WO2000062061A1 - Vorrichtung und verfahren zur verwendung bei der durchführung von rezeptor-ligand- und affinitätstests - Google Patents

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    • B01L3/0231—Pipettes, i.e. with only one conduit for withdrawing and redistributing liquids of the plunger pump type having several coaxial pistons

Definitions

  • the invention relates to methods and an apparatus which can be used when performing receptor ligand and affinity tests, e.g. Fluorescence or enzyme immunoassays can be used, which may result in applications in medical diagnostics, environmental and food analysis.
  • receptor ligand and affinity tests e.g. Fluorescence or enzyme immunoassays can be used, which may result in applications in medical diagnostics, environmental and food analysis.
  • analyte-specific antibodies are immobilized on the wall of a test tube.
  • the antibodies are immobilized on magnetic particles.
  • complex washing and pipetting steps are required, which on the one hand are highly error-prone and generally do not have to be carried out directly at the actual examination site, but rather in laboratories with relatively great effort.
  • this aspect is particularly important in environmental analysis important, since the substances to be analyzed in the collected samples should be examined very easily, in a short time, with little work and instrumental effort and little error.
  • the device according to the invention which can be used for carrying out fluorescence or enzyme immunoassays, essentially consists of three individual parts.
  • a hollow piston is received and guided in a hollow cylinder, an opening for the entry of a sample being provided in the hollow cylinder, so that the device according to the invention is essentially designed like a conventional syringe.
  • a sealing plate which is sealed for a wide variety of fluids is arranged on the end face, which points into the interior of the hollow cylinder, the sealing plate being arranged and guided so as to be translationally movable within the hollow piston.
  • the end face of the hollow piston which has already been mentioned, is porous as a separating layer, a conventional frit as known from column chromatography, but also a membrane, can be used for this.
  • Particles can be present in a space which is formed within the hollow cylinder, between the inner wall of the hollow cylinder and the hollow piston. The particles are selected so that their grain size prevents them from penetrating the porous separation layer.
  • porous separating layer which is used as the end face for a hollow piston or another porous separating layer, which is at the inlet opening for the
  • Sample can be arranged in the hollow cylinder, can advantageously be selected so that they e.g. can retain cellular components of a whole blood sample and a blood plasma obtained in this way can be used as a sample without additional preparation steps.
  • the opening formed in the hollow cylinder can be temporarily closed, for which purpose an appropriately designed plug, which can be pushed onto the opening if necessary and then closes, can be used.
  • a check valve which is arranged in or at the opening.
  • Sampling in preparation for the test actually to be carried out can be carried out in such a way that a relative movement between the hollow cylinder and the hollow piston is carried out with the opening of the hollow cylinder open and the sample taken through the opening into the space in which the particles can be contained becomes.
  • the corresponding relative movement of the hollow piston and hollow cylinder can be fixed one of the two parts and corresponding movement of the other or by moving both parts can be achieved. It is particularly advantageous if there are appropriate end stops on the hollow piston and / or hollow cylinder or on a manipulation unit producing the relative movement, such as a corresponding automatic machine, so that in any case a defined sample volume is taken up in the device according to the invention.
  • Antigens or antibodies are present, either the respective antigens or antibodies being labeled with a suitable fluorophore or enzyme.
  • either antigen or antibody can be reversible on the inner wall of the hollow cylinder and the other partner can be immobilized on the surface of the particles. If the sample is now sucked into the device according to the invention, antigens or antibodies are detached from the inner wall by the sample and bind to one another.
  • the unlabeled or marked biocomponents can also be bound to the porous separating layer which is arranged on the end face of the hollow piston, with a combination also binding to the inner wall of the hollow cylinder, the porous
  • Separating layer and on the particles may be possible. Different partners can also be bound to the inner wall, the particles or the separating layer in order to carry out a test on at least two different analytes of a sample. Following this, an opposite relative movement of the hollow piston and the hollow cylinder is carried out with the opening of the hollow cylinder closed, at the same time a certain part of the sample volume reaching the interior of the hollow piston through the porous separating layer. The sample volume now located inside the hollow piston is covered by the sealing plate and a space containing a specific sample volume is formed between the porous separating layer and the sealing plate.
  • the device according to the invention can be evaluated quantitatively with the correspondingly prepared sample.
  • light with at least one fluorescence-exciting wavelength, corresponding to the fluorophore (s) used is directed onto the sample prepared in the space between the porous separating layer and sealing plate within the hollow bulb and the intensity of the fluorescent light is measured with a corresponding optical detector, whereby Known measurement methods can be used for this.
  • light sources come e.g. monochromatic light emitting lasers are used.
  • Mixed light can also be used using appropriate filters.
  • filters can also be arranged in front of the optical detector in order to at least reduce the influence of stray light.
  • the hollow cylinder and the hollow piston can in Entirely made of a transparent material for the light used. Alternatively, however, only corresponding windows for the irradiation of the prepared sample and the detection of the fluorescent light can also be formed.
  • the most diverse known assay formats such as competitive, titration, displacement and sandwich assays for the most diverse receptor-ligand systems, such as e.g. Antibody-
  • Antigen, lectin carbohydrate, DNA or RNA complementary nucleic acid, DNA or RNA protein, hormone receptor, enzyme-enzyme cofactors, protein G or protein A immunoglobin or avidin-biotin can be carried out.
  • the respective analyte concentration can be determined directly proportional and inversely proportional in sandwich immunoassays.
  • the invention also makes it possible to carry out competitive assays for high-molecular analytes.
  • body fluids can be immediately, i.e. can be examined without additional preparatory steps and pre-treatment measures.
  • the fluorophores are replaced by enzymes as marking substances.
  • the corresponding enzyme-specific substrate and, if appropriate, suitable buffer substances for conditioning the sample are deposited in advance on the underside of the sealing plate received in the hollow piston. If, as already described when carrying out fluorescence immunoassays, the corresponding sample is sucked into the sample according to the invention and then subsequently partially introduced through the porous separating layer into the space between the porous separating layer and the sealing plate within the hollow bulb, a colorimetric evaluation can be carried out in a time-resolved manner . On the one hand, there is the possibility of measuring the intensity of a wavelength that is typical of the color change that is caused accordingly.
  • various receptor ligand or affinity tests such as fluorescence immunoassays or enzyme immunoassays, can also be carried out in such a way that, through a relative movement of the hollow cylinder and hollow piston, a defined sample volume through the opening into the space which increases in accordance with the relative movement Hollow cylinder is sucked.
  • at least one analyte contained in the sample can displace the one of a receptor-ligand system labeled with a fluorophore or enzyme.
  • the fluorophore- or enzyme-labeled partner (s) can be bound to the particles and / or the porous separating layer, whereby in addition to covalent bonds, e.g. adsorptive or affinity bonds can also be considered.
  • the sample prepared in this way is then closed again by closing the opening of the hollow cylinder and by the relative movement of the hollow cylinder and hollow piston through the porous separating layer into the correspondingly increasing space between the porous ones Separating layer and the sealing plate inside the hollow bulb and the corresponding evaluation by means of fluorescence or colorimetric measurement can then be carried out.
  • the device according to the invention can furthermore be designed such that a hollow cylinder is used which has two chambers, in each of which a correspondingly designed hollow piston, which is preferably independent of one another relative to the chambers of the
  • Hollow cylinders can be moved are introduced. As a result, at least one separate analyte can be determined in each chamber of such a hollow cylinder.
  • markings with a plurality of fluorophores or enzymes can also be carried out, so that a multi-analyte determination is possible.
  • markings with a plurality of fluorophores or enzymes can also be carried out, so that a multi-analyte determination is possible.
  • Figure 1 shows the schematic structure of an example of a device according to the invention, before the actual sampling and sample preparation;
  • FIG. 2 shows a part of the preliminary direction in an enlarged view
  • Figures 3a and 3b is a schematic representation of the inclusion of a sample in the device according to Figures 1 and 2;
  • 3c shows the transfer of part of the sample volume into a space formed in the interior of the hollow piston
  • Figure 3d is a schematic representation of the actual measurement in a fluorescence immunoassay
  • FIG. 4a and 4b an example of a device according to the invention supplemented with a rod-shaped element.
  • FIG. 1 A possible example of a device according to the invention is shown schematically in FIG. It can be clearly seen how a hollow piston 2 is guided into the interior of a hollow cylinder 3, the play between the hollow piston outer wall and the hollow cylinder inner wall being kept relatively small, on the one hand to largely rule out tilting errors and on the other hand to achieve a certain degree of sealing.
  • an opening 8 is formed on its outer end face, through which, as will be described below, the sample can reach the interior of the device.
  • the hollow piston 2 is designed here in such a way that its end face pointing into the interior of the hollow cylinder 3 is designed as a porous separating layer 5.
  • the porous separating layer 5 can consist of plastic, plastic mixtures, glass, ceramic or metal.
  • a sealing plate 4 is arranged in the interior of the hollow piston 2, lying directly on the porous separating layer 5 before the sample is taken and the measurement is carried out.
  • the sealing plate 4 consists of a material that is sealed for liquids and gases. It is dimensioned and designed so that it can be moved in translation inside the hollow piston 2 along its longitudinal axis.
  • At least one pressure compensation opening 1 is provided on the hollow piston 2, which enables gas to enter or exit the hollow piston 2.
  • particles 6 are present in the hollow cylinder 3 in the space between the end face of the hollow piston 2, the particle size of which is selected such that they cannot penetrate the porous separating layer 5.
  • Polymers preferably crosslinked, are used as particle materials.
  • the opening 8 can be closed for a safe inclusion of the particles 6 in the hollow cylinder 3 by means of a further porous separating layer as a frit, a filter or a membrane, through which the respective sample can easily get into the hollow cylinder 3.
  • a further porous separating layer as a frit, a filter or a membrane
  • sealing plate 4 is also provided with a circumferential seal 9, which prevents sample liquid from getting into the space above the sealing element 4 of the hollow piston 2.
  • the thickness of the sealing plate 4 can be chosen accordingly, taking into account the free cross section inside the hollow piston 2.
  • guide elements can also be formed on the upper side of the sealing plate 4, which preferably rest in a radially symmetrical arrangement on the inner wall of the hollow piston 2 for guiding the sealing plate 4 with a corresponding translatory movement.
  • FIG. 2 also shows more clearly that 6 analyte-specific antibodies are bound to the different particles.
  • the corresponding antigens 7 are reversibly bound to the inner wall of the hollow cylinder 3, as is indicated in FIG. 3a. It stands in this form the device according to the invention for recording and preparing a corresponding sample is available. Either the antibody or the antigen 7 is labeled with an appropriately suitable fluorophore for carrying out fluorescence immunoassays or with a corresponding enzyme for carrying out enzyme immunoassays.
  • opening 8 of the device according to the invention is immersed in a container containing a corresponding sample and, by moving the hollow piston 2 as indicated by the arrow, the volume of the space 14 inside the hollow cylinder 3 can be moved in the vertical direction enlarged and the sample can be taken into this space, since the sealing plate 4 forms a liquid and gas-tight seal.
  • the inner wall of the hollow cylinder 3 is released and the fluorophor-labeled antigens 7 can move freely within the liquid sample.
  • a precisely defined sample volume can be sucked out of the container into the device according to the invention, that is to say into the space 14, by adhering to a certain predetermined path which the hollow piston 2 covers in the example shown here become.
  • the opening 8 of the hollow cylinder 3 can be closed with a stopper 13 and after an analyte-specific predetermined time has elapsed, the sole movement of the hollow piston 2 or the starting position can be restored by a corresponding relative movement of the hollow piston 2 and the hollow cylinder 3, part of the sample volume passing through the porous separating layer 5 into the interior of the hollow piston 2, i.e. into a space 11 between the porous separating layer 5 and the sealing plate 4, and being kept locked there .
  • the sample within the space 11 is irradiated from one side with a suitable light source and fluorescence is excited.
  • the intensity of the fluorescent light can be measured with an optical detector 12 arranged diametrically to the light source and the respective analyte quantity can be deduced from the corresponding measurement signals.
  • the entire device including the sample can be disposed of safely after the measurement has been carried out.
  • an internal standardization can also be carried out.
  • a first measurement of a fluorescence intensity is carried out when the sample has been sucked up via the opening 8 into the space 14 within the hollow cylinder 3, as shown in FIG. 3b.
  • light with at least one wavelength is used with the fluorescence of the Detected fluorophores can be excited, directed and the fluorescence intensity detected with a suitable optical detector.
  • the fluorescence intensity measured in this way can then subsequently be compared with and / or related to the fluorescence intensities which, as has been shown and described in FIG. 3d, have been recorded.
  • the measurement accuracy can be increased in a simple manner and the measurement effort required can be increased only insignificantly.
  • FIGS. 4a and 4b show an example of a device according to the invention modified with a rod-shaped element 15.
  • the rod-shaped element 15 aligned parallel to the longitudinal axis of the hollow cylinder 2 is connected to the sealing plate 4, so that the sealing plate 4 can be forcibly moved in translation by means of the rod-shaped element 15.
  • the rod-shaped element 15 should be led out of the hollow piston 2 in order to ensure that it can be handled.
  • FIG. 4a shows the starting position of all elements before the actual sample acquisition.
  • the sample then, with the opening 8 open, by means of a corresponding relative movement of the hollow cylinder 3 and the hollow piston 2 into the space 14, in which particles with a partner of a receptor-ligand system bound to them and reversibly on the wall of the Hollow cylinder 3 bound enzyme-labeled other partners of the receptor-ligand system are located.
  • the analyte in the sample now binds to the two mentioned Partner and forms a so-called "sandwich".
  • the sample After a corresponding incubation period, the sample, together with the excess unbound components, is pressed out of the space 14 through the opening 8 by means of pressure on the rod-shaped element 15 by the opposite relative movement of the hollow cylinder 3 and the hollow piston 2, the sealing plate 4 always being in contact with the porous one Separating layer 5 remains and therefore no liquid can pass through the latter.
  • substrate solution By appropriate relative movement of the hollow cylinder 3 and hollow piston 2 substrate solution is now taken up through opening 8 in room 14.
  • the enzyme bound to one of the partners of the receptor-ligand system sets the colorless substrate (eg tetramethylbenzidine / H 2 0 2 in the case of peroxidase or p-aminophenyl phosphate in the
  • a rinsing step can be switched on between the steps described above.
  • the procedure can also be such that the enzyme-labeled antibody (partner of a receptor li gand-Systems) is not already reversibly bound to the wall of the hollow cylinder, but is taken up separately into the device after the incubation of the sample with the partner bound to the particles and pressing out of the sample.
  • the receptor-ligand system has a sandwich structure, antibody-analyte-antibody with additional enzyme, and can be bound to particles.

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Verwendung bei der Durchführung von Rezeptor-Ligand- und Affinitätstests. Hierzu wird ein Hohlkolben und ein Hohlzylinder aus zumindest teilweise für Licht transparentem Material verwendet. Der Hohlkolben weist an seiner Stirnfläche eine poröse Trennschicht auf, die im Inneren des Hohlkolbens mit einer Gas- und Flüssigkeitsdichtplatte abgedeckt ist. Diese Dichtplatte (4) ist so ausgebildet, dass sie im Inneren des Hohlkolbens translatorisch bewegbar ist und bei entsprechender Relativbewegung von Hohlkolben und Dichtplatte eine vorbereitete Probe aus dem Hohlzylinder in einen Raum zwischen poröser Trennschicht und Dichtplatte gelangt. Im Nachgang hierzu kann dann beispielsweise ein Fluoreszenzimmun- oder Enzymimmuntest der Probe durchgeführt werden.

Description

Vorrichtung und Verfahren zur Verwendung bei der Durchführung von Rezeptor-Ligand- und Affinitätstests
Die Erfindung betrifft Verfahren und eine Vorrichtung, die bei der Durchführung von Rezeptor-Ligand- und Affinitätstests, z.B. Fluoreszenz- oder Enzymimmuntests verwendet werden kann, wobei sich mögliche Applikationen in der medizinischen Diagnostik, der Umwelt- und Lebensmittelanalytik ergeben können.
Insbesondere in der Umwelt- und Lebensmittelanalytik können solche Tests bisher lediglich für sogenannte Screeningmethoden eingesetzt werden, bei denen jedoch keine konkrete Aussage bezüglich einer einzigen Probe getroffen werden kann und lediglich der Analyseaufwand vorab entsprechend eingeschränkt werden kann. Die mit solchen Tests erhaltenen Aussagen sind bisher offiziell noch nicht anerkannt und können demzufolge auch nicht als klare Beweisaussage verwendet werden.
Bei den bekannten Methoden für solche quantitativen bzw. semiquantitativen Tests werden sogenannte Fest- phasenimmunoassays durchgeführt. Bei einem solchen
Test, nämlich dem sogenannten Dioxin-Assay der Firma CAPE werden analytspezifische Antikörper an der Wand eines Teströhrchens immobilisiert. Bei dem sogenannten BTEX rapid assay der Firma Coring Systems erfolgt die Immobilisierung der Antikörper an magnetische Partikel. In beiden Fällen sind jedoch aufwendige Wasch- und Pipettierschritte erforderlich, die zum einen stark fehlerbehaftet sind und in der Regel auch nicht unmittelbar am eigentlichen Untersuchungsort, sondern in Labors mit relativ hohem Aufwand durchgeführt werden müssen.
Dieser Aspekt ist aber gerade in der Umweltanalytik von Bedeutung, da die in gesammelten Proben zu analysierenden Stoffe sehr einfach, in kurzer Zeit, mit geringem Arbeits- und instrumenteilen Aufwand und geringem Fehler untersucht werden sollen.
Es ist daher Aufgabe der Erfindung, eine Möglichkeit vorzuschlagen, mit der verschiedene Proben in sehr einfacher Form und mit geringem Zeitaufwand vorbereitet und analysiert werden können.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungs- formen und Weiterbildungen der Erfindung, ergeben sich mit den in den untergeordneten Ansprüchen ent- haltenen Merkmalen.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung, die zur Verwendung bei der Durchführung von Fluoreszenz- oder Enzymimmuntests eingesetzt werden kann, besteht dabei im wesentlichen aus drei Einzelteilen. Dabei ist in einem Hohlzylinder ein Hohlkolben aufgenommen und geführt, wobei im Hohlzylinder eine Öffnung für den Eintritt einer Probe vorhanden ist, so daß die erfindungsgemäße Vorrichtung im wesentlichen, wie eine herkömmliche Spritze ausgebildet ist. Im Inneren des Hohlkolbens ist eine für die verschiedensten Fluide dichte Dichtplatte auf der Stirnfläche, die in das Innere des Hohlzylinders zeigt, angeordnet, wobei die Dichtplatte innerhalb des Hohlkolbens translatorisch bewegbar angeordnet und geführt ist. Die bereits erwähnte Stirnfläche des Hohlkolbens ist porös als Trennschicht ausgebildet, wobei hierfür eine herkömmliche Fritte, wie sie aus der Säulenchromatographie bekannt ist, aber auch eine Membran, verwendet werden kann . In einem Raum, der innerhalb des Hohlzylinders , zwischen Hohlzylinderinnenwandung und Hohlkolben ausgebildet ist, können Partikel vorhanden sein. Die Partikel sind hierfür so ausgewählt, daß ihre Korngröße verhindert, daß sie die poröse Trennschicht durchdringen können.
Die poröse Trennschicht, die als Stirnfläche für einen Hohlkolben verwendet wird bzw. eine andere poröse Trennschicht, die an der Eintrittsöffnung für die
Probe in den Hohlzylinder angeordnet sein kann, kann vorteilhaft so ausgewählt werden, daß sie z.B. zelluläre Bestandteile einer Vollblutprobe zurückhalten kann und ein so erhaltenes Blutplasma, ohne zusätzli- ehe Vorbereitungsschritte als Probe verwendet werden kann.
Bei der Probennahme und Probenvorbereitung ist es auch wichtig, daß die im Hohlzylinder ausgebildete Öffnung temporär verschlossen werden kann, wobei hierfür ein entsprechend ausgebildeter Stopfen, der bei Bedarf auf die Öffnung geschoben werden kann und diese dann verschließt, einsetzbar ist. Eine andere Alternative hierzu besteht in der Verwendung eines Rückschlagventiles, das in bzw. an der Öffnung angeordnet ist .
Die Probennahme in Vorbereitung des eigentlich durchzuführenden Tests kann in der Weise erfolgen, daß eine Relativbewegung zwischen Hohlzylinder und Hohl- kolben, bei geöffneter Öffnung des Hohlzylinders durchgeführt wird und die Probe durch die Öffnung in den Raum, in dem die Partikel enthalten sein können, aufgenommen wird. Die entsprechende Relativbewegung von Hohlkolben und Hohlzylinder kann durch Fixierung eines der beiden Teile und entsprechende Bewegung des jeweils anderen oder durch Bewegung beider Teile erreicht werden. Dabei ist es besonders günstig, wenn entsprechende Endanschläge am Hohlkolben und/oder Hohlzylinder oder an einer die Relativbewegung erzeugenden Manipulationseinheit, wie einem entsprechenden Automaten vorhanden sind, so daß in jedem Falle ein definiertes Probenvolumen in die erfindungsgemäße Vorrichtung aufgenommen wird.
Für die Durchführung von Fluoreszenzimmuntests sind in dem Raum, in dem die Partikel angeordnet sind, z.B. Antigene oder Antikörper vorhanden, wobei entweder die jeweiligen Antigene bzw. Antikörper mit einem geeigneten Fluorophor oder Enzym markiert sind.
Vor dem Einsaugen der Probe in die erfindungsgemäße Vorrichtung können entweder Antigen oder Antikörper an der Innenwandung des Hohlzylinders reversibel und der jeweils andere Partner an der Oberfläche der Partikel immobilisiert sein. Wird nun die Probe in die erfindungsgemäße Vorrichtung eingesaugt, werden Antigene bzw. Antikörper durch die Probe von der Innenwandung gelöst und binden aneinander an.
Die Bindung der unmarkierten oder markierten Biokomponenten kann aber auch an der porösen Trennschicht, die an der Stirnfläche des Hohlkolbens angeordnet ist, erfolgen, wobei auch eine Kombination Bindung an der Innenwandung des Hohlzylinders, der porösen
Trennschicht und auf den Partikeln möglich sein kann. Es können auch jeweils unterschiedliche Partner an der Innenwandung, den Partikeln bzw. der Trennschicht gebunden sein, um mindestens an zwei verschiedenen Analyten einer Probe einen Test durchzuführen. Im Anschluß hieran wird bei geschlossener Öffnung des Hohlzylinders eine entgegengesetzte Relativbewegung von Hohlkolben und Hohlzylinder durchgeführt, wobei gleichzeitig ein bestimmter Teil des Probenvolumens durch die poröse Trennschicht in das Innere des Hohl- kolbens gelangt. Dabei wird das nunmehr sich im Inneren des Hohlkolbens befindliche Probenvolumen von der Dichtplatte abgedeckt und zwischen poröser Trennschicht und Dichtplatte ein ein bestimmtes Probenvo- lumen enthaltender Raum gebildet.
Im Nachgang hierzu kann die erfindungsgemäße Vorrichtung mit der entsprechend vorbereiteten Probe analyt- spezifisch quantitativ ausgewertet werden. Hierfür wird Licht mit mindestens einer fluoreszenzanregenden Wellenlänge, entsprechend dem/den verwendeten Fluoro- phor(en) auf die im Raum zwischen poröser Trennschicht und Dichtplatte innerhalb des Hohlkolbens vorbereitete Probe gerichtet und mit einem entspre- chenden optischen Detektor die Intensität des Fluoreszenzlichtes gemessen, wobei auf hierfür bekannte Meßverfahren zurückgegriffen werden kann. Als Lichtquellen kommen z.B. monochromatisches Licht sendende Laser zum Einsatz. Es kann aber auch Mischlicht unter Verwendung entsprechender Filter eingesetzt werden. Solche Filter können auch vor dem optischen Detektor angeordnet werden, um den Streulichteinfluß zumindest zu verringern.
Günstig kann es außerdem sein, die optische Auswertung innerhalb eines, ansonsten geschlossenen Gehäuses durchzuführen, um Fremdlichteinflüsse auszuschließen.
Der Hohlzylinder und der Hohlkolben können dabei in Gänze aus einem für das verwendete Licht transparenten Material bestehen. Alternativ können hierfür aber auch lediglich entsprechende Fenster für die Bestrahlung der vorbereiteten Probe und die Detektion des Fluoreszenzlichtes ausgebildet sein.
Mit der Erfindung können die verschiedensten bekannten Assayformate, wie kompetitive, - Titrations-, Ver- drängungs- und Sandwich-Assays für die verschieden- sten Rezeptor-Ligand-Systeme, wie z.B. Antikörper-
Antigen, Lectin-Kohlenhydrat , DNA oder RNA komplementäre Nukleinsäure, DNA- oder RNA-Protein, Hormon-Rezeptor, Enzym-Enzymcofaktoren, Protein G oder Protein A-Immunoglobin oder Avidin-Biotin durchgeführt wer- den. Dabei kann die jeweilige Analytkonzentration direkt proportional und bei Sandwich- Immunoassays umgekehrt proportional bestimmt werden. Mit der Erfindung besteht auch die Möglichkeit der Durchführung kompetitiver Assays für hochmolekulare Analyte .
Werden für die Markierung Fluorophore, die im nahen Infrarotbereich angeregt werden können, verwendet, können Körperflüssigkeiten unmittelbar, d.h. ohne zusätzliche Vorbereitungsschritte und Vorbehandlungs- maßnahmen untersucht werden.
Wird die erfindungsgemäße Vorrichtung für die Durchführung von Enzymimmunotests verwendet, treten an die Stelle der Fluorophore Enzyme als Markierungsstoffe. In diesem Falle kann es günstig sein, wenn das entsprechende enzymspezifische Substrat und gegebenenfalls geeignete Puffersubstanzen für eine Konditio- nierung der Probe vorab an der Unterseite der im Hohlkolben aufgenommenen Dichtplatte deponiert sind. Wird nun die entsprechende Probe, wie bereits bei der Durchführung von Fluoreszenzimmuntests beschrieben, in die erfindungsgemäße Probe aufgesaugt und dann nachfolgend teilweise durch die poröse Trennschicht in den Raum zwischen poröser Trennschicht und Dicht- platte innerhalb des Hohlkolbens eingeführt, kann eine colorimetrische Auswertung zeitaufgelöst durchgeführt werden. Hierfür besteht zum einen die Möglichkeit, die Intensität einer für den entsprechend hervorgerufenen Farbumschlag typischen Wellenlänge zeitaufgelöst zu messen.
Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung können auch verschiedene Rezeptor-Ligand- oder Affinitätstests, als Fluoreszenzimmuntests bzw. Enzymimmuntests so durchgeführt werden, daß wieder durch eine Relativbewegung von Hohlzylinder und Hohlkolben ein definiertes Probenvolumen durch die Öffnung in den sich entsprechend der Relativbewegung vergrößernden Raum in- nerhalb des Hohlzylinders gesaugt wird. Dabei kann mindestens ein in der Probe enthaltener Analyt abhängig von seiner Konzentration den mit einem fluoro- phor- bzw. enzymmarkierten Partner eines Rezeptor- Ligand-Systems verdrängen. Der bzw. die fluorophor- bzw. enzymmarkierte Partner kann/können an den Partikeln und/oder der porösen Trennschicht gebunden sein, wobei hierfür neben kovalenten Bindungen, z.B. auch adsorptive oder Affinitätsbindungen in Frage kommen können .
Die so vorbereitete Probe wird dann wieder nach Verschließen der Öffnung des Hohlzylinders und durch entgegengesetzte Relativbewegung von Hohlzylinder und Hohlkolben durch die poröse Trennschicht in den sich entsprechend vergrößernden Raum zwischen poröser Trennschicht und der Dichtplatte innerhalb des Hohl- kolbens geführt und die entsprechende Auswertung mittels Fluoreszenz bzw. colorimetrischer Messung kann dann durchgeführt werden.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann weiterhin so ausgeführt werden, daß ein Hohlzylinder verwendet wird, der zwei Kammern aufweist, in denen jeweils ein entsprechend ausgebildeter Hohlkolben, die bevorzugt unabhängig voneinander relativ zu den Kammern des
Hohlzylinders bewegt werden können, eingeführt sind. Dadurch kann in jeder Kammer eines solchen Hohlzylinders mindestens ein gesonderter Analyt bestimmt werden.
Bei einer solchen Ausführungsform, wie auch bei der mit einfach ausgebildetem Hohlzylinder und Hohlkolben können auch Markierungen mit mehreren Fluorophoren bzw. Enzymen vorgenommen werden, daß eine Multiana- lytbestimmung möglich ist. Bei Verwendung mehrerer verschiedener Fluorophore sollten solche verwendet werden, deren Immisions- bzw. Anregungswellenlängen sich gegeneinander nicht beeinflussen.
Nachfolgend soll die Erfindung beispielhaft beschrieben werden.
Dabei zeigen:
Figur 1 den schematischen Aufbau eines Beispiels einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, vor der eigentlichen Probennahme und Probenaufbereitung;
Figur 2 einen Teil der in Figur 1 gezeigten Vor- richtung in vergrößerter Darstellung;
Figur 3a und 3b eine schematische Darstellung der Aufnahme einer Probe in die Vorrichtung gemäß Figuren 1 und 2 ;
Figur 3c die Überführung eines Teiles des Probenvolumens in einen im Inneren des Hohlkolbens ausgebildeten Raum;
Figur 3d eine schematische Darstellung der eigentlichen Messung bei einem Fluoreszenzimmuntests und
Figur 4a und 4b ein mit einem stabförmigen Element ergänztes Beispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung.
In der Figur 1 ist ein mögliches Beispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung schematisch dargestellt. Dabei ist deutlich erkennbar, wie ein Hohlkolben 2 in das Innere eines Hohlzylinders 3 geführt ist, wobei das Spiel zwischen Hohlkolbenaußenwandung und Hohl- zylinderinnenwandung relativ klein gehalten ist, um zum einen Kippfehler weitestgehend auszuschließen und zum anderen ein gewisses Maß an Abdichtung zu erreichen.
Im Hohlzylinder 3 ist an seiner äußeren Stirnfläche eine Öffnung 8 ausgebildet, durch die, wie nachfolgend noch zu beschreiben sein wird, die Probe in das Innere der Vorrichtung gelangen kann. Der Hohlkolben 2 ist dabei hier so ausgeführt, daß seine in das Innere des Hohlzylinders 3 weisende Stirnfläche, als poröse Trennschicht 5 ausgebildet ist. Die poröse Trennschicht 5 kann aus Kunststoff, KunstStoffmischungen, Glas, Keramik oder Metall bestehen.
Oberhalb der porösen Trennschicht 5 ist im Inneren des Hohlkolbens 2 eine Dichtplatte 4, vor der Proben- aufnähme und der Durchführung der Messung unmittelbar auf der porösen Trennschicht 5 aufliegend, angeordnet. Die Dichtplatte 4 besteht aus einem für Flüssigkeiten und Gase dichtem Material . Sie ist dabei so dimensioniert und ausgebildet, daß sie im Inneren des Hohlkolbens 2 entlang seiner Längsachse translatorisch bewegt werden kann.
Am Hohlkolben 2 ist mindestens eine Druckausgleichsöffnung 1 vorhanden, die einen Gasein- oder Austritt in bzw. aus dem Hohlkolben 2 ermöglicht.
Im Hohlzylinder 3 sind bei diesem Beispiel in dem Raum zwischen der Stirnfläche des Hohlkolbens 2 Partikel 6 vorhanden, deren Korngröße so gewählt ist, daß sie die poröse Trennschicht 5 nicht durchdringen können. Es können z.B. Polymere, bevorzugt quervernetzte als Partikelmaterialien verwendet werden.
In nicht dargestellter Form, kann die Öffnung 8 für einen sicheren Einschluß der Partikel 6 im Hohlzylinder 3 mittels einer weiteren porösen Trennschicht als Fritte, ein Filter oder einer Membran verschlossen sein, durch die die jeweilige Probe jedoch ohne weiteres in den Hohlzylinder 3 gelangen kann. In Figur 2 ist deutlich erkennbar, daß an der äußeren Mantelfläche des Hohlkolbens 2, im Bereich der porösen Trennschicht 5 umlaufende Dichtelemente 10 vorhanden sind, die verhindern, daß Probenflüssigkeit in den Spalt zwischen Hohlkolben 2 und Hohlzylinder 3 gelangen und mit denen der nötige Unterdruck zum Aufsaugen der Probe erzeugt werden kann.
Außerdem ist deutlicher dargestellt, daß auch die Dichtplatte 4 mit einer umlaufenden Dichtung 9 versehen ist, die verhindert, daß Probenflüssigkeit in den Raum, oberhalb des Dichtelementes 4 des Hohlkolbens 2 gelangen kann.
Um ein Verkanten der Dichtplatte 4, bei einer translatorischen Bewegung entlang der Längsachse des Hohl- kolbens 2 zu verhindern, kann die Dicke der Dicht- platte 4 unter Berücksichtigung des freien Querschnittes im Inneren des Hohlkolbens 2 entsprechend gewählt werden.
Um den gleichen Effekt zu erreichen, können aber auch, hier nicht dargestellte Führungselemente an der Oberseite der Dichtplatte 4 ausgebildet sein, die sich bevorzugt in radialsymmetrischer Anordnung an der Innenwandung des Hohlkolbens 2 zur Führung der Dichtplatte 4 bei einer entsprechenden translatorischen Bewegung anliegen.
In der Figur 2 ist außerdem deutlicher dargestellt, daß an den verschiedenen Partikeln 6 analytspezifische Antikörper gebunden sind. In nicht dargestellter Form sind die entsprechenden Antigene 7, reversibel an der Innenwandung des Hohlzylinders 3 gebunden, wie dies in Figur 3a angedeutet ist. In dieser Form steht die erfindungsgemäße Vorrichtung für die Aufnahme und Vorbereitung einer entsprechenden Probe zur Verfügung. Dabei ist entweder der Antikörper oder das An- tigen 7 mit einem entsprechend geeigneten Fluorophor, für die Durchführung von Fluoreszenzimmuntests oder mit einem entsprechenden Enzym für die Durchführung von Enzymimmuntests markiert.
Wie dies in Figur 3a erkennbar ist, wird Öffnung 8 der erfindungsgemäßen Vorrichtung in ein eine entsprechende Probe enthaltendes Behältnis eingetaucht und es kann durch Bewegung des Hohlkolbens 2 , wie mit dem Pfeil bezeichnet, in vertikaler Richtung das Volumen des Raumes 14 im Inneren des Hohlzylinders 3 vergrößert und die Probe in diesen Raum aufgenommen werden, da die Dichtplatte 4 ein flüssigkeits- und gasdichten Abschluß bildet.
Im Nachgang hierzu, werden, wie dies in Figur 3b an- gedeutet ist, die Bindungen der Antigene 7 an der
Innenwandung des Hohlzylinders 3 gelöst und die hier fluorophormarkierten Antigene 7 können sich frei innerhalb der flüssigen Probe bewegen.
Wie bereits im allgemeinen Teil der Beschreibung erwähnt, kann durch Einhaltung eines bestimmten vorgegebenen Weges, den, bei dem hier gezeigten Beispiel, der Hohlkolben 2 zurücklegt, ein exakt definiertes Probenvolumen aus dem Behältnis in die erfindungsge- mäße Vorrichtung, also in den Raum 14 gesaugt werden.
Im Anschluß hieran kann die Öffnung 8 des Hohlzylinders 3 mit einem Stopfen 13 verschlossen werden und nach Ablauf einer analytspezifisch vorgebbaren Zeit kann durch alleinige Bewegung des Hohlkolbens 2 oder durch entsprechende Relativbewegung von Hohlkolben 2 und Hohlzylinder 3 die Ausgangsposition wieder hergestellt werden, wobei ein Teil des Probenvolumens durch die poröse Trennschicht 5 in das Innere des Hohlkolbens 2, also in einen Raum 11 zwischen poröser Trennschicht 5 und Dichtplatte 4 gelangt und dort eingeschlossen gehalten wird.
In dieser Form kann die eigentliche Auswertung des Fluoreszenzimmuntests, wie dies in Figur 3d schematisch dargestellt ist, durchgeführt werden.
Hierzu wird die Probe innerhalb des Raumes 11 mit einer geeigneten Lichtquelle von einer Seite be- strahlt und Fluoreszenz angeregt. Die Intensität des Fluoreszenzlichtes kann mit einem diametral zur Lichtquelle angeordneten optischen Detektor 12 gemessen und aus den entsprechenden Meßsignalen auf die jeweilige Analytquantität geschlossen werden.
Da die Probe innerhalb der erfindungsgemäßen Vorrichtung durch den Stopfen 13 und mittels der Dichtplatte 4 sowie Hohlkolben 2 und Hohlzylinder 3 allseitig eingeschlossen ist, kann die gesamte Vorrichtung ein- schließlich der Probe im Nachgang zur durchgeführten Messung ohne weiteres, gefahrlos entsorgt werden.
Bei der Durchführung von Fluoreszenzimmuntests kann zusätzlich eine interne Standardisierung durchgeführt werden. Hierzu wird eine erste Messung einer Fluoreszenzintensität durchgeführt, wenn die Probe über die Öffnung 8 in den Raum 14, innerhalb des Hohlzylinders 3 aufgesaugt worden ist, wie dies in Figur 3b dargestellt ist. Hierzu wird Licht, mit mindestens einer Wellenlänge, mit der Fluoreszenz des bzw. der verwen- deten Fluorophore angeregt werden kann, gerichtet und die Fluoreszenzintensität mit einem geeigneten optischen Detektor erfaßt.
Die so gemessene Fluoreszenzintensität kann dann im Nachgang mit der bzw. den Fluoreszenzintensitäten verglichen und/oder ins Verhältnis zueinander gesetzt werden, die, wie dies in Figur 3d dargestellt und beschrieben worden ist, erfaßt worden sind. Dadurch kann auf einfache Weise die Meßgenauigkeit erhöht und der erforderliche Meßaufwand nur unwesentlich vergrößert werden .
In den Figuren 4a und 4b ist ein mit einem stabförmi- gen Element 15 modifiziertes Beispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung gezeigt . Dabei ist das parallel zur Längsachse des Hohlzylinders 2 ausgerichtete stabförmige Element 15 mit der Dichtplatte 4 verbunden, so daß die Dichtplatte 4 mit Hilfe des stabförmigen Elementes 15 zwangsweise translatorisch bewegt werden kann. Hierfür sollte das stabförmige Element 15 aus den Hohlkolben 2 herausgeführt sein, um die Handhabbarkeit zu gewährleisten.
In der Figur 4a ist die Ausgangsposition sämtlicher Elemente vor der eigentlichen Probenaufnahme dargestellt. Die Probe gelangt dann, wie bereits mehrfach beschrieben, bei geöffneter Öffnung 8 durch entsprechende Relativbewegung von Hohlzylinder 3 und Hohl- kolben 2 in den Raum 14, in dem sich Partikel mit daran gebundenem Partner eines Rezeptor-Ligand- Systems und reversibel an die Wandung des Hohlzylinders 3 gebundene enzymmarkierte andere Partner des Rezeptor-Ligand-Systems befinden. Der in der Probe befindliche Analyt bindet nun an die beiden erwähnten Partner und bildet einen sogenannten "Sandwich". Nach einer entsprechenden Inkubationszeit wird die Probe mitsamt den überschüssigen ungebundenen Komponenten durch entgegengesetzte Relativbewegung von Hohlzylin- der 3 und Hohlkolben 2 mittels Druck auf das stabförmige Element 15 durch die Öffnung 8 aus dem Raum 14 gedrückt, wobei die Dichtplatte 4 stets in Kontakt mit der porösen Trennschicht 5 bleibt und somit keine Flüssigkeit durch letztere hindurchtreten kann. Durch entsprechende Relativbewegung von Hohlzylinder 3 und Hohlkolben 2 wird nun Substratlösung durch Öffnung 8 in Raum 14 aufgenommen. Das an einen der Partner des Rezeptor-Ligand-Systems gebundene Enzym setzt das farblose Substrat (z.B. Tetramethylbenzidin/H202 im Falle von Peroxidase oder p-Aminophenylphosphat im
Falle von Alkalischer Phosphatase) zum gefärbten Produkt um. Nach einer entsprechenden Inkubationszeit wird durch entgegengesetzte Relativbewegung von Hohlzylinder 3 und Hohlkolben 2 bei geschlossener Öffnung 8 die Substratlösung durch die poröse Trennschicht 5 in den Raum 11, der sich durch Zurückweichen von Dichtplatte 4 bildet, gedrückt (stabförmiges Element 15 ist in diesem Fall frei beweglich) . Hierdurch wird die Enzymreaktion gestoppt, da Enzym und Substrat nun räumlich voneinander getrennt vorliegen, und die Absorption der im Raum 11 befindlichen Substratlösung kann in einem Photometer gemessen werden (Endpunkt- bestimmung) . Ein solches Vorgehen ist insbesondere für Chemilumineszenz-Assays oder Enzymimmunoassays geeignet
Zwischen den oben beschriebenen Schritten kann jeweils ein Spülschritt eingeschaltet werden.
Es kann aber auch so verfahren werden, dass der en- zymmarkierte Antikörper (Partner eines Rezeptor-Li- gand-Systems) nicht bereits reversibel an der Wand des Hohlzylinders gebunden vorliegt, sondern gesondert nach der Inkubation der Probe mit dem an die Partikel gebundenen Partner und Herausdrücken der Probe, in die Vorrichtung aufgenommen wird. Das Re- zeptor-Ligand-System hat nach erfolgter Inkubation einen Sandwich-Aufbau Antikörper-Analyt-Antikörper mit zusätzlichem Enzym und kann an Partikel gebunden sein.
Es können aber auch an sich bekannte kompetitive Assay-Formate mit zusätzlichem Enzym in dieser Form bzw. auch Titrationsassays durchgeführt werden.

Claims

Patentansprüche
1. Vorrichtung zur Verwendung bei der Durchführung von Rezeptor-Ligand- und Affinitätstests, bei der ein Hohlkolben (2) aus zumindest teilweise für Licht transparenten Material in einem mit einer temporär verschließbaren Öffnung (8) versehenen Hohlzylinder (3), der ebenfalls zu- mindest teilweise aus einem für Licht transparenten Material besteht, aufgenommen und geführt ist;
die in das Innere des Hohlzylinders (3) weisende Stirnfläche des Hohlkolbens (2) aus einer porösen Trennschicht (5) besteht; und
im Hohlkolben (2) parallel zur porösen Trennschicht (5) eine gas- und flüssigkeitsdichte, innerhalb des Hohlkolbens (2) translatorisch bewegbare Dichtplatte (4) angeordnet ist.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß innerhalb des Hohlzylinders (3) in einem Raum (14) zwischen
Hohlzylinder (3) und Hohlkolben (2) Partikel (6) vorhanden sind, deren Korngröße so gewählt ist, daß sie die poröse Trennschicht (5) nicht durchdringen können.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2 , d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß die Öffnung (8) des Hohlzylinders (3) mittels eines Verschlußes (13) oder eines Rück- schlagventiles verschließbar ist.
4. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2 , dadurch gekennzeichnet, daß die Dichtplatte (4) eine außen umlaufende Dichtung (9) aufweist.
5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Dichtplatte (4) in Bezug zur lichten Weite innerhalb des Hohl- kolbens (2) eine Dicke aufweist, die ein Verkanten bei einer translatorischen Bewegung inner- halb des Hohlkolbens (2) verhindert.
6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß an der Dichtplatte
(4), ein Verkanten der Dichtplatte (4) bei einer translatorischen Bewegung innerhalb des Hohlkolbens (2) verhindernde, Führungselemente angeordnet sind.
7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Hohlkolben (2) an seiner äußeren Mantelfläche im Bereich seiner in das Innere des Hohlzylinders (3) weisenden Stirnseite umlaufende Dichtungselemente (10) aufweist .
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß am Hohlkolben (2) mindestens eine Druckausgleichsöffnung (1) vorhanden ist .
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Partikel (6) aus Polymeren bestehen.
10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß an den Partikeln (6) ein Partner eines Rezeptor-Ligand-Systems gebunden ist.
11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die poröse Fritte
(5) aus Kunststoff, Kunststofflegierungen, Glas, Keramik oder Metall besteht.
12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß am Hohlzylinder (3) und/oder am Hohlkolben (2) Wegbegrenzungsanschläge vorhanden sind.
13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Öffnung (8) mittels einer weiteren Fritte, einer Membran oder eines Filters verschlossen ist.
14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Dichtplatte (4) mit einem parallel zur Längsachse des Hohlkolbens (2) ausgerichteten stabförmigem Element (15) verbunden ist.
15. Verfahren zur Durchführung von Rezeptor-Ligand- oder Affinitätstests, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß durch Bewegung eines Hohlzylinders (3) und eines Hohlkolbens (2) relativ zueinander ein definiertes Probenvolumen durch eine Öffnung (8) im Hohlzylinder (3) in einen sich entsprechend der Relativbewegung vergrößernden Raum (14) ge- saugt, mindestens ein fluorophor-markierter Partner eines Rezeptor-Ligand-Systems, der an der Innenwandung des Hohlzylinders (3) und/oder der porösen Trennschicht (5) reversibel immobilisiert ist, in der Probe gelöst wird;
der jeweilige Partner abhängig von der Konzentration des Analyten in der Probe und gemäß dem gewählten Testformat teilweise mit dem anderen Partner des Rezeptor-Ligand-Systems, der an Partikel (6) und/oder eine poröse Trennschicht (5) gebunden ist, reagiert,
bei verschlossener Öffnung (8) des Hohlzylinders (3) durch entgegengesetzte Relativbewegung von
Hohlzylinder (3) und Hohlkolben (2) ein Teil der so vorbereiteten Probe aus dem Raum (14) durch die poröse Trennschicht (5) in einen sich entsprechend dem jeweiligen Probenvolumen vergrö- ßernden Raum (11) innerhalb des Hohlkolbens (2) zwischen poröser Trennschicht (5) und eine Dichtplatte (4) gelangt;
und die Probe im Raum (11) von außen mit Licht einer fluoreszenzanregenden Wellenlänge des verwendeten Fluorophors bestrahlt und die Fluoreszenzintensität mit einem Detektor (12) gemessen wird.
16. Verfahren zur Durchführung von Rezeptor-Ligand- oder Affinitätstests, dadurch gekennzeichnet, daß durch Relativbewegung eines Hohlzylinders (3) und eines Hohlkolbens (2) ein definiertes Probenvolumen durch eine Öffnung (8) im Hohlzylinder (3) in einen sich entsprechend der Relativbewegung vergrößernden Raum (14) gesaugt,
mindestens ein in der Probe enthaltener Analyt abhängig von seiner Konzentration den fluoro- phormarkierten Partner eines Rezeptor-Ligand- Systems, der aufgrund seiner Affinität an den anderen Partner dieses Systems, der an Partikel (6) und/oder eine poröse Trennschicht (5) gebun- den ist, verdrängt;
und bei verschlossener Öffnung (8) des Hohlzylinders (3) durch entgegengesetzte Relativbewegung von Hohlzylinder (3) und Hohlkolben (2) ein Teil der so vorbereiteten Probe aus dem Raum
(14) durch die poröse Trennschicht (5) in einen sich entsprechend dem jeweiligen Probenvolumen vergrößernden Raum (11) innerhalb des Hohlkolbens (2) zwischen poröser Trennschicht (5) und eine Dichtplatte (4) gelangt;
und die Probe im Raum (11) von außen mit Licht einer fluoreszenzanregenden Wellenlänge des verwendeten Fluorophors bestrahlt und die Fluores- zenzintensität mit einem Detektor (12) gemessen wird.
17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß die im Raum (14) aufgenommene Probe von außen mit Licht einer fluoreszenzanregenden Wellenlänge des verwendeten Fluorophors bestrahlt, die Fluoreszenzintensität gemessen und die so gemessene Fluoreszenz - intensität mit der im Nachgang gemessenen Fluo- reszenzintensität der beeinflußten Probe, die im Raum (11) gemessen worden ist, verglichen und/- oder ins Verhältnis gesetzt wird.
18. Verfahren zur Durchführung von Rezeptor-Ligand- oder Affinitätsimmuntests, dadurch gekennzeichnet, daß durch Relativbewegung eines Hohlzylinders (3) und eines Hohlkolbens (2) ein definiertes Probenvolumen durch eine Öffnung (8) im Hohlzylinder (3) in einen sich entsprechend der Relativbewegung vergrößernden Raum (14) gesaugt,
mindestens ein enzymmarkierter Partner eines Rezeptor-Ligand-Systems, der an der Innenwandung des Hohlzylinders (3) und/oder einer porösen
Trennschicht (5) reversibel immobilisiert ist, in der Probe gelöst wird;
dieser Partner abhängig von der Konzentration des Analyten in der Probe und gemäß dem gewählten Testformat teilweise mit dem jeweils anderen Partner des Rezeptor-Ligand-Systems, der an Partikel (6) und/oder eine poröse Trennschicht (5) gebunden ist, reagiert,
bei verschlossener Öffnung (8) des Hohlzylinders (3) durch entgegengesetzte Relativbewegung von Hohlzylinder (3) und Hohlkolben (2) ein Teil der so vorbereiteten Probe aus dem Raum (14) durch die poröse Trennschicht (5) in einen sich entsprechend dem jeweiligen Probenvolumen vergrößernden Raum (11) innerhalb des Hohlkolbens (2) zwischen poröser Trennschicht (5) und eine Dichtplatte (4) gelangt und danach die Probe innerhalb des Raumes (11) einer zeitaufgelösten colorimetrischen Messung unterzogen wird.
19. Verfahren zur Durchführung von Rezeptor-Ligand- oder Affinitätstests, dadurch gekennzeichnet, daß durch Relativbewegung eines Hohlzylinders (3) und eines Hohlkolbens (2) ein definiertes Probenvolumen durch eine Öffnung (8) im Hohlzylinder (3) in einen sich entsprechend der Relativbewegung vergrößernden Raum (14) gesaugt,
mindestens ein in der Probe enthaltener Analyt abhängig von seiner Konzentration den enzymmarkierten Partner eines Rezeptor-Ligand-Systems, der aufgrund seiner Affinität an den anderen, an Partikel (6) und/oder eine poröse Trennschicht (5) gebundenen Partner dieses Systems gebunden ist, verdrängt,
bei verschlossener Öffnung (8) des Hohlzylinders (3) durch entgegengesetzte Relativbewegung von Hohlzylinder (3) und Hohlkolben (2) ein Teil der so vorbereiteten Probe aus dem Raum (14) durch die poröse Trennschicht (5) in einen sich entsprechend dem jeweiligen Probenvolumen vergrößernden Raum (11) innerhalb des Hohlkolbens (2) zwischen poröser Trennschicht (5) und eine Dichtplatte (4) gelangt
und danach die Probe innerhalb des Raumes (11) einer zeitaufgelösten colorimetrischen Messung unterzogen wird.
0. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass durch Bewegung eines stabförmigen Elementes (15), bei mittels Dichtplatte (4) einseitig verschlossener poröser Trennschicht (5) die Probe durch die Öffnung (8) aus dem Raum (14) verdrängt;
anschließend durch Relativebewegung von Hohlzylinder (3) und Hohlkolben (2) eine Substratlö- sung durch die Öffnung (8) in den Raum (14) aufgenommen und nach einer Umsetzung eines an ein Rezeptor-Ligand-Systems gebundenen Enzyms durch entgegengesetzte Relativbewegung von Hohlzylinder (3) und Hohlkolben (2) bei geschlossener Öffnung (8) Substratlösung durch die poröse
Trennschicht (5) in den Raum (11) gedrückt und eine Verfärbung der Substratlösung colorime- trisch gemessen wird.
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