WO2001068799A1

WO2001068799A1 - Cell cultivation-support material, method of cocultivation of cells and cocultivated cell sheet obtained therefrom

Info

Publication number: WO2001068799A1
Application number: PCT/JP2001/002123
Authority: WO
Inventors: Teruo Okano; Masayuki Yamato; Akihiko Kikuchi
Original assignee: CellSeed Inc
Current assignee: CellSeed Inc
Priority date: 2000-03-16
Filing date: 2001-03-16
Publication date: 2001-09-20
Anticipated expiration: 2002-09-16
Also published as: DK1264877T3; US7405078B2; EP1264877A1; EP2298858A1; US20030036196A1; JP4567936B2; EP1264877B1; EP1264877A4

Description

明細書

細胞培養用支持体材料、細胞の共培養方法および

それより得られる共培養細胞シート技術分野

本発明は、生物学、医学および免疫学等の分野における細胞培養用支持体材料並びに該支持体材料を用いた細胞の共培養方法およびその方法より得られる細胞シートの作製方法に関する。背景技術

近年、人工臓器の開発、再生医学、安全性評価並びに医薬品開発等を目的とする細胞培養が注目され、その技術も多種多様化し、ますます高度なものとなってきている。その一例として、 2種以上の細胞を同一の培養基材上で培養するといつた共培養法（共存培養とも称される）が挙げられる。

従来、細胞培養は、ガラス表面上あるいは種々の処理を行った合成高分子の表面上にて行われていた。例えば、ポリスチレンを材料とする表面処理、例えばァ線照射、シリコーンコーティング等を行った種々の容器等が細胞培養用容器として普及しているが、多種多様なの培養方法に十分に対応できるものではなかった。特公平 0 6— 1 0 4 0 6 1号公報には、水に対する上限若しくは下限臨界溶解温度が 0〜8 O :である高分子で基材表面を被覆した細胞培養支持体上にて、細胞を上限臨界溶解温度以下または下限臨界溶解温度以上で培養し、その後上限臨界溶解温度以上または下限臨界溶解温度以下にすることにより酵素処理なくして培養細胞を剥離させる新規な細胞培養法が記載されている。しかしながら、ここで示される支持体では温度応答性高分子が基材表面に均一に被覆されたもので、基材表面で培養した細胞をすベて剥離させてしまい、この基材においても多種多様な培養方法に十分に対応できるものではなかった。

ところで、上記のような細胞培養用容器を用いて複数の細胞を増殖させ共培養することは極めて難しい。例えば、肝実細胞の長期培養化には、（生体の肝臓の構造を考えて）共培養が有効であると考えられているが、ただ単に肝実細胞と線維芽細胞あるいは肝実質細胞と内皮細胞との混合等では安定に共培養することはできない。

肝臓中では肝実質細胞は決して単独で存在しているわけではない。肝臓は、肝実質細胞の他、内皮細胞、星細胞等が構築する肝小葉と呼ばれる微細構造の反復からなる。肝実質細胞の機能維持にこれら非実質細胞が重要であるとの考えから共培養の検討がなされてきた。また、人工肝モジュールに初代肝実質細胞を組み込む際、非実質細胞の混入がある方が肝分化機能を維持できるという観察からも、非実質細胞の必要性は強く示唆されている。し力 ^し、通常の培養皿を用いる方法では超短期的な共培養しか実現できない上、また共培養する両細胞数の比率を変える以外には十分な検討ができず、詳細を明らかにすることはできなかった。

トナーらは、シリコーン表面上にラミニンをフォトレジスト技術を用い、光照射でパターン化して固定させた（S. N. B h a t i a, M. L. Ya rmu s h, M. Ton e r, J . B i ome d. Ma t e r. Re s. ， 34, 189 - 199 ( 1997) ) 。この表面上に肝実質細胞を培養すると、肝実質細胞はラミニン固定ドメイン上にのみ接着し増殖する。この後に、線維芽細胞を播種すると、この細胞が極めて接着性が高いために、シリコーンドメイン上に接着し、肝実質細胞との共培養系が達成された。しかし、どのような組み合わせでもこれができるのではなく、肝実質細胞と、線維芽細胞ほどに接着性が高くない内皮細胞との共培養は達成することができない。

特開平 4— 94679号公報では、上記特公平 06— 104061号公報に示される技術を発展させ、基材表面の温度応答性高分子をパターン状に被覆させ、それを用いて細胞を培養する方法を記載している。しかしながら、ここで示される基材では、温度応答性高分子が付着していない基材表面の細胞親和性が弱く、複数の細胞の培養を目的とした基材としては不十分であった。また、この基材を用いる限り、共培養後に基材表面に広がった細胞シート全体を剥離させることはできなかった。発明の開示

本発明は、多岐にわたる細胞培養法に対応できる細胞培養用支持体材料を提供

することを目的とする。また、この支持体材料を用いることで上記のような問題点を解決するためになされたもので、例えば接着性が高くない内皮細胞のような細胞と肝実質細胞のような他の細胞との共培養を可能にする細胞の共培養方法およびそれより細胞シートを作製する方法を提供することを目的とする。

本発明は、温度応答性領域を表面に有する細胞培養用支持体材料に関する。また、本発明は、温度応答性領域を表面に有する細胞培養用支持体材料を用いることを特徴とする細胞の共培養方法に関する。

さらに、本発明は、温度応答性領域を表面に有する細胞培養用支持体材料を用いることを特徴とする細胞シートの作製方法に関する。図面の簡単な説明

図 1は、実施例 1 0に記載した肝実質細胞と内皮細胞の共培養を説明する顕微鏡写真である。図 1の aは使用した金属マスクのマスクパターンを示す。孔径は l mm、中心間距離は 1 . 5 mmである。図 1の bは 3 7 °Cで肝実質細胞を播種したときの顕微鏡写真を示す。全面に肝実質細胞が接着 ·伸展している。図 1の cは 2 0 で P I P AAm上の肝実質細胞を脱着した後の顕微鏡写真を示す。 P I P AAmをグラフトした温度応答性領域からのみ細胞は脱着する。図 1の dは 3 7 で内皮細胞を播種して 3日後のマスクパターンの顕微鏡写真を示す。マスクパターン通りに肝実質細胞と内皮細胞が安定に共培養できている。

図 2は、実施例 1 7に記載した肺胞上皮細胞と線維芽細胞の共培養を説明するために、肺胞上皮細胞から分泌されるサーファクタントプロテインを常法により蛍光染色した顕微鏡写真である。図 2の aは培養 1 3日後の分泌のようす、 bはそのときの細胞核の位置（図 aと bの中の細胞の位置は同じにしている。）を示している。図 2の cは細胞を細胞培養支持体材料から剥がさず、そのまま 2 2日間培養したときのようす、 dはそのときの細胞核の位置（図 cと dの中の細胞の位置は同じにしている。）を示している。剥離せずに培養し続けると分泌量は激減することが分かる。

図 3は、図 2と同様、実施例 1 7に記載した肺胞上皮細胞と線維芽細胞の共培養を説明するための写真である。培養 1 3日後に、本発明による方法にて剥離させ、再び細胞培養支持体材料上に付着させたときのようすで、図 3 aは剥離後さらに 3 0日培養したときのようす、 cは剥離後さらに 6 0日培養したときのようすを示している。本発明の方法に従えば、長期間、肺胞上皮細胞の活性を維持させられることが分かる。

図 4は、図 2と同様、実施例 1 7に記載した肺胞上皮細胞と線維芽細胞の共培養を説明するために、肺胞上皮細胞表層の特異的な糖鎖を蛍光染色した顕微鏡写真である。図 4 aは培養 1 3日後の肺胞上皮細胞表層糖鎖を常法に従い蛍光染色した結果である。図 4 bは剥離させた後、再び細胞培養支持体材料上に付着させたときのものであり、上記方法により肺胞上皮細胞が明らかに活性化されていることが分かる。

-発明を実施するための最良の形態

本発明で示される支持体材料とは、温度応答性高分子が被覆された A領域と、 ( 1 ) 細胞と親和性の高い高分子が被覆されている領域、

( 2 ) A領域と異なる量の温度応答性高分子が被覆されている領域、

( 3 ) A領域と異なる温度に応答する高分子が被覆されている領域

のいずれか、または（1 ) 〜（3 ) の任意の 2つもしくは 3つの組み合わせからなる B領域の 2領域を表面に持つことを特徵とするものである。

その製造法としては、最終的に上記の構造を有するものであれば何ら制約されるものではないが、例えば、 ①基材表面上全体にまず B領域を作成し、その後、最終的に B領域となる部分をマスクして A領域を上乗せする方法、或いはその A， Bを逆にした方法、 ②基材表面上全体にまず B領域を作成し、その後、最終的に A領域を構成するものを噴霧して上乗せする方法、或いはその A, Bを逆にした方法、 ③被覆物質をあらかじめ溶媒中に分散、或いは乳化させ、これを塗布する方法、 ④あらかじめ A, Bの 2層を被覆しておき、超音波或は走査型機器によりどちらかの層を削り取る方法、 ⑤被覆物質をオフセット印刷する方法、等を単独または併用する方法が挙げられる。

被覆領域の形態は、上部から観察して、例えば、 ①ラインとスペースからなるパターン、 ②水玉模様のパターン、 ③格子状のパターン、その他特殊な形のパ夕ーン、或いはこれらが混ざっている状態のパターンが挙げられるが、何ら限定されるものではない。

被覆領域の大きさは何ら限定されるものではないが、後述する複数の細胞を共培養する際には、隣接する A、 B領域に存在する細胞間で最も長い距離（中心間距離）が 1 c m以下、好ましくは 0 . 0 5 mm〜8 mm、さらに好ましくは 0 . l mm〜3 mmが良い。 1 c m以上の場合、共培養している異種の細胞間の影響が弱くなり、共培養の効率が悪くなり好ましくない。逆に、 0 . 0 5 mm以下であると A， B領域の何れか、若しくは両方の領域において細胞が増殖するための十分なスペースがなく共培養の効率が悪くなり好ましくない。

被覆を施される細胞培養支持体の材質は、通常細胞培養に用いられるガラス、改質ガラス、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレ一ト等の物質のみならず、一般に形態付与が可能である物質、例えば、上記以外の高分子化合物、セラミックス、金属類など全て用いることができる。その形状は、ペトリ皿等の細胞培養皿に限定されることはなく、プレート、ファイバー、（多孔質）粒子であってもよい。また、一般に細胞培養等に用いられる容器の形状（フラスコ等）を有したものであっても差し支えない。

細胞培養支持体への温度応答性高分子の被覆方法は、支持体基材と被覆物質を、 ( 1 ) 化学的な反応によって結合させる方法、（2 ) 物理的な相互作用を利用する方法、を単独でまたは併用して行うことができる。すなわち、（1 ) 化学的な反応によって結合させる場合は、電子線照射（e 1 e c t r 0 n b e a m ; E B ) 、ァ線照射、紫外線照射、プラズマ処理、コロナ処理等を用いることができる。さらに、支持体と被覆材料が適当な反応性官能基を有する場合は、ラジカル反応、ァニオン反応、カチオン反応等の一般に用いられる有機反応を利用することができる。（2 ) 物理的な相互作用による方法としては、被覆材料単独または支持体との相溶性のよいマトリックスを媒体とし（例えば、支持体を形成するモノマーまたは支持体と相溶性のよいモノマーと被覆材料とのグラフトポリマー、ブロックポリマー等）、塗布、混練等の物理的吸着を用いる方法等がある。

細胞と親和性の高い高分子としては、例えば、イオン性基、親ノ疎水性基等を有するもの、また、それらを基材表面に被覆後、グロ一放電、コロナ放電などで表面処理を施したもの、さらには、フイブロネクチン、コラーゲン、ラミニン等の細胞接着性蛋白質のいずれかもしくは組み合わせた高分子或いはそれらの処理物で良く、特に限定されるものではない。

細胞培養用基材は、通常、基材表面に細胞が付着し易くさせるためグロ一放電、コロナ放電などで表面処理を施されている。本発明の技術は、この表面を B領域として用い、温度応答性高分子からなる A領域を作成しても良いが、このものでは後述する A領域の細胞を剥離させる際、 B領域に付着した細胞も若干引きずられて剥離してしまい、効率が悪く好ましくない。この場合、 B領域の細胞付着性を強めることでそのような問題が解決できることが分かった。

温度応答性高分子の被覆量は、 0. 1〜5. Ο zg/cm²の範囲が良く、好ましくは 0. 3〜3. O ^gZcm²であり、さらに好ましくは 0. 5〜2. 5 gZcm²である。 0. 1 gZcm²より少ない被覆量のとき、温度を変化させても当該高分子上の細胞は剥離し難く、作業効率が著しく悪くなり好ましくない。逆に 5. 0 g/cm²以上であると、その領域に細胞が付着し難く、細胞を十分に培養することが困難となる。

A, B両領域に温度応答性高分子が付着されている場合、 A， B間の被覆量の差は少なくとも 0. 1 ^ gZcm²以上必要で、好ましくは 0. 20 gZcm ²以上、さらに好ましくは 0. 50 gZcm²以上必要である。 0. l O g ノ cm²以下であるとどちらか一方の上の細胞を剥離させようとしても、他方の領域の細胞も引きずられて剥離してしまうので好ましくない。

高分子の被覆量は、例えばフーリエ変換赤外分光計全反射法（FT - I R— A TR法）、被覆領域の染色や蛍光物質の染色による分析、さらに接触角測定等による表面分析を単独或いは併用して求めることができる。本発明の A， B領域の広さが分析可能な範囲より狭い場合は、あらかじめ分析可能な広さで被覆量を求めておく必要があり、その条件と同条件で被覆すれば良い。

本発明の温度応答性領域を作製するために用いる温度応答性高分子はホモポリマーであっても共重合体であってもよい。使用し得る温度応答性高分子の基本構成単位としては、例えば、アクリルアミド、メ夕クリルアミド等の（メタ）ァクリルアミド化合物、 N—ェチルアクリルアミド（単独重合体の下限臨界溶解温度 7 2 °C) 、 N— n—プロピルアクリルアミド（同 2 1 °C) 、 N— n—プロピルメタクリルアミド（同 2 7 °C) 、 N—イソプロピルアクリルアミド（同 3 2で）、 N Γソプロピルメタクリルアミド（同 4 3で）、 N—シクロプロピルアクリルアミド（同 4 5で）、 N—シクロプロピルメタクリルアミド（同 6 0 °C) 、 N— エトキシェチルアクリルアミド（同約 3 5 ）、 N—エトキシェチルメタクリルアミド（同約 4 5 °C) 、 N—テトラヒドロフルフリルアクリルアミド（同約 2 8 °C) 、 N—テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（同約 3 5で）等の N— アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、 N, N—ジメチル（メタ）ァクリルアミド、 N, N—ェチルメチルアクリルアミド（単独重合体の下限臨界溶解温度 5 6で）、 N， N—ジェチルアクリルアミド（同 3 2 ）等の N， N—ジアルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、さらに 1— ( 1—ォキソ一 2—プロべニル） —ピロリジン（同 5 6 t ) 、 1— ( 1 —ォキソ— 2 —プロぺニル） —ピぺリジン（同約 6で）、 4— ( 1 —ォキソ一 2 —プロべニル） —モルホリン、 1— ( 1 一ォキソ _ 2—メチル— 2—プロぺニル） —ピロリジン、 1— ( 1—ォキソ — 2—メチル— 2 —プロぺニル）ーピペリジン、 4— ( 1—ォキソ—2—メチル _ 2—プロべニル） —モルホリン等の環状基を有する（メタ）アクリルアミド誘導体、メチルビニルエーテル（単独重合体の下限臨界溶解温度 3 5で）等のビニルエーテル誘導体、また増殖細胞の種類によって臨界溶解温度を調節する必要がある場合や、被覆物質と細胞培養支持体との相互作用を高める必要が生じた場合や、細胞支持体の親水、疎水性のバランスを調整する等の目的で、上記以外のモノマ一類との共重合、重合体同士のグラフト重合または共重合、あるいは重合体、共重合体の混合物を用いてもよい。また、重合体本来の性質を損なわない範囲で架橋することも可能である。

A， B両領域に異なる温度応答性高分子が付着されている場合、 A， Bそれぞれの高分子の応答する温度の差は少なくとも 2 以上必要で、好ましくは 4で以上、さらに好ましくは 8で以上必要である。 2で以下であるとどちらか一方の上の細胞を剥離させようとしても、他方の領域の細胞も引きずられて剥離してしまうので好ましくない。

本発明者らは、異種の細胞をパターン化した基材上に培養することで共培養を実現する新手法を開発した。

例えば、支持体表面に B領域として細胞と親和性の高い高分子を被覆させ、その中に A領域としてポリ一 N—イソプロピルアクリルアミド（以下、 P I P A A mとする）を固定化して温度応答性領域をデザインし、この領域上の細胞の接着 /脱着を利用する手法である。すなわち、例えば、まず所定の細胞を 3 7 °Cで単層（シート）に培養した後に、温度応答ドメイン上の細胞のみを温度低下（例えば、 2 5で以下）によって剥離させる。温度を再び 3 7 ^：に上昇させた後に違う細胞を播種し、既にドメイン化した安定な所定の細胞中に異種の細胞領域を作る新手法である。肝実質細胞の単一培養系では、一週間後から次第に死んでいくのに対し、本発明の細胞培養支持体を用いる方法によれば、肝実質細胞と内皮細胞系では 2週間以上にわたり（1力月レベル）共培養が可能であり、肝実質細胞の機能（アルブミン産生能）は長期にわたり（2週間以上）維持された。

ここでの共培養方法の一例を以下に説明する。

1 . 3 7 :の温度下で上記支持体の表面に細胞を接着し、増殖させる。低温で細胞を脱着することのできる P I P AAm領域は 3 7 で疎水性、 3 2で以下で親水性に変化する。

2 . この表面上に単層の細胞シートを作製することができる。したがって、温度応答性高分子を用いて温度応答性領域を特定の形状にすることによって、特定の形をくり抜いた細胞シートを支持体表面上に自由に作製することができる。

3 . 温度応答性領域を海島構造あるいはストライプ構造など自由にデザインでき、 0 . 1〜0 . 5 mm以上の孔径の球状ドメインや幅のストライプドメインで、温度低下（2 5で以下）により、 P I P AAmがグラフトされていない部分に一方の細胞（以下、 A細胞と称する）が残る。

4 . 3 7でに戻すと P I P AAm領域には細胞が接着するので、他方の細胞（以下、 B細胞と称する）を播種し、増殖させることができる。

5 . A細胞と B細胞のパ夕一ンをコントロールして、共培養できる新しいシステムとなる。

6 . A細胞として肝実質細胞、 B細胞として内皮細胞を用いた場合、各々の細胞をパターン化することで長期培養（2週間以上）が可能となる。また、肝実質細胞の長期機能培養（例えば、アルブミン産生 3 0 O n g / h / 1 0⁵ c e 1 1 s を 2週間以上維持すること）を行うことができる。肝実質細胞の長期機能培養ができるために、薬物開発等、様々な領域において希求されている培養肝実質細胞による化学物質の試験システムを構築することも可能である。

本発明では、温度応答性高分子が被覆された A領域と B領域の一部若しくは全部が A領域と異なる量の温度応答性高分子で被覆されている細胞培養用支持体材料も示される。この場合、同じ温度でも高分子の被覆量が多い領域ほど応答性が速くなる。従って、処理時間の差によって片方の領域の細胞のみを剥離させられる。本発明では A、 Bどちらの領域の被覆量が多くても良く、目的に合わせ自由に支持体表面を設計することができる。

本発明では、また、温度応答性高分子が被覆された A領域と B領域の一部若しくは全部が A領域と異なる温度に応答する高分子で被覆されている細胞培養用支持体材料も示される。この場合、それぞれの高分子の応答する温度によって、片方の領域の細胞のみを剥離させられる。本発明では A、 Bどちらの高分子の応答する温度が高くても良く、目的に合わせ自由に支持体表面を設計することができる。

本発明では、さらに、支持体表面上の A領域と B領域の全てが温度応答性の高分子で被覆されている場合、すべての高分子が応答するような温度、処理時間などの条件を選べば、支持体材料表面上で共培養された細胞全てをそのまま剥離させることができる。

また、その支持体表面上の A領域と B領域の全てが温度応答性の高分子で被覆されているものであれば、初めから複数の細胞が混在しているような状態で培養を始めても、基材表面に存在するパターンが異なる細胞間で接着性の差を生じ、同種の細胞同士が若干集まる傾向にあり、その傾向は温度処理によりさらに進行することが分かった。この操作を繰り返すことで、今まで分割困難な細胞同士でも分割できる。

かくして得られた細胞培養用支持体材料であれば、

前記トナーらの方法と異なり、本発明の共培養方法は細胞の組み合わせの制約がないので、すべての細胞種の間で共培養が可能である。例えば、肺胞上皮細胞と線維芽細胞、脳内の神経細胞とグリア細胞との共培養を挙げることができる。実施例

以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれによって何ら限定されるものではない。実施例 2

市販のポリスチレン製細胞培養皿（べクトン ·ディッキンソン · ラブウェア (Be e t on D i c k i n s on L a b w a r e ) 社製ファレ'コン（ F AL CON) 3002ペトリディッシュ（直径 6 c m) 上に、 N—イソプロピルァクリルアミドモノマーを 40 %になるようにイソプロピルアルコールに溶解させたものを 0. 35m 1塗布した。その塗布面上に直径 lmm、中心間距離 1. 5mmの孔をもつ金属製マスク（図 1の a) をのせ、そのままの状態で 0. 25 MGyの強度の電子線を照射し、培養皿表面に N—イソプロピルアクリルアミドポリマー（P I PAAm) をドメイン状（島状の部分。マスク下の部分は電子線が当たらず何も被覆されない海部分となる。 ) に固定化した。照射後、イオン交換水により培養皿を洗浄し、残存モノマーおよび培養皿に結合していない P I P AAmを取り除き、クリーンベンチ内で乾燥し、エチレンオキサイドガスで滅菌することで細胞培養基材を得た。ここで島部分の P I PAAmの被覆量は、マスクを使わずに上と全く同条件で作製した細胞培養支持体材料より求めた。その結果、この条件下であれば、基材表面に温度応答性高分子が 1. 6 gZcm²被覆されることが分かった。細胞培養前に、 1. 5 gZm 1の濃度のフイブロネクチン溶液 2 m l (実施例 1) 、或いはコラーゲン溶液 2 m 1 (実施例 2)を上記培養皿に入れ、 20°C 1時間インキュベートすることにより海部分のみに吸着させること（20 では、 P I PAAm部分は親水性であり、接着性蛋白を付着させなかった。）で本発明である細胞培養支持体材料を得た。

得られた細胞培養支持体材料上にて、常法によりゥシ大動脈血管内皮細胞を培養した（使用培地：ゥシ胎児血清（FCS) を 10%含むダルベッコ一改変ィーグル培地（DMEM) 。 37で、 5%C0₂下）。培養した結果を表 1に示す。実施例 3、 4

金属製マスクを、直径 0. 5mm、中心間距離 0. 8 mmのもの（実施例 3) 、直径 1. 5mm、中心間距離 5 mmのもの（実施例 4) に変更した以外は、実施例 1と同様の方法で細胞培養支持体材料を得た。

実施例し 2と同様な方法でゥシ大動脈血管内皮細胞を培養した。培養した結果を表 1に示す。実施例 5、 6

上記ファルコン 3002ペトリディッシュ（直径 6 cm) 上に、 N Γソプ口ピルァクリルアミドモノマーを 35 %になるようにイソプロピルアルコールに溶解させたものを 0. 35m 1塗布した後、そのままの状態で 0. 25MGyの強度の電子線を照射し、培養皿表面全体に N—イソプロピルアクリルアミドポリマ一（P I PAAm) を被覆させた。さらにその上に N—イソプロピルアクリルアミドモノマーの 10 %イソプロピルアルコール溶液（実施例 5) 、或いは 2 0 %イソプロピルアルコール溶液（実施例 6) を 0. 35m 1塗布し、その塗布面上に直径 lmm、中心間距離 1· 5 mmの孔をもつ金属製マスク（図 1の a) をのせ、 0. 25MGy強度の電子線を照射し、 N Γソプロピルアクリルアミドポリマー（P I PAAm) をドメイン状（島状の部分。 ) に多く被覆させた。照射後、実施例 1、 2と同様に洗浄、乾燥し、滅菌工程を経ることで細胞培養支持体材料を得た。ここで海部分の P I PAAmの被覆量は、実施例 1、 2と同様により求めた結果、 1. 6 gZcm2であった。同様に島部分の被覆量はそれぞれ 1. 8 ^gZcm² (実施例 5) 、 2. 0 g/cm² (実施例 6) であった。得られた細胞培養支持体材料上にて、実施例 1、 2と同様な方法でゥシ大動脈血管内皮細胞を培養した。培養した結果を表 1に示す。比較例

上記ペトリディッシュ（直径 6 cm) 上に、 N—イソプロピルアクリルアミドモノマーの 35 %イソプロピルアルコール溶液を 0. 35ml塗布した後、そのままの状態で 0. 25MGyの強度の電子線を照射し、培養皿表面全体に N—ィソプロピルアクリルアミドボリマー（P I PAAm) を被覆させた。その後、さらにその上に N Γソプロピルアクリルアミドモノマーの 40 %イソプロピルァルコール溶液を 0. 35m l塗布し、その塗布面上に直径 lmm、中心間距離 1. 5mmの孔をもつ金属製マスク（図 1の a) をのせ、 0. 25MGy強度の電子線を照射し、 N—イソプロピルアクリルアミドボリマ一（P I PAAm) をドメイン状（島状の部分。）に多く被覆させた。照射後、実施例 1、 2と同様に洗浄、乾燥し、滅菌工程を経ることで細胞培養支持体材料を得た。実施例 1、 2と同様に海部分と島部分の P I PAAmの被覆量を求めたところ、それぞれ 1. 6 g / c m²> 5. 5 gz cm²であった。

得られた細胞培養支持体材料上にて、実施例 1、 2と同様な方法でゥシ大動脈血管内皮細胞を培養した。培養した結果を表 1に示す。比較例 2

1回目の照射時に 60 %イソプロピルアルコール溶液を 0. 35m l塗布した後、そのままの状態で 0. 4MGyの強度の電子線を照射したこと以外は比較例 1と同様な手段により細胞培養支持体材料を得た。実施例 1、 2と同様に海部分と島部分の P I PAAmの被覆量を求めたところ、それぞれ 5. 3 g/cm\ 8. 9 g/cm²であった。

得られた細胞培養支持体材料上にて、実施例 1、 2と同様な方法でゥシ大動脈血管内皮細胞を培養した。培養した結果を表 1に示す。実施例 7

上記ペトリディッシュ（直径 6 cm) 上に、幅 lmm、間隔 lmmのライン状に孔をもつ金属製マスクをのせ（のせた場所に印をつける。）、 N— n—プロピルアクリルアミドモノマーの 35 %イソプロピルアルコール溶液を 0. 35m 1塗布させた後、 0. 25 MGyの強度の電子線を照射した。照射後、実施例 1、 2 と同様に洗浄、乾燥し、まず格子状にポリマーが被覆した基材を製造した。その後、先のマスクのライン状の孔を lmmずらして置き（先のマスク部分に孔がくるようにする。）、今度は N—イソプロピルアクリルアミドモノマーの 35 %ィソプロピルアルコール溶液を 0. 35m l塗布し、 0. 25MGyの強度の電子線を照射し、 N— n—プロピルァクリルアミドポリマーと N—イソプロピルァクリルアミドボリマーがライン状に交互に被覆した。照射後、実施例し 2と同様に洗浄、乾燥し、滅菌工程を経ることで細胞培養支持体材料を得た。実施例 2と同様にそれぞれのポリマーの被覆量を求めたところ、いずれも 1. ら a c m²であった。

得られた細胞培養支持体材料上にて、実施例し 2と同様な方法でゥシ大動脈血管内皮細胞を培養した。培養した結果を表 1に示す。実施例 8、 9

上記ペトリディッシュ（直径 6 cm) 上に、 N—n—プロピルアクリルアミドモノマー（実施例 8) 、 N—テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（実施例 9)の 30 %イソプロピルアルコール溶液を 0. 35ml塗布させたこと以外は実施例 5、 6と同様に培養皿表面全体にそれぞれのポリマーを被覆させ、その後、さらに実施例 5と同様に N—イソプロピルアクリルアミドモノマーの 10%イソプロピルアルコール溶液を塗布し、それぞれのポリマーが被覆された中に N—ィソプロピルアクリルアミドボリマー（P I PAAm) をドメイン状に多く被覆させた。照射後、実施例 2と同様に洗浄、乾燥し、滅菌工程を経ることで細胞培養支持体材料を得た。実施例 1、 2と同様に海部分と島部分の P I PAAmの被覆量を求めたところ、それぞれ 1. 5 gZcm²、 2. O wg/cm²であつた（実施例 8、 9共に同じ結果であった。）。

得られた細胞培養支持体材料上にて、実施例 2と同様な方法でゥシ大動脈血管内皮細胞を培養した。培養した結果を表 1に示す。表 1

実施例 1〜 9の結果から、本願発明で示される温度応答性高分子が被覆された種々の形態の細胞培養支持体材料いずれにおいても通常の細胞培養が行え、細胞の付着性、増殖性等のようすも市販のペトリディッシュと同等であった。一方、比較例 1、 2で示されるように、細胞培養支持体材料表面の一部、もしくは全部において温度応答性高分子が多量に被覆されているとき、その部分への細胞の付着は認められず、細胞培養支持体材料として好ましいものではなかつた。実施例 10、 11

実施例 1、 2で得られた細胞培養支持体材料（それぞれ実施例 10、実施例 1 1) 上で、この表面にラット肝実質細胞を 10⁷個を播種し、 37 で1日（実施例 10、図 1の b) 、および 2日（実施例 1 1) 培養させた（使用培地： 1 0%ゥシ胎児血清（FCS) 、 10— ⁸Mデキサメサゾン、 10— ⁷Mインスリン、 10mMニコチンアミド、さらに 10 n g/m 1表皮成長因子（EGF) を含む W i 1 1 i ams E培地。 37Τ 5%C0₂下）。図 1の bによれば、全面に肝実質細胞が接着 ·伸展していることがわかる。

培養後、 20でで 2時間インキュベートし、ピペッティングにより P I PAAm ドメインからのみ肝実質細胞を脱着させた（例えば実施例 10の場合、図 1の c) 。図 1の cは、 P I PAAmをグラフトした温度応答性ドメインからのみ細胞が脱着したことを示している。再び、細胞培養支持体材料の温度を 37 °Cにし、ラット血管内皮細胞を 10⁷ 個播種した。内皮細胞は細胞のいない P I PAAmドメインにのみ接着した。その後 37でで 3日間共培養した（使用培地： 10%ゥシ胎児血清（FCS) 、 1 0一⁸ Mデキサメサゾン、 10— ⁷Mインスリン、 10mMニコチンアミド、さら〖こ 10 n g/m 1表皮成長因子（EGF) を含む W i 1 1 i ams E培地とゥシ胎児血清（FCS) を 10 %含むダルベッコ一改変イーグル培地（DMEM) を 1 ： 1で混合したカクテル培地。 37°C、 5%C0₂下）。図 1の dは、実施例 10の 3日後の各細胞の増殖状態を示す図である。図 1の dによれば、マスクパターン通りに肝実質細胞と内皮細胞が安定に共培養できていることがわかる。常法に従い、共培養後の肝実質細胞のアルブミン産生能を測定した結果を表 2 に示す。比較例 3

市販のペトリディッシュファルコン 3002 (直径 6 cm) 上で実施例 10 と同様にラット肝実質細胞を培養させた。培養後、実施例 10と同様に 20でで 2時間インキュベートし、ピベッティングにより基材表面の細胞を剥離させようとしたが困難であった。一方で、同じ細胞培養基材上でラット肝実質細胞を培養し続けた。そのときの肝実質細胞のアルブミン産生能を測定した結果を表 2に示す。実施例 12

実施例 5で得られた細胞培養支持体材料上で、この表面にラット肝実質細胞を 10⁷個を播種し、 37でで 2日培養させた（使用培地： 5%ゥシ胎児血清（F CS) 、 10— ⁸Mデキサメサゾン、 10— ⁷Mインスリン、 10mMニコチンァミド、さらに 10 n g/m 1表皮成長因子（EGF) を含む W i 1 1 i ams E培地。 37で、 5%C〇₂下）。培養後、 20°Cで 30分間インキュベートし、ピベッティングにより P I PAAmが多く被覆したドメインからのみ肝実質細胞を脱着させた。再び、細胞培養支持体材料の温度を 37 °Cにし、ラッ卜血管内皮細胞を 10⁷個播種した。内皮細胞は肝実質細胞の剥がれた細胞のいない部分のみに接着した。その後 37°Cで 3日間共培養した（使用培地： 10%ゥシ胎児血清（FCS) 、 10_⁸Mデキサメサゾン、 1 0_⁷Mインスリン、 1 0mMニコチンアミド、さらに 1 O ngZm l表皮成長因子（EGF) を含む W i I l i a ms E培地とゥシ胎児血清（FCS) を 10 %含むダルベッコ一改変イーグル培地（DMEM) を 1 ： 1で混合したカクテル培地。 37° (：、 5%C0₂下）。常法に従い、共培養後の肝実質細胞のアルブミン産生能を測定した結果を表 2に示す。比較例 4

実施例 5と同様な方法で、まずファルコン 3002ペトリディッシュ（直径 6 cm) 表面全体に N—イソプロピルアクリルアミドボリマー（P I PAAm) を被覆させた。その後、さらにその上に N—イソプロピルアクリルアミドモノマーの 5 %イソプロピルアルコール溶液を 0. 2m l塗布する以外は実施例 5と同様な方法で細胞培養支持体材料を得た。実施例 2と同様に海部分と島部分の P I PAAmの被覆量を求めたところ、それぞれ 1. 6 g/cm²、 1. 65 ^ g/ c m²であった。

得られた細胞培養支持体材料上にて、実施例 12と同様な方法で肝実質細胞を培養した。培養後、 20でで 30分間インキュベートし、ピペッティングにより P I P A Amが多く被覆したドメインからのみ肝実質細胞を脱着させようとしたが、島部分だけでなく、海部分に存在する肝実質細胞も剥離してしまい、本発明の細胞培養支持体材料として好ましいものではなかった。実施例 1 3

実施例 8で得られた細胞培養支持体材料上で、この表面にラット肝実質細胞を 10⁷個播種し、 37でで 2日培養させた（使用培地： 5%ゥシ胎児血清（FC S) 、 1 0— ⁸Mデキサメサゾン、 1 0— ⁷Mインスリン、 1 OmMニコチンアミド、さらに 1 O ngZm l表皮成長因子（EGF) を含む W i 1 1 i ams E 培地。 37°C、 5%C0₂下）。培養後、 25でで 1時間インキュベートし、ピペッティングにより P I PAAmが被覆したドメインからのみ肝実質細胞を脱着させた。再び、細胞培養支持体材料の温度を 37でにし、ラット血管内皮細胞を 10⁷個播種した。内皮細胞は肝実質細胞の剥がれた細胞のいない部分のみに接着した。その後 37 で 3日間共培養した（使用培地： 10%ゥシ胎児血清（F CS) 、 10—⁸Mデキサメサゾン、 10— ⁷Mインスリン、 10mMニコチンァミド、さらに 10 n gZm 1表皮成長因子（EGF) を含む W i 1 1 i ams E培地とゥシ胎児血清（FCS) を 10 %含むダルベッコ一改変イーグル培地 (DMEM) を 1 ： 1で混合したカクテル培地。 37° (：、 5%C0₂下）。常法に従い、共培養後の肝実質細胞のアルブミン産生能を測定した結果を表 2に示す。比較例 5

上記巿販ペトリディッシュ（直径 6 cm) 上に、 N— n—プロピルメタクリルアミドモノマ一の 30%イソプロピルアルコール溶液を 0. 35ml塗布させたこと以外は実施例 5、 6と同様に培養皿表面全体にそれぞれのポリマーを被覆させ、その後、さらに実施例 5と同様に N—テトラヒドロフルフリルアクリルアミドモノマーの 20 %イソプロピルアルコール溶液を塗布し、 N— n—プロピルメタクリルアミドポリマーが被覆された中に N—テトラヒドロフルフリルァクリルアミドボリマ一をドメイン状に多く被覆させた。照射後、実施例 1、 2と同様に洗浄、乾燥し、滅菌工程を経ることで細胞培養支持体材料を得た。実施例 1、 2 と同様に海部分と島部分の P I PAAmの被覆量を求めたところ、それぞれ 5 g/cm², 2. 1 gZcm²であった。

得られた細胞培養支持体材料上にて、実施例 12と同様な方法で肝実質細胞を培養した。培養後、 20°Cで 30分間インキュベートし、ピペッティングにより P I PAAmが多く被覆したドメインからのみ肝実質細胞を脱着させようとしたが、島部分だけでなく、海部分に存在する肝実質細胞も剥離してしまい、本発明の細胞培養支持体材料として好ましいものではなかつた。表 2

実施例 1 0〜 1 3の結果から、本願発明で示される共培養方法に従えば、従来技術では数日しか保持できなかった肝実質細胞の活性（比較例 3) を 4週間という極めて長期にわたって保持させられることが分かる。実施例 1 4

実施例 7で得られた細胞培養支持体材料上で、この表面にラット脳内神経細胞を 1 0⁷個播種し、常法にて 30でで 3日培養（使用培地： 5 a g/m 1 ヒトトランスフェリン、 5mgZm 1ブタインスリン、 2 0 nMプロゲステロン、 3 0 nM亜セレン酸ナトリウム、 Ι Ο Ο ^Μプトレシン、 5 0 単位 11 1ストレプトマイシン、 5 0 単位 Zm 1ペニシリンを含む MEM、 Ham ' s F - 1 2 1 ： 1混合培地。 3 0 ：、 5 %C〇₂下）し、まず N— n—プロピルアクリルァミドポリマー上にラット脳内神経細胞をライン状に増殖させた。培養後、細胞培養支持体材料の温度を 3 7でとし、ラットグリア細胞を 1 0⁷個播種し、培養した（使用培地：上の神経細胞を培養した培地とゥシ胎児血清（FC S) を 1 0 % 含む DMEM、 Ham ' s F— 1 2 1 ： 1混合培地を 1 ： 1で混合したカクテル培地。 3 7°C、 5 %C〇₂下）。グリア細胞は神経細胞のない部分に接着し、ライン状に増殖した。その後 3 7でで 3日間共培養した。

その結果、神経細胞とグリア細胞はどちらか一方が多量に増殖するようなことはなく、またそれぞれが混じり合うようなこともなく、それぞれライン状に増殖させることができた。

このことより、本発明の細胞支持体材料を用い、本発明に示すところの共培養方法に従えば、従来、困難であった神経細胞とグリア細胞をパターン状に培養することが可能となり、この共培養されたものはバイォチップとして有用である。実施例 15、 16

実施例 12、 13で共培養された肝実質細胞および血管内皮細胞を、細胞培養支持体材料と共に 20°Cで 2時間インキュベートし、ピベッティングすることにより全て剥離させた（それぞれ実施例 15、実施例 16) 。常法に従い、剥離された細胞のアルブミン産生能を測定した結果を表 3に示す。表 3

実施例 15、 16の結果から、本願発明で示される共培養方法に従えば、従来技術では数日しか保持できなかった肝実質細胞の活性（比較例 3) を 4週間という極めて長期にわたって保持させられ、しかも実施例 10〜13に示される活性よりさらに高くさせられることが分かる。実施例 17

実施例 5で得られた細胞培養支持体材料上で、この表面にラット肺胞上皮細胞 (全細胞数の 15 %は線維芽細胞が混在）を 10⁶個播種し、常法に従い 37 で 13日間培養（使用培地： 2%ゥシ胎児血清（FCS) 、 l O gノ m lインスリン、 100 n gZm 1コレラトキシン、 5 gZm 1コルチヅールを含む D MEM、 Ham ' s F— 12を 1 ： 1で混合したカクテル培地。 37° (：、 5 % C〇₂下）し、細胞培養支持体材料表面全体に増殖させた。培養後、 20°Cで 2 時間インキュベートし、ピベッティングすることにより基材表面の細胞全体を剥離させた。その後、細胞培養支持体材料内に 37での上記培地入れ、先に剥離させた細胞シートを戻した。得られた結果を図 2〜4に示す。図 2， 3は肺胞上皮細胞から分泌されるサーファクタントプロテインを常法に従い蛍光染色した結果である。線維芽細胞が混在した肺胞上皮細胞を細胞培養支持体材料から剥離させる前（培養 1 3日後、図 2 a ) 、肺胞上皮細胞からサーファクタントプロテインが十分に分泌されていることが分かるが、それをそのまま 2 2日間培養すると分泌量は激減している。一方、培養 1 3日後に、上記方法にて剥離させ、再び細胞培養支持体材料上に付着させたものは、剥離後さらに 3 0日培養（図 3 a ) 、 6 0日培養（図 3 c ) させても分泌されていることが分かる。このことより、本発明の細胞支持体材料を用レ本発明に示すところの共培養方法に従えば、従来、困難であった肺胞上皮細胞を長期にわたり活性を維持させられるようになった。さらに、このことは肺胞上皮細胞表層の特異的な糖鎖の発現からも明らかであった。図 4 aは培養 1 3曰後の肺胞上皮細胞表層糖鎖を常法に従い蛍光染色した結果である。図 4 bは剥離させた後、再び細胞培養支持体材料上に付着させたときのものであり、上記方法により肺胞上皮細胞が明らかに活性化されていることが分かる。産業上の利用の可能性

従来の細胞培養基材に比べ、本願発明の細胞支持体材料は、材料表面に被覆されている各高分子の種類、量、被覆面積などをコントロールすることでさまざまな培養方法に活用できるものである。その結果、従来技術では活性を高く維持し続けることが全く困難であった肝実質細胞、肺胞上皮細胞、神経細胞等細胞の培養においても十分な活性を長期にわたり保持させることが可能となった。このような結果は、全く初めての例であり、したがって、本発明の細胞培養用支持体材料並びに該材料を用いた細胞の共培養方法および細胞シートの作製方法は、細胞工学、遺伝子工学、医用工学、などの医学、安全評価、生物学等の分野において極めて有用な発明である。

Claims

請求の範囲

1 . 温度応答性高分子が被覆された A領域と、

( 1 ) 細胞と親和性の高い高分子が被覆されている領域、

のいずれか、または（1 ) 〜（3 ) の任意の 2つもしくは 3つの組み合わせからなる B領域の 2領域を表面に持つことを特徴とする細胞培養支持体材料。

2 . 少なくとも 1つの温度応答性高分子がポリ（N—イソプロピルアクリルァミド）である、請求項 1記載の細胞培養用支持体材料。

3 . 請求項 1、 2のいずれか 1項記載の細胞培養用支持体材料を用いることを特徴とする細胞の共培養方法。

.

4. B領域の全てが温度応答性高分子で被覆されていない請求項 1、 2の支持体表面上において、まず細胞を所定期間培養させた後、温度応答性高分子上の細胞の全てもしくは一部を剥離、除去し、その後、異種の細胞を播種し培養させること、或いはさらにそれを繰り返すことを特徴とする細胞の共培養方法。

5 . B領域のすべてが温度応答性高分子で被覆されている請求項 1、 2の支持体表面上において、まず細胞を所定期間培養させた後、温度応答性高分子上の細胞の一部を剥離、除去し、その後、異種の細胞を播種し培養させること、或いはさらにそれを繰り返すことを特徴とする細胞の共培養方法。

6 . B領域の全てもしくは一部に、 A領域と異なる温度応答性高分子が被覆されている請求項 1、 2の支持体表面上において、まず A、 Bいずれかの領域の高分子上に細胞を付着、増殖させ、その後、もう一方の高分子上に異なる細胞を付着、培養させることを特徴とする細胞の共培養方法。

7 . 請求項 1 , 2の支持体上で、培養開始時から複数の種類の細胞を播種し、培養させ、その後、その全てもしくは一部を剥離させ、再びそのものを基材に付着させること、或いはさらにそれ—を繰り返すことを特徴とする細胞の共培養方法。

8 . 共培養する細胞の組み合わせが、肝実質細胞と内皮細胞、肺胞上皮細胞と線維芽細胞、神経細胞とグリァ細胞であることを特徴とする請求項 3〜 7記載の細胞の共培養方法。

9 . 請求項 3〜 8の共培養方法によって得られる支持体表面上の細胞を剥離させることで得られる共培養細胞シ一ト