WO2001007618A1

WO2001007618A1 - Homeobox genes encoding proteins participating in differentiation

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Publication number: WO2001007618A1
Application number: PCT/JP2000/004904
Authority: WO
Inventors: Tatsuo Kakimoto
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Ltd
Priority date: 1999-07-22
Filing date: 2000-07-21
Publication date: 2001-02-01
Anticipated expiration: 2002-01-22
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Description

分化に関わる蛋白質をコードするホメオボックス遺伝子

発明の分野

本発明は分化に関わりホメォドメイン様配列を持つ蛋白質をコ一ドする遺伝子に関する。具体的には、本発明は不定芽 · 分枝誘導能を有し、ホメォドメイン様配列を持つ蛋白質をコードする遺伝子明

ならびにその利用方法に関するものである。

田背景技術

植物は一般に分化全能性を持ち、例えば体細胞に由来する未分化組織から不定芽、あるいは不定胚の再生を経て植物個体を再生することができる。この能力は苗条培養における苗の生産等に利用されている。また、植物の体細胞組織や培養細胞に遺伝子を導入した後

、不定芽や不定胚の再生を経て形質転換植物を再生することは、近年、植物バイオテクノ口ジ一分野においては不可欠の重要な技術である。一般に未分化細胞塊であるカルスや、葉 · 茎等の植物組織からの不定根や不定芽の再生は植物ホルモンであるオーキシンやサイトカイニンの相互作用によって制御されると言われている。また、植物の形態形成については、植物ホルモン以外に、ホメォボックスを含む一連の遺伝子群が関わっていることが報告されている。ホメオボックスはショゥジョゥバエの発生を制御するいくつかの遺伝子に共通して存在する、よく保存された 1 83 塩基対の DNA 配列として見出された。この領域から翻訳される 6 1ァミノ酸配列はホメォドメインと呼ばれ、 3 つの αヘリックス力、らなるへリックス一ターン一へリックス構造をとり、特異的な塩基配列を認識して DNA に結合する。

動物のホメォボックス遺伝子は発生過程を調節する転写因子であることが明ら力、にされてきたが、高等植物のホメオボックス遺伝子は 1991年、トウモロコシの KNOTTED 1 (KN1 ) 遺伝子として単離されたのが最初である（Vol lbrecht et al. 、 ature 350 ： 241 - 243 、 1991) c トゥモロコシの葉の葉脈は平行脈であるが Knottedl変異株は葉脈が乱れ、葉脈に沿って結び目（knot) のような突起を作ることから Knotted という名前がつけられた。

一方、多くの動物で見つかつていたホメオボックス内の特に保存性の高いアミノ酸配列に対応する合成 DNA を用いて、双子葉植物のシロイヌナズナのゲノム DNA が検索され、いくつかのホメォボックス遺伝子が報告された（Ruberti et al.、 EMBO J. 10: 1787- 1791 、 1991) 。

これまでに報告された高等植物のホメオボックス遺伝子は、ホメォドメインのァミノ酸組成の類似性ゃホメオボックス部分以外の構造から大きく 5 つのタイプに分類されてきた（田坂，蛋白質核酸酵素 40 ( 8 ) : 1033-1042、 1995) 。第 1 のタイプはトウモロコシの KN1 遺伝子に代表されるタイプ、第 2 のタイプはホメォボックスが蛋白質のほぼ中央に位置し、その C 末端側に隣接して蛋白質の 2 量体形成に関与するロイシン残基の規則的な繰り返し構造（ロイシンジッパー）が存在するものである。第 3 のタイプは蛋白質の C 末端付近にホメォドメインを有し、さらに N 末端側に金属結合型のフィンガー構造を有する。第 4 のタイプは、第 3 のタイプと共通の構造に加えて、いくつかのァミノ酸配列の繰り返し構造を含むものである。第 5 のタイプは N 末端側にホメォボックスを有する力く、それ以外によく知られた特徴的な構造は見出されていない。

それぞれのタイプ間の全体を通したァミノ酸配列の相同性はホメォドメィン内で 32〜 58 %である力く、動物のホメォドメィンを含む蛋白質が DNA に結合する際に、ホメォドメイン中の 3 番目のへリックスがタ一ゲッ卜となる DNA の 2 重らせんの主溝に人り込み転写を調節するという報告からも推測できるように、植物のホメオボックス遺伝子産物でも、タイプを超えて、この 3 番目のへリックスが最も高い相同性を示す。この領域は、ホメォドメイン蛋白質が転写因子として DNA に結合するために必須といわれている。なお、最近、これら 5 つのグループに属さないホメオボックス遺伝子 IUS CHE L が報告された（C e l l , v o l . 95， p805 - 815, 1998 ) 。 WUS CHEL 遺伝子の機能欠損突然変異体では茎頂分裂組織の正常な発達ができないが、 S CHE L 遺伝子を過剰発現させた実験報告はなく、 WUSCHEL 遺伝子の発現を人為的に上昇させた場合、どのような変化が起こるのかは不明である。

植物のホメオボックス遺伝子については、器官形成や発生過程の調節、また感染防御や植物体内での物質輸送の制御に関与する可能性が示唆されている力く、その詳細は明らかになっていない。また、一般にホメォボックスを持つ蛋白質は転写因子として機能すると考えられる力それぞれのホメォドメィン蛋白質が転写調節を行うターゲッ卜遺伝子も未だ明らかになっていない。さらに、ホメオボックス遺伝子のうち、タイプのものを過剰発現させると植物体に激しい形態異状が引き起こされるが、カルス上で不定芽を形成するかどうかは不明である。

また、農業への利用という観点から考えれば、組織培養系で、例えばカルス等の培養組織の上に不定芽や分枝を誘導する能力の高い遺伝子が有用であると考えられる力、そのようなものはない。

発明の開示そこで、分化に関わり、ホメォドメイン様配列を持つ蛋白質、具体的には不定芽 · 分枝誘導能を有する蛋白質をコードする遺伝子及びそれによりコードされる蛋白質並びにこれらの用途を提供しょうとするものである。

本発明者は、シロイヌナズナ（Arab_idopsis thai iana) を用いてアクティベーション夕ギング (activation tagging) を行い、不定芽 · 分枝誘導能を有する蛋白質をコードする遺伝子を得た。ァクティベーションタギングとは、植物ゲノムにランダムにェンハンサ一配列を挿入することにより、揷人工ンハンサー近くの遺伝子の転写が活性化された突然変異体を分離する方法である。

従って、本発明は、分化に関わり、ホメォドメイン様配列を持つ蛋白質をコードする遺伝子を提供する。詳しくは、不定芽 · 分枝誘導能を有し、ホメォドメイン様配列を持つ蛋白質をコードする遺伝子を提供する。

より具体的には、本発明は配列番号： 2 に記載のァミノ酸配列を有し、分化に関わり、ホメォドメィン様配列を持つ蛋白質をコ一ドする遺伝子を提供する。本発明はさらに、配列番号： 2 のアミノ酸配列において、 1 〜複数個のァミノ酸の付加 · 欠失及び Z又は他のァミノ酸による置換により修飾されたァミノ酸を有し且つ分化に関わり、ホメォドメイン様配列を持つ蛋白質をコードする遺伝子を提供する。本発明はさらに、配列番号： 1 に記載する核酸、特に DNA 、又はその部分とハイブリダィズし、且つ分化に関わり、ホメォドメイン様配列を持つ蛋白質をコードする遺伝子を提供する。

本発明はさらに、配列番号： 4 に記載のァミノ酸配列を有し、分化に関わり、ホメォドメイン様配列を持つ蛋白質をコードする遺伝子を提供する。本発明はさらに、配列番号： 4 のアミノ酸配列において、 1 〜複数個のァミノ酸の付加 . 欠失及び/又は他のァミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸を有し且つ分化に関わり、ホメォドメイン様配列を持つ蛋白質をコードする遺伝子を提供する。本発明はさらに、配列番号： 3 に記載する核酸、特に DNA 、又はその部分とハイブリダィズし、且つ分化に関わり、ホメォドメイン様配列を持つ蛋白質をコードする遺伝子を提供する。

なお、分化に関わり、ホメォドメイン様配列を持つ蛋白質とは、細胞が形態的 · 機能的に違いを持った細胞、例えば不定芽、枝、葉、花などに分化する過程に関わり、 DNA 結合ドメインとして機能するホメォドメィンに類似の配列を持つ蛋白質であり、具体的には、不定芽の形成を誘導する蛋白質、分枝を誘導する蛋白質等を示す。本発明はまた、上記遺伝子を含んでなるベクターを提供する。本発明はさらに、上記ベクターにより形質転換された宿主を提供する。この宿主は植物細胞であっても、植物体であってもよい。本発明はまた、上記宿主を培養、栽培することによる、分化に関わり、ホメォドメイン様配列を持つ蛋白質の製造方法を提供する。本発明はまた、上記遺伝子を植物又は植物細胞に導入し、該遺伝子を発現せしめることによる植物又は植物細胞の分化を誘導する方法を提供する。

本発明はまた、上記遺伝子を植物又は植物細胞に導人し、該遺伝子を発現せしめることによる植物又は植物細胞の不定芽形成を誘導する方法を提供する。

本発明はまた、上記遺伝子を植物に導人し、該遺伝子を発現せしめることにより植物の分枝形成を誘導する方法を提供する。発明の実施の形態

発明者は、ァクティべ一ションタギングによって過剰発現した時に、カルスの上に不定芽形成を誘導するような分化に関わる遺伝子を同定できるのではないかと考えた：そこで、アクティベーション夕ギング用ベクター p PCV l CE n4HPTをァグロパクテリゥムを介して導入したシロイヌナズナ形質転換体力ルスをサイトカイニンを含まない培地上でスクリーニングし、通常は、サイトカイニン非存在下では不定芽が形成されないが、サイトカイニン非存在下でも不定芽を形成した突然変異体を分離した。このうち、 many s h o o t ( ms h ) と名付けた変異体は、サイトカイニン非存在下において不定芽を形成した。

ίϋ ]ΐ_変異体の表現型の原因となつている遺伝子とそれに対応する MSH cDNAを単離し解析した結果、遺伝子にコードされる蛋白質はホメォドメィンと有意な相同性を示すァミノ酸配列を有し、中でも、一連のホメォドメイン蛋白質で保存されているホメォドメインの第 3 番目の αヘリックス部分の相同性が高かった。また、 MS H cDNAのコ一ド領域をシロイヌナズナカルスに導入し過剰発現させたところ、変異体の表現型からも推測されるように、形質転換されたカルスは培地中のサイトカイニンの有無に関わらず不定芽を形成した。さらに、 MSH cDNAを過剰発現させたシロイヌナズナ形質転換体では、野性型シロイヌナズナと比べて分枝が多くなる場合が多く、葉の上に不定芽が形成されることもあった。

以上のことから、 ^IL遺伝子は分化に関わり、ホメォボックス様配列を持つ蛋白質をコードすることが明らかになり、これを過剰発現させることによって不定芽 · 分枝形成能が向上することが期待できる。

本発明の遺伝子としては、例えば配列番号： 2 又は 4 に記載のァミノ酸配列をコードするものが挙げられる。しかしながら、複数個のァミノ酸の付加、欠失および/または他のァミノ酸との置換によつて修飾されたアミノ酸配列を有する蛋白質ももとの蛋白質と同様のて。って明は、配列号

： 2 又は 4 に記載のアミノ酸配列に対して 1 個または複数個のアミノ酸の付加、欠失および / または他のァミノ酸との置換により修飾されたァミノ酸配列を有する蛋白質および当該蛋白質をコードする遺伝子も本発明に属する。

ここで、この修飾の程度は、本件出願の前に周知技術となっている手段、例えば部位特定変異誘発、 P C R 法等により可能な程度である。不定芽 · 分枝誘導活性を維持しながら修飾の対象となるアミノ酸の数は、例えば 50個以下、好ましくは 25個以下、例えば 10個以下での o

本発明はまた、配列番号： 1 又は 3 に記載の塩基配列を有する核酸、例えば DNA 、又はその部分と、ストリンジェント条件下でハイブリダィズすることができ、且つ分化に関わり、ホメォドメイン様配列を持つ蛋白質をコードする遺伝子を提供する。ここでストリンジェント条件とは、例えば 5 x S S C、 50 °Cの条件下でハイプリダィズする条件をいう。なお適切なハイブリダィゼ一ションの温度は塩基配列やその塩基配列の長さによって異なるため、適宜選択して行うことができる。

また、上記の核酸の部分とは、少なくとも数個の連続するァミノ酸配列をコードする部分であり、好ましくはホメォドメイン内の連続する数個のアミノ酸配列をコードする部分である。より好ましくは、配列番号： 1 又は 3 に記載の配列のうち、ホメォドメインの配列の一部又は全部を含み、かつ配列番号： 1 又は 3 に記載の全コード配列に対して、 25 %以上、例えば 50 %以上、さらに好ましくは 75 %以上の長さを有する部分又は断片を意味する。

上記ハイブリダィゼーシヨンの対象としての遺伝子源としては、植物、微生物などから調製される c DNAライブラリ一、ゲノム DNA ラィブラリー等を使用することができ、植物として例えばシロイヌナズナ、ペチュニア、キンギヨソゥ、イネ、トウモロコシ、タバコ、ポプラ等が挙げられるつ

このようにして得られる、分化に関わり、ホメォドメイン様配列を持つ蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列は、配列番号： 1 又は 3 に示す塩基配列に対して、 50 %以上、 60 %以上、好ましくは 70 % 以上又は 80 %以上、例えば 90 %以上の相同性を有する。

配列番号： 2 又は 4 に示すアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする本発明の遺伝子は、 cDNAまたはゲノム DNA として、シロイヌナズナから得ることができる。

生来の塩基配列を有する遺伝子は実施例に具体的に示すように、例えば c DNAライブラリーのスクリーニングによって得られる。また、修飾されたァミノ酸配列を有する蛋白質をコ一ドする DNA は生来の塩基配列を有する DNA を基礎として、常用の部位特定変異誘発や PC R 法を用いて合成することができる。例えば修飾を導入したい DN A 断片を生来の c DNAまたはゲノム DNA の制限酵素処理によって得、これを鋒型にして、所望の変異を導人したプライマーを用いて部位特異的変異誘発または PCR 法を実施し、所望の修飾を導入した DNA 断片を得る。その後、この変異を導入した DNA 断片を目的とする蛋白質の他の部分をコードする DNA 断片と連結すればよい。

あるいはまた、短縮されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする DNA を得るには、例えば目的とするアミノ酸配列より長いアミノ酸配列、例えば全長アミノ酸配列をコ一ドする DNA を所望の制限酵素により切断し、その結果得られた DNA 断片が目的とするアミノ酸配列の全体をコ一ドしていない場合は、不足部分の配列からなる DNA 断片を合成し、連結すればよい。

得られた遺伝子を大腸菌および酵母での遺伝子発現系を用いて発現させることにより、遺伝子産物である MSH 蛋白質を得ることができる。あるいはまた、配列番号： 2 又は 4 のいずれかに記載のアミノ酸配列がコードする蛋白質に対する抗体を用いても、 MSH の蛋白質を得ることができ、抗体を用いて他の生物から MSH と同様の機能を有する蛋白質の遺伝子をクローン化することもできる。

従って本発明はまた、前述の遺伝子を含む組換えベクター、特に発現ベクター、及び当該ベクターによって形質転換された宿主に関するものである。宿主としては、原核生物または真核生物を用いることができる。原核生物としては細菌、例えばェシヱリヒア（ Esch erichia)属に属する細菌、例えば大腸菌（Escherichia col i ) 、バシルス (Baci 1 lus) 属微生物、例えばノくシルス . スブシルス（ ci_ 1 lus subtilis)など常用の宿主を用いることができる。

真核性宿主としては、下等真核生物、例えば真核性微生物、例えば真菌である酵母または糸状菌が使用できる。酵母としては例えばサッカロミセス（^_ccharomyces)属微生物、例えばサッカロミセス . セレヒシェ ( Sacchar omy ces cer ev i s i ae) 等力く挙げられ、また糸状菌としてはァスペルギルス (Aspergi 1 lus)属微生物、例えばァスぺノレギノレス . ォリゼ（Aspergillus oryzae) 、ァスぺノレギノレス. 二ガ— （Aspergillus n i ger) _s ぺニシリウム（ Pen i c i i 1 i um)属微生物が挙げられる。さらに動物細胞または植物細胞が使用でき、動物細胞としては、マウス、ハムスター、サル、ヒト等の細胞系が使用され、具体的には COS 細胞、 Vero細胞、 CH0 細胞、 L細胞、 C127細胞、 BALBZc3T3細胞、 Sp— 2/0 細胞等を用いることもできる。植物細胞としては、タバコの培養細胞、ポプルス属、ユーカリ属、アカンァ属の培養細胞等が使用される。

さらに昆虫細胞、例えばカイコ細胞、またはカイコの成虫それ自体も宿主として使用される。具体的には、昆虫細胞、例えばヨガ細胞 (Spodoptera f rugiperda), カイコ細胞 ( Bombvx mori)等を用いることができる。

発現べクタ一としては、プラスミド、ファージ、ファージミド、ウィルス（バキュロウィルス（昆虫細胞発現系）、ワクシニアウイルス（動物細胞発現系））等が使用できる。

本発明の発現ベクターはそれらを導人すべき宿主の種類に依存して発現制御領域、例えばプロモーターおよびターミネータ一、複製起点等を含有する。細菌用発現べクタ一のプロモーターとしては、常用のプロモータ一、例えば trc プロモ一夕一、 tac プロモータ一、 lac プロモーター等が使用され、酵母用プロモータ一としては、例えばグリセルアルデヒド 3 リン酸デヒドロゲナ一ゼプロモータ一、 PH05プロモータ一、 adhlプロモータ一、 pqk プロモータ一等が使用され、糸状菌用プロモ一夕一としては例えばアミラーゼ、 trpC等が使用される。

また、昆虫用プロモーターとしてはバキュロウィルスポリへドリンプロモータ一等、動物細胞としては Simian Virus 40 の early および lateブロモ一ター、 CMV プロモーター、 HSV- TKプロモータ一または SRひプロモーター等が挙げられる。

また、植物用プロモータ一としては、例えば CaMV35S プロモータ一、ノパリン合成酵素のプロモータ一、誘導型プロモータ一としては、グルタチオン— S — トランスフェラ一ゼ I I系遺伝子のプロモータ一、 hsp80 プロモーター、リブロース 2 リン酸カノレボキシラーゼ小サブュニット遺伝子のプロモーター等が挙げられる。また、発現ベクターには、以上の他にェンハンサー、スプライシングシグナル、ポリ A付加シグナル、選択マーカー（例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（メトトレキセート耐性）、 neo 遺伝子（ G 418 耐性）等 ) 等を含有しているのを用いるのも好ましい一態様である。なお、ェンハンサー用る、例えば SV40のェンハンサ一等を遺伝子の上流または下流に揷入する。

発現ベクターによる宿主の形質転換は、当業者においてよく知られている常法により行うことができ、これらの方法は例えば、 Curr en t Protocols I n Molecular Biology, John Wi ley & Sons 社、 19 95年、に記載されている。形質転換体の培養も常法に従って行うことができる。培養物からの精製は、蛋白質を単離 · 精製するための常法に従って、例えば、限外ろ過、各種カラムクロマトグラフィー、例えばセファロ一スを用いるクロマトグラフィ一等により行うことができる。また、 GST やポリヒスチジンとの融合タンパク質として宿主中で発現させた場合、適切なァフィ二ティ一クロマトグラフィ一により容易に精製できる。

現在の技術水準をもってすれば、さらに、この cDNAあるいはゲノムクロ一ンを構成的なあるいは誘導型のプ口モータ一の制御下に連結し、ァグロバクテリウムを用いるシステムあるいはパーティクルガン、エレクト口ポーレーシヨンを用いるシステムで、この遺伝子を植物に導人し発現させることで、植物ホルモンによる人為調節によっても個体再生が困難な植物、例えばバラなどにおいて、不定芽の形成や分枝形成等の分化を促進することが可能である。

さらに、本発明の遺伝子の発現を制御することで、園芸植物の形態を変化させること、例えばスタンダードタイプの植物をスプレータイプに変化させ、その結果として花数や葉数の増加させることができると考えられる。実施例

以下実施例に従って発明の詳細を述べる。分子生物学的手法は特に断らない限り、 Molecular Cloning (Sambrook et al.、 1989) に従った。

実施例 1 . サイトカイニン応答突然変異^:のス―クリ一二ング分化、例えば不定芽 · 分枝の形成に関与する遺伝子の転写量を增大させ、サイトカイニン非存在下でもサイトカイニン応答を示す突然変異体を得るため、シロイヌナズナ（Arabidopsis thai i ana) を用いてァクティべーションタギングを行った。

約 50， 000個のシロイヌナズナのカルスを赤間らの方法（Akama et al.， Plant Cell Rep. , 12, 7， 1992) に従い、ァクティべーション夕ギング用ベクター pPCVICEn4HPT (Hayashi et al.、 Science, 2 58, P1350-1353, 1992) を用いて形質転換を行った。なお、 pPCVIC En4HPTには CaMV35S プロモータ一に由来する強力なェンハンサ一配列が存在するので、植物のゲノムに挿人された後に、このェンハンサー配列に隣接する遺伝子の転写が活性化される。形質転換後、形質転換されたカルスをサイトカイニンを含まない培地上で培養した野生型（非形質転換）シロイヌナズナカルスはサイトカイニンを含まない培地上では細胞増殖が抑えられ、不定芽形成を行うことができないが、形質転換カルスの中には、サイトカイニンが存在しないにも関わらず、不定芽を形成するカルスが存在した。その中でも

、不定芽形成能が高く多くの不定芽を形成する突然変異体を^ ( many shoot) 突然変異体と名付けた。 msh 変異体から得られた種子を通常シロイヌナズナ培養用寒天培地に播種したところ、子葉の上にも多くの不定芽が観察された。

実施例 2 . msh 突然変異体の原因遺伝子 MSH の単離

実施例 1 で得られた lL突然変異体からゲノム DNA を抽出した。このゲノム DNA を制限酵素^ _で処理した後、 DNA を精製し、 T4リガーゼにより DNA 断片の環状化をおこなった。これを大腸菌に導入し、アンピシリン耐性を獲得した大腸菌よりプラスミドを回収したこのよう：こして回収されたプラスミドは T-DNA のほとんどの領域 t msh 突然変異体のゲノム内で T - DNA の Right border (RB) に隣接しているゲノ厶配列を含んでいる。

この RBに隣接するゲノム DNA 56i0bpの塩基配列を決定し、得られた塩基配列について GENSCA ' 7ルゴリズム (ht tp： //CCR-081. mi t. ed u/GE SCA . html) で遺伝子の存在を予測したところ、 RBに最も近い遺伝子は RBから 882 番目の塩基から転写が始まることが明らかとなり、本遺伝子を ^JLと名付けた。

実施例 3. MSH cDNA の単離

^L突然変異体ならびに野生型シロイヌナズナの植物体全体から RNA を抽出し、 oligotex dT30 (日本ロッシュ社）を用いて mRNAを精製した。これを铸型とし、ラムダ ZAP II cDNAライブラリー合成キット（Stratagene 社）を用いて、 S tratagene社の推奨する方法により cDNAライブラリーを作製した。これら 5^突然変異体並びに野生型シロイヌナズナの cDNAライブラリ一を実施例 2で得られた MSH 遺伝子をプローブとしてスクリーニングした。野性株由来の cDNAライブラリーは、約 300， 000 クローンをスクリーニングしても MSH 遺伝子に対応する cDNAは得られず、このことから、野生型シロイヌナズナにおいて遺伝子の発現は非常に弱い、あるいは特定の細胞でのみ発現していると考えられる。

一方、 msh 突然変異体由来の cDNAラィブラリー約 20， 000クローンをスクリーニングしたところ、 31個の陽性クローンが得られ、このうち、 M6と名付けたクローンをその後の解析に用いた。 M6クローンの塩基配列を決定し、その配列を配列表の配列番号： 1 に示す。また、その塩基配列に対応するアミノ酸配列を配列番号： 2 に示す。

このコ一ド領域全長の配列は ^^遺伝子に含まれており、 M6は ^ 遺伝子に対応する cDNAであることが判明した。 cDNAの塩基配列を解析した結果、遺伝子にコ — ドされる蛋白質はホメォドメイン蛋白質と有意な相同性を示し、中でもホメォドメイン蛋白質間で保存されているホメォドメインの第 3 番目の αヘリックスに相当する配列が、遺伝子にコ一ドされる蛋白質においてもよく保存されていることがわかった。また、 SH_遺伝子にコ一ドされるタンノク質のァミノ酸配列は、ホメォドメィン蛋白質の中でも WUSCHEL の配列と最も高い相同性を示した。

ただし、報告されている中で MSH と最も相同性の高い SCHEL と比較した場合でも、ホメォドメィン内の同一ァミノ酸の割合は 42 % 、タンパク質全体では約 20%であり、配列からは WUSCHEL と類似の機能を持つかどうかは判断できない。ホメォドメイン蛋白質の中で、 WUSCHEL の次に相同性が高かったのは KN1 タイプの蛋白質であるが、これらを MSH とホメォドメイン内で比較した場合の相同性は、同一アミノ酸の割合が 20%以下であった。また、クローニングの過程で、 MSH cDNAとホメォドメィン内で 86%、全領域で 40%の同一性のある配列を有する cDNAクローンも単離され、 M8と名付けた。その塩基配列を配列表の配列番号： 3 に示し、対応するアミノ酸配列を配列番号： 4 に示す。

実施例 4. MSH cDNAの過剰発現による不定芽形成

実施例 2で予測されたように、 MSH 遺伝子の過剰発現が不定芽の形成を引き起こすのかどうかを解析した。バイナリ一ベクタ一 pBE2

113GUS (Plant Cell Physiology, 37. p49- 59， 1996 、 NIARより人手）から、制限酵素 li H I / Sacl 処理によって ^^遺伝子を除き

、替わりに MSHM6 cDNAのコード領域をプライマ一 #170(5' - GAAGAT

CTCATCATGTCCTCCTCAAAC-3' ) (配列番号： 5 ) とプライマー #172 (

5 ' - CGGAGCTCTAAATAAGATAATAGATTGCGC-3' ) (配列番号： 6 ) を用いた PCR で増幅し、その後制限酵素^ Πしで処理した DNA 断片を組み込んだ。この操作により、バイナリーベクターに揷入された \1SH cDNAは CaMV35S プロモータ一由来の人工プロモーターの制御下に置かれている _c このプラスミドを PBE2113MSHと名付けた。

PBE2113GUSと pBE2113MSHをァグロバクテリゥ厶を介して野生型シロイヌナズナカルスに導入した。カナマイシン耐性を指標として形質転換細胞を選別した。 PBE2113GUSを導入した形質転換体力ルスは不定芽形成にサイトカイニンを要求したが、 PBE2113MSHで形質転換されたカルスはサイトカイニンの有無に関わらず不定芽を再生することができた。サイトカイニン存在下では、どちらのプラスミドで形質転換したカルスも不定芽を再生したが、 pBE2113MSHで形質転換されたカルスは、 PBE2113GUSで形質転換されたカルスよりも速やかに不定芽を再生した。また、既に報告されている 2成分制御系（tw 0 - component system) のセンサ一 ' ヒスチジンキナーゼである CK II cDNA を過剰発現するシロイヌナズナカルスもサイトカイニン非存在下で不定芽を形成できるが、形成される不定芽の数は MSH cDNAを過剰発現しているカルスのほうが多かった。

一方、 PBE2113MSHをァグロバクテリウム減圧浸潤法を用いてシロィヌナズナの生殖細胞に導人し（Bechtold et al. , C. R. Acad. Sci. Paris, Life Sciences, 316, pll94_1199， 1993 、荒木崇，植物細胞工学シリーズ 4，モデル植物の実験プロトコール， pl09- 113， 19 96) 、遺伝子が導人された芽生えをカナマイシン耐性を指標として選択した。このようにして得られた形質転換体シロイヌナズナでは、野性株と比べて分枝が多いことが観察された。

さらに、実施例 3 で得られた、 MSH cDNAと相同な蛋白質をコードする M8 cDNA にコードされる蛋白質の機能に関しても、 M8c DNA にコードされる蛋白質と GUS の融合タンパク質をシロイヌナズナ植物体で過剰発現させることによって解析した。 M8 cDNA のコード領域をプライマー #224 ( 5' - GCTCTAGAACAATGGCTTCTTCGAATAGACAC-3' )

(配列番号： 7 ) とプライマ— #225 ( 5 ' - TCCCCCGGGCTGATCAGATA GTACGAGGCTCC-3' ) (配列番号： 8 ) を用いて PCR によって增幅後、制限酵素^ 処理によって得られる遺伝子断片を、 P BE21 13GUS の Xbal/Smal 認識部位の間に揷入した。

得られたバイナリーベクター pBE2113M8GUSを了グロノくクテリウム減圧浸潤法を用いてシロイヌナズナの生殖細胞に導入し、遺伝子が導入された芽生えをカナマイシン耐性を指標として選択した。このようにして得られた形質転換体シロイヌナズナでは、先の MSHM6 cD NAを過剰発現したシロイヌナズナ変異株と同様、分枝が多くなつた

産業上の利用可能性

以上のように、ァクティべ一ションタギングによってシロイヌナズナから得られた遺伝子^ _は、不定芽形成に関与するホメオボックス遺伝子と考えられ、不定芽形成に関わる遺伝子の転写因子をコ — ドすると推測される。 MSH c DNA を 35S プロモーターの制御下で過剰発現させた結果から、サイトカイニンの有無に関わらず、が不定芽形成を促進すること、加えて、植物体の分枝にも関与することが示唆された。

このことから、遺伝子の発現を制御することによって、植物又は植物細胞からの不定芽 · 分枝形成を制御することが可能となつた。

Claims

請求の範囲

1 . 配列番号： 2 に記載のァミノ酸配列を有し、分化に関わり、ホメォドメィン様配列を持つ蛋白質をコードする遺伝子。

2 . 配列番号： 2 に記載のアミノ酸配列において 1 個又は複数個のアミノ酸の付加、欠失及び Z又は他のアミノ酸による置換により修飾されているアミノ酸配列を有し、且つ分化に関わり、ホメォドメイン様配列を持つ蛋白質をコードする遺伝子。

3 . 配列番号： 1 に記載の塩基配列を有する核酸又はその部分と、ストリンジェン卜条件下でハイプリダイズし、且つ分化に関わり

、ホメォドメイン様配列を持つ蛋白質をコードする遺伝子。

4 . 配列番号： 4 に記載のアミノ酸配列を有し、分化に関わり、ホメォドメィン様配列を持つ蛋白質をコ一ドする遺伝子。

5 . 配列番号： 4 に記載のアミノ酸配列において 1 個又は複数個のァミノ酸の付加、欠失及び Z又は他のァミノ酸による置換により修飾されているアミノ酸配列を有し、且つ分化に関わり、ホメォドメイン様配列を持つ蛋白質をコードする遺伝子。

6 . 配列番号： 3 に記載の塩基配列を有する核酸又はその部分と、ストリンジェント条件下でハイプリダイズし、且つ分化に関わり、ホメォドメイン様配列を持つ蛋白質をコードする遺伝子。

7 . 前記蛋白質が、不定芽誘導能を有する蛋白質である請求項 1 〜 6 のいずれか 1 項に記載の遺伝子。

8 . 前記蛋白質が、分枝誘導能を有する蛋白質である請求項 1 〜 6 のいずれか 1 項に記載の遺伝子。

9 . 請求項 1 〜 8 のいずれか 1 項に記載の遺伝子を含んでなるベクタ一。

1 0 . 請求項 9 に記載のベクタ一により形質転換された宿主。

1 1 . 請求項 1 〜 8 のいずれか 1 項に記載の遺伝子によってコードされる蛋白質。

1 2 . 請求項 1 0 に記載の宿主を培養し、又は成育させ、そして該宿主から分化に関わり、ホメォドメイン様配列を持つ蛋白質を採取することを特徴とする該蛋白質の製造方法。

1 3 . 前記蛋白質が、不定芽誘導能を有する蛋白質である請求項 1 2 に記載の蛋白質の製造方法。

1 4 . 前記蛋白質が、分枝誘導能を有する蛋白質である請求項 1 2 に記載の蛋白質の製造方法。

1 5 . 請求項 1 〜 8 のいずれか 1 項に記載の遺伝子が導入された植物又は植物細胞。

1 6 . 請求項 1 〜 8 のいずれか 1 項に記載の遺伝子を植物又は植物細胞に導人し、該遺伝子を発現せしめることによる植物又は植物細胞から分化を誘導する方法。

1 7 . 請求項 1 〜 8 のいずれか 1 項に記載の遺伝子を植物又は植物細胞に導入し、該遺伝子を発現せしめることによる植物又は植物細胞から不定芽形成を誘導する方法。

1 8 . 請求項 1 〜 8 のいずれか 1 項に記載の遺伝子を植物体に導入し、該遺伝子を発現せしめることによる植物体の分枝を誘導する方法。