eines zellulären Gens ist das Amylase-Gen des Menschen. Dieses Gen wird durch die LTR eines HERV-E Elements kontrolliert und dadurch spezifisch nur in den Speicheldrüsen exprimiert (Ting et al., 1992). Darüber hinaus haben Schulte und Mitarbeiter (1996) gezeigt, daß die Insertion eines endogenen Retrovirus in die 5' nicht transla- tierte Region des Pleiotrophin-Gens für dessen Trophoblasten-spezifische Aktivität verant - wortlich ist (Schulte et al., 1996). In anderen Fällen können polyA-Signale von HERV-LTRs auch dazu dienen, zelluläre Transkripte zu polyadenyiieren (Mager, 1989; Goodchild et al., 1992).
Der große Vorteil beim Einsatz retroviraler Promotoren liegt darin, daß, wie bereits oben ausgeführt, alle für die Transkription erforderlichen Signalstrukturen auf engem Raum innerhalb des U3-Bereichs und des R-Bereichs der LTR lokalisiert sind, da Retroviren möglichst unabhängig von der Umgebung ihres Integrationsortes transkriptionsaktiv bleiben müssen. Da diese HERV-Promotoren seit Millionen Jahren im Primatengenom persistieren, haben sie sich im Laufe der Evolution so angepaßt, daß sie wie zelluläre Promotoren zelltyp-spezifisch aktiv sind, und somit die Vorteile zellulärer und retroviraler Promotoren in sich vereinen.
Die Transkription der HERVs wird von einem klassischen RNA Polymerasell-Promotor aus gestartet (Wilkinson et al., 1994). Dieser Promotor ist innerhalb der LTR-Region lokalisiert. Das HERV-Transkript besteht daher nicht aus der vollständigen Kopie des Provirus. Um den Verlust der Transkriptionskontrollelemente zu kompensieren, haben diese Elemente den Mechanismus der reversen Transkription entwickelt, mit dem die verlorengegangenen Sequenzen an beiden Seiten der Elemente regeneriert werden, woraus wiederum die LTRs entstehen. Neben Promotorsequenzen enthalten HERV-LTRs noch eine Vielzahl verschiedener Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren (Seifarth et al., 1998), die für die Gewebespezifität der Expression verantwortlich sind.
Obwohl eine gewisse strukturelle Ähnlichkeit zwischen HERVs und exogenen animalen Retroviren wie MLV oder MMTV besteht, wurden HERV-Sequenzen und insbesondere Promotoren von HERVs nie als mögliche Kandidaten für die Entwicklung retroviraler Expressionsvektoren in Betracht gezogen. Sie wurden, ganz im Gegeneil, im Zusammenhang mit einer Gentherapie bisher ausschließlich als Störfaktoren betrachtet (Patience et al., 1997). Es wurde befürchtet, daß sie in der Zielzelle durch Rekombinationen aufgrund von Sequenzhomologien mit dem therapeutischen Vektor interferieren könnten. Diese Befürchtungen konnten bislang zwar nicht experimentell bestätigt werden, jedoch mit der Entwicklung sehr effizienter humaner Verpackungszellinien tauchte das Problem des Mitverpackens und der ungewollten Übertragung möglicherweise infektiöser HERV-Sequenzen auf. Daher wurde die mögliche Verpackung exprimierter HERV-Sequenzen in Virionen, die auf MLV basieren, ausführlich untersucht. Patience et al. (1998) identifizierten mRNA-Transkripte mehrerer verschiedener HERV-Familien wie HERV-K und HERV-H in humanen Verpackungszellinien. Jedoch konnten selbst mit einem hochsensitiven RT-PCR Test keine dieser Sequenzen in den von den Zellen freigesetzten MLV- Vektor-Partikeln nachgewiesen werden.
Nach diesen Befunden schien eine Verpackung und Übertragung von HERV-Sequenzen und damit schließlich auch HERV-basierender Vektoren in MLV-Verpackungssystemen ausgeschlossen zu sein. Zwar weisen HERV-Gene eine Sequenzhomologie zu MLV-Genen von 50 - 65 % auf, jedoch besitzen gerade die für die Verpackung und Infektion essentiellen Bereiche, insbesondere das zwischen der 5' LTR und der gag-Region lokalisierte Verpackungssignal und die LTR selbst, keine erkennbare Sequenzhomologie zu den entsprechenden MLV-Sequenzen. Effiziente HERV-Verpackungssysteme hingegen sind zur Zeit ebenfalls nicht vorstellbar, da bislang keine Zellinien bekannt sind, die in ausreichenden Mengen HERV-Partikel produzieren.
Die vorliegende Erfindung löst somit das Problem von retroviralen Expressionsvektoren, die eine zell- und gewebespezifische Expression von Fremdgenen (Gen von Interesse) steuern, dadurch, daß Expressionsvektoren bereitgestellt werden, die, in funktioneller Anordnung, zumindest die nachfolgenden Elemente enthalten:
a) DNA-Sequenzen zur Verpackung der Vektor-RNA und zur zellspezifischen Expression von Proteinen oder Peptiden, die von heterologen DNA-Nukleotidsequenzen kodiert werden,-
b) ein oder mehrere für ein Protein oder Peptid kodierende heterologe DNA- Nukleotidsequenzen (Transkriptionseinheit); die DNA-Sequenzen zur zellspezifischen Expression sind dadurch charakterisiert, daß sie eine zellspezifisch regulierbare Promotorregion umfassen, die aus einem humanen endogenen retroviralen Virus, insbesondere der LTR-Sequenz dieses Virus, stammen;
Der Promotorbereich aus einer HERV-Sequenz kann den gesamten LTR-Bereich des HERV umfassen. In weiteren Ausführungsformen der Erfindung umfaßt der Promotorbereich jedoch nur den U3-Bereich oder den R-U3-Bereich der HERV-LTR. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird neben diesen Bereichen zusätzlich der nicht transla- tierte Bereich zwischen der 5' LTR und den gag-Genen vom Promotorabschnitt mit umfaßt. Erfindungsgemäß wurde nämlich festgestellt, daß auch in diesem Bereich Sequenzen lokalisiert sind, die eine zellspezifische Expression von Proteinen bzw. Peptiden steuern, d.h. für diese zellspezifische Expression zumindest mit verantwortlich sind.
Die Promotoren sind Teilabschnitte der DNA, die für den Start der Transkription der zugeordneten Strukturgene notwendig sind. Der Promotor beinhaltet den Startpunkt der Transkription, die Erkennungs- und Bindungsstelle für die RNA-Polymerase. Der Promotor kann auch weitere Sequenzen umfassen, an die reguiatohsche Proteine binden können und dadurch spezifisch die Initiation der Transkription regulieren. Beispiele für derartige Proteine sind Transkriptionsfaktoren und Repressoren. Beispiele für diese Regulationselemente der Transkriptionsaktivität sind die CAAT-Box, die GC-Box und die TATA-Box. Die Promotoren werden von einer Polymerase des Typs II erkannt.
Die Promotorabschnitte zur zellspezifischen Expression von Fremdproteinen aus HERVs können wahlweise mit weiteren Sequenzen kombiniert werden, die aus exogenen Retroviren stammen und die zellspezifische Expression fördern. Auch eine Kombination mit Regulationssequenzen aus zellulären Genen ist denkbar, um die zellspezifische Expression zu unterstützen.
Der erfindungsgemäße retrovirale Expressionsvektor enthält weiterhin zumindest DNA- Sequenzen zur Verpackung des Vektors durch eine Verpackungs-Helferzellinie. Die DNA- Sequenzen zur Verpackung sind zwischen der 5' LTR und dem gag-Gen lokalisiert. Derartige Verpackungssignale sind in allen retroviralen Vektoren vorhanden und sind dem Fachmann deshalb bekannt. Beispiele für Verpackungssequenzen sind aufgeführt in Mann et al., 1985, sowie Rein, 1994, sowie der dort zitierten Literatur. Auf diese Literatur wird vollinhaltlich Bezug genommen.
Der retrovirale Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung enthält ein oder mehrere Transkriptionseinheiten, die für eine Aminosäuresequenz kodieren. Die Aminosäuresequenz steht für ein Protein oder Peptid. Es können beliebige Sequenzen in den Expressionsvektor inseriert werden, die für ein beliebiges Protein oder Peptid von Interesse kodieren. Derartige Proteine oder Peptide können beispielsweise von Markergenen, therapeutisch wertvollen Genen, antiviral wirkenden Genen, Antitumorgenen und/oder Zytokingenen kodiert werden. Diese Liste ließe sich beliebig ergänzen. Die in den retroviralen Expressionsvektor einsetz- baren Gene sind dem Fachmann bekannt. Die Art der eingesetzten Gene hängt vom Anwendungszweck des erfindungsgemäßen Vektors ab.
Die erfindungemäßen Vektoren können beispielsweise in der Gentherapie eingesetzt werden, um heterologe DNA in Targetzellen zu transferieren, um Krankheiten einer spezifischen Therapie zugänglich zu machen. Die Vektor-DNA wird in die ausgewählten Targetzellen derart eingeführt, daß die heterologe DNA in der Zielzelle exprimiert und das durch die DNA kodierte Produkt produziert wird. Hierunter fallen insbesondere solche Gene zur Expression von Proteinen, die in der Zielzelle nicht oder nicht mehr oder in nicht ausreichender Menge produziert werden, so daß sich ein Krankheitszustand einstellt. Die Erfindung umfaßt nicht nur solche Proteine bzw. Peptide, die natürlicherweise vorkommen, sondern auch solche, die in einer Weise abgeändert wurden, daß ein gewünschter Effekt erreicht wird, beispielsweise eine höhere Aktivität eines Enzyms, die Blockierung der Bindungsstelle von Viren, Zerstörung von Tumorzellen durch Suizidgene usw.
Bei den für ein Protein oder ein Peptid kodierenden DNA-Nukleotidsequenzen handelt es sich im allgemeinen um heterologe DNA, die für RNA und Proteine kodiert, die normalerweise in vivo von der Zelle, in der die Proteine bzw. Peptide exprimiert werden, nicht produziert werden. Sie kann auch als Fremd-DNA bezeichnet werden. Beliebige Proteine, beispielsweise Enzyme, Hormone und Antikörper, fallen hierunter. Die erfindungsgemäß bereitgestellten retroviralen Expressionsvektoren sind deshalb so ausgelegt, daß sie in menschlichen Zellen Proteine von Interesse exprimieren können.
Die erfindungsgemäß eingesetzten Promotorbereiche werden aus HERV-Sequenzen ausgewählt, die aus den bekannten HERV-Familien stammen. Beispiele hierfür sind HERV-K, HERV-H, HERV-E, HERV-L, HERV-T, HERV-R, HERV-I, HERV-P, ERV9, HERV-W.
Selbstverständlich können auch andere, zur Zeit noch nicht bekannte HERV-Familien gesc- reent werden, um noch unbekannte, die zellspezifische Expression steuernde Promotorsequenzen aufzufinden.
Erfindungsgemäß bevorzugte LTR-Sequenzen aus HERVs, die zur gewebespezifischen Expression von Proteinen und Peptiden von Interesse einsetzbar sind, werden im Anhang offenbart. Sie sind in retrovirale Expressionsvektoren einsetzbar, um die erfindungsgemäß gestellte Aufgabe zu lösen. Selbstverständlich können durch an sich bekannte Methoden auch nur Teile dieser LTRs ausgewählt werden, um die in den Vektor eingesetzten Sequenzen so klein wie möglich zu halten. Mit Hilfe verschiedener Deletionsmutanten können die geeigneten Fragmente ausgewählt werden. Auch weitere Abänderungen dieser LTR- Sequenzen sind möglich, z.B. Punktmutationen, Insertionen, Additionen, Austausch mehrerer Nukleotide etc., um die Effizienz der gewebespezifischen Expression zu steigern und an die gewünschte Funktion anzupassen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die eingangs beschriebenen ProCon-Vektoren eingesetzt. Derartige ProCon-Vektoren umfassen einen 5' LTR-Abschnitt der Struktur U3-R-U5, ein oder mehrere Sequenzen, die für ein Protein oder Peptid kodieren, und wahlweise nicht kodierenden Sequenzen, und einen 3' LTR-Abschnitt, umfassend einen teilweise oder vollständig deletierten U3-Abschnitt, wobei der deletierte U3-Abschnitt zumindest die erfindungsgemäß eingesetzten HERV-LTR-Sequenzen umfaßt, gefolgt vom R-U5- Abschnitt. Nähere Einzelheiten sind beispielsweise in der WO96/07748 und der WO96/28564 beschrieben. Auf diese Schriften wird hier vollinhaltlich Bezug genommen.
Erfindungsgemäß wurde eine Strategie entwickelt, um zellspezifisch wirkende Promotorsequenzen aufzuspüren. Diese Strategie wird in der nachfolgenden Beschreibung näher erläutert. Selbstverständlich sind grundsätzlich auch andere Methoden zum Auffinden von zellspezifisch wirksamen HERV-LTR-Sequenzen denkbar und anwendbar. Die Erfindung ist somit nicht auf die nachfolgenden Ausführungsbeispiele beschränkt.
Die erfindungsgemäßen retroviralen Expressionsvektoren sind verpackungsdefizient, d.h. sie sind nicht in der Lage, ohne Hilfe einer Verpackungs-Helferzellinie Viruspartikel zu produzieren. Die Erfindung umfaßt deshalb auch eine retroviraies Vektorsystem, das einen retroviralen Expressionsvektor, wie er in der vorliegenden Erfindung beschrieben wird, und eine Ver- packungszellinie mit zumindest einem retroviralen oder rekombinanten retroviralen Konstrukt enthält, das für die Verpackungsproteine des retroviralen Expressionsvektors kodiert. Derartige Verpackungszellinien sind an sich bekannt und beschrieben. Beispielsweise wird hier auf die murine Verpackungszellinie PA317 (Salier et al., 1998) hingewiesen. Nachfolgend wird die Erfindung zunächst allgemein und dann anhand von Ausführungsbeispielen beschrieben.
Erfindungsgemäß wurde die Eignung humaner endogener Retroviren zur Entwicklung gewebespezifischer Vektoren für die Gentherapie untersucht. Dazu wurde zunächst die Gewebespezifität der HERV pol Transkription in verschiedenen Zellinien wie T-Zellen, Keratinozy- ten und Brustkrebs-Zellen in einem "Reversen Dot Blof'-Verfahren überprüft. Die Expressionsmuster der verschiedenen HERV-Familien erwiesen sich dabei durchwegs als Zelltyp- abhängig. Zur Isolierung der transkriptionsaktiven HERV-LTRs aus verschiedenen Zellinien und Geweben wurden Primer entwickelt, mit denen spezifisch die U3/R-Regionen aus mRNA-Präparationen amplifiziert werden können. Die isolierten LTR-Sequenzen sowie einzelne Vertreter bereits bekannter LTRs wurden in Expressionsvektoren eingebaut. Die Aktivität der LTR-Promotoren wurde nach transienter Transfektion der Reporterplasmide über Luziferaseaktivität bzw. über eGFP-Fluoreszenz in verschiedenen Zellinien getestet. Es zeigte sich, daß die Promotoraktivitäten der einzelnen HERV-LTRs deutlich in Abhängigkeit von der getesteten Zellinie variieren. Die Promotorregion einer HERV-H LTR, die aus Astro- zyten und Leberzellen isoliert worden war und sich in mehreren Versuchen als besonders aktiv in Lungenfibroblastenzellen (LC5) erwiesen hatte, wurden in zwei retrovirale Promotor- konversionsvektoren (pLESN und PLX) eingebaut , in Verpackungszellinien getestet, die Verpackungseffizienz untersucht und überprüft, ob nach Infektion der Zielzellen eine Promotorkonversion stattgefunden hat. Zum Nachweis der Transkriptionsaktivität in den Zielzellen wurden FACS-Analysen durchgeführt.
Es wurde somit eine Methode beschrieben, mit der HERV Promotorsequenzen (U3/R- Region), die eine gewebespezifische Expression vermitteln, identifiziert und isoliert werden können. Die Gewebespezifität und Promotoraktivität dieser Sequenzen wurde dann in einem transienten Transfektions-Assay in verschiedenen humanen Zellinien getestet. Schließlich wurden geeignete Sequenzen ausgewählt, in einen Promotorkonversionsvektor (ProCon- Vektor) kloniert und dabei ihre Eignung zur Konstruktion gewebespezifischer Vektoren für die Gentherapie überprüft. Die Herstellung der erfindungsgemäßen retroviralen Expressionsvektoren erfolgt durch an sich bekannte rekombinante Techniken. Derartige Techniken sind beispielsweise beschrieben in Sambrook et al., 1989, und Perbai, 1984. Zur Konstruk- tion der ProCon-Vektoren wird auf die bereits eingangs erwähnte WO 96/07748 und die damit zussammenhängende Literatur verwiesen.
3. Ergebnisse
3.1 Analyse der HERV-Transkription in unterschiedlichen Zelltypen
Zur Untersuchung der HERV Transkription in unterschiedlichen Zellen wurde im ersten Schritt eine Methode (Reverse Dot-Blot Hybridisierung) eingesetzt, die ursprünglich zum Nachweis der HERV-Expression in mononukleären Zellen des peripheren Bluts entwickelt worden war (Herrmann und Kalden, 1994). Dabei wurden klonierte und charakterisierte HERV po.-Genfragmente aus humaner genomischer DNA auf einer Membran fixiert und mit radioaktiven HERV-po/ Gensonden hybridisiert. Die Sonden wurden mittels RT-PCR aus mRNA verschiedener Zeilen unter Verwendung degenerierter Oligonukleotide amplifiziert, die zu einem hochkonservierten Bereich retroviraler po.-Gene homolog sind (Shih et al., 1989; Donehower et al., 1990). Mit dieser Methode erhielten wir mit jeder bisher untersuchten Zellinie ein charakteristisches Hybridisierungsmuster, was einen ersten Hinweis auf eine gewebespezifische Expression der HERV Elemente darstellte.
3.2 Isolierung von LTR U3-Regionen exprimierter HERVs
Die gewebespezifische Expression eines Retrovirus ist vor allem durch ihre U3-Region festgelegt. In diesem Bereich sind alle regulatorischen Sequenzen wie Promotor, Enhancer und die Bindungsstelien für verschiedene zelluläre Transkriptionsfaktoren lokalisiert. Aus diesem Grund wurden Primer entwickelt, mit denen diese HERV-Sequenzen durch eine RT-PCR aus mRNA unterschiedlicher Zellinien gezielt isoliert werden konnten (Tab. 2; Abb.1). Auf diese Weise wurden ca. 30 verschiedene HERV-LTRs kloniert. Ein Teil dieser Sequenzen wurde in einem Reporterplasmid auf Promotoraktivität und Gewebespezifität getestet.
Im ersten Ansatz wurde für die PCR ein polydT-Primer mit einem Primer kombiniert, der komplementär zum Polypurin Trakt (PPT) der retroviralen RNA ist (Abb.1). Der PPT-Trakt ist eine konservierte Region im nicht translatierten Bereich zwischen dem env Gen und der U3- Region der 3'-LTR. Die PPT-Region wird während der reversen Transkription des Retrovirus als Primerbindungsstelle für die Synthese des Plus-Stranges genutzt (Sorge und Hughes, 1982).
Durch Datenbankanalysen wurden PPT-Sequenzen unterschiedlicher HERV-Familien identifiziert und durch Vergleich ihrer Homologien in verschiedene Gruppen eingeteilt. Aus den Konsensussequenzen der einzelnen Gruppen wurden Oligonukleotide als Primer für die RT- PCR synthetisiert. Die mRNA wurde aus verschiedenen Zellinien präpariert: Epithelzellen (HeLa, HaCaT), Fibroblastenzellen (LC5), T-Zellen (H9, HUT78), Lymphoblasten (CML), Gnomzellen (85HG66, U373), Pancreaszellen (MiaPaCa2, Pand), Leberzellen (Chang Liver) und Brus tkrebszellinien (T47-D, MCF7). Darüber hinaus wurden zusätzlich cDNA Genbanken (Clontech) verschiedener menschlicher Gewebe (Gehirn, Herz, Leber, Niere, Lunge, Pankreas, Plazenta, Skeiettmuskel) für die RT-PCR eingesetzt.
Die erhaltenen Fragmente wurden anschließend kloniert, sequenziert und mittels Datenbankvergleichen analysiert. Von den PCR-Fragmenten, die mit den PPT- und den polydT-Primern erhalten wurden, konnten zwei LTRs über Homologievergleiche der HERV-H und der HERV- K Familie zugeordnet werden. Durch die Verwendung von polydT-Primern in diesen PCR- Ansätzen wurden zahlreiche Sequenzen amplifiziert, die keine Homologien zu bekannten retroviralen LTRs und darüber hinaus auch keine Promotorstrukturelemente enthielten. Aus diesem Grund wurden weitere Sequenzen aus konservierten Bereichen der U3-Region und aus der R-Region von HERV-K und HERV-H Familien zur Primersynthese ausgesucht (Mold et al., 1997), (Abb.1 , Tab.1). Die resultierenden PCR-Produkte wurden nach Auftrennung im Agarosegel auf Nitrozellulosefilter transferiert und mit Sonden hybridisiert, die aus den LTR- Regionen verschiedener HERV-LTRs (HERV-K-pl167, HERV-H-H6, HERV-E, HERV-L) präpariert wurden. Die hybridisierenden Fragmente wurden anschließend in einen Vektor (pZE- RO, Invitrogen) kloniert und sequenziert. Mit dieser Methode konnten verschiedene HERV- LTRs isoliert werden, die in Tabelle 3 aufgelistet sind.
Die HERV-K-LTRs, die aus menschlichem Gehirn und Herzgewebe sowie aus T47-D Zellen isoliert wurden, zeigen sehr hohe Sequenzhomologien zu der 3 'LTR von HERV-K10. Die HERV-H LTRs zeigen dagegen sehr viel höhere Sequenzvariabilitäten. HERV-H31 , HERVHS, HERV-HCM1 , HERV-HCM4, HERV-HMP23 sind homolog zu der von Mager et al. isolierten HERV-H-H6 LTR, die anderen HERV-H Sequenzen zeigen Homologien zu den von Anderssen et al. (1997) isolierten HERV-H LTRs aus Meerkatze, Krallenaffe und Mensch. Die aus T47-D Zellen isolierten HERV-W LTRs sind mit der LTR des Klons CL6 (Komurian- Pradel, 1999) verwandt.
3.3 Analyse der Expression von HERV-Promotoren in einem transienten Luziferase-Assay
Zur Analyse der Promotoraktivität und der Gewebespezifität der isolierten HERV-LTRs wurden diese zunächst in ein Luziferasereporterplasmid (pBL, Butz, K., DKFZ, Heidelberg) kloniert. Dieser Vektor enthält das Photinus pyralis Luziferasegen, fusioniert an das SV40 polyA Signal von pBLCAT2 (Hoppe-Seyler et al., 1991).
Die einzelnen Vektorkonstrukte wurden transient in verschiedene Zellinien transfiziert. Nach 48 h wurde die Luziferaseaktivität aus dem Zellysat mit dem Luziferase-Assay Kit von Pro- mega gemessen und nach Abgleichen der ß-Galaktosidaseaktivität bzw. der Renilla- Luziferaseaktivität als relative Luziferaseaktivität bestimmt. Die Promotoraktivitäten der LTRs wurden in Epithelzellen (HeLa, HaCaT), Fibroblastenzellen (LC5), T-Zellen (H9, HUT78), Gliomzellen (85HG66, U373), Leberzellen (Chang Liver), Pancreaszellen (MiaPaCa2, Pand) und Brustkrebszellinien (T47-D, MCF7) bestimmt.
Die Ergebnisse sind in den Abbildungen 2a - 2f dargestellt. Die HERV-H-H6 LTR besitzt demnach von allen untersuchten endogenen LTRs den stärksten Promotor. Die HERV-K LTR aus Plazenta ist in HeLa-Zellen besonders aktiv. In allen anderen Zellinien ist diese LTR nur sehr schwach aktiv. Ebenfalls eine starke Aktivität in HeLa Zellen zeigte HERV-K-T47-D, diese LTR war auch in HaCat-Zellen und Pankreaszellen aktiv. Die HERV-L LTR besitzt in Leberzellen eine starke Promotoraktivität und ist in T-Zellen und Pankreaszellen schwach aktiv. Die HERV-T-S71A und HERV-E LTRs waren in keiner getesteten Zelline aktiv. Ebenso konnte bisher keinerlei Aktivität einer HERV-LTR in CML-Zellen beobachtet werden.
Die klonierten HERV-H LTRs (HERV-H1 , HERV-H8, HERV-H13, HERV-H19, HERV-H-H6, Tab. 3) waren fast alle in 85HG66 Zeilen aktiv, wobei HERV-H 1 und HERV-H8 in dieserZel- linie die höchste Aktivität zeigten (ohne Abb). HERV-H19 war in HeLa-Zellen sehr aktiv. Die HERV-HCM1 LTR zeigte in allen Zellinien die höchste Promotoraktivität und war besonders in Lungenfibroblasten (LC5) aktiv (Abb. 3).
3.4 Konstruktion von HERV-Hybrid-Vektoren und Überprüfung der Aktivitäten von HERV- Promotoren in diesen Vektoren
Die Funktionsfähigkeit menschlicher endogener retroviraler LTR Sequenzen in retroviralen Vektoren wurde in zwei unterschiedlichen Promotorkonversionsvektoren (ProCon) ausgetestet. Dazu wurden hybride HERV/MLV Vektoren unter Verwendung zweier auf MLV basierender Vektoren pLESN-MMTV (Abb. 7) und pLX-MMTV (Abb. 8) konstruiert. Diese Vektoren enthalten das EGFP Gen als Reportergen, das von der 5' LTR (unterschiedlich, je nachdem ob vor oder nach der Promotorkonversion) aus exprimiert wird, sowie ein Neomycingen, das von einem SV40 Promotor aus exprimiert wird. Darüberhinaus enthält der Vektor pLX-MMTV einen prokaryotischen Replikationsorigin, der die Reklonierung des Provirus für weitere molekulare Charakterisierungen erlaubt.
Zur Konstruktion der HERV-Hybrid Vektoren wurde jeweils die MMTV-LTR durch die HERV- HCM1 LTR ersetzt (Abb. 7). Dazu wurde die LTR zunächst mittels PCR aus dem VektorpBL- HERV-H mit spezifischen Primern amplifiziert, die zusätzliche Sequenzen für die Restriktionsenzyme Mlul und Sacll enthielten. Diese Fragmente wurden anschließend in die 3'U3 deletierten Vektoren eingebaut. Das Reportergen EGFP wird nach der Transfektion in die Verpackungszellinie zunächst vom MLV Promotor aus exprimiert. (Abb 9a) Nach Infektion der Zielzellen und erfolgreicher Promotorkonversion durch die reverse Transkription in den Zielzeilen liegt das Reportergen unter der Transkriptionskontrolle der HERV LTR vor.
Die HERV-Hybrid Vektorkonstrukte pLESN-HERV-H (Abb. 7) und pLX-HERV-H (Abb.8), sowie die Ursprungsvektoren pLESN-MMTV und pLX-MMTV wurden in die amphotrophe Verpackungszellinie PA317 transfiziert. Die resultierenden retroviralen Vektorpartikel wurden anschließend benutzt, um die Zellinien CrfK und LC5 zu infizieren.
Die infizierten Zellinien wurden kloniert und die selektionierten Zeilklone daraufhin untersucht, ob sie die Vektorkonstrukte enthielten und ob die Promotorkonversion stattgefunden hatte. Dazu wurde aus infizierten und nicht infizierten Zellen chromosomale DNA präpariert und mittels PCR analysiert. Die Primer wurden aus der MLV U3 (P5) und R (P2) Region sowie aus der HERV-H Region (P1) ausgesucht und in Kombination mit einem Primer aus der EGFP Region für eine PCR eingesetzt (Abb. 9a). Die PCR-Produkte wurden mit HERV-H spezifischen Sonden hybridisiert (Abb. 9b). Dabei ergab die DNA, die mit den pLX HERV-H Partikeln infiziert wurden, nach Amplifikation mit den Primern P1 und P3 ein PCR Produkt von 1 ,1 kb, das mit der HERV-H-Sonde hybridisierte. Die Amplifikation mit den MLV U3 spezifischen Primern (P2/P3) ergab mit DNA von Zellen, die mitpLX und mit pLX HERV-H infiziert waren, PCR Produkte mit einer Größe von etwa 900 bp, die nicht mit der HERV-H Sonde hybridisierten. Aus der Amplifikation mit den MLV R Primern (P5/P3) wurde kein PCR- Produkt erhalten, das mit der HERV-H Sonde hybridisierte. Diese Ergebnisse zeigen, daß eine Promotorkonversion stattgefunden hat und der MLV Promotor der 5'LTR durch den HERV-Promotor ersetzt worden war.
Die Promotoraktivität der HERV LTR in den retroviralen Vektoren wurde nach Integration in die DNA der Zielzellen mittels FACS-Analysen über die Messung der EGFP Fluoreszenz bestimmt (Abb. 10). Die Aktivität des Ausgangsvektors pLX-MMTV wurde dabei mit dem HERV-Vektor pLX-HERV-H (H6) vor und nach Induktion mit Dexamethason verglichen. Der Vektor mit der MMTV LTR ist durch Dexamethason aktivierbar. Der Vektor mit der HERV LTR wird durch Dexamethason nicht aktiviert, er ist jedoch um etwa den Faktor 10 aktiver als der Dexamethason-stimmulierte MMTV-Hybrid-Vektor.
3.5 Einfluß von Regulationseiementen in R- und U5-Region auf die Promotoraktivität von HERV-Sequenzen.
Um auszutesten, welcher Sequenzbereich für einen funktionsfähigen HERV-Promotor erforderlich ist, wurde an einigen Beispielen der Einfluß von zusätzlichen LTR-Sequenzen, die außerhalb der U3-Region in der LTR lokalisiert sind, untersucht. Dazu wurde von 7 HERV-K LTRs (HERV-K-T47D, L5, L50, L8, L9, L48 und L20/49) die Aktivität der U3-Region mit der Aktivität der entsprechenden U3-R-Fragmente im Luziferase-Assay verglichen. Überraschenderweise zeigte sich, daß die verschiedenen R-Regionen den Promotor in der U3-Region sehr unterschiedlich beeinflussen können. Bei LTRs der Gruppe 1 (L5, L50, L8, L9) führt die Anwesenheit von R-Sequenzen in allen getesteten Zellinien zu einem deutlichen Anstieg der Pro- motoraktivität (Abb. 4a). Bei LTRs der Gruppe 2 (L20/L49) hingegen wird die Aktivität des HERV-Promotors durch die R-Region reduziert (Abb. 4b). Der HERV-K-T47D-Promotor (Abb. 5) und der L48-Promotor (ohne Abbildung) werden durch die entsprechenden R-Sequenzen nicht wesentlich beeinflußt. Interessanterweise haben jedoch im Falle der HERV-K-T47D-LTR Sequenzbereiche, die downstream der U3-R-Region lokalisiert sind und die U5-Region, sowie den 3' nicht transla tierten Bereich und den Beginn des gag-Gens umfassen, einen deutlich aktivierenden Effekt (Abb. 5).
Die Sequenzanalyse der verschiedenen getesteten R-Regionen zeigte, daß LTRs der Gruppe 1 in der R-Region eine Bindungsstelle für den Transkriptionsfaktor SP1 aufweisen, die in der R-Region der Gruppe 2 LTR fehlt (Abb. 6). Dagegen enthält die Gruppe 2 R-Region eine potentielle Bindungssteile für den Faktor TFS3, der als Transkriptionsrepressor wirkt. Dies zeigt, daß die Aktivität von HERV-Promotoren durch den Einbau zusätzlicher Regulationselemente wie Transkriptionsfaktorbindungsstellen, Enhancer-Sequenzen oder negativ regulierende Elemente modifiziert werden kann.
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Claims

Patentansprüche
1. Retroviraler Expressionsvektor, enthaltend zumindest die nachfolgenden Elemente in funktioneller Anordnung:
a) DNA-Sequenzen zur Verpackung der Vektor-RNA und zur zellspezifischen Expression von Proteinen oder Peptiden, die von heterologen DNA-Nukleotidsequenzen kodiert werden; b) ein oder mehrere für ein Protein oder Peptid kodierende DNA-Nukleotidsequenzen,
dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenzen zur zellspezifischen Expression eine zellspezifisch regulierbare Promotorregion aus einer humanen endogenen retroviralen DNA-Nukleotid- sequenz (HERV) enthalten.
2. Expressionsvektor nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenzen zur zellspezifischen Expression aus dem LTR-Bereich und wahlweise dem nicht translatierten Bereich zwischen der 5' LTR und dem gag- Bereich von HERVs stammen.
2. Vektor nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der gesamte LTR-Bereich, der U3-Bereich oder der R- und U3-Bereich aus einer humanen endogenen retroviralen Nukleotidsequenz stammt.
3. Vektor nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die für ein oder mehrere Proteine oder Peptide kodierende Nukleotidsequenzen ausgewählt werden aus einem oder mehreren Elementen der Gruppe, bestehend aus Markergenen, therapeutischen Genen, antiviralen Genen, Antitumorgenen und Zyto- kingenen.
. Vektor nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die zellspezifisch regulierbare Promotorregion aus dem LTR-Bereich einer zell- spezifisch exprimierten endogenen humanen retroviralen Nukleotidsequenz stammt.
5. Vektor nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die humanen endogenen retroviralen zeilspezifisch regulierbaren Promotorsequenzen ausgewählt werden aus einem oder mehreren Promotorsequenzen von HERV-Familien der Gruppe, bestehend aus HERV-K, HERV-H, HERV-E, HERV-L, HERV-T, HERV-R, HERV-I, HERV-P, ERV9. HERV-W.
6. Vektor nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Promotorregion neben der TATA-Box weitere Erkennungs- und Bindungsstellen für regulatorische Proteine umfaßt.
7. Vektor nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkennungs- und Bindungsstellen für regulatorische Proteine die GC-Box, die CAAT-Box, Enhancersequenzen und Repressorsequenzen sowie Hormon-re- sponsible Sequenzmotive umfassen und daß wahlweise zusätzlich Erkennungs- und Bindungsstellen für regulatorische Proteine aus der LTR-Region exogener Retroviren und/oder aus zellulären Genen enthalten sind.
8. Vektor nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor ein Promotor-Konversionsvektor ist, umfassend einen 5' LTR-Abschnitt der Struktur U3-R-U5, ein oder mehrere Sequenzen, ausgewählt aus kodierenden und nicht kodierenden Sequenzen, und einen 3' LTR-Abschnitt, umfassend einen teilweise oder vollständig deletierten U3-Abschnitt, wobei der deletierte US- Abschnitt durch eine zellspezifisch regulierbare Promotorregion aus einer HERV- LTR-Sequenz ersetzt ist, gefolgt vom R-U5-Abschnitt.
. mRNA oder RNA eines retroviralen Expressionsvektors nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche.
10. Prokaryontenzeile oder Eukaryontenzelle, enthaltend einen retroviralen Expressionsvektor nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche.
11. Eukaryontenzelle, enthaltend einen retroviralen Expressionsvektor nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche in integrierter Form.
12. Verwendung eines zellspezifisch regulierbaren Promotorabschnitts aus einer humanen endogenen retroviralen DNA-Nukleotidsequenz zur Steuerung der Expression von Fremdgenen in retroviralen Expressionsvektoren, bevorzugt ProCon-Vektoren.
13. Verwendung eines Expressionsvektors nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche zur Expression von Fremdgenen in der Gentherapie.
14. Virion, enthaltend eine retrovirale Expressionsvektor-RNA, abgeleitet von einer Expressionsvektor-DNA nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche.
15. Verfahren zur Herstellung eines Virions nach Anspruch 15 zum Einführen einer oder mehreren für ein Protein oder Peptid kodierender Nukleotidsequenzen, dadurch gekennzeichnet, daß der retrovirale Expressionsvektor nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche in eine geeignete Verpackungszellinie unter solchen Bedingungen eingebracht wird, daß das Virion ausgebildet wird und von der Verpakungszellinie freigesetzt wird.
16. Verfahren zum Einführen von Nukleotidsequenzen, die für ein oder mehrere Proteine oder Peptide kodieren, in eine Eukaryontenzelle, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle mit einem Virion nach Anspruch 15 unter solchen Bedingungen infiziert wird, daß die für das Protein oder Peptid kodierende Nukleotidsequenzen in die chro- mosomale DNA der Eukaryontenzelle inseriert wird.
17. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Eukaryontenzelle eine Säugerzelle ist.
18. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Säugerzelle eine menschliche Zelle ist.
19. Retrovirales Vektorsystem, umfassend einen retroviralen Expressionsvektor nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche und eine Verpackungszeliinie mit zumindest einem retroviralen oder rekombinanten retroviralen Konstrukt, das für die Verpackungsproteine des retroviralen Expressionsvektors kodiert.
20. Retrovirales Vektorsystem nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Verpackungszeliinie retrovirale oder rekombinante retrovirale Konstrukte enthält, die für solche retroviralen Proteine kodieren, die vom retroviralen Expressionsvektor nicht kodiert werden.
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