WO2001011027A1 - Nueva proteina - Google Patents

Nueva proteina Download PDF

Info

Publication number
WO2001011027A1
WO2001011027A1 PCT/ES2000/000308 ES0000308W WO0111027A1 WO 2001011027 A1 WO2001011027 A1 WO 2001011027A1 ES 0000308 W ES0000308 W ES 0000308W WO 0111027 A1 WO0111027 A1 WO 0111027A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
blip
protein
activation
sequence
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/ES2000/000308
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Jorge Moscat Guillen
Maria Teresa Diaz-Meco Conde
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Glaxo Wellcome SA
Original Assignee
Glaxo Wellcome SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Glaxo Wellcome SA filed Critical Glaxo Wellcome SA
Priority to EP00951548A priority Critical patent/EP1231264A1/en
Priority to JP2001515813A priority patent/JP2003506081A/ja
Priority to AU64446/00A priority patent/AU6444600A/en
Publication of WO2001011027A1 publication Critical patent/WO2001011027A1/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators

Definitions

  • the present invention relates to human lambda interaction proteins involved in the activation of KB Nuclear Factor (NF-KB) and also, but not exclusively, to kinase-inactive mutants of such proteins; to nucleotide sequences encoding such proteins and mutant proteins; and to expression vectors, cell lines, antibodies, selection procedures, compounds, production procedures and treatment procedures related to proteins.
  • NF-KB Nuclear Factor
  • PKC Protein Kinase C
  • the NF- ⁇ B transcription factor plays a critical role in several cellular functions including key inflammatory responses and immune responses.
  • the nuclear KB factor is a transcription factor of multiple subunits expressed everywhere, which is activated in various cell types by a diverse group of inflammatory agents such as TNF ⁇ , IL-l ⁇ , bacterial endotoxin and RNA virus.
  • NF- ⁇ B is composed of dimers of different members of the Re ⁇ family of proteins.
  • the classical form of NF- ⁇ B is a heterodimer of p50 and p65 (Re ⁇ A) (Baeurle and Henkel, 1994; Baldwin, 1996; Thanos and aniatis, 1995); It is complexed in the cytosol by I ⁇ B, which prevents its nuclear translocation and activity.
  • I ⁇ B ⁇ is phosphorylated, activating its extension and subsequent degradation of I ⁇ B through the proteosomal pathway
  • IKK ⁇ and IKK ⁇ that phosphorylate residues 32 and 36 of I ⁇ B ⁇ , and whose activity is potentially stimulated by TNF and IL-1
  • IKK bind to NIK (NFKB inducing kinase), a member of the MAPKKK family that interacts with TRAF2 (Malinin et al., 1997), thus associating I ⁇ B degradation and NF- ⁇ B activation with the TNF receptor complex .
  • TNF ⁇ is a potent activator of atypical PKCs in vivo. It has previously been shown that the atypical isoforms of PKC ⁇ (zeta) and ⁇ / t (lambda / iota) play a critical role during the activation of NF- ⁇ B (Diaz-Meco et al., 1996; Folgueira et al., 1996 ; Sontag et al., 1997).
  • PKCs In contrast to the classic or new isoforms of PKCs, atypical PKCs are insensitive to phorbol esters or diacylglycerol, but are activated by other important second lipid messengers such as phosphatidylinositol 3,4,5-P 3 (Nakanishi et al. , 1993) and ceramide (Lozano et al., 1994). Although the products of PI 3-kinase activate aPKC (Nakanishi et al., 1993; Akimoto et al., 1996), they also stimulate other kinases such as ⁇ PKC, ⁇ PKC, PRK1 or c-Akt (Diaz-Meco et al.
  • Ceramide activates both aPKC (Lozano et al., 1994; Müller et al., 1995), but it also stimulates ceramide-activated protein kinase, among other possible targets. This suggests that Different lipid mediators are not selective for a given PKC.
  • BLIP lambda interaction protein
  • an isolated human BLIP protein or a variable thereof is provided.
  • the protein It has an amino acid sequence as provided in Figure 2A (SEQ ID NO: 4).
  • a further aspect of the present invention is a mutant without kinase activity of a BLIP protein.
  • Another aspect of the present invention is an isolated human LIP protein or a variant thereof.
  • the protein has the amino acid sequence of the SEC.
  • an isolated nucleotide sequence that encodes a BLIP protein or a variant thereof, or a nucleotide sequence that is complementary thereto.
  • the nucleotide sequence is a cDNA sequence.
  • the nucleotide sequence is or comprises SEQ ID NO: 3.
  • an isolated nucleotide sequence that encodes an LIP protein or a variant thereof, or a nucleotide sequence that is complementary thereto.
  • the nucleotide sequence is a cDNA sequence.
  • the nucleotide sequence is or comprises SEQ ID NO: 6.
  • an isolated DNA molecule having a sequence selected from the group consisting of: (a) isolated DNA encoding the BLIP protein of Figure 2A (SEQ ID NO: 4); (b) isolated DNA that hybridizes with the DNA isolated from (a) above under conditions represented by a washing rigor of 0.3 M NaCl, 0.03 M sodium citrate and 0.1% SDS at 60 ° C, which has a homology of at least 65% with the DNA isolated from (a) above, and encoding a BLIP protein; and (c) isolated DNA having a sequence complementary to (a) - (c) above.
  • an expression vector comprising a nucleic acid sequence as mentioned above.
  • a nucleic acid construct having a promoter and a heterologous nucleic acid operably linked to said promoter, wherein said heterologous nucleic acid is a nucleic acid molecule as provided above.
  • a stable cell line comprising a recombinant DNA sequence or an expression vector as mentioned above, capable of expressing the encoded protein.
  • the Cell line is a Hela or HEK293 modified cell line.
  • a polyclonal or monoclonal antibody that specifically binds to a BLIP protein as indicated above.
  • an antisense oligonucleotide complementary to a nucleic acid is provided as indicated above and which is of sufficient length to hybridize therewith under physiological conditions; together with a DNA encoding such an antisense oligonucleotide; and a nucleic acid construct having a promoter and a heterologous nucleic acid operably linked to said promoter, wherein the heterologous nucleic acid is a DNA encoding such an antisense oligonucleotide.
  • a method for inhibiting the activation of NF- ⁇ B in a cell comprising providing the cell with an inhibitor of NF- ⁇ B activation related to BLIP, in an amount effective to inhibit the activation of NF- ⁇ B in said cell.
  • the cell can be provided in any suitable form, such as in an in vitro culture.
  • the proportion step can be performed by any suitable means, such as by supplying the inhibitor compound inside the cell or by supplying within the cell a nucleic acid that encodes and expresses an inhibitor protein.
  • the cell is preferably a mammalian cell and, more preferably, a human cell.
  • Another aspect of the present invention is the use of a BLIP mutant without kinase activity, or a LIP protein, as an inhibitor of NF- ⁇ B activation in a cell or as an agent or adjuvant against cancer.
  • a method for selecting compounds with respect to the ability to modulate (increase or inhibit) the BLIP-dependent activation of NF- ⁇ B comprise contacting a test compound with a BLIP protein as mentioned above and detecting modulation activity or inactivity.
  • a method of treatment or prophylaxis of a disorder that responds to the modulation of BLIP-dependent activation of NF- ⁇ B in a mammal which comprises administering to said patient an amount Effective of a compound that modulates (inhibits or increases) BLIP-dependent NF- ⁇ B activation.
  • the disorder is selected from neoplastic, inflammatory and immune disorders.
  • the use of a compound that modulates the activation of BLF-dependent NF- ⁇ B is provided in a method of formulating a medicament for the treatment or prophylaxis of a disorder that responds to the modulation of the BLIP-dependent NF- ⁇ B activation.
  • Figure 1 shows in a graph the effect of LIP overexpression on the activation of NF- ⁇ B; by increasing the expression of LIP the reduced activity of the KB-dependent messenger induced by TNF ⁇ .
  • Figure 2A shows the amino acid sequence of the human BLIP protein (SEQ ID NO: 4).
  • Figure 2B is a schematic representation of BLIP showing the domain of type PI 3 -FRAP / ATM kinase and the LIP region.
  • Figure 3A is an alignment of the PI 3- kinase domain of the human BLIP protein with that of FRAP. Asterisks indicate amino acids that are identical in the two aligned proteins; The conserved critical residues that confer catalytic activity to the protein are included in boxes.
  • Figure 3B is an alignment of the PI 3- kinase domain of the human BLIP protein with that of ATM. Asterisks indicate amino acids that are identical in the two aligned proteins; The conserved critical residues that confer catalytic activity to the protein are included in boxes.
  • Figure 4A shows in a graph the effects of BLIP on the activation of NF- ⁇ B in human HEK293 cell cultures.
  • HEK293 cells were transiected with a KB-dependent luciferase messenger plasmid and: a negative control vector (first bar); increasing concentrations of an expression plasmid for wild type BLIP (BLIP; second-sixth bars); increasing concentrations of an expression plasmid for the BLIP kinase-inactive protein (BLIP MUT ; seventh-eleventh bar); or an RIP expression vector (positive control; final bar).
  • BLIP MUT increasing concentrations of an expression plasmid for the BLIP kinase-inactive protein
  • RIP expression vector positive control
  • Figure 4B illustrates in a graph the role of BLIP on the activation of NF- ⁇ B in HEK293 cell cultures.
  • the cells were transfected with a KB-dependent luciferase messenger plasmid and: a negative control vector (white bars), an expression plasmid for wild-type ⁇ / tPKC ( ⁇ / iPKC; shaded bars) or an expression plasmid for ⁇ / tPKC kinase-inactive ( ⁇ / iPKC " 1 "; black bars).
  • Luciferase activity was evaluated in cells without BLIP (control) and with increasing concentrations of wild-type BLIP (BLIP) after 24 hours. The results are the mean ⁇ SD of three independent experiments with duplicate incubations.
  • Figure 5 shows the percentage of HeLa cells with nuclear p65 after transfection with a vector for a HA-labeled version of BLIP TM 1- . Twenty hours after transfection, the cells were left untreated (control, white bars) or stimulated for 20 minutes with TNF ⁇ (30 ng / ml; black bars). The analysis was performed by confocal immunofluorescence microscopy with anti-HA 12CA5 monoclonal antibody and a goat anti-p65 polyclonal antibody. The Graph shows the mean ⁇ SD of several fields (300 cells) of three independent experiments.
  • Figure 6 provides the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 3) of the DNA encoding the BLIP protein of SEQ ID NO: 4.
  • BLIP LIP isoform
  • FRAP FKBP-rapamycin-associated protein
  • ATM Ataxia Telangiectasia
  • Atypical PKCs are regulated by protein regulators. In comparison to the amino acid sequences of the new or classic PKCs, the sequences of the atypical PKC subfamily differ in the regulatory domain. The identification of selective modulators for each PKC isotype will help to understand the function and regulation of the different PKC isoforms.
  • a protein called LIP has been identified as a selective regulator of ⁇ / iPKC (Diaz-Meco et al., 1996). LIP binds to the zinc protrusion of ⁇ / tPKC, but does not bind to ⁇ PKC, ⁇ PKC or even the very related ⁇ PKC (Diaz-Meco et al., 1996). Interestingly, overexpression of a LIP fragment (the R4 fragment) that is sufficient to interact with ⁇ / iPKC is capable of stimulating a KB-dependent promoter activity (Diaz-Meco et al., 1996).
  • LIP was initially identified by the two yeast hybrid system. Diaz-Meco et al. (1996) describe a cDNA isolated from LIP encoding a protein of 713 amino acids, with an expected molecular weight of 79.7 kDa.
  • the present inventors determined that the sequence of LIP was 779 amino acids (SEQ ID NO: 6) and observed that LIP was expressed in testis and heart tissues, but not in other tissues investigated (liver, ovaries, spleen, thymus, brain , lung and kidney). However, a band that reacted with the anti-LIP antibody and had a molecular weight greater than 200 kDa was unexpectedly detected (results not shown).
  • the present inventors evaluated whether BLIP could bind to ⁇ / iPKC in vivo (Example 3), using HEK293 cells that were not treated (control) or stimulated with TNF ⁇ for various times. Under resting conditions there was a small or no association of BLIP or LIP with ⁇ / tPKC (data not shown). However, after TNF ⁇ stimulation, there was a rapid and sustained interaction of BLIP with ⁇ / tPKC.
  • BLIP is a 2392 amino acid protein (Fig. 2A, SEQ ID NO: 4); the region that includes amino acids 881-1209 of BLIP has a high degree of homology with the domains PI 3 - kinase of FRAP
  • BLIP, FRAP and ATM indicates that BLIP has kinase activity, since the DXXXXN and DFG motifs that constitute critical remains of the catalytic site conserved in all members of the ATM family with kinase activity, are also conserved in BLIP. (see Figs. 3A and 3B).
  • HEK293 cells were transfected with a KB-dependent messenger gene (luciferase) along with increasing concentrations of expression plasmids for BLIP, either for wild-type BLIP or for a kinase-inactive mutant (BLIP " 1 ").
  • luciferase a KB-dependent messenger gene
  • Figure 4A indicate that the expression of wild-type BLIP (but not a Inactive BLIP kinase mutant) is sufficient to activate KB-dependent messenger activity to a degree comparable to that of RIP (Receptor Interaction Protein).
  • Example 7 Other experiments established that the effect of NF- ⁇ B activation of the BLIP protein depends on ⁇ / tPKC (Example 7).
  • the cells were transfected with a KB-dependent luciferase messenger plasmid and a negative control vector, an expression plasmid for wild-type ⁇ / iPKC, or an expression plasmid for ⁇ / ⁇ PKC M ⁇ kinase-inactive.
  • Luciferase activity was evaluated in cells without BLIP (control) and with increasing concentrations of wild-type BLIP (BLIP) and it was observed that co-expression of wild-type ⁇ / iPKC cooperated with BLIP to activate NF- ⁇ B, while the expression of the ⁇ / iPKC kinase-inactive mutant did not.
  • the results are shown in Figure 4B.
  • BLIP is a critical component of the NF- ⁇ B pathway, and depends on its own kinase activity and that of ⁇ / iPKC to exert its function.
  • Atypical PKCs are involved in the control of NF-KB and p70S6K (Romanelli et al., 1999). The two routes are critical in controlling the function of inflammatory and immunosuppressive cells.
  • NF- ⁇ B controls a myriad of immune responses and is a potent anti-apoptotic molecule. Inhibition of atypical PKC kinases blocks cell growth and proliferation and initiates programmed cell death.
  • atypical PKCs target key intermediates in the signaling cascade of cells involved in cell proliferation.
  • ⁇ PKC as well as ⁇ / tPKC, control the activation of the MEK-ERK signaling cascade, together with Raf, on the Ras and PI 3-kinase ⁇ (Diaz-Meco et al., 1994, 1995; Liao et al., 1997; Schónwasser et al., 1998; Takeda et al., 1999).
  • BLIP has a very homologous domain to the FRAP kinase region.
  • FRAP is the target of the immunosuppressive molecule rapamycin (Dennis et al., 1999). Rapamycin blocks the activation of p70S6K in T cells, which constitutes the molecular basis of its immunosuppressive actions (Dennis et al., 1999). Interestingly, the activity of p70S6K is required and is sufficient for the cell cycle progression of T lymphocytes.
  • the tandem BLIP- ⁇ / vPKC represents an alternative route to that of FRAP in the design of new potentially immunosuppressive molecules.
  • amino acid sequences described here are presented in the amino to carboxy direction, from left to right. The amino and carboxy groups do not occur in the sequence. Nucleotide sequences are presented here with only one chain, in the 5 'to 3' direction, from left to right. Nucleotides and amino acids are represented as recommended by the IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission, or (for amino acids) by the three letter code, according to the established use.
  • the present invention relates to isolated BLIP and LIP proteins.
  • Sequence information for isolated human BLIP is provided in Figure 2A (amino acids; SEQ ID NO: 4) and in Fig. 6 (nucleotides; SEQ ID NO: 3).
  • the amino acid sequence information for a BLIP kinase-inactive mutant is provided in SEQ ID NO: 5.
  • sequence information for LIP is provided in SEQ ID NO: 6 (amino acids) and in SEQ ID NO. : 7
  • isolated indicates that the protein or nucleotide molecule is not in its native state, as long as it has been purified at least to some degree or produced synthetically, for example, by recombinant procedures. .
  • isolated therefore, includes the possibility of the molecule that is in combination with other biological or non-biological material such as cells, cell suspensions or cell fragments, proteins, peptides, expression vectors, organic or inorganic solvents or other materials when appropriate, but excludes the situation in which the protein is in the state in which it is found in nature.
  • Routine procedures known in the art may be employed, such as those further explained in the experimental section shown further. hereinafter, to purify and / or synthesize the protein and nucleotide molecules according to the invention.
  • Such procedures are well understood by persons skilled in the art and include techniques such as those described in Sambrook, J. et al (1), the description of which is included herein in its entirety by reference.
  • BLIP variant refers to other peptides and proteins that retain the same essential functional character of the BLIP protein of SEQ ID NO: 4 provided herein. , but that varies in the amino acid sequence. Variants are also intended to be included within the scope of the invention. For example, variants of the BLIP protein, peptides or proteins with a sequence homology greater than about 65%, preferably at least 70%, 75%, 80% or 85% and, in a particularly preferred way, are considered of at least about 90% or even 95% or 98% with SEQ ID NO: 4, and that retain BLIP functions.
  • Such variants may include the deletion, modification or addition of individual amino acids or groups of amino acids within the protein sequence, provided that the peptide maintains the basic biological functionality of a BLIP protein, that is, interacts with ⁇ / iPKC of a protein. TNF ⁇ dependent form and activate NF- ⁇ B in a TNF ⁇ dependent and ⁇ / iPKC dependent manner. Is Biological functionality can be assessed by conducting studies such as those described herein and those known in the art.
  • BLIP protein does not include a protein consisting only of the sequence of the LIP protein (SEQ ID NO: 6) or the R4 fragment (SEQ ID NO: 8).
  • a BLIP protein is one that has the amino acids of SEQ ID NO: 4, or that has an amino acid homology of at least 65%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% or even 99% with SEQ ID NO: 4 and which has BLIP functions.
  • a protein that has BLIP functions is one that interacts with ⁇ / iPKC in a TNF ⁇ dependent manner, which activates NF- ⁇ B in a TNF ⁇ dependent manner and ⁇ / vPKC dependent, and which contains a functional kinase domain.
  • the degree of homology of the amino acid sequence between proteins can be calculated using various commercially available computer software programs (for example, BLAST analysis, as is known in the art).
  • a BLIP inactive mutant kinase is a protein or peptide that has substantial sequence homology with a functional BLIP protein (eg, with a sequence homology of at least about 65%, 75%, 80% , 85%, 90%, 95%, 97%, 98% or even 99%), but it has a non-functional kinase domain.
  • a person skilled in the art will recognize the PI-3 kinase domain of a BLIP protein by its sequence.
  • An example of a BLIP kinase-inactive mutant is provided in SEQ ID NO: 5.
  • LIP variant refers to other peptides or proteins that retain the same functional character of the LIP protein of SEQ ID NO: 6 provided herein, but that varies in the amino acid sequence. Variants are also intended to be included within the scope of the invention. For example, peptides or proteins with a sequence homology greater than about 90%, 92%, 95% or even 97% or 99% with SEQ ID NO: 6 and that retain LIP functions, are considered variants of the LIP protein Such variants may include the deletion, modification or addition of individual amino acids or groups of amino acids within the protein sequence, provided that the peptide maintains the basic biological functionality of an LIP protein, that is, inhibits NF-dependent transcription. ⁇ B.
  • a LIP protein is one that has the amino acids of SEQ ID NO: 6 or that has an amino acid homology of at least about 90%, 92%, 95%, 97%, 98% or even 99% with SEQ ID NO: 6 and it has LIP functions.
  • the degree of homology of the amino acid sequence between proteins can be calculated using various commercially available computer software programs (for example, BLAST analysis as is known in the art).
  • proteins containing such deletions or substitutions are an additional aspect of the present invention.
  • one or more amino acids of a sequence may be replaced by one or more different amino acids provided that such replacement does not affect the function of the sequence.
  • Such changes can be guided by known homologies between amino acids in physical characteristics such as charge density, hydrophobia / hydrophilicity, size and configuration, such that the amino acids are substituted with other amino acids that have essentially the same functional properties, as known in the technique.
  • the invention also includes nucleotide sequences encoding BLIP and LIP proteins, mutants and variants thereof, as well as sequences of nucleotides that are complementary to them.
  • the nucleotide sequence can be DNA or RNA, including genomic DNA, synthetic DNA or cDNA.
  • the nucleotide sequence is a DNA sequence and, even more preferably, a cDNA sequence.
  • Nucleotide sequence information is provided in Figure 6 (SEQ ID NO: 3); the BLIP protein of SEQ ID NO: 4 is encoded by nucleotides 152-7327 of SEQ ID NO: 3).
  • Nucleotide molecules can be isolated from human cells or synthesized according to procedures known in the art, as described by way of example in Sambrook, J.
  • Nucleotide molecules according to the invention have utility in the production of proteins according to the invention, which can take place in vitro, in vivo or ex vivo. Nucleotide molecules can be involved in recombinant protein synthesis or, in fact, as therapeutic agents themselves, they can be used in gene therapy techniques. In gene therapy, nucleotides complementary to those encoding BLIP proteins or antisense sequences can also be used, such as in strategies for the negative regulation of the expression of the proteins of the invention.
  • DNA molecules encoding a BLIP protein are intended to include natural allelic variations of DNA molecules.
  • Hybridization conditions that allow other 7DNA sequences encoding a BLIP protein to hybridize with a DNA sequence such as that provided here are generally very stringent conditions.
  • hybridization of such sequences can be performed under conditions represented by a washing rigor of 0.3 M NaCl, 0.03 M sodium citrate, 0.1% SDS at 60 ° C or even at 70 ° C, in a conventional in situ hybridization assay. See J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd Ed. 1989) (Cold Spring Harbor Laboratory)).
  • DNA sequences encoding a BLIP protein and hybridize with a DNA sequence of SEQ ID NO: 3 described herein will have a nucleotide sequence homology of at least 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92% or even 95% with SEQ ID NO: 3, and will encode a protein with BLIP functions.
  • the sequence homology can be determined using commercially available computer software programs (for example, BLAST analysis as is known in the art).
  • the isolated DNA of the present invention can be of any species of origin, including mouse, rat, rabbit, cat, pig and human, but preferably it is of mammalian origin and more preferably of human origin.
  • a DNA molecule encoding an LIP protein includes natural allelic variations in the DNA molecules.
  • Hybridization conditions that allow other DNA sequences encoding an LIP protein to hybridize with a DNA sequence such as that provided herein are generally very stringent conditions.
  • hybridization of such sequences can be performed under conditions represented by a washing rigor of 0.3 M NaCl, 0.03 M sodium citrate, 0.1% SDS at 60 ° C or even at 70 ° C in one test of conventional in situ hybridization. See J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd Ed. 1989) (Cold Spring Harbor Laboratory)).
  • DNA sequences encoding an LIP protein and hybridize with a DNA sequence of SEQ ID NO: 3 described herein will have at least a nucleotide sequence homology of at least 65%, 70%, 75% , 80%, 85%, 90%, 92% or even 95% with SEQ ID NO: 3, and will encode a protein with LIP functions. Sequence homology can be determined using commercially available computer software programs (for example, BLAST analysis as is known in the art).
  • the isolated DNA of the present invention can be of any species of origin, including mouse, rat, rabbit, cat, pig and human, but preferably it is of mammalian origin and more preferably of human origin.
  • oligonucleotide molecules encoding BLIP or LIP proteins (or mutants or variants thereof) but which differ in the codon sequence of the previous DNA molecules due to the degeneracy of the genetic code are also an aspect of this invention.
  • the degeneracy of the genetic code which allows different nucleic acid sequences to code for the same protein or peptide, is well known in the art.
  • Oligonucleotide molecules that code for the same BLIP protein as the one encoded by the above sequences, but which differs from these in the codon sequence due to site-directed mutagenesis are another aspect of this invention.
  • the techniques of directed localization mutagenesis are known in the art.
  • the present invention also includes expression vectors comprising nucleotide sequences encoding the present proteins, mutants or variants thereof.
  • expression vectors are routinely constructed in the technique of molecular biology and may involve, for example, the use of plasmid DNA and appropriate initiators, promoters, inducers and other elements, such as, for example, polyadenylation signals that can be necessary and that are placed in the correct orientation to allow the expression of proteins.
  • Appropriate vectors will be apparent to persons skilled in the art.
  • Vectors can be used to amplify the DNA encoding a desired protein and / or to express a DNA encoding a desired protein.
  • the DNA sequence encoding the desired protein is operably linked to suitable control sequences capable of carrying out the expression of the protein in a suitable host.
  • DNA regions are operatively linked or operatively associated when they are functionally related to each other.
  • a promoter is operably linked to a coding sequence if it controls the transcription of the sequence; or a ribosome binding site is operably linked to a coding sequence if it is positioned so as to allow translation.
  • the need for such control sequences will vary depending on the host selected and the transformation procedure chosen.
  • Vectors may include plasmids, viruses (eg, adenovirus, cytomegalovirus), phage and integrable DNA fragments (i.e., fragments integrable into the host genome by recombination).
  • the invention also includes cell lines that have been modified or transfected to express the proteins of the present invention.
  • Such cell lines include upper, transient or preferably stable eukaryotic cell lines. (such as mammalian cells or insect cells), lower eukaryotic cells (such as yeasts) or prokaryotic cells (such as bacterial cells). It is also possible that the proteins of the invention are expressed transiently in a cell line, such as, for example, in a baculovirus expression system.
  • the present invention also relates to antibodies (polyclonal or preferably monoclonal antibodies) that specifically bind to the proteins of the present invention, (i.e., antibodies that bind to a single antigenic site or epitope of the proteins)
  • antibodies are preferably of monoclonal origin.
  • the antibodies are preferably IgG antibodies of any suitable species, such as rat, rabbit or horse, but are generally of mammalian origin. It is understood that IgG antibody fragments that retain the ability to specifically bind to the proteins of the present invention, such as F (ab ') 2 , F (ab') and Fab fragments, are included by the term "antibody" of this document. See, in general, E. Harlow and D.
  • the antibodies can be chimeric, as described by M. alker et al., Molecular Immunol. 26, 403 (1989). Antibodies that bind to proteins BLIP, but not shorter LIP proteins, are particularly preferred.
  • Such antibodies are useful in purification, isolation or selection that involve immunoprecipitation techniques, and can be used as tools to further ascertain the function of the protein.
  • Oligodeoxynucleotides of complementary nucleic acids and capable of hybridizing with the sense chain of a gene, or with an mRNA transcribed from that gene are antisense oligodeoxynucleotides.
  • the sense chain of a target gene, or an mRNA is exposed to its antisense oligodeoxynucleotides, the interaction of the two will occur, so that gene transcription will be blocked or mRNA translation will be blocked.
  • the present invention includes oligomers capable of hybridizing with a portion of a gene (or mRNA) encoding the BLIP or LIP protein.
  • Substantial prevention means that protein is not produced or produced at levels that are not functional.
  • Antisense oligonucleotides (and nucleic acids that express such antisense molecules) They can be obtained according to conventional techniques. See, for example, US Patent No. 5,023,243 to Tull ⁇ s; and U.S. Patent No. 5,149,797 to Pederson et al.
  • the length of the antisense oligonucleotide (that is, the number of nucleotides it has) is not critical as long as it selectively binds to the desired location; This can be determined according to routine procedures. In general, the antisense oligonucleotide will have a length from 8, 10 or 12 nucleotides to 20, 30 or 50 nucleotides.
  • Such antisense oligonucleotides may be oligonucleotides in which at least one or all of the nucleotide binding phosphate moieties are modified phosphates, such as methyl phosphonates, methyl phosphonothioates, phosphoromorpholyates, phosphoropiperazidates and phosphoramidates.
  • each of the nucleotide binding phosphate moieties may be modified as described.
  • such antisense oligonucleotides are oligonucleotides in which at least one or all nucleotides contain a 2 'lower alkyl radical.
  • one oligonucleotide can be modified if and another not as described. See also P. Furdon et al., Nucleic Acids Res. 17, 9193-9204 (1989); S.
  • Another aspect of the present invention relates to selection procedures designed to identify compounds that modulate BLIP activation of ⁇ / iPKC, or that modulate NF- ⁇ B activation.
  • modulation is meant that there will be an increase or reduction in the activation of NF- ⁇ B in the presence of the compound (compared to that which would be observed in the absence of the compound); such activity will generally be produced by the binding of a ligand of the compound to BLIP, ⁇ / iPKC, the tandem of BLIP and ⁇ / tPKC, or to NF-KB itself.
  • such selection procedures involve administering a test compound to a cell and detecting BLF-related activation of NF- ⁇ B, compared to a control cell in which the test compound (or the BLIP protein is absent) functional).
  • the activation of NF- ⁇ B can be evaluated using a KB-dependent messenger gene (such as the luciferase gene), or by measuring the translocation of NF- ⁇ B to the cell nucleus (using procedures that are known in the art, for example, the use of anti-Rel65 antibodies to detect nuclear NF- ⁇ B).
  • Such selection procedures may comprise furthermore the detection of whether said test compound binds to ⁇ / tPKC (or BLIP, or NF- ⁇ B), for example, preparing cell extracts and immunoprecipitating the protein of interest, and performing an immunoblot using an antibody directed to the test compound .
  • the ability of the compounds to modulate BLIP autophosphorylation activity can also be used as a procedure to select compounds with respect to the activation of NF- ⁇ B or inhibitory effects.
  • selection procedures involve the administration of a test compound to a cell and the detection of BLIP autophosphorylation, as compared to a control cell in which the test compound is absent.
  • the present invention also includes within its scope the compounds that are identified as compounds that possess a useful NFKB modulation activity, by the above-mentioned selection procedures.
  • Another aspect of the present invention is the use of compounds that inhibit or increase the activation of NF- ⁇ B (including the compounds identified by the selection techniques mentioned above), in the treatment or prophylaxis of disorders that respond to BLIP activity modulation or NF- ⁇ B activity modulation in a mammalian patient (preferably a human being).
  • the present invention provides a method for inhibiting (or increasing) the activation of NF- ⁇ B in a cell, providing the cell with a compound that inhibits (or increases) the activation of BLIP-dependent NF- ⁇ B.
  • a compound that inhibits (or increases) the activation of BLIP-dependent NF- ⁇ B is a BLIP mutant without kinase activity.
  • inhibitor compound for example, a protein of SEQ ID NO: 5
  • antisense nucleotide as described above
  • the inhibitor compound is provided in an amount effective to reduce the activation of endogenous BLIP-dependent NF- ⁇ B in the cell (compared to the activation of NF- ⁇ B that would occur in the cell in the absence of the inhibitor compound).
  • Compounds that increase NF- ⁇ B activation are provided in an amount effective to increase endogenous BLIP-dependent NF- ⁇ B activation in the cell (as compared to activation of NF- ⁇ B that would occur in the cell in the absence of compound).
  • the proportion step can be performed by any suitable means, such as by releasing the inhibitor compound within the cell or by releasing within the cell a nucleic acid encoding and expressing the inhibitor compound.
  • Compounds that inhibit BLF-related activation of NF- ⁇ B will have beneficial therapeutic effects in pathologies in which such activation is positively regulated.
  • NF- ⁇ B is activated in response to various pathogenic signals, and induces the transcription of a variety of genes encoding immunologically relevant proteins. Baeuerle and Henkel, A ⁇ nu Rev. Immunol. 12: 141 (1994).
  • Interference with the activation or activity of NF- ⁇ B can suppress immunological reactions, including views in toxic / septic shock, in host reactions against grafts, in acute inflammatory reactions and in radiation injuries.
  • both chemotherapy and radiation therapy can activate NF- ⁇ B, which, in turn, reduces the apoptotic effects of the therapy. It has been reported that inhibition of NF- ⁇ B activation in tumors increases the apoptotic potential of cancer treatments. ang et al., Nature Medicine 5: 412 (1999).
  • BLIP-mediated NF- ⁇ B activation is involved in immunological and neoplastic diseases. Therefore, inhibition of BLIP-mediated NF- ⁇ B activation will provide a positive therapeutic advantage when immune suppression is desired or when antineoplastic effects are desired.
  • Inhibitors will be useful for the treatment and / or prophylaxis of disorders such as toxic / septic shock, host reactions against grafts, acute inflammatory reactions and radiation injuries.
  • Such compounds will also have utility as antineoplastic agents in the treatment of tumors or cancers and as adjuvants in chemotherapy or radiation therapy of neoplastic growths.
  • adenoviral release in cancer cells of a mutant without BLIP kinase activity (or another inhibitor of BLIP-dependent NF- ⁇ B activation) will be useful as an adjuvant in cancer chemotherapy, to increase the apoptotic effects of chemotherapies. .
  • Compounds that increase or induce BLF-related activation of NF- ⁇ B will have beneficial therapeutic effects in pathologies in which such activation is reduced, or when it is desired to positively regulate the activation of NF- ⁇ B.
  • Such compounds are useful as immunostimulators and as cell death inhibitors.
  • NF-KB modulating compounds including those identified according to the selection procedures indicated above, can be formulated with conventional pharmaceutically acceptable carriers and / or excipients as is routine in the pharmaceutical art and as further described in Remmington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Eastern Pennsylvania, 17 to Ed, 1985, whose description is included here in its entirety by reference.
  • the compounds may be administered by enteric or parenteral routes such as oral, buccal, anal, pulmonary, intravenous, intraarterial, intramuscular, intraperitoneal, topical or other appropriate routes of administration.
  • recombinant human TNF ⁇ was purchased from Promega; Boehringer's 12CA5 anti-Hemagglutinin (anti-HA) monoclonal antibody; the monoclonal antibody against ⁇ PKC from Transduction Laboratories; goat polyclonal anti-p65 antibody (NF- ⁇ B) from Santa Cruz Biotechnologies, Inc. Rabbit affinity purified anti-LIP has already been described (D ⁇ az-Meco et al., 1996). Human HEK293 and HeLa cells were obtained from the American Type Culture Collection (ATCC).
  • ATCC American Type Culture Collection
  • the HEK293 cell cultures were maintained in Dulbecco's Modified Eagle medium with high glucose content, which contained 10% fetal calf serum, penicillin G (100 ⁇ g / ml) and streptomycin (100 ⁇ g / ml) (Flow) .
  • Hela cells are they kept Eagle's minimum essential medium supplemented with 0.1 mM non-essential amino acids, 1.0 mM sodium pyruvate and 10% fetal calf serum.
  • Subconfluent cells were transfected by the calcium phosphate procedure (Clontech Laboratories, Inc.).
  • Plasmids To clone the cDNA for the BLIP coding sequence, a human brain cDNA Marathon Ready (Clontech Laboratories, Inc.) was used following the manufacturer's procedures. This cDNA was subcloned into the Notl site of the pCDNA3-HA vector to obtain the pCDNA3-HA-BLIP construct.
  • pCDNA3 -HA-BLIT ⁇ D1066A; N1071K
  • was obtained by site-directed mutagenesis Quality Change, Stratagene.
  • pCDNA3-HA- ⁇ / ⁇ PKC and pCDNA3-HA- ⁇ / ⁇ PKC MUT have been previously described (D ⁇ az-Meco et al., 1996).
  • Immunoprecipitations For immunoprecipitations of endogenous proteins, HEKI293 cells were used. Some cells were stimulated with 30 ng / ml of YNF- ⁇ . The cells were then collected and lysed in PD buffer [40 mM Tris-HCl (pH 8.0), 500 mM NaCl, 0.1% Nonidet P-40, 6 mM EDTA, 6 mM EGTA, 10 mM ⁇ -glycerophosphate , 10 mM NaF, 10 mM PNPP, 3 V0 4 300 ⁇ M, 1 mM benzamidine, 2 M PMSF, 10 ⁇ g / ml aprotinin, 1 ⁇ g / ml leupeptin, 1 ⁇ g / ml pepstatin, 1 mM DTT] and 1 mg of whole cell used was diluted in PD buffer and incubated with 10 ⁇ g of the anti- ⁇ / iPKC monoclonal antibody.
  • Luciferase Messenger Assays Subconfluent cultures of HEK293 cells were transfected with different amounts of plasmid pCDNA3-HA-BLIP or pCDNA3-HA-BLIP MUT , together with the KB-Luc messenger plasmid, with or without expression vectors for the wild type and ⁇ / tPKC dominant negative (pCDNA3-HA- ⁇ / ⁇ PKC and pCDNA3-HA- ⁇ / ⁇ PKC MUT ). After 24 hours, the cells were stimulated with TNF- ⁇ for 4 hours. Extracts were prepared and luciferase activity was determined as described (D ⁇ az-Meco et al., 1996).
  • I ⁇ iminofluorescence HeLa cells developed on glass coverslips in growth medium. Subconfluent cells were transfected with 5 ⁇ g of HA-BLIP MUT . Twenty hours after transfection, the cells were stimulated with TNF- ⁇ (30 ng / ml) for 20 minutes. The cells were quickly washed twice in ice-cold PBS and fixed in 4% formaldehyde for 15 minutes at room temperature. The cells were washed 4 times with PBS and permeabilized with 0.1% Triton X-100. The free aldehyde groups were inactivated with 50 mM NH 4 C1. The endogenous peroxidase activity was inactivated by treatment with 1% H 2 0 2 in PBS for 15 minutes.
  • HA-labeled protein was visualized with the 12CA5 anti-HA monoclonal antibody (Boehringer Mannheim) and an FITC conjugated anti-mouse antibody (Cappel), and the endogenous p65 with a goat polyclonal antibody (Santa Cruz Biotech), and the tetramethyl-rhodamine tyramide TSA-Direct amplification system (NEN Life Science Products).
  • the glass coverslips were mounted on a Mowiol and examined with a MRC 1024 Bio-Rad confocal system (Bio-Rad Richmond, CA) mounted on a Zeiss Axiovert 135 microscope (Zeiss, Oberkochen, Germany).
  • LIP LIP was expressed in testicular and cardiac tissues, but not in other tissues investigated (liver, ovaries, spleen , thymus, brain, lung and kidney). However, unexpectedly a band that reacted with the LIP antibody and that It had a molecular weight greater than 200 kDa (results not shown).
  • BLIP binding to ⁇ / iPKC The present inventors evaluated whether BLIP could bind ⁇ / iPKC in vivo. Using HEK293 cells, the cells were left untreated (control) or stimulated with TNF ⁇ for various times, after which cell extracts were prepared, inoprecipitated with a selective anti- ⁇ / iPKC antibody and analyzed by immunoblotting with the anti-LIP antibody
  • HEK293 cells were transfected with a KB-dependent messenger gene (luciferase) along with increasing concentrations of an expression plasmid for LIP ( 0.2, 0.5, 1.0 and 2.0 ⁇ g / well of 60 mm diameter). Twenty hours after transfection, the cells were left untreated or stimulated with 30 ng / ml of TNF ⁇ . The results (mean ⁇ SD of three independent experiments with duplicate incubation; Figure 1) demonstrate that LIP expression reduces the KB-dependent messenger activity induced by TNF ⁇ .
  • a KB-dependent messenger gene luciferase
  • the present inventors then cloned and molecularly characterized the human BLIP protein.
  • BLIP was found to be a 2392 amino acid protein
  • BLIP, FRAP and ATM indicates that BLIP has activity kinase, since the DXXXXN and DFG motifs that constitute critical remains of the catalytic site conserved in all members of the ATM family with kinase activity, are also conserved in BLIP.
  • the BLIP kinase region is not located in the part closest to the C-terminal end of the molecule, but approximately in the middle (Fig. 2B).
  • the C-terminal portion of BLIP is the sequence corresponding to LIP. Therefore, LIP constitutes a BLIP domain (Fig. 2B), which reveals an organization of domains that differs from other PI 3- kinases.
  • HEAT domains Upstream of the PI 3 domain-FRAP kinase there is a series of protein-protein interaction modules called HEAT domains (Dennis et al., 1999). Such domains (or other regions through which interactions with other proteins could be predicted) are absent in the BLIP molecule, with the exception of the LIP region through which ⁇ / iPKC interacts (Dennis et al., 1999).
  • Another feature of FRAP that is absent in LIP is the FRB domain; This domain is the region responsible for the interaction of FRAP with the FKB / rapamycin complex (Dennis et al., 1999). This suggests that BLIP is insensitive to rapamycin.
  • HEK293 cells were transfected with a messenger gene KB dependent along with increasing concentrations
  • HEK293 cells were transfected with a KB-dependent luciferase messenger plasmid and one of the following: a negative control vector, an expression plasmid for wild-type ⁇ / iPKC or an expression plasmid for? * ./ ⁇ PKC kinase-inactive.
  • luciferase activity was evaluated in cells without BLIP (control) and with increasing concentrations (0.5, 1.0, 2.0 ⁇ g / 60 mm diameter) of wild-type BLIP (BLIP). The results are shown in Figure 4B. Coexpression of wild-type ⁇ / tPKC cooperates with BLIP to activate NF- ⁇ B, while expression of ⁇ / iPKC kinase-inactive mutant appeals this BLIP effect.
  • HeLa cells were transfected with the HA-labeled BLIP expression vector (BLIP " 1 "), - as non-transfected HeLa cells were used as control cells. Twenty-four hours after transfection, cells were stimulated with TNF ⁇ for 20 minutes or left untreated (control). The cells were then analyzed by double immunofluorescence using an anti p65 antibody (RelA) and an anti HA antibody to detect the cells expressing the construct (data not shown). Cell analysis indicates that more than 80% of the cells transfected with the wild-type BLIP mutant had a TNF ⁇ -induced translocation of p65, compared to approximately 20% of the cells transfected with the BLIP mutant ( Figure 5 ).
  • test compound is administered to the test cells; no test compound is administered to control cells.
  • the cells are stimulated with TNF ⁇ during various times, after which cell extracts are prepared, they are immunoprecipitated with a selective anti- ⁇ / iPKC antibody and analyzed by immunoblotting with the anti-BLIP antibody.
  • An increase in the association of BLIP with ⁇ / iPKC in the test cells indicates that the test compound increases the activation of ⁇ / iPKC dependent on BLIP (and, therefore, therefore, the activation of NF- ⁇ B), - a reduction indicates that the test compound inhibits the activation of ⁇ / tPKC dependent on BLIP (and, therefore, the activation of NF- ⁇ B).
  • the cells can be transfected with a KB-dependent messenger gene, such as luciferase, and the activity of the messenger gene can be evaluated as a measure of NF- ⁇ B activation in the presence of a test compound, as compared to the cells of control .
  • a KB-dependent messenger gene such as luciferase
  • Target of rapamacyn (TOR): balancing the opposite forces of protein synthesis and degradation. Curr. Opin. Gen. & Devel. 9: 49-54. 9. Diaz-Meco, MT, E. Berra, MM Municio, L. Sanz, J. Lozano, V. D ⁇ az-Golpe, MT Lain de Lera, J. Alcam ⁇ , CV Paya, F. Arenzana-Seisdedos, JL Virelizier, and J. Moscat. 1993. A dominant negative protein kinase C ⁇ subspecies blocks NF- ⁇ B activation. Mol. Cell Biol. 13: 4770-4775.
  • NF- ⁇ B a pleitropic mediator of inducible and tissue-specific gene control.
  • Protein kinase C ⁇ isoform is critical for ⁇ B-dependent promoter activation by sphingomyelinase. J. Biol. Chem. 269: 19200-19202.
  • IKK-1 and IKK-2 cytokine-activated I ⁇ B kinases essential for NF- ⁇ B activation.
  • PKC ⁇ is a molecular switch in signal transduction of TNF ⁇ , bifunctionally regulated by ceramide and arachidonic acid. EMBO J. 14: 1961-1969.
  • Protein phosphatase 2A is a critical regulator of protein kinase C ⁇ signaling targeted by SV40 small t to ptomote cell growth and NF- ⁇ B activation. EMBO J. 16: 5662-5671.
  • I ⁇ B kinase- ⁇ NF- ⁇ B activation and complex formation with I ⁇ B kinase- ⁇ and NIK. Science 278: 866-869.
  • Zandi E., D.M. Rothwarf, M. Delhase, M. Hayakawa, and M. Karin. 1997.
  • the I ⁇ B kinase complex (IKK) contains two kinase subunits, IKK ⁇ and IKK ⁇ , necessary for I ⁇ B phosphorylation and NF-KB activation. Cell 91: 243-252.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Proteinas de interación lambda humanas LIB y BLIP implicadas en la activación de NF-KB y los mutantes quinasa inactivos de BLIP. Asimismo la invención se refiere a las secuencias de nucleótidos que codifican tales proteinas y sus mutantes, procedimientos de producción de las citadas proteinas, vectores de expresión, líneas celulares, anticuerpos, compuestos moduladores de la activación de NF-KB dependiente de BLIP y sus procedimientos de selección, y procedimientos de tratamiento relacionadas con dichas proteinas.

Description

Nueva Proteína
Campo de la invención
La presente invención se refiere a proteínas de interacción lambda humanas implicadas en la activación del Factor Nuclear KB (NF-KB) y además, pero no exclusivamente, a mutantes quinasa-inactivos de tales proteínas; a secuencias de nucleótidos que codifican tales proteínas y proteínas mutantes; y a vectores de expresión, líneas celulares, anticuerpos, procedimientos de selección, compuestos, procedimientos de producción y procedimientos de tratamiento relacionados con las proteínas .
Antecedentes de la Invención
Los isotipos atípicos de la Proteína Quinasa C (PKC) (λ/iPKC y ςPKC) son necesarios para funciones celulares básicas tales como la proliferación y la supervivencia. Ciertos estudios han demostrado que las PKC atípicas (aPKC) se estimulan por el TNFα y se requieren para activación de NF-κB por esta citocina, a través de un mecanismo que implica probablemente la fosforilación de IκB mediante la activación de la IκB quinasa β.
El factor de transcripción NF-κB juega un papel crítico en varias funciones celulares incluyendo las respuestas clave inflamatorias y las respuestas inmunes. El factor KB nuclear es un factor de transcripción de múltiples subunidades expresado en todas partes, que se activa en varios tipos de células por un grupo diverso de agentes inflamatorios tales como TNFα, IL-lβ, endotoxina bacteriana y virus de ARN. NF-κB se compone de dímeros de diferentes miembros de la familia de proteínas Reí . la forma clásica de NF-κB es un heterodímero de p50 y p65 (Reí A) (Baeurle y Henkel, 1994; Baldwin, 1996; Thanos y aniatis, 1995); está complejado en el citosol por IκB, que impide su translocación nuclear y su actividad.
Tras la estimulación de las células por citocinas inflamatorias tales como TNFα o IL-1, el IκBα se fosforila, activando su extensión y la posterior degradación de IκB a través de la ruta proteosómica
(Verna y col., 1995). Estos acontecimientos liberan NF-
KB, que se transloca al núcleo, donde activa varios genes (Baeurle y Henkel, 1994; Baldwin, 1996; Thanos y
Maniatis, 1995; Verma y col., 1995).
La identificación de la quinasa responsable de la fosforilación de IκB inducida por la señal ha sido objeto de investigación. Se han identificado varios grupos y se han clonado dos actividades IκB quinasa
(IKKα e IKKβ) que fosforilan los restos 32 y 36 de IκBα, y cuya actividad se estimula potencialmente por TNF e IL-1 (DiDonato y col., 1997; Mercurio y col., 1997; Réginer y col., 1997; oronicz y col., 1997; Zandi y col., 1997) . Las IKK se unen a NIK (quinasa inductora de NFKB) , un miembro de la familia MAPKKK que interacciona con TRAF2 (Malinin y col., 1997), asociando así la degradación de IκB y la activación de NF-κB al complejo receptor del TNF.
El TNFα es un potente activador de las PKC atípicas in vivo. Previamente se ha demostrado que las isoformas atípicas de PKC ς (zeta) y λ/t (lambda/iota) juegan un papel crítico durante la activación de NF-κB (Diaz-Meco y col., 1996; Folgueira y col., 1996; Sontag y col., 1997) . Así pues, el bloqueo de las PCK atípicas por inhibidores peptídicos de pseudosustrato microinyectados (Domínguez y col., 1993), oligonucleótidos antisentido (Folgueira y col., 1996) o la transfección de mutantes negativos dominantes sin actividad quinasa de ςPKC o λ/tPKC (Berra y col., 1995, Bjorkoy y col., 1995; Diaz-Meco y col., 1996; Sontag y col., 1997) debilita dramáticamente la activación de NFKB.
Sin embargo, siguen sin conocerse los mecanismos por los que las PKC atípicas participan en la ruta de activación de NF-κB. Como ςPKC no puede fosforilar directamente IκB (Diaz-Meco y col., 1994), es posible que las señales generadas por la estimulación de las PKC atípicas pueda estar mediada por las nuevas IKK. A este respecto, recientemente se ha demostrado que las PKC atípicas se unen a las IKK in vi tro e in vivo (Lallena y col., 1999) . La sobreexpresión de estas PKC modula positivamente la actividad IKKβ, pero no la actividad IKKα, mientras que la transfección de sus mutantes negativos dominantes respectivos debilita gravemente la activación de IKKβ, pero no la de IKKα, en células estimuladas con TNFα (Lallena y col., 1999). Además, la PKC atípica activa recombinante estimula dramáticamente in vi tro la IKKβ -- pero no la IKKα -- en células no estimuladas (Lallena y col., 1999). Colectivamente, estos resultados demuestran un papel crítico de las PKC atípicas en la ruta de NF-κB a través de la regulación de la actividad de IKKβ.
En contraste con las isoformas clásicas o nuevas de las PKC, las PKC atípicas son insensibles a esteres de forbol o al diacilglicerol , pero se activan por otros segundos mensajeros lipidíeos importantes tales como fosfatidilinositol 3,4,5-P3 (Nakanishi y col., 1993) y ceramida (Lozano y col., 1994) . Aunque los productos de la PI 3 -quinasa activan las aPKC (Nakanishi y col., 1993; Akimoto y col., 1996), también estimulan otras quinasas tales como εPKC, θPKC, PRK1 o c-Akt (Diaz-Meco y col., 1996) . La ceramida activa a las dos aPKC (Lozano y col., 1994; Müller y col., 1995), pero la también estimula la proteína quinasa activada por ceramida, entre otras dianas posibles. Esto sugiere que los diferentes mediadores lipidíeos no son selectivos para una PKC dada.
Ahora se ha descubierto que una nueva proteína de interacción lambda (denominada aquí BLIP) interacciona con λ/iPKC de una forma dependiente del TNFα. La expresión ectópica de BLIP de tipo silvestre es suficiente para activar NF-κB de una forma dependiente de λ/tPKC, mientras que el mutante de BLIP quinasa- inactivo es dominante negativo. Las proteínas BLIP humanas y de otros mamíferos son útiles para seleccionar procedimientos para la identificación y desarrollo de nuevos agentes farmacéuticos, incluyendo agonistas y antagonistas de las proteínas, que pueden usarse para aumentar o reducir la activación de NF-κB (en comparación con la activación que se produciría en una célula de control no tratada) .
Por consiguiente, es un objeto de la presente invención proporcionar proteínas BLIP humanas aisladas y ADN que codifica tales proteínas. Otros objetos de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada de la misma.
Resumen de la Invención
De acuerdo con una realización de la presente invención, se proporciona una proteína BLIP humana aislada o una variable de la misma. En un aspecto particularmente preferido de la invención, la proteína tiene una secuencia de aminoácidos como la proporcionada en la Figura 2A (SEC ID NO: 4) .
Un aspecto adicional de la presente invención es un mutante sin actividad quinasa de una proteína BLIP.
Otro aspecto de la presente invención es una proteína LIP humana aislada o una variante de la misma.
En un aspecto particularmente preferido de la invención, la proteína tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC
ID NO: 6.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona una secuencia de nucleótidos aislada que codifica una proteína BLIP o una variante de la misma, o una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la misma. Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos es una secuencia de ADNc . De una forma particularmente preferida, la secuencia de nucleótidos es o comprende la SEC ID NO: 3.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona una secuencia de nucleótidos aislada que codifica una proteína LIP o una variante de la misma, o una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la misma. Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos es una secuencia de ADNc. De una forma particularmente preferida, la secuencia de nucleótidos es o comprende la SEC ID NO: 6. De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona una molécula de ADN aislada que tiene una secuencia seleccionada entre el grupo compuesto por: (a) ADN aislado que codifica la proteína BLIP de la Figura 2A (SEC ID NO: 4) ; (b) ADN aislado que híbrida con el ADN aislado de (a) anterior bajo condiciones representadas por una rigurosidad de lavado de NaCl 0,3 M, citrato sódico 0,03 M y SDS 0,1% a 60 °C, que tiene una homología de al menos un 65% con el ADN aislado de (a) anterior, y que codifica una proteína BLIP; y (c) ADN aislado que tiene una secuencia complementaria a (a) - (c) anteriores.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico como se ha mencionado anteriormente. De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona una construcción de ácido nucleico que tiene un promotor y un ácido nucleico heterólogo unido operativamente a dicho promotor, donde dicho ácido nucleico heterólogo es una molécula de ácido nucleico como la proporcionada anteriormente.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona una línea de células estables que comprende una secuencia de ADN recombinante o un vector de expresión como se ha mencionado anteriormente, capaz de expresar la proteína codificada. Preferiblemente, la línea celular es una línea de células Hela o HEK293 modificadas .
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un anticuerpo policlonal o monoclonal que se une específicamente a una proteína BLIP como se ha indicado anteriormente.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un oligonucleótido antisentido complementario a un ácido nucleico como se ha indicado anteriormente y que tiene una longitud suficiente como para hibridar con el mismo bajo condiciones fisiológicas; junto con un ADN que codifica tal oligonucleótido antisentido; y una construcción de ácido nucleico que tiene un promotor y un ácido nucleico heterólogo unido operativamente a dicho promotor, donde el ácido nucleico heterólogo es un ADN que codifica tal oligonucleótido antisentido.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento para inhibir la activación de NF-κB en una célula, que comprende proporcionar a la célula un inhibidor de la activación de NF-κB relacionada con BLIP, en una cantidad eficaz para inhibir la activación de NF-κB en dicha célula. La célula puede proporcionarse en cualquier forma adecuada, tal como en un cultivo in vi tro. La etapa de proporción puede realizarse por cualquier medio adecuado, tal como suministrando el compuesto inhibidor en el interior de la célula o suministrando dentro de la célula un ácido nucleico que codifica y expresa una proteína inhibidora. La célula preferiblemente es una célula de mamífero y, más preferiblemente, una célula humana.
Otro aspecto de la presente invención es el uso de un mutante BLIP sin actividad quinasa, o una proteína LIP, como un inhibidor de la activación de NF-κB en una célula o como un agente o adyuvante contra el cáncer.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento para seleccionar compuestos con respecto a la capacidad de modular (aumentar o inhibir) la activación dependiente de BLIP de NF-κB. Tales procedimientos comprenden poner en contacto un compuesto de ensayo con una proteína BLIP como se ha mencionado anteriormente y detectar la actividad o la inactividad de modulación.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un compuesto que modula la actividad NF-κB dependiente de BLIP, identificable por los procedimientos mencionados anteriormente .
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento de tratamiento o profilaxis de un trastorno que responde a la modulación de la activación de NF-κB dependiente de BLIP, en un mamífero, que comprende administrar a dicho paciente una cantidad eficaz de un compuesto que modula (inhibe o aumenta) la activación NF-κB dependiente de BLIP. Preferiblemente, el trastorno se selecciona entre trastornos neoplásicos, inflamatorios e inmunes.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona el uso de un compuesto que modula la activación de NF-κB dependiente de BLIP en un procedimiento de formulación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de un trastorno que responde a la modulación de la activación de NF-κB dependiente de BLIP.
Breve Descripción de las Figuras.
La presente invención se describirá adicionalmente a modo de ejemplo y haciendo referencia a las siguientes figuras :
La Figura 1 muestra en un gráfico el efecto de la sobreexpresión de LIP sobre la activación de NF-κB; aumentando la expresión de LIP la actividad reducida del mensajero dependiente de KB inducido por TNFα.
La Figura 2A muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína BLIP humana (SEC ID NO: 4) . La Figura 2B es una representación esquemática de BLIP que muestra el dominio de tipo PI 3 -quinasa de FRAP/ATM y la región LIP.
La Figura 3A es una alineación del dominio de PI 3- quinasa de la proteína BLIP humana con el de FRAP. Los asteriscos indican los aminoácidos que son idénticos en las dos proteínas alineadas; los restos críticos conservados que confieren actividad catalítica a la proteína están incluidos en recuadros.
La Figura 3B es una alineación del dominio de PI 3- quinasa de la proteína BLIP humana con el de ATM. Los asteriscos indican los aminoácidos que son idénticos en las dos proteínas alineadas; los restos críticos conservados que confieren actividad catalítica a la proteína están incluidos en recuadros.
La Figura 4A muestra en un gráfico los efectos del BLIP sobre la activación de NF-κB en cultivos de células HEK293 humanas. Las células HEK293 se transíectaron con un plásmido mensajero de luciferasa dependiente de KB y: un vector de control negativo (primera barra) ; concentraciones crecientes de un plásmido de expresión para BLIP de tipo silvestre (BLIP; segunda-sexta barras) ; concentraciones crecientes de un plásmido de expresión para la proteína BLIP quinasa-inactiva (BLIPMUT; séptima-undécima barra) ; o un vector de expresión RIP (control positivo; barra final) . Después de 24 horas, se determinaron los niveles de expresión de luciferasa. Los resultados son la media ±SD de tres experimentos independientes con incubaciones por duplicado.
La Figura 4B ilustra en un gráfico el papel de BLIP sobre la activación de NF-κB en cultivos de células HEK293. Las células se transfectaron con un plásmido mensajero de luciferasa dependiente de KB y: un vector de control negativo (barras blancas) , un plásmido de expresión para λ/tPKC de tipo silvestre (λ/iPKC; barras sombreadas) o un plásmido de expresión para λ/tPKC quinasa-inactivo (λ/iPKC"1"; barras negras) . Se evaluó la actividad luciferasa en las células sin BLIP (control) y con concentraciones crecientes de BLIP de tipo silvestre (BLIP) después de 24 horas. Los resultados son la media ± SD de tres experimentos independientes con incubaciones por duplicado.
La Figura 5 muestra el porcentaje de células HeLa con p65 nuclear después de la transfección con un vector para una versión marcada con HA de BLIP™1-. Veinte horas después de la transfección, las células se dejaron sin tratar (control, barras blancas) o se estimularon durante 20 minutos con TNFα (30 ng/ml ; barras negras). El análisis se realizó mediante microscopía confocal de inmunofluorescencia con anticuerpo monoclonal anti-HA 12CA5 y un anticuerpo policlonal de cabra anti-p65. El gráfico muestra la media ± SD de varios campos (300 células) de tres experimentos independientes.
La Figura 6 proporciona la secuencia de nucleótidos (SEC ID NO: 3) del ADN que codifica la proteína BLIP de la SEC ID NO: 4.
Descripción Detallada de la Invención
Los presentes inventores han aislado y caracterizado una nueva isoforma LIP, denominada aquí BLIP (por "big LIP" (LIP grande)) (SEC ID NO: 4). BLIP interacciona con λ/tPKC de una forma dependiente de TNFα y activa NF-κB de una forma dependiente de λ/iPKC. De relevancia funcional, BLIP tiene un dominio que es muy homólogo a la región semejante a PI 3 -quinasa de la proteína asociada a FKBP-rapamicina (FRAP) y la proteína Ataxia Telangiectasia Mutada (ATM) (véanse las Figs. 3A y 3B) . De forma interesante, la expresión ectópica de BLIP de tipo silvestre es suficiente para activar NF-κB de una forma dependiente de λ/tPKC, mientras que el mutante quinasa-inactivo de BLIP es dominante negativo. Esta es la primera evidencia de la implicación de una molécula semejante a FRAP/ATM en la activación de NF-KB. Se ha demostrado que NF-KB es relevante en la proliferación de las células y en la apoptosis (Baldwin, 1996; Lenardo y Baltimore, 1989). Los presentes inventores expandieron adicionalmente la secuencia conocida de la proteína LIP humana y determinaron que la proteína LIP inhibe la transcripción dependiente de NFKB cuando se expresa en una célula.
Las PKC atípicas se regulan por reguladores proteicos. En comparación con las secuencias de aminoácidos de las PKC nuevas o clásicas, las secuencias de la subfamilia de PKC atípicas difieren en el dominio regulador. La identificación de moduladores selectivos para cada isotipo de PKC ayudará a comprender la función y regulación de las diferentes isoformas de PKC. Se ha identificado una proteína denominada LIP como regulador selectivo de λ/iPKC (Diaz-Meco y col., 1996) . LIP se une al saliente de cinc de λ/tPKC, pero no se une a αPKC, a εPKC ni incluso al ςPKC muy relacionado (Diaz-Meco y col., 1996). De forma interesante, la sobreexpresión de un fragmento de LIP (el fragmento R4) que es suficiente para interaccionar con λ/iPKC es capaz de estimular una actividad promotora dependiente de KB (Diaz-Meco y col., 1996) .
Previamente, se informó que la expresión de una región C-terminal mínima de LIP (denominada R4 en Diaz- Meco y col., 1996) que se unía a λ/iPKC, también era suficiente para activar NF-κB (Diaz Meco y col., 1996). Sin embargo, los presentes inventores determinaron que la sobreexpresión de LIP de longitud entera no activa NF-κB, y de hecho inhibe la transcripción de genes dependientes de KB (véase el Ejemplo 4) . LIP se identificó inicialmente por el sistema de dos híbridos en levadura. Diaz-Meco y col., (1996), describen un ADNc aislado de LIP que codifica una proteína de 713 aminoácidos, con un peso molecular previsto de 79,7 kDa. Los presentes inventores determinaron que la secuencia de LIP era de 779 aminoácidos (SEC ID NO: 6) y observaron que LIP se expresaba en tejidos de testículo y de corazón, pero no en otros tejidos investigados (hígado, ovarios, bazo, timo, cerebro, pulmón y riñon) . Sin embargo, inesperadamente se detectó una banda que reaccionaba con el anticuerpo anti-LIP y que tenía un peso molecular mayor de 200 kDa (resultados no mostrados) .
Después se determinó la expresión de LIP y la banda recién identificada en dos líneas de células humanas diferentes (células HEK293 y HeLa) . Véase el Ejemplo 2. Se observó que las dos bandas eran detectables en las dos líneas de células aunque variaba la proporción, siendo la proteína de mayor peso molecular (BLIP) más abundante en células HEK293 que en células HeLa (resultados no mostrados) .
Los presentes inventores evaluaron si BLIP se podía unir a λ/iPKC in vivo (Ejemplo 3), usando células HEK293 que no estaban tratadas (control) o estimuladas con TNFα durante diversos tiempos. Bajo condiciones de reposo había una asociación pequeña o nula de BLIP o LIP con λ/tPKC (datos no mostrados) . Sin embargo, tras la estimulación de TNFα, había una interacción rápida y sostenida de BLIP con λ/tPKC.
Para investigar adicionalmente si BLIP era fisiológicamente relevante en la ruta aPKC/NF-κB, los presentes inventores después clonaron y caracterizaron moleculármente BLIP (Ejemplo 5) . BLIP es una proteína de 2392 aminoácidos (Fig. 2A, SEC ID NO: 4) ; la región que abarca los aminoácidos 881-1209 de BLIP presenta un alto grado de homología con los dominios PI 3 -quinasa de FRAP
(SEC ID NO:l) y de ATM (SEC ID NO: 2) (Figs. 3A y 3B) .
La alineación de los dominios de tipo PI 3 -quinasa de
BLIP, FRAP y ATM indica que BLIP tiene actividad quinasa, ya que los motivos DXXXXN y DFG que constituyen restos críticos del sitio catalítico conservado en todos los miembros de la familia ATM con actividad quinasa, también se conservan en BLIP. (véanse las Figs. 3A y 3B) .
Los presentes inventores investigaron si el dominio quinasa semejante a FRAP/ATM de BLIP juega un papel en la activación de NF-κB (Ejemplo 6) . Se transfectaron células HEK293 con un gen mensajero dependiente de KB (luciferasa) junto con concentraciones crecientes de plásmidos de expresión para BLIP, bien para BLIP de tipo silvestre o para un mutante quinasa- inactivo (BLIP"1") . Los resultados (Figura 4A) indican que la expresión de BLIP de tipo silvestre (pero no un mutante de BLIP quinasa inactivo) es suficiente para activar la actividad del mensajero dependiente de KB en un grado comparable al de RIP (Proteína de Interacción con el Receptor) .
Otros experimentos establecieron que el efecto de activación de NF-κB de la proteína BLIP depende de λ/tPKC (Ejemplo 7) . Las células se transfectaron con un plásmido mensajero de luciferasa dependiente de KB y un vector de control negativo, un plásmido de expresión para λ/iPKC de tipo silvestre, o un plásmido de expresión para λ/ιPKCMυτ quinasa-inactivo. Se evaluó la actividad luciferasa en células sin BLIP (control) y con concentraciones crecientes de BLIP de tipo silvestre (BLIP) y se observó que la co-expresión de λ/iPKC de tipo silvestre cooperaba con BLIP para activar NF-κB, mientras que la expresión del mutante λ/iPKC quinasa- inactivo no lo hacía. Los resultados se muestran en la Figura 4B.
El trabajo de los presentes inventores indica que BLIP es un componente crítico de la ruta de NF-κB, y depende de su propia actividad quinasa y de la de λ/iPKC para ejercer su función.
Para demostrar que BLIP controla la translocación de RelA al núcleo, se transfectaron células con el vector de expresión de BLIP mutante (BLIP1™7) marcado con HA. Veinticuatro horas después de la transfección, las células se estimularon con TNFα o se dejaron sin tratar
(control) . Después, las células se analizaron mediante inmunofluorescencia doble usando un anticuerpo anti p65 (RelA) y un anticuerpo anti-HA para detectar las células que estaban expresando la construcción (datos no mostrados) . El análisis de las células reveló que las células transfectadas con el BLIP mutante habían inhibido la translocación inducida por TNFα de p65 en comparación con las células transfectadas con BLIP de tipo silvestre (Fig. 5) .
Las PKC atípicas están implicadas en el control de NF-KB y p70S6K (Romanelli y col., 1999). Las dos rutas son críticas en el control de la función de células inflamatorias e inmunosupresoras . NF-κB controla una miríada de respuestas inmunes y es una molécula anti- apoptótica potente. La inhibición de las quinasas PKC atípicas bloquea el crecimiento y la proliferación de las células e inicia una muerte celular programada
(Berra y col, 1993, 1997; Diaz-Meco y col., 1996; Murray y col., 1997). Además, la inhibición de aPKC conduce a la inversión del fenotipo transformante de células transformadas con Ras (Bjorkoy y col., 1995), indicando que los inhibidores de las PKC atípicas pueden tener efectos antineoplásicos y serían adecuados para la selección de efectos terapéuticos contra el cáncer. Consistente con esta noción, las PKC atípicas se dirigen a intermedios clave de la cascada de señalización de las células implicada en la proliferación celular. Se ha demostrado que ςPKC, así como λ/tPKC, controlan la activación de la cascada de señalización MEK-ERK, junto con Raf, en las rutas Ras y PI 3 -quinasa γ (Diaz-Meco y col., 1994, 1995; Liao y col., 1997; Schónwasser y col., 1998; Takeda y col., 1999).
Los presentes inventores determinaron que BLIP tiene un dominio muy homólogo a la región quinasa de FRAP. FRAP es la diana de la molécula inmunosupresora rapamicina (Dennis y col., 1999). La rapamicina bloquea la activación de p70S6K en células T, lo cual constituye la base molecular de sus acciones inmunosupresoras (Dennis y col., 1999). De forma interesante, se requiere la actividad de p70S6K y es suficiente para la progresión del ciclo celular de los linfocitos T. El tándem BLIP-λ/vPKC representa una ruta alternativa a la de FRAP en el diseño de nuevas moléculas potencialmente inmunosupresoras .
Los resultados presentados aquí demuestran el papel crítico de BLIP en la activación de NF-κB, y también demuestran que el dominio quinasa semejante a FRAP/ATM de BLIP es importante en la activación de NF- KB. Un mutante sin actividad quinasa de la proteína BLIP no puede activar BLIP NF-κB, e incluso tiene una actividad dominante negativa cuando transfecta a células activadas con TNFα (similar a los efectos de LIP de longitud entera) . Aunque no se desea limitación por una sola teoría subyacente a los mecanismos de las proteínas LIP y BLIP, los presentes investigadores postulan que la proteína LIP de longitud entera limita la capacidad de λ/iPKC de activar NF-κB. Esta limitación no está presente cuando el fragmento R4 se usa para investigar la activación de NF-κB (Diaz-Meco y col., 1996) . Es posible que en el caso de BLIP, la supuesta limitación se alivie por la acción de la actividad quinasa similar a FRAP/ATM.
A lo largo de la presente memoria descriptiva y de las reivindicaciones adjuntas, las palabras "comprender" e "incluir" y variaciones tales como "comprende", "comprendiendo", "incluye" e "incluyendo" deben interpretarse de forma inclusiva. Es decir, estas palabras pretenden significar la posible inclusión de otros elementos o enteros no mencionados específicamente, cuando lo permita el contexto.
Las secuencias de aminoácidos descritas aquí se presentan en la dirección amino a carboxi, de izquierda a derecha . Los grupos amino y carboxi no se presentan en la secuencia. Las secuencias de nucleótidos se presentan aquí solo con una cadena, en la dirección 5' a 3', de izquierda a derecha. Los nucleótidos y aminoácidos se representan de la forma recomendada por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB, o (para aminoácidos) por el código de tres letras, de acuerdo con el uso establecido .
Como se ha mencionado anteriormente, la presente invención se refiere a proteínas BLIP y LIP aisladas. La información de secuencia para la BLIP humana aislada se proporciona en la Figura 2A (aminoácidos; SEC ID NO: 4) y en la Fig. 6 (nucleótidos; SEC ID NO: 3) . La información de la secuencia de aminoácidos para un mutante quinasa- inactivo de BLIP se proporciona en la SEC ID NO: 5. La información de la secuencia para LIP se proporciona en la SEC ID NO: 6 (aminoácidos) y en la SEC ID NO: 7
(nucleótidos) . En el contexto de esta invención, el término "aislado" indica que la molécula de proteína o nucleótido no está en su estado nativo, en tanto que se ha purificado al menos en algún grado o se ha producido sintéticamente, por ejemplo, por procedimientos recombinantes . El término "aislado", por lo tanto, incluye la posibilidad de la molécula que está en combinación con otro material biológico o no biológico tal como células, suspensiones de células o fragmentos celulares, proteínas, péptidos, vectores de expresión, disolventes orgánicos o inorgánicos u otros materiales cuando sea apropiado, pero excluye la situación en la que la proteína está en el estado en el que se encuentra en la naturaleza.
Pueden emplearse procedimientos rutinarios conocidos en la técnica, tales como los explicados adicionalmente en la sección experimental mostrada más adelante, para purificar y/o sintetizar las moléculas de proteínas y nucleótidos de acuerdo con la invención. Tales procedimientos se comprenden bien por las personas especialistas en la técnica e incluyen técnicas tales como las descritas en Sambrook, J. y col (1) , cuya descripción se incluye aquí en su totalidad por referencia .
El término "variante de BLIP", según se usa a lo largo de toda la memoria descriptiva y las reivindicaciones, se refiere a otros péptidos y proteínas que retienen el mismo carácter funcional esencial de la proteína BLIP de la SEC ID NO: 4 proporcionada aquí, pero que varía en la secuencia de aminoácidos. También pretenden incluirse variantes dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, se consideran variantes de la proteína BLIP, péptidos o proteínas con una homología de secuencia mayor de aproximadamente un 65%, preferiblemente de al menos un 70%, 75%, 80% u 85% y, de una forma particularmente preferida, de al menos aproximadamente un 90% o incluso de un 95% o 98% con la SEC ID NO: 4, y que retienen funciones de BLIP. Tales variantes pueden incluir la deleción, modificación o adición de aminoácidos individuales o de grupos de aminoácidos dentro de la secuencia de la proteína, siempre que el péptido mantenga la funcionalidad biológica básica de una proteína BLIP, es decir, interaccione con λ/iPKC de una forma dependiente de TNFα y active NF-κB de una forma dependiente de TNFα y dependiente de λ/iPKC. Esta funcionalidad biológica puede evaluarse realizando estudios como los descritos aquí y los conocidos en la técnica.
El término "proteína BLIP", como se usa en este documento, no incluye una proteína que consta sólo de la secuencia de la proteína LIP (SEC ID NO: 6) o el fragmento R4 (SEC ID NO: 8) .
Como se usa en este documento, una proteína BLIP es una que tiene los aminoácidos de la SEC ID NO: 4, o que tiene una homología de aminoácidos de al menos un 65%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o incluso del 99% con la SEC ID NO: 4 y que tiene funciones de BLIP. Una proteína que tiene funciones de BLIP es una que interacciona con λ/iPKC de una forma dependiente de TNFα, que activa NF-κB de una manera dependiente de TNFα y dependiente de λ/vPKC, y que contiene un dominio quinasa funcional. El grado de homología de la secuencia de aminoácidos entre proteínas puede calcularse usando diversos programas de software de ordenador disponibles en el mercado (por ejemplo, el análisis BLAST, como se conoce en la técnica) .
Como se usa aquí, un mutante quinasa inactivo de BLIP es una proteína o péptido que tiene una homología de secuencia sustancial con una proteína BLIP funcional (por ejemplo, con una homología de secuencia de al menos aproximadamente un 65%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o incluso del 99%) , pero que tiene un dominio quinasa no funcional. Un especialista en la técnica reconocerá el dominio PI-3 quinasa de una proteína BLIP por su secuencia. En la SEC ID NO: 5 se proporciona un ejemplo de un mutante BLIP quinasa-inactivo.
El término "variante de LIP", según se usa a lo largo de toda la memoria descriptiva y las reivindicaciones, se refiere a otros péptidos o proteínas que retienen el mismo carácter funcional de la proteína LIP de la SEC ID NO : 6 proporcionada aquí, pero que varía en la secuencia de aminoácidos. También pretenden incluirse variantes dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, los péptidos o proteínas con una homología de secuencia mayor de aproximadamente un 90%, 92%, 95% o incluso 97% o 99% con la SEC ID NO: 6 y que retienen funciones de LIP, se consideran variantes de la proteína LIP. Tales variantes pueden incluir la deleción, modificación o adición de aminoácidos individuales o de grupos de aminoácidos dentro de la secuencia de la proteína, siempre que el péptido mantenga la funcionalidad biológica básica de una proteína LIP, es decir, inhiba la transcripción dependiente de NF-κB. Esta funcionalidad biológica puede evaluarse realizando los estudios descritos en este documento y conocidos en la técnica. Como se usa aquí, una proteína LIP es una que tiene los aminoácidos de la SEC ID NO: 6 o que tiene una homología de aminoácidos de al menos aproximadamente un 90%, 92%, 95%, 97%, 98% o incluso un 99% con la SEC ID NO: 6 y que tiene funciones de LIP. El grado de homología de la secuencia de aminoácidos entre proteínas puede calcularse usando diversos programas de software de ordenador disponibles en el mercado (por ejemplo, análisis BLAST como se conoce en la técnica) .
En general, los especialistas en la técnica apreciarán que pueden realizarse deleciones o sustituciones minoritarias en las secuencias de aminoácidos de los péptidos y proteínas de la presente invención sin afectar adversamente a la actividad de las mismas. Así pues, las proteínas que contienen tales deleciones o sustituciones son un aspecto adicional de la presente invención. En péptidos que contienen sustituciones o reemplazos de aminoácidos, uno o más aminoácidos de una secuencia pueden reemplazarse por uno o más aminoácidos distintos siempre que tal reemplazo no afecte a la función de la secuencia. Tales cambios pueden guiarse por homologías conocidas entre aminoácidos en características físicas tales como densidad de carga, hidrofobia/hidrofilia, tamaño y configuración, de tal forma que los aminoácidos se sustituyan con otros aminoácidos que tienen esencialmente las mismas propiedades funcionales, como se conoce en la técnica.
La invención también incluye secuencias de nucleótidos que codifican proteínas BLIP y LIP, mutantes y variantes de las mismas, así como secuencias de nucleótidos que son complementarias a las mismas. La secuencia de nucleótidos puede ser ADN o ARN, incluyendo ADN genómico, ADN sintético o ADNc. Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos es una secuencia de ADN y, aún más preferiblemente, una secuencia de ADNc. (La información de la secuencia de nucleótidos se proporciona en la Figura 6 (SEC ID NO: 3); la proteína BLIP de la SEC ID NO: 4 se codifica por los nucleótidos 152 - 7327 de la SEC ID NO: 3) . Las moléculas de nucleótidos pueden aislarse a partir de células humanas o sintetizarse de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica, como se describe a modo de ejemplo en Sambrook, J. y col (1) , cuya descripción se incluye aquí én su totalidad por referencia. Las moléculas de nucleótidos de acuerdo con la invención tienen utilidad en la producción de las proteínas de acuerdo con la invención, que pueden tener lugar in vi tro, in vivo o ex vivo . Las moléculas de nucleótidos pueden implicarse en síntesis de proteínas recombinantes o, de hecho, como agentes terapéuticos por sí mismas, pueden utilizarse en técnicas de terapia génica. En la terapia génica también pueden usarse nucleótidos complementarios a los que codifican proteínas BLIP o secuencias antisentido, tales como en estrategias para la regulación negativa de la expresión de las proteínas de la invención.
Como se usa en este documento, las moléculas de ADN que codifican una proteína BLIP pretenden incluir variaciones alélicas naturales de las moléculas de ADN. Las condiciones de hibridación que permiten que otras secuencias de 7ADN que codifican para una proteína BLIP hibriden con una secuencia de ADN como la proporcionada aquí (por ejemplo, SEC ID NO: 3), en general son condiciones muy rigurosas. Por ejemplo, la hibridación de tales secuencias puede realizarse bajo condiciones representadas por una rigurosidad de lavado de NaCl 0 , 3 M, citrato sódico 0,03 M, SDS al 0,1% a 60°C o incluso a 70°C, en un ensayo de hibridación convencional in situ. Véase, J. Sambrook y col., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2a Ed. 1989) (Cold Spring Harbor Laboratory) ) . En general, las secuencias de ADN que codifican para una proteína BLIP e hibridan con una secuencia de ADN de la SEC ID NO: 3 descrita aquí, tendrán una homología de secuencia de nucleótidos de al menos un 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92% o incluso del 95% con la SEC ID NO: 3, y codificarán una proteína con funciones de BLIP. La homología de las secuencias puede determinarse usando programas de software de ordenador disponibles en el mercado (por ejemplo, el análisis BLAST como se conoce en la técnica) . El ADN aislado de la presente invención puede ser de cualquier especie de origen, incluyendo ratón, rata, conejo, gato, cerdo y ser humano, pero preferiblemente es de origen mamífero y más preferiblemente de origen humano.
Como se usa en este documento, se entiende que una molécula de ADN que codifica una proteína LIP incluye variaciones alélicas naturales en las moléculas de ADN. Las condiciones de hibridación que permiten que otras secuencias de ADN que codifican para una proteína LIP hibriden con una secuencia de ADN como la proporcionada aquí (por ejemplo, la SEC ID NO: 7), son en general condiciones muy rigurosas. Por ejemplo, la hibridación de tales secuencias puede realizarse bajo condiciones representadas por una rigurosidad de lavado de NaCl 0,3 M, citrato sódico 0,03 M, SDS 0,1% a 60°C o incluso a 70 °C en un ensayo de hibridación convencional in situ. Véase, J. Sambrook y col., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2a Ed. 1989) (Cold Spring Harbor Laboratory)) . En general, las secuencias de ADN que codifican para una proteína LIP e hibridan con una secuencia de ADN de la SEC ID NO : 3 descrita aquí tendrán al menos una homología de secuencia de nucleótidos de al menos un 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92% o incluso del 95% con la SEC ID NO: 3, y codificarán una proteína con funciones de LIP. La homología de secuencia puede determinarse usando programas de software de ordenador disponibles en el mercado (por ejemplo, análisis BLAST como se conoce en la técnica) . El ADN aislado de la presente invención puede ser de cualquier especie de origen, incluyendo ratón, rata, conejo, gato, cerdo y humano, pero preferiblemente es de origen mamífero y más preferiblemente de origen humano.
Además, las moléculas de oligonucleótido que codifican para proteínas BLIP o LIP (o mutantes o variantes de las mismas) pero que difirieren en la secuencia de los codones de las moléculas de ADN anteriores debido a la degeneración del código genético, también son un aspecto de esta invención. La degeneración del código genético, que permite que diferentes secuencias de ácido nucleico codifiquen para la misma proteína o péptido, es bien conocida en la técnica. Las moléculas de oligonucleótido que codifican para la misma proteína BLIP que la codificada por las secuencias anteriores, pero que difiriere de éstas en la secuencia de codones debido a mutagénesis de localización dirigida, son otro aspecto de esta invención. En la técnica se conocen las técnicas de mutagénesis de localización dirigida.
La presente invención también incluye vectores de expresión que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican las presentes proteínas, mutantes o variantes de las mismas. Tales vectores de expresión se construyen rutinariamente en la técnica de la biología molecular y pueden implicar, por ejemplo, el uso de ADN plasmídico y de iniciadores apropiados, promotores, inductores y otros elementos, tales como, por ejemplo, señales de poliadenilación que pueden ser necesarias y que se colocan en la orientación correcta para permitir la expresión de las proteínas. Para las personas especialistas en la técnica serán evidentes los vectores adecuados. A modo de ejemplo adicional a este respecto, se hará referencia a Sambrook y col. (1), cuya descripción se incluye aquí en su totalidad.
Pueden usarse vectores para amplificar el ADN que codifica una proteína deseada y/o para expresar un ADN que codifica una proteína deseada. La secuencia de ADN que codifica la proteína deseada se une operativamente a secuencias de control adecuadas capaces de realizar la expresión de la proteína en un hospedador adecuado. Las regiones de ADN se unen operativamente o se asocian operativamente cuando están relacionadas funcionalmente entre sí. Por ejemplo, un promotor se une operativamente a una secuencia codificante si controla la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosomas se une operativamente a una secuencia codificante si está situado de forma que permita la traducción. La necesidad de tales secuencias de control variará dependiendo del hospedador seleccionado y del procedimiento de transformación elegido. Los vectores pueden incluir plásmidos, virus (por ejemplo, adenovirus, citomegalovirus) , fagos y fragmentos de ADN integrables (es decir, fragmentos integrables en el genoma del hospedador por recombinación) .
La invención también incluye líneas de células que se han modificado o transfectado para expresar las proteínas de la presente invención. Tales líneas de células incluyen líneas de células eucariotas superiores, transitorias o preferiblemente estables (tales como células de mamífero o células de insectos) , células eucariotas inferiores (tales como levaduras) o células procariotas (tales como células bacterianas) . También es posible que las proteínas de la invención se expresen transitoriamente en una línea de células, tal como, por ejemplo, en un sistema de expresión de baculovirus .
De acuerdo con otro aspecto, la presente invención también se refiere a anticuerpos (anticuerpos policlonales o preferiblemente monoclonales) que se unen específicamente a las proteínas de la presente invención, (es decir, anticuerpos que se unen a un solo sitio antigénico o epítopo de las proteínas) . Tales anticuerpos son preferiblemente de origen monoclonal . Los anticuerpos son preferiblemente anticuerpos IgG de cualquier especie adecuada, tal como rata, conejo o caballo, pero generalmente son de origen mamífero. Se entiende que los fragmentos de anticuerpos IgG que retienen la capacidad de unirse específicamente a las proteínas de la presente invención, tales como fragmentos F(ab')2, F(ab') y Fab, se incluyen por el término "anticuerpo" de este documento. Véase, en general, E. Harlow y D. Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual (1988) (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press) . Los anticuerpos pueden ser quiméricos, como se describe por M. alker y col., Molecular Immunol . 26, 403 (1989) . Los anticuerpos que se unen a proteínas BLIP, pero no a proteínas LIP más cortas, son particularmente preferidos.
Tales anticuerpos son útiles en la purificación, aislamiento o selección que implican técnicas de inmunoprecipitación, y pueden usarse como herramientas para averiguar adicionalmente la función de la proteína
BLIP, o como agentes terapéuticos por sí mismos.
Los oligodesoxinucleótidos de ácidos nucleicos complementarios y capaces de hibridar con la cadena con sentido de un gen, o con un ARNm transcrito a partir de ese gen, son oligodesoxinucleótidos antisentido. Cuando la cadena con sentido de un gen diana, o un ARNm, se expone a sus oligodesoxinucleótidos antisentido, se producirá la interacción de los dos, de tal forma que se bloqueará la transcripción del gen o se bloqueará la traducción del ARNm. La presente invención incluye oligómeros capaces de hibridar con una porción de un gen (o de un ARNm) que codifica la proteína BLIP o LIP. Cuando tal oligómero híbrida con la molécula diana, la producción de la proteína se impedirá o se reducirá sustancialmente (en comparación con la que se produciría en ausencia del oligonucleótido antisentido) . La prevención sustancial significa que la proteína no se produce o se produce a niveles que no son funcionales .
Los oligonucleótidos antisentido (y los ácidos nucleicos que expresan tales moléculas antisentido) pueden obtenerse de acuerdo con técnicas convencionales. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos No. 5.023.243 de Tullís; y la Patente de Estados Unidos No. 5.149.797 de Pederson y col. La longitud del oligonucleótido antisentido (es decir, el número de nucleótidos que tiene) no es crítica siempre que se una selectivamente a la localización deseada; esto puede determinarse de acuerdo con procedimientos rutinarios. En general, el oligonucleótido antisentido tendrá una longitud desde 8, 10 ó 12 nucleótidos hasta 20, 30 ó 50 nucleótidos. Tales oligonucleótidos antisentido pueden ser oligonucleótidos en los que al menos uno o todos los restos de fosfato de unión entre nucleótidos son fosfatos modificados, tales como metil fosfonatos, metil fosfonotioatos, fosforomorfolidatos , fosforopiperazidatos y fosforamidatos . Por ejemplo, cada uno de los restos fosfato de unión entre nucleótidos puede estar modificado como se ha descrito. En otro ejemplo no limitante, tales oligonucleótidos antisentido son oligonucleótidos en los que al menos uno o todos los nucleótidos contienen un radical alquilo inferior 2 '
(por ejemplo, alquilo ^- , lineal o ramificado, saturado o insaturado, tal como metilo, etilo, etenilo, propilo, 1-propenilo, 2-propenilo e isopropilo) . Por ejemplo, pueden estar modificados un oligonucleótido si y otro no como se ha descrito. Véase también P. Furdon y col., Nucleic Acids Res. 17, 9193-9204 (1989); S.
Agrawal y col., Proc . Nati. Acad. Sci . USA 87, 1401-1405
(1990); C. Baker y col., Nucleic Acids Res. 18, 3537- 3543 (1990); B. Sproat y col., Nucleic Acids Res. 17, 3373-3386 (1989); R. alder and J. Walder, Proc . Nati. Acad. Sci. USA 85, 5011-5015 (1988).
Otro aspecto de la presente invención se refiere a procedimientos de selección diseñados para identificar compuestos que modulan la activación por BLIP de λ/iPKC, o que modulan la activación de NF-κB. Por el término "modulación" se entiende que habrá un aumento o una reducción de la activación de NF-κB en presencia del compuesto (en comparación con la que se observaría en ausencia del compuesto) ; tal actividad generalmente se producirá por la unión de un ligando del compuesto a BLIP, λ/iPKC, el tándem de BLIP y λ/tPKC, o al propio NF- KB.
En términos generales, tales procedimientos de selección implican administrar un compuesto de ensayo a una célula y detectar la activación relacionada con BLIP de NF-κB, en comparación con una célula de control en la que está ausente el compuesto de ensayo (o la proteína BLIP funcional) . La activación de NF-κB puede evaluarse usando un gen mensajero dependiente de KB (tal como el gen de la luciferasa) , o midiendo la translocación de NF-κB al núcleo celular (usando procedimientos que son conocidos en la técnica, por ejemplo, el uso de anticuerpos anti-Rel65 para detectar el NF-κB nuclear) . Tales procedimientos de selección pueden comprender además la detección de si dicho compuesto de ensayo se une a λ/tPKC (o a BLIP, o a NF-κB) , por ejemplo, preparando extractos celulares e inmunoprecipitando la proteína de interés, y realizando una inmunotransferencia usando un anticuerpo dirigido al compuesto de ensayo.
La capacidad de los compuestos de modular la actividad de autofosforilación de BLIP también puede usarse como un procedimiento para seleccionar compuestos con respecto a la activación de NF-κB o efectos inhibidores. En términos generales, tales procedimientos de selección implican la administración de un compuesto de ensayo a una célula y la detección de la autofosforilación de BLIP, en comparación con una célula de control en la que está ausente el compuesto de ensayo.
La presente invención también incluye dentro de su alcance los compuestos que se identifican como compuestos que poseen una actividad de modulación de NFKB útil, por los procedimientos de selección mencionados anteriormente .
Otro aspecto de la presente invención es el uso de compuestos que inhiben o aumentan la activación de NF-κB (incluyendo los compuestos identificados por las técnicas de selección mencionadas anteriormente) , en el tratamiento o profilaxis de trastornos que responden a la modulación de la actividad BLIP o la modulación de la actividad NF-κB, en un paciente mamífero (preferiblemente un ser humano) .
Así pues, la presente invención proporciona un procedimiento para inhibir (o aumentar) la activación de NF-κB en una célula, proporcionando a la célula un compuesto que inhibe (o aumenta) la activación de NF-κB dependiente de BLIP. Un ejemplo de tal compuesto inhibidor es un mutante de BLIP sin actividad quinasa
(por ejemplo, una proteína de la SEC ID NO: 5) , o un nucleótido antisentido como se ha descrito anteriormente, donde el compuesto inhibidor se proporciona en una cantidad eficaz como para reducir la activación de NF-κB dependiente de BLIP endógena en la célula (en comparación con la activación de NF-κB que se produciría en la célula en ausencia del compuesto inhibidor) . Los compuestos que aumentan la activación de NF-κB se proporcionan en una cantidad eficaz para aumentar la activación de NF-κB dependiente de BLIP endógena en la célula (en comparación con la activación de NF-κB que se produciría en la célula en ausencia del compuesto) . La etapa de proporción puede realizarse por cualquier medio adecuado, tal como mediante la liberación del compuesto inhibidor dentro de la célula o mediante la liberación dentro de la célula de un ácido nucleico que codifica y expresa el compuesto inhibidor. Los compuestos que inhiben la activación relacionada con BLIP de NF-κB tendrán efectos terapéuticos beneficiosos en patologías en las que tal activación está regulada positivamente. En muchas células del sistema inmune, el NF-κB se activa en respuesta a diversas señales patógenas, e induce la transcripción de una diversidad de genes que codifican proteínas inmunológicamente relevantes. Baeuerle y Henkel, Aπnu Rev. Immunol . 12:141 (1994). La interferencia con la activación o actividad de NF-κB puede suprimir reacciones inmunológicas, incluyendo las vistas en el choque tóxico/séptico, en reacciones del hospedador frente a injertos, en reacciones inflamatorias agudas y en lesiones producidas por radiación. En células cancerosas o neoplásicas, tanto la quimioterapia como la terapia con radiación pueden activar el NF-κB que, a su vez, reduce los efectos apoptóticos de la terapia. Se ha informado que la inhibición de la activación de NF-κB en tumores aumenta el potencial apoptótico de los tratamientos del cáncer. ang y col., Nature Medicine 5:412 (1999) .
Por consiguiente, la activación de NF-κB mediada por BLIP está implicada en enfermedades inmunológicas y neoplásicas. Por lo tanto, la inhibición de la activación de NF-κB mediada por BLIP proporcionará una ventaja terapéutica positiva cuando se desee una supresión inmune o cuando se deseen efectos antineoplásicos . En particular, tales compuestos inhibidores tendrán utilidad para el tratamiento y/o profilaxis de trastornos tales como el choque tóxico/séptico, reacciones del hospedador frente a injertos, reacciones inflamatorias agudas y lesiones producidas por radiación. Tales compuestos además tendrán utilidad como agentes antineoplásicos en el tratamiento de tumores o cánceres y como adyuvantes en la quimioterapia o terapia de radiación de crecimientos neoplásicos. Por ejemplo, la liberación adenoviral en células cancerígenas de un mutante sin actividad quinasa de BLIP (u otro inhibidor de la activación de NF-κB dependiente de BLIP) será útil como adyuvante en la quimioterapia de cánceres, para aumentar los efectos apoptóticos de las quimioterapias.
Los compuestos que aumentan o inducen la activación relacionada con BLIP de NF-κB tendrán efectos terapéuticos beneficiosos en patologías en las que tal activación está reducida, o cuando se desee regular positivamente la activación de NF-κB. Tales compuestos son útiles como inmunoestimuladores y como inhibidores de la muerte celular.
Los compuestos moduladores de NF-KB, incluyendo los identificados de acuerdo con los procedimientos de selección indicados anteriormente, pueden formularse con vehículos y/o excipientes farmacéuticamente aceptables convencionales como es rutinario en la técnica farmacéutica y como se describe adicionalmente en Remmington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Eastern Pennsylvania, 17a Ed, 1985, cuya descripción se incluye aquí en su totalidad por referencia . Los compuestos pueden administrarse mediante rutas entéricas o parenterales tales como por vía oral, bucal, anal, pulmonar, intravenosa, intraarterial , intramuscular, intraperitoneal, tópica u otras rutas de administración apropiadas.
La presente invención se describirá a continuación a modo de ejemplo en la sección experimental adjunta.
Ejemplo 1 Materiales y Métodos
Reactivos y Cultivos de Células: el TNFα humano recombinante se adquirió de Promega; el anticuerpo monoclonal 12CA5 anti-Hemaglutinina (anti-HA) de Boehringer; el anticuerpo monoclonal contra λPKC de Transduction Laboratories; el anticuerpo policlonal de cabra anti-p65 (NF-κB) de Santa Cruz Biotechnologies, Inc. El anti-LIP purificado por afinidad de conejo ya se ha descrito (Díaz-Meco y col., 1996). Las células HEK293 y HeLa humanas se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC) . Los cultivos de células HEK293 se mantuvieron en medio de Eagle Modificado de Dulbecco con alto contenido de glucosa, que contenía un 10% de suero de ternero fetal, penicilina G (100 μg/ml) y estreptomicina (100 μg/ml) (Flow) . Las células Hela se mantuvieron en medio esencial mínimo de Eagle suplementado con aminoácidos no esenciales 0,1 mM, piruvato sódico 1,0 mM y un 10% de suero de ternero fetal. Las células subconfluentes se transfectaron por el procedimiento de fosfato calcico (Clontech Laboratories, Inc.).
Plásmidos : Para clonar el ADNc para la secuencia codificante de BLIP, se usó un ADNc de cerebro humano Marathón Ready (Clontech Laboratories, Inc.) siguiendo los procedimientos del fabricante. Este ADNc se subclonó en el sitio Notl del vector pCDNA3-HA para obtener la construcción pCDNA3-HA-BLIP . pCDNA3 -HA-BLIT^ (D1066A; N1071K) se obtuvo por mutagénesis de localización dirigida (Quick Change, Stratagene) . pCDNA3-HA-λ/ιPKC y pCDNA3-HA-λ/ιPKCMUT se han descrito previamente (Díaz- Meco y col . , 1996) .
Inmunoprecipitaciones : Para las inmunoprecipitaciones de proteínas endógenas, se usaron células HEKI293. Algunas células se estimularon con 30 ng/ml de YNF-α. Las células después se recogieron y lisaron en tampón PD [Tris-HCl 40 mM (pH 8,0), NaCl 500 mM, Nonidet P-40 al 0,1%, EDTA 6 mM, EGTA 6 mM, β-glicerofosfato 10 mM, NaF 10 mM, PNPP 10 mM, Na3V04 300 μM, benzamidina 1 mM, PMSF 2 M, 10 μg/ml de aprotinina, 1 μg/ml de leupeptina, 1 μg/ml de pepstatina, DTT 1 mM] y 1 mg de usado de células enteras se diluyó en tampón PD y se incubó con 10 μg del anticuerpo monoclonal anti-λ/iPKC. Esta mezcla de reacción se incubó en hielo durante 2 horas y después se añadieron 25 μl de proteína A o perlas G y la mezcla se dejó incubar con rotación suave durante 1 hora más a 41°C. Después los inmunoprecipitados se lavaron tres veces con tampón PD. Las muestras se fraccionaron en SDS-PAGE al 8%, se transfirieron a membrana ECL de nitrocelulosa (Amersham) y se sometieron a un análisis de transferencia de Western con anti-LIP . Las proteínas se detectaron con el reactivo ECL (Amersham) .
Ensayos del Mensajero de Luciferasa: Cultivos subconfluentes de células HEK293 se transfectaron con diferentes cantidades del plásmido pCDNA3-HA-BLIP o pCDNA3-HA-BLIPMUT, junto con el plásmido mensajero KB- Luc, con o sin vectores de expresión para el tipo silvestre y λ/tPKC dominante negativo (pCDNA3-HA-λ/ιPKC y pCDNA3-HA-λ/ιPKCMUT) . Después de 24 horas, las células se estimularon con TNF-α durante 4 horas. Se prepararon extractos y se determinó la actividad luciferasa como se describe (Díaz-Meco y col., 1996).
Iπiminofluorescencia: Las células HeLa se desarrollaron en cubreobjetos de vidrio en medio de crecimiento. Las células subconfluentes se transfectaron con 5 μg de HA- BLIPMUT. Veinte horas después de la transfección, las células se estimularon con TNF-α (30 ng/ml) durante 20 minutos . Las células se lavaron rápidamente dos veces en PBS enfriado con hielo y se fijaron en formaldehído al 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron 4 veces con PBS y se permeabilizaron con Tritón X-100 al 0,1%. Los grupos aldehido libres se inactivaron con NH4C1 50 mM. La actividad peroxidasa endógena se inactivo mediante tratamiento con un 1% de H202 en PBS durante 15 minutos. Las células fijadas se bloquearon en solución bloqueante. Las células se incubaron con diferentes anticuerpos durante 1 hora a 37 °C. La proteína marcada con HA transfectada se visualizó con el anticuerpo monoclonal 12CA5 anti-HA (Boehringer Mannheim) y un anticuerpo anti-ratón conjugado con FITC (Cappel) , y la p65 endógena con un anticuerpo policlonal de cabra (Santa Cruz Biotech) , y el sistema de amplificación de tetrametil-rodamina tiramida TSA-Direct (NEN Life Science Products) . Los cubreobjetos de vidrio se montaron en un Mowiol y se examinaron con un sistema confocal MRC 1024 Bio-Rad (Bio-Rad Richmond, CA) montado en un microscopio Zeiss Axiovert 135 (Zeiss, Oberkochen, Alemania) .
Ejemplo 2
Detección de BLIP
En el transcurso de una serie de análisis de inmunotransferencia para determinar la expresión de LIP en diferentes órganos y tejidos murinos, los presentes inventores observaron que LIP se expresaba en tejidos de testículo y cardíacos, pero no en otros tejidos investigados (hígado, ovarios, bazo, timo, cerebro, pulmón y riñon) . Sin embargo, inesperadamente se detectó una banda que reaccionaba con el anticuerpo LIP y que tenía un peso molecular mayor de 200 kDa (resultados no mostrados) .
Después se determinó la expresión de LIP y de la banda recién identificada en dos líneas de células humanas diferentes usadas rutinariamente en el laboratorio (células HEK293 y células HeLa) . Se observó que las dos bandas eran detectables en las dos líneas celulares, aunque la proporción variaba, siendo la proteína de alto peso molecular más abundante en células HEK293 que en células HeLa (resultados no mostrados) .
Ejemplo 3
Unión de BLIP a λ/iPKC Los presentes inventores evaluaron si BLIP se podía unir a λ/iPKC in vivo. Usando células HEK293, las células se dejaron sin tratar (control) o se estimularon con TNFα durante diversos tiempos, después de lo cual se prepararon extractos celulares, se in unoprecipitaron con un anticuerpo anti-λ/iPKC selectivo y se analizaron por inmunotransferencia con el anticuerpo anti-LIP
(resultados no mostrados) . Bajo condiciones de reposo, hubo una asociación pequeña o nula de BLIP (o LIP; tampoco mostrada) con λ/iPKC. Sin embargo, tras la estimulación con TNFα, hubo una interacción rápida y sostenida de BLIP con λ/iPKC. Esto indica que BLIP presenta una asociación inducida por estímulos con Ej emplo 4
LIP Inhibe la Transcripción Dependiente de NF-κB
Para determinar el efecto de la sobreexpresión de LIP (SEC ID NO: 6) sobre la activación de NF-κB, se transfectaron células HEK293 con un gen mensajero dependiente de KB (luciferasa) junto con concentraciones crecientes de un plásmido de expresión para LIP (0,2, 0,5, 1,0 y 2,0 μg/pocillo de 60 mm de diámetro). Veinte horas después de la transfección, las células se dejaron sin tratar o se estimularon con 30 ng/ml de TNFα. Los resultados (media ± SD de tres experimentos independiente con incubación por duplicado; Figura 1) demuestran que la expresión de LIP reduce la actividad mensajera dependiente de KB inducida por TNFα.
Ejemplo 5 Clonación de BLIP
Los presentes inventores después clonaron y caracterizaron moleculármente la proteína BLIP humana.
El clon BLIP (SEC ID NO: 3) expandió la secuencia de LIP presentada previamente por Diaz-Meco y col., (1996). Se descubrió que BLIP era una proteína de 2392 aminoácidos
(Fig. 2A, SEC ID NO: 4) con un peso molecular previsto de 269 kDa. La región que abarca los aminoácidos 881-
1209 de BLIP presenta un alto grado de homología con los dominios PI 3 -quinasa de FRAP y ATM (Figs. 3A y 3B) . La alineación de los dominios semejantes a PI 3 -quinasa de
BLIP, FRAP y ATM indica que BLIP tiene actividad quinasa, ya que los motivos DXXXXN y DFG que constituyen restos críticos del sitio catalítico conservado en todos los miembros de la familia ATM con actividad quinasa, también se conservan en BLIP. A diferencia de FRAP y ATM, sin embargo, la región quinasa de BLIP no está localizada en la parte más cercana al extremo C-terminal de la molécula, sino aproximadamente en el medio (Fig. 2B) . La porción C-terminal de BLIP es la secuencia correspondiente a LIP. Por lo tanto, LIP constituye un dominio de BLIP (Fig. 2B) , lo que revela una organización de dominios que difiere de otras PI 3- quinasas . Cadena arriba del dominio PI 3 -quinasa de FRAP hay una serie de módulos de interacción de proteína- proteína denominados dominios HEAT (Dennis y col . , 1999) . Tales dominios (u otras regiones a través de las cuales se podrían predecir interacciones con otras proteínas) están ausentes en la molécula BLIP, con la excepción de la región LIP por la que interacciona λ/iPKC (Dennis y col., 1999). Otra característica de FRAP que está ausente en LIP es el dominio FRB; este dominio es la región responsable de la interacción de FRAP con el complejo FKB/rapamicina (Dennis y col., 1999) . Esto sugiere que BLIP es insensible a rapamicina.
Ejemplo 6
Dominio Quinasa de BLIP
Para investigar si el dominio quinasa de tipo FRAP/ATM de BLIP juega un papel en la activación de NFKB, se transfectaron células HEK293 con un gen mensajero dependiente de KB junto con concentraciones crecientes
(0,2, 0,5, 1,0 y 2,0 μg/pocillo de 60 mm de diámetro) de plásmidos de expresión para BLIP (de tipo silvestre (SEC
ID NO: 4) o un mutante quinasa-inactivo (SEC ID NO:5)) . Como control positivo, las células también se transfectaron con un vector de expresión RIP (Proteína de Interacción con el Receptor) (RIP es un activador potente de NF-κB) . Los resultados (Figura 4A) indican que la expresión de BLIP de tipo silvestre (pero no de BLIP mutante) es suficiente como para activar la actividad del mensajero dependiente de KB en un grado comparable al de RIP.
Ejemplo 7 Activación de NF-κB relacionada con BLIP y λ/iPKC
Para determinar si el efecto de la activación de NF-KB de BLIP es dependiente de λ/iPKC, se transfectaron células HEK293 con un plásmido mensajero de luciferasa dependiente de KB y uno de los siguientes: un vector de control negativo, un plásmido de expresión para λ/iPKC de tipo silvestre o un plásmido de expresión para ?*./ιPKC quinasa-inactivo. Después de 24 horas se evaluó la actividad luciferasa en las células sin BLIP (control) y con concentraciones crecientes (0,5, 1,0, 2,0 μg/diámetro de 60 mm) de BLIP de tipo silvestre (BLIP) . Los resultados se muestran en la Figura 4B. La coexpresión de λ/tPKC de tipo silvestre coopera con BLIP para activar NF-κB, mientras que la expresión del mutante λ/iPKC quinasa-inactivo abroga este efecto de BLIP.
Ejemplo 8 Translocación de RelA al Núcleo Celular
Para demostrar adicionalmente que BLIP controla la translocación real de RelA al núcleo, se transfectaron células HeLa con el vector de expresión mutante de BLIP marcado con HA (BLIP"1") ,- como células de control se usaron células HeLa no transfectadas . Veinticuatro horas después de la transfección, las células se estimularon con TNFα durante 20 minutos o se dejaron sin tratar (control) . Las células después se analizaron mediante inmunofluorescencia doble usando un anticuerpo anti p65 (RelA) y un anticuerpo anti HA para detectar las células que expresaban la construcción (datos no mostrados) . El análisis de las células indica que más de un 80% de las células transfectadas con el mutante BLIP de tipo silvestre tenían una translocación inducida por TNFα de p65, en comparación con aproximadamente el 20% de las células transfectadas con el mutante BLIP (Figura 5) .
Ejemplo 9 Procedimientos de Selección Usando una línea de células de mamífero apropiada
(tal como células HEK293 o células HeLa) , se administra un compuesto de ensayo a las células de ensayo; no se administra compuesto de ensayo a las células de control.
Después, las células se estimulan con TNFα durante diversos tiempos, después de lo cual se preparan los extractos celulares, se inmunoprecipitan con un anticuerpo anti-λ/iPKC selectivo y se analizan mediante inmunotransferencia con el anticuerpo anti -BLIP. Un aumento en la asociación de BLIP con λ/iPKC en las células de ensayo (en comparación con la asociación encontrada en las células de control) indica que el compuesto de ensayo aumenta la activación de λ/iPKC dependiente de BLIP (y, por lo tanto, la activación de NF-κB) ,- una reducción indica que el compuesto de ensayo inhibe la activación de λ/tPKC dependiente de BLIP (y, por lo tanto, la activación de NF-κB) .
Alternativamente, las células pueden transfectarse con un gen mensajero dependiente de KB, tal como luciferasa, y la actividad del gen mensajero puede evaluarse como una medida de la activación de NF-κB en presencia de un compuesto de ensayo, en comparación con las células de control .
Referencias
1. Sambrook, J. , Fritsch, E.F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nσ Edition. CSH Laboratory Press. (1989)
2. Akimoto, K. , K. Mizuno, S. Osada, S. Hirai, S. Tanuma, K. Suzuki, and S. Ohno. 1994. A new member of the third class in the Protein Kinase C Family, PKC, expressed dominantly in an undifferentiated mouse embryonal carcinoma cell line and also in any tissues and cells. J. Biol . Chem. 269: 12677-12683.
3. Baeuerle, P.A., and T. Henkel. 1994. Function and activation of NF-κB in the immune system. Annu . Rev . Immunol . 12: 141-179.
4. Baldwin, A.S. 1996. The NF-κB and IκB proteins: new discoveries and insights. Annu. Rev. Immunol . 14: 649- 683.
5. Berghe, W.V. , S. Plaisance, E. Boone, K. De Bosscher, M.L. Schmitz, W. Fiers, and G. Haegeman. 1998. p38 and the extracellular signal-regulated kinase mitogen-activated protein kinase pathways are required for nuclear factor-κB p65 transactivation mediated by tumor necrosis factor. J. Biol. Chem. 273: 3285-3290.
6. Berra, E., M.T. Diaz-Meco, J. Lozano, S. Frutos, M.M. Municio, P. Sánchez, L. Sanz, and J. Moscat . 1995. Evidence for a role of MEK and MAPK during signal transduction by protein kinase C ς. EMBO J . 14: 6157- 6163.
7. Bjorkoy, G. , A. Overvatn, M.T. Díaz-Meco, J. Moscat, and T. Johansen. 1995. Evidence for a bifurcation of the mitogenic signaling pathway activated by ras and phosphatidylcholina-hidrolyzing. J. Biol . Chem. 270: 21299-21306.
8. Dennis, PB., S. Fumagalli, and G. Thomas . 1999.
Target of rapamacyn (TOR) : balancing the opposite forces of protein synthesis and degradation. Curr. Opin. Gen. & Devel . 9: 49-54. 9. Diaz-Meco, M.T., E. Berra, M.M. Municio, L. Sanz, J. Lozano, V. Díaz-Golpe, M.T. Lain de Lera, J. Alcamí, C.V. Paya, F. Arenzana-Seisdedos, J.L. Virelizier, and J. Moscat. 1993. A dominant negative protein kinase C ς subspecies blocks NF-κB activation. Mol. Cell. Biol. 13: 4770-4775.
10. Díaz-Meco, M-T. , J. Lozano, M.M. Municio, E. Berra, S. Frutos, L. Sanz, and J. Moscat. 1994. ςPKC
Induces Phosforylation and Inactivation of IκB-α In Vitro. EMBO J. 13: 2842-2848.
11. Díaz-Meco, M.T., J. Lozano, M.M. Municio, E. Berra, S. Frutos, L. Sanz, and J. Moscat. 1994. Evidence for the in vitro interaction of Ras with protein kinase C ς. J. Biol. Chem. 269: 31706-31710.
12. Diaz-Meco, M.T., M.M. Municio, P. Sánchez, J. Lozano, and J. Moscat. 1996. Lambda-interacting protein, a novel protein that specifically interacts with the zinc finger domain of the atypical protein kinase C isotype λ/i and stimulates its kinase activity in vi tro and in vivo. Mol. Cell. Biol. 16: 105-114.
13. DiDonato, J.A. , M. Hayakawa, D.M. Rothwarf, E. Zandi , and M. Karin. 1997. A citokine-responsive IκB kinase that activates the transcription factor NF-κB. Nature 388: 548-554.
14. Domínguez, I., L. Sanz, F. Arenzana-Seisdedos, M.T. Díaz-Meco, J.L. Virelizier, and J. Moscat. 1993. Inhibition of protein kinase ς subspecies blocks the activation of a NF-κB-like activity in Xenopus laevis oocytes. Mol. Cell. Biol. 13:1290-1295.
15. Folgueira, L. , J.A. McElhinny, G.D. Bren, W.S. MacMorran, M.T. Díaz-Meco, J. Moscat, and C.V. Paya. 1996. Protein kinase C-ς mediates NF-κB activation in human immunodeficiency virus-infected monocytes . J. Virol . 70: 223-231. 16. Jung, M. , Y. Zhang. S. Lee and A. Dritschilo. 1995. Correction of radiation sensitivity in ataxia telangiectasia cells by a truncated I kappa B-alpha. Science 268:1619-21.
17. Lallena, M.J., M.T. Diaz-Meco, G. Bren, C.V. Paya, and J. Moscat. 1999. Activation of IκB kinase b by Protein Kinase C Isoforms. Mol. Cell. Biol. 19: 2180- 2188.
18. Lenardo, M. , and D. Baltimore. 1989. NF-κB: a pleitropic mediator of inducible and tissue-specific gene control. Cell 58: 227-229.
19. Liao, D.F., B. Monia, N. Dean, and B.C. Berk. 1997. Protein kinase C-ς mediates angiotensin II activation of ERKl/2 in vascular smooth muscle cells. J. Biol. Chem. 272: 6146-6150.
20. Lozano, J. , E. Berra, M.M. Municio, M.T. Diaz- Meco, I. Domínguez, L. Sanz, and J. Moscat. 1994. Protein kinase C ς isoform is critical for κB-dependent promoter activation by sphingomyelinase . J. Biol. Chem. 269:19200-19202.
21. Malinin, N.L., M.P. Boldin, A.V. Kovalenko, and D. Wallach. 1997. MAP3K-related kinase inolved in NF-κB induction by TNF, CD95 and IL-1. Nature 385:540-544.
22. Mercurio, F., H. Zhu, B.W. Murray, A. Shevchenko, B.L. Bennett, J.W. Li , D.B. Young, M. Barbosa, M. Mann, A. Manning, and A. Rao. 1997. IKK-1 and IKK-2 : cytokine- activated IκB kinases essential for NF-κB activation.
Science 278: 860-866
23. Müller, G. , M. Ayoub, P. Storz, J.Rennecke, D. Fabbro, and K. Pfizenmaier. 1995. PKCς is a molecular switch in signal transduction of TNFα, bifuncionally regulated by ceramide and arachidonic acid. EMBO J . 14: 1961-1969.
24. Murray, N.R. and A.P. Fields. 1997. Atypical protein kinase C iota protects human leukemina cells against drug-induced apoptosis Biol. Chem. 272 27521-27524.
25. Nakanishi, H. , K.A. Brewer, and J.H. Exton. (1993) . Activation of the isozyme of protein kinase C by phosphatidylinositol 3 , 4 , 5-trisphosphate J. Biol. Chem. 268: 13-16.
26. Régimer, C.H., H.Y. Song, X. Gao, D.V. Goeddel, Z. Cao, and M. Rothe . 1997. Identification and characterization of an IκB kinase. Cell 90: 373-383.
27. Romanelli, A. K. A. Martin, A. Toker, and J. Blenis. 1999. P70 S6 kinase is regulated by protein kinase c zeta and participates in a phosphoinositide 3- kinase-regulated signalling complex. Mol . Cell . Biol . 19-2921-8.
28. Rzy kiewicz, D.M., T. Tetsuka, D. Daphna-Iken, S. Srivastava, and A.R. Morrison. 1996. Interleukin-lβ activates protein kinase C ς in renal mesangial cells. J. Biol. Chem. 271: 17241-17246.
29. Schónwasser, D.C., R.M. Marais, C.J. Marshall, and P. J. Parker. 1998. Activation of the mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase pathway by conventional, novel, and atypical protein kinase C isotypes. Mol. Cell. Biol. 18: 790-798.
30. Sontag, E. J.M. Sontag, and A. García. 1997. Protein phosphatasa 2A is a critical regulator of protein kinase C ς signaling targeted by SV40 small t to ptomote cell growth and NF-κB activation. EMBO J. 16: 5662-5671.
31. Stancovski, I., and D. Baltimore. 1997. NF-κB activation: The IκB kinase revealed? Cell 91:299-302.
32. Takeda, H. T. Matozaki, T.. Takada, T. Noguchi , T. Yamao, M. Tsuda, F. Ochi, K. Fukunaga, K. Inagaki, and M. Kasuga. 1999. PI 3 -kinase gamma and protein kinase C- ς medíate RAS-independent activation of MAP kinase by a Gi protein-coupled receptor. EMBO J 18:386-395. 33. Thanos, D. , and T. Maniatis. 1995 NF-KB: a lesson in family valúes. Cell 80: 529-532.
34. Verma, I.M., J.K. Stevenson, E.M. Schwarz, D. VanAntwerp, and S. Miyamoto. 1995. Rel/NF-κB/lκB family: intímate tales of association and dissociation. Genes Dev. 9: 2723-2735.
35. Woronicz, J.D. , X. Gao, Z. Cao, M. Rothe and D.V. Goeddel . 1997. IκB kinase-β: NF-κB activation and complex formation with IκB kinase-α and NIK. Science 278: 866-869. 36. Zandi, E., D.M. Rothwarf, M. Delhase, M. Hayakawa, and M. Karin. 1997. The IκB kinase complex (IKK) contains two kinase subunits, IKKα and IKKβ, necessary for IκB phosphorylation and NF-KB activation. Cell 91: 243-252.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Una proteína BLIP humana aislada o una variante de la misma.
2. Una proteína aislada que tiene una secuencia seleccionada entre:
(a) SEC ID NO: 4; y
(b) secuencias que tienen al menos una homología del 70% con la SEC ID NO:4, y donde la proteína es una proteína
BLIP.
3. Un mutante quinasa inactivo de una proteína BLIP de acuerdo con la reivindicación 2.
4. Un mutante quinasa inactivo de una proteína BLIP que tiene la SEC ID NO: 5.
5. Una proteína aislada que tiene una secuencia seleccionada entre:
(a) SEC ID NO: 6; y
(b) secuencias que tienen una homología de secuencia de al menos aproximadamente un 90% con la SEC ID NO : 6 , y donde la proteína es una proteína LIP.
6. Una molécula de ácido nucleico aislada que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada entre:
(a) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la SEC ID NO: 4; (b) una secuencia de nucleótidos que híbrida con la secuencia de (a) anterior bajo condiciones representadas por una rigurosidad de lavado de NaCl 0,3 M, citrato sódico 0,03 M y SDS al 0,1% a 60 °C, y que codifica una proteína BLIP; y
(c) una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de los puntos (a) - (b) anteriores.
7. Una molécula de nucleótido aislada de acuerdo con la reivindicación 6, que es una secuencia de ADNc .
8. Un ácido nucleico aislado que codifica una proteína BLIP que tiene la secuencia de aminoácidos indicada aquí como SEC ID NO: 4.
9. Una molécula de ácido nucleico aislada que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada entre:
(a) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la SEC ID NO: 6; (b) una secuencia de nucleótidos que híbrida con la secuencia del punto (a) anterior bajo condiciones representadas por una rigurosidad de lavado de NaCl 0,3 M, citrato sódico 0,03 M y SDS al 0,1% a 60°C, y que codifica una proteína LIP con una homología de secuencia de al menos aproximadamente un 90% con la SEC ID NO: 6 ;
Y
(c) una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de los puntos (a) - (b) anteriores.
10. Un ácido nucleico aislado que codifica una proteína LIP que tiene la secuencia de aminoácidos indicada en este documento como SEC ID NO: 6.
11. Una construcción de ácido nucleico que tiene un promotor y un ácido nucleico heterólogo unido operativamente a dicho promotor, donde dicho ácido nucleico heterólogo es un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6-10.
12. Una célula que contiene una construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 11.
13. Una célula que contiene una construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 11, y capaz de expresar la proteína codificada.
14. Un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, que es capaz de expresar la proteína codificada.
15. Una línea de células de acuerdo con la reivindicación 13, que es una línea de células HEK293 o HeLa modificadas.
16. Un procedimiento para producir una proteína BLIP que comprende introducir en una línea de células apropiada un vector adecuado que comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 6, bajo condiciones adecuadas para obtener la expresión de la secuencia de nucleótidos.
17. Un anticuerpo que se une específicamente a una proteína codificada por una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 6.
18. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 17, que es un anticuerpo monoclonal.
19. Un procedimiento para seleccionar compuestos con respecto a la capacidad de modular la activación de NFKB dependiente de BLIP, que comprende administrar un compuesto de ensayo a una célula de ensayo y detectar cualquier aumento o reducción en la activación de NF-κB dependiente de BLIP en la célula de ensayo, en comparación con una célula de control a la que no se administró el compuesto de ensayo.
20. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 19, en el que dicha detección de la activación de NF-κB dependiente de BLIP utiliza un gen mensajero dependiente de KB.
21. Un compuesto identificado por el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 19.
22. Un procedimiento para inhibir la activación de NFKB en una célula, que comprende administrar a la célula un inhibidor de la activación de NF-κB relacionada con BLIP, en una cantidad eficaz para inhibir la activación de NF-κB en comparación con la activación de NF-κB que se produciría en ausencia de dicho inhibidor.
23. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 22, en el que dicho inhibidor es un mutante de BLIP sin actividad quinasa o una proteína LIP.
24. Un procedimiento de tratamiento o profilaxis de un trastorno que responde a la inhibición de la activación de NF-κB dependiente de BLIP en un sujeto mamífero, que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad eficaz de un compuesto que inhibe la activación de NF-κB dependiente de BLIP.
25. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 24, en el que dicho trastorno se selecciona entre trastornos neoplásicos, inflamatorios e inmunes.
26. El uso de un compuesto que modula la activación de NF-κB dependiente de BLIP en un procedimiento de formulación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de un trastorno que es responsable de la modulación de la activación de NF-κB dependiente de BLIP.
PCT/ES2000/000308 1999-08-06 2000-08-04 Nueva proteina Ceased WO2001011027A1 (es)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP00951548A EP1231264A1 (en) 1999-08-06 2000-08-04 New protein
JP2001515813A JP2003506081A (ja) 1999-08-06 2000-08-04 ＮＦ−κＢ活性化に関与するプロテインキナーゼＣ相互作用性タンパク質
AU64446/00A AU6444600A (en) 1999-08-06 2000-08-04 New protein

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP99500139.3 1999-08-06
EP99500139 1999-08-06

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2001011027A1 true WO2001011027A1 (es) 2001-02-15

Family

ID=8242515

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/ES2000/000308 Ceased WO2001011027A1 (es) 1999-08-06 2000-08-04 Nueva proteina

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP1231264A1 (es)
JP (1) JP2003506081A (es)
AU (1) AU6444600A (es)
WO (1) WO2001011027A1 (es)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2284287T3 (es) 1998-10-16 2007-11-01 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Sistemas adyuvantes y vacunas.
CN103211821A (zh) * 2006-04-22 2013-07-24 霍利斯—伊登医药公司 药物和用途

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BROWNE J. ET AL.: "A mammalian protein targeted by G1-arresting rapamycin-receptor complex", NATURE, vol. 369, 1994, pages 756 - 758, XP002031997 *
LABORATORIO GLAXO WELLCOME-CSIC DE BIOLOGIA MOLECULAR Y CELULAR: "Localization of atypical protein kinase C into lysosome- targeted endosomes through interaction with p62", MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, May 1998 (1998-05-01), pages 3069 - 3080, XP000996166 *
MARIA T. DIAZ-MECO ET AL.: "Lambda-interactin protein, a novel protein that specifically interacts with the zinc finger domain of the atypical protein kinase C isotype 9/7 and stimulates its kinase activity in vitro and vivo", MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, January 1996 (1996-01-01), pages 105 - 114, XP002161203 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU6444600A (en) 2001-03-05
JP2003506081A (ja) 2003-02-18
EP1231264A1 (en) 2002-08-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5698428A (en) Human PAK65
US6864355B1 (en) Inhibition of NF-κB activation by blockade of IKKβ-NEMO interactions at the NEMO binding domain
de Jesús Ibarra-Sánchez et al. The T-cell protein tyrosine phosphatase
US7189802B2 (en) Integrin-linked kinase and its uses
EP1073723B1 (en) Ste20-related protein kinases
US7655780B2 (en) Integrin-linked kinase and its uses
US20050125852A1 (en) Novel kinases
JP2002508937A (ja) Ａｕｒ１および／またはａｕｒ２関連疾患の診断および治療
JP3839103B2 (ja) アポトーシス誘導タンパク質およびそれをコードする遺伝子
EP1088079A2 (en) Nek-related and bub1-related protein kinases
EP1231264A1 (en) New protein
US6451977B1 (en) Fused polypeptides
US6699983B1 (en) Integrin-linked kinase and its uses
WO1998039429A2 (en) Compositions for treatment of disorders involving programmed cell death
US5559019A (en) Protein serine kinase, SRPK1
KR100740342B1 (ko) Ｐｋｃ 델타의 ｈｓｐｂ1 결합부위를 포함하는 암 치료용조성물
US20040019918A1 (en) Human MEKK2 protein and nucleic acid molecules and uses therefor
WO2005025610A1 (en) Use of markk or markk antagonists for the treatment of pathologies characterised by increased or reduced phosphorylation of mark or tau protein
JP2005518198A (ja) Ｐａｋ５関連の組成物及び方法
US20030064496A1 (en) Human MEKK2 protein and nucleic acid molecules and uses therefor
US20130040894A1 (en) Inhibition or activation of serine/threonine ulk3 kinase activity

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CR CU CZ DE DK DM DZ EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NO NZ PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TR TT TZ UA UG US UZ VN YU ZA ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE BF BJ CF CG CI CM GA GN GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2000951548

Country of ref document: EP

REG Reference to national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: 8642

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2000951548

Country of ref document: EP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 2000951548

Country of ref document: EP