WO2001065270A2 - Verfahren zur esr-spektroskopischen bestimmung von veränderungen der transporteigenschaften des albumins in einer albuminhaltigen probe, esr-spektrometer zur durchführung des verfahrens und einsatz des verfahrens zur diagnose und zur kontrolle albuminhaltiger präparate - Google Patents

Verfahren zur esr-spektroskopischen bestimmung von veränderungen der transporteigenschaften des albumins in einer albuminhaltigen probe, esr-spektrometer zur durchführung des verfahrens und einsatz des verfahrens zur diagnose und zur kontrolle albuminhaltiger präparate Download PDF

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Definitions

  • the invention relates to a method which can be used in medical, biological, biotechnological and veterinary practice for electron spin resonance (ESR) spectroscopic determination of changes in the transport properties of albumin in an albumin-containing sample, which is used for diagnosis and / or monitoring of physiological or pathological changes in human or animal Body or for quality control of albumin-containing preparations, especially blood products, can be used.
  • ESR electron spin resonance
  • the invention also relates to an ESR spectrometer for carrying out the method according to the invention.
  • haematological parameters or parameters relating to antigens, hormones, enzymes and other biologically active substances for the diagnosis of diseases, which is widely used in routine clinical-chemical diagnostics.
  • Lipid components can be used in blood serum. Even though The application of ESR spectroscopy using spin labels to investigate motion processes in macromolecules represents the state of the art, the widespread introduction of this test method in routine clinical diagnostics has so far failed due to the high equipment costs and the complicated or unreliable analysis of the signals.
  • SU 1319705 AI describes a method for diagnosing malignant diseases in which the ability of the blood plasma or blood serum to bind an inserted spin probe is measured by means of ESR.
  • the binding coefficient ⁇ which represents the ratio of the amplitude of peak A to the amplitude of peak B, is determined. If ⁇ > 1, it is a carcinogenic disease. If ⁇ , ⁇ 1 the subject is healthy.
  • the described method has the disadvantage that it is not sensitive enough and therefore cannot provide a reliable diagnosis. Studies on this method have shown that the false positive and false negative diagnostic statements in the early stage of the disease are> 30%.
  • EP 0 973 043 AI describes an E ⁇ R spectroscopic method for the diagnosis of malignant neoplasms in blood serum, in which physico-chemical parameters of the spin probe mobility of a spin probe, which is a spin-labeled fatty acid, are determined in the three binding sites of the albumin.
  • Albumin is the main component in the blood transport system, which enables the transport of fatty acids, tryptophan, bilirubin, calcium, steroid hormones and other functionally important active ingredients to the target cell and thereby binds and distributes a large number of toxins (including endogenous origin). is involved.
  • Albumin is a polypeptide (molecular weight 68,000) with a large binding capacity for exogenous (drugs) and endogenous substances. It consists of 585 amino acids, which are arranged in a loop structure by disulfide bridges. Different binding sites on serum albumin are distinguished in the literature. The binding sites 1, 2 and 3 exist in the albumin molecule for fatty acids.
  • the cancer is determined by the deviation of the parameters of the spin probe binding from the values that healthy subjects have.
  • the ESR method according to EP 0 973 043 AI thus determines the specific native conformational state of the albumin in the blood, which is different from that of a healthy subject when a carcinogenic finding is present. It has been shown that this method provides false positive or false negative statements if there are additional influences from the blood on the albumin, e.g. Increased blood lipid levels, medication intake or influences from the solvent of the spin probe or by keeping the blood sample in the air.
  • the method is intended for early diagnosis and / or monitoring of physiological or pathological changes in the human or animal body, for quality control of albumin Materials, especially of preserved blood, and be suitable for assessing the detoxification capacity of albumin molecules.
  • the object of the invention was also to provide a device for advantageously carrying out the method.
  • the object of the invention is achieved in that the changes in the transport properties of the albumin in the sample to be examined are determined by means of ESR spectroscopy, in that targeted conformational changes of the albumin molecule are induced in the sample to be examined by means of a polar reagent with the addition of a suitable spin probe. It has been shown that the parameters of the binding of a spin probe to specific, known binding sites of the albumin, which can be determined by means of ESR, correlate with biophysical parameters of the albumin conformation and the latter provide reliable information about physiological or pathological changes in the human or animal body or also in preparations of transfusion or Allow transplant medicine.
  • At least three, preferably up to eight, different concentrations of a spin probe binding with the albumin and additionally at least three, preferably up to eight, different concentrations of a polar reagent are added to aliquots of the sample, based on the ESR spectra of those with spin probe and polar reagent Aliquot parts of the degree of change in the binding parameters of the spin probe to specific binding sites of the albumin depending on the spin probe concentration and the concentration of polar reagent determined by means of computer simulation of the ESR spectra and the change in the transport properties of the albumin from the changes in the values of the binding parameters of the spin probe for those through the different Concentrations of spin probe and polar reagent induced conformational states of the albumin are calculated, the concentrations of spin probe to be added being selected so that the mean of the ratio of the concentration of the spin probe to the concentration of albumin is 2.5 + 0.5 and, based on this mean, at least two additional concentrations are selected whose deviation from this mean is not less than 1.0.
  • concentrations of polar reagent to be added are selected so that the mean value of the final concentration of the polar reagent in the aliquots is (0, 6 + 0, 25) • Cp, where Cp represents the critical concentration of the polar reagent, which is exceeded in order to denature the albumin leads, and based on this mean at least two additional concentrations of polar reagent are selected, the deviation from this mean is at least 15%.
  • concentrations of the spin probe and polar reagent which are added to the respective aliquot parts of the sample must be selected within the concentration ranges indicated so that at least one aliquot part has a low probe concentration and a low concentration of polar reagent in at least one aliquot part a high probe concentration and a high concentration of polar reagent and in at least one aliquot a medium concentration of polar reagent and a medium concentration of probe are present (3-spectrum screening analysis).
  • concentrations can preferably be chosen such that a high probe concentration and a low concentration of polar reagent are present in at least one aliquot part and particularly preferably in addition a low probe concentration and a high concentration of polar reagent in at least one aliquot part Reagent is present (8 spectra analysis).
  • This concentration combination ensures that the transport properties of the albumin are recorded in the various stages, namely the physiological state when binding hydrophobic compounds such as fatty acids (low probe concentration and low concentration of polar reagent), the physiological state during the transport of hydrophobic compounds by the vascular system (high probe concentration and low concentration of polar reagent) and the physiological state when delivering (discharging) hydrophobic compounds to the target cells (high probe concentration and high concentration of polar reagent).
  • the method according to the invention detects changes in the albumin conformation (conformational mobility ) in the course of time under the influence of a polar reagent and thus the albumin functionality and change in the binding parameters of substrates to the albumin. Since such changes occur very early on, e.g. B. by pathological processes such. B. cancer, medical treatment, drug abuse or even during the fractionation steps of blood plasma components and incorrect storage of plasma derivatives, it is possible according to the invention to make clear diagnostic statements at an early stage of changes in the albumin functionality.
  • the albumin conformation and thus the binding properties of a number of substrates on the albumin are changed in the blood samples.
  • the method according to the invention is therefore characterized in that changes in the transport properties of the albumin (the albumin functionality), for example in the blood, are determined by means of ESR spectroscopy, in that specific conformational changes in the albumin molecule are caused by different concentrations of polar reagent in the presence of different concentrations of spin probe.
  • the ESR spectra recorded by the aliquots are electronically simulated using a mathematical model, which is preferably based on a Hamilton function with axial anisotropy, the experimental and simulated spectra are compared and parameters of the spin probe binding at specific spin probe binding sites of the albumin are determined electronically, preferably by Minimization of the squares of the differences in the spectral values of the modeled and the experimentally measured ESR spectra which correspond to these binding sites, the determined parameters of the spin probe binding correlating with biophysical parameters of the albumin conformation and, depending on the physiological or pathological change to be diagnosed, selecting specific parameters from the determined parameters and from these parameters the cut-off values as a decision criterion by means of a discrimination function for the specific modification of the albuminformats on how it occurs with special pathological or physiological changes can be electronically calculated.
  • a compound is used as the spin probe which can form a specific bond with the albumin, in particular fatty acids, steroid hormones or hetero-cyclic hydrocarbons, which must be spin-labeled.
  • hydrophobic compounds that are labeled with nitroxyl radicals as known spin probes can be used in the process according to the invention.
  • spin-labeled fatty acids are used as spin probes, preferably doxylstearic acids. 16-, 5-, 7- or 12 -doxyl-stearic acid is very particularly preferably used. If spin-labeled fatty acids are used as spin probes, parameters of the spin probe binding in the binding sites 1, 2 and 3 of the albumin can be determined.
  • Alcohol or DMSO can be used as the polar reagent, a C 1 -C 6 alcohol preferably being used, very particularly preferably ethyl alcohol.
  • the albumin-containing sample is e.g. understand a blood sample or a drug or product sample containing albumin.
  • the ESR spectra are recorded with at least three, preferably also up to eight, spin probe concentrations.
  • three aliquots of a serum sample, each with a volume of 50 ⁇ l, are mixed with 16-doxyl stearic acid in three different concentrations and with a polar reagent in three different volumes, so that the final concentration of the spin probe in the aliquots to be examined 8, 33 * 10 ⁇ 4 mol / 1, 1.55 * 10 " mol / 1 and 2.41 * 10 " 3 mol / 1 and the concentration of the polar
  • Reagent is 2.90 mol / 1, 3.37 mol / 1 and 3.80 mol / 1
  • the incubation period is from 7 to 15 minutes, preferably 10 minutes. Shake during incubation.
  • the ESR spectra are usually recorded at 37 ° C and the physiological pH of the blood. To increase precision, the spectra can be at two or more different temperature values of the samples between 15 and 45 ° C and / or at two or more different pH values of the serum samples from 7.5 to 3.5 are recorded.
  • the analysis of the measured ESR spectra is carried out electronically with the help of a specially developed computer software for the molecular mobility structure analysis (MMS).
  • MMS molecular mobility structure analysis
  • the ESR spectra recorded on the basis of the at least three, preferably eight aliquots of an albumin-containing sample, preferably a serum or plasma sample, are transferred to the computer software in order to calculate the parameters of the spin probe binding at the different types of binding sites.
  • the parameters of the spin probe bonds are analyzed on the basis of an ESR spectrum simulation.
  • An ESR spectra model preferably based on a Hamilton function with axial anisotropy, is used for the simulation of the experimentally obtained ESR spectra.
  • the parameters of the spin probe binding in albumin describe the simulation by minimizing the squares of the differences between simulated and experimentally obtained ESR spectra, as are shown for example in EP 0 973 043 AI.
  • the parameters are calculated separately for the different types of binding sites.
  • the parameters that characterize the bindings of the spin probe in the binding sites of the albumin molecule are calculated by ESR spectral simulation.
  • a spin model which is preferably based on the Hamilton function with axial anisotropy, is used to calculate each component of the spectrum. The calculation is carried out as described in EP 0 973 043 AI, page 4 below to page 7 above.
  • the time to process an ESR spectrum is less than 15 seconds.
  • the set of 17 parameters according to Table 2 describes the state of the spin probe molecules bound in the binding sites of the albumin, which under the influence of the binding properties of the binding sites reflect the current conformational state of the albumin molecule in the form of bio-physical parameters.
  • the spin probe distribution and mobility parameters for the individual aliquots are calculated in accordance with Table 3, with the parameters of the relative spin probe concentration of the spin probe pool C x to C 3 being the distribution characteristics of the relative number of spin probe molecules N 1 to bound in the binding sites N 3 is calculated by multiplying Cl to C3 by the ratio of the concentrations of fatty acid (FS) to serum albumin (SA).
  • FS fatty acid
  • SA serum albumin
  • the mobility characteristics of the spin probe molecules immobilized in the albumin binding sites are calculated according to the formulas in Table 3, the polarity factors of the microenvironment of the binding sites 1 and 2 being calculated from the isotropic constants the RF structure A x or A 2 are calculated.
  • the alignment factors S 1 and S 2 are calculated from the isotropic constants of the HF structure A. or A 2 and the respective anisotropy of the HF structure ⁇ A j or ⁇ A 2 .
  • the correlation times T'2 and T''2 are calculated from the widths of the spectral lines W L , W M and W H.
  • the binding parameters of the albumin are preferably determined using the mathematical method of
  • N 1 ° capacity of the fatty acid binding site 1
  • C p critical concentration of the polar reagent calculated by regression of the ratio between the relative number of spin probe molecules bound in the fatty acid binding sites (N 1 , N 2 , N 3 ) to the concentration of the polar reagent (C) according to formula I:
  • the parameters for the individual aliquots are further binding parameters of the albumin
  • N 2 R 2 -N, - (l + K 2 -C- (L 2 -N,)) (II).
  • the changes in the transport properties of the albumin are calculated from the set of the calculated binding parameters of the albumin for the aliquots depending on the test conditions used for the production of the aliquots according to Table 4.
  • the described ESR method can be used for the diagnosis and / or monitoring of physiological or pathological changes in the human or animal body, for example for the early diagnosis of cancer.
  • diagnosis of diseases or physiological changes go for the ESR screening analysis, based on the evaluation of at least 3 aliquots with different concentrations of the spin probe and the polar reagent, each incorporates certain binding parameters from Table 2 into a discrimination function in order to determine the cut-off values for the respective disease to be diagnosed or determine pathological changes and compare them with the cut-off values of reference samples.
  • parameters D. are determined in accordance with Table 5 for the diagnosis of cancer.
  • One of the parameters O 1 -O 6 is already sufficient to make a reliable diagnosis.
  • the diagnostic precision of the diagnostic method according to the invention was checked in 212 patients with cancer and in 87 patients without cancer (cf. Table 6).
  • Table 6 shows the high diagnostic precision of the ESR method according to the invention of over 90%. Cancer can also be diagnosed at a very early stage. With the calculation of D 2 , D 3 , D 5 or D 6 , a higher diagnostic precision of approx. 95% is achieved.
  • the ESR analysis of blood samples thus allows the diagnosis of cancer and other diseases or physiological changes in the very early stages of the disease.
  • the method according to the invention can be used both as an in-process control parameter in the production of albumin-containing medicinal products and for determining and checking the quality of albumin-containing preparations, preferably blood or plasma preparations, by changing the transport properties of the albumin determined according to the invention into Relationship is made to the transport properties of the starting material and / or the native serum albumin of healthy subjects.
  • the use of the method according to the invention also includes applications for determining the effectiveness of various methods for purifying the albumin from ligands bound to the molecule and the methods such as e.g. Hemosorbtion and hemodialysis to remove endotoxins, each of which influences the binding characteristics and transport properties of the albumin, by comparing the starting material and the purified albumin-containing material.
  • the method according to the invention is cost and time effective. It allows automated determination of different ESR spectra. The result of each screening test for 3 aliquots is available within less than 10 minutes; the complex ESR analysis of 8 aliquots takes approximately 24 minutes.
  • the invention also relates to a test kit for carrying out the method according to the invention, which contains a microtiter plate with the fixed, stabilized and precisely metered necessary different concentrations of spin probe and polar reagent.
  • the test kit can also only contain the precisely metered amounts of spin probe and polar reagent in extra containers, e.g. sealed sample tubes, so that the pre-dosed amounts in the laboratory only have to be added to the aliquots of the sample to be examined.
  • the invention also relates to an ESR spectrometer for carrying out the method according to the invention and a method for achieving high accuracy, stability and sensitivity of the ESR spectra recording.
  • the ESR spectrometer according to the invention meets the requirements of simple and reliable handling in modern clinical laboratory practice by integrating automatic device control, signal registration and signal evaluation in cooperation with a computer program for the diagnostic analysis of the measurement data.
  • the ESR spectrometer 1 for realizing the method according to the invention consists of a shielded compact electromagnet with Hall stabilization system 2, a measuring resonator 3, which is coupled to a homodyne UHF unit 5, a device control - and one Signal registration unit 9 and a system of thermostat control 7 of the test samples.
  • the device control and signal registration unit 9 consists of two single-chip computers (not shown), one of which serves as a system controller 10 for automated tuning and stabilization, while the second as the ESR signal processor 11 generates the scanning algorithm of the spectra, the signal data is accumulated, digitally filtered and recorded.
  • the test sample is inserted into the measuring shaft of the resonator 3, in which the UHF waves are emitted by the main oscillator of the UHF unit 5.
  • the ESR signal is measured using a homodyne waveguide unit as the source of the UHF radiation, which is reflected by the measuring resonator 3.
  • the magnetic field that is required to excite the ESR signal is generated by the electromagnet 2.
  • the voltage source 6 of the electromagnet 2 is regulated by an ESR signal processor 11.
  • the UHF unit 5 is controlled by the device control unit 10, which ensures the fine frequency tuning of the measuring resonator 3 with the main oscillator of the UHF unit 5, controls the thermostat control 7 of the test sample and the ESR spectrometer 1 with the personal computer 8 Operator connects, which is used for spectrometer control and data analysis.
  • Tuning in a wide frequency range only by means of Tuning the generator is made possible, while the tuning of the resonator regulates only a small frequency range, but ensures a stable frequency when measuring different samples, the inventive spectrometer with two coupled control devices, one for the control of the generator frequency and a second one for the Equipped resonance frequency. This is necessary, on the one hand, to enable a wide range of applications for examining different and different types of samples and, at the same time, to enable the mandatory congruence and reproducibility of the characteristics of the ESR spectra when examining aliquot samples according to the inventive method.
  • One of the control devices is installed on the main oscillator of the UHF unit 5 for frequency tuning in the range of 200-400, preferably 300 MHz of the central frequency of 9.45 + 0.5 GHz.
  • the second control device is installed on the measuring resonator 3 for tuning the resonance frequency in the range of 10-50, preferably 30 MHz by means of a resonator cavity volume variation with the aid of a motor-driven pull rod.
  • the main oscillator of the UHF unit 5 is trimmed after the exchange of the test samples only if the range of the resonance frequency tuning is inadequate. This happens in the event of a change in the type of test sample or in the event of a significant change in the sample preparation procedure.
  • the thermostat control system 7 is used to stabilize the sample temperature in the range from 30 ° C to 45 ° C with high accuracy.
  • this system 7 contains an additional subsystem in the form of an additional control loop, not shown.
  • the general control loop of the thermostat control system 7 consists of a heat-controlled air flow which, depending on the requirement, blows preheated or pre-cooled air into the resonator shaft to regulate the temperature of the sample ampoule.
  • the additional control loop of the thermostat control system 7 serves to increase the precision of the
  • Sample temperature stabilization by minimizing the gradients within the resonator shaft.
  • the resonator body 3 is heated to the specific sample temperature by means of self-heating of the magnet by its heat radiation.
  • the temperature of the resonator body 3 is measured by means of a temperature sensor 4.
  • the voltage source 6 of the electromagnet 2 is switched to increased or reduced values during the interruptions of the spectra recordings.
  • the structure and the large mass of the shielded compact electromagnet 2 additionally ensure the thermal insulation of the resonator 3 from environmental influences.
  • the ESR signal processor generates an algorithm of the spectrum scanning by regulating the voltage source.
  • the readings of the ESR signal from the UHF unit 5 are transformed by means of an analog / digital converter at a frequency of 10 kHz and accumulated in the memory of the signal processor 11.
  • each spectra point is developed from 60 or more signal readings.
  • the ESR spectrometer is an ultra-sensitive instrument that can respond to electromagnetic interference or mechanical vibrations.
  • a high sensitivity and stability of the inventive ESR spectrometer is achieved by using a special algorithm for the calculation of each spectral point, in which N recordings of the ESR signal £ 1; accumulated for each spectra point, summed up with the special weighting factors k ⁇ . These factors are inversely proportional to the squares of the measurement errors in the corresponding recordings.
  • the error A of the i-th signal reading is calculated as the difference between this reading S i and the arithmetic mean of the other (N-1) readings:
  • the error value A is increased (for example ten times) and the corresponding weighting factors k t are decreased many times (for example a hundred times).
  • the inventive ESR spectrometer readings with pulse noise are thereby excluded from the recording of the spectral information in the inventive ESR spectrometer. This algorithm is used for the accumulation of each of the measured points on the spectrum.
  • the ESR spectra obtained are analyzed with the help of special ESR software (MMS), the program for the ESR screening analysis generating a measurement algorithm for measuring 3 aliquots, and the results according to the regulation for the evaluation based on the discrimination functions according to Table 5 realized.
  • MMS special ESR software
  • the program To carry out the complex ESR analysis, the program generates a measurement algorithm for 5 to preferably 8 aliquots, the results of which are realized using the regulation for determining the transport properties of the albumin using the mathematical method of regression.
  • the program ensures simple automated execution of sample measurement and evaluation without requiring special training or qualification of the measuring personnel.
  • Blood serum is obtained by whole blood centrifugation and the serum samples are divided into three aliquots. This
  • Serum samples of 50 ⁇ L are mixed with 10, 12 and 14 ⁇ L an alcoholic spin probe solution (final spin probe concentration 8.33 * 10 " " mol / L, 1.55 * 10 "3 mol / L and 2.41 * 10 " 3 mol / L).
  • the prepared mixtures are incubated for 10 min at 37 ° C. with continuous shaking.
  • the prepared samples are transferred to three capillaries.
  • the ESR spectra are recorded for each capillary in the resonator of the ESR spectrometer at a constant temperature of 37 + 0.2 ° C.
  • Each recorded ESR spectrum is a superposition of the specific spectrum of the spin probe molecules that are immobilized at different binding sites, which is specific for long-chain fatty acids. These sites are located in the serum albumin of the blood serum examined.
  • the three recorded ESR spectra are loaded into a computer to calculate the parameters of the spin probe binding. This analysis is carried out separately for each binding site using the ESR spectra simulation method described above.
  • Tables 7 and 2 contain examples for the determination of the (16-DS) spin probe parameters in the serum albumin of some patients with and without carcinoma diseases:
  • Table 7 and Fig. 2 show that the measured binding parameters of the spin probes for cancer patients and
  • the serum samples were with a volume of 50 ⁇ L with 3 resp. 8 different concentrations of 16-doxil-stearic acid spin probe (dissolved in ethyl alcohol) mixed so that spin probe end concentrations from 0.83 * 10 "3 mol / L to and 2.34 * 10 " 3 mol / L and ethyl alcohol end concentrations of 1.86 mol / L bis and 3.8 mol / L resulted.
  • the pH The values of the serum samples after mixing with the spin probes were 7.4 + 0.05.
  • the prepared mixtures were incubated for 10 min at 37 ° C. with continuous shaking and, after incubation in glass capillaries, transferred for ESR spectra recording and analysis. The spectra were recorded in the ESR spectrometer according to the invention.
  • the ESR spectra were recorded for each capillary in the resonator of the ESR spectrometer at a constant temperature of 37 + 0.2 ° C.
  • ESR spectra 3 and 8 spectra
  • the parameters of the spin probe binding are calculated in the integrated ESR analyzer with the aid of the computer software according to the invention.
  • An ESR spectrum model (Hamilton function with axial anisotropy) is used to simulate the experimentally obtained ESR spectra from different spin probes.
  • the parameters of spin probe binding in serum albumin describe the simulation by minimizing the squares of the differences between simulated and experimentally obtained ESR spectra.
  • the analysis is carried out separately for each binding site and the ESR parameters for the characteristics of the albumin functionality and conformation are created by the computer program.
  • Hemoblastoses chronic lymphocytic leukosis (CML), plasmocytoma
  • Blood serum is obtained by whole blood centrifugation and the serum samples are divided into three aliquots. This
  • Serum samples of 50 ⁇ L are mixed with 10, 12 and 14 ⁇ L of an alcoholic spin probe solution
  • the prepared samples are transferred to three capillaries.
  • the ESR spectra are recorded for each capillary in the resonator of the ESR spectrometer according to the invention at a constant temperature of 37 + 0.2 ° C.
  • the three recorded ESR spectra are loaded into a computer to calculate the parameters of the spin probe binding. This analysis is carried out separately for each binding site using the ESR spectra simulation method described above using the computer software according to the invention.
  • Discrimination parameters of serum samples from 5 patients with CML and 3 patients with plasmocytoma Discrimination parameters of serum samples from 5 patients with CML and 3 patients with plasmocytoma.
  • the discrimination functions D1-D5 provide a typical picture for the presence of a carcinoma, which is also expressed in the 3-D analysis of the fatty acid binding sites.
  • the samples of the albumin-containing drugs were each with a volume of 50 ⁇ L with 3 resp. 8 different concentrations of 16-doxil-stearic acid spin probe (dissolved in ethyl alcohol) mixed so that final spin probe concentrations of 0.83 * 10-3 mol / L to and 2.34 * 10 "3 mol / L and final ethyl alcohol concentrations of 1.86 mol / L to 3.8 mol / L.
  • the pH of the serum samples after mixing with the spin probes was 7.4 + 0.05.
  • the prepared mixtures were incubated for 10 min at 37 ° C. with continuous shaking and after Incubation in glass capillaries for ESR spectra recording and analysis transferred.
  • the spectra were recorded in the ESR spectrometer according to the invention.
  • the ESR spectra were recorded for each capillary in the resonator of the ESR spectrometer at a constant temperature of 37 + 0.2 ° C
  • the Parameters of the spin probe binding are calculated using the computer software according to the invention.
  • the parameters of spin probe binding in serum albumin describe the simulation by minimizing the squares of the differences between simulated and experimentally obtained ESR spectra.
  • the analysis is carried out separately for each binding site and the ESR parameters for the characteristics of the albumin functionality and conformation are created by the computer program according to the invention.
  • the matrix of the concentration distribution of the aliquots (example - rel number of spin probe molecules in BS-2) is shown in FIG. 3 Tab. 2: 16-DS spin probe parameters determined from ESR spectra and their correlation with a characteristic of the albumine conformation and functionality.
  • Kb B- (Cp-C ⁇ / -> 10 7
  • N R, - ⁇ - K Calc ⁇ (L, -N,)) - N ⁇
  • the parameters C1, C2 and C3 are the values of the relative spin probe concentration in the binding sites 1, 2 and 3 respectively.
  • C - serum sample with a final spin probe concentration of 2.34 * 10-3mol / l The coefficients K 1 to K 6 depend on the specific concentrations of the related reactives and on the result of the expansion and precision of the data on the parameters of serum albumin of as large a number of cancer patients and healthy people as possible.
  • the coefficients K 1 to K 6 can, for example, be the values
  • Table 11 ESR parameters of intact and denatured albumin solutions. Screening parameters of the albumin functionality
  • Serum sample contains 50 ⁇ L serum, 10 ⁇ L of the alcoholic spin sample solution with a concentration of 0.5 * 10 "2 mol / L, final spin sample concentration 8.33 * 10 " 4 mol / L
  • Serum sample contains 50 ⁇ L serum, 12 ⁇ L of the alcoholic spin sample solution with a concentration of 0.8 * 10 2 mol / L, final spin sample concentration 1.55 * 10 "3 mol / L
  • Serum sample contains 50 ⁇ L serum, 14 ⁇ L of the alcoholic spin sample solution with a concentration of 1.1 * 10 "2 mol / L, final spin sample concentration 2, -41 * 10 " 3 mol / L
  • Fig. 3 shows preferred concentrations of the spin probe

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein in der medizinischen, biologischen, biotechnologischen und veterinärmedizinischen Praxis anwendbares Verfahren zur ESR-spektroskopischen Bestimmung von Veränderungen der Transporteigenschaften des Albumins in einer albuminhaltigen Probe, das zur Diagnose und/oder Überwachung physiologischer oder pathologischer Veränderungen im menschlichen oder tierischen Körper oder zur Qualitätskontrolle von albuminhaltigen Präparaten, insbesondere Blutprodukten, eingesetzt werden kann. Gegenstand der Erfindung ist auch ein ESR-Spektrometer zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, das als automatisierter ESR-Analysator den Anforderungen einfacher und zuverlässiger Handhabung in der modernen klinischen Laborpraxis gerecht wird, indem es automatische Gerätesteuerungen, Signalregistrierung und Signalauswertung im Zusammenwirken mit einem Computerprogramm zur diagnostischen Analyse der Meßdaten integriert.

Description

Verfahren zur ESR-spektroskopischen Bestimmung von
Veränderungen der Transporteigenschaften des Albumins in einer albuminhaltigen Probe. ESR-Spektrometer zur Durchführung des Verfahrens und Einsatz des
Verfahrens zur Diagnose und zur Kontrolle albuminhaltiger Präparate
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein in der medizinischen, biologischen, biotechnologischen und veterinärmedizinischen Praxis anwendbares Verfahren zur ElektronenSpinResonanz (ESR) -spektroskopischen Bestimmung von Veränderungen der Transporteigenschaften des Albumins in einer albuminhaltigen Probe, das zur Diagnose und/oder Überwachung physiologischer oder pathologischer Veränderungen im menschlichen oder tierischen Körper oder zur Qualitätskontrolle von albuminhaltigen Präparaten, insbesondere Blutprodukten, eingesetzt werden kann. Gegenstand der Erfindung ist auch ein ESR-Spektrometer zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens .
Es ist bekannt, zur Diagnose von Krankheiten hämato- logische Parameter oder Parameter betreffend Antigene, Hormone, Enzyme und andere biologisch aktive Substanzen heranzuziehen, was in der klinisch-chemischen Routinediagnostik breite Anwendung findet .
Auch die NMR- und die ESR-Spektroskopie können in der
Krankheitsdiagnostik zur Erfassung struktureller und funktioneller Eigenschaften von Protein- und
Lipidkomponenten im Blutserum eingesetzt werden. Obwohl die Anwendung der ESR-Spektroskopie unter Einsatz von Spinlabels zur Untersuchung von Bewegungsvorgängen in Makromolekülen bekannten Stand der Technik darstellt, scheiterte die breite Einführung dieser Testmethode in die klinische Routinediagnostik bisher an den hohen Ausrüstungskosten und an der komplizierten oder nicht zuverlässigen Analyse der Signale.
SU 1319705 AI beschreibt ein Verfahren zur Diagnose von bösartigen Erkrankungen, indem mittels ESR die Fähigkeit des Blutplasmas oder Blutserums gemessen wird, eine eingebrachte Spinsonde zu binden. Es wird der Bindungskoeffizient α, der das Verhältnis der Amplitude des Peaks A zur Amplitude des Peaks B darstellt, bestimmt. Ist α > 1, so handelt es sich um eine cancerogene Erkrankung. Bei α, < 1 ist der Proband gesund.
Das beschriebene Verfahren hat den Nachteil, daß es nicht sensitiv genug arbeitet und deshalb keine zuverlässige Diagnose liefern kann. Untersuchungen zu dieser Methode haben gezeigt, daß die falsch-positiven und falschnegativen Diagnoseaussagen im frühen Krankheitsstadium > 30% betragen.
EP 0 973 043 AI beschreibt ein EΞR-spektroskopisches Verfahren zur Diagnose von malignen Neoplasmen im Blutserum, bei dem physiko- chemische Parameter der Spinsondenmobilität einer Spinsonde, die eine spinmarkierte Fettsäure darstellt, in den drei Bindungstellen des Albumins bestimmt werden.
Albumin ist die Hauptkomponente im Transportsystem des Blutes, die den Transport von Fettsäuren, Tryptophan, Bilirubin, Kalzium, Steroidhormonen und anderen funktioneil wichtigen Wirkstoffen an die Zielzelle ermöglicht und dabei an der Bindung und Verteilung einer Vielzahl von Toxinen (darunter auch endogenen Ursprungs) beteiligt ist. Albumin ist ein Polypeptid (Molekulargewicht 68.000) mit einer großen Bindungskapazität für exogene (Arzneimittel) und endogene Substanzen. Es besteht aus 585 Aminosäuren, die durch Disulfidbrücken in einer Schleifenstruktur angeordnet sind. In der Literatur werden verschiedene Bindungsstellen am Serumalbumin unterschieden. Für Fettsäuren existieren die sogenannten Bindungsstellen 1, 2 und 3 im Albuminmolekül .
Beim Diagnoseverfahren gemäß EP 0 973 043 AI wird die Krebserkrankung durch die Abweichung der Parameter der Spinsondenbindung von den Werten bestimmt, die gesunde Probanden aufweisen.
Mit dem ESR-Verfahren gemäß EP 0 973 043 AI wird also der konkrete native Konformationszustand des Albumins im Blut bestimmt, der bei Vorliegen eines cancerogenen Befundes verändert gegenüber dem eines gesunden Probanden ist . Es hat sich gezeigt, daß dieses Verfahren falsch-positive oder falsch-negative Aussagen liefert, wenn zusätzliche Einflüsse aus dem Blut auf das Albumin vorhanden sind, z.B. erhöhte Blutfettwerte, Medikamenteneinnahme oder Einflüsse vom Lösungsmittel der Spinsonde oder durch Aufbewahrung der Blutprobe an der Luft .
Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein kostengünstiges und schnell durchführbares Verfahren zur ESR-spektroskopischen Bestimmung von albuminhaltigen Proben, insbesondere Blutproben, bereitzustellen, das richtige und reproduzierbare Aussagen zur Konformation des Albumins unter Berücksichtigung der genannten Einflüsse erlaubt und in der klinisch-chemischen Laborpraxis anwendbar ist. Das Verfahren soll zur frühzeitigen Diagnose und/oder Überwachung physiologischer oder pathologischer Veränderungen im menschlichen oder tierischen Körper, zur Qualitätskontrolle albuminhaltiger Materialien, insbesondere von Blutkonserven, und zur Beurteilung der Detoxifikationskapazität von Albuminmolekülen geeignet sein. Aufgabe der Erfindung war es auch, ein Gerät zur vorteilhaften Durchführung des Verfahrens bereitszustellen.
Die Aufgabe der Erfindung wird gelöst, indem die Veränderungen der Transporteigenschaften des Albumins in der zu untersuchenden Probe mittels ESR-Spektroskopie bestimmt werden, indem in der zu untersuchenden Probe gezielte Konformationsänderungen des Albuminmoleküls mittels eines polaren Reagenzes unter Zusatz einer geeigneten Spinsonde induziert werden. Es hat sich gezeigt, daß die mittels ESR bestimmbaren Parameter der Bindung einer Spinsonde an spezifische, bekannte Bindungsstellen des Albumins mit biophysikalischen Parametern der Albuminkonformation korrelieren und letztere zuverlässige Aussagen über physiologische oder pathologische Veränderungen im menschlichen oder tierischen Körper oder auch in Präparaten der Transfusions- oder Transplantationsmedizin erlauben.
Erfindungsgemäß werden aliquoten Teilen der Probe mindestens drei, vorzugsweise bis zu acht, unterschiedliche Konzentrationen einer mit dem Albumin bindenden Spinsonde und zusätzlich mindestens drei, vorzugsweise bis zu acht, unterschiedliche Konzentrationen eines polaren Reagenzes zugesetzt, anhand der ESR-Spektren der mit Spinsonde und polarem Reagenz versetzten aliquoten Teile der Grad der Veränderung der Bindungsparameter der Spinsonde an spezifische Bindungsstellen des Albumins in Abhängigkeit von der Spinsondenkonzentration und der Konzentration an polarem Reagenz mittels Computersimulation der ESR-Spektren bestimmt und die Veränderung der Transporteigenschaften des Albumins aus den Veränderungen der Werte der Bindungsparameter der Spinsonde für die durch die unterschiedlichen Konzentrationen an Spinsonde und polarem Reagenz induzierten Konformationszustände des Albumins berechnet, wobei die zuzusetzenden Konzentrationen an Spinsonde so ausgewählt werden, daß der Mittelwert des Verhältnisses der Konzentration der Spinsonde zur Konzentration des Albumins 2,5+0,5 beträgt und ausgehend von diesem Mittelwert mindestens zwei zusätzliche Konzentrationen ausgewählt werden, deren Abweichung von diesem Mittelwert nicht geringer als 1,0 ist. Die zuzusetzenden Konzentrationen an polarem Reagenz werden so ausgewählt, daß der Mittelwert der Endkonzentration des polaren Reagenzes in den Aliquoten (0, 6+0 , 25) • Cp betragt, wobei Cp die kritische Konzentration des polaren Reagenzes darstellt, dessen Überschreitung zur Denaturierung des Albumins führt, und ausgehend von diesem Mittelwert mindestens zwei zusätzliche Konzentrationen an polarem Reagenz ausgewählt werden, deren Abweichung von diesem Mittelwert mindestens 15% beträgt.
Dabei müssen die Konzentrationen an Spinsonde und polarem Reagenz, die den jeweiligen aliquoten Teilen der Probe zugesetzt werden, innerhalb der angegebenen Konzentrationsbereiche so gewählt werden, daß mindestens in einem aliquoten Teil eine geringe Sondenkonzentration und eine geringe Konzentration an polarem Reagenz, in mindestens einem aliquoten Teil eine hohe Sondenkonzentration und eine hohe Konzentration an polarem Reagenz und in mindestens einem aliquoten Teil eine mittlere Konzentration an polarem Reagenz und eine mittlere Konzentration Sonde vorhanden sind (3 -Spektren- Screening-Analyse) . Vorzugsweise können zusätzlich noch weitere Konzentrationen so gewählt werden, daß in mindestens einem aliquoten Teil eine hohe Sondenkonzentration und eine geringe Konzentration an polarem Reagenz vorhanden ist und besonders bevorzugt zusätzlich in mindestens einem aliquoten Teil eine geringe Sondenkonzentration und eine hohe Konzentration an polarem Reagenz vorhanden ist (8-Spektren-Analyse) . Durch diese Konzentrationskombination wird sichergestellt, daß die Transporteigenschaften des Albumins in den verschiedenen Etappen erfaßt werden, nämlich der physiologische Zustand beim Binden hydrophober Verbindungen wie z.B. Fettsäuren (geringe Sondenkonzentration und geringe Konzentration an polarem Reagenz) , der physiologische Zustand während des Transports hydrophober Verbindungen durch das vaskuläre System (hohe Sondenkonzentration und geringe Konzentration an polarem Reagenz) und der physiologische Zustand beim Abgeben (Entladen) hydrophober Verbindungen an die Zielzellen (hohe Sondenkonzentration und hohe Konzentration an polarem Reagenz) .
Während gemäß SU 1319705 lediglich die Bestimmung des Bindungskoeffizienten des Blutplasmas oder Blutserums im nativen Zustand möglich ist und gemäß EP 0 973 043 AI der konkrete native Zustand des Albumins in der zu untersuchenden Blutprobe bestimmt wird, erfaßt das erfindungsgemäße Verfahren Veränderungen der Albumin- konformation (Konformationsmobilität) in ihrem zeitlichen Verlauf unter dem Einfluß eines polaren Reagenzes und damit die Albuminfunktionalität und Veränderung der Bindungsparameter von Substraten an das Albumin. Da solche Veränderungen schon sehr frühzeitig z. B. durch pathologische Prozesse wie z. B. Krebsentstehung, durch eine medizinische Behandlung, durch Drogenabusus oder auch während der Fraktionierungsschritte von Blutplasmabestandteilen und bei inkorrekter Lagerung von Plasmaderivaten hervorgerufen werden, ist es erfindungsgemäß möglich, schon im frühen Stadium von Veränderungen der Albuminfunktionalität klare Diagnoseaussagen zu treffen. In Abhängigkeit von der physiko-chemischen Charakteristik des Mediums für die ESR- Analyse werden in den Blutproben die Albuminkonformation und dadurch auch die Bindungseigenschaften einer Reihe von Substraten am Albumin verändert . Das erfindungsgemäße Verfahren ist also dadurch gekennzeichnet, daß mittels ESR-Spektroskopie Veränderungen der Transporteigenschaften des Albumins (die Albuminfunktionalität) z.B. im Blut bestimmt werden, indem gezielte Konformationsänderungen des Albuminmoleküls durch verschiedene Konzentrationen an polarem Reagenz in Gegenwart verschiedner Konzentrationen an Spinsonde hervorgerufen werden. Die von den aliquoten Teilen aufgezeichneten ESR-Spektren werden mittels eines mathematischen Modells, das vorzugsweise auf einer Hamilton-Funktion mit axialer Anisotropie basiert, elektronisch simuliert, die experimentellen und simulierten Spektren verglichen und Parameter der Spinsondenbindung an spezifischen Spinsondenbindungsstellen des Albumins elektronisch bestimmt, vorzugsweise durch Minimierung der Quadrate der Differenzen der Spektrenwerte der modellierten und der experimentell gemessenen ESR-Spektren, die diesen Bindungsstellen entsprechen, wobei die ermittelten Parameter der Spinsondenbindung mit biophysikalisehen Parametern der Albuminkonformation korrelieren und je nach zu diagnostizierender physiologischer oder pathologischer Veränderung aus den ermittelten Parametern spezifische Parameter selektiert werden und aus diesen Parametern die cut-off-Werte als Entscheidungskriterium mittels einer Diskriminierungsfunktion für die spezifische Modifizierung der Albuminkonformation wie sie bei speziellen pathologischen oder physiologischen Veränderungen auftritt, elektronisch berechnet werden.
Erfindungsgemäß wird als Spinsonde eine Verbindung eingesetzt, die eine spezifische Bindung mit dem Albumin eingehen kann, insbesondere Fettsäuren, Steroidhormone oder heteroeyclische Kohlenwasserstoffe, die spinmarkiert sein müssen. Auch hydrophobe Verbindungen, die mit Nitroxylradikalen als bekannten Spinsonden markiert sind, können im erfindungsgemäßen Verfahren Anwendung finden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden spin-markierte Fettsäuren als Spinsonden eingesetzt, bevorzugt Doxylstearinsäuren. Ganz besonders bevorzugt kommt 16-, 5-, 7- oder 12 -Doxyl-Stearinsäure zur Anwendung. Werden spin-markierte Fettsäuren als Spinsonden eingesetzt, so können Parameter der Spinsondenbindung in den Bindungsstellen 1, 2 und 3 des Albumins bestimmt werden .
Als polares Reagenz kommt Alkohol oder DMSO in Frage, wobei vorzugsweise ein C1-C6-Alkohol eingesetzt wird, ganz besonders bevorzugt Ethylalkohol .
Als albuminhaltige Probe ist im Sinne der vorliegenden Erfindung z.B. eine Blutprobe oder eine albuminhaltige Arznemittel- oder Produktprobe zu verstehen.
Erfindungsgemäß werden die ESR-Spektren mit mindestens drei, vorzugsweise auch bis zu acht, Spinsondenkonzentrationen aufgezeichnet. Beispielsweise werden drei Aliqoten einer Serumprobe mit einem Volumen von je 50 μl mit 16-Doxyl-Stearinsäure in drei verschiedenen Konzentrationen und mit einem polaren Reagenz in drei verschiedenen Volumina versetzt, so daß die Endkonzentration der Spinsonde in den zu untersuchenden Aliquoten 8 , 33*10~4 mol/1, 1,55*10" mol/1 und 2,41*10"3 mol/1 und die Konzentration des polaren
Reagenzes 2,90 mol/1, 3,37 mol/1 und 3,80 mol/1 beträgt
(siehe Tabelle 1) .
Die Inkubationszeit beträgt von 7 bis 15 Minuten, vorzugsweise 10 Minuten. Bei der Inkubation sollte geschüttelt werden. Die ESR-Spektren werden in der Regel bei 37°C und dem physiologischen pH-Wert des Blutes aufgezeichnet. Zur Erhöhung der Präzision können die Spektren bei zwei oder mehr verschiedenen Temperaturwerten der Proben zwischen 15 und 45 °C und/oder bei zwei oder mehr verschiedenen pH-Werten der Serumproben von 7,5 bis 3,5 aufgezeichnet werden.
Die Analyse der gemessenen ESR-Spektren erfolgt elektronisch mit Hilfe einer speziell entwickelten Computersoftware für die Molekül-Mobilitäts-Struktur Analyse (MMS) . Die auf der Basis der mindestens drei, vorzugsweise acht Aliquote einer albuminhaltigen Probe, vorzugsweise einer Serum- oder Plasmaprobe aufgezeichneten ESR-Spektren werden in die Computersoftware überführt, um die Parameter der Spinsondenbindung an den verschiedenen Typen der Bindungsstellen zu berechnen. Die Parameter der Spinsondenbindungen werden auf der Basis einer ESR- Spektrensimulation analysiert. Ein ESR-Spektrenmodell , vorzugsweise basierend auf einer Hamilton-Funktion mit axialer Anisotropie, wird für die Simulation der experimentell gewonnenen ESR-Spektren verwendet. Die Parameter der Spinsondenbindung im Albumin beschreiben die Simulation durch die Minimierung der Quadrate der Differenzen von simulierten und experimentell gewonnenen ESR-Spektren, wie sie beispielsweise in EP 0 973 043 AI gezeigt sind.
Die Berechnung der Parameter erfolgt separat für die verschiedenen Typen der Bindungsstellen. Die Parameter, die die Bindungen der Spinsonde in den Bindungsstellen des Albuminmoleküls charakterisieren, werden durch ESR- Spektrensimulation berechnet. Ein Spin-Modell, das vorzugsweise auf der Hamilton-Funktion mit axialer Anisotropie basiert wird zur Berechnung jeder Komponente des Spektrums benutzt. Die Berechnung erfolgt wie in EP 0 973 043 AI, Seite 4 unten bis Seite 7 oben beschrieben.
Zur mathematischen Verarbeitung des ESR-Spektrums der Spinsonde wird das o.g. Computerprogramm angewandt, das den beschriebenen Berechnungsalgorithmus ausführt. Die Zeit zur Verarbeitung eines ESR-Spektrums liegt unter 15 Sekunden.
Als Ergebnis der Simulationsrechnung eines jeden ESR- Spektrums erhält man einen Werteumfang von 48 Spinsondenparametern für die drei Albuminbindungsstellen. Jeder von diesen Parametern hat eine spezifische Varianz, korrespondierend zu den Zuständen der an den Albuminmolekülen gebundenen Spinsondenmolekülen, die den Konformationsstatus der Albuminmoleküle wiederspiegeln.--- Insgesamt werden für den Fall, daß beispielsweise 16- Doxyl-Stearinsäure als Spinsonde dient, die 17 Parameter der Tabelle 2 aus dem Werteumfang selektiert, die den Albuminkonformationsstatus spezifisch charakterisieren.
Das Set aus 17 Parametern gemäß Tabelle 2 beschreibt den Zustand der in den Bindungsstellen des Albumins gebundenen Spinsondenmoleküle, die unter dem Einfluß der Bindungseigenschaften der Bindungsstellen den aktuellen Konformationszustand des Albuminmoleküls in Form bio- pysikalischer Parameter wiederspiegeln.
Aus dem ermittelten Set von 17 Parametern werden die Spinsondenverteilungs- und mobilitätsparameter für die einzelnen Aliquoten gemäß Tabelle 3 berechnet, wobei aus den Parametern der relativen Spinsondenkonzentration des Spinsondenpools Cx bis C3 die Verteilungscharakteristika der relativen Anzahl der in den Bindungsstellen gebundenen Spinsondenmoleküle N1 bis N3 durch Multiplikation von Cl bis C3 mit dem Verhältnis der Konzentrationen von Fettsäure (FS) zu Serumalbumin (SA) berechnet wird.
Die Mobilitätscharakteristika der in den Albuminbindungsstellen immobilisierten Spinsondenmoleküle werden gemäß der Formeln aus Tabelle 3 berechnet, wobei die Polaritätsfaktoren der Mikroumgebung der Bindungsstellen 1 und 2 aus den isotropischen Konstanten der HF-Struktur Ax bzw. A2 berechnet werden. Die Ausrichtungsfaktoren S1 und S2 werden aus den isotropischen Konstanten der HF-Struktur A. bzw. A2 und der jeweiligen Anisotropie der HF-Struktur δAj bzw. δA2 berechnet. Die Korrelationszeiten T'2 und T''2 werden aus den Breiten der Spektrenlinien WL, WM und WH berechnet.
Dabei werden die Bindungsparameter des Albumins vorzugsweise mittels der mathematischen Methode der
Regression des Verhältnisses der Bindungsparameter der Spinsonden in den Aliquoten in Abhängigkeit von der
Veränderung der Konzentrationen der Spinsonde und der
Konzentrationen des polaren Reagenzes bestimmt. Als
Bindungscharakteristika des Albumins wird ein Set der Bindungsparameter der Aliquoten bestehend aus • KB = Bindungskonstante,
• N1° = Kapazität der Fettsäurebindungsstelle 1 und
• Cp = Kritische Konzentration des polaren Reagenzes mittels Regression des Verhältnisses zwischen der relativen Anzahl der in den Fettsäurebindungsstellen gebundenen Spinsondendenmoleküle (N1 , N2, N3) zur Konzentration des polaren Reagenzes (C) gemäß Formel I berechnet :
Figure imgf000012_0001
Als weitere Bindungsparameter des Albumins werden für die einzelnen Aliquoten die Parameter
• R2 = Ratio der Kapazitäten der Fettsäurebindungsstellen
2 zu 1 im nativen Zustand des Albumins, • K2 = Flexibilitätsfaktor der Fettsäurebindungsstelle 2,
• L2 = Limit der Konformationsstabilität des Albumins mittels Regression des Verhältnisses zwischen der relativen Anzahl der in den Fettsäurebindungsstellen gebundenen Spinsondendenmoleküle (N1# N2, N3) zur Konzentration des polaren Reagenzes (C) gemäß Formel II ermittelt :
N2=R2-N, -(l+K2-C-(L2-N,)) (II) .
Die Formeln (I) und (II) beschreiben ein Model der Konformationsflexibilität des Systems der Fettsäurebindungsstellen des Albuminmoleküls, das erfindungsgemäß auf der Basis umfangreicher experimenteller Studien erarbeitet wurde .
Die Veränderungen der Transporteigenschaften des Albumins werden aus dem Set der berechneten Bindungsparameter des Albumins für die Aliquoten in Abhängigkeit von den für die Herstellung der Aliquoten angewandten Testbedingungen gemäß Tabelle 4 berechnet . Die vorzugsweise anzuwendenden Testbedingungen ermöglichen die Berechnung der Charakteristika, die die Beladung des Albumins mit Fettsäuren (KL, NL° - Testbedingung: C=0, Quotient Fettsäure / Albumin = 0,5), den Transport von Fettsäuren (Nτ°, Kτ- Testbedingung: C=0, Quotient Fettsäure / Albumin = 1,5) und die Entladung der Fettsäuren
Figure imgf000013_0001
Testbedingung: C=3,37 M, Quotient Fettsäure / Albumin = 1,5) bestimmen. Die Berechnung dieser Charakteristika erfolgt nach folgenden Formeln:
Integrale Bindungskonstante = KL = KB* (N1°+N2°) , Effektive Beladungskapazität = NL° = (N + N2°) , Effektive Transportkapazität = Nτ° = (KL.0 + N2°) , Integrale Transportbindungskonstante = K-, = KB* (N1°+N2°) , Dissoziationskonstante = D„ = l/KB, Effektive Entladungskapazität = Nυ° = (Nf + N2°) .
Erfindungsgemäß kann das beschriebene ESR-Verfahren zur Diagnose und/oder Überwachung physiologischer oder pathologischer Veränderungen im menschlichen oder tierischen Körper angewandt werden, z.B. zur frühzeitigen Diagnose von Krebserkrankungen. Für die Diagnose von Krankheiten bzw. physiologischen Veränderungen gehen für die ESR-Screening-Analyse auf der Basis der Auswertung von mindestens 3 Aliquoten mit unterschiedlichen Konzentrationen der Spinsonde und des polaren Reagenzes jeweils bestimmte Bindungsparameter aus Tabelle 2 in eine Diskriminierungsfunktion ein, um die Cut-off-Werte für die jeweilige zu diagnostizierende Krankheit bzw. pathologische Veränderung zu bestimmen und mit den cut- off-Werten von Referenzproben zu vergleichen.
So werden beispielsweise zur Diagnose von Krebser- krankungen die Parameter D. gemäß Tabelle 5 ermittelt. Dabei ist bereits einer der Parameter O1 -O6 ausreichend, um eine zuverlässige Diagnose zu treffen. Zur weiteren Erhöhung der Zuverlässigkeit der Aussagen kann es vorteilhaft sein, weitere Parameter, insbesondere D2 , D3 D5 oder D6, oder alle sechs Parameter D. zu bestimmen. Ist einer der Parameter D. > 1 , so ist die Albuminkonformation gestört und es handelt sich beispielsweise um eine onkologische Erkrankung. Ist D.. < 1 , so hat der Proband keine onkologische Erkrankung.
Die diagnostische Präzision der erfindungsgemäßen Diagnosemethode wurde an 212 Patienten mit Krebserkrankungen und an 87 Patienten ohne Krebserkrankungen überprüft (vgl. Tabelle 6) .
Tabelle 6 belegt die hohe diagnostische Präzision des erfindungsgemäßen ESR-Verfahrens von über 90%. Es können auch Krebserkrankungen in einem sehr frühen Stadium der Erkrankung diagnostiziert werden. So wird mit der Berechnung von jeweils D2 , D3 , D5 oder D6 sogar eine höhere diagnostische Präzision von jeweils ca. 95% erzielt.
Die ESR-Analyse von Blutproben erlaubt somit die Diagnose von Krebs und anderen Erkrankungen oder physiologischen Veränderungen in sehr frühen Stadien der Erkrankung. Die
Modifikation der Transportfunktion des Albumins basiert auf einer Blockierung der spezifischen Fettsäurebindungsstellen des Albumins, die bereits zu Beginn einer Erkrankung auftritt . Die Folge dieser Bindungsblockierung sind global gestörte Albuminfunktionen und -bindungseigenschaften für die normalen Transportaufgaben, nicht aber für die Versorgung von Neoplasmen und damit eine der Voraussetzungen für deren Wachstum. Die Blockierung an den Fettsäurebindungsstellen führt zu einer erheblichen Mangelversorgung normaler Zellen und auch zu Störungen des Immunsystems . Die mit gegenwärtigen Methoden der klinisch-chemischen Routinediagnostik bestimmbaren Parameter erfassen diese Veränderungen nicht; erste Reaktionen des Organismus auf die Tumorentwicklung sind nur mittels der erfindungsgemäßen ESR-Methode nachweisbar.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann sowohl als In-prozess- Kontroll-Parameter bei der Produktion von albuminhaltigen Arzneimitteln als auch zur Bestimmung und Kontrolle der Qualität von albuminhaltigen Präparaten, vorzugsweise Blut- oder Plasmapräparaten, angewandt werden, indem die erfindungsgemäß bestimmten Veränderungen der Transporteigenschaften des Albumins ins Verhältnis gesetzt werden zu den Transporteigenschaften des Ausgangsmaterials und/oder des nativen Serumalbumins gesunder Probanden. Die Anwendung des erfindungsgemaßen Verfahrens schließt auch Anwendungen zur Bestimmung der Effektivität verschiedener Verfahren zur Reinigung des Albumins von an das Molekül gebundenen Liganden und die Verfahren wie z.B. Haemosorbtion und Haemodialyse zur Herauslösung von Endotoxinen, die jeweils Bindungscharakteristika und Transporteigenschaften des Albumins beeinflussen, durch den Vergleich von Ausgangsmaterial und gereinigtem albuminhaltigen Material ein.
Die erfindungsgemäße Methode ist kosten- und zeiteffektiv. Sie erlaubt eine automatisierte Bestimmung von verschiedenen ESR-Spektren. Das Ergebnis jedes Screeningtests für 3 Aliquoten liegt innerhalb von weniger als 10 Minuten vor, für die komplexe ESR-Analyse von 8 Aliquoten werden ca. 24 Minuten benötigt.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Testkit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, der eine Mikrotiterplatte mit den fixierten, stabilisierten und exakt dosierten notwendigen unterschiedlichen Konzentrationen an Spinsonde und polarem Reagenz beinhaltet. Der Testkit kann auch lediglich die exakt dosierten Mengen an Spinsonde und polarem Reagenz in Extrakontainern, z.B. versiegelten Probenröhrchen, umfassen, so daß die vordosierten Mengen im Labor den aliquoten Teilen der zu untersuchenden Probe nur noch zugesetzt werden müssen.
Gegenstand der Erfindung ist daneben auch ein ESR- Spektrometer zur Durchführung des erfindungsgemaßen Verfahrens und ein Verfahren zur Erzielung einer hohen Genauigkeit, Stabilität und Sensitivität der ESR- SpektrenaufZeichnung. Das erfindungsgemäße ESR- Spektrometer wird als automatisierter ESR-Analysator den Anforderungen einfacher und zuverlässiger Handhabung in der modernen klinischen Laborpraxis gerecht, indem es automatische Gerätesteuerung, Signalregistrierung und Signalauswertung im Zusammenwirken mit einem Computerprogramm zur diagnostischen Analyse der Meßdaten integriert .
Das ESR-Spektrometer 1 zur Realisierung des Verfahrens nach der Erfindung besteht entsprechend der Darstellung in der Fig. 1 aus einem geschirmten Kompakt- Elektromagneten mit Hall-Stabilisierungssystem 2, einem Meßresonator 3, der mit einer homodynen UHF-Einheit 5 gekoppelt ist, einer Gerätesteuer- und einer Signalregistriereinheit 9 und einem System der Thermostat- regelung 7 der Untersuchungsproben.
Die Gerätesteuer- und Signalregistriereinheit 9 besteht aus zwei Single-Chip-Computern (nicht dargestellt) , von denen einer als System-Controller 10 für automatisiertes Tuning und Stabilisierung dient, während der zweite als ESR-Signalprozessor 11 den Scann-Algorithmus der Spektren generiert, die Signaldaten akkumuliert, digital filtert und aufzeichnet.
Für die Aufzeichnung der ESR-Spektren wird die Unter- suchungsprobe in den Meßschacht des Resonators 3 eingesetzt, in dem die UHF-Wellen vom Haupt-Oszillator der UHF-Einheit 5 emittiert werden. Das ESR-Signal wird gemessen mittels einer homodynen Waveguide-Einheit als Quelle der UHF-Strahlung, die durch den Meßresonator 3 reflektiert wird.
Das Magnetfeld, das zur Anregung des ESR-Signals benötigt wird, wird durch den Elektromagneten 2 erzeugt. Die Spannungsquelle 6 des Elektromagneten 2 wird durch einen ESR-Signalprozessor 11 geregelt.
Die UHF-Einheit 5 wird geregelt durch die Gerätesteuereinheit 10, die die feine Frequenzabstimmung des Meß-resonators 3 mit dem Haupt-Oszillator der UHF- Einheit 5 gewährleistet, die Thermostatregelung 7 der Untersuchungsprobe kontrolliert und das ESR-Spektrometer 1 mit dem Personalcomputer 8 des Operators koppelt, der für die Spektrometersteuerung und die Datenanalyse genutzt wird.
Im Gegensatz zu bekannten ESR-Spektrometern, die nur ein
Tuningelement entweder für die Generator- oder die Resonanzfrequenzabstimmung beinhalten, wobei die
Abstimmung in einem großen Frequenzbereich nur mittels Tuning des Generators ermöglicht wird, während die Abstimmung des Resonators nur einen kleinen Frequenzbereich regelt, dafür aber eine stabile Frequenz bei der Messung verschiedener Proben gewährleistet, ist das erfinderische Spektrometer mit zwei gekoppelten Steuerungsgeräten, eines für die Steuerung der Generatorfrequenz sowie ein zweites, für die Resonanzfrequenz ausgestattet. Das ist erforderlich, um einerseits eine große Bandbreite der Anwendung zur Untersuchung verschiedener und verschiedenartiger Proben zu ermöglichen und gleichzeitig die zwingend notwendige Kongruenz und Reproduzierbarkeit der Charakteristika der ESR-Spektren bei der Untersuchung aliquoter Proben gemäß dem erfinderischen Verfahren zu ermöglichen.
Eines der Steuerungsgeräte ist auf dem Haupt-Oszillator der UHF-Einheit 5 installiert zur Frequenzabstimmung im Bereich von 200-400, vorzugsweise 300 MHz der zentralen Frequenz von 9,45 + 0,5 GHz. Das zweite Steuerungsgerät ist auf dem Meßresonator 3 installiert zur Abstimmung der Resonanzfrequenz im Bereich von 10-50, vorzugsweise 30 MHz mittels einer Resonatorhohlraumvolumenvariation mit Hilfe einer motorgetriebenen Zugstange.
Das Trimmen des Haupt-Oszillators der UHF-Einheit 5 nach dem Austausch der Untersuchungsproben erfolgt nur, wenn der Bereich der Resonanzfrequenzabstimmung unzureichend ist. Das geschieht im Falle eines Wechsels des Typs der Untersuchungsproben oder im Falle einer wesentlichen Änderung der Probenvorbereitungsprozedur.
Wenn also ein Set von Proben gleichen Typs untersucht wird, werden deren Spektren praktisch bei einer UHF- Frequenz aufgezeichnet. In diesem Fall ist die Basis- (Hintergrund- ) Spektrallinie identisch für alle aufgezeichneten Spektren, was sehr wichtig für die Genauigkeit der anschließenden Berechnung der Charakteristika der untersuchten Objekte ist.
Das Thermostatregelungssystem 7 dient der Stabilisierung der Probentemperatur im Bereich von 30°C bis 45°C mit hoher Genauigkeit.
Im Gegensatz zu bekannten ESR-Spektrometern beinhaltet dieses System 7 ein zusätzliches Subsystem in Form einer zusätzlichen, nicht dargestellten Regelungsschleife. Die allgemeine Regelungsschleife des Ther- mostatregelungssystems 7 besteht aus einem wärmegeregelten Luftström, der je nach Erfordernis vorgeheizte oder vorgekühlte Luft in den Resonatorschacht bläst zur Temperaturregelung der Probenampulle.
Die zusätzliche Regelschleife des Thermostatregelsystems 7 dient der Präzisionserhöhung der
Probentemperaturstabilisierung durch Minimierung der Gradienten innerhalb des Resonatorschachtes . Zu diesem Zweck wird der Resonatorkörper 3 mittels Selbstaufheizung des Magneten durch dessen Wärmestrahlung auf die konkrete Probentemperatur angewärmt. Die Temperatur des Resonator- kδrpers 3 wird dazu mittels eines Temperatursensors 4 gemessen. Während der Unterbrechungen der Spektrenaufzeichnungen wird dazu die Spannungsquelle 6 des Elektromagneten 2 auf erhöhte oder reduzierte Werte geschaltet .
Die Struktur und die große Masse des geschirmten Kompakt- Elektromagneten 2 sichert zusätzlich die Thermoisolation des Resonators 3 von Umgebungseinflüssen.
Zur Analyse der ESR-Spektren mittels ESR-
Spektrensimulation gemäß dem erfinderischen Verfahren war es im Gegensatz zu bekannten Spektrometern erforderlich, ein spezielles Verfahren der digitalen Filtration zur Gewährleistung der Aufzeichnung einer exakten Form der Spektren für die Berechnung der Spektrenparameter mittels Simulation zu entwickeln, da im Gegensatz zu bekannten Verfahren die Korrelation in dem gemessenen Signal die bei der Filtration von Signalrauschen und Impulsstörungen bzw. durch Rauschunterdrückung auftreten, minimisiert werden mußte, um die Anwendung des erfiderischen Spektrometers für das erfinderische Verfahren durch Gewährleistung der erforderlichen hohen Genauigkeit der ESR- SpektrenaufZeichnung, der Stabilität und der Sensitivität des Spektrometers zu gewährleisten.
Dafür generiert der ESR-Signalprozessor einen Algorithmus des Spektrenscannings mittels Regelung der Spannungsquelle .
Die Ablesungen des ESR-Signals von der UHF-Einheit 5 werden mittels eines Analog/Digital-Konverters mit einer Frequenz von 10 KHz transformiert und im Speicher des Signalprozessors 11 akkumuliert.
Weil die typische Spektrenscannzeit mehr als eine Minute beträgt und die Anzahl der Spektrenpunkte weniger als 10.000 beträgt, wird jeder Spektrenpunkt aus 60 oder mehr Signalablesungen entwickelt .
Dessen ungeachtet ist ein bestimmter Teil der akkumulierten Spektrenablesungen gewöhnlich falsch, da das ESR-Spektrometer ein ultra- sensitives Instrument ist, das auf elektromagnetische Störungen oder mechanische Vibrationen reagieren kann.
Eine hohe Sensitivität und Stabilität des erfinderischen ESR-Spektrometers wird im Gegensatz zu bekannten ESR- Spektrometern dadurch erreicht, daß ein spezieller Algorithmus der Berechnung jeden Spektrenpunktes angewandt wird, bei dem N Aufzeichnungen des ESR-Signals £1; akkumuliert für jeden Spektrenpunkt, summiert werden mit den speziellen Wichtungsfaktoren k± . Diese Faktoren verhalten sich invers proportional zu den Quadraten der Messfehler der korrespondierenden Aufzeichnungen.
Der Fehler A der i-ten Signalablesung wird berechnet als die Differenz zwischen dieser Ablesung Si und dem arithmetischen Mittel der anderen (N - 1) Ablesungen:
Figure imgf000021_0001
Figure imgf000021_0002
Der resultierende Ausdruck für die Berechnung des Signalpunktes lautet
Figure imgf000021_0003
Wenn die Ablesung Si ein Impulsrauschen enthält, wird der Fehlerwert A erhöht (z.B. um das Zehnfache) und die korrespondierenden Wichtungsfaktoren kt werden um ein Vielfaches verringert (z.B. hundertfach) . Dadurch werden im erfinderischen ESR-Spektrometer, im Gegensatz zu bekannten ESR-Spektrometern, Ablesungen mit Impulsrauschen von der Aufzeichnung der Spektreninformationen ausgeschlossen. Dieser Algorithmus wird für die Akkumulation eines jeden der gemessenen Punkte des Spektrums angewandt .
Im Ergebnis wird eine hohe Sensitivität und Stabilität des aufgezeichneten ESR-Spektrums gewährleistet. Gleichzeitig wird dadurch die Herstellung einer zusätzlichen Korrelation zwischen benachbarten Spektrenpunkten verhindert, die bei bekannten Verfahren der Filtration von ESR-Signalen eine der Hauptursachen der Verringerung der Genauigkeit der Bestimmung der Spektrenparameter mittels Spektrensimulation darstellt.
Die gewonnenen ESR-Spektren werden mit Hilfe einer speziellen ESR-Software (MMS) analysiert, wobei das Programm für die ESR-Screeninganalyse einen Meßalgorithmus zur Messung von 3 Aliquoten generiert, und die Ergebnisse gemäß der Vorschrift für die Auswertung anhand der Diskriminierungsfunktionen gemäß Tabelle 5 realisiert.
Für die Durchführung der komplexen ESR-Analyse generiert das Programm einen Meßalgorithmus für 5 bis vorzugsweise 8 Aliquoten, deren Ergebnisse anhand der Vorschrift zur Bestimmung der Transporteigenschaften des Albumins unter Anwendung der mathematischen Methode der Regression realisiert .
Das Programm gewährleistet eine einfache automatisierte Durchführung der Probenmessung und Auswertung ohne eine besondere Ausbildung oder Quailifikation des Meßpersonals zu erfordern.
Nachfolgend wird die Erfindung an Ausführungsbeispielen näher erläutert :
Beispiel 1
Untersuchung von Patienten mit onkologischen Erkrankungen und von gesunden Patienten mittels ESR-Screening-Analyse ( 3 -Spektrenanalyse)
Blutserum wird durch Vollblutzentrifugation gewonnen und die Serumproben in drei Aliquote geteilt. Diese
Serumproben von jeweils 50 μL werden mit 10, 12 und 14 μL einer alkoholischen Spinsondenlösung versetzt (Spinsondenendkonzentration 8,33*10"" mol/L, 1,55*10"3 mol/L und 2,41*10"3 mol/L). Die präparierten Mischungen werden für 10 min bei 37°C unter kontinuierlichem Schütteln inkubiert .
Nach der Inkubation der präparierten Proben werden diese in drei Kapillaren überführt. Die ESR-Spektren werden für jede Kapillare im Resonator des ESR-Spektrometers bei einer konstanten Temperatur von 37 + 0,2 °C aufgenommen.
Jedes aufgenommene ESR-Spektrum ist eine Superposition des spezifischen Spektrums der Spinsondenmoleküle, die an verschiedenen Bindungsstellen immobilisiert werden, was spezifisch für langkettige Fettsäuren ist. Diese Bmdungsstellen sind im Serumalbumin des untersuchten Blutserums lokalisiert.
Die drei aufgenommenen ESR-Spektren werden in einen Computer eingeladen, um die Parameter der Spinsondenbindung zu berechnen. Diese Analyse wird separat für jede Bindungsstelle mit Hilfe der oben beschriebenen Methode der ESR-Spektren-Simulation durchgeführt.
Tabelle 7 und Fig. 2 enthalten Beispiele für die Bestimmung der (16-DS) -Spinsondenparameter im Serumalbumin einiger Patienten mit und ohne Karzinomerkrankungen:
1. Patienten mit Krebserkrankung
1. Patient, study code 506.
Klinische Diagnose: Ösophagus-Karzinom.
2. Patient, study code 507. Klinische Diagnose: Magen-Karzinom.
3. Patient, study code 528. Klinische Diagnose: Mamma-Karzinom.
4. Patient, study code 529. Klinische Diagnose: Lungen-Karzinom, .
II. Patienten ohne Krebserkrankung
1. Patient, study code 110, 42 Jahre. Klinische Diagnose: Diffuse Mastopathie . Kein histologischer Nachweis für Krebs.
2. Patient, study code 111, 23 Jahre. Klinische Diagnose: Gesunder Allgemeinzustand.
3. Patient, study code 112, 22 Jahre. Klinische Diagnose: Gesunder Allgemeinzustand.
4. Patient, study code 113, 40 Jahre. Klinische Diagnose: Rheumatische Herzerkrankung.
Tabelle 7 und Fig. 2 belegen, daß sich die gemessenen Bindungsparameter der Spinsonden für Krebspatienten und
Patienten ohne Krebshinweise nur bei höheren
Alkoholkonzentrationen des polaren Reagenzes unterscheiden (Serumproben B und C) . Diese Unterschiede zeigen eine spezifische Modifikation der Konformationsmobilität der Serummoleküle in den Blutproben von Patienten mit
Krebserkrankungen .
Beispiel 2
Komplexe ESR-Spektrenanalyse (3- und 8-Spektrenanalyse) der Albumintransportfunktion im Nativserum einer gesunden Population (Frauen und Männer)
Die Serumproben wurden mit einem Volumen von je 50 μL mit 3 resp . 8 verschiedenen Konzentrationen 16-Doxil- Stearinsäure-Spinsonde (gelöst in Ethylalkohol) gemischt, so daß Spinsondenendkonzentrationen von 0,83*10"3 mol/L bis und 2,34*10"3 mol/L und Ethylalkoholendkonzentrationen von 1,86 mol/L bis und 3,8 mol/L resultierten. Der pH- Werte der Serumproben betrug nach der Mischung mit den Spinsonden 7,4 + 0,05. Die präparierten Mischungen wurden für 10 min bei 37 °C unter kontinuierlichem Schütteln inkubiert und nach der Inkubation in Glaskapillaren zur ESR-Spektrenaufnahme und -analyse überführt. Die Aufnahme der Spektren erfolgte im erfindungsgemäßen ESR- Spektrometer. Die ESR-Spektren wurden für jede Kapillare im Resonator des ESR-Spektrometers bei einer konstant gehaltenenen Temperatur von 37 + 0,2 °C aufgenommen. Für alle aufgenommenen ESR-Spektren (3 und 8 Spektren) jeder Probe werden im integrierten ESR-Analyser die Parameter der Spinsondenbindung mit Hilfe der erfindungsgemaßen Computersoftware berechnet. Für die Simulation der experimentell gewonnenen ESR-Spektren von verschiedenen Spinsonden wird ein ESR-Spektrummodell (Hamilton-Funktion mit axialer Anisotropie) verwendet. Die Parameter der Spinsondenbindung im Serumalbumin beschreiben die Simulation durch die Minimierung der Quadrate der Differenzen von simulierten und experimentell gewonnenen ESR-Spektren. Die Analyse wird separat für jede Bindungsstelle durchgeführt und durch das Computerprogramm die ESR-Parameter zur Charakteristik der Albuminfunktionalität und -konformation erstellt.
Die Parameter der Albumintransportfunktion im Nativserum gesunder Blut- und Plasmaspender stehen in Tabelle 8 als Beispiel für intakte Albumintransportfunktionen. Mit Hilfe der komplexen ESR-Spektrenanalyse konnten in den Serumproben dieser gesunden Spender keine Abnormalit ten festgestellt werden. Beispiel 3
Erweiterte ESR-Spektrenanalyse (3-Spektren- und 3-D- Analyse) der Albumintransportfunktion im Nativserum von Patienten mit hämatologisehen Systemerkrankungen
(Hämoblastosen, chronisch lymphatische Leukose (CML) , Plasmocytom)
Blutserum wird durch Vollblutzentrifugation gewonnen und die Serumproben in drei Aliquote geteilt. Diese
Serumproben von jeweils 50 μL werden mit 10, 12 und 14 μL einer alkoholischen Spinsondenlösung versetzt
(Spinsondenendkonzentration 0,83*10"3 mol/L, 1,61*10"3 mol/L und 2,34*103 mol/L) . Die präparierten Mischungen werden für 10 min bei 37°C unter kontinuierlichem
Schütteln inkubiert.
Nach der Inkubation der präparierten Proben werden diese in drei Kapillaren überführt. Die ESR-Spektren werden für jede Kapillare im Resonator des erfindungsgemäßen ESR- Spektrometers bei einer konstanten Temperatur von 37 + 0,2 °C aufgenommen. Die drei aufgenommenen ESR-Spektren werden in einen Computer eingeladen, um die Parameter der Spinsondenbindung zu berechnen. Diese Analyse wird separat für jede Bindungsstelle mit Hilfe der oben beschriebenen Methode der ESR-Spektren-Simulation mittels der erfindungsgemäßen Computersoftware durchgeführt.
Maligne hämatologische Systemerkrankungen können durch das ESR-Screening erfaßt werden. In Tabelle 9 sind die
Diskriminierungsparameter der Serumproben von 5 Patienten mit CML und 3 Patienten mit Plasmocytom dargestellt . Die Diskriminierungsfunktionen D1-D5 ergeben ein typisches Bild für das Vorliegen einer Karzinomerkrankung, das auch in der 3 -D-Analyse der Fettsäurebindungsstellen zum Ausdruck kommt .
Beispiel 4 :
Erweiterte ESR-Spektrenanalyse (3 -Spektren- und 3-D- Analyse) der Albumintransportfunktion von albuminhaltigen Arzneimittelproben zur Qualitätskontrolle
Die Proben der albuminhaltigen Arzneimittel (Albuminlösungen, gefrorenes Frischplasma) wurden mit einem Volumen von je 50 μL wurden mit 3 resp. 8 verschiedenen Konzentrationen 16-Doxil-Stearinsäure- Spinsonde (gelöst in Ethylalkohol) gemischt, so daß Spinsondenendkonzentrationen von 0,83*10-3 mol/L bis und 2,34*10"3 mol/L und Ethylalkoholendkonzentrationen von 1,86 mol/L bis 3,8 mol/L resultierten. Der pH-Wert der Serumproben betrug nach der Mischung mit den Spinsonden 7,4 + 0,05. Die präparierten Mischungen wurden für 10 min bei 37 °C unter kontinuierlichem Schütteln inkubiert und nach der Inkubation in Glaskapillaren zur ESR- Spektrenaufnahme und -analyse überführt. Die Aufnahme der Spektren erfolgte im erfindungsgemäßen ESR-Spektrometer. Die ESR-Spektren wurden für jede Kapillare im Resonator des ESR-Spektrometers bei einer konstant gehaltenenen Temperatur von 37 + 0,2 °C aufgenommen. Für alle aufgenommenen ESR-Spektren (3 und 8 Spektren) jeder Aliquoten werden im integrierten ESR-Analyser die Parameter der Spinsondenbindung mit Hilfe der erfindungsgemäßen Computersoftware berechnet. Für die
Simulation der experimentell gewonnenen ESR-Spektren von verschiedenen Spinsonden wird ein ESR-Spektrummodell
(Hamilton-Funktion mit axialer Anisotropie) verwendet. Die Parameter der Spinsondenbindung im Serumalbumin beschreiben die Simulation durch die Minimierung der Quadrate der Differenzen von simulierten und experimentell gewonnenen ESR-Spektren. Die Analyse wird separat für jede Bindungsstelle durchgeführt und durch das erfindungsgemäße Computerprogramm die ESR- Parameter zur Charakteristik der Albuminfunktionalität und -konformation erstellt.
Bei der Herstellung von albuminhaltigen Arzneimitteln ist die erweiterte ESR-Spektrenanalyse (3 -Spektren- und 3-D- Analyse) der Albumintransportfunktion zur Qualitäts- und Inprozess-Kontrolle geeignet. Die Tabellen 10 und 11 zeigen die prozessbegleitende Anwendung der ESR- Technologie in der 3- und 8-Spektrenanalyse für unterschiedlich gewonnene (Vollblutplasma vs . Aphereseplasma) und behandelte (gefilterte leukozytendepletierte) Plasmaprodukte (Tabelle 10) , sowie für intaktes und denaturiertes Albumin (Tabelle 11) . Es wird deutlich, daß die Kapazität der Albumintransportfunktion des Endprodukte (z.B. Albuminlösungen, gefrorenes Frischplasma zur Transfusion) bewertet werden kann, aber auch einzelne Abschnitte des Herstellungsprozesses hisichtlich ihres Einflusses auf die qualitativen Albumintransporteigenschaften analysiert werden können . Tab. 1
Bevorzugte Konzentrationen der Spinsonde (16 Doxilstearinsäure) und des polaren Reagenzes (Ethylalkohol)
1. ESR-Screβning-Analyse
Figure imgf000029_0001
2. Komplexe ESR-Spe trenanalyse
Figure imgf000029_0002
durcn das Programm gesetzt.
PO = expeπmentaler Grenzwert der πativen Konformation des Albumins *= CAIbumin für Serum oder Plasma physiologisch 35 - 45 g/l "= Werte für polares Reagenz Ethylalkohol
Die Matrix der Konzentrationsverteilung der Aliquoten (Beispiel - rel Anzahl Spinsondenmolekule in BS-2) ist in Fig 3 dargestellt Tab. 2: 16-DS-Spinsondenparameter, die von ESR-Spektren ermittelt wurden und ihre Korrelation mit einer Charakteristik der Albuminkonformation und -funktionalität.
Figure imgf000030_0001
* Bemerkung: Weil die dritte Komponente des Spektrums mit den Spinsonden in Bindungsstellen niedriger Affinität korrespondiert, sind ihre anderen Charakteristika unbedeutend. Tabelle 3
Figure imgf000031_0001
Tabelle 4
Bestimmung der Parameter der Transporteigenschaften des Albumins
Charakteiistika de] j FS-Bindungsstelleπ Flexibilität
Funktionale Abhängigkeit der Btndunnsparameter
« Bindungskonstante
Kb = B-(Cp-Cα/->107
• Eflekm'e Kapazität derBS-1 K
• EjfekliΛ'e Kapazit t der BS-2
N, = R,-π - K Calc ■( L, -N, ))-Nι
Figure imgf000032_0001
Tab. 5: Beispiele der Diskriminierungsfunktionen
Figure imgf000033_0001
D6= 2-P2 (C) * K6 Polantatsfaktor der Spinsondenumgebung in der Fettsaurebmdungsstelle 2 der Serumprobe C
Die Parameter C1 , C2 und C3 sind die Werte der relativen Spinsondenkonzentration jeweils in den Bindungsstellen 1 , 2 und 3 Der Polantatsfaktor P2 wird berechnet P2= 1 ,47333 / A2 (mT), wobei A2 die isotropische HFS-Konstante der Fettsaurebmdungsstelle 2 darstellt Die Symbole A, B und C kennzeichnen die Probennummern jeweils einer Serie der gemessenen Serumproben einer untersuchten Blutprobe wie folgt
A - Serumprobe mit einer Spinsondenendkonzentration von 8,3*1 O^mol/I B - Serumprobe mit einer Spinsondenendkonzentration von 1 ,61*10-3mol/l C - Serumprobe mit einer Spinsondenendkonzentration von 2,34*10-3mol/l Die Koeffizienten K1 bis K6 sιnd abhangig von den konkreten Konzentrationen der verwandten Reaktive und vom Ergebnis der Erweiterung und Prazisierung der Daten zu den Parametern des Serumalbumins einer möglichst großen Zahl von Krebspatienten und Gesunden Die Koeffizienten K, bis K6 können z B die Werte
K,=7,843 K2= -1 ,517 K3=6,3 K4=1 ,881 K5=3 009
K6=1 ,002 annehmen Tab. 6:
Diagnostische Präzision von Tests auf der Basis von Diskriminierungsfunktionen im Ergebnis einer klinischen Studie von 212 Patienten mit Krebserkrankungen (Magen-,
Osophagus-, Rektum-, Leber-, Lungen-, Brust-, Prostata-Karzinom) und 87 Patienten ohne Krebserkrankung
Figure imgf000034_0001
Tab. 7:
Bindungsparameter von Spinsonden in den spezifischen Bindungsstellen des Albumins der in den Ausführungsbeispielen und Tab.3 angeführten Patienten mit und ohne Krebserkrankung.
Figure imgf000035_0001
*Fur jeden der untersuchten Patienten wurden die dargestellten Parameter durch eine ESR-Analyse von drei Serumproben, bezeichnet mit A, B, C bestimmt. Die Proben A, B und C wurden jeweils mit 10 μl, 12 μl und 14 μl alkoholischer Lösung der Spinsonde gemischt (Spinsondenendkonzentration 8,33*10"4 mol/l, 1 ,55*10 3 mol/l bzw. 2,41 *103 mol/l).
Die dargestellten Parameter bezeichnen: C 1 - Relative Spinsondenkonzentration in der Bindungsstelle 1 ; C 2 - Relative Spinsondenkonzentration in der Bindungsstelle 2; C 3 - Relative Spinsondenkonzentration in der Bindungsstelle 3 Tabelle 8: ESR-Parameter gesunder Personen (16 männlich, 18 weiblich).
Screeningparameter der Albuminfunktionalität
Figure imgf000036_0001
Physiko-chemische Charakteristika der Fettsäurebindungsstellen
Figure imgf000036_0002
Faktoren von Albumin-Transport, -Ladung und -Entladung
Figure imgf000036_0003
Tabelle 9
Screeningparameter der Albuminfunktionalität
Figure imgf000037_0001
Tabelle 1Q--ESR-Parameter von unterschiedlich gewonnenen und behandelten Plasmaprodukten (gefrorenes Fπschplasma)
Figure imgf000038_0001
Tabelle 11 : ESR-Parameter von intakten und denaturierten Albuminlösungen. Screeningparameter der Albuminfunktionalität
Figure imgf000039_0001
In Fig. 1 bedeuten:
1 ESR-Spektrometer
2 Elektromagnet
3 Meßresonator 4 Temperatursensor
5 UHF-Einheit
6 Spannungsquelle
7 Thermostatregelungssystem
8 Personalcomputer 9 Gerätesteuer- und Signalregistriereinheit
10 Gerätesteuereinheit
11 Signalprozessor
Fig. 2 zeigt die induzierte Modifikation der Bindungspa- rameter von Spinproben in Serumalbumin von Patienten mit und ohne Krebserkrankung als ein Ergebnis des Alkohlein- flusses auf die Albuminmolekülkonformation. Die dargestellten Kurven zeigen die Abhängigkeit der Spinprobenparameter von der Alkoholkonzentration in der Serumprobe. A) Serumprobe enthält 50 μL Serum, 10 μL der alkoholischen Spinprobenlösung mit einer Konzentration von 0,5*10"2 mol/L, Spinprobenendkonzentration 8,33*10"4 mol/L
B) Serumprobe enthält 50 μL Serum, 12 μL der alkoholischen Spinprobenlösung mit einer Konzentration von 0,8*10 2 mol/L, Spinprobenendkonzentration 1,55*10"3 mol/L
C) Serumprobe enthält 50 μL Serum, 14 μL der alkoholischen Spinprobenlösung mit einer Konzentration von 1,1*10"2 mol/L, Spinprobenendkonzentration 2,-41*10"3 mol/L
[110] ... [529] : Study codes der Patienten.
Fig . 3 zeigt bevorzugte Konzentrationen der Spinsonde
( 16 Doxilstearinsäure ) und des polaren Reagenzes
(Ethylalkohol ) .

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur ESR- spektroskopischen Bestimmung von Veränderungen der Transporteigenschaften des Albumins in einer albuminhaltigen Probe, bei dem in der zu untersuchenden Probe gezielte Konformationsänderungen des Albuminmoleküls induziert werden, indem aliquoten Teilen der Probe mindestens drei unterschiedliche Konzentrationen einer mit dem Albumin bindenden Spinsonde und zusätzlich mindestens drei unterschiedliche Konzentrationen eines polaren
Reagenzes zugesetzt werden, anhand der ESR-Spektren der mit Spinsonde und polarem Reagenz versetzten aliquoten Teile der Grad der Veränderung der Bindungsparameter der Spinsonde an spezifische Bindungsstellen des Albumins in Abhängigkeit von der
Spinsondenkonzentration und der Konzentration an polarem Reagenz mittels Computersimulation der ESR- Spektren bestimmt wird und die Veränderungen der Transporteigenschaften des Albumins aus den Veränderungen der Werte der Bindungsparameter der
Spinsonde für die durch die unterschiedlichen Konzentrationen an Spinsonde und polarem Reagenz induzierten Konformationszustände des Albumins berechnet werden, wobei die zuzusetzenden Konzentrationen an Spinsonde so ausgewählt werden, daß der Mittelwert des Verhältnisses der Konzentration der Spinsonde zur Konzentration des Albumins 2,5+0,5 beträgt und ausgehend von diesem Mittelwert mindestens zwei zusätzliche Konzentrationen ausgewählt werden, deren Abweichung von diesem Mittelwert nicht geringer als 1,0 ist, und die zuzusetzenden Konzentrationen an polarem Reagenz so ausgewählt werden, daß der Mittelwert der Endkonzentration des polaren Reagenzes (0, 6+0 , 25) • Cp beträgt, wobei Cp die kritische Konzentration des polaren Reagenzes darstellt, dessen Überschreitung zur Denaturierung des Albumins führt, und ausgehend von diesem Mittelwert mindestens zwei zusätzliche Konzentrationen an polarem Reagenz ausgewählt werden, deren Abweichung von diesem Mittelwert mindestens 15% beträgt, wobei die Konzentrationen an Spinsonde und polarem Reagenz, die den jeweiligen aliquoten Teilen der Probe zugesetzt werden, innerhalb der angegebenen Konzentrationsbereiche so gewählt werden, daß mindestens in einem aliquoten Teil eine geringe Sondenkonzentration und eine geringe Konzentration an polarem Reagenz, in mindestens einem aliquoten Teil eine mittlere Konzentration an polarem Reagenz und eine mittlere Konzentration an Spinsonde und in mindestens einem aliquoten Teil eine hohe Sondenkonzentration und eine hohe Konzentration an polarem Reagenz vorhanden sind.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich noch weitere Konzentrationskombinationen an Spinsonde und polarem Reagenz so gewählt werden, daß in mindestens einem aliquoten Teil eine hohe Sondenkonzentration und eine geringe Konzentration an polarem Reagenz vorhanden ist .
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich noch weitere Konzentrationskombinationen an Spinsonde und polarem Reagenz so gewählt werden, daß in mindestens einem aliquoten Teil eine geringe Sondenkonzentration und eine hohe Konzentration an polarem Reagenz vorhanden ist .
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als albuminhaltige Probe eine Blutprobe oder eine
Arzneimittelprobe eingesetzt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß als Spinsonde eine Verbindung eingesetzt wird, die eine spezifische Bindung mit Albumin eingeht, vorzugsweise spinmarkierte Fettsäuren, besonders bevorzugt Doxylstearisinsäuren .
6. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß als polares Reagenz Alkohol oder DMSO eingesetzt wird, vorzugsweise Ethylalkohol .
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Parameter der Spinsondenbindung von Aliquoten einer Blutprobe bei unterschiedlichen Temperaturen von 15 bis 45°C und/oder bei unterschiedlichen pH- Werten von 7,5 bis 3,5 bestimmt werden
8. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Bindungsparameter des Albumins mittels der mathematischen Methode der Regression des Verhältnisses der Bindungsparameter der Spinsonden in den Aliquoten in Abhängigkeit von der Veränderung der Konzentrationen der Spinsonde und der Konzetrationen des polaren Reagenzes bestimmt werden und aus diesen Bindungsparametern die Veränderung der Transporteigenschaften des Albumins berechnet wird.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es zur Diagnose und/oder Überwachung physiologischer oder pathologischer Veränderungen im menschlichen oder tierischen Körper angewandt wird, indem aus den ermittelten Bindungsparametern des Albumins je nach zu diagnostizierender physiologischer oder pathologischer
Veränderung spezifische Parameter, vorzugsweise die Verhältnisse der relativen Spinsondenkonzentrationen Cl, C2, C3 in den Fettsäurebindungsstellen zwischen den Aliquoten bestimmt und diese mit den mittels Diskriminierungsfunktion ermittelten cut-off-Werten von Referenzproben verglichen werden.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es zur Diagnose und/oder Überwachung onkologischer
Erkrankungen angewandt wird.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß einer oder mehrere der Parameter D. gemäß Tabelle 5 ermittelt werden, wobei eine onkologische Erkrankung vorliegt, wenn einer der Parameter D. > 1 ist.
12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es zur Bestimmung und Kontrolle der Qualität von albuminhaltigen Präparaten, vorzugsweise Blut- oder Plasmapräparaten, angewandt wird, indem die gemäß Anspruch 1 bestimmten Veränderungen der Transporteigenschaften des Albumins ins Verhältnis gesetzt werden zu den Transporteigenschaften des Ausgangsmaterials und/oder des nativen Serumalbumins gesunder Probanden.
13. Testkit zur Durchführung des Verfahrens nach den Ansprüchen 1 bis 12 , bestehend aus einer Kunststoffplatte mit einer Vielzahl von Kavitäten, vorzugsweise einer Mikrotiterplatte, deren Kavitäten fixierte, stabilisierte und exakt dosierte unterschiedliche Konzentrationen an Spinsonde und polarem Reagenz enthalten.
1 . Testkit zur Durchführung des Verfahrens nach den Ansprüchen 1 bis 12 umfassend in Probencontainern exakt dosierte Konzentrationen an Spinsonde und polarem Reagenz .
15. ESR-Spektrometer zur Durchführung des Verfahrens nach den Ansprüchen 1 bis 12, bestehend aus einem geschirmten Kompakt-Elektromagneten mit Hall- Stabilisierungssystem (2) , einem Meßresonator (3) , der mit einer UHF-Einheit (5) mit geregeltem Haupt-
Oszillator zur Frequenzabstimmung in einem ersten Bereich von 200 bis 400 MHz der zentralen Frequenz von 9,45 + 0,5 GHz gekoppelt ist, einer Gerätesteuer- und einer Signalregistriereinheit (9) und einem System zur Thermossta regelung (7) der
Untersuchungsproben, wobei zur Regelung des Meßresonators (3) bezüglich der Kompensation des Frequenzunterschieds bei der Spektrenregistrierung der Aliquoten einer Untersuchungsprobe der Meßresonator (3) mit einem weiteren Steuergerät für die Abstimmung der Resonanzfrequenz in einem zweiten Bereich von 10 bis 50 MHz mittels einer Resonatorhohlraumvolumenvariation gekoppelt ist.
16. ESR-Spektrometer nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Thermostatregelungssystem (7) eine zusätzliche Regelungssc leife zur Präzisionserhöhung der Probentemperaturstabilisierung durch Minimierung der Gradienten innerhalb des Resonatorschachtes durch elektromagnetische Selbstaufheizung enthält, die durch Regelung der Stromzufuhr zum Elektromagneten dessen Selbstaufheizung während der Unterbrechungen der Spektrenabtastung steuert, dessen Wärmeab- Strahlung den Resonator erwärmt .
17. ESR-Spektrometer nach den Ansprüchen 15 und 16, dadurch gekennzeichnet, daß der Resonatorkörper (3) mit einem Temperatursensor (4) zur Regelung der elektromagnetischen Selbstheizung des Elektromagneten verbunden ist, welche die Aufheizung des Resonators bis zur konkreten Probentemperatur vornimmt .
18. Verfahren zur Erzielung einer hohen Genauigkeit, Stabilität und Sensivitität der ESR-Spektren- aufzeichnung mit dem ESR-Spektrometer nach den Ansprüchen 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß in der Signalregistriereinheit (9) die registrierten ESR-Signaldaten zur Erzielung einer hohen Genauigkeit bei der Computersimulation der ESR-Spektren verarbeitet werden, indem die Signaldatenkorrelation, die bei der Filtration des Signalrauschens und der Impulsstörungen entsteht, durch digitale Filtration der aufgezeichneten ESR-Signale reduziert wird, wobei die Berechnung jeden Spektrenpunktes mittels eines speziellen Algorithmus erfolgt, nach welchem N Aufzeichnungen des ESR-Signals S± für jeden Spektrenpunkt akkumuliert und mit speziellen Wichtungsfaktoren k± summiert werden, wobei sich die
Wichtungsfaktoren Jci invers proportional zu den Quadraten der Meßfehler der korrespondierenden Aufzeichnungen verhalten entsprechend den Ausdrücken
/. = (/K- i)2 /(£ - ; - - /,2
und
Figure imgf000046_0001
PCT/EP2001/002248 2000-02-28 2001-02-28 Verfahren zur esr-spektroskopischen bestimmung von veränderungen der transporteigenschaften des albumins in einer albuminhaltigen probe, esr-spektrometer zur durchführung des verfahrens und einsatz des verfahrens zur diagnose und zur kontrolle albuminhaltiger präparate Ceased WO2001065270A2 (de)

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