WO2001025469A2 - Procede de preparation de steroides modifies par fermentation de levures - Google Patents

Procede de preparation de steroides modifies par fermentation de levures Download PDF

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    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0077—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14) with a reduced iron-sulfur protein as one donor (1.14.15)
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • C12P33/06—Hydroxylating

Definitions

  • the present invention relates to a new process for the production of hydroxylated and / and acetylated steroids by fermentation of yeasts.
  • Steroids in particular steroids derived from cholesterol, are involved in many physiological processes, including the regulation of carbohydrate and cholesterol levels in the blood circulation, maintenance and development of muscle mass, development of the central nervous system. .
  • autoimmune diseases such as lupus
  • certain cancers for example breast cancer
  • cardiovascular diseases for example atherosclerosis
  • problems with steroid regulation are also suspected in the triggering of certain neurological diseases such as Parkinson's or Alzheimer's.
  • the methods according to the present invention can moreover be used in order to obtain steroids whose structure is also known but which, until now, were difficult to access by commercially acceptable methods.
  • the present invention is based on the demonstration of the fact that yeasts are capable of biologically converting, or bioconverting, precursor steroids by producing various hydroxylated and / or acetylated steroids, which may well understood, if necessary, then be modified to such particularly reactive functions.
  • the present invention relates in particular to a process for the production of hydroxylated and / or acetylated steroids comprising the steps according to which:
  • yeasts are grown on a medium comprising at least one precursor of such hydroxylated and / or acetylated steroids, then
  • the yeast naturally has an enzymatic activity of acetylation coded by the gene atfl, and an enzymatic activity of dehydrogenation coded by the gene ylll24w.
  • the enzyme coded by the atf2 gene (whose sequence and activity are described in Cauet et a 1., 1999, Eur. J. Biochem., 261, 317-324 and in French patent application FR2774393 or in l 'address http://genome-www.stanford.edu/ Saccharomyces) is acetylated coenzyme-A-pregnenolone-acetyl transferase, hereinafter called "APAT".
  • This enzyme allows the esterification, and more particularly the acetylation, of a steroid precursor such as for example a ⁇ 5 - or ⁇ 4 -3 ⁇ -hydroxysteroide, such as pregnenolone, 17-hydroxy pregnenolone, dehydroepiandrosterone (DHEA ), or 4-pregnene-3 ⁇ ol-20-one, for example.
  • a steroid precursor such as for example a ⁇ 5 - or ⁇ 4 -3 ⁇ -hydroxysteroide, such as pregnenolone, 17-hydroxy pregnenolone, dehydroepiandrosterone (DHEA ), or 4-pregnene-3 ⁇ ol-20-one, for example.
  • this esterification is carried out at the OH function in position 3 of a said precursor.
  • the expression of this activity in yeasts therefore makes it possible to obtain derivatives of acetylated steroid precursors, in whole or in part.
  • yeast strains lacking the APAT enzymatic activity such as in particular those described in Cauet et al. (1999, Eur. J. Biochem., 261, 317-324) or in French patent application FR2774393, the contents of which are incorporated by reference in the present application.
  • the yill24w gene was described during the yeast genome sequencing project, however its function had not yet been determined. It is located on chromosome IX, at coordinates 126204 to 127097. Its sequence is easily accessible to those skilled in the art in the Saccharomyces genome database located, for example, at http: // genome - www. Stanford. edu /.
  • the protein encoded by the yill24w gene has a dehydrogenase activity comparable to the activity of 17 ⁇ -hydroxysteroid dehydrogenase previously described in mammals (17BDH; Wu et al., 1993, J. Biol. Chem., 268, 12964-12969). This activity more specifically directs the reduction in alcohol of the ketone function located, naturally or after chemical modification, in position 17 of certain steroid precursors such as DHEA, for example.
  • the enzymatic activity of the protein encoded by the yill24w gene leads to the reduction of the ketone function of this steroid and to the formation of a 3, 17-diol, to which we will refer below. -after like "Diol".
  • the sequence of the yill24w gene being known, it is easy for a person skilled in the art, familiar with the techniques of mutagenesis in yeast, to produce a yeast strain in which the yill24w gene is inactivated. .
  • yeast strains for which the coding sequence of the yll124w gene is interrupted (knock-out technique) and the enzymatic activity suppressed are examples of yeast strains for which the coding sequence of the yll124w gene is interrupted (knock-out technique) and the enzymatic activity suppressed.
  • the Cyp7b gene is known, it has already been described by Stapleton et al., (1995, J. Biol. Chem., 270, 29739-29745) or Rose et al. (1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 4925-4930). Its sequence is described in particular in patent application WO9612820 and is accessible from the Institute for Fermentation Osaka (IFO) under the access code IFO 2031. The contents of these documents are incorporated by reference into the present application. However, there was nothing to suggest that this mammalian gene could be expressed, and more particularly expressed in its active form, by yeast.
  • the Cyp7b gene is a gene isolated from mammals, in particular rats, mice and humans, in which the enzyme coded by this gene belongs to the family of enzymes commonly known as “cytochromes P450 ", the active form of which contains Theme (Poulos, 1988, Pharm. Res., 5, 67-75) and which are involved in the metabolic pathways of steroids (see Rose et al, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 4925-4930).
  • the protein Cyp7b is a hydroxylase, and more particularly a 7-hydroxylase making it possible to obtain 7-hydroxylated steroids, and more particularly 7 ⁇ -hydroxylated steroids. Nevertheless, it is possible to envisage the particular case for which the steroid substrate is an equivalent of the known steroid compounds, in which by modification of the structure of one of the cycles the "naturally position 7" is transformed into a "position equivalent 6 ". In this specific case, the Cyp7b protein would make it possible to obtain 6-hydroxylated steroids.
  • the action on the compound “Diol” described above of the enzyme Cyp7b expressed in the yeasts used allows the formation of a 3, 7, 17-triol, hereinafter called “ Triol ”.
  • Triol a 3, 7, 17-triol
  • the 3OH function of said diol or of said triol is acetylated, one will speak respectively of “acetyl-diol” or of “acetyl-triol”.
  • the nature of the hydroxylated and / or acetylated steroids produced according to the process of the invention therefore depends on the possibility for the yeast to express or not the acetylation functions encoded by the al fi gene, and / or dehydrogenation, encoded by the yill24w gene, in combination with the possibility for said yeast to express the hydroxylation enzyme Cyp7b.
  • the compounds which it is desired to produce according to the present invention will be hydroxylated compounds, insofar as, for a large number of steroids, it has been shown that the hydroxylated derivative is more active than the acetylated derivative.
  • the acetylated function is capable of being progressively hydrolyzed in vivo and can therefore constitute a delayed form of the hydroxylated form (that is to say that the compound as administered to the patient n is not the active form but that this active form is obtained in vivo, after natural metabolization of the acetylated compound).
  • the present invention relates just as well to a process for producing steroids comprising free OH functions, as protected by an acetylated radical.
  • the activity APAT of the yeast used in the process of the invention is low or zero. There are different possibilities for doing this.
  • yeast strains in which the atfi gene is naturally absent or, at the very least, is little or not expressed.
  • Nagasawa et al. Biosci. Biotechnol. Biochem. 62, 1852-1857, 1998) mention that a strain IFO2031 (Sacccharomyces bayanus) is free from the atfi gene.
  • the Applicant has highlighted the fact that the strains possessing atfi + activity carry out more limited acetylation reactions under oxidative conditions, in particular by growth on non-fermentable carbon sources, such as for example glycerol or l 'acetate.
  • yeast strains having, naturally or after genetic manipulation, deacetylase activity This activity has been described as acting on esters of short-chain alcohols (rEF). The use of such a system would make it possible to deacetylate the products obtained by the APAT activity.
  • Atfi ' strains that is to say in which the gene is not expressed or in which the product of this gene is inactive. More particularly, a person skilled in the art is capable, by routine experiments, of preparing yeast strains lacking the APAT enzymatic activity, such as in particular those described in Cauet et al. (1999, Eur. J. Biochem., 261, 317-324) or in French patent application FR2774393, the contents of which are incorporated by reference in the present application.
  • the activity of the atfi gene may be advantageous to induce the activity of the atfi gene only at a certain point in the process of the invention, for example sequentially with the expression of the Cyp7b gene.
  • certain promoters have been described in yeast, which are active only in the presence of external stimulation (Guarente et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci., 79, 7410-7414) or when the yeasts are in stationary phase (Panaretou et al., 1992, Eur. J. Biochem., 206, 635-640).
  • the use of an atfi gene placed under the control of such a promoter therefore makes it possible to control the APAT activity in yeast containing such a recombinant gene.
  • yeast used in the process of the invention leads to the formation of reduced compounds which can provide value. added to the unmodified product.
  • culture conditions in an oxidative medium or the use of yeast strains in which the yill24w gene has been inactivated it is possible to use culture conditions in an oxidative medium or the use of yeast strains in which the yill24w gene has been inactivated.
  • yeast strains capable of overexpressing the yill24w gene or of expressing 17BDH activity at a privileged time. bioconversion, for example by the use of strains for which the yill24w gene is placed under the control of an inducible promoter such as those described above.
  • Methylated steroid derivatives can thus be obtained when the gene in question codes for an enzyme with methylase activity.
  • steroids or steroid precursors having a 7-hydroxylable position that is to say accessible and capable of being hydroxylated by an enzyme having hydroxylase activity.
  • hydroxylable positions consist in particular of a carbon, a sulfur, a nitrogen.
  • steroid precursor substrates which can be used in the present invention, mention should be made more particularly of 3-hydroxylated steroids and in particular 3- ⁇ -hydroxylated steroids, or having a 3-keto function.
  • a precursor selected from the group consisting of steroids with structure of androstanic, androstenic, pregnanic, pregnenic, cholanic type, cholenic, cholesteric, ergostanic, ergostenic, testosteronic or stigmamic for example DHEA, testosterone, pregnenolone, pregnanolone, 25-hydroxy-cholesterol, 5- ⁇ -androstane-3 ⁇ -17 ⁇ -diol, or 5- ⁇ -androstene-3 ⁇ -17 ⁇ - diol.
  • these compounds can also be obtained in acetylated form.
  • the ketone function 17 of the precursors having one can also undergo a reduction, as has been described previously.
  • the invention can be implemented using yeasts of different genera which can be, without this list being exhaustive, selected from Candida, Yarrovia, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces, Torulopsis, Pichia, Hansenula.
  • a preferred embodiment of the invention will use yeasts of the genus Saccharomyces, for example S. cerevisiae.
  • the additional culture conditions are the usual conditions but can be optimized.
  • the amounts of precursor added to the culture medium in the context of the process of the invention will be chosen so as to obtain a concentration in the bioconversion medium of between 10 and 200 ⁇ g / ml, preferably between 20 and 100 ⁇ g / ml.
  • the yeasts used in the context of the invention are strains transformed so as to express the product of the Cyp7b gene. This means that said strains have been previously modified so as to introduce the Cyp7b gene into yeasts and allow its expression. With regard to the transformation of yeasts in order to express the Cyp7b gene, it is possible to introduce this gene either into the yeast genome, or so that it has an extrachromosomal localization. For these effects, systems of the plasmid type, circular or linear, can be used.
  • plasmids comprising origins of yeast replication
  • plasmids derived from the 2 ⁇ plasmid of Saccharomyces which will preferably include, as selection marker, either a selection marker for antibiotic resistance, for example the G418R gene, or at least one auxotrophy marker such as URA3, URA3d LEU2.
  • selection marker either a selection marker for antibiotic resistance, for example the G418R gene, or at least one auxotrophy marker such as URA3, URA3d LEU2.
  • the Cyp7b gene its nucleic sequence (Institute for Fermentation Osaka (IFO), access code IFO 2031 or SEQ ID NO1) can be cloned under the control of a yeast promoter such as CYCl (Degryse et al . Yeast (1995), ⁇ , pp. 629-640), TEF1 (Cotrelle et al., 1985, J. Biol. Chem., 260, 3090-3096) or TDH3 (Bitter and Egan, 1984, Gene, 32, 263-274) in order to allow its expression in transformed yeasts.
  • the method of the invention further comprises a step in which the steroids produced are isolated from the medium. Such a step is not a crucial element of the said process and can use various techniques generally used in the field of steroid purification (chromatography, HPLC, etc.).
  • the invention further relates to the new hydroxylated steroids which can be or are obtained by the process described above as well as their use in the context of therapeutic or prophylactic applications, in particular as neurosteroids, for the preparation of a drug intended for the treatment of the human or animal body.
  • compositions in particular pharmaceuticals, containing such new hydroxylated steroids.
  • These pharmaceutical compositions also contain one or more pharmaceutically acceptable carriers.
  • a support is preferably isotonic, hypotonic or weakly hypertonic and has a relatively low ionic strength, such as by example a sucrose solution.
  • a support can contain any solvent, or aqueous or partially aqueous liquid such as sterile non-pyrogenic water.
  • the pH of the formulation is further adjusted and buffered to meet the requirements for in vivo use.
  • the formulation may also include a pharmaceutically acceptable diluent, adjuvant or excipient, as well as solubilizers, stabilizers, preservatives.
  • an aqueous, non-aqueous or isotonic solution formulation is preferred. It can be presented as a single dose or in multidose in liquid or dry form (powder, lyophilisate, etc.) capable of being reconstituted extemporaneously with an appropriate diluent.
  • the cyp7b cDNA is amplified using the oligo of sequence SEQ ID No. 1, thus introducing a SalI site (underlined) and a sequence of 4A before the ATG codon and a second primer of sequence SEQ ID No. 2 introducing a Mlul site after the stop codon.
  • the first PCR product is subcloned after a Sali Mlul restriction in the Sali Mlul site of the vector equivalent to pTG10164 (Degryse et al., Yeast (1995), ⁇ , pp. 629-640). This leads to a vector pTG14010 containing the Cyp7b gene under the control of the CYCl promoter (Degryse et al.
  • the Notl expression block containing the promoter CYCl (respectively, TEF1) was introduced into the plasmid based on the 2 micron pTG 10042 (respectively, pTG10092) containing the gene URA3d to give the plasmid pTG14012 (respectively, pTG14014).
  • the plasmid pTG14015 was constructed in the same way as pTG14014, from pTG 10220, which carries the URA3 gene, as a selection gene.
  • the URA3d gene was chosen because it leads to selection for a very large number of copies in minimum medium.
  • the URA3 gene produces an average number of copies, and the selection pressure is reasonable in minimum medium.
  • the plasmids pTG14012, pTG14014 and pTG14015 were introduced by transformation into the strain FY1679-28c, the transformants selected on an appropriate minimal medium and then stored.
  • All vectors contain the replicon of E. coli and the origin of replication of the 2 ⁇ yeast plasmid.
  • the yeasts used are:
  • FY1679-28c (Mata ura3-52 trpl - 63 leu2 - 1 his3- 200 GAL fenl), a segregating Mata from FY1679.
  • TGY202 and TGY206 are TRP1 derivatives obtained after transformation of the strains, respectively, F1679-28c and TGY186.
  • TGY156 part of the atfi gene was inactivated and replaced by URA3.
  • TGY186 is a derivative of TGY156 in which the URA3 gene at the atfi locus has been replaced by TEF1:: PGK1 in the form of an expression block.
  • the strains are transformed using the lithium acetate procedure (Ito, et al., 1983, J. Bact. 153, 163-168) or by electroporation (Nacken et al., 1994, Nucleic Acids Res, 22, 1509-10) and selected on a solid YNBG medium containing the appropriate amino acids.
  • the cells are grown on a solid YNBG medium supplemented with the appropriate amino acids. Preculture is carried out for 24 hours at
  • the minimal medium (YNB and the carbon source) is supplemented with 0.5% casamino acids (in addition to the nutrients necessary for the strain).
  • the glucose is also present at 0.1% to start the culture.
  • An aliquot of the preculture is used to inoculate 10 ml of culture medium with an optical density at 600 nm of 0.1 and the DHEA is dissolved in a tergitol / ethanol mixture 50/50 at 10 mg / ml (or added at the time indicated). At different time intervals an aliquot of 500 ⁇ l of the culture medium is taken and the steroids are extracted in order to measure them.
  • the different culture media which have been used are YPG, YNBD (2% glucose) and YNBG (2% glycerol, 0.1% glucose).
  • the yil! 24w gene was amplified by PCR using the sequence primers
  • Sali and Mlul The amplification product after restriction by the enzymes SalI and Mlul was subcloned into the yeast vector pTG 10851 to give the vector pTG 14491.
  • the yill24w gene is thus under the control of the yeast promoter TEF1 and the terminator of PGK1 yeast.
  • the origin of replication is 2-micron and the selection marker is the G418 resistance gene.
  • the values are expressed in ⁇ g / ml of the steroid extracted from the culture medium
  • Plasmid pTG 14491 was restricted by PstI and Ncol (unique restriction sites in the coding sequence of yill24w) and the sticky ends were blunted by T4 DNA polymerase.
  • the URA3 gene is then cloned into this plasmid, so that the coding sequence of yill24w is interrupted by this URA3 selection marker.
  • the resulting plasmid pTG14584 contains the URA3 gene in the same translation direction as the TIL124w gene.
  • the released fragment containing yill24w interrupted by URA3 is introduced into the strains TGY202 and TGY206, and the recombinant colonies are selected on YNBD + LH, the selection being for prototrophy for uracil.
  • the TGY279 and TGY282 strains are thus obtained respectively.
  • the TGY206 and TGY282 strains are incubated in the presence of DHEA or acetyl-DHEA in the YNBD medium for 24 hours and the products obtained are measured.
  • TGY282 strain is no longer capable of reducing DHEA or acetyl-DHEA into resp. diol or acetyl diol. This confirms the inactivation of the yill24w gene, as well as its 17-dehydrogenase function.
  • yeast has an intrinsic deacetylation activity from acetyl-DHEA to DHEA.
  • the identification of the responsible gene and its over-expression in relation to the APAT activity will make it possible to produce steroids without using mutants of the atfi gene.
  • EXAMPLE 6 Implementation of the method according to the present invention to obtain 7-hydroxy-DHEA from DHEA, using the strain TGY202, transformed with the expression plasmids of cyp7b.
  • the TGY202 strain transformed with the plasmids pTG14012, pTG14014 or pTG14015 is incubated in the presence of DHEA (40 ⁇ g / ml) in YPG medium, for 48 hours, and the presence of 7-hydroxy-DHEA (7 ⁇ HO-DHEA) is evaluated in the medium.
  • DHEA 40 ⁇ g / ml
  • any potential substrate for Cyp7b can be hydroxylated in vivo by a yeast strain expressing cyp7b.
  • EXAMPLE 7 Increase in the production of 7 ⁇ HO-DHEA by bioconversion, by modulating the fermentation conditions TGY202-pTG14012 and TGY202-pTG14014 are incubated in the media
  • YNBD and YNBG for 48 hours, in the presence of DHEA (40 ⁇ g / ml) added to the medium immediately after inoculation, or after 8 hours of incubation.
  • EXAMPLE 8 Preferential production of 7 ⁇ HO-DHEA in the absence of acetylated derivatives by the use of KO strains for the APAT activity
  • TGY206-pTG14014 is incubated in YNBD in the presence of DHEA (lOO ⁇ g / ml) for 49 hours. Analysis of the products obtained indicates that 100% of 7 ⁇ HO-DHEA is recovered (91.7 ⁇ g / ml).
  • the TGY202 and TGY279 strains were incubated with DHEA for 24 hours in the YPD culture medium, and the steroids produced were measured.
  • the TGY279 and TGY282 strains are transformed with the plasmid pTG14011 and selected on YPG + G418.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé de production de stéroïde hydroxylé et/ou acétylé comprenant les étapes selon lesquelles: on cultive des levures sur un milieu comprenant au moins un précurseur de tels stéroïdes hydroxylés et/ou acétylés, puis on isole les stéroïdes hydroxylés et/ou acétylés du milieu après bioconversion, ledit procédé étant caractérisé en ce que lesdites levures sont des levures transformées de façon à exprimer le produit du gène Cyp7b. L'invention concerne aussi les souches de levures modifiées.

Description

PROCEDE DE PREPARATION DE STEROÏDES MODIFIES PAR FERMENTATION DE LEVURES La présente invention concerne un nouveau procédé de production de stéroïdes hydroxylés ou/et acétylés par fermentation de levures. Les stéroïdes, notamment les stéroïdes dérivés du cholestérol, sont impliqués dans de nombreux processus physiologiques parmi lesquels on peut citer la régulation des taux de glucides et cholestérol dans la circulation sanguine, le maintien et développement de la masse musculaire, le développement du système nerveux central. Parmi les inconvénients observés en cas de dérèglement des taux de stéroïdes circulants, on peut citer le déclenchement éventuel de maladies auto-immunes, telles le lupus, de certains cancers, par exemple le cancer du sein, de maladies cardiovasculaires, par exemple l'athérosclérose. Des problèmes de régulation de stéroïdes sont également soupçonnés dans le cas du déclenchement de certaines maladies neurologiques tels les maladies de Parkinson ou d'Alzheimer. Les études réalisées, notamment par le Professeur Baulieu, sur la déhydroépiandrostérone ou DHEA ont montré l'importance des stéroïdes, notamment des neurostéroïdes, dans le développement du système nerveux central mais également l'impact possible de ce type de stéroïdes dans tous les processus connexes, y compris le phénomène de vieillissement (Baulieu et Robel , 1998, Proc. Natl. Acad. Sci., 95, 4089-4091).
Il est donc particulièrement intéressant de pouvoir disposer de nouveaux dérivés stéroïdiques, notamment de la famille des neurostéroïdes, qui sont impliqués dans un très grand nombre de processus physiologiques.
C'est précisément l'un des objets de la présente invention, à savoir la mise au point d'un procédé permettant l'accès à de nouveaux dérivés stéroïdiques, notamment des neurostéroïdes, et ce par des méthodes de fermentation qui autorisent des spécificités élevées, de même que des rendements de production importants.
Les procédés selon la présente invention peuvent d'ailleurs être utilisés afin d'obtenir des stéroïdes dont la structure est également connue mais qui, jusqu'ici, étaient difficilement accessibles par des procédés commercialement acceptables.
La présente invention repose sur la mise en évidence du fait que les levures sont capables de convertir biologiquement, ou bioconvertir, des stéroïdes précurseurs en produisant des stéroïdes hydroxylés et/ou acétylés divers, lesquels peuvent bien entendu, si cela est nécessaire, être ensuite modifiés sur de telles fonctions particulièrement réactives.
C'est pourquoi la présente invention concerne notamment un procédé de production de stéroïdes hydroxylés et/ou acétylés comprenant les étapes selon lesquelles :
• on cultive des levures sur un milieu comprenant au moins un précurseur de tels stéroïdes hydroxylés et/ou acétylés, puis
• on isole les stéroïdes hydroxylés et/ou acétylés du milieu après bioconversion, ledit procédé étant caractérisé en ce que lesdites levures sont des levures transformées de façon à exprimer le produit du gène Cyp7b.
La levure possède naturellement une activité enzymatique d'acétylation codée par le gène atfl, et une activité enzymatique de déshydrogénation codée par le gène ylll24w. L'enzyme codée par le gène atf2 (dont la séquence et l'activité sont décrites dans Cauet et a 1., 1999, Eur. J. Biochem., 261, 317-324 et dans la demande de brevet français FR2774393 ou à l'adresse http://genome-www.stanford.edu/ Saccharomyces) est l' acétylé coenzyme-A-pregnénolone-acétyle transférase, ci-après dénommée « APAT ». Cette enzyme permet l'estérification, et plus particulièrement l'acétylation, d'un précurseur stéroïdien tel que par exemple un Δ5 - ou Δ4 -3β-hydroxystéroide, tel que la pregnénolone, la 17-hydroxy pregnénolone, la déhydroépiandrostérone (DHEA), ou la 4-pregnene-3βol-20-one, par exemple. De manière préférée, cette estérification est réalisée au niveau de la fonction OH en position 3 d'undit précurseur. L'expression de cette activité dans les levures permet par conséquent l'obtention de dérivés de précurseurs steroïdiens acétylés, en tout ou en partie. De même il est possible de protéger chimiquement tout ou partie des fonctions OH du précurseur incorporé au milieu de culture de manière à ce que la réaction d'acétylation ne puisse pas se produire sur tout ou partie desdites fonctions. De telles méthodes de protection sont bien connues et consistent par exemple en l'addition de silane, en la modification en fonction ester,...
Toutefois, selon un mode de réalisation particulier de la présente invention décrit ci-après, il est également possible d'utiliser des souches de levure dépourvue de l'activité enzymatique APAT, telles que notamment celles décrites dans Cauet et al. (1999, Eur. J. Biochem., 261, 317-324) ou dans la demande de brevet français FR2774393, dont les contenus sont incorporés par référence dans la présente demande. Le gène yill24w a été décrit lors du projet de séquençage du génome de la levure, toutefois sa fonction n'avait alors pas été déterminée. Il est localisé sur le chromosome IX, aux coordonnées 126204 à 127097. Sa séquence est aisément accessible à l'homme de l'art dans la base de données du génome de Saccharomyces située, par exemple, à l'adresse http ://genome- www. Stanford. edu/. Dans le cadre des travaux de la présente invention, il a été montré que la protéine codée par le gène yill24w possède une activité déshydrogénase comparable à l'activité de la 17β- hydroxystéroïde déshydrogénase précédemment décrite chez les mammifères (17BDH ; Wu et al., 1993, J. Biol. Chem., 268, 12964-12969). Cette activité dirige plus spécifiquement la réduction en alcool de la fonction cétone située, naturellement ou après modification chimique, en position 17 de certains précurseurs steroïdiens tels que la DHEA, par exemple. Plus particulièrement, dans le cas du substrat DHEA, l'activité enzymatique de la protéine codée par le gène yill24w conduit à la réduction de la fonction cétone de ce stéroïde et à la formation d'un 3, 17-diol, auquel on référera ci-après comme « Diol ». En outre, lorsque le cas l'impose, la séquence du gène yill24w étant connue, il est aisé à l'homme du métier, familier des techniques de mutagénèse dans la levure, de produire une souche de levure dans lesquelles le gène yill24w est inactivé. Par exemple, conformément aux exemples qui suivent, il est possible d'obtenir des souches de levure pour lesquelles la séquence codante du gène ylll24w est interrompue (technique Knock-out) et l'activité enzymatique supprimée.
Le gène Cyp7b est connu, il a déjà été décrit par Stapleton et al., (1995, J. Biol. Chem., 270, 29739-29745) ou Rose et al. (1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 4925- 4930). Sa séquence est notamment décrite dans la demande de brevet WO9612820 et est accessible auprès de Institute for Fermentation Osaka (IFO) sous le code d'accès IFO 2031. Les contenus de ces documents sont incorporés par référence à la présente demande. Toutefois, rien ne laissait supposer que ce gène de mammifère pouvait être exprimé, et plus particulièrement exprimé sous sa forme active, par une levure. En outre, rien ne permettait d'envisager qu'une telle levure serait capable d'utiliser un stéroïde comme substrat. En effet, le gène Cyp7b est un gène isolé chez les mammifères, notamment le rat, la souris et l'homme, chez lesquels l'enzyme codée par ce gène appartient à la famille des enzymes communément appelées « cytochromes P450 », dont la forme active renferme de Thème (Poulos, 1988, Pharm. Res., 5, 67-75) et qui sont impliquées dans les voies métaboliques des stéroïdes (voir Rose et al, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 4925-4930). La protéine Cyp7b est une hydroxylase , et plus particulièrement une 7-hydroxylase permettant d'obtenir des stéroïdes 7-hydroxylés, et plus particulièrement des stéroïdes 7α-hydroxylés. Néanmoins, il est possible d'envisager le cas particulier pour lequel le substrat stéroïdien est un équivalent des composés steroïdiens connus, dans lequel par modification de la structure de l'un des cycles la « position naturellement 7 » soit transformée en un « équivalent position 6 ». Dans ce cas précis, la protéine Cyp7b permettrait d'obtenir des stéroïdes 6-hydroxylés.
Selon un cas préféré de l'invention, l'action sur le composé « Diol » décrit plus haut de l'enzyme Cyp7b exprimée dans les levures utilisées permet la formation d'un 3, 7, 17- triol, ci-après dénommé « Triol ». En outre, lorsque la fonction 3OH dudit diol ou dudit triol est acétylée, on parlera respectivement d'« acétyl-diol » ou d'« acétyl-triol ».
La nature des stéroïdes hydroxylés et/ou acétylés produits selon le procédé de l'invention dépend par conséquent de la possibilité pour la levure d'exprimer ou non les fonctions d'acétylation codée par le gène al fi, et/ou de déshydrogénation, codée par le gène yill24w , en combinaison avec la possibilité pour ladite levure d'exprimer l'enzyme d'hydroxylation Cyp7b.
De préférence, les composés que l'on souhaitera produire selon la présente invention seront des composés hydroxylés, dans la mesure où, pour un grand nombre de stéroïdes, il a été montré que le dérivé hydroxylé était plus actif que le dérivé acétylé. Néanmoins, à cet égard, il convient de noter que la fonction acétylé est susceptible d'être progressivement hydrolysée in vivo et peut donc constituer une forme retard de la forme hydroxylée (c'est à dire que le composé tel qu'administré au patient n'est pas la forme active mais que cette forme active est obtenue in vivo, après métabolisation naturelle du composé acétylé). C'est pourquoi la présente invention concerne tout aussi bien un procédé de production de stéroïdes comportant des fonctions OH libres, que protégées par un radical acétylé.
En tout état de cause, selon le mode de réalisation préféré pour lequel on cherche à produire des dérivés steroïdiens hydroxylés, il est souhaitable que l'activité APAT de la levure mise en œuvre dans le procédé de l'invention soit faible ou nulle. Pour ce faire, il existe différentes possibilités .
Selon une première variante, il est possible d'utiliser des souches de levures dans lesquelles le gène atfi est naturellement absent ou, à tout le moins, est peu ou non exprimé. Ainsi, Nagasawa et al. (Biosci. Biotechnol. Biochem. 62, 1852-1857, 1998) mentionnent qu'une souche IFO2031 (Sacccharomyces bayanus) est exempte du gène atfi.
Selon une autre variante, il est possible d'utiliser des conditions de culture dans lesquelles la capacité des levures à acétyler le ou les précurseurs steroïdiens présents dans le milieu de culture est fortement réduite, voire éliminée. En particulier, la demanderesse a mis en évidence le fait que les souches possédant l'activité atfi+ effectuent des réactions d'acétylation plus limitées en conditions oxydatives, notamment par croissance sur des sources de carbone non fermentescibles, telles que par exemple le glycérol ou l'acétate. Selon une troisième variante, il est également possible d'utiliser des souches de levure présentant, naturellement ou après manipulation génétique, une activité désacétylase. Cette activité a été décrite comme agissant sur les esters d'alcools à chaîne courte (rEF). L'utilisation d'un tel système permettrait de désacétyler les produits obtenus par l'activité APAT. Enfin, il est possible d'utiliser des souches atfi', c'est-à-dire dans lesquelles le gène ne s'exprime pas ou dans lesquelles le produit de ce gène est inactif. Plus particulièrement, l'homme du métier est capable, par des expériences de routine, de préparer des souches de levure dépourvues de l'activité enzymatique APAT, telles que notamment celles décrites dans Cauet et a l. ( 1999, Eur. J. Biochem., 261, 317-324) ou dans la demande de brevet français FR2774393 dont les contenus sont incorporés par référence dans la présente demande.
De même, il peut être intéressant de n'induire l'activité du gène atfi qu'à un certain moment du procédé de l'invention, par exemple séquentiellement à l'expression du gène Cyp7b. Ainsi, certains promoteurs ont été décrits chez la levure, qui ne sont actifs qu'en présence d'une stimulation extérieure (Guarente et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci., 79, 7410-7414) ou lorsque les levures sont en phase stationnaire (Panaretou et al., 1992, Eur. J. Biochem., 206, 635-640). L'utilisation d'un gène atfi placé sous contrôle d'un tel promoteur permet par conséquent de contrôler l'activité APAT chez la levure renfermant un tel gène recombiné.
De la même façon, la présence chez la levure utilisée dans le procédé de l'invention d'une activité endogène similaire à l'activité 17BDH des mammifères (codée par le gène yill24w) mène à la formation de composés réduits qui peuvent apporter une valeur ajoutée par rapport au produit non modifié. Inversement, il peut également être souhaitable de disposer de souches de levure ou des conditions de culture pour lesquelles l'activité du gène yill24w est réduite ou supprimée. Ainsi, il est possible de faire appel à des conditions de culture en milieu oxydatif ou à l'utilisation de souches de levures dans lesquelles le gène yill24w a été inactivé.
Bien entendu, selon des cas préférés de l'invention pour lesquels il est intéressant d'obtenir des composés réduits, il est possible de disposer de souches de levure capables de surexprimer le gène yill24w ou d'exprimer l'activité 17BDH à un moment privilégié de la bioconversion, par exemple par l'utilisation de souches pour lesquelles le gène yill24w est placé sous le contrôle d'un promoteur inductible tel que ceux décrits plus haut.
Il est bien entendu possible de modifier en outre la fonction acétylé obtenue après l'action de l'activité APAT lors du procédé de l'invention mettant en œuvre une souche de levure atfi+, par exemple en transformant ladite souche de levure afin qu'elle exprime en outre une activité enzymatique réagissant sur ce substrat. On peut ainsi obtenir des dérivés steroïdiens méthylés, lorsque le gène en question code pour une enzyme à activité méthylase.
Parmi les substrats précurseurs de stéroïdes utilisables dans la présente invention, il faut citer les stéroïdes ou précurseurs de stéroïdes possédant une position 7- hydroxylable, c'est à dire accessible et susceptible d'être hydroxylée par une enzyme présentant une activité hydroxylase. Des exemples de telles positions hydroxylables consistent notamment en un carbone, un soufre, un azote.
Parmi les substrats précurseurs de stéroïdes utilisables dans la présente invention, il faut citer plus particulièrement les stéroïdes 3 -hydroxylés et notamment les stéroïdes 3-β-hydroxylés, ou possédant une fonction 3-céto.
Plus particulièrement, sans que cette liste ne soit limitative, dans cette invention on considérera un précurseur sélectionné parmi le groupe consistant en les stéroïdes à structure de type androstanique, androsténique, prégnanique, prégnénique, cholanique, cholénique, cholestérique, ergostanique, ergostènique, testostéronique ou stigmamique, par exemple la DHEA, la testostérone, la pregnénolone, la prégnanolone, le 25- hydroxy-cholestérol, le 5-α-androstane-3β-17β-diol, ou le 5-α-androstène-3β-17β- diol. Bien entendu, ces composés peuvent également être obtenus sous forme acétylée. La fonction cétone 17 des précurseurs en possédant une peut aussi subir une réduction, comme cela a été décrit précédemment.
L'invention peut être mise en œuvre en utilisant des levures de différents genres qui peuvent être, sans que cette liste ne soit limitative, sélectionnés parmi Candida, Yarrovia, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces, Torulopsis, Pichia, Hansenula.
Une réalisation préférée de l'invention mettra en œuvre des levures du genre Saccharomyces, par exemple S. cerevisiae.
Les conditions dans lesquelles ces levures peuvent être cultivées sont connues de l'homme du métier, il suffit d'ajouter au milieu de culture un substrat précurseur des stéroïdes souhaités pour mettre en œuvre le procédé selon la présente invention.
Les exemples proposés ci-dessous montrent que certains milieux sont plus favorables que d'autres à la production de stéroïdes hydroxylés, il s'agit là d'un paramètre qui peut être aisément optimisé par l'homme du métier. Parmi les milieux, il faut citer : YPD, YPG, YNBD et YNBG contenant notamment du glycérol et/ou du glucose (voir également Sherman, 1991, Methods Enzymol., 194, 3-21). De même, il est possible d'adapter la composition du milieu en cours de procédé ou de sélectionner le milieu en fonction du promoteur sélectionné pour diriger l'expression du gène Cyp7b (par exemple, le milieu minimum YNBD sera choisi dans le cas du promoteur CYCl et le milieu riche YPG sera sélectionné dans le cas du promoteur TEF1).
Les conditions additionnelles de culture sont les conditions habituelles mais peuvent être optimisées.
Les quantités de précurseur ajoutées au milieu de culture dans le cadre du procédé de l'invention seront choisies de manière à obtenir une concentration dans le milieu de bioconversion comprise entre 10 et 200 μg/ml, préférentiellement comprise entre 20 et 100 μg/ml. Les levures utilisées dans le cadre de l'invention sont des souches transformées de façon à exprimer le produit du gène Cyp7b. Cela signifie que lesdites souches ont été préalablement modifiées de façon à introduire le gène Cyp7b dans les levures et permettre son expression. Pour ce qui concerne la transformation des levures afin d'exprimer le gène Cyp7b, il est possible introduire ce gène soit dans le génome de la levure, soit de façon à ce qu'il ait une localisation extrachromosomale. A ces effets, on peut utiliser des systèmes de type plasmidique, circulaires ou linéaires. Parmi les plasmides comportant des origines de réplication de la levure, on peut citer les plasmides dérivés du plasmide 2μ de Saccharomyces, lequel comportera de préférence comme marqueur de sélection, soit un marqueur de sélection de résistance aux antibiotiques, par exemple le gène G418R, soit au moins un marqueur d'auxotrophie tel que URA3, URA3d LEU2. De telles techniques de transformation sont bien décrites dans la littérature et ne présentent pas de difficulté particulière.
Pour ce qui concerne le gène Cyp7b, sa séquence nucléique (Institute for Fermentation Osaka (IFO), code d'accès IFO 2031 ou SEQ ID NOl) peut être clonée sous le contrôle d'un promoteur de levure tel que CYCl (Degryse et al. Yeast (1995), ϋ, pp. 629-640 ), TEF1 (Cotrelle et al., 1985, J. Biol. Chem., 260, 3090-3096) ou TDH3 (Bitter and Egan, 1984, Gène, 32, 263-274) afin de permettre son expression dans les levures transformées. Le procédé de l'invention comporte en outre une étape selon laquelle les stéroïdes produits sont isolés du milieu. Une telle étape ne constitue pas un élément crucial dudit procédé et peut mettre en œuvre différentes techniques généralement utilisées dans le domaine de la purification des stéroïdes (chromatographie, HPLC,...).
L'invention concerne, en outre, les nouveaux stéroïdes hydroxylés qui peuvent être ou qui sont obtenus par le procédé décrit précédemment ainsi que leur utilisation dans le cadre d'applications thérapeutique ou prophylactique, notamment à titre de neurostéroïdes, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement du corps humain ou animal.
Elle concerne également des compositions, notamment pharmaceutiques, refermant de tels nouveaux stéroïdes hydroxylés. Ces compositions pharmaceutiques renferment en outre un ou plusieurs support acceptable d'un point de vue pharmaceutique. Un tel support est préférentiellement isotonique, hypotonique ou faiblement hypertonique et présente une force ionique relativement faible, tel que par exemple une solution de sucrose. Par ailleurs, un tel support peut renfermer tout solvant, ou liquide aqueux ou partiellement aqueux tel que de l'eau stérile non pyrogène. Le pH de la formulation est en outre ajusté et tamponné afin de répondre aux exigences d'utilisation in vivo. La formulation peut également inclure un diluant, un adjuvant ou un excipient acceptable d'un point de vue pharmaceutique, de même que des agents de solubilisation, de stabilisation, de préservation. Pour une administration injectable, on préfère une formulation en solution aqueuse, non- aqueuse ou isotonique. Elle peut être présentée en dose unique ou en multidose sous forme liquide ou sèche (poudre, lyophilisât...) susceptible d'être reconstituée de manière extemporanée par un diluant approprié.
Les exemples ci-après permettront de comprendre les méthodes de construction des vecteurs et de transformation des levures mais il s'agit là, pour l'essentiel, de technologies qui sont déjà connues de l'homme du métier. Les vecteurs sont décrits dans Degryse et al. (Yeast (1995), ϋ, pp. 629-640 ). II est entendu que les résultats ci dessous ne sont donnés qu'à titre d'exemples.
Ainsi, les taux obtenus, par exemple dans les manipulations de bioconversion, ne sont donnés qu'à titre indicatif, et ne représentent aucunement une revendication de la capacité maximale du système en conditions optimisées.
EXEMPLE 1 : Construction des vecteurs d'expression pour l'ADNc de cyp7b
L'ADNc de cyp7b est amplifié en utilisant l'oligo de séquence SEQ ID N° 1, en introduisant ainsi un site Sali (souligné) et une séquence de 4A avant le codon ATG et une seconde amorce de séquence SEQ ID N° 2 introduisant un site Mlul après le codon stop. Le premier produit de PCR est sous-cloné après une restriction Sali Mlul dans le site Sali Mlul du vecteur équivalent à pTG10164 ( Degryse et al., Yeast (1995), ϋ, pp. 629-640 ). Ceci conduit à un vecteur pTG14010 contenant le gène Cyp7b sous contrôle du promoteur CYCl (Degryse et al. Yeast (1995), JJ_, pp. 629-640) dans un environnement 2μ et avec le gène G418R (neo). Ensuite, le promoteur TEF1 (Cotrelle et al., 1985, J. Biol. Chem., 260, 3090-
3096) est clone par échange Clal Sali, ce qui conduit au vecteur pTG1401 1, les plasmides correspondants sont décrits dans l'article de Yeast pré- cité. Par la méthode de recombinaison déjà décrite dans l'article de Yeast, le bloc d'expression Notl contenant le promoteur CYCl (respectivement, TEF1) a été introduit dans le plasmide basé sur le 2 micron pTG 10042 (respectivement, pTG10092) contenant le gène URA3d pour donner le plasmide pTG14012 (respectivement, pTG14014). Le plasmide pTG14015 a été construit de la même façon que pTG14014, à partir de pTG 10220, qui porte le gène URA3, comme gène de sélection.
Le gène URA3d a été choisi parce qu'il conduit à une sélection pour un très grand nombre de copies en milieu minimum. Le gène URA3 produit un nombre moyen de copies, et la pression de sélection est raisonnable en milieu minimum.
Les plasmides pTG14012, pTG14014 et pTG14015 ont été introduits par transformation dans la souche FY1679-28c, les transformants sélectionnés sur un milieu minimal approprié puis stockés.
On trouvera ci-après un résumé des vecteurs d'expression pour cyp7b :
Figure imgf000011_0001
Tous les vecteurs contiennent le réplicon d'E. coli et l'origine de réplication du plasmide 2μ de levure.
Les levures utilisées sont :
FY1679-28c (Mata ura3-52 trpl - 63 leu2 - 1 his3- 200 GAL fenl), un ségréguant Mata de FY1679.
TGY202 et TGY206 sont des dérivés TRP1 obtenus après transformation des souches, respectivement, F1679-28c et TGY186.
Dans TGY156, une partie du gène atfi a été inactivée et remplacée par URA3. TGY186 est un dérivé de TGY156 dans lequel le gène URA3 au locus atfi a été remplacé par TEF1 : :PGK1 sous forme de bloc d'expression. Les souches sont transformées en utilisant la procédure à l'acétate de lithium (Ito, et al., 1983, J. Bact. 153, 163-168) ou par électroporation (Nacken et al., 1994, Nucleic Acids Res, 22, 1509-10) et sélectionnées sur un milieu solide YNBG contenant les acides aminés appropriés.
EXEMPLE 2 : BIOCONVERSION
Les cellules sont mises en croissance sur un milieu solide YNBG supplémenté avec les acides aminés appropriés. Une préculture est effectuée pendant 24 heures à
28°C dans un milieu ayant la même composition que le milieu de culture à tester. Le milieu minimal (YNB et la source de carbone) est supplémenté avec 0,5% de casamino acides (en plus des nutriments nécessaires pour la souche).
Lorsque le milieu de croissance contient du glycérol (2%), le glucose est également présent à 0,1% pour faire démarrer la culture.
Un aliquote de la préculture est utilisé pour inoculer 10 ml de milieu de culture avec une densité optique à 600 nm de 0,1 et la DHEA est solubilisée dans un mélange tergitol/éthanol 50/50 à 10 mg/ml (ou ajoutée au moment indiqué). A différents intervalles de temps un aliquote de 500 μl du milieu de culture est pris et on extrait les stéroïdes afin de les doser.
On ajoute au milieu de culture 4 ml de dichloro méthane, le mélange est passé au vortex pendant 10 minutes et centrifugé durant 3 minutes à 3 000 tours/minute. La phase organique est séchée sous un flux d'azote à 50°C. On ajoute au résidu 500 μl de dichlorométhane, l'échantillon est passé au vortex rapidement puis séché comme précédemment. Le résidu est repris dans un mélange isopropanol/eau 90/10 et transféré dans des tubes à injection qui sont scellés. L'échantillon est analysé par HPLC contre des standards composés de DHEA, 7-hydroxy DHEA et acétylé DHEA. Quelques standards contiennent en plus la 5-androstène-3β-17β-diol.
Les différents milieux de culture qui ont été utilisés sont YPG, YNBD (glucose à 2%) et YNBG (glycérol à 2%, glucose à 0,1%).
Les résultats obtenus sont rassemblés dans les exemples ci-après ; EXEMPLE 3 : Mise en évidence d'une activité intrinsèque 17-déshvdrogénase chez la levure
L'incubation de TGY202 et de l'acétyl-DHEA pendant 49 heures dans le YNBD a permis d'isoler l'acétyl-diol, indiquant une activité déshydrogénase chez la levure.
La caractérisation du produit obtenu a permis de déterminer que cette activité est similaire à celle de la 17β-hydroxystéroïde déshydrogénase des mammifères (17BDH) .
EXEMPLE 4 : Identification du gène yill24w codant pour l'activité 17BDH de la levure Saccharomvces cerevisiae
Le gène yil!24w a été amplifié par PCR en utilisant les amorces de séquences
SEQ ID N° 3 et SEQ ID N° 4 qui introduisent respectivement des sites de restriction
Sali et Mlul. Le produite de l'amplification après restriction par les enzymes Sali et Mlul a été sous-cloné dans le vecteur de levure pTG 10851 pour donner le vecteur pTG 14491. le gène yill24w est ainsi sous le contrôle du promoteur de levure TEF1 et du terminateur de levure PGK1. L'origine de réplication est le 2-micron et le marqueur de sélection est le gène de résistance au G418.
Après transformation de TGY206 par pTG 14491, on effectue une bioconversion pendant 24 heures dans le milieu YNBD, en utilisant la DHEA en tant que substrat. Les stéroïdes présents dans le milieu de culture sont analysés :
Figure imgf000013_0001
les valeurs sont exprimées en μg/ml du stéroïde extrait du milieu de culture
Ces résultats confirment l'activité 17BDH du gène yill24w, et montrent que sa surexpression permet de produire des dérivés steroïdiens réduits.
EXEMPLE 5 : Génération d'un mutant Knock-Out pour le gène yill24w
Le plasmide pTG 14491 a été restreint par PstI et Ncol (sites de restriction uniques dans la séquence codante de yill24w) et les bouts cohésifs ont été rendus francs par l'ADN polymérase de T4. Le gène URA3, est alors clone dans ce plasmide, afin que la séquence codante de yill24w soit interrompue par ce marqueur de sélection URA3. Le plasmide résultant pTG14584 contient le gène URA3 dans le même sens de traduction que le gène TIL124w. Après restriction de pTG 14584 par Sali et Mlul, le fragment libéré contenant yill24w interrompu par URA3 est introduit dans les souches TGY202 et TGY206, et les colonies recombinantes sont sélectionnées sur YNBD + LH, la sélection étant pour une prototrophie pour l'uracile. Sont ainsi obtenues respectivement les souches TGY279 et TGY282.
Les souches TGY206 et TGY282 sont incubées en présence de DHEA ou acétyl-DHEA dans le milieu YNBD pendant 24h et les produits obtenus sont mesurés.
Figure imgf000014_0001
Résultats exprimés en μg/ml extrait du milieu de culture.
Il apparaît donc clairement que la souche TGY282 n'est plus capable de réduire le DHEA ou l'acétyle-DHEA en resp. diol ou acétyl-diol. Ceci confirme l'inactivation du gène yill24w, ainsi que de sa fonction 17-déshydrogénase.
Par ailleurs, il est possible d'observer que la levure possède une activité intrinsèque de désacétylation de l'acétyl-DHEA en DHEA. Ainsi, l'identification du gène responsable et sa sur-expression par rapport à l'activité APAT permettra de produire des stéroïdes sans utiliser des mutants du gène atfi.
EXEMPLE 6 : Mise en œuyre du procédé selon la présente invention pour obtenir la 7- hydroxy-DHEA à partir de la DHEA, en utilisant la souche TGY202, transformée avec les plasmides d'expression de cyp7b.
La souche TGY202 transformée avec les plasmides pTG14012, pTG14014 ou pTG14015 est incubée en présence de DHEA (40μg/ml) dans un milieu YPG, pendant 48 heures, et la présence de 7-hydroxy-DHEA (7αHO-DHEA) est évaluée dans le milieu.
Les résultats sont rassemblés au tableau ci-après :
Figure imgf000015_0001
La présence de 7αHO-DHEA dans le milieu indique que le gène cyp7b est exprimé sous une forme active permettant la bioconversion de la DHEA en 7αHO- DHEA par la levure. Ainsi, tout substrat potentiel de Cyp7b peut être hydroxylé in vivo par une souche de levure exprimant cyp7b.
Par ailleurs, ces résultats indiquent que le promoteur TEF1 est plus efficace que CYCl, et que le marqueur de sélection URA3d donne de meilleurs résultats que le marqueur URA3.
EXEMPLE 7 : Augmentation de la production de 7αHO-DHEA par bioconversion, par la modulation des conditions de fermentation TGY202-pTG14012 et TGY202-pTG14014 sont incubées dans les milieux
YNBD et YNBG pendant 48 heures, en présence de DHEA (40μg/ml) ajoutée au milieu immédiatement après inoculation, ou après 8 heures d'incubation.
Les résultats sont rassemblés dans le tableau suivant (en % de produit accumulé).
Figure imgf000016_0001
On constate ainsi une influence du milieu de fermentation et du moment de l'apport du substrat DHEA pour la production sélective de 7αHO-DHEA, une inoculation tardive donnant en général de meilleurs résultats, et le milieu YNBG étant supérieur aux autres milieux .
EXEMPLE 8 : Production préférentielle de 7αHO-DHEA en l'absence de dérivés acétylés par l'utilisation de souches KO pour l'activité APAT
TGY206-pTG14014 est incubée dans du YNBD en présence de DHEA (lOOμg/ml) pendant 49 heures. L'analyse des produits obtenus indique que l'on récupère 100% de 7αHO- DHEA (91,7μg/ml).
Lorsque le milieu de culture est YNBG, on obtient un mélange de 7αHO- DHEA (89%, 73,8μg/ml), Triol (6%, 5μg/ml) et DHEA (5,3%, 4,4μg/ml).
Ces observations indiquent qu'en l'absence d'activité APAT, on évite la production de dérivés acétylés. En revanche, la présence de l'activité intrinsèque 17BDH mène à une présence contaminante des Diol ou Triol.
EXEMPLE 9 : Production préférentielle du Triol
L'incubation de TGY206-pTG14014 en présence de Diol (lOOμg/ml) pendant 48 heures mène à la production de 26,4 μg/ml Triol (36%) des produits finaux, 74% de Diol restant) dans le YNBG. L'utilisation de YNBD donne un taux de bioconversion de 100%.
Ces résultats montrent qu'en changeant le milieu de fermentation, on peut canaliser la production de métabolites à partir d'un substrat. En particulier, on peut aisément concevoir que la surexpression du gène yill24w permet une accumulation rapide et/ou complète de dérivés réduits. En couplant cette surexpression avec celle de cyp7b, on peut ainsi aboutir à une conversion quasi-totale en Triol, à partir de DHEA comme substrat de départ.
EXEMPLE 10 : Production préférentielle de l'acétyl-DHEA par l'utilisation d'une souche de levure KO pour l'activité 17BDH
Les souches TGY202 et TGY279 ont été incubées avec le DHEA pendant 24 heures dans le milieu de culture YPD, et les stéroïdes produits mesurés.
Figure imgf000017_0001
Résultats exprimés en pourcentage du total des stéroïdes extraits du milieu de culture
Il apparaît clairement que la souche TGY279 transforme quasi totalement le DHEA en acétyl-DHEA, en l'absence de l'activité 17BDH. EXEMPLE 1 1 : Production exclusive de 7αHO-DHEA par l'utilisation de la souche TGY282. KO pour les activités APAT et 17BDH. et exprimant cyp7b
Les souches TGY279 et TGY282 sont transformées avec le plasmide pTG14011 et sélectionnées sur YPG + G418. L'incubation des souches transformées dans le milieu YPD pendant 24 heures, en utilisant le DHEA en tant que substrat, permet de mesurer les taux des stéroïdes produits par ces souches.
Figure imgf000018_0001
Résultats exprimés en pourcentage du total des stéroïdes extraits du milieu de culture
Bien que la bioconversion ne soit pas allé au bout dans cette expérience, on voit que la souche TGY282-pTG14011 produit exclusivement du 7αHO-DHEA à partir du DHEA, alors qu'une souche contenant également l'activité APAT produit, non seulement du 7αHO-DHEA, mais aussi de l'acétyl-DHEA.

Claims

REVENDICATIONS 1) Procédé de production de stéroïdes hydroxylés et/ou acétylés comprenant les étapes selon lesquelles :
• on cultive des levures sur un milieu comprenant au moins un précurseur de tels stéroïdes hydroxylés et/ou acétylés, puis
• on isole les stéroïdes hydroxylés et/ou acétylés du milieu après bioconversion, ledit procédé étant caractérisé en ce que lesdites levures sont des levures transformées de façon à exprimer le produit du gène Cyp7b. 2) Procédé selon la revendication 1 de production de stéroïde hydroxylé, caractérisé en ce lesdites levures ont une activité APAT faible ou nulle et ou en ce que l'on cultive lesdites levures dans des conditions oxydatives.
3) Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit précurseur contient une position 7 susceptible d'être hydroxylée. 4) Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit précurseur est un stéroïde 3-hydroxylé, de préférence 3β-hydroxylé, ou possédant une fonction 3-céto.
5) Procédé selon la revendication 1 à 4, caractérisé en ce que ledit précurseur est choisi parmi les stéroïdes à structure de type androstanique, androstènique, prégnanique, prégnènique, cholanique, cholénique, cholestérique, ergostanique, ergostènique, testostéronique ou stigmamique.
6) Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le précurseur est choisi parmi le groupe consistant en la DHEA, la testostérone, la pregnénolone, la prégnanolone, le 25-hydroxy-cholestérol, le 5-α-androstane-3β-17β-diol, et le 5-α- androstène-3β-17β-diol.
7) Procédé selon l'une des revendications 2 à 6, caractérisé en ce que l'activité APAT de la levure a été rendue faible ou nulle par inactivation du gène atfi ou par utilisation d'un mutant atf2".
8) Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la levure porte également une activité déshydrogénase.
9) Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'activité déshydrogénase est une 17-déshydrogénase qui conduit à un dérivé 17-hydroxylé. 10) Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'activité 17- déshydrogénase est portée par le gène yill24w.
11) Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que l'activité 17-déshydrogénase de la levure a été rendue faible ou nulle, en particulier par inactivation du gène yill24w ou utilisation d'un mutant yill24w~.
12) Procédé selon l'une des revendications 1 à 1 1, caractérisé en ce que la levure est du genre Saccharomyces.
13) Procédé selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que le gène Cyplb est sous le contrôle d'un promoteur levure choisi parmi CYCl, TEFl et TDH3.
14) Stéroïde hydroxylé et/ou acétylé caractérisé en ce qu'il peut être obtenu par le procédé selon l'une des revendications 1 à 13.
15) Souche de levure possédant une activité 17-déshydrogénase nulle par inactivation du gène yill 24w. 16) Souche de levure transformée avec un plasmide comprenant une cassette d'expression exprimant le gène Cyplb.
17) Utilisation d'un stéroïde selon la revendication 14, pour la préparation d'un médicament pour le traitement de maladies du système nerveux central.
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