WO2001014575A1

WO2001014575A1 - Procede de production de glycosides

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Publication number: WO2001014575A1
Application number: PCT/JP2000/005576
Authority: WO
Inventors: Nozomu Yasutake; Shinsuke Miyoshi; Taiichi Usui; Takeomi Murata; Kazuhide Totani
Original assignee: Showa Sangyo Co Ltd
Current assignee: Showa Sangyo Co Ltd
Priority date: 1999-08-19
Filing date: 2000-08-18
Publication date: 2001-03-01
Anticipated expiration: 2002-02-19
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Description

明細書配糖体の製造方法技術分野

本発明は、ラタトシル配糖体または N ァセチルラクトサミニル配糖体の製造方法に関する。さらに詳しくは、 0 — 1 ， 4ダルコシル結合を切断する活性を有する酵素を用いるラクトシル配糖体または N ァセチルラクトサミ二ル配糖体の製造方法に関する。背景技術

糖質および複合糖質（糖蛋白質、糖脂質、配糖体など）は、生物細胞、体液、果実、種子など動，植物に存在し、細胞膜表面における生体情報の伝達、細胞の形態形成、蛋白質との共有結合による高次構造の維持など、遺伝子や蛋白質と同様に生体機能の維持 ·調節に不可欠な機能を担っていることが明らかにされてきている。

複合糖質である糖脂質は、スフインゴ糖脂質、グリセ口糖脂質などに分類される。スフインゴ糖脂質は、大部分が動物組織に存在し、その基本糖鎖の構造によってグロボ系、ラクト系、ガンダリオ系、ガラ系のおおよそ 4つの系列に大別される。このうち、グロボ系、ラクト系、ガンダリオ系の 3つは、ラクトース構造を有し、セラミドにラクト一スが結合したラクトシルセラミ 'ドを基本骨格としており、つぎに付加される糖質によって分類されている。

このラクトシルセラミドは、 Gal 1 4 Glcュニット、すなわちラタトースユニットを有しているが、細菌が複合糖質の配列を認識する際、このラクトースュニットを認識することが知られるようになり、微生物が宿主細胞に糖鎖を介して接着するというメカニズムは、細胞と細胞の認識作用のモデルとして重要な役割を示している。さらに、細菌は細胞表面にある糖鎖の末端部分だけを認識して結合するだけではなく、糖鎖内部にある糖鎖構造を認識することがわかってきた。例：大腸菌、シユードモナス属菌、放線菌、プロピオン酸菌は糖鎖の内部にあるラクト一ス構造も認識することが知られている。

このように、このラクトシルセラミドは、細胞の接着などの生理学的に重要な機能を担っている。従って、ラクトシル配糖体は、医療、食品などの用途に利用できるが、その製造が容易ではないのが実状である。

複合糖質である配糖体にも多くの種類がある。例えば、グリセロールをァグリコンとするグルコース、ガラクト一ス、 N—ァセチルラクトサミンの配糖体が知られてる。グルコースの配糖体としては、グリセリルダルコシド ~0- -D-Glucosylglycerol , (2R) - 1 - 0 - a _D- Glucosylglycerol、およぴ (2S) -1-0- a -D-Glucosylglycerol) などの天然物質が知られている。ガラクトースの配糖体としては、化学合成物質として、グリセリルガラクトシド ( 1-0- β -D-Galactosyl glycerol ) が知られている。また、 N—ァセチルラクトサミ二ル配糖体としては、 (0- /3 -D-Galactopyranosyl- (1→3) - 0 - β -D- 2-Acetylaraino-2-deoxy l-Glucopyranosyl- ( l -→2)一 Glycerin) の存在力 ^幸艮告されている。

上記の配糖体のうち、グリセリルグルコシド、グリセリルガラクトシドなどは味質や保湿性、生理機能に特徴を有する物質である。また、これらの物質はグリセ口糖脂質の合成原料としても有用である。グリセ口糖脂質は微生物から高等植物に至るまで広く生体に存在し、乳化安定性や発ガンプロモ一タ一抑制効果などが報告されている。従って、異なる構造の糖がグリセ口一ルに付加した化合物は新たな機能や新たなグリセ口糖脂質の原料としての応用が期待できる。

また、 N—ァセチルラクトサミニル配糖体は、ブドウ状球菌が認識するレセプター、あるいはインフルエンザウイルス Aおよび B、センダイウィルス、ニューカッスル病ウィルスなどが認識する糖鎖構造のコァ部分に存在することが知られており、細胞の認識に関与するので、医療用途に有用であるが、その製造が容易ではないのが実状である。

このような糖関連物質の機能に注目し、その機能をさらに向上させ、あるいはその生理機能を改変して、医療、食品などの用途に利用すべく、糖鎖および複合糖質の修飾 ·置換研究（リモデリング）が行われている。

糖質および複合糖質の糖鎖のリモデリングの方法には、化学的な方法と酵素的な方法、および双方を組み合わせた方法がある。

化学的な方法として有機合成法による糖鎖合成があるが、この方法は操作が煩雑である上、副生産物の除去（目的物質の精製）工程が必要となる。さらに、人体に有害な試薬を用いることが多く、廃液による周辺環境への影響が危惧されるという問題点がある。

他方、糖鎖を酵素的にリモデリングする方法としては、転移酵素またはェキソダルコシダ一ゼを用レ、る方法、エンドダルコシダ一ゼを用レ、る方法などが知られている。

転移酵素またはェキソダルコシダーゼを用いる方法として、 D. H. ジョジアツセ（D. H. Joziasse) ら Eur. J, Biochem.、第 1 9 1卷、第 7 5〜 8 3頁（1 9 9 0 ) には、ェキソダルコシダーゼまたはダルコシルトランスフェラーゼを用いて、糖鎖の非還元末端にダルコシル基を逐次添加していく方法が記載されている。

しかし、ェキソダルコシダーゼまたはダルコシルトランスフェラーゼを用レ、た糖鎖合成は、化学的合成に比べると容易であるが、それでも糖残基一つ一つについてその酵素反応を逐次的に行う必要があるので、多数の反応ステップを行う必要があり、煩雑であるという問題がある。

エンドダルコシダ一ゼを用いる糖転移反応として、 R . B . トリムブル (R. B. Trimble) ら J. Biol. Chem.、第 26 1卷、第 1 2000〜 1 20 05頁（1 986) には、ブラボバクテリゥム .メニンゴセプチカム（Flav obacteriura meningosepticum) 由来のェンドー β— Ν—ァセチノレグノレコサミニダーゼを用いる方法が記載されている。 R. Μ. バーデ一ルス（R. M. Ba rdales) ら J. Biol. Chem.、第 264卷、第 1 98 93〜： 1 989 7頁 ( 1 989) に（ケィプロコッカス ' ニュ一モニエ (Diprococcus pneumoni ae) 由来のエンド一ひ一 N—ァセチルガラクトサミニダーゼを用いる方法が記載されている。さらに、特開平 5— 64594号公報には、ァルスロバク 'ター ·プロ卜ホノレミエ (Arthrobacter protophormiaeリ由来のエンド一 ]3— N—ァセチルダルコサミニダ一ゼによる糖質への高マンノース型糖鎖の転移反応が記載されている。また、 K. ャマモト（K. Yaraamoto) ら Biochem. Biophys. Res. Commun.、第 203卷、第 244〜 252頁（1 994) にはムコール . ヒェマリス（Mucor hiemalis) 由来のエンド一 3—ァセチルダルコサミニダーゼによる糖質への糖鎖転移反応が記載されている。さらに、特開平 1 0— 245402号公報には、エンド一 jS—N—ァセチルダルコサミニダ一ゼを用いた（_Man) 6—GlcNAcの転移反応が記載され、特開平 1 0 -33 1 94号公報には、ラクト一 N—ビオシダーゼを用いた Gal/31— 3Glc NAcの転移反応が記載されている。

このように、エンドダルコシダ一ゼで様々な糖鎖を転移する例が報告されているが、ラクトースまたは N—ァセチルラクトサミンを転移させた例はこれまでに報告されていない。

従って、ラクトシル配糖体または N—ァセチルラクトサミニル配糖体の簡便な製造方法が望まれている。発明の開示

本発明は、 ]3 1 , 4ダルコシル結合切断活性を有する酵素の存在下、次式：

L a c A - X + Y → L a c A— Y + X (式中、 L a c Aはラクトースまたは N—ァセチルラクトサミンを、 Xは水素（H) 、糖質、複合糖質、またはフニノール性化合物を、 Yはアルコール性水酸基またはフユノール性水酸基を有する化合物をそれぞれ表す。）で表わされる転移反応を用いることを特徴とする、ラクトシル配糖体または N— ァセチルラクトサミニル配糖体の製造方法に関する。

好ましい実施態様においては、前記 Yがアルコール性水酸基を有する化合物である。

別の好ましい実施態様においては、前記アルコール性水酸基を有する化合物が脂肪族アルコールまたは糖質である。

' さらに別の好ましい実施態様においては、前記アルコール性水酸基を有する化合物が、セリンまたはスレオニン残基を有するアミノ酸、ペプチドまたは蛋白質である。

好ましい実施態様においては、 Xが水素である。

また、好ましい実施態様においては、前記 — 1， 4ダルコシル結合を切 '断する活性を有する酵素が、ェキソ一セロビォヒドロラーゼ、 β — D—ダルコシダーゼ、および/またはセルラーゼである。

本発明は、また、以下の構造式（I ) で示される、グリセリル Ν—ァセチノレラク卜サミニド (0- β -D-Galactopyranosyl- (1→4) -0- β -D-2-Acetylamin ο - 2 - deoxyl - Glucopyranosyl - (1^→1) - LJ丄 ycerin) に関， ·。₀

図面の簡単な説明

第 1図は、 L a c— pNPのラクトシル基の脂肪族アルコールへの転移反応を示す薄層クロマトグラフィーである。

第 2図はェチルラタトシドの¹ H— NMRである。

第 3図はェチルラクトシドの質量分析スぺクトルである。

第 4図は、 L a c— pNPのラクトシル基の、アミノ酸への転移反応を示す薄層クロマトグラフィ一である。

第 5図は、 L a c— p NPのラクトシル基の、単糖への転移反応を示す薄層クロマトグラフィーである。

第 6図は、 L a c— p NPのラクトシル基の、 L—メントールへの転移反応を示す薄層クロマトグラフィーである。

第 7図は、 La cNAc— pNPの N—ァセチルラクトサミニル基の、脂肪族アルコールへの転移反応を示す薄層クロマトグラフィーである。

第 8図は、ラクトースと脂肪族アルコールまたは単糖との縮合反応を示す薄層クロマトグラフィーである。

第 9図は、 N—ァセチルラクトサミンと脂肪族アルコールまたは単糖との縮合反応を示す薄層クロマトグラフィーである。発明を実施するための最良の形態

本発明は、 |3 1, 4ダルコシル結合切断活性を有する酵素の存在下、次式：

L a c A-X + Y → L a c A-Y + X で表わされる転移反応を用いることを特徴とする、ラクトシル配糖体または Ν—ァセチルラクトサミニル配糖体の製造方法である。 (酵素）

本発明に用いられる酵素は、 /3 1， 4ダルコシル結合切断活性を有する酵素であれば、特に制限がない。エンド型の酵素でもよく、ェキソ型の酵素でもよレ、。好ましい酵素としては、ェキソ一セロビォヒドロラーゼ、）3— D— ダルコシダーゼ、セルラーゼなどが挙げられる。これらの酵素は、単独で用いてもよく、混合して用いてもよい。

酵素は、市販の] 3 1 , 4ダルコシル結合切断活性を有する酵素であってもよく、 β 1， 4ダルコシル結合切断活性を有する酵素を生産する微生物、その培養液あるいは抽出物、あるいは精製物であってもよい。 1， 4ダルコシル結合切断活性を有する酵素を生産する微生物は、公知である。

細菌の例としては、例えば、バシラス（Bacillus) 属、セルビブリオ（Ce llvibrio) 属、セルロモナス（Cellulomonas) 属、シユードモナス（Pseudo raonas) 属、スポロサイ卜ファーガ (Sporocytophaga) 属、ァセティビブリォ（Acetivibrio) 属、クロストリジゥム（Clostridium) 属、バクテリオイド (Bacterioidesリ属、トレホネマ (Treponema) 属、ノレミノコッカス (Rum inococcus) 属など力 S挙げられる。

糸状菌の例としては、例えば、フミコ一ラ（Humicola) 属、トリコデルマ (Tricoderraa) 属、マイ口セシウム（Myrothecium) 属、ァスぺノレギノレス（A spergillus) 属、イノレペタス (Irpex) 属、ぺニシリウム (Penicilliura; 属、ペリクラリラ（Pellicularia) 属などに属する微生物が挙げられる。

放線菌の例としては、ストレプトマイセス（Streptomyces) 属、サーモノスポラ（Thermonospola) 属に属する微生物が挙げられる。 (供与体）

一般式 L a c A— X で表されるラクトースまたは N—ァセチルラクトサミン供与体としては、ラクトース又は N—ァセチルラクトサミン（Xが水素の場合）及び、ラクトース又は N—ァセチルラクトサミンを含有する糖質、複合糖質、またはフエノール性化合物が挙げられる。

ラクトース供与体及び Z又は N—ァセチルラクトサミン供与体の糖質としては、ラクトースまたは N—ァセチルラクトサミンが ;3 _ダルコシド結合したオリゴ糖が挙げられる。

ラクトース供与体及び Z又は、 N—ァセチルラクトサミン供与体の複合糖質としては、ラクト一ス又は N—ァセチルラクトサミンを末端に有する糖蛋白質、プロテオダリカン、糖脂質が挙げられる。糖脂質としては、スフインゴ糖脂質が好ましく、スフインゴ糖脂質の構成成分であるセラミドあるいはセラミド類縁体の末端にラクト一スまたは N—ァセチルラクトサミンを有するものが好ましく用いられる。

ラクトースまたは N—ァセチルラクトサミン供与体のフエノール性化合物としては、特に制限がない。ラクト一ス又は N—ァセチルラクトサミンを有するフエノールおよびその誘導体（例えば、パラニトロフエノール）、チロシンおよびその誘導体、サリチル酸およびその誘導体などが挙げられる。なお、 L a c A— Xがラクトースまたは N—ァセチルラクトサミンの場合には、受容体 Yとの間で縮合反応が起こるが、これも本発明でいう転移反応に含まれるものである。

(受容体）

ラクトースまたは N—ァセチルラクトサミンの受容体である Yとしては、水酸基、すなわち、アルコール性水酸基またはフエノール性水酸基を有する化合物が挙げられる。

ラクトースまたは N—ァセチルラクトサミンの受容体であるアルコール性水酸基を有する化合物としては、例えば、脂肪族アルコール、アミノ酸、糖質などが挙げられる。

脂肪族アルコールは脂肪族炭化水素の水素原子の 1個または複数個を水酸基で置換したものであり、これらは、水酸基の結合している炭素に結合するアルキル基の数で一級アルコール、二級アルコール、三級アルコールに分類される。また、水酸基の結合数によって、一価アルコール、二価アルコール、多価アルコールとも分類される。

一級アルコールとしては、メタノール、エタノール、ブタノール、プロパノール、へキサノ一ノレ（シス一 3 _へキサノール）、ォクタノール、ァリルアルコール、ゲラニオール、シトロネオ一ルなどが挙げられる。

二級アルコールとしては、イソプロパノール、 sec—ブタノールなどが挙げられる。

三級アルコールとしては、 t一ブチルアルコールなどが挙げられる。

一価アルコールとしては、上記メタノールなどが、二価アルコールとしてはエチレンダリコールなどが、三価アルコールとしてはグリセロールなどが代表的なものである。

以上の物質の他に、メントール、サンタロールなどの環状構造を有する脂環族アルコールも脂肪族アルコールに含む。

また、アルコール性水酸基を有するアミノ酸としては、例えば、セリン、スレオニンなどが挙げられる。さらに、アルコール性水酸基を有するァミノ酸、例えば、セリン、スレオニン残基を含有するペプチドおよび蛋白質、あるレヽは後述のフノ一ル性水酸基を有するチロシンを含有するペプチドも本発明の受容体として用いられる。

• また、アルコール性水酸基を有する糖質としては、グルコース、マンノースなどの単糖が挙げられる。オリゴ糖としては、マルトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、サイクロデキストリン、ゲンチォオリゴ糖、ニゲロオリゴ糖などの澱粉関連のオリゴ糖、マルトオリゴシルスクロース、フラクトオリゴ糖、パラチノース、ラクトスクロース、キシロシルフルクトシド、ラフイノ一ス、スタキオースなどの砂糖関連のオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、ラクトスクロ —ス、ラクチュロースなどの乳糖関連のオリゴ糖、キシロオリゴ糖、ァガロオリゴ糖、キチン 'キトサンオリゴ糖、マンノオリゴ糖、アルギン酸オリゴ糖などが挙げられる。また、糖蛋白質、糖脂質の構成成分となっている糖鎖もしくはその部分構造となる糖鎖などを挙げることができる。

フエノール性水酸基を有する化合物としては、フエノールおよびその誘導体、チロシンおよびその誘導体、サリチル酸およびその誘導体、ゲユスティンなどの大豆イソフラボン類などが挙げられる。

その他、糖蛋白質やスフインゴ糖脂質などの複合糖質、セラミドなどの複合脂質、フラボノールなどのフラボノイド類縁体が水酸基を有しており、受容体として用いることができる。

(ラクトシルまたは N—ァセチルラクトサミニル転移反応）

ラクトシルまたは N—ァセチルラクトサミニル転移反応には、特に制限はない。ラタトシルまたは N—ァセチルラクトサミニル供与体と、 i3— 1 , 4 グルコシル結合を切断する活性を有する酵素と、ラクトシルまたは N—ァセチルラクトサミニル受容体とを適切な割合で混合し、反応させればよレ、。転移反応におけるラクトシルまたは N—ァセチルラクトサミニル供与体および受容体の濃度は、特に制限はなく、当業者が反応の効率などを考慮して適宜決定すればよい。

. 用いる酵素の濃度は、特に制限がない。基質の濃度、反応温度、反応時間などを考慮して、当業者が決定すればよい。例えば、予備試験を行って、用いる酵素量を決定することができる。

反応温度は特に制限はない。一般的には、用いる酵素の至適温度 ± 2 0 °C 程度の範囲で行われる。より好ましくは酵素の至適温度土 1 0 °C程度の範囲で行われる。

反応の pHも特に制限がなく、用いる酵素によっても異なるが、一般には用いる酵素の至適 pH± 3程度の範囲で行われる。より好ましくは酵素の至適 pH± 2程度の範囲で行われる。このような pH調整には、当業者が用いる適切な緩衝液が用いられる。

なお、基質が水に溶解しにくい場合、基質を溶解して反応効率を高めるために少量の溶媒や界面活性剤を加えても良い。実施例

以下、実施例によって本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施

.例に限定されない。実施例 1

脂肪族アルコールを受容体とするラクトシル転移反応を行った。ラクトース供与体として、 P-ニトロフエニル -]3- D-ラクトシド（以下、 L a c— p NPという）を用い、ラクトース受容体として、脂肪族アルコールであるェタノ一ノレ、ブタノ一ノレ、へキサノーゾレ、ォクタノーノレ、イソプロノヽ。ノ一ノレおよび t—ブチルアルコールを用いた。酵素として、トリコデルマ · リ一ゼィ (T. reesei) 由来のセルラーゼ（協和発酵製）を用いた。

1 Omg/m 1の酵素溶液 50 μ 1 ( 20 mM酢酸緩衝液（ ρ Η 5. 0) に溶解）に、 4. 65mg /m 1の L a c— pNPを 200 μ 1、各種アルコールを 1 20 μ 1、 0. 2Μ酢酸緩衝液（ρΗ5. 5) を 30 μ ΐ加え、全量を 400 μ 1 とした。酵素反応は 40°Cで行い、転移反応は経時的に薄層クロマトグラフィー（以下、 TLCという：展開溶媒はクロ口ホルム：メタノール：水 =60 : 35 : 8) で確認した。 TLCはメルク社製のアルミニゥムシ一トシリ力ゲル 6 O/Kieselgur F 254プレコ一トを用いた。検出は、オルシン—硫酸による発色で行った。

結果を図 1に示す。図中、 Rはラタトース（L a c) と L a c— pNPの混合液を表し、ラクトースの R 直（0. 1 3) はし a c— pNPの R f 値

(0. 43) より小さレ、。また、 Sは反応液を、 Bはブランクを意味する。なお、ブランクは、酵素の代わりに水を添加して反応させたものである。図 1において、（1)はエタノール、（2)はブタノール、（3)はへキサノール、（4) はォクタノール、（5)はィソプロパノールおよび（6)は t—ブチルアルコールを基質としたときの結果である。

(1)〜（6)のすベての反応液 S中に、反応初期には存在しなかったラクトース（L a c) が生成され、さらに（1)〜（6)のそれぞれの基質に対応するアルキルラクトシド（それぞれ、ェチルラクトシド、ブチルラクトシド、へキシルラクトシド、ォクチルラクトシド、イソプロピルラクトシド、および t— ブチルラクトシド）が生成していた。即ち、（1)〜（6)のすベての反応液で、 L a c— pNPのラクトシル基が脂肪族アルコールの水酸基に転移されて、アルキルラクトシドが生成していることが確認された。なお、（2)のブチルラクトシドの R f 値（ 0. 3 8) と（6)の t—プチルラクトシドの R f 値

(0. 45) は、 L a c— pNPの R f 値（0. 43) と近かったので、図 1の TLCにおいて、（2)と（6)とは、一見、 L a c— p NPと区別がされに

実施例 2

実施例 1のエタノールをラクトース受容体としたもの（（1)) について、反応生成物を解析した。 27時間反応させた後、 1 00°C、 1 0分加熱し、 1 7， 000 r pm、 1 0分の遠心分離処理を行い、上清を得た。上清をェバポレートして乾固し、 1 Om 1の 25%メタノール水溶液に溶解した。溶解液をトョパール HW— 40 Sゲル濾過力ラムクロマトグラフィー (φ 2. 5 X 80 cm) にロードし、 25%メタノール水溶液を溶媒として、流速 1. Om l /分で、 1 Om 1づっ、分画した。検出は、 21 011111ぉょび300 11111の11¥吸収、フユノール—硫酸法による発色（485 nm) を測定することにより、行った。チューブ No. 34〜44の画分をプールし、エバポレートして乾固した。

乾固物を 1 Om 1のクロロホルム：メタノール：水 = 50 ： 45 ： 1 0に溶解し、ヮコーゲル C— 300を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィ一で分離 ·精製した。クロ口ホルム：メタノール：水 = 50 : 45 : 1 0を展開溶媒とし、流速 2. Om l /分で展開し、 1 0m lづっ、分画した。検出は、 2 10 nmおよび 300 nmの UV吸収、フエノール一硫酸法による発色（485 nm) を測定することにより、行った。チューブ No. 1 1〜 1 3の画分をプールし、エバポレートして乾固した。

得られた乾固物の一部を 0. 3 m 1の蒸留水に溶解して、質最分析 FAB ZMASを行い、他方で、得られた乾固物の一部を重水に溶解して、 — NMR分析を行った。 — NMRの結果を図 2に、 FABZMASの結果を図 3に示す。また、図 2、 3に対応する¹ H— NMRおよび F ABZMA Sのデータを以下に示す。

^JH-NMR (270MH z、 D₂〇）： 54.50(d, / 7.9Ηζ, Η—1),4·45 (d, ゾ 7.7Hz， H - Γ),3.30(dd，H-2), 1.24(t， H- ）；

• FAB/MAS ： (m/z)=371(C₁₄H₂₆N0_n+H)\ (m/z)=393 (C_uH₂₆N0_n+Na)⁺ _o これらのデータから、（1)の生成物が以下の構造式（II)で示されるェチルラクトシドであることが確認された。

実施例 3

アルコール性水酸基を有するアミノ酸へのラクトシル転移反応を行った。酵素とラクトース供与体は、実施例 1と同じものを使用した。反応液として、酵素を 0. 5m g、 L a c— p NPを 0. 9 4 m g、セリンを 5 0 m gまたはスレオニンを 1 5 m g含む、 1 5 mM酢酸緩衝液（p H 5. 0) 4 0 0 μ 1を調製し、 4 0°C、 24時間反応させた。反応後、実施例 1と同様に T L Cを用いて分析した。結果を図 4に示す。なお、展開溶媒は、クロ口ホルム：メタノール：水 = 5 0 : 4 5 : 1 0であった。

図 4において、 Rは L a cと L a c— p N Pの混合液、 Sは反応液、 Bはブランクを示す。（7)はセリン、（8)はスレオニンを受容体としたときの結果である。（7)および (8)の反応液において、基質 L a c— p NPは消滅し、それぞれ、セリルラクトシドとスレオニルラクトシドとが生じていた。なお、セリルラクトシドとスレオニルラクトシドの R f 値はそれぞれ、 0. 2 7、 0. 2 9であり、ラクトースの R f 値（0. 3 4) と近いために、セリルラクトシドとスレオニルラクトシドはラクトースから明確に分離されず、プロードなバンドとして表れた。実施例 4

. アルコール性水酸基を有する単糖へのラクトシル転移反応を行った。酵素とラクトース供与体は、実施例 1と同じものを使用した。反応液として、酵素を 0. 5 m g、 L a c— p N Pを 0. 9 4m g、グルコースまたはマンノ —スをそれぞれ 7 Om g含む、 1 5mM酢酸緩衝液（p H 5. 0) 4 0 0 1を調製し、 4 0°C、 24時間反応させた。反応後、実施例 1と同様に TL Cを用いて分析した。結果を図 5に示す。なお、展開溶媒は、クロ口ホルム：メタノール：水 = 5 0 ： 4 5 ： 1 0であった。

図 5において、 Rは L a cと L a c— p NPの混合液、 Sは反応液、 Bはブランクを示す。（9)はグルコース、（10)はマンノースを受容体としたときの結果である。（9)および（10)の反応液において、基質 L a c— pNPは消滅し、それぞれ、ダルコシルラクトシドとマンノシルラクトシドとが生じていた。ダルコシルラクトシドとマンノシルラクトシドの R ί値はそれぞれ、 0. 24、 0. 25であり、ラクト一ス（L a c) の R f値（0. 34) よりも小さい R f値を有しており、ラクトースから明確に分離された。

なお、図 5において、 L a c— p NPと L a cの間にバンドがあるが、 (9)はグルコース（G l u) 、（10)はマンノース（Ma n) であった。実施例 5

アルコール性水酸基を有する脂環族アルコールである Lーメントールへのラクトシル転移反応を行った。酵素とラクトース供与体は、実施例 1と同じものを使用した。反応液として、酵素を lmg、 L a c— pNPを lmg、 L—メントールを 5mg、および界面活性剤として、コール酸を 2重量％含む、 1 5 mM酢酸緩衝液（ p H 5. 0) 400 _μ 1を調製し、 40°C、 24 時間反応させた。反応後、実施例 1と同様に TLCを用いて分析した。結果を図 6に示す。なお、展開溶媒は、クロ口ホルム：メタノール：水 = 65 ： 35 ： 4であった。

' 図 6において、 Rは L a cと L a c _ p NPの混合液、 Sは反応液、 Bはブランクを示す。基質 L a c— pNPは消滅し、 L—メントリルラクトシド (L a c—メントール）が生じており（R f 値 0. 62) 、ラクト一ス（R f 値 0. 13) と区別された。 L—メントリルラクトシド以外のスポットは、 R f 値 0. 81のコール酸以外は、なんらかの反応生成物と考えられる。実施例 6

アルコール性水酸基を有する脂肪族アルコールへの N—ァセチルラクトサミニル転移反応を行った。

N—ァセチルラクトサミン供与体として、 p—二トロフエニル一 3—N— ァセチルラクトサミン（以下、 L a cNAc— pNPという）を用いた。反応液として、 0. 94mg、 N—ァセチルラクトサミン（以下、 L a cNA cとレ、う）受容体として、メタノール、エタノール、プロパノールをそれぞれ 120 /Z 1、酵素として、トリコデルマ · リ一ゼィ（T. reesei) 由来のセルラーゼ（協和発酵製）を 0. 5mgを含む 400 1の 15mM酢酸緩衝液（pH5. 0) を調製し、 40°C、 24時間反応させた。反応後、実施例 1と同様に丁 LCを用いて分析した。結果を図 7に示す。なお、展開溶媒は、クロロホルム：メタノール：水 = 50 : 40 : 50であった。

図 7において、 Rは L a cNAcおよび L a cNAc—ρΝΡを、 Bはブランクを示す。基質 L a cNAc -pNP (R f =0. 56) は消滅し、 L a cNAc (R f 値 =0. 30 ) 、および矢印で示される R f 値 = 0. 38、 0. 46および 0. 56の新しいスポットが表れ、それぞれ、メチル N—ァセチルラクトサミニド（1) 、ェチル N—ァセチルラクトサミニド（2) およびプロピル N—ァセチルラクトサミニド（3) に対応していた。このうち、ェチル N—ァセチルラクトサミニド（2) については、標品（Carbiochem 製）と TLCのスポットが一致した。実施例 7

アルコール性水酸基を有する脂肪族アルコール、糖類を受容体とするラクトシル転移（ラクトースの縮合）反応をおこなった。供与体としてラクトースを用いた。また、受容体としてメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノ一ル、へキサノール、ォクタノール、ドデカノール、ァリルァノレコール、マンノースを用いた。

ラクトース 100mg、各受容体 1 70μ 1 (マンノースの場合は 75 m _g) 、酵素としてトリコデルマ · リーゼィ（T. r e e s e i ) 由来のセルラ一ゼ（協和発酵製）を 25mg含む 650μ1の 10 mM酢酸緩衝液（ p H5. 0) を調製し、 40°C、 48時間反応させた。反応後、 TLCで分析した。結果を図 8 (1) 〜（7) に示す。図中、 Sは反応液、 Bはブランクを示す。また、展開溶媒は、クロ口ホルム：メタノール：水 =60 ： 35 ： 8である。

各反応液とも複数のスポットが認められたがラクトース（L a c) の R f 値 =0. 29に対して、矢印で示す R f 値 =0. 45、 0. 52、 0. 54、 0. 62、 0. 65、 0. 68、 0. 69の新しいスポットが見出された。それぞれのスポットから、メチルラクトシド（ 1 ) 、ェチルラクトシド (2) 、プロピルラクトシド（3) 、ブチルラクトシド（4) 、へキシルラクトシド（5) 、ォクチルラクトシド（6) 、ドデシルラクトシド（7) の生成が示唆された。

また、ラクトースの R f値 =0. 36に対して、 R fi=0, 53、 0. 29 (展開溶媒としてクロ口ホルム：メタノール：水 = 50 ： 45 ： 10) の新しいスポットが見出され（図 8 (8) 〜（9) ) 、それぞれァリルラクトシド（8) 、マンノシルラクトシド（9) の生成が示唆された。以下、それぞれの生成物を確認した。 7-1. ェチルラクトシド（2)

ェチルラクトシド（2) の TLCのスポットは、実施例 1における L a c 一 pNPとエタノールとの転移反応生成物及び標品（シグマ社製）と一致した。また、実施例 2と同様に分離精製後、得られた乾燥物の一部を FAB/ MAS, — NMR、および¹³ C— NMRにて分析した結果を以下に示す。

F A B /MA S ： (m/z) =371 (C₁₄H₂₆N0_n+H) +、 (ra/z) =393 (C₁₄H₂₆N0_n+Na) ⁺；

^XH-NMR (270MHz、 D_zO) ： δ 4.50 (d, / 7.9Hz, H— 1),4.45 (d， /7.7Hz, H-l'),3.30 (dd, H-2), 1.24(t, -β)

¹³C— NMR (2 70MH z、 D₂0) ： 17.1 (C- ;3)、 62.9 (C- 6)、 63. 8 (C— 6，）、 69.0(C— 4，）、 71.4 (C— a)、 73.8 (C— 2，）、 75.4 (C一 3，）、 75.6 (C一 2)、 77.3 (C-3)、 77.6 (C— 5)、 78.2 (C— 5，）、 81.3 (C— 4)、 104.5 (C_l)、 10

以上から、生成物（2) は構造式（Π)に示すェチルラクトシドであることが確認された。

7-2 ブチルラクトシド（4) 、へキシルラクトシド（5) 、ォクチルラクトシド（6)

ブチルラクトシド（4) 、へキシルラクトシド（5) 、ォクチルラクトシド（6) についても実施例 1で得られた、 L a c _ρ ΝΡと対応する脂肪族アルコールにおける転移反応生成物と TLCのスポッ卜が一致した。

更に、ォクチルラクトシド（6) を含むと思われる反応液を前出のシリカゲルカラム（(f) 2 X 5 0 c m) に力け、溶離液として、クロロホルム：メタノール：水 = 6 0 ： 2 5 ： 4を用レヽ、流速 2. Om l Z分で溶出した。 1 0 m 1 /フラクションで分画を行い、反応生成物をフエノールー硫酸法による発色（4 8 5 nm) で検出した。フラクション N o. 2 1〜2 8を回収し、凍結乾燥して反応生成物約 5 m gを得た。本品の純度は T L C、及び液体ク口マトグラフィ一により 9 9%以上であることを確認した。

得られた乾燥物の一部を FABZMASにて、他方を¹ H— NMR、 ¹³C 一 NMRにて分析した。結果を以下に示す。

. FABZMAS ： (m/z)=455 (C₂₀H₃₈N0_n + H) ⁺、 (m/z)=477 (C₂₀H₃₈N0_n + Na) +；

〗H— NMR (2 7 0MH z、 D₂O) ： 54.48 (d, J8.0Hz, H- 1) ，4.45

(d, 7.7Hz, H - 1，) ，3.31 (dd, H-2) , 1.63(m, H-/3), 1.36 (m, Η-γ), 1.29 (m, H- δ - 77 ), 0.87 (t, H- Θ )；

. ¹³C— NMR (2 7 0MHz、 D₂〇）： 16.2 (C - Θ )、 24.8 (C - η )、 27. 8 (C- γ ) , 31.2 (C— δ)、 31.2 (C- ε )、 31.5 (C- β )、 33.9 (C— ζ )、 63.0 (C— 6)、 63.8 (C一 6')、 71.4 (C- 4，）、 73.6 (C - α)、 73.8 (C_2')、 75.4 (C - 3')、 75.7 (C— 2)、 77.3 (C— 3)、 77.6 (05)、 78.2 (C— 5')、 81.3 (C一 4)、 10 4.8 (C-l)、 105.7 (C - Γ) 。

以上より、生成物（6) は、以下の構造式（III) で示されるォクチルラクトシドであることが確認された。

(III)

7-3 ドデシルラクトシド（7)

さらに、ドデシルラクトシド（7) を含むと思われる反応液を、 Chromato rex- ODS DM1020Tを用いた 0DSカラム（φ 3. 5 X 60 c m) にかけた。カラムの 5倍量の 6 5%メタノールで洗浄後、 7 5%メタノール（流速 2. 5 m 1 /分）で溶出した。 3 Om 1 /フラクションで分画を行い、反応生成物をフエノール一硫酸法による発色（485 nm) で検出した。フラクション N o. 1 7〜 23を回収し、凍結乾燥して反応生成物約 5 m gを得た。本品の純度は TLC、及び液体クロマトグラフィ一により 99%以上であることを確認した。

■ 得られた乾燥物の一部を FAB/MASにて、他方を¹ H— NMR、 ¹³C 一 NMRにて分析した。結果を以下に示す。

FABZMAS ： (m/z)=511 (C₂₄H₄₆N0_n + H) +、 (m/z)=533 (C₂₄H₄₆N0_n +

Na) +； iH— NMR (2 70MH z、 D₂0) ： 64.23 (d, 8.0Hz, H— 1) 、 4.4 5 (d, 7.3Hz, H - Γ) 、 3.19 (dd， H- 2) 、 1.57 (ιη，Η- )、 1.33(m, H- γ )， 1.24 (m， H- δ〜え）、 0.85 ( t , H- ）；

^{] 3}C— NMR (270MH z、 D₂〇）： 14.4 (Ομ)、 23.7 (C—又）、 27. 1 (C— γ)、 30.5 (C— δ)、 30.5 (C- ε )、 30.6 (C-β) 30.8 (C— ζ )、 30.8 (C— η)、 30.8 (C- θ ) 30.8 (C— τ)、 33.1 (C— κ )、 61.9 (C— 6)、 62.5 (C- 6')、 70.3(C— 4')、 71.0 (Οα)、 72.6 (C— 2，）、 74.8 (C— 3，）、 74.8 (C— 2)、 7 6.4 (C— 3)、 76.5 (C— 5)、 77.1 (C_5，）、 80.7 (C— 4)、 104.3 (C—l)、 105.1 (C- 1')。

以上より、生成物（7) は、以下の構造式（IV)で示されるドデシルラクトシド（7) であることが確認された。

(IV)

7—4 マンノトシド（8)

また、マンノシルラクトシド（8) については、実施例 4で得られた転移生成物のマシルラクトシドと T L Cのスポットがー致した。 (実施例 8)

アルコール性水酸基を有する脂肪族アルコール、糖類への N—ァセチルラクトサミニル転移（N—ァセチルラクトサミンの縮合）反応を行った。

供与体として N—ァセチルラクトサミン（L a c NA c) を用い、受容体としてメタノール、エタノール、プロパノ一ル、マンノースを用いて、実施例 7と同条件で反応を行った。図 9に結果を示す。図中、 Sは反応液を、 B はブランクをそれぞれ表す。各反応液とも複数のスポッ卜が認められたが、 L a cNAcの R f値 =0. 24に対して、矢印で示す、 R f 値 = 0. 36、 0. 40、 0. 45 (展開溶媒としてクロ口ホルム：メタノール：水 = 6 0 : 35 : 8) の新しいスポットにより、それぞれメチル N—ァセチルラクトサミニド（1) 、ェチル N—ァセチルラクトサミニド（2) 、プロピル N ーァセチルラクトサミニド（3) の生成が示唆された（図 9 ( 1 ) 〜 (3) ) 。

また、 L a c NA cの R f 値 = 0. 58に対して、 R =0. 3 (展開溶媒としてクロ口ホルム：メタノ一ル：水 = 50 : 45 : 10) の新しいスポットにより、マンノシル N—ァセチルラクトサミニド（4) の生成が示唆された（図 9 (4) ) 。 8-1 ェチル N—ァセチルラクトサミニド（2) の構造確認

ェチル N—ァセチルラクトサミニド（2) を含むと思われる反応液を前出のシリカゲルカラム（φ 2 X 40 cm) に力け、溶離液として、クロ口ホルム：メタノール：水 =50 ： 45 ： 10を用い、流速 2. 0m 1 Z分で溶出した。 5m 1 Zフラクションで分画を行い、反応生成物をフエノール—硫酸法による発色（485 nm) で検出した。フラクション N o . 1 1〜： 14を回収し、凍結乾燥して反応生成物約 5m gを得た。本品の純度は TLC、及び液体ク口マトグラフィ一により 99 %以上であることを確認した。

' 得られた乾燥物の一部を F AB/MASにて、他方を¹ H— NMR、 ¹³C 一 NMRにて分析した。結果を以下に示す。

F AB/MAS ： (ra/z)=411 (C₁₆H₂₉N0_U + H) ⁺、 (m/z)=433 (C₁₆H₂₉NO_n +

Na) ⁺； 'H-NMR (2 70MH z、 D₂O) ： 54.53 (d, 5, 6Hz, H— 1) ,4.4 5 (d，ゾ 7.9Hz， H-1') , 2.02 (s, C0CH₃) , 1.24(t,H-/3) ；

¹³C-NMR (2 7 0MH z、 D₂0) ： δ 17.1 (C- /3 )、 24.9 (NHCOCH ₃) 、 57.9 (C— 2) 、 62.9 (C一 6)、 63.8 (C— 6，）、 69.1 (C— 4，）、 71.4 (C- a ) , 73.8 (C— 2')、 74.9 (C— 3，）、 75.3(C— 3)、 77.6 (C - 5，）、 78.2 (C- 5)、 81.3 (C 一 4)、 103.4(C- 1)、 105.7 (C— 1')、 177· 6(NH )CH₃)。

以上より、生成物は以下の構造式（V) で示されるェチル N—ァセチルラクトサミニドであることが確認された。

8-2 マンノシル N—ァセチルラクトサミニド（4) の構造確認

マンノシル N—ァセチルラクトサミニド（4) を含むと思われる反応物をクロマトグラフ用活性炭素（和光純薬製）を用いた活性炭カラム（Φ 2. 5 X 2 5 c m) にかけ、水/エタノール溶液のリニアグラジェント（0— 3 0% ； 2 L) により、流速 1. 5m 1ノ分で溶出した。 1 5 m l /フラクシヨンで分画を行い、反応生成物をフエノールー硫酸法による発色（4 8 5 η m) で検出した。フラクション N o. 8 0〜 1 0 2を回収し、凍結乾燥して反応生成物約 5 m gを得た。本品の純度は T L C、及び液体ク口マトグラフィ一により 9 9%以上であることを確認した。

' 得られた乾燥物の一部を FAB/MASにて、他方を¹ H— NMR、 ¹³C 一 NMRにて分析した。結果を以下に示す。

FAB/MAS ： (ra/z)=546 (C₂₄H₄₆N0_n + H) ⁺、 (ra/z)=568 (C₂₄H₄₆N0_u +

Na) +； 'H-NMR (2 7 0MH z、 CD₃〇D) ： 55.16 (d, 1.6Hz, H - 1 a) 、 4.89 (s,H— 1/3) 、 4.58 (d，ゾ 8.3Hz， H - 1，）、 4.47 (d, ゾ 7.6Hz, H— 1，，）、 (dd, H-2) ；

¹³C-NMR (270MHz、 D₂〇）： 24.9 (NHC0CH₃) , 58.0 (C-2')、 63.2 (C— 6')、 62.8 (C一 6c )、 62.8 (C一 6 /3 )、 63.8 (C_6")、 71.4 (C一 4'，）、 7 1.8 (C-2 a), 73.0 (C— 3a)、 73.5 (C— 5a)、 73.5 (C一 2 、 73.8 (C— 2")、 74.6 (C— 3jS)、 74.9 (C— 3，'）、 75.3 (C一 3，）、 77.5 (C- 5j3)、 77.6 (C— 5")、 7 8.2 (C一 5')、 79.8 (C-4 β ) , 80.3 (C一 4ひ）、 81.1 (C— 4')、 96.4 (C— 1 /3 )、 96. 5 (C-l ) , 104.2 (C- 1，）、 105.7 (C- 1")、 177.6 (NH^)CH₃)。

以上より、生成物は以下の構造式 (VI)で示されるマンノシル N—ァセチルラクトサミニドであることが確認された。

実施例 7および 8の結果は、 4ダルコシド結合を切断する酵素の存在下、ラタトース及び Ν-ァセチルラクトサミンき体がアルコール性水酸基を有する化合物と縮合し、対応する配糖体が生成することを示している。

(実施例 9)

10 Om g/m 1の酵素溶液 5. 6m 1に 1 gの N—ァセチルラクトサミン（L a cNAc) 、 4. 2m lのグリセロール、 1. 4m lの酢酸ェチルを加え、酢酸カルシウムで pHを 7. 0に調整し、 40°Cで 48時間反応を行った。

反応液をァニリン酢酸処理し、 L a c NA cを除去した後、この反応液を前出のものと同じ単体を用いた活性炭カラム（<) 5 X 50 cm) にロードして、流速 5m 1 分で吸着物を溶出させた。展開溶媒として、水/メタノ一ル溶液（リニアグラジェント、 0— 20% ; 6 L) を用いた。 50m l /フラクシヨンで分画を行い、反応生成物をフエノールー硫酸法による発色（4 85 nm) で検出した。フラクション No. 1 1 5〜 125を回収し、凍結乾燥して反応生成物である乾燥物を約 1 Omg得た。本品の純度は TLC、及び液体ク口マトグラフィ一により 99%以上であることを確認した。

得られた乾燥物の一部を F ABZMASにて、他方を¹ H— NMR、 ¹³C — NMRにて分析した。結果を以下に示す。

FAB/MAS ： (m/z)=458 (C₁₇H₃₁N0₁₃+H) +、 (m/z) =607 (C₁₇H₃₁N0₁₃+ i'riethanolamine) ^T；

XH-NMR (270MHz、 D₂〇）： 64.55 (d, ゾ 7.3Hz， H— 1) 、 4.47 (d, / 6.8Hz, H-l') 、 2.04 (s, C0CH₃) ；

¹³C— NMR (270MHz、 D₂0) ： 625.0 (NHC0CH₃) 、 57.9 (C— 2) 、 62.9 (C— 6)、 63.9 (C一 6，）、 65.2 (C— γ)、 71.4 (C— 4，）、 73.1 (C— /3)、 73.5 (C— a)、 73.8 (C— 2')、 75.2 (C— 3，）、 75.4 (C— 3)、 77.6 (C— 5，）、 78.2 (C一 5)、 81.3 (C-4)、 104.2 (C— 1)、 105.7 (C一 Γ)、 177.6(NHCOCH₃)₀

以上より、生成物は以下の構造式（I)で示される、 0- /3 - D- Galactopyranos yl_ (1→4) -0- β -D-2-Acetylaraino-2-deoxyl-Glucopyranosyl- (1^→1) -ij丄 ycer inであることが判明した。

得られた化合物は、従来報告された化合物とは、ガラクトースと N—ァセチルダルコサミンの結合様式並びに N—ァセチルダルコサミンとグリセ口一ルの結合様式において異なる新規物質である。

本発明において、グリセロールに N—ァセチルラクトサミンが付加した新規配糖体が得られたことにより、従来のグリセロールをァグリコンとする配糖体が呈する公知の物性、及び生理学的機能は勿論のこと、全く新規の機能が期待でき、グリセ口糖脂質等の有用物質の新たな骨格（原料）物質としても活用できる。産業上の利用可能性

本発明により、食品、機能性食品素材、医薬品および試薬として有用なラクトシル配糖体および N—ァセチルラクトサミニル配糖体が、温和な条件で、しかも高収率で大量に製造され、安価に供給することが可能となる。また、本発明によるラクトシル配糖体および N—ァセチルラクトサミニル配糖体は、医学、生化学の研究に貢献するものである。

Claims

請求の範囲

1. J31, 4ダルコシル結合切断活性を有する酵素の存在下、次式：

L a cA-X + Y → L a c A- Y + X

(式中、 L a c Αはラクトースまたは Ν—ァセチルラクトサミンを、 Xは水素（H) 、糖質、複合糖質、またはフエノール性化合物を、 Yはアルコール性水酸基またはフノール性水酸基を有する化合物をそれぞれ表す。）で表わされる転移反応を用いることを特徴とする、ラクトシル配糖体または N— ァセチルラクトサミニル配糖体の製造方法。

2. 前記 Yがアルコール性水酸基を有する化合物である、請求項 1に記載の製造方法。

3. 前記アルコール性水酸基を有する化合物が、脂肪族アルコールまたは糖質である、請求項 2に記載の製造方法。

4. 前記アルコール性水酸基を有する化合物が、セリンまたはスレオニン残基を有するアミノ酸、ペプチドまたは蛋白質である、請求項 2に記載の製造方法。

5. Xが水素である、請求項 1ないし 4のいずれかの項に記載の製造方法。

6. 前記 /3_ 1， 4ダルコシル結合を切断する活性を有する酵素が、ェキソーセロビォヒドロラーゼ、 3— D—ダルコシダーゼ、および/またはセルラーゼである、請求項 1ないし 5のいずれかの項に記載の製造方法。

7 . 以下の構造式（ I ) で示される、グリセリル N—ァセチルラクトサミニド (0 - β -D-Galactopyranosyl- (1→4) -0- β - D- 2- Acetylamino_2-deoxy丄- Glucopyranosyl一 (1^→1J一 Lr丄 ycerin) 。

(I)