WO2001007620A1 - Pyrf gen und seine verwendung - Google Patents

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WO2001007620A1
WO2001007620A1 PCT/EP2000/006091 EP0006091W WO0107620A1 WO 2001007620 A1 WO2001007620 A1 WO 2001007620A1 EP 0006091 W EP0006091 W EP 0006091W WO 0107620 A1 WO0107620 A1 WO 0107620A1
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WO
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pyrf
protein
defect
expression
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PCT/EP2000/006091
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Rupert Pfaller
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Original Assignee
Consortium fuer Elektrochemische Industrie GmbH
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    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1077—Pentosyltransferases (2.4.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/02—Pentosyltransferases (2.4.2)
    • C12Y204/0201—Orotate phosphoribosyltransferase (2.4.2.10)

Definitions

  • the invention relates to a pyrF gene and its use as a selection marker gene for an expression system for the production of proteins in fungi of the genera Trametes, Coriolus or Polyporus.
  • DE-A-19814853 describes in detail the related prior art.
  • DE-A-19814853 itself discloses a method for transforming filamentous fungi from the genera Trametes and Polyporus, with which significantly higher production rates can be achieved for each protein that is exposed.
  • the application discloses expression vectors which contain genetic regulatory elements for expression in filamentous fungi of the class Basidiomycetes. When transforming filamentous fungi of the Basidiomycetes class, they allow the selection of positive transformants due to the complementation of an auxotrophic gene defect.
  • DE-A-19814853 relates to the pyrG gene. This gene codes for the orotidine-5 ⁇ -phosphate decarboxylase.
  • DE-A-19814853 also disclosed strains with a defect in the pyrG gene which can only grow on minimal medium in the presence of uridine (uridine auxotrophy). After transformation of these strains with DNA vectors containing an intact pyrG gene, the uridine auxotrophic strains grow again on minimal medium without uridine (uridine prototrophy).
  • Uridine auxotrophic strains are isolated according to the prior art (Boeke et al., Methods Enzymol. (1987) 154, 164-175) by treatment with the genotoxic substance 5-fluoro-orotic acid (FOA). Uridine auxotrophic strains produced during treatment with FOA have a genetic defect either in pyrG gene or in the pyrF gene. The pyrF gene is also called the ura5 gene. It codes for the enzyme orotic acid phosphobosyl transferase.
  • FOA genotoxic substance 5-fluoro-orotic acid
  • An object of the present invention is to provide pyrF genes from filamentous fungi from the class of the Basidiomycetes. These genes are suitable for use as selection marker genes for the transformation of U ⁇ dm-auxotrophic strains.
  • the present invention relates to a DNA sequence which codes for a protein with enzyme activity of orotic acid phosphoribosyl transferase (pyrF activity), characterized in that it comprises the chromosomal DNA sequence SEQ ID NO: 1 from position 1133 to position 1877 inclusive comprises or comprises the cDNA sequence SEQ ID NO: 2 from position 1 up to and including position 684 or comprises a DNA sequence with a sequence homology greater than 60% to the DNA sequence SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • PEF activity orotic acid phosphoribosyl transferase
  • a DNA sequence with a sequence homology is preferably large more than 70% of the DNA sequence SEQ ID NO: 2.
  • the present invention comprises a DNA sequence with a sequence homology greater than 80% to the DNA sequence SEQ ID NO: 2.
  • the DNA sequence SEQ ID NO: 1 according to the invention from position 1133 up to and including position 1225 and from position 1287 up to and including position 1877, or the cDNA sequence SEQ ID NO: 2 derived therefrom from position 1 up to and including position 684 codes for a protein with pyrF activity.
  • the present invention therefore also relates to a protein with pyrF activity, characterized in that it comprises the amino acid sequence SEQ ID NO: 3 or an amino acid sequence with a sequence homology greater than 60% to the amino acid sequence SEQ ID NO: 3.
  • amino acid sequence with a sequence homology greater than 70% to the amino acid sequence SEQ ID NO: 3 is preferred. Particularly preferred in the present invention is an amino acid sequence with a sequence homology greater than 80% to the amino acid sequence SEQ ID NO: 3.
  • the DNA sequence SEQ ID NO: 1 from position 1226 up to and including position 1286 is an intron that is not translated into amino acid sequence.
  • the DNA sequence SEQ ID NO: 1 represents from position 1 to position 1132 the DNA sequence for the promoter region for the transcription of the pyrF gene from Tramtetes versicolor. This promoter sequence can be exchanged for any other promoter sequences for transcription.
  • the DNA sequence according to the invention can be read through, for example
  • a gene bank of Trametes versicolor TV-1 is created using methods known per se. They may be spindles a cDNS- or a genomic library han ⁇ .
  • DNA probes which contain pyrF-specific DNA sequences.
  • DNA probes can be obtained, for example, by means of a PCR reaction using DNA primers from genomic DNA from Trametes versicolor TV-1.
  • DNA sections with a length of preferably 23 to 26 bp are used as primers, the sequence of which is determined by sequence comparison of known pyrF genes.
  • the DNA segments suitable as primers are preferably obtained by oligonucleotide synthesis of the specified DNA segments.
  • the isolation of a pyrF gene according to the invention can, for example as described in Examples 1 to 3.
  • a pyrF gene isolated in this way can be modified using techniques known to those skilled in the art, such as, for example, site-directed mutagenesis, at the desired position in the sequence. Therefore, also a DNA sequence encoding a protein with pyrF activity comprising a DNA sequence with a sequence homology greater than 60%, preferably 70%, particularly be ⁇ vorzugt 80% to the DNA sequence SEQ ID NO: 2 from position 1 to position 684 inclusive of the invention.
  • this expression vector containing the pyrF gene is introduced into a microorganism and expressed in the microorganism.
  • the invention therefore also relates to an expression vector which is characterized in that it contains a pyrF gene according to the invention.
  • genes coding for proteins are also to be understood as the cDNA genes of the proteins derived from the structural genes.
  • the proteins can be heterologous proteins for the host organism or proteins homologous for the host organism.
  • the expression vector according to the invention thus preferably also contains at least one gene which codes for a protein to be expressed.
  • the expression vector according to the invention particularly preferably contains at least one gene which is responsible for a hydrolytic enzyme encoded, for example from the group of cellulases, hemicellulases and lipases or from the group of oxidoreductases such as, for example, lignin peroxidases, manganese peroxidases, laccases, cellobiose quinone oxidoreductase or cellobiose oxidase.
  • a hydrolytic enzyme encoded, for example from the group of cellulases, hemicellulases and lipases or from the group of oxidoreductases such as, for example, lignin peroxidases, manganese peroxidases, laccases, cellobiose quinone oxidoreductase or cellobiose oxidase.
  • the expression vector according to the invention particularly preferably contains a gene for a laccase.
  • the expression vector according to the invention can be a DNA construct which is integrated into the genome of the host organism and replicated together with it.
  • the expression vector can be an autonomously replicating DNA construct that does not integrate into the host genome, e.g. a plasmid, an artificial chromosome or a comparable extrachromosomal genetic element.
  • An expression vector according to the invention should preferably also contain the following genetic elements:
  • a promoter that mediates expression of a protein coding gene in the host organism should preferably be a strong promoter so that high expression performance can be guaranteed.
  • the promoter is preferably operably linked to the 5 'end of the gene to be expressed.
  • the promoter can be derived from the gene to be expressed or the promoter of a foreign gene can also be used.
  • Promoters which are preferably suitable are selected from the group of promoters active in filamentous fungi from the class of the Basidiomycetes, such as, for example, B. the GAPDH promoter from Trametes versicolor, promoters for laccase genes from Trametes versicolor or the Polyporus pinsitus, the promoter for the ornithine transcarbamoylase gene or the GAPDH gene from Coriolus hirsutus or the GAPDH promoter from Agaricus bisporus.
  • the GAPDH promoter from Trametes versicolor is particularly preferred. This promoter is disclosed in DE-A-19814853 Example 5 and DE-A-19814853, SEQ ID NO: 3, Base 1-1542.
  • signals suitable for the host organism for transcription termination and eukaryotes should preferably also contain signals for polyadenylation in the expression vector and be linked functionally11 to the 3 ′ end of the gene to be expressed.
  • signals for the transcript term and polyadenylation are e.g. SEQ ID NO: 1, bp 1878-3448.
  • the terminator of the protein-encoding gene to be expanded or the terminator of a foreign gene can be used as the transcription terminator.
  • the transcription terminator from the gene of a laccase is preferably used.
  • the proteins can be expressed intracellularly or, in the presence of a functional signal sequence, for the purpose of secretion, also extracellularly.
  • the expression vector according to the invention preferably contains a functional signal sequence 5 'in front of the protein-coding gene.
  • a so-called secretion carrier functionally linked to the 5 'end of the protein-coding gene, can also be contained in the expression vector according to the invention,
  • the secretion carrier can be the gene for em secreted protein or the fragment of a gene for em secreted protein.
  • the secretion carrier can be functionally linked to the protein to be secreted in such a way that a fusion protein composed of the secretion carrier and the protein.
  • the linkage of the secretion carrier and the protein to be secreted is designed in such a way that the secretion carrier can be separated from the protein to be secreted. This can be achieved, for example, by inserting a recognition sequence for a protein-cleaving enzyme in the linkage point between the secretion carrier and the protein to be secreted.
  • KEX2 protease and, as an example for a secretion carrier, the glucoamylase from Aspergillus niger (Contreras et al., Bio / Technology (1991) 9, 378-381, Broekhuijsen et al., J. of Biotechnology (1993) 31, 135-145).
  • DNA sequences which, unlike transcription terminators at the 3 'end of the protein-coding gene, are involved in the expression and secretion of the expressed gene can also be contained in the expression vector according to the invention.
  • An example of this is provided by the gene for laccase from Neurospora crassa, the 3 end of which contains the sequence for 13 amino acids which are removed during the secretion of the protein and are no longer contained in the mature protein (Germann et al., J. Biol. Chem. (1988) 263, 885-896).
  • the expression vectors according to the invention are produced by means of methods known in the art. Different possibilities are shown in the examples. The methods described there can be applied by the person skilled in the art to any other vectors, resistance genes, regulatory elements and structural genes.
  • the invention further relates to microorganisms which are characterized in that they contain an expression vector according to the invention.
  • Suitable microorganisms for expressing an expression vector according to the invention are strains of filamentous fungi from the class of the Basidiomycetes.
  • Particularly preferred host organisms are monokaryotic strains from the genera Trametes, Coriolus and Polyporus.
  • Host organisms of the Trametes versicolor species are particularly preferred.
  • the host organism is preferably distinguished by the fact that it has a genetic defect in metabolic metabolism (axotrophy), due to which the essential metabolic metabolite uridine can no longer be synthesized and the host organism on minimal media without the addition of this metabolic metabolite no longer increases is empowered.
  • axotrophy genetic defect in metabolic metabolism
  • the expression vectors according to the invention allow the selection of positive transformants due to complementation of an auxotrophic gene defect in the host organism when transforming fungi selected from the genera Trametes, Coriolus and Polyporus.
  • the expression vectors according to the invention are suitable for the production of fungal strains which are capable of efficient expression and secretion of proteins.
  • the invention therefore also relates to processes for the production of fungal strains which are capable of efficient expression and secretion of proteins.
  • This method in which a fungus with an auxotrophic gene defective as host strain by means of process steps known per se with an expression vector which has an gene for complementing the auxotrophic gene defect in the host strain, is transformed in a transformation approach and clones transformed from the transformation approach with the expression vector are selected by selection for complementation of the auxotrophic gene defect, wherein the expression of the gene for complementing the auxotrophic gene defect in the host strain is controlled by a genetic regulatory element which is active in the host strain, characterized in that the host strain is an Uridm-auxotrophic fungus selected from the genera Trametes, Coriolus and Polyporus with a gene defect in the pyrF Gene is used.
  • a monokaryotic Basidiomycet from the genus Trametes, Coriolus or Polyporus is preferred as the host for gene expression.
  • Particularly preferred for gene expression is a host of the Trametes versicolor type, which has a defect in the pyrF gene and is auxotrophic for U ⁇ dm.
  • the invention also relates to an expression system comprising a host strain selected from the genera Trametes, Coriolus and Polyporus with a genetic defect in the metabolic metabolism on the basis of which the metabolite uridine, which is essential for growth, can no longer be synthesized and the host strain cannot be synthesized on minimal media without the addition of this metabolite is more capable of growth and an expression vector containing selection marker gene which complements the auxotrophic gene defect of the host strain, characterized in that the host strain has a defect in the metabolism of metabolism as a defect in the pyrF gene, and the selection marker gene is the pyrF gene.
  • the pyrF gene preferably comes from a fungus of the genus Agaricus, Coriolus, Polyporus, Pleurotus, Phanerochaete, Schizophyllum or Trametes.
  • the orotic acid phosphorobosyltransferase gene from a filamentous fungus of the class of the Basidiomycetes Trametes versicolor is particularly suitable as a selection marker gene for the expression system according to the invention.
  • the expression ectors according to the invention are particularly suitable for the expression of the pyrF gene.
  • the expression of the pyrF gene from the Basidiomycete Trametes versicolor is preferably regulated by the promoter and possibly terminator for the pyrF gene from Trametes versicolor.
  • the expression system according to the invention is particularly suitable for the expression of a gene which is used for a hydrolytic enzyme e.g. from the group of proteases, cellulases, hemicellulases and lipases or from the group of oxidoreductases such as, for. B. the lignin peroxidases, manganese peroxidases, laccases, cellobiose quinone oxidoreductase or cellobiose oxidase.
  • a hydrolytic enzyme e.g. from the group of proteases, cellulases, hemicellulases and lipases or from the group of oxidoreductases such as, for. B. the lignin peroxidases, manganese peroxidases, laccases, cellobiose quinone oxidoreductase or cellobiose oxidase.
  • the host strain is transformed using methods that correspond to the state of the art. These methods include the transformation of protoplasts according to the CaCl./PEG method, the transformation by electroporation or the biolistic transformation by bombardment with DNA-containing microprojectiles. These procedures are described in standard textbooks.
  • the gene to be transformed is cloaked in a known manner in an expression vector according to the invention. nated and introduced into a filamentous mushroom selected from the genera Trametes, Coriolus and Polyporus using the methods mentioned.
  • the gene to be transformed can also be cloned into an expression vector without a selection marker gene and used together with a vector which complements the auxotrophic gene defect of the host strain to generate transformants (cotransformation).
  • the strain to be used for the transformation is a uridine auxotrophic filamentous fungus selected from the genera Trametes, Coriolus and Polyporus.
  • the relevant strain from the class of the Basidiomycetes can be a monocaryotic or else a dikaryotic strain. In a preferred embodiment, it is a uridine auxotrophic strain that has a defect in the pyrF gene.
  • a monokaryotic, uridine-auxotrophic, pyrF-deficient strain from the species Trametes versicolor is particularly preferred for the transformation.
  • the selection of positive transformants is carried out, for example, by applying protoplasts after the transformation with vector DNA on a medium which contains an additive such as, for example, the osmotic stabilization of the protoplasts.
  • B. sorbitol, mannitol or sucrose is added and which allows the selection of transformants with the complementing pyrF gene.
  • the filamentous fungus Trametes versicolor is transformed with the gene of a laccase from Trametes versicolor in a homologous system. This results in an increase in the expression rate for the said laccase, which is achievable according to the prior art Production rate in the fermentation of 0.1 g laccase / 1 culture medium improved significantly.
  • the promoter which is inherent in the laccase gene or the promoter for a strongly expressed gene from Trametes versicolor is preferably used for this purpose.
  • the promoters of laccase genes I and III, the isolation and use of which is disclosed in DE-A-19814853, are preferably used.
  • the promoter of another strongly expressed gene is the GAPDH promoter for the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from Trametes versicolor.
  • Selection media are preferably used on which only those transformants of Trametes versicolor can grow which had been transformed with a functionally expressed selection marker gene for the pyrF gene. It is preferably a minimal medium described in the 6th example in the absence of uridine, on which pyrF auxotrophic strains of Trametes versicolor can no longer grow, or can only grow again after uridine has been added.
  • the pyrF selection marker gene is preferably under the control of genetic regulatory elements from Basidiomycetes, particularly preferably from those selected from the genera Trametes, Coriolus and Polyporus.
  • the pyrF gene is preferably under the control of the 5 'promoter region upstream of it and the 3' terminator region downstream of it.
  • SEQ ID NO: 1 describes such a DNA fragment in which the pyrF gene from Trametes versicolor is under the control of the expression signals of the pyrF gene from Trametes versicolor.
  • the pyrF gene can be under the control of expression signals from Basidiomycetes which are different from those of the pyrF gene.
  • the expression signals that fulfill this function include GAPDH promoters filamentoser fungi from the class of Basidiomycetes, such as Coriolus hirsutus, Phanerochaete chrysosporium, Aga ⁇ cus bisporus or Trametes versicolor, the OCT promoter from Coriolus hirsutus, the Promo ⁇ tor of the laccase I or the Laccase III from Trametes versicolor and the terminator of the GAPDH gene from Agaricus bisporus or the terminators of the Laccase I or Laccase III gene from Trametes versicolor.
  • GAPDH promoters filamentoser fungi from the class of Basidiomycetes, such as Coriolus hirsutus, Phanerochaete chrysosporium, Aga ⁇ cus bisporus or Trametes versi
  • a vector in which the pyrF gene from Trametes versicolor is under the control of the expression signals of the GAPDH gene from Trametes versicolor is described in the fourth example.
  • a vector in which the pyrF gene from Trametes versicolor is under the control of the expression signals of the pyrF gene from Trametes versicolor is described in the 3rd example.
  • the pyrF gene can be any gene which codes for a protein with the enzymatic activity of an orotic acid phosphobosyl transferase.
  • the pyrF gene preferably comes from a filamentous fungus the class of the Basidiomycetes, such as Agaricus bisporus, Phanerochaete chrysosporium, Coriolus hirsutus, Polyporus pinsitus, Schizophyllum commune or Trametes versicolor.
  • Basidiomycetes such as Agaricus bisporus, Phanerochaete chrysosporium, Coriolus hirsutus, Polyporus pinsitus, Schizophyllum commune or Trametes versicolor.
  • the pyrF gene from Trametes versicolor is particularly preferred.
  • the invention also relates to a process for the production of a protein which is characterized in that the expression system according to the invention containing a gene coding for the protein is used for protein production in a manner known per se or that a fungus strain containing a gene coding for the protein was produced by the method according to the invention, is cultivated in a manner known per se.
  • a DNA probe for isolating a pyrF gene was obtained by PCR amplification from T. versicolor genomic DNA with degenerate Generated primers.
  • the degenerate primers were constructed using a sequence comparison of known pyrF genes.
  • Genes for the orotic acid phosphoribosyltransferase (referred to as pyrF genes or, in another nomenclature referred to as ura5 genes) were searched for the following gene databases: a) swissprot, b) sptrembl, c) pir, d) embl, e) gene bank, f) em_tags , g) gb_tagsEMBL.
  • Ura5 and pyrF genes of the following organisms were selected for the sequence comparison: Yarrowia lipolytica, Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli, Rhizomu cor circmelloides, Colletot ⁇ chum grammicola, T ⁇ choderma reesei and Sorda ⁇ a macrospora.
  • the ammosaur sequences of the pyrF genes mentioned were compared.
  • the sequence comparison identified three peptides with a length of 6 to 9 amino acids that were completely conserved in all pyrF proteins. Two of these peptides were translated back into consideration degenerate codons DNA to produce degenerate primers.
  • the primers had the following sequences (the abbreviation I denotes the base Inosm):
  • Primer A 5 '-TTYGGICCIGCITAYAARGGIATHCC-3' SEQ ID NO: 4
  • Primer B 5 '-TTICCICCYTCICCRTGRTCYTT-3' SEQ ID NO: 5
  • PCR amplifications were carried out according to the state of the art according to the manufacturer's instructions (PCR kit from Qiagen, Hilden): A 50 ⁇ l PCR reaction contained 100 ng chromosomal T. versicolor DNA (isolated as described in Example 2), the buffer provided by the manufacturer and, in addition, 1.25 U Taq polymerase, 1.25 mM MgCl2, 0.2 M each of the four dNTPs (dATP, dCTP, cGTP, dTTP, and 100 pmol each of primers A and B) Further conditions for the specific amplification of the desired PCR product were: 4 mm at 94 ° C., followed by 10 cycles of 1 mm at 94 ° C., 1 mm at 45 ° C.
  • PCR product of approximately 140 bp was obtained The PCR product was obtained by agarose gel electrophoresis purified, cloned into the pCR-Script vector (cloning kit from Stratagene, Heidelberg) and transformed into E. coli. The plasmid was isolated from the cultivation of transformed E. coli. DNA sequence analysis from the 5 'and 3' ends confirmed that the cloned DNA fragment was the fragment of a pyrF gene.
  • the pyrF-specific PCR fragment was cut out by treatment with Not I and Eco RI, isolated by agarose electrophoresis and with the non-radioactive “Gene Images” detection kit from the company Amersham, Braunschweig marked.
  • the strain Trametes versicolor TV-1 (deposited with the DSMZ German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, D-38124 Braunschweig under the number DSM 11523) was used. Trametes versicolor mycelium was first obtained by culturing for 7 days at 28 ° C on malt agar plates (3% malt extract, 0.3% peptone from soybean meal, 1.5% agar agar, pH 5.0). Three pieces were punched out of the malt agar plates and 100 ml of sterile malt extract medium (3% malt extract, 0.3% peptone from soybean meal, pH 5.0) were inoculated into 500 ml Erlenmeyer flasks.
  • the culture was incubated under rubble at 100 rpm for 7 days at 28 ° C.
  • the mycelium suspension prepared in this way was sucked off through a porcelain suction filter and washed with 0.9% saline.
  • 1 g of T. versicolor mycelium was ground into a fine powder in the presence of liquid nitrogen using a mortar and pestle.
  • the powder was taken up in a sterile sample vessel and immediately with 5 ml of extraction solution (0.1 M Tris-HCl, pH 8.0, 0.1 M EDTA, 0.25 M NaCl, 0.6 mg / ml Proteinase K) and 0, 5 ml of a 10% (w / v) sodium lauroyl sarcosine solution are added.
  • the mixture was mixed with 0.85 ml of 5 M NaCl and 0.7 ml of a 10% (w / v) CTAB solution in 0.7 M NaCl and incubated 30 mm at 65 ° C.
  • 7 ml of a chloroform-isoamyl alcohol mixture 24: 1
  • the mixture was shaken out, the two phases were separated by centrifugation, the aqueous phase was removed and chromosomal DNA was precipitated by adding 0.6 part by volume of isopropanol.
  • the precipitated DNA was then further purified on a column (Qiagen Genomic Tip). In this way, 0.5 mg of chro-osmale DNA could be isolated from 16 g of mycelium.
  • chromosomal gene bank 90 ⁇ g of chromosomal DNA from Trametes versicolor TV-1 were cut in a partial digest with Sau 3A and separated by agarose gel electrophoresis.
  • the chromosomal DNA fragments were isolated in the large range of 5-20 kb and large 20 kb and cloned into lambda phages pre-cut with Bam HI ("Lambda Zap Express" cloning system from Stratagene). From the 5-20 kb DNA 4 x 10 4 phages / ⁇ g vector DNA were obtained and 5 ⁇ 10 4 phages / ⁇ g vector DNA were obtained from the DNA fraction larger than 20 kb. The phages were obtained by infection of the E. coli strain XL-1 Blue MRF ' amplified.
  • the chromosomal library of Trametes versicolor TV-1 described in the second example was used. Screening for the genomic pyrF gene was carried out according to the prior art. In a first screen, cells of E. coli XL-1 Blue MRF 'were first cultivated on 10 Petri dishes and then infected with 50,000 phages from the chromosomal gene bank (5-20 kb fraction, see 2nd example) per Petri dish. After incubation at 37 ° C. overnight, the newly formed phages were transferred to nylon filters (Stratagene). The filters were then manufactured according to the manufacturer's recommendations non-radioactive labeled pyrF-specific probe (see 1st example) hybridized. The hybridization temperature was 60 ° C.
  • the clone pyrF61 contained sequence information for the pyrF structural gene (coding region, SEQ ID NO: 1, bp 1133-1877).
  • the coding sequence region additionally contained an intron (SEQ ID NO: 1, bp 1226-1286), which is not translated in the amino acid sequence.
  • the corresponding pyrF cDNA gene is given in SEQ ID NO: 2.
  • the pyrF structural gene contained in clone pyrF61, without the intron sequence, codes for a protein with the amino acid sequence given in SEQ ID NO: 3.
  • clone pyrF61 also contained sequence information m in region 5 'before the ATG start codon (promoter region, SEQ ID No: 1, bp 1 - 1132) and sequence information m in region 3' after the stop codon (terminator region, SEQ ID No: 1, bp 1878-3448).
  • promoter region SEQ ID No: 1, bp 1 - 1132
  • sequence information m in region 3' after the stop codon terminal region, SEQ ID No: 1, bp 1878-3448.
  • Vector pPyrFl was cut with Sac I, the imaged, 4.6 kb vector isolated by agarose gel electrophoresis and dephosphorylated by treatment with alkaline phosphatase.
  • the vector prepared in this way was ligated with the marker oligonucleotides PyF-1 (SEQ ID NO: 6) and PyF-2 (SEQ ID NO: 7).
  • PyF-1 and PyF-2 had the following sequence:
  • Example I interface (in addition to two already contained m pPyrFl).
  • the vector produced in this way (approx. 4.5 kb supra) received the designation pPyrF2.
  • the DNA sequence of the promoter for the T. versicolor GAPDH gene is disclosed in DE-A-19814853, SEQ ID NO: 3, bp 1-1542.
  • An approximately 1 kb promoter fragment of the GAPDH gene was isolated as a Sph I fragment and cloned into a pUC19 vector.
  • Eco RI obtained in the polylinker of pUC19
  • BspLUll I obtained in the GAPDH promoter fragment
  • a singular BspLUll I interface had previously been removed from the pUC19 vector used for the production of pTVgap, which would have been disruptive in the further vector construction. This was done by cutting the pUC19 vector with BspLUll I and treating the vector which had thereby been immersed with Klenow DNA polymerase. This filled in the ends of the pUC19 vector which had been displaced after the BspLUll I digestion. Subsequent ligation and transformation of E. coli Top 10F resulted in clones which contained a modified pUC19 vector without a BspLUll I interface.
  • the vector pTVgap was cut with BspLUll I and Eco RI, the resulting 3.7 kb vector fragment was isolated by agarose gel electrophoresis and dephosphorylated by treatment with alkaline phosphatase.
  • the pyrF gene was isolated from the vector pPyrF2 as a 1.6 kb BspLUll I - Eco RI fragment.
  • pPyrF2 was first partially cut with BspLUll I and the 4.6 kb linear Isolated vector fragment isolated by agarose gel electrophoresis. The isolated 4.6 kb fragment was then cut with Eco RI. The desired 1.6 kb pyrF gene fragment was obtained, which was isolated by agarose gel electrophoresis.
  • BspLUll I interface was functionally linked to the GAPDH promoter ver ⁇ were identified by restriction analysis. The correct linkage of the GAPDH promoter with the start ATG codon of the pyrF gene was confirmed by DNA sequencing. The correct clone was 5.3 kb in size and was named pPyrFgap (Fig. 2).
  • the dikaryotic strains Trametes versicolor TV-1, Trametes versicolor 38070 (available from American Type Culture Collection, Rockville, MD 20852 USA) and the monokaryotic strain Trametes versicolor F2 100 (deposited with the DSMZ) were used to obtain protoplasts German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, D-38124 Braunschweig under number DSM 11972).
  • Trametes versicolor mycelium was first obtained by culturing for 7 days at 28 ° C. on malt agar plates (3% malt extract, 0.3% peptone from soybean meal, 1.5% agar agar, pH 5.0). There were three of the malt agar plates
  • the culture was incubated without debris at 28 ° C for 7 days until the culture fluid thickly covered with a mycelium mat.
  • the culture fluid was decanted and fresh medium added (30 ml for the mycelium of a 100 ml culture).
  • the mycelium was homogenized with an Ultra Turrax (9500 rpm, 4 min) and incubated with shaking at 100 rpm for a further 18 h at 28 ° C.
  • the mycelium suspension prepared in this way was harvested by centrifugation for 5 min at 1500 rpm (2000 ⁇ g) and the mycelium obtained in this way was suspended three times by suspending with 0.1 M MgSO 4 , 0.6 M sucrose, 0.1 M phosphate, pH 5 , 8 (OMT medium) and subsequent centrifugation.
  • the isolated mycelium was weighed and stored at 4 ° C until treatment with lytic enzyme.
  • Protoplasts were prepared as follows: In a sterile Erlenmeyer flask, mycelium from a flask was suspended in 15 ml of a freshly prepared and sterile-filtered solution of the lytic enzyme mixture Novozym 234 (3 mg / ml, Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark) in OMT medium. The mycelium resuspended in the enzyme solution was incubated at low speed (80 rpm) on a shaking incubator (Infors) for 1 to 3 h at 30 ° C. During the incubation, the formation of the protoplasts was observed in the microscope. Free moving protoplasts were usually seen after 1 h.
  • the end point of the protoplasting was determined by visual inspection under a microscope and the protoplasts were separated from residual mycelium by filtration through glass wool in a glass filter. The glass wool was carefully washed with ice-cooled OMT medium. Protoplasts were isolated by centrifuging the suspension in a sterile sample vessel (2000 rpm; 2500 xg, 4 ° C, 10 mm). The cells were further processed at 4 ° C. The protoplast pellet was washed by suspending in OMT medium and reisolated by centrifugation. If necessary, the washing step was repeated. The concentration of protoplasts was observed under the microscope in a number chamber Right. The protoplast suspension was adjusted to a concentration of 1 x 10 8 protoplasts / ml for experiments for protoplast regeneration or for transformations.
  • dilution series were prepared from the protoplast suspension and plated on agar plates which contained 1.5% malt extract, 0.1% trypticase peptone, 2% glucose, 1.5% agar and, for osmotic stabilization, 0.4 M mannitol.
  • the proportion of viable cells was determined and tested whether the protoplasts obtained could be regenerated to mycelium-like growth.
  • the proportion of osmotically stable cells eg mycelium fragments
  • Uridine-auxotrophic mutants of Trametes versicolor with a gene defect in the pyrimidine metabolism were based on the method described in Boeke et al. , Methods Enzymol. (1987) 154, 164-175.
  • the genotoxic substance 5-fluoro-orotic acid (FOA) was used as a selective agent.
  • Trametes versicolor protoplasts were mutagenized by UV treatment.
  • the monocaryotic strain Trametes versicolor F2 100 described in the fifth example was used for the mutagenesis. Plastics of this strain were produced as described in the 5th example.
  • a BioRad UV linker BioRad, Kunststoff, power 5.8 W / cm 2 , distance from the UV source 16 cm
  • the number of ver for mutagenesis ⁇ applied protoplasts was 8 x q 10th Protoplasts from Trametes versicolor were placed in a Petri dish and irradiated with UV light for different lengths of time. It was found that, under the conditions described, irradiation for 60 seconds was optimal for the subsequent selection of auxotrophic mutants.
  • the MM medium was supplemented with 0.6 M sucrose (MMS medium) for the osmotic stabilization of protoplasts.
  • MMS medium 0.6 M sucrose
  • the MM medium was produced without agar in liquid culture.
  • the MMS medium was supplemented with different concentrations of FOA and 10 mM uridine in order to characterize the growth properties on a selective medium for different tram strain strains. It was found that MMS medium with 1.5 mg / ml FOA and 10 mM uridine (selective MMS) completely suppressed the growth of the trametes strain investigated.
  • Mutagenesis with FOA can either lead to mutants in the desired pyrF gene (orotic acid phosphoribosyltransferase) or in the pyrG gene (orotodin 5 'phosphate decarboxylase).
  • pyrG mutants and pyrF mutants were differentiated by transformation with the pyrF gene from Trametes versicolor, the isolation of which was described in the third example (plasmid pyrF61).
  • uridine auxotrophic T. versicolor strains were also transformed with the plasmid pPyrFgap (preparation see example 4). The transformation of Trametes versicolor is described in the 7th example.
  • the pyrF gene described in the second example is a new selection marker gene for the transformation of Trametes versicolor.
  • the strains Trametes versicolor F2 100C2-1, F2 100C2-8 and F2 100C4-13 are the first pyrF-deficient strains of Trametes versicolor described so far. These pyrF-deficient strains can serve as host organisms for the transformation of Trametes versicolor and are therefore new valuable host organisms for protein expression and protein secretion in filamentous fungi from the class of the Basidiomycetes.
  • the use of the strain F2 100C2-1 for this purpose is described in the following examples. 7. example
  • T. versicolor F2 100C2-1 were produced according to the procedure described in the 5th example.
  • the growth medium for the auxotrophic strain had been supplemented with 10 M rpm. It was (as described in Example 3) with the vector pyrF ⁇ l or pPyrFgap (described in Example 4) trans ⁇ formed.
  • protoplasts of Trametes versicolor F2 100C2-1 were produced and suspended in a final concentration of 10 8 / ml.
  • incubation vessels of 12 ml volume 0.1 ml aliquots of the protoplasts were mixed with 10 ⁇ g DNA of the plasmid in question and incubated 30 mm on ice. Then slowly and with repeated mixing, 1.25 ml of a PEG4000 solution was added to the transformation mixture. After a further 20 mm incubation at room temperature, the reaction vessels were filled with the OMT medium described in the fifth example, mixed and centrifuged 10 mm at 4 ° C. at 2000 ⁇ g.
  • the pellets were resuspended and plated on osmotically stabilized MMS plates without uridine (described in the 6th example). The plates were incubated at 28 ° C for 14 days and checked for growth of colonies. In various experiments, transformation rates of 0.5 - 3 transformants / ⁇ g plasmid DNA were achieved.
  • Mycelium of the transformants obtained was picked and cleaned by plating on fresh plates with MM medium.
  • the inoculum was applied punctiform in the middle of the plate. After incubation for about 7 days at 28 ° C, radial mycelium growth was observed. This cleaning process was repeated, taking the inoculum mycelium from the edge of the first cleaning plate. MM plates were then inoculated again with the inoculum of the second cleaning plate and incubated at 28 ° C. until the plates were completely covered with mycelium.
  • the hybridization temperature for the DNA blotted on nylon filters with the non-radioactively labeled DNA probe was 60 ° C. Otherwise, the conditions described in the literature for Southern blots were met. Southern blots were evaluated by autoradiography. In addition to other fragments, two Nco I fragments from the pBK CMV vector portion of pyrF ⁇ l with a length of 0.7 kb or 1.9 kb were detected. These two fragments could only be found in the transformants, but not in the Uridm auxotrophic strain F2 100C2-1 be detected.
  • Protoplasts from T. versicolor were produced according to the method described in the fifth example.
  • the vector pyrF61 described in the second example and the laccase expression vector pLac3gap were used for the transformation.
  • the two vectors were used in co-transformation experiments where the selection marker gene and the gene to be expressed are contained on separate plasmids.
  • the production of pLac3gap is disclosed in DE-A-19814853, 6th example.
  • the gene for laccase III from T. versicolor is functionally linked to that of the GAPDH promoter from T. versicolor.
  • protoplasts of the pyrF-deficient strain Trametes versicolor F2 100C2-1 were produced and suspended in a final concentration of 10 8 / ml.
  • 0.1 ml aliquots of the protoplasts were mixed with 10 ⁇ g DNA of the plasmids pLac3gap and pyrF ⁇ l in incubation vessels of 12 ml volume and incubated on ice for 30 min. Then slowly and with repeated mixing, 1.25 ml of a PEG4000 solution was added to the transformation mixture. After a further 20 min incubation at room temperature, the reaction vessels were filled with the OMT medium described in the 5th example, mixed and centrifuged for 10 min at 4 ° C.
  • transformants obtained were picked and, as described in the 7th example, cleaned twice by plating out on fresh plates with MM selection medium without uridine. Selective plates were then inoculated again with the inoculum of the second cleaning plate and after the plates were completely covered with mycelium, the laccase production was checked in shake flask cultures.
  • Laccase activity was measured photometrically with the substrate ABTS (2, 2'-azino-bis (3-ethyl-benzothiazolin-6-sulfonic acid) at 420 nm. (Extinction coefficient of ABTS at 420 nm ⁇ 42Q : 3.6 x 10 4 [1 x mol "1 x cm " 1 ]). 1 U of laccase activity corresponded to the conversion of 1 ⁇ mol ABTS / min at 37 ° C and a pH of 4.5.
  • Transformants of the F2 100 strain increased by a factor of 14 (without induction) or a factor of 6 (with induction) compared to the non-transformed parent strain.
  • microorganism referred to under I was received by this international depository on (date of first deposit) and an application for the conversion of this first deposit into a deposit under the Budapest Treaty was received on (date of receipt of the request for conversion).
  • microorganism referred to under I was received by this international depository on (date of first deposit) and an application for the conversion of this first deposit into a deposit under the Budapest Treaty was received on (date of receipt of the request for conversion).

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein pyrF-Gen und seine Verwendung als Selektionsmarkergen für ein Expressionssystem zur Produktion von Proteinen in Pilzen der Gattungen Trametes, Coriolus oder Polyporus. Das pyrF-Gen ist dadurch gekennzeichnet, dass es die DNS-Sequenz SEQ ID NO:1 ab Position 1133 bis einschliesslich Position 1877 umfasst oder die DNS-Sequenz SEQ ID NO:2 ab Position 1 bis einschliesslich Position 684 umfasst oder eine DNS-Sequenz mit einer Sequenzhomologie grösser als 60 % zu den genannten Bereichen der DNS-Sequenz SEQ ID NO:1, oder SEQ ID NO:2 umfasst.

Description

pyrF Gen und seine Verwendung
Die Erfindung betrifft ein pyrF-Gen und seine Verwendung als Selektionsmarkergen für ein Expressionssystem zur Produktion von Proteinen in Pilzen der Gattungen Trametes, Coriolus oder Polyporus .
Zur Proteinproduktion sind verschiedene prokaryontische und eu- karyontische Expressionssysteme bekannt. Die Anmeldung DE-A- 19814853 beschreibt ausfuhrlich den diesbezüglichen Stand der Technik. DE-A-19814853 selbst offenbart ein Verfahren zur Transformation von filamentosen Pilzen aus den Gattungen Trametes und Polyporus, mit dem signifikant höhere Produktionsraten für ein jeweils expnmiertes Protein erzielt werden können. Die Anmeldung offenbart Expressionsvektoren, die genetische Regulationselemente für die Expression in filamentosen Pilzen der Klasse der Basidiomyceten enthalten. Sie erlauben bei Transformation filamentoser Pilze der Klasse der Basidiomyceten die Selektion positiver Transformanten aufgrund der Komplementation eines auxotrophen Gendefekts.
Der in DE-A-19814853 offenbarte Gendefekt betrifft das pyrG-Gen. Dieses Gen kodiert für die Orotidin-5 ^-Phosphat Decarboxylase . DE-A-19814853 offenbarte ferner Stamme mit einem Defekt im pyrG- Gen, die auf Minimalmedium nur in Gegenwart von Uridin wachsen können (Uridin Auxotrophie) . Nach Transformation dieser Stamme mit DNS-Vektoren, die ein intaktes pyrG-Gen enthalten, wachsen die Uridin-auxotrophen Stamme wieder auf Minimalmedium ohne U- ridin (Uridin Prototrophie) .
Uridin-auxotrophe Stamme werden nach dem Stand der Technik (Boeke et al., Methods Enzymol. (1987) 154, 164 - 175) durch Behandlung mit der genotoxischen Substanz 5-Fluor-Orotsaure (FOA) isoliert. Bei der Behandlung mit FOA erzeugte Uridin- auxotrophe Stamme besitzen einen genetischen Defekt entweder im pyrG-Gen oder im pyrF-Gen. Das pyrF-Gen wird auch ura5-Gen genannt. Es kodiert für das Enzym Orotsaure-Phosphoπbosyl- transferase .
Auch Uridm-auxotrophe Basidiomycetenstamme mit einem Defekt im pyrF-Gen waren wertvolle Stamme für die Transformation zum Zweck der Proteinproduktion, wenn das intakte pyrF-Gen aus Basidiomyceten als Selektionsmarkergen für die effiziente Transformation zur Verfugung stände. PyrF-Gene sind aber bisher nur für Pilze aus der Klasse der Ascomyceten wie z. B. Podospora anseπna (Gene 5_3 (1987), 201 - 209), Kluyveromyces lactis (unveröffentlicht, die DNS-Sequenz ist m der „Genbank" Datenbank unter der Zugangsnummer kl 001358. gb_pl abgelegt) oder Yarrowia lipolytica (M. Sanchez et al., Yeast 11 (1995), 425 - 433) be- schrieben worden. Dagegen sind keine pyrF-Gene von filamentosen Pilzen aus der Klasse der Basidiomyceten wie z.B. der Gattungen Trametes, Coriolus oder Polyporus bekannt.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, pyrF-Gene von filamentosen Pilzen aus der Klasse der Basidiomyceten zur Verfugung zu stellen. Diese Gene eignen sich zur Verwendung als Selektionsmarkergene für die Transformation Uπdm-auxotropher Stamme.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine DNS-Sequenz, die für ein Protein mit Enzymaktivitat der Orotsaure-Phosphoribosyl- transferase (pyrF-Aktivitat ) kodiert, dadurch gekennzeichnet, daß sie die chromosomale DNS-Sequenz SEQ ID NO:l ab Position 1133 bis einschließlich Position 1877 umfaßt oder die cDNS- Sequenz SEQ ID NO: 2 ab Position 1 bis einschließlich Position 684 umfaßt oder eine DNS-Sequenz mit einer Sequenzhomologie großer als 60 % zu der DNS-Sequenz SEQ ID NO:l oder SEQ ID NO: 2 umfaßt .
Bevorzugt ist eine DNS-Sequenz mit einer Sequenzhomologie gro- ßer als 70 % zu der DNS-Sequenz SEQ ID NO : 2.
In einer besonders bevorzugten Ausfuhrung umfaßt die vorliegende Erfindung eine DNS-Sequenz mit einer Sequenzhomologie großer als 80 % zu der DNS-Sequenz SEQ ID NO: 2.
In der vorliegenden Erfindung beziehen sich alle erwähnten Homologiewerte auf Ergebnisse, die mit dem Computerprogramm "Wis¬ consin Package Version 9.1, Genetics Computer Group (GCG) , Ma- dison, Wisconsin" erhalten werden. D e Homologiebestimmung erfolgt durch eine Suche in der Datenbank mit dem Unterprogramm "blast" und den voreingestellten Werten (Trefferhaufigkeit 10,0) . Die ahnlichsten Sequenzen werden dann mit dem Unterprogramm "gap" auf Homologie untersucht. Hierbei werden die voreingestellten Parameter "gap creation penalty 50" und "gap extension penalty 3" verwendet, um DNS-Sequenzen zu vergleichen. Um Ammosauresequenzen zu vergleichen, werden die voreingestellten Parameter „gap weight 8" und „length weight 2" verwendet .
Die erfmdungsgemaße DNS Sequenz SEQ ID NO:l von Position 1133 bis einschließlich Position 1225 und ab Position 1287 bis einschließlich Position 1877, bzw. die davon abgeleitete cDNS- Sequenz SEQ ID NO: 2 von Position 1 bis einschließlich Position 684 kodiert für ein Protein mit pyrF-Aktivitat .
Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch ein Protein mit pyrF-Aktivitat , dadurch gekennzeichnet, daß es die Ammosaure- sequenz SEQ ID NO : 3 umfaßt oder eine Aminosauresequenz mit ei- ner Sequenzhomologie großer 60 % zur Aminosauresequenz SEQ ID NO: 3 umfaßt.
Bevorzugt ist eine Aminosauresequenz mit einer Sequenzhomologie großer als 70 % zu der Aminosauresequenz SEQ ID NO: 3. Insbesondere bevorzugt m der vorliegenden Erfindung ist eine Aminosauresequenz mit einer Sequenzhomologie großer 80 % zu der Aminosauresequenz SEQ ID NO : 3.
Die DNS-Sequenz SEQ ID NO:l ab Position 1226 bis einschließlich Position 1286 ist ein Intron, das nicht in Aminosauresequenz translatiert wird.
Die DNS-Sequenz SEQ ID NO:l gibt von Position 1 bis Position 1132 die DNS Sequenz für die Promotorregion zur Transkription des pyrF-Gens aus Tramtetes versicolor wieder. Diese Promotorsequenz laßt sich gegen beliebige andere Promotorsequenzen zur Transkription austauschen.
Die erfmdungsgemaße DNS-Sequenz laßt sich beispielsweise durch
Klonierung aus dem Basidiomycetenstamm Trametes versicolor TV-1
(hinterlegt bei der DSMZ Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, D-38124 Braunschweig unter der Nummer
DSM 11523) erhalten. Dazu wird mittels an sich bekannter Metho- den eine Genbank von Trametes versicolor TV-1 erstellt. Es kann sich dabei um eine cDNS- oder um eine genomische Genbank han¬ deln.
Zur Isolierung der erfmdungsgemaßen DNS-Sequenz m der Genbank werden DNS-Sonden verwendet, die pyrF-spezifische DNS-Sequenzen enthalten. Solche DNS-Sonden lassen sich beispielsweise mittels PCR-Reaktion unter Verwendung von DNS-Primern aus genomischer DNS von Trametes versicolor TV-1 gewinnen.
Als Primer werden degenerierte DNS Abschnitte einer Lange von vorzugsweise 23 bis 26 bp verwendet, deren Sequenz durch Sequenzvergleich bekannter pyrF-Gene festgelegt wird. Die als Primer geeigneten DNS-Abschnitte erhalt man vorzugsweise durch Oligonukleotidsynthese der festgelegten DNS-Abschnitte . Die I- solation eines erfmdungsgemaßen pyrF-Gens kann beispielsweise wie in den Beispielen 1 bis 3 beschrieben erfolgen.
Ein beispielsweise derart isoliertes pyrF-Gen laßt sich mittels dem Fachmann bekannten Techniken wie beispielsweise der Site directed Mutagenese an jeweils gew nschter Position der Sequenz modifizieren. Daher ist auch eine DNS-Sequenz kodierend für ein Protein mit pyrF-Aktivitat umfassend eine DNS-Sequenz mit einer Sequenzhomologie großer als 60 %, bevorzugt 70 %, besonders be¬ vorzugt 80% zu der DNS-Sequenz SEQ ID NO: 2 ab Position 1 bis einschließlich Position 684 von der Erfindung umfasst.
Zur Expression der erfmdungsgemaßen DNS wird diese n an sich bekannter Art und Weise in einem Expressionsvektor klomert, dieser das pyrF-Gen enthaltende Expressionsvektor in einen Mik- roorganismus eingebracht und m dem Mikroorganismus exprimiert.
Die Erfindung betrifft daher auch einen Expressionsvektor der dadurch gekennzeichnet ist, daß er ein erf dungsgemaßes pyrF- Gen enthalt.
Die erfmdungsgemaßen Expressionsvektoren eignen sich insbesondere zur Expression von Genen die für Proteine kodieren einem Wirtsorganismus der Gattung Trametes, Coriolus und Polyporus. Unter Genen die für Proteine kodieren sind im Sinne der Erfindung auch die von den Strukturgenen abgeleiteten cDNS-Gene der Proteine zu verstehen. Bei den Proteinen kann es sich um f r den Wirtsorganismus heterologe Proteine oder um für den Wirtsorganismus homologe Proteine handeln.
Der erfmdungsgemaße Expressionsvektor enthalt somit vorzugsweise auch mindestens ein Gen, das für ein zu expπmierendes Protein kodiert .
Besonders bevorzugt enthalt der erfmdungsgemaße Expressions- vektor mindestens ein Gen, das für ein hydrolytisches Enzym z.B. aus der Gruppe der Cellulasen, Hemicellulasen und Lipasen oder aus der Gruppe der Oxidoreduktasen wie z.B. den Lignin- peroxidasen, Manganperoxidasen, Laccasen, Cellobiose-Chinon- Oxidoreductase oder Cellobiose-Oxidase kodiert.
Insbesondere bevorzugt enthalt der erfmdungsgemaße Expressionsvektor ein Gen für eine Laccase.
Bei dem erfindungsgemaßen Expressionsvektor kann es sich um ein DNS-Konstrukt handeln, das in das Genom des Wirtsorganismus integriert und zusammen mit diesem repliziert wird. Alternativ kann es sich bei dem Expressionsvektor um ein autonom replizierendes DNS-Konstrukt handeln, das nicht in das Wirtsgenom integriert, wie z.B. ein Plasmid, ein artiflzielles Chromosom oder ein vergleichbares extrachromosomales genetisches Element.
Ein erfindungsgemaßer Expressionsvektor sollte vorzugsweise auch folgende genetische Elemente enthalten:
Einen Promotor, der die Expression eines proteinkodierenden Gens in dem Wirtsorganismus vermittelt. Es sollte sich dabei vorzugsweise um einen starken Promotor handeln, damit eine hohe Expressionsleistung gewährleistet werden kann. Der Promotor ist vorzugsweise funktionell mit dem 5 ' -Ende des zu exprimierenden Gens verknüpft. Der Promotor kann von dem zu exprimierenden Gen stammen oder es kann auch der Promotor eines fremden Gens verwendet werden.
Vorzugsweise geeignete Promotoren sind ausgewählt aus der Grup- pe der in filamentosen Pilzen der Klasse der Basidiomyceten aktiven Promotoren wie z. B. der GAPDH-Promotor aus Trametes versicolor, Promotoren für Laccasegene aus Trametes versicolor o- der Polyporus pinsitus, der Promotor für das Ornithin- Transcarbamoylasegen oder das GAPDH-Gen aus Coriolus hirsutus oder der GAPDH-Promotor aus Agaricus bisporus. Besonders bevorzugt ist der GAPDH-Promoter aus Trametes versicolor. Dieser Promotor ist in DE-A-19814853 Beispiel 5 und DE- A-19814853, SEQ ID NO: 3, Base 1 - 1542 offenbart.
Ferner sollten vorzugsweise für den Wirtsorganismus passende Signale für die Transkπptionstermmation und Eukaryonten zusätzlich Signale für die Polyadenylierung m dem Expressionsvektor enthalten und funktlone11 mit dem 3 ' -Ende des zu expπ- mierenden Gens verknüpft sein. Solche Signale für die Trans- kriptlonstermmatlon und Polyadenylierung sind z.B. SEQ ID NO:l, bp 1878 - 3448 gezeigt.
Als Transkriptionsterminator kann der Terminator des zu expπ- mierenden proteinkodierenden Gens verwendet werden oder aber der Terminator eines fremden Gens. Bevorzugt wird der Transkriptionsterminator aus dem Gen einer Laccase verwendet.
Die Expression der Proteine kann intrazellular oder m Gegen- wart einer funktionsfähigen Signalsequenz, zum Zweck der Sekretion, auch extrazellular erfolgen.
Falls die Sekretion des expπmierten Proteins aus der Zelle erwünscht ist, enthalt der erfmdungsgemaße Expressionsvektor vorzugsweise eine funktionstüchtige Signalsequenz 5' vor dem proteinkodierenden Gen. Daruberhinaus kann auch em sogenannter Sekretionscarrier, funktionell mit dem 5' -Ende des proteinkodierenden Gens verknüpft, m dem erfmdungsgemaßen Expressionsvektor enthalten sein,
Bei dem Sekretionscarrier kann es sich um das Gen für em sekretiertes Protein oder um das Fragment eines Gens für em sekretiertes Protein handeln. Der Sekretionscarrier kann mit dem zu sekretierenden Protein funktionell so verknüpft sein, daß em Fusionsprotein aus Sekretionscarrier und dem zu sekre- tierenden Protein entsteht. In einer anderen Ausfuhrung ist die Verkn pfung von Sekretionscarrier und dem zu sekretierenden Protein so gestaltet, daß der Sekretionscarrier von dem zu sekretierenden Protein getrennt werden kann. Dies kann bei- spielsweise bewerkstelligt werden durch Einfügung einer Erkennungssequenz für eine proteinspaltendes Enzym m die Verknup- fungsstelle zwischen Sekretionscarrier und zu sekretierendem Protein. Als Beispiel hierfür sei genannt die Lysin-Argmm Erkennungssequenz für die sogenannte KEX2-Protease und als Bei- spiel für einen Sekretionscarrier die Glucoamylase aus Asper- gillus niger (Contreras et al., Bio/Technology (1991) 9, 378 - 381, Broekhuijsen et al., J. of Biotechnology (1993) 31, 135 - 145) .
DNS-Sequenzen, die anders als Transkriptionsterminatoren am 3'- Ende des proteinkodierenden Gens an der Expression und Sekretion des exprimierten Gens beteiligt sind, können ebenfalls m dem erfmdungsgemaßen Expressionsvektor enthalten sein. Em Beispiel dafür liefert das Gen für die Laccase aus Neurospora crassa, dessen 3 -Ende die Sequenz für 13 Aminosäuren enthalt, die wahrend der Sekretion des Proteins entfernt werden und im reifen Protein nicht mehr enthalten sind (Germann et al., J. Biol. Chem. (1988) 263, 885 - 896).
Die Herstellung der erfmdungsgemaßen Expressionsvektoren erfolgt mittels im Stand der Technik bekannter Verfahren. Verschiedene Möglichkeiten sind m den Beispielen dargelegt. Die dort beschriebenen Verfahren lassen sich vom Fachmann auf beliebige andere Vektoren, Resistenzgene, Regulationselemente und Strukturgene anwenden.
Die Erfindung betrifft ferner Mikroorganismen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie einen erf dungsgemaßen Expressionsvektor enthalten. Geeignete Mikroorganismen zur Expression eines erfmdungs- gemaßen Expressionsvektors sind Stamme filamentoser Pilze aus der Klasse der Basidiomyceten.
Besonders geeignet sind Stamme aus den Gattungen Trametes, Coriolus und Polyporus.
Besonders bevorzugte Wirtsorganismen sind monokaryontische Stamme aus den Gattungen Trametes, Coriolus und Polyporus.
Insbesondere bevorzugt sind Wirtsorganismen der Art Trametes versicolor .
Der Wirtsorganismus zeichnet sich vorzugsweise dadurch aus, daß er einen genetischen Defekt im Stoffwechselmetabolismus (Au- xotrophie) besitzt, aufgrund dessen der essentielle Stoffwech- selmetabolit Uridin nicht mehr synthetisiert werden kann und der Wirtsorgansimus auf Mmimalmedien ohne Zusatz dieses Stoff- wechselmetaboliten nicht mehr zum Wachstum befähigt ist.
Die erfmdungsgemaßen Expressionsvektoren erlauben die Selektion positiver Transformanten aufgrund Komplementation eines auxotrophen Gendefekts im Wirtsorganismus bei Transformation von Pilzen ausgewählt aus den Gattungen Trametes, Coriolus und Polyporus.
Die erfmdungsgemaßen Expressionsvektoren eignen sich zur Herstellung von Pilzstammen, die zur effizienten Expression und Sekretion von Proteinen befähigt sind.
Die Erfindung betrifft daher auch Verfahren zur Herstellung von Pilzstammen, die zur effizienten Expression und Sekretion von Proteinen befähigt sind.
Dieses Verfahren, bei dem em Pilz mit einem auxotrophen Gen- defekt als Wirtsstamm mittels an sich bekannter Verfahrensschritte mit einem Expressionsvektor, der em Gen zur Komple- mentation des auxotrophen Gendefekts im Wirtsstamm besitzt, in einem Transformationsansatz transformiert wird und aus dem Transformationsansatz mit dem Expressionsvektor transformierte Klone durch Selektion auf Komplementation des auxotrophen Gendefekts ausgewählt werden, wobei die Expression des Gens zur Komplementation des auxotrophen Gendefekts im Wirtsstamm durch e genetisches Regulationselement kontrolliert wird, das im Wirtsstamm aktiv ist, dadurch gekennzeichnet, daß als Wirtsstamm em Uridm-auxotropher Pilz ausgewählt aus den Gattungen Trametes, Coriolus und Polyporus mit einem Gendefekt im pyrF Gen eingesetzt wird.
Bevorzugt als Wirt für die Genexpression ist em monokaryon- tischer Basidiomycet aus der Gattung Trametes, Coriolus oder Polyporus .
Insbesondere bevorzugt für die Genexpression ist em Wirt der Art Trametes versicolor, der einen Defekt im pyrF Gen hat und für Uπdm auxotroph ist.
Die Erfindung betrifft auch e Expressionssystem umfaßend einen Wirtsstamm ausgewählt aus den Gattungen Trametes, Coriolus und Polyporus mit einem genetischen Defekt im Stoffwechselmeta- bolismus aufgrund dessen der für das Wachstum essentielle Stoffwechselmetabolit Uridin nicht mehr synthetisiert werden kann und der Wirtsstamm auf Minimalmedien ohne Zusatz dieses Stoffwechselmetaboliten nicht mehr zum Wachstum befähigt ist sowie einen Expressionsvektor enthaltend e Selektionsmarkergen, welches den auxotrophen Gendefekt des Wirtsstammes komplementiert, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirtsstamm als genetischen Defekt im Stoffwechselmetabolismus einen Defekt im pyrF Gen besitzt, und das Selektionsmarkergen em pyrF Gen ist. Das pyrF Gen stammt bevorzugt aus einem Pilz der Gattung Agari- cus, Coriolus, Polyporus, Pleurotus, Phanerochaete, Schizophyl- lum oder Trametes .
Insbesondere geeignet als Selektionsmarkergen für das erfin- dungsgemaße Expressionssystem ist das Orotsäure-Phospho- ribosyltransferasegen (pyrF Gen) aus einem filamentosen Pilz der Klasse der Basidiomyceten Trametes versicolor.
Bevorzugt geeignet für die Expression des pyrF Gens sind die erfindungsgemaßen Expressions ektore .
Vorzugsweise wird die Expression des pyrF Gens aus dem Basidiomyceten Trametes versicolor vom Promotor und ggf. Terminator für das pyrF Gen aus Trametes versicolor reguliert.
Das erfmdungsgemaße Expressionssystem eignet sich insbesondere zur Expression eines Gens, das für ein hydrolytisches Enzym z.B. aus der Gruppe der Proteasen, Cellulasen, Hemicellulasen und Lipasen oder aus der Gruppe der Oxidoreduktasen wie z. B. den Ligninperoxidasen, Manganperoxidasen, Laccasen, Cellobiose- Chinon-Oxidoreductase oder Cellobiose-Oxidase kodiert.
Insbesondere bevorzugt eignet es sich zur Expression eines Gens f r eine Laccase.
Die Transformation des Wirtsstammes erfolgt nach Methoden, die dem Stand der Technik entsprechen. Zu diesen Methoden gehören die Transformation von Protoplasten nach der CaCl./PEG-Methode, die Transformation durch Elektroporation oder die biolistische Transformation durch Beschüß mit DNS-haltigen Mikroprojektilen. Diese Verfahren sind in Standardlehrbuchern beschrieben.
Beispielsweise wird das zu transformierende Gen in bekannter Art und Weise in einen erfindungsgemaßen Expressionsvektor klo- niert und mittels der genannten Methoden in einen filamentosen Pilz ausgewählt aus den Gattungen Trametes, Coriolus und Polyporus eingebracht.
Das zu transformierende Gen kann aber auch in einen Expressionsvektor ohne Selektionsmarkergen kloniert werden und zusammen mit einem den auxotrophen Gendefekt des Wirtsstammes komplementierenden Vektor zur Erzeugung von Transformanten verwendet werden (Cotransformation) .
Der für die Transformation zu verwendende Stamm ist ein Uridin- auxotropher filamentoser Pilz ausgewählt aus den Gattungen Trametes, Coriolus und Polyporus. Bei dem betreffenden Stamm aus der Klasse der Basidiomyceten kann es sich um einen monokaryon- tischen oder aber auch um einen dikaryontischen Stamm handeln. In einer bevorzugten Ausführung handelt es sich um einen Uri- din-auxotrophen Stamm, der einen Defekt im pyrF Gen hat.
Besonders bevorzugt für die Transformation ist ein monokaryon- tischer, Uridin-auxotropher, pyrF defizienter Stamm aus der Art Trametes versicolor.
Die Selektion positiver Transformanten erfolgt beispielsweise, indem Protoplasten nach der Transformation mit Vektor DNS auf einem Medium ausgebracht werden, welchem zur osmotischen Stabilisierung der Protoplasten ein Zusatz wie z. B. Sorbitol, Man- nitol oder Saccharose beigefugt ist und welches die Selektion von Transformanten mit dem komplementierenden pyrF- Gen erlaubt.
In einer bevorzugten Ausfuhrung der Erfindung wird in einem homologen System der filamentose Pilz Trametes versicolor mit dem Gen einer Laccase aus Trametes versicolor transformiert. Dadurch wird eine Steigerung der Expressionsrate für die besagte Laccase erzielt, die die nach dem Stand der Technik erzielbare Produktionsrate in der Fermentation von 0,1 g Laccase/1 Kulturmedium signifikant verbessert.
Vorzugsweise verwendet man dazu den Promotor, der dem Laccase- gen eigen ist oder den Promotor für ein stark exprimiertes Gen aus Trametes versicolor. Vorzugsweise verwendet man die Promotoren der Laccasegene I und III, deren Isolierung und Verwendung in DE-A-19814853 offenbart ist. Den Promotor eines weiteren stark exprimierten Gens stellt der GAPDH Promotor für die Glycerinaldehyd-3-Phosphatdehydrogenase aus Trametes versicolor dar.
Vorzugsweise verwendet man Selektionsmedien, auf denen nur solche Transformanten von Trametes versicolor wachsen können, die mit einem funktionell exprimierten Selektionsmarkergen für das pyrF-Gen transformiert worden waren. Bevorzugt handelt es sich um ein im 6. Beispiel beschriebenes Minimalmedium in Abwesenheit von Uridin, auf dem pyrF auxotrophe Stamme von Trametes versicolor nicht mehr wachsen können, bzw. erst nach Zusatz von Uridin wieder wachsen können.
Die erfolgreiche Anwendung eines erfindungsgemaßen Expressionsvektors enthaltend das pyrF Gen als Selektionssystem ist abhangig von der effizienten Expression des Selektionsmarkergens in Trametes Transformanten. F r eine effiziente Expression sind entsprechende Expressionssignale notwendig.
In Trametes versicolor bewirken Expressionssignale aus Basidiomyceten mit überraschenderweise erheblich höherer Effizienz ei- ne funktioneile Expression als die anderweitig verfugbaren Expressionssignale aus Ascomyceten. Deshalb stehen bei den erfin- dungsgemaßen DNS Vektoren das pyrF Selektionsmarkergen vorzugsweise unter der Kontrolle von genetischen Regulationselementen aus Basidiomyceten, insbesondere bevorzugt von solchen ausge- wählt aus den Gattungen Trametes, Coriolus und Polyporus. Vorzugsweise steht das pyrF Gen unter der Kontrolle der ihm vorgeschalteten 5 ' -Promotorregion sowie der ihm nachgeschalteten 3' -Terminatorregion. Em solches DNS-Fragment, bei dem das pyrF Gen aus Trametes versicolor unter Kontrolle der Ex- pressionssignale des pyrF Gens aus Trametes versicolor steht, beschreibt SEQ ID NO:l.
Weiterhin kann das pyrF Gen unter der Kontrolle von Expressi- onssignalen aus Basidiomyceten stehen, die verschieden von denen des pyrF Gens sind. Zu den Expressionssignalen, die diese Funktion erfüllen, gehören GAPDH-Promotoren filamentoser Pilze aus der Klasse der Basidiomyceten, wie z.B. Coriolus hirsutus, Phanerochaete chrysosporium, Agaπcus bisporus oder Trametes versicolor, der OCT-Promotor aus Coriolus hirsutus, der Promo¬ tor der Laccase I oder der Laccase III aus Trametes versicolor sowie der Terminator des GAPDH-Gens aus Agaricus bisporus oder die Terminatoren des Laccase I, bzw. Laccase III Gens aus Trametes versicolor.
Besonders bevorzugt ist em Vektor, bei dem das pyrF Gen aus Trametes versicolor unter Kontrolle der Expressionssignale des GAPDH Gens aus Trametes versicolor steht. Ein solcher Vektor ist im 4. Beispiel beschrieben.
Insbesondere bevorzugt ist em Vektor, bei dem das pyrF Gen aus Trametes versicolor unter Kontrolle der Expressionssignale des pyrF Gens aus Trametes versicolor steht. Em solcher Vektor ist im 3. Beispiel beschrieben.
Das pyrF Gen kann jedes Gen sein, das für em Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Orotsaure-Phosphoπbosyl- transferase kodiert.
Bevorzugt stammt das pyrF Gen aus einem filamentosen Pilz aus der Klasse der Basidiomyceten, wie z.B. Agaricus bisporus, Pha- nerochaete chrysosporium, Coriolus hirsutus, Polyporus pinsi- tus, Schizophyllum commune oder Trametes versicolor.
Besonders bevorzugt ist das pyrF Gen aus Trametes versicolor.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins welches dadurch gekennzeichnet ist, daß das erfin- dungsgemaße Expressionssystem enthaltend ein das Protein kodie- rendes Gen in an sich bekannter Weise zur Proteinproduktion eingesetzt wird oder daß em Pilzstamm enthaltend ein das Protein kodierendes Gen, der nach dem erfmdungsgemaßen Verfahren hergestellt wurde, in an sich bekannter Art und Weise kultiviert wird.
Solche Herstellungsverfahren sind prinzipiell beispielsweise bekannt aus Eggert et al., Appl. Environ. Microbiol (1996) 62, 1151 - 1158, Martinez et al., Appl. Microbiol. Biotechnol . (1994) 41, 500 - 504, oder WO 93/08272.
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung. Die in den Beispielen verwendeten Standardmethoden zur Behandlung von DNS oder RNS, wie die Behandlung mit Restrikti- onsendonukleasen, DNS Polymerasen, Reverser Transkriptase etc. sowie die Standardverfahren wie Transformation von Bakterien, Southern und Northern Analyse, DNS Sequenzierung, radioaktive Markierung, Screening und PCR-Technologie wurden, wenn nicht anders angegeben, durchgeführt wie vom Hersteller empfohlen o- der wenn keine Herstelleranleitung vorhanden war entsprechend dem aus den Standardlehrbuchern bekannten Stand der Technik.
1.Beispiel
Isolierung einer pyrF-spezifischen DNS Sonde
Eine DNS-Sonde zur Isolierung eines pyrF-Gens wurde durch PCR- Amplifikation aus T. versicolor genomischer DNS mit degene- πerten Primern erzeugt. Die degenerierten Primer wurden anhand eines Sequenzvergleichs bekannter pyrF-Gene konstruiert. Gene für die Orotsaure Phosphoribosyltransferase (bezeichnet als pyrF Gene oder, m einer anderen Nomenklatur bezeichnet als ura5 Gene) wurden den folgenden Gendatenbanken gesucht: a) swissprot, b) sptrembl, c) pir, d) embl, e) genbank, f) em_tags, g) gb_tagsEMBL. Ura5, bzw. pyrF Gene folgender Organismen wurden für den Sequenzvergleich ausgewählt: Yarrowia li- polytica, Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli, Rhizomu- cor circmelloides, Colletotπchum grammicola, Tπchoderma reesei und Sordaπa macrospora. Die Ammosauresequenzen der genannten pyrF Gene wurden verglichen. Durch den Sequenzvergleich konnten drei Peptide mit einer Lange von 6 bis 9 Aminosäuren identifiziert werden, die in allen pyrF-Protemen vollständig konserviert waren. Zwei dieser Peptide wurden unter Berücksichtigung degenerierter Codons DNS zurück übersetzt, um degenerierte Primer herzustellen. Die Primer hatten die folgenden Sequenzen (die Abkürzung I bezeichnet die Base Inosm) :
Primer A: 5 ' -TTYGGICCIGCITAYAARGGIATHCC-3 ' SEQ ID NO: 4 Primer B: 5 ' -TTICCICCYTCICCRTGRTCYTT-3 ' SEQ ID NO: 5
PCR-Amplifikationen wurden entsprechend dem Stand der Technik nach den Angaben des Herstellers (PCR Kit von Qiagen, Hilden) durchgef hrt: Eine 50 μl PCR Reaktion enthielt 100 ng chromo- somaler T. versicolor DNS (isoliert wie m 2. Beispiel beschrieben) , den vom Hersteller bereitgestellten Puffer und da- ruberhmaus 1,25 U Taq Polymerase, 1,25 mM MgCl2, je 0,2 M der vier dNTPs (dATP, dCTP, cGTP, dTTP, und jeweils 100 pmol der Primer A und B. Die weiteren Bedingungen zur spezifischen Amplifikation des gewünschten PCR-Produkts waren: 4 mm bei 94°C, gefolgt von 10 Zyklen von 1 mm bei 94°C, 1 mm bei 45°C und 1 mm bei 65°C sowie 30 Zyklen von 1 mm bei 94°C, 1 mm bei 50°C und 1 mm bei 72°C. Es wurde em PCR-Produkt von ca. 140 bp erhalten. Das PCR-Produkt wurde durch Agarose Gelelektrophorese gereinigt, in den pCR-Script Vektor (Klonierkit von Stratagene, Heidelberg) kloniert und in E. coli transformiert. Aus der Anzucht transformierter E. coli wurde das Plasmid isoliert. Eine DNS-Sequenzanalyse vom 5'- und 3 ' -Ende bestätigte, daß es sich bei dem klonierten DNS-Fragment um das Fragment eines pyrF-Gens handelte .
Zur Vorbereitung der DNS-Sonde für das Screening von pyrF-Genen wurde das pyrF-spezifische PCR-Fragment durch Behandlung mit Not I und Eco RI ausgeschnitten, über Agarose Elektrophorese isoliert und mit dem nicht-radioaktiven „Gene Images" Detekti- onskit der Fa. Amersham , Braunschweig markiert.
2. Beispiel Herstellung einer chromosomalen Genbank aus Trametes versicolor.
Es wurde der Stamm Trametes versicolor TV-1 (hinterlegt bei der DSMZ Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, D-38124 Braunschweig unter der Nummer DSM 11523) verwen- det. Mycel von Trametes versicolor wurde zuerst durch Anzucht für 7 Tage bei 28°C auf Malzagarplatten (3 % Malz Extrakt, 0,3 % Pepton aus Sojabohnenmehl, 1,5 % Agar-Agar, pH 5,0) gewonnen. Von den Malzagarplatten wurden drei Stucke ausgestanzt und damit 100 ml steriles Malzextrakt Medium (3 % Malz Extrakt, 0,3 % Pepton aus Sojabohnenmehl, pH 5,0) in 500 ml Erlenmeyerkolben angeimpft. Die Kultur wurde unter Schuttein bei 100 rpm für 7 Tage bei 28°C inkubiert. Die auf diese Weise hergestellte My- celsuspension wurde über eine Porzellannutsche abgesaugt und mit 0,9 % Saline gewaschen. 1 g Mycel von T. versicolor wurden in Gegenwart von fl ssigem Stickstoff mit Morser und Pistill zu einem feinen Pulver zerrieben. Das Pulver wurde in einem sterilen Probengefäß aufgenommen und sofort mit 5 ml Extraktionslosung (0,1 M Tris-HCl, pH 8.0, 0,1 M EDTA, 0,25 M NaCl, 0,6 mg/ml Proteinase K) und 0,5 ml einer 10 % (w/v) Natriumlauroyl- sarcosinlosung versetzt. Nach Incubation bei 50°C für mindes- tens 2 h wurde das Gemisch mit 0,85 ml 5 M NaCl und 0,7 ml einer 10 % (w/v) CTAB-Losung in 0,7 M NaCl versetzt und 30 mm bei 65°C kubiert. Nach Zugabe von 7 ml eines Chloroform- Isoamylalkoholgemisches (24:1) wurde der Ansatz ausgeschüttelt, die beiden Phasen durch Zentrifugation getrennt, die wassrige Phase entfernt und chromosomale DNS durch Zugabe von 0,6 Volu- menanteilen Isopropanol gefallt. Die weitere Reinigung der gefällten DNS erfolgte anschließend ber eine Säule (Qiagen Geno- mic Tip) . Auf diese Weise konnten aus 16 g Mycel 0,5 mg chro o- somale DNS isoliert werden.
Zur Herstellung der chromosomalen Genbank wurden 90 μg chromosomale DNS von Trametes versicolor TV-1 m einem Partialverdau mit Sau 3A geschnitten und durch Agarose Gelelektrophorese auf- getrennt. Die chromosomalen DNS-Fragmente wurden im Großen- bereich von 5 - 20 kb und großer 20 kb isoliert und jeweils in mit Bam HI vorgeschnittene Lambda-Phagen kloniert („Lambda Zap Express" Klonierungssystem von Stratagene) . Von der 5 - 20 kb DNS-Fraktion wurden 4 x 104 Phagen/μg Vektor-DNS und von der DNS-Fraktion großer 20 kb wurden 5 x 104 Phagen/μg Vektor-DNS erhalten. Die Phagen wurden durch Infektion des E. coli Stammes XL-1 Blue MRF' ampliflziert .
3. Beispiel Isolierung des pyrF-Gens .
Es wurde die im 2. Beispiel beschriebene chromosomale Genbank von Trametes versicolor TV-1 verwendet. Das Screenmg nach dem genomischen pyrF-Gen wurde nach dem Stand der Technik durchgeführt. In einer ersten Screenmgrunde wurden Zellen von E. coli XL-1 Blue MRF' auf 10 Petrieschalen zuerst kultiviert und dann mit 50000 Phagen der chromosomalen Genbank (5 - 20 kb Fraktion, siehe 2. Beispiel) pro Petrieschale infiziert. Nach Inkubation bei 37°C über Nacht wurden die neu gebildeten Phagen auf Nylonfilter (Stratagene) transferiert. Die Filter wurden dann entsprechend αen Empfehlungen des Herstellers mit der nicht-radioaktiv markierten pyrF-spezifischen Sonde (siehe 1. Beispiel) hybridisiert. Die Hybπdisierungstemperatur betrug 60°C. Positive Klone wurden gepickt und durch Wiederholung des Screeningverfahrens gereinigt. Nach drei Runden der Verein- zelung wurden bei dem Screenmg 6 stark hybridisierende Pha- genklone isoliert, die nach einer Vorschrift des Herstellers (Stratagene) durch " m vivo excision" m den pBK CMV Vektor (Stratagene) umkloniert wurden. Analyse der Klone durch Verdau mit Restriktionsendonucleasen und PCR zeigte, daß es sich bei allen Klonen um pyrF-Gene handelte. Nach Sequenzanalyse von drei Klonen wurde vom längsten der pyrF-Klone ca. 3,4 kb Se- quenzmformation ermittelt. Dieser pyrF-Klon erhielt die Bezeichnung pyrF61 (SEQ ID NO: 1) . Der Klon pyrF61 enthielt Sequenzinformation für das pyrF-Strukturgen (kodierender Bereich, SEQ ID NO: 1, bp 1133 - 1877) . Der kodierende Sequenzbereich enthielt zusätzlich e Intron (SEQ ID NO: 1, bp 1226 - 1286), das nicht m Aminosauresequenz translatiert wird. Das entsprechende pyrF cDNS-Gen ist in SEQ ID NO: 2 angegeben. Das in Klon pyrF61 enthaltene pyrF-Strukturgen, ohne die Intronsequenz, ko- diert für em Protein mit der in SEQ ID NO: 3 angegebenen Aminosauresequenz .
Daneben enthielt Klon pyrF61 auch Sequenzinformation m der Region 5' vor dem ATG-Startkodon (Promotorbereich, SEQ ID No : 1, bp 1 - 1132) sowie Sequenzinformation m der Region 3' nach dem Stopkodon (Terminatorbereich, SEQ ID No: 1, bp 1878 - 3448) . Es handelt sich hierbei um neue genetische Regulationselemente für Trametes versicolor, die für die Herstellung von Expressionsvektoren zur Genexpression in filamentosen Pilzen aus der Klas- se der Basidiomyceten verwendet werden können.
4. Beispiel
Funktionelle Verknüpfung des Trametes versicolor GAPDH- Promotors mit dem pyrF-Gen aus Trametes versicolor A: Klonieren des pyrF-Gens in den pBluescript Vektor Für die weitere Bearbeitung wurde das pyrF-Gen aus pyrF61 in den Vektor pBluescript umkloniert . Dazu wurde das pyrF-Gen als 1,6 kb Sac I - Spe I Fragment aus dem im 3. Beispiel erhaltenen Klon pyrFδl isoliert und in den mit Sac I und Spe I vor- geschnittenen pBluescript Vektor subkloniert. Das dabei entstandene 4,6 kb Plasmid wurde pPyrFl genannt.
B : Einbau eines Linkers in pPyrFl für die funktionelle Verkn pfung des ATG Translationsstartkodons des pyrF-Gens mit dem GAPDH-Promotor
Vektor pPyrFl wurde mit Sac I geschnitten, der lmeaπsierte, 4,6 kb große Vektor durch Agarose Gelelektrophorese isoliert und durch Behandlung mit alkalischer Phosphatase dephosphory- liert. Der auf diese Weise vorbereitete Vektor wurde mit den Lmkeroligonukleotiden PyF-1 (SEQ ID NO : 6 ) und PyF-2 (SEQ ID NO: 7) ligiert. PyF-1 und PyF-2 hatten die folgende Sequenz:
Oligo PyF-1:
5 ' -CTAGACATGTCGCTCGAAÄAATACCAGACAGAGCT-3 ' SEQ ID NO: 6 Oligo PyF-2:
5 ' -CTGTCTGGTATTTTTCGAGCGACATGTCTAGAGCT-3 ' SEQ ID NO: 7
In PyF-1 und PyF-2 ist die Schnittstelle f r die Restπktions- endonuklease BspLUll I unterstrichen, die für die funktionelle Verknüpfung mit dem GAPDH-Promotor aus T. versicolor verwendet werden kann.
Ligationsansatze von Sac I geschnittenem pPyrFl mit den Linker- oligos PyF-1 und PyF-2 wurden in E. coli Top 10FΛ-Zellen trans- formiert. Positive Klone enthielten eine neu eingeführte
BspLUll I Schnittstelle (neben zwei bereits m pPyrFl enthaltenen) . Die richtige Orientierung des eingebauten Linkers, bei der am Start-ATG Kodon des pyrF-Gens eine BspLUll I Schnittstelle eingeführt worden war, wurde durch DNS-Sequenzanalyse bestimmt. Der auf diese Weise hergestellte Vektor (ca. 4,5 kb Große) erhielt die Bezeichnung pPyrF2.
C: Einbau des T. versicolor GAPDH-Promotors in den pUC19 Vektor
Die DNS-Sequenz des Promotors für das T. versicolor GAPDH-Gen ist m DE-A-19814853, SEQ ID NO : 3 , bp 1 - 1542 offenbart. Em ca. 1 kb großes Promotorfragment des GAPDH-Gens wurde als Sph I Fragment isoliert und m einen pUC19 Vektor kloniert. Nach Analyse durch Doppelverdau mit den Restπktionsendonukleasen Eco RI (im Polylinker von pUC19 enthalten) und BspLUll I (im GAPDH- Promoterfragment enthalten) wurde em Klon ausgewählt, in dem die BspLUll I Schnittstelle der Eco RI Schnittstelle benachbart war. Der auf diese Weise hergestellte 3,7 kb große Vektor erhielt die Bezeichnung pTVgap (Fig. 1).
Aus dem für die Herstellung von pTVgap verwendeten pUC19 Vektor war vorher eine singulare BspLUll I Schnittstelle entfernt worden, die bei der weiteren Vektorkonstruktion störend gewesen wäre. Dies erfolgte, indem der pUC19 Vektor mit BspLUll I geschnitten und der dadurch lmearisierte Vektor mit Klenow DNA- Polymerase behandelt wurde. Dadurch wurden die nach dem BspLUll I Verdau versetzten Enden des pUC19 Vektors aufgefüllt. Anschließende Ligation und Transformation von E. coli Top 10F ergab Klone, die einen modifizierten pUC19 Vektor ohne BspLUll I Schnittstelle enthielten.
D : Funktionelle Verknüpfung des GAPDH-Promotors mit dem pyrF- Gen
Der Vektor pTVgap wurde mit BspLUll I und Eco RI geschnitten, das dabei entstandene 3,7 kb große Vektorfragment durch Agarose Gelelektrophorese isoliert und durch Behandlung mit alkalischer Phosphatase dephosphoryliert .
Aus dem Vektor pPyrF2 wurde das pyrF Gen als 1,6 kb großes BspLUll I - Eco RI Fragment isoliert. Dazu wurde pPyrF2 zuerst partial mit BspLUll I geschnitten und das 4,6 kb große, linea- risierte Vektorfragment durch Agarose Gelelektrophorese isoliert. Das isolierte 4,6 kb Fragment wurde anschließend mit Eco RI nachgeschnitten. Dabei entstand das gewünschte 1,6 kb pyrF Genfragment, das durch Agarose Gelelektrophorese isoliert wur- de.
Das 3,7 kb große BspLUll I - Eco RI Vektorfragment aus pTVgap und das 1,6 kb großes BspLUll I - Eco RI Fragment aus pPyrF2 wurden ligiert und mit dem Ligationsansatz E. coli Top 10F Zellen transformiert. Klone, bei denen das pyrF Gen über die
BspLUll I Schnittstelle funktionell mit dem GAPDH-Promotor ver¬ knüpft worden war, wurden durch Restriktionsanalyse identifiziert. Durch DNS-Sequenzierung wurde die korrekte Verknüpfung des GAPDH-Promotors mit dem Start-ATG Kodon des pyrF Gens bes- tatigt. Der korrekte Klon hatte eine Große von 5,3 kb und erhielt die Bezeichnung pPyrFgap (Fig. 2).
5. Beispiel :
Herstellung von Trametes Protoplasten und Regenerierung von Pilzkolonien
Für die Gewinnung von Protoplasten verwendet wurden die dikary- otischen Stamme Trametes versicolor TV-1, Trametes versicolor 38070 (erhältlich von American Type Culture Collection, Rock- ville, MD 20852 USA) und der monokaryotische Stamm Trametes versicolor F2 100 (hinterlegt bei der DSMZ Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, D-38124 Braunschweig unter der Nummer DSM 11972) . Mycel von Trametes versicolor wurde zuerst durch Anzucht für 7 Tage bei 28°C auf Malzagarplatten (3 % Malz Extrakt, 0,3 % Pepton aus Sojabohnenmehl, 1,5 % Agar- Agar, pH 5,0) gewonnen. Von den Malzagarplatten wurden drei
Stucke ausgestanzt und damit 100 ml steriles Malzextrakt Medium (3 % Malz Extrakt, 0,3 % Pepton aus Sojabohnenmehl, pH 5,0) n 500 ml Erlenmeyerkolben, bzw. 125 ml des sterilen Mediums in 162 cm' Zellkulturgefaßen, angeimpft. D e Kultur wurde ohne Schuttein für 7 Tage bei 28°C mkubiert, bis die Kulturflussig- keit dicht mit einer Mycelmatte bewachsen war. Die Kulturflus- sigkeit wurde dekantiert und frisches Medium zugegeben (30 ml für das Mycel einer 100 ml Anzucht) . Das Mycel wurde mit einem Ultra Turrax (9500 rpm, 4 min) homogenisiert und unter Schut- teln bei 100 rpm für weitere 18 h bei 28°C inkubiert.
Die auf diese Weise hergestellte Mycelsuspension wurde durch Zentrifugation für 5 min bei 1500 rpm (2000 x g) geerntet und das dabei erhaltene Mycel dreimal durch suspendieren mit 0,1 M MgS04, 0,6 M Saccharose, 0,1 M Phosphat, pH 5,8 (OMT-Medium) und anschließendes Zentrifugieren gewaschen. Das isolierte Mycel wurde gewogen und bis zur Behandlung mit lytischem Enzym bei 4°C aufbewahrt.
Protoplasten wurden folgendermaßen hergestellt: In einem sterilen Erlenmeyerkolben wurde Mycelium eines Kolbens in 15 ml einer frisch hergestellten und sterilfiltrierten Losung des lyti- schen Enzymgemisches Novozym 234 (3 mg/ml, Novo Nordisk, Bags- vaerd, Danemark) in OMT-Medium suspendiert. Das in der Enzymlo- sung resuspendierte Mycelium wurde bei geringer Drehzahl (80 rpm) auf einem Schuttelinkubator (Infors) für 1 bis 3 h bei 30°C inkubiert. Wahrend der Inkubation wurde die Bildung der Protoplasten im Mikroskop beobachtet. Frei bewegliche Protoplasten waren üblicherweise nach 1 h zu sehen. Der Endpunkt der Protoplastierung wurde durch visuelle Inspektion im Mikroskop bestimmt und die Protoplasten durch Filtration über Glaswolle in einem Glasfilter von restlichem Mycelium abgetrennt. Die Glaswolle wurde sorgfaltig mit eisgekühltem OMT-Medium gewaschen. Protoplasten wurden durch Zentrifugation der Suspension in einem sterilen Probengefaß isoliert (2000 rpm; 2500 x g, 4°C, 10 mm) . Die weitere Bearbeitung der Zellen erfolgte bei 4°C. Das Protoplastenpellet wurde durch suspendieren in OMT- Medium gewaschen und durch Zentrifugation reisoliert. Bei Bedarf wurde der Waschschritt wiederholt. Die Konzentration von Protoplasten wurde unter dem Mikroskop in einer Zahlkammer be- stimmt. Die Protoplastensuspension wurde für Experimente zur Protoplastenregenerierung oder für Transformationen auf eine Konzentration von 1 x 108 Protoplasten/ml eingestellt.
Für Regenerierungsexperimente wurden von der Protoplastensuspension Verdunnungsreihen hergestellt und auf Agarplatten ausplattiert, die 1,5 % Malzextrakt, 0,1 % Trypticase Pepton, 2 % Glucose, 1,5 % Agar und zur osmotischen Stabilisierung 0,4 M Mannitol enthielten. Auf diese Weise wurde der Anteil an uber- lebensfähigen Zellen bestimmt und getestet, ob die erhaltenen Protoplasten zu mycelartigem Wachstum regeneriert werden konnten. Auf die gleiche Weise wurde auf osmotisch nicht stabilisierten Platten (ohne Mannitol) der Anteil an osmotisch stabilen Zellen (z.B. Mycelfragmente) bestimmt. Nach Inkubation bei 28°C für 7 Tage wurden die erhaltenen Kolonien gezahlt. Der An¬ teil uberlebensfähiger Zellen aus einer Reihe von Pro- toplastenpräparationen betrug ca. 0,5 %. Diese Ergebnisse zeigen, daß von Trametes versicolor uberlebensfahige und regenerierbare Protoplasten für Transformationsexperimente her- gestellt werden können.
6. Beispiel
Isolierung von Uridin-auxotrop en Mutanten von Trametes versicolor Uridin-auxotrophe Mutanten von Trametes versicolor mit einem Gendefekt im Pyrimidin Stoffwechsel (pyr-Mutanten) wurden in Anlehnung des in Boeke et al . , Methods Enzymol. (1987) 154, 164 - 175 beschriebenen Verfahrens isoliert. Als selektives Agens wurde die genotoxische Substanz 5-Fluor-Orotsäure (FOA) verwen- det. Mutagenese von Trametes versicolor Protoplasten erfolgte durch UV-Behandlung.
A: UV-Mutagenese :
Für die Mutagenese verwendet wurde der im 5. Beispiel beschrie- bene monokaryontische Stamm Trametes versicolor F2 100. Proto- plasten dieses Stammes wurden hergestellt wie im 5. Beispiel beschrieben.
Für die Mutagenese wurde als Quelle für UV-Licht ein BioRad UV- Linker (BioRad, München, Leistung 5,8 W/cm2, Abstand von der UV- Quelle 16 cm) verwendet. Die Zahl der für die Mutagenese ver¬ wendeten Protoplasten betrug 8 x 10q. Protoplasten von Trametes versicolor wurden in einer Petrieschale vorgelegt und für verschieden lange Zeitabschnitte mit UV-Licht bestrahlt. Dabei stellte sich heraus, daß unter den beschriebenen Bedingungen eine Bestrahlung für 60 sec. optimal für die nachfolgende Selektion auxotropher Mutanten war.
B : Selektion von Uridin auxotrophen Mutanten : Für die Selektion von Uridin auxotrophen Mutanten wurde folgendes Minimalmedium (MM) verwendet:
Glucose 20 g/i
Agar 15 g/i
Kaliumdihydrogenphosphat 1 g/i
Magnesiumsulfat 0,5 g/i
Dinatriumhydrogenphosphat 0,1 g/i
Adenin 27,5 mg/1
DL-Phenylalanin 0,15 g/i
L-Asparagin 2,5 g/i
Thiamin 0,48 mg/1
Calciumchlorid 10 mg/1
Eisensulfat 10 mg/1
Kupfersulfat 2 mg/1
Zinksulfat 1 mg/1
Mangansulfat 1 mg/1 pH 5,0, mit Schwefelsaure eingestellt.
Für die osmotische Stabilisierung von Protoplasten wurde das MM-Medium mit 0,6 M Saccharose supplementiert (MMS-Medium). Für Flussiganzuchten wurde das MM-Medium ohne Agar hergestellt.
Zu Beginn wurde das MMS-Medium mit verschiedenen Konzentrationen FOA sowie 10 mM Uridin supplementiert, um die Wachstumseigenschaften auf selektivem Medium für verschiedene Trame- tesstamme zu charakterisieren. Es stellte sich heraus, daß MMS- Medium mit 1,5 mg/ml FOA und 10 mM Uridin (selektives MMS) das Wachstum der untersuchten Trametesstamme vollständig unterdruckte .
Platten mit selektivem MMS wurden mit UV-mutagenisierten Protoplasten (in Abschnitt A beschrieben) beimpft und 21 Tage bei 28°C inkubiert. Im Gegensatz zu nicht mutagenisierten Protoplasten wurde das Wachstum von 35 Kolonien beobachtet. Diese potentiellen pyr-defizienten Mutanten wurden, um den Uridin auxotrophen Phanotyp naher zu charakterisieren, auf MM-Platten, MM-Platten mit 10 mM Uridin und selektiven MM-Platten ausgebracht und das Wachstum zum Ausgangsstamm F2 100 verglichen. Dabei zeigten von den 35 gepickten Kolonien 13 Trametesmutanten eindeutig einen pyr-defizienten Phanotyp. Dies ist beispielhaft in der Tabelle 1 für den Wildtypstamm und drei Mutanten dargestellt.
Tabelle 1 Wachstum von Trametes versicolor Mutanten auf verschiedenen MM- Medien
Stamm MM MM + 10 mM Uri- MM + 10 mM Uridin din + 1,5 mg/ml FOA F2 100 + +
F2 100C2-1 - + +
F2 100C2-8 - + +
F2 100C4-13 - + + C: Identifizierung von pyrF-Mutanten
Die Mutagenese mit FOA kann entweder zu Mutanten im gewünschten pyrF Gen (Orotsaure-Phosphoribosyltransferase) oder im pyrG Gen (Orotodin-5' -Posphatdecarboxylase) fuhren. pyrG Mutanten und pyrF Mutanten wurden differenziert durch Transformation mit dem pyrF-Gen aus Trametes versicolor, dessen Isolierung im 3. Beispiel beschrieben wurde (Plasmid pyrF61). Parallel dazu wurden Uridin-auxotrophe T. versicolor Stamme auch mit dem Plasmid pPyrFgap transformiert (Herstellung siehe 4. Beispiel). Die Transformation von Trametes versicolor wird im 7. Beispiel beschrieben .
Bei 6 der 13 isolierten pyr-defizienten Mutanten konnten nach Transformation mit den Plasmiden pyrF61 und pPyrFgap Kolonien auf MM-Medium beobachtet werden. Dies deutet darauf hin, daß diese sechs Mutanten defizient im pyrF Gen waren. Die drei Stamme F2 100C2-1, F2 100C2-8 und F2 100C4-13 ließen sich wiederholt mit der höchsten Häufigkeit transformieren und wurden für die weiteren Untersuchungen verwendet. Ein Vergleich der Plasmide pyrF61 und pPyrFgap bez glich der Transformationshau- figkeit ergab keine signifikanten Unterschiede, sodaß der pyrF- Promotor ausreichend f r die Isolierung von Transformanten war.
Bei dem im 2. Beispiel beschriebenen pyrF-Gen handelt es sich um ein neues Selektionsmarkergen für die Transformation von Trametes versicolor. Bei den Stammen Trametes versicolor F2 100C2-1, F2 100C2-8 und F2 100C4-13 handelt es sich um die ersten bisher beschriebenen pyrF-defizienten Stamme von Trametes versicolor. Diese pyrF-defizienten Stamme können als Wirtsorga- nismen dienen für die Transformation von Trametes versicolor und sind somit neue wertvolle Wirtsorganismen für die Proteinexpression und Proteinsekretion in filamentosen Pilzen aus der Klasse der Basidiomyceten. Die Verwendung des Stammes F2 100C2- 1 zu diesem Zweck wird m den folgenden Beispielen beschrieben. 7 . Beispiel
Transformation von pyrF-defizienten Trametes versicolor Stammen mit dem pyrF-Gen aus Trametes versicolor
A: Isolierung von Transformanten
Protoplasten von T. versicolor F2 100C2-1 wurden nach dem im 5. Beispiel beschriebenen Verfahren hergestellt. Dabei war das Anzuchtsmedium für den auxotrophen Stamm mit 10 M Uπdm supplementiert worden. Es wurde mit dem Vektor pyrFδl (beschrieben im 3. Beispiel), bzw. pPyrFgap (beschrieben im 4. Beispiel) trans¬ formiert .
Wie im 5. Beispiel beschrieben, wurden Protoplasten von Trametes versicolor F2 100C2-1 hergestellt und in einer Endkonzent- ration von 108/ml suspendiert. In Inkubationsgefaßen von 12 ml Volumen wurden 0,1 ml Aliquots der Protoplasten mit je 10 μg DNS des betreffenden Plasmids gemischt und 30 mm auf Eis mkubiert. Danach wurde langsam und unter wiederholtem mischen 1,25 ml einer PEG4000 Losung zum Transformationsansatz gegeben. Nach weiteren 20 mm Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Reak- tionsgefaße mit dem im 5. Beispiel beschriebenen OMT-Medium aufgefüllt, gemischt und 10 mm bei 4°C bei 2000 x g zentrifu- giert. Die Pellets wurden resuspendiert und auf osmotisch stabilisierten MMS-Platten ohne Uridin (beschrieben im 6. Bei- spiel) ausplattiert. Die Platten wurden bei 28°C für 14 Tage mkubiert und auf Wachstum von Kolonien überprüft. Bei verschiedenen Experimenten wurden Transformationsraten von 0,5 - 3 Transformanten/μg Plasmid DNS erzielt.
B : Reinigung der Transformanten
Mycel der erhaltenen Transformanten wurde gepickt und durch Ausplattieren auf frische Platten mit MM-Medium gereinigt. Dabei wurde das Inokulum punktformig in der Mitte der Platte aufgebracht. Nach Inkubation für ca. 7 Tage bei 28°C konnte radia- les Mycelwachstum beobachtet werden. Dieser Reinigungsvorgang wurde wiederholt, wobei das Mycel für das Inokulum vom Rand der ersten Reinigungsplatte entnommen wurde. MM-Platten wurden dann erneut mit Inokulum der zweiten Remigungsplatte inokuliert und bei 28°C mkubiert, bis die Platten vollständig mit Mycel be- wachsen waren.
C : Analyse der Transformanten
Transformanten von Trametes versicolor wurden mittels Southernblot Analyse auf die Integration des Plasmids PyrF61, untersucht. Dazu wurde von verschiedenen Transformanten und als Kontrolle dem pyrF-def zienten Stamm F2 100C2-1 Zellmycel m Flussigkultur hergestellt (siehe 2. Beispiel, Malzextrakt- medium, für F2 100C2-1 mit 10 mM Uπdm versetzt) . Von dem isolierten Mycel wurde chromosomale DNS isoliert wie im 2. Bei- spiel beschrieben.
Von den untersuchten Transformanten und dem nicht transformierten, Uridm-auxotrophen Ausgangsstamm F2 100C2-1 wurden je 3 μg der chromosomalen DNS, von pyrF61 100 ng des Plasmids mit Nco I geschnitten, anschließend durch Agarose Gelelektrophorese getrennt und auf Nylonfilter (Qiagen) geblottet. Als DNS-Sonde wurde Nco I geschnittenes Plasmid pyrF61 verwendet, nicht- radioaktiv markiert wie im 1. Beispiel beschrieben. Mit dieser DNS-Sonde konnten sowohl das pyrF Gen sowie die Vektoranteile aus dem jeweiligen Plasmid nachgewiesen werden.
Die Hybridisierungstemperatur für die auf Nylonfilter geblot- tete DNS mit der nicht-radioaktiv markierten DNS-Sonde betrug 60°C. Ansonsten wurden die m der Fachlitertur beschriebenen Bedingungen für Southernblots eingehalten. Southernblots wurden durch Autoradiographie ausgewertet . Neben anderen Fragmenten konnten zwei, vom pBK CMV-Vektoranteil von pyrFδl stammende Nco I Fragmente mit einer Lange von 0,7 kb, bzw. 1,9 kb detektiert werden. Diese beiden Fragmente konnten nur m den Transforman- ten, nicht jedoch in dem Uridm-auxotrophen Stamm F2 100C2-1 nachgewiesen werden. Dieses Ergebnis bestätigt, daß bei der Transformation des Uridin-auxotrophen Stammes Trametes versicolor F2 100C2-1 das Plasmid pyrF61 in das Genom integriert worden war und zur produktiven Expression des Selektionsmarkergens pyrF führte, wodurch die Uridin Auxotrophie dieses Stammes komplementiert wurde.
8. Beispiel
Verwendung des pyrF-Gens zur Herstellung Laccase- überproduzierender Trametes versicolor Stämme A. Transformation von T. versicolor
Protoplasten von T. versicolor wurden nach dem im 5. Beispiel beschriebenen Verfahren hergestellt. Zur Transformation verwendet wurde der im 2. Beispiel beschriebene Vektor pyrF61 sowie der Laccase Expressionsvektor pLac3gap. Die beiden Vektoren wurden in Co-Transformationsexperimenten verwendet, wo das Selektionsmarkergen und das zu exprimierende Gen auf getrennten Plasmiden enthalten sind. Die Herstellung von pLac3gap ist in in DE-A-19814853, 6. Beispiel, offenbart. In pLac3gap ist das Gen für die Laccase III aus T. versicolor funktionell mit dem dem GAPDH Promotor aus T. versicolor verknüpft.
Wie im 7. Beispiel beschrieben, wurden Protoplasten des pyrF- defizienten Stammes Trametes versicolor F2 100C2-1 hergestellt und in einer Endkonzentration von 108/ml suspendiert. In Inkubationsgefäßen von 12 ml Volumen wurden 0,1 ml Aliquots der Protoplasten mit je 10 μg DNS der Plasmide pLac3gap und pyrFδl gemischt und 30 min auf Eis inkubiert. Danach wurde langsam und unter wiederholtem mischen 1,25 ml einer PEG4000 Lösung zum Transformationsansatz gegeben. Nach weiteren 20 min Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Reaktionsgefäße mit dem im 5. Beispiel beschriebenen OMT-Medium aufgefüllt, gemischt und 10 min bei 4°C bei 2000 x g zentrifugiert . Die Pellets wurden resuspendiert und auf osmotisch stabilisiertem MM-Medium ohne U- ridin (beschrieben im 6. Beispiel) ausplattiert. Die Platten wurden bei 28°C für 14 Tage inkubiert und auf Wachstum von Kolonien überprüft. Bei verschiedenen Experimenten wurden Transformationsraten von 0,5 - 3 Transformanten/μg DNS des Selekti- onsmarkerplasmids pyrFδl erzielt.
Die erhaltenen Transformanten wurden gepickt und wie im 7. Beispiel beschrieben zweimal durch ausplattieren auf frischen Platten mit MM-Selektionsmedium ohne Uridin gereinigt. Selektivplatten wurden dann erneut mit Inokulum der zweiten Reini- gungsplatte inokuliert und nachdem die Platten vollständig mit Mycel bewachsen waren, wurde die Laccaseproduktion in Schüttel- kolbenanzuchten überpr ft .
B : Anzucht im Schüttelkolben Für die Anzucht im Schuttelkolben wurden 2 cm2 Mycel aus einer voll bewachsenen Platte ausgestochen, steril zerkleinert und damit eine Vorkultur von 50 ml (in einem 250 ml Erlenmeyerkolben) Malzextrakt-Medium (siehe 1. Beispiel) beimpft. Die Vorkultur wurde 6 Tage bei 28°C unter Schuttein bei 120 rpm in- kubiert. Am sechsten Tag wurde die Vorkultur mit einem Ultra Turrax für 30 sec bei 9500 rpm homogenisiert und damit 250 ml Hauptkulturmedium (Zusammensetzung siehe MM-Medium im 6. Beispiel) m einem 11 Erlenmeyerkolben beimpft. Die Hauptkultur wurde dann wieder bei 28°C unter Schütteln bei 120 rpm inku- biert. Die Laccaseproduktion wurde ab dem zweiten Tag der Anzucht taglich gemessen. Laccaseaktivitat wurde photometrisch mit dem Substrat ABTS (2 , 2'-Azino-bis ( 3-Ethyl-Benzthiazolin-6- Sulfonsaure) bei 420 nm gemessen. (Extinktionskoeffizient von ABTS bei 420 nm ε42Q: 3,6 x 104 [1 x Mol"1 x cm"1]) . Dabei ent- sprach 1 U Laccaseaktivitat dem Umsatz von 1 μmol ABTS/min bei 37°C und einem pH von 4,5. Das Maximum der Laccaseproduktion in Schuttelkolbenanzuchten wurde 10 - 14 Tage nach Beginn der Hauptkultur erreicht. Tabelle 2 zeigt einen Vergleich verschiedener Transformanten mit dem nicht transformierten Ausgangs- stamm Trametes versicolor F2 100. Für den nicht transformierten Stamm F2 100 wurde daruberhmaus die Laccaseproduktion nach Induktion mit dem in der Literatur beschriebenen Induktor 2,5- Xylidm (Yaver et al . , Applied and Environmental Microbiology (1996) 62, 834 - 841) bestimmt. Wie aus Tabelle 2 zu ersehen, ist die Laccaseproduktion im Schuttelkolben bei den besten
Transformanten des Stammes F2 100 gegenüber dem nichttransfor- mierten Ausgangsstamm um den Faktor 14 (ohne Induktion), bzw. um den Faktor 6 (mit Induktion) erhöht.
Tabelle 2
Stamm Trametes versicolor Maximale Laccaseproduktion (U/ml)
F2 100 4,60
F2 100/Xylιdm* 11,20
TV L3F-4 15,20
TV L3F-7 42,50
TV L3F-9 17, 60
TV L3F-14 51,50
TV L3F-21 33,90
TV L3F-29 64,80
TV L3F-35 35,10
TV L3F-38 13,80
TV L3F-51 56,70
* Die Induktion mit erfolgte drei Tage nach Beginn der Hauptkultur durch Zugabe von 2,5-Xylιdm (1,5 mM Endkonzentration) .
INTERNATIONALES FORMBLATT
Consortium für elektrochem. Industrie GmbH Zielstattstr. 20 - 22
81379 München LEBENSFÄHIGKEITSBESCHEINIGUNG ausgestellt gemäß Regel 10.2 von der unten angegebenen
INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE
I. HINTERLEGER II. KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS
Name: Consortium für elektrochem. Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE
Industrie GmbH zugeteilte EINGANGSNUMMER: Anschrift: Zielstattstr . 20 - 22 DSM 11972
81379 München Datum der Hinterlegung oder Weiterleitung':
1998 -01-28
III. LEBENSFÄHIGKErTSBESCHEINIGUNG
Die Lebensfähigkeit des unter II genannten Mikroorganismus ist am 1998 - 01 - 2 8 2 geprüft worden. Zu diesem Zeitpunkt war der Mikroorganismus
(X)' lebensfähig
( )J nicht mehr lebensfähig
IV. BEDINGUNGEN, UNTER DENEN DIE LEBENSFÄHIGKEITSPROFUNG DURCHGEFÜHRT WORDEN IST4
V. INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE
Name: DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Unterschrift(en) der zur Vertretung der internationalen Hinterlegungsstelle MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH befugten Person(en) oder des (der) von ihr ermächtigten Bediensteten:
Anschrift: Mascheroder Weg lb D-38124 Braunschweig
Datum: 1998 - 02 - 02
Angabe des Datums der Ersthinterlegung. Wenn eine erneute Hinterlegung oder eine Weiterleitung vorgenommen worden ist, Angabe des Datums der jeweils letzten erneuten Hinterlegung oder Weiterleituπg.
In den in Regel 10.2 Buchstabe a Ziffer ii und iii vorgesehenen Fällen Angabe der letzten Lebensfähigkeitsprüfung.
Zutreffendes ankreuzen.
Ausfüllen, wenn die Angaben beantragt worden sind und wenn die Ergebnisse der Prüfung negativ waren.
Formblatt DSMZ-BP/9 (einzige Seite) 0196 INTERNATIONALES FORMBLATT
Consortium für elektrochem. Industrie GmbH Zielstattstr. 20 - 22
81379 München EMPFANGSBESTÄTIGUNG BEI ERSTHINTERLEGUNG, ausgestellt gemäß Regel 7.1 von der unten angegebenen INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE
I. KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS
Vom HINTERLEGER zugeteiltes Bezugszeichen: Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE zugeteilte EINGANGSNUMMER: F2 100
DSM 11972
II. WISSENSCHAFTLICHE BESCHREIBUNG UND/ODER VORGESCHLAGENE TAXONOMISCHE BEZEICHNUNG
Mit dem unter I. bezeichneten Mikroorganismus wurde
( ) eine wissenschaftliche Beschreibung
(X ) eine vorgeschlagene taxonomische Bezeichnung eingereicht. (Zutreffendes ankreuzen).
III. EINGANG UND ANNAHME
Diese internationale Hinterlegungsstelle nimmt den unter I bezeichneten Mikroorganismus an, der bei ihr am 9 8 - 0 - 28 (Datum der Ersthinterlegung)' eingegangen ist
rV. EINGANG DES ANTRAGS AUF UMWANDLUNG
Der unter I bezeichnete Mikroorganismus ist bei dieser Internationalen Hinterlegungsstelle am eingegangen (Datum der Ersthinterlegung) und ein Antrag auf Umwandlung dieser Ersthinterlegung in eine Hinterlegung gemäß Budapester Vertrag ist am eingegangen (Datum des Eingangs des Antrags auf Umwandlung).
V. INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE
Name: DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Unterschrift(en) der zur Vertretung der internationalen Hinterlegungsstelle MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH befugten Person(en) oder des (der) von ihr ermächtigten Bediensteten:
Anschrift: Mascheroder Weg Ib D-38I24 Braunschweig
Datum: 1998 - 02 - 02
' Falls Regel 6.4 Buchstabe d zutrifft, ist dies der Zeitpunkt, zu dem der Status einer internationalen Hinterlegungsstelle erworben worden ist. Formblatt DSMZ-BP/4 (einzige Seite) 0196 INTERNATIONALES FORMBLATT
Consortium für elektrochemische Industrie GmbH Zielstattstr. 20
81379 München EMPFANGSBESTÄTIGUNG BEI ERSTHINTERLEGUNG, ausgestellt gemäß Regel 7.1 von der unten angegebenen INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE
I. KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS
Vom HINTERLEGER zugeteiltes Bezugszeichen: Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE zugeteilte EINGANGSNUMMER: TV- 1
DSM 11523
II. WISSENSCHAFTLICHE BESCHREIBUNG UND/ODER VORGESCHLAGENE TAXONOMISCHE BEZEICHNUNG
Mit dem unter I. bezeichneten Mikroorganismus wurde
( ) eine wissenschaftliche Beschreibung
(X ) eine vorgeschlagene taxoπomische Bezeichnung eingereicht (Zutreffendes ankreuzen). m. EINGANG UND ANNAHME
Diese internationale Hinterlegungsstelle nimmt den unter I bezeichneten Mikroorganismus an, der bei ihr am 1997 - 0 - 25 (Datum der Ersthinterlegung)' eingegangen ist
IV. EINGANG DES ANTRAGS AUF UMWANDLUNG
Der unter I bezeichnete Mikroorganismus ist bei dieser Internationalen Hinterlegungsstelle am eingegangen (Datum der Ersthinterlegung) und ein Antrag auf Umwandlung dieser Ersthinterlegung in eine Hinterlegung gemäß Budapester Vertrag ist am eingegangen (Datum des Eingangs des Antrags auf Umwandlung).
V. INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE
Name: DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Unterschrift(en) der zur Vertretung der internationalen Hinterlegungsstelle MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH befugten Person(en) oder des (der) von ihr ermächtigten Bediensteten:
Anschrift: Mascheroder Weg lb D-38124 Braunschweig ( .
Figure imgf000037_0001
Datum: 1997 - 04 - 29
1 Falls Regel 6.4 Buchstabe d zutrifft, ist dies der Zeitpunkt, zu dem der Status einer internationalen Hinterlegungsstelle erworben worden ist. Formblatt DSMZ-BP/4 (einzige Seite) 0196 INTERNATIONALES FORMBLATT
Consortium für elektrochemische Industrie GmbH Zielstattstr. 20
81379 München LEBENSFÄHIGKEITSBESCHEINIGUNG ausgestellt gemäß Regel 10.2 von der unten angegebenen INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE
I. HINTERLEGER II. KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS
Name: Consortium für elektroVon der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE chemische Industrie GmbH zugeteilte EINGANGSNUMMER: Anschrift Zielstattstr . 20 DSM 11523
81379 München Datum der Hinterlegung oder Weiterleitung': 1997 - 04 -25
III. LEBENSFAHIGKEΓΓSBESCHEINIGUNG
Die Lebensfähigkeit des unter II genannten Mikroorganismus ist am 1997 - 04 - 25 2 geprüft worden. Zu diesem Zeitpunkt war der Mikroorganismus
(X)1 lebensfähig
( )' nicht mehr lebensfähig
IV. BEDINGUNGEN, UNTER DENEN DIE LEBENSFÄraGKEITSPRÜFUNG DURCHGEFÜHRT WORDEN IST4
V. INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE
Name: DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Unterschrift(en) der zur Vertretung der internationalen Hinterlegungsstelle MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH befugten Person(en) oder des (der) von ihr ermächtigten Bediensteten:
Anschrift' Mascheroder Weg Ib D-38124 Braunschweig es ?*.^
Datum: 1997 - 04 - 29
Angabe des Datums der Ersthinterlegung. Wenn eine erneute Hinterlegung oder eine Weiterleitung vorgenommen worden ist, Angabe des Datums der jeweils letzten erneuten Hinterlegung oder Weiterleitung.
In den in Regel 10.2 Buchstabe a Ziffer ii und iii vorgesehenen Fällen Angabe der letzten Lebensfähigkeitsprüfung.
Zutreffendes ankreuzen.
Ausfüllen, wenn die Angaben beantragt worden sind und wenn die Ergebnisse der Prüfung negativ waren.
Formblatt DSMZ-BP 9 (einzige Seite) 01 6

Claims

Patentansprüche :
1. DNS-Sequenz, die für ein Protein mit Enzymaktivität der 0- rotsäure-Phosphoribosyltransferase (pyrF-Aktivitat ) kodiert, dadurch gekennzeichnet, daß sie die DNS-Sequenz SEQ ID NO:l ab Position 1133 bis einschließlich Position 1877 umfaßt o- der die DNS-Sequenz SEQ ID NO:2 ab Position 1 bis einschließlich Position 684 umfaßt oder eine DNS-Sequenz mit einer Sequenzhomologie größer als 60 % zu den genannten Bereichen der DNS-Sequenz SEQ ID NO:l, oder SEQ ID NO: 2 umfasst.
2. Protein mit pyrF-Aktivität dadurch gekennzeichnet, daß es die Aminosäure-Sequenz SEQ ID NO: 3 umfaßt oder eine Aminosäure-Sequenz mit einer Sequenzhomologie größer als 60 % zu der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 3.
3. Expressionsvektor dadurch gekennzeichnet, daß er eine DNS- Sequenz gemäß Anspruch 1 umfaßt.
4. Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, daß er einen Expressionsvektor gemäß Anspruch 3 enthält.
5. Verfahren zur Herstellung von Pilzstämmen, die zur effizienten Expression und Sekretion von Proteinen befähigt sind, bei dem ein Pilzstamm mit einem auxotrophen Gendefekt als Wirtsstamm mittels an sich bekannter Verfahrensschritte mit einem Expressionsvektor, der ein Gen zur Komplementation des auxotrophen Gendefekts im Wirtsstamm besitzt, in einem
Transformationsansatz transformiert wird und aus dem Transformationsansatz mit dem Expressionsvektor transformierte Klone durch Selektion auf Komplementation des auxotrophen Gendefekts ausgewählt werden, wobei die Expression des Gens zur Komplementation des auxotrophen Gendefekts im Wirtsstamm durch ein genetisches Regulationselement kontrolliert wird, das im Wirtsstamm aktiv ist, dadurch gekennzeichnet, daß als Wirtsstamm ein Uridin-auxotropher Pilz ausgewählt aus den Gattungen Trametes, Coriolus und Polyporus mit einem Gende- fekt im pyrF Gen eingesetzt wird.
6. Expressionssystem umfaßend einen Wirtsstamm ausgewählt aus den Gattungen Trametes, Coriolus und Polyporus mit einem genetischen Defekt im Stoffwechselmetabolismus aufgrund dessen der für das Wachstum essentielle Stoffwechselmetabolit Uridin nicht mehr synthetisiert werden kann und der Wirtsstamm auf Minimalmedien ohne Zusatz dieses Stoffwechselmetaboliten nicht mehr zum Wachstum befähigt ist sowie einen Expressionsvektor enthaltend ein Selektionsmarkergen, welches den auxotrophen Gendefekt des Wirtsstammes komplementiert, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirtsstamm als genetischen Defekt im Stoffwechselmetabolismus einen Defekt im pyrF Gen besitzt, und das Selektionsmarkergen, das pyrF Gen aus einem Pilz der Klasse der Basidiomyceten ist.
7. Verfahren zur Herstellung eines Proteins, dadurch gekennzeichnet, daß ein Expressionssystem gemäß Anspruch 6 enthaltend ein das Protein kodierendes Gen in an sich bekannten Weise zur Proteinproduktion eingesetzt wird oder daß ein Mikroorganismus gemäß Anspruch 5 enthaltend ein das Protein kodierendes Gen oder ein Pilzstamm hergestellt nach einem Verfahren gemäß Anspruch 4 enthaltend ein das Protein kodierendes Gen in an sich bekannter Art und Weise kultiviert wird und das Protein aus der Kultur gewonnen wird.
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RASMUSSEN JACK B ET AL: "The PYR1 gene of the plant pathogenic fungus Colletotrichum graminicola: Selection by intraspecific complementation and sequence analysis.", MOLECULAR & GENERAL GENETICS, vol. 235, no. 1, 1992, pages 74 - 80, XP002151888, ISSN: 0026-8925 *

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