WO2001077179A1 - Proteine mit hoher immunreaktivität sowie ein verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents

Proteine mit hoher immunreaktivität sowie ein verfahren zu ihrer herstellung Download PDF

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Ivan F. Benes
Silke Thomsen-Bosslet
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Definitions

  • the invention relates to preparations of immunoreactive proteins, preferably in purified form, which have a high proportion of immunoreactive molecules with respect to the total number of molecules. These proteins can be obtained by fermentation of a host cell expressing the immunoreactive protein in a fluidized bed reactor and recovery of the protein from the host cell or of the medium used for cultivation.
  • the protein preparations according to the invention are outstandingly suitable for the production of diagnostic and therapeutic compositions.
  • Diagnostic and therapeutic proteins can be found both in prokaryotic (e.g. E. coli (Houston et al., US Patent 5, 1, 32.405)) and in eukaryotic cell systems (e.g. Pichia pastoris, Baby Hamster Kidney (BHK-) cells, Chinese Hamster Ovary (CHO) cells, hybridomas, transgenic animals and plants (Meade et al., US Pat. No. 4,873,31 6)) are expressed and purified using protein chemical methods.
  • prokaryotic e.g. E. coli (Houston et al., US Patent 5, 1, 32.405)
  • eukaryotic cell systems e.g. Pichia pastoris, Baby Hamster Kidney (BHK-) cells, Chinese Hamster Ovary (CHO) cells, hybridomas, transgenic animals and plants (Meade et al., US Pat. No. 4,873,31 6)
  • prokaryotic e.g. E. coli (Houston e
  • Prokaryotic cell systems allow the inexpensive production of smaller, carbohydrate-free proteins due to the undemanding nutrient media and the rapid growth of the microorganisms in less demanding fermentation systems.
  • the nature of the The (glyco) protein preparations to be cleaned are very decisively influenced by the cell culture medium and the fermentation system used. Differences in the glycosylation of the protein, which have an influence on the half-life in the plasma and on certain biological effector functions of the purified (glyco) protein preparation, have been described in the specialist literature (Stahl et al., PNAS, 73 (1 976), 4045-4049).
  • the percentage of functionally active (glyco) proteins in the purified preparation is an important factor determining the quality of the product, which can also be influenced by cell culture medium, fermentation conditions and purification processes.
  • the method of choice for determining the proportion of functionally active, radiolabeled molecules is that of Lindmo et al. (Immunological Methods 72 (1 984), 77) for the first time described quantitative binding assay in excess of antigen. This method allows the proportion of immunoreactive and bindable radiolabeled MAb to be determined quantitatively after protein chemical purification.
  • Other binding assays such as that of Seitz et al.
  • the percentage of functionally active MAb molecules moves in conventional fermentation processes, such as stirred fermenters and hollow fiber modules, and in classic protein chemical processes that, in addition to protein A columns, also ion exchange columns and in many cases also gel chromatography columns contain, purified preparations in the range of 40 to 80% when the Lindmo test is used (Mattes, MJ, Int. J.
  • Granulocytes used in excess antigen despite the addition of a 1 0,000 fold molar excess of unlabeled specific MAb (Schubiger et al., Euro J. Nucl. Med., 1 5 (1 989), 605-608). Accordingly, the immunoreactivity value after subtracting the non-specific binding is ⁇ 90%.
  • radioactively labeled diagnostic monoclonal antibodies a reduced immunoreactivity of the MAb is particularly disadvantageous, since radiolabeled molecules that do not bind to the specific target structure circulate in the blood, contribute to the non-specific background, are partially absorbed into the liver and make interpretation of nuclear medical findings more difficult , In the case of radiolabeled therapeutic antibodies, the portion does not carry the target tissue bound MAb molecules for the unspecific and undesired irradiation of non-target tissues.
  • MAb preparations (also GMP-compliant) that have an immunoreactivity of between 80 and 90% can be produced from these cell culture supernatants using conventional purification processes.
  • the loss of immunoreactivity of approx. 10% observed in the course of the purification is due to the large number of column chromatographic steps.
  • the invention thus relates to a preparation of immunoreactive proteins, the percentage of immunoreactive molecules determined in a modified Lindmo test being> 81%, preferably> 90% and particularly preferably> 95% with respect to the total number of molecules.
  • the immunoreactive proteins can be obtained by production in cell culture, in particular in eukaryotic host cells.
  • the immunoreactive proteins can be coupled to a label, in particular a radioactive label, without loss of activity.
  • Immunoreactive proteins in the sense of the present invention are proteins which contain at least one antibody binding domain.
  • proteins are antibodies, in particular monoclonal antibodies, chimerized antibodies, humanized antibodies, recombinant antibodies, such as single-chain antibodies or fragments thereof, for example proteolytic Fragments such as Fab, Fab 'or F (ab) 2 fragments or recombinant antibody fragments, such as single chain Fv fragments
  • fusion proteins can also be used which have at least one antibody binding domain and a further domain, e.g. contain an effector domain such as an enzyme or cytokine.
  • an effector domain such as an enzyme or cytokine.
  • scFv cytokines e.g. scFv-IL1, scFv-IL2, scFv-IL6, scFv-IL1 0, scFv-IL1 1, scFv-IL1 2, scFv-TNF, SCFV-I FN, scFv-IFNß, scFv-IFN ⁇ or scFv coagulants, e.g.
  • scFv-tTF scFv- (deoxy) ribonuclease ⁇ or fusions with enzymes, such as that in B ⁇ tish J. Cancer 654 (1 992), 234-238, described fusion protein, consisting of the VH-CH 1 heavy chain of the humanized MAb BW 431/26 fused via a linker to ⁇ -glucuronidase and the humanized VL-CL light chain of the same humanized MAb ,
  • the protein preparations according to the invention are obtainable by fermentation in a fluidized bed reactor.
  • the cultivated host cells e.g. B. Hyb ⁇ dom cells or other eukaryotic cells
  • Dying cells detach from the glass spheres and are continuously removed from the fermentation system with the harvested medium.
  • the amounts of proteases and cell debris in the fermentation system can be kept low and the integrity of the protein produced can be guaranteed.
  • An example of a suitable fluidized bed fermentation reactor is the Bioreactor Pilot B 500 (Papaspyrou Biotechnologie GmbH).
  • the immunoreactivity of the protein preparations according to the invention is measured by the modified Lindmo test described in Example 3.
  • the antigen-containing material When carrying out this test, it is essential that the antigen-containing material is used in excess in order to quantitatively bind the immunoreactive protein, for example the MAb. Furthermore, it is important that the antigen-containing material contains a sufficient amount of epitopes so that unspecific adsorption effects caused by large surfaces can be neglected. Epitope densities of> 10 4 per fixed cell are preferred.
  • the reading point for the immunoreactivity is the point at which a control MAb (same isotype as the test MAb but irrelevant binding region) shows no significant non-specific adsorption.
  • the protein preparations according to the invention obtained and their advantageous use as a diagnostic and therapeutic agent are also described below.
  • New to production process I is fermentation in a fluidized bed reactor in combination with a conventional cleaning process.
  • the immunoreactivity of the (glyco) protein to be produced e.g. a MAb
  • T-bottles, fluid bed reactor, purified protein > 90% in the Lindmo test, mostly even 95%, as shown by way of example in Example 1 for the MAb BW 250/1 83.
  • comparable high immunoreactivity values have not been achieved with any in vitro production process described in the prior art.
  • MAb BW 431/26 selective for CD66e
  • MAb BW 278/1 05 selective for a subpopulation of FVIII RAG
  • MAk BW 575/931 selective for N-CAM
  • MAk YTH 24.5 selective for CD45
  • the production methods according to the invention can be used for the GMP-compliant production of a large number of (glyco-) proteins which have no Fc part, including the fusion protein described by Bosslet et al (British Journal of Cancer, 645 (1,992) , 234-238), an alternative affmitate chromatography method being used instead of protein A affinity chromatography (anti-idiotype, lectin column, protein L, nickel acid, etc.)
  • Figure 1 shows the description of a fluidized bed fermentation reactor
  • the reactor (2) is equipped with support balls (4), e.g. B. balls of open-pore sintered glass with a diameter of preferably 0.4 to 0.7 mm, which are subjected to an acid treatment (z. B. 2, 5 N HCI and 5% nitric acid) and after neutra sation by heat treatment (z. B. 220 ° C, 6 h) were sterilized, partially filled.
  • the reactor continues to contain a Aeration module (6) with which a gas mixture (8) is blown into the reactor and swirled out to swirl the carrier balls.
  • the reactor is also equipped with pH electrodes, oxygen electrodes, temperature probes etc.
  • the medium is recirculated in a circuit (10) at a flow rate of, for example, 450 to 500 ml / min.
  • the circuit may include an inlet of fresh medium (12), a pump (14) and a sampling valve (16).
  • the line (18) removes medium for harvesting the protein contained therein.
  • the MAk-containing samples of the cell culture supernatants or the purified MAk end products were treated as exactly described in Example 3 and the modified Lindmo test was carried out according to the instructions.
  • a MAb of the same isotype (IgG-), same light chain (K), comparable isoelectric point and irrelevant specificity was used as negative control.
  • the positive control is a batch of MAb BW 250/1 83 purified on an antigen column on an analytical scale with an immunoreactivity of 91 to 94%.
  • the result curve is shown in FIG. 2A.
  • MAb Purified MAb end product
  • MAb Purified MAb end product
  • MAb MAb end product
  • WF fluidized bed fermentation
  • SR "low-column” cleaning
  • the immunoreactivity of the MAb BW 250/1 83 is clearly dependent on the fermentation and purification conditions. In conventional fermentation, typically up to 80% of the immunoreactivity is achieved in the cell supernatant - but in the new fermentation process using a fluidized bed reactor, the immunoreactivity is significantly higher at 97%.
  • the cleaning process also affects the immunoreactivity of MAb.
  • the new "low-column” cleaning process is much gentler than the conventional cleaning process (8% decrease in immunoreactivity in the conventional process compared to only 1% waste in the new "low-acid” cleaning process).
  • Bone marrow display clearly shows the liver and spleen
  • a group of 1,9 patients with acute myeloid leukemia or chronic myeloid leukemia was treated as part of a healing trial.
  • Batches of MAb BW 250/1 83 (immunoreactivity> 90%) were labeled with Re 188 (specific activity; 5-7, 5 GBq / mg) and 6.5-1 2.4 GBq administered iv.
  • the patient population consisted of people with a risk of recurrence of 40-50% within 2 years. Surprisingly, radioimmunotherapy did not induce any significant side effects. This was followed by standard therapy consisting of 1 2 Gray whole-body radiation and cyclophosphamide administration. All 1 9 patients could be brought into a complete remission, which indicates the future role of radioimmunotherapy with MAb BW 250/1 83 in the treatment of leukemia in connection with standard therapies. It seems conceivable that radioimmunotherapy will replace the full-body radiation with side effects.
  • MAb BW 250/1 83 with an immunoreactivity> 90% Another advantage of using MAb BW 250/1 83 with an immunoreactivity> 90% is that the amount of MAb administered could be reduced from 1 mg per application to 0.5 mg per application. This reduction led to a HAMA (human-anti-mouse-anti-body) frequency which was below 2% and thus did not deviate significantly from the background HAMA values of normal people
  • standard cell culture conditions synthetic protein-free cell culture medium
  • the cells After reaching a cell number of 1, 2-1, 5 x 10 9 cells, the cells are placed in a fluidized-bed reactor containing 900 ml of cell culture medium and 200 ml of S ⁇ ran R -Car ⁇ er (Bioreactor Pilot B 500, Papaspyrou Biotechnologie GmbH, Technologie scholar Julich, D-52428 Julich ) inoculated and cultivated according to the handling instructions of the company Papaspyrou Biotechnologie for 60 days at 36.5 ° C oxygen content, pH value, glucose concentration and the MAb content are checked at 1-4 day intervals.
  • the cell culture supernatant is continuously harvested and stored at 4 ° C Protein chemical purification using a conventional process
  • the volume of the culture ultra concentrate to be worked up is also determined and, while stirring, 1.5 times the amount of saturated ammonium sulfate solution is slowly added.
  • the amount of dissolved sediment calculated for a Protein A run is mixed with an aqueous Triton X-100 O solution, 100 g / l, with stirring, so that the final concentration of Triton X-100 is 0.5% (50 ml Triton X- 1 OO solution per 1,000 ml dissolved sediment).
  • the Protein A fractionation is then carried out immediately.
  • the sample is applied under aseptic conditions as possible and by means of a pump, the flow rate being able to correspond to one to two times the column volume per hour, so that contact between MAb and Protein A is ensured for at least 30 minutes.
  • the proteins and Triton which do not bind to protein A are washed off the column with start buffer and rinsed until the extinction / transmission of the flow rate reaches the initial value of the start buffer again (duration: 0.5 to 3 hours ).
  • the MAb is eluted with elution buffer, pH 3.0.
  • the eluate is collected in a vessel cooled with flake ice (weighed glass bottle) in which approx. 1/10 of the column volume is 2 M Tris / HCl, pH 8.0 was submitted.
  • the clarified protein solution is immediately applied to a regenerated column equilibrated with Tris / HCl-NaCl buffer, pH 7.5 with Sephadex G-25.
  • the volume of the protein solution to be salted should not exceed 15% of the column volume.
  • the solution coming from the column is passed through a flow photometer and then through a pH ion monitor.
  • the column is rinsed with Tris / HCl-NaCl buffer, pH 7.5 at a flow rate in the column of approximately 20 ml per cm 2 and per hour.
  • the MAb running in the exclusion volume of the column is collected in a sterile template according to the UV line recorder profile until the initial value of the extinction / transmission (approx. 95%) is registered again on the line recorder.
  • the conductivity of the solution is checked and, if necessary, adjusted to the conductivity of the buffer by adding sodium chloride solution, 10 g / l or water for injection purposes.
  • the product is applied to a prepared Q-Sepharose column under as aseptic conditions at a rate of 1 50 ml per hour (2 to 5 mg protein per ml Q-Sepharose). Elution is carried out with Tris / H CI-N a CI buffer, p H 7.5 at a flow rate of approx. 25 ml per cm 2 and per hour.
  • the solution coming from the column is passed through a flow photometer and then through a pH / ion monitor.
  • the pH of the MAb-containing eluate after the anion exchange chromatography is adjusted to pH 6.9 with 1 N HCl or 1 N sodium hydroxide solution.
  • the clarified protein solution is immediately applied to a regenerated column equilibrated with sodium phosphate-NaCI sorbitol buffer, pH 7.2, with Sephadex G-25 under as aseptic conditions (maximum 1 5% of the column volume).
  • the solution coming from the column is passed through a flow photometer and then through a pH / ion monitor.
  • the column is filled with sodium phosphate-NaCI sorbitol Buffer, pH 7.2 (flow rate approx. 20 ml per cm 2 and per hour) rinsed.
  • the MAb in the reject volume of the column is collected in a sterile template according to the UV line recorder profile until the initial value of the extinction / transmission (approx. 95%) is registered again on the line recorder.
  • the pH of the solution is checked and adjusted to pH 7.2 with 1 N HCl or 1 N sodium hydroxide solution.
  • the "final bulk" is diluted to the desired final concentration with sodium phosphate-NaCl sorbitol buffer, pH 7.2.
  • the product is sterile filtered through a 0.2 ⁇ m disposable filter, aliquoted and the "final bulk" stored at -20 ° C.
  • standard cell culture conditions synthetic protein-free cell culture medium
  • the cells After reaching a cell count of 1, 2- 1, 5 x 1 0 9 cells the cells are inoculated into a fluidized bed reactor containing 900 ml of cell culture medium and 250 ml of Siran R carrier (bioreactor Pilot B 500, Papaspyrou Biotechnologie GmbH, Technology Center Julich, D-52428 Julich) and in accordance with the handling instructions from Papaspyrou Biotechnologie for 60 days at 36 , 5 ° C cultivated. Oxygen content, pH value, glucose concentration and the MAb content are checked at 1-4 day intervals. During the fermentation, the cell culture supernatant is continuously harvested and stored at 4 ° C.
  • Siran R carrier bioreactor Pilot B 500, Papaspyrou Biotechnologie GmbH, Technology Center Julich, D-52428 Julich
  • a cell separation is carried out by means of “tangential flow” microfiltration, followed by sterile filtration through a 0.2 ⁇ m filter.
  • the cell-free and sterile cell culture harvest is stored at -20 ° C until sufficient cell culture harvest is available for further purification (cell culture harvest of approx. 250 l cell culture medium).
  • the sterile cell culture harvest is thawed, clarified by microfiltration and concentrated 100 to 150 times by means of ultrafiltration. The ultraconcentrate is then mixed with an equal volume of 2 times concentrated starting buffer (pH 8, 6) and sterile filtered.
  • the Triton-treated ultra concentrate is then pumped onto a Protein A-Sepharose-4-Fast-Flow column, which was previously equilibrated with 5 column volumes of start buffer.
  • Non-binding proteins and Triton X-100 are washed from the column with 5 column volumes of start buffer.
  • the MAb bound to protein A is then washed off the column with the elution buffer (pH 3.0) and collected in 1 30 ml of neutralization buffer (pH 8). Then the pH of the in neutralization buffer collected MAb if necessary adjusted to pH 7-7, 5 with NaOH, diluted with an equal volume of 2x membrane adsorber buffer (pH 7; 5) and sterile filtered.
  • the MAb solution is then pumped under sterile conditions through a membrane adsorber, which was previously equilibrated with WFI and the adsorber buffer (pH 7.5).
  • the flow containing the MAb which is now freed of any contaminating pyrogens and DNA, is collected in a sterile container and adjusted to 500 ⁇ g MAb / ml with a buffer (pH 7.5).
  • the diluted MAb solution is then freed of potentially contaminating viruses by ultrafiltration using a Viragard hollow fiber module.
  • the permeate containing the virus-free MAb is concentrated by ultrafiltration to a concentration of 4-5 mg MAb / ml and diafiltered against final buffer (pH 7.2). After sterile extrusion, dilution in the final buffer and renewed sterile filtration, the MAb is filled in bulk.
  • Substrate buffer 0.5 M Tris, 0.01% MgCl, pH 9.6 - 60.57 g Tris and
  • the concentration of the MUP solution is 1 mg4-MPU / 4. ml substrate buffer.
  • the pH of the solution is adjusted with 5 N NaOH.
  • antiqen-containing material (antiqen-containing material"; ACM)
  • NCA-95 nonspecific cross reacting antigen expressed on the membrane of granulocytes
  • the fixed tissues are passed through a stainless steel mesh.
  • the fixed cells are washed at least 10 times in PBS until the supernatant is reasonably clear and then
  • the ACM is washed at least 10 May with PBS and then the pellet is suspended and incubated in 100 mM glycine (4-fold pellet volume) for 30 minutes at 4 ° C.
  • the cells are then washed 4 more times with PBS.
  • Hybridoma supernatant containing 25 ng MAb BW 250/1 83, incubated overnight at room temperature (upside down rotation).
  • Negative controls are treated with 25 ng of the anti-mycoplasma MAb
  • the ACM is centrifuged off, the supernatant is removed and analyzed for remaining mouse IgG molecules which have not bound to the ACM pellet.
  • the storage time of the pretreated microtiter plates is at least 6 months. Block free binding sites
  • 200 ⁇ l block solution are pipetted per well and the plates are incubated at room temperature for 60 minutes. The block solution is then suctioned off.
  • microtiter plates are washed 3 times with washing solution as described above.
  • the substrate reaction is after incubation at room temperature for
  • Excitation wavelength is 355 nm and the emission wavelength is 460 nm.
  • the sensitivity of this test is in the range of 1 to 2 ng mouse IgG / ml.
  • the immunoreactivity is calculated at the reading point. This point lies with the ACM volume (X axis of the ELISA curve) at which there is just no drop in the plateau value of the non-specific control (non-specific binding).

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Abstract

Die Erfindung betrifft (Glyko-) Proteine, insbesondere monoklonale Antikörper, die über eine Immunreaktivität von >81 % verfügen, vorzugsweise >90 %. Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper werden unter Verwendung eines Wirbelschichtreaktors in Verbindung mit einem konventionellen proteinchemischen Reinigungsverfahren oder vorzugsweise einem säulenarmen Reinigungsverfahren hergestellt. Die so hergestellten monoklonalen Antikörper eignen sich in mit η-Strahlern, wie z.B. Tc-99m markierter Form, zur in vivo Diagnose entzündlicher Erkrankungen und von Knochenmarkmetastasen. In einer mit α- oder β-Strahlern, wie Astatin oder Re-188 bzw. Y-90 markierten Form, können die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper beispielsweise zur Therapie von Leukämien verwendet werden.

Description

Proteine mit hoher Immunreaktivität sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung
Beschreibung
Die Erfindung betrifft Präparationen von immunreaktiven Proteinen, vorzugsweise in aufgereinigter Form, die einen hohen Anteil an immunreaktiven Molekülen bezüglich der Gesamtzahl von Molekülen aufweisen. Diese Proteine sind durch Fermentation einer das immunreaktive Protein exprimierenden Wirtszelle in einem Wirbelschichtreaktor und Gewinnung des Proteins aus der Wirtszelle bzw. des zur Kultivierung ve rwe nd ete n M ed i u m s erh ältl i ch . D i e erf i nd u n g sg e mäße n Proteinpräparationen sind hervorragend zur Herstellung diagnostischer und therapeutischer Zusammensetzungen geeignet.
Diagnostische und therapeutische Proteine können sowohl in prokaryontischen (z.B. E. coli (Houston et al. , US-Patent 5, 1 32,405)) als auch in eukaryontischen Zellsystemen (z.B. Pichia pastoris, Baby Hamster Kidney (BHK-)Zellen, Chinese Hamster Ovary (CHO-)Zellen, Hybridomen, transgenen Tieren und Pflanzen (Meade et al. , US-Patent 4,873,31 6)) exprimiert und mitteis proteinchemischer Verfahren gereinigt werden.
Prokaryontische Zellsysteme erlauben aufgrund der anspruchslosen Nährmedien und des schnellen Wachstums der Mikroorganismen in wenig anspruchsvollen Fermentationssystemen eine kostengünstige Herstellung von kleineren, Kohlenhydrat-freien Proteinen.
Für die Herstellung komplexer, Kohlenhydrat-tragender (Glyko-) Proteine müssen allerdings die oben erwähnten eukaryontischen Zellsysteme verwendet werden, die aufwendige Fermentationssysteme und die
Verwendung von teuren Zellkulturmedien bedingen. Die Beschaffenheit der zu reinigenden (Glyko-) Protein-Präparationen wird dabei ganz entscheidend von dem eingesetzten Zellkulturmedium und dem verwendeten Fermentationssystem beeinfiusst. Vor allem Unterschiede in der Glykosiiierung des Proteins, die einen Einfluss auf die Halbwertzeit im Plasma sowie auf bestimmte biologische Effektorfunktionen der gereinigten (Glyko-) Protein-Präparation haben, sind in der Fachliteratur beschrieben worden (Stahl et al., PNAS, 73 ( 1 976) , 4045-4049) .
Neben dem oben erwähnten Einfluss auf die Kohlenhydrat- Zusammensetzung ist der prozentuale Anteil an funktionell aktiven (Glyko-) Proteinen in der gereinigten Präparation ein wesentlicher, die Qualität des Produktes bestimmender Faktor, der ebenfalls durch Zellkulturmedium, Fermentationsbedingungen und Reinigungsverfahren beeinfiusst werden kann.
Als Methode der Wahl zur Bestimmung des Anteils funktionell aktiver, radiomarkierter Moleküle (z.B. MAk mit physiologisch intakter V-Region) wird der von Lindmo et al. (Immunological Methods 72 ( 1 984), 77) zum ersten Mal beschriebene quantitative Bindungsassay im Antigen- Überschuss verwendet. Diese Methode erlaubt es, den Anteil immunreaktiver und bindefähiger radiomarkierter MAk nach proteinchemischer Reinigung quantitativ zu bestimmen. Andere Bindungsassays, wie der von Seitz et al. (European Journal of Nuclear Medicine 26 ( 1 999), 1 265) beschriebene Immunreaktivitätstest, bei dem Immunreaktivitäten von bis zu 1 00 % beschrieben sind, erlauben nur eine relative Bestimmung des immunreaktiven Anteils von radiomarkierten MAk im Vergleich zum unmarkierten Standard und sind somit zur Bestimmung der absoluten immunreaktiven Fraktion nicht geeignet. Auch das von Jagoda et al. (Journal of Immunological Methods 1 73 ( 1 994) , 1 91 -201 ) beschriebene affinitäts-chromatographische Verfahren zur Bestimmung der Immunreaktivität ist aufgrund des relativ hohen Anteils an unspezifischer Bindung an die Affinitätssäule ( 10-20 %) für eine quantitative Bestimmung des immunreaktiven Anteils nur bedingt verwendbar.
Aber auch der von den meisten Autoren verwendete Lindmo-Test ist trotz des Anspruchs der Autoren auf Generalisierbarkeit der Methode nur zur Evaluierung von radiomarkierten MAk geeignet, deren Bindung unter Verwendung steigender Antigenmengen ein distinktes Plateau ergeben. Mit MAk niedriger Avidität oder im Falle des Mangels an Zellen, die hohe Antigendichten pro Zelle exprimieren, wird oft kein distinktes Plateau erreicht (Mattes, M.J., Int. J . Cancer: 61 ( 1 995) , 286-288) . Selbst in Untersuchungen, bei denen ein definiertes Plateau erreicht wird, können nach Auftragen der Werte aus den Sättigungskurven entsprechend der von Lindmo et al. vorgegebenen Methode zwei sich schneidende Geraden entstehen, deren Schnittpunkt mit der Y-Achse zu unterschiedlichen Immunreaktivitäten führen kann (Mattes, M.J. , Int. J . Cancer: 61 ( 1 995), 286-288, Seite 287, Figur 1 B und E) . Bei Verwendung der Lindmo- Methode muss deshalb zwangsläufig sowohl der maximale spezifisch gebundene radioaktive Anteil und der bis zum unendlichen Antigen- Überschuss extrapolierte Wert angegeben werden. Wenn die Differenz zwischen diesen beiden Werten > 10 % ist, kann der extrapolierte Immunreaktivitätswert nicht als verlässlich angesehen werden (Mattes, M.J., Int. J. Cancer: 61 ( 1 995), 286-288, Seite 288).
Unter Berücksichtigung der oben aufgezeigten methodischen Bedenken bewegt sich der prozentuale Anteil funktioneil aktiver MAk-Moleküle in mit konventionellen Fermentationsverfahren, wie gerührte Fermenter und Hohlfasermodule, hergestellten und mit klassischen proteinchemischen Verfahren, die neben Protein A-Säulen auch lonenaustauschersäulen und in vielen Fällen auch gelchromatographische Säulen enthalten, gereinigten Präparationen im Bereich von 40 bis 80 %, wenn der Lindmo-Test verwendet wird (Mattes, M.J., Int. J. Cancer: 61 ( 1 995), 286-288; Jagoda et al., Journal of Immunological Methods 1 73 ( 1 994), 1 91 -201 ; Morales- Morales et al., Nuclear Medicine & Biology, Vol 26 ( 1 999) , 275-279, Boven et al., Blood, 67, No 2 ( 1 986) , 429-435) Hierbei spielt das verwendete Radiomarkierungsverfahren und das verwendete Radioisotop ebenfalls eine wichtige Rolle
Dies bedeutet, dass herstellungsbedingt 20 bis 60 % der MAk-Molekule dieser Praparationen nicht die erwünschte diagnostische oder therapeutische Funktion vermitteln
Eine literaturbekannte Ausnahme stellt das von Schubiger et al. (Eur. J. Nucl. Med 1 5: ( 1 989), 605-608) beschriebene Granuloszint dar, bei dem eine Immunreaktivitat von 93 bzw 40 %, abhangig vom jeweiligen Markierungsverfahren, beschrieben wird Allerdings wurde dieser MAk in Form von Aszites (persönliche Mitteilung) hergestellt Dieses in vivo Verfahren erfüllt weder ökonomische noch moderne regulatorische Bedingungen und muss hier als Ausnahme betrachtet werden. Desweiteren muss hier bemerkt werden, dass der Anteil der wirklich spezifisch bindenden MAk-Molekule geringer ist als der im Lindmo-Test bestimmte Wert. Dies ist bedingt durch die unspezifische Bindung von radiomarkierten MAk an z. B. im Antigen-Uberschuss verwendeten Granulozyten trotz Zugabe eines 1 0.000fachen molaren Überschusses an unmarkiertem spezifischem MAk (Schubiger et al., Euro J. Nucl. Med., 1 5 ( 1 989), 605- 608) . Demzufolge egt der immunreaktivitatswert nach Subtraktion der unspezifischen Bindung bei < 90 %.
Im Falle von radioaktiv markierten diagnostischen monoklonalen Antikörpern ist eine verringerte Immunreaktivitat des MAk von besonderem Nachteil, da radiomarkierte, nicht an die spezifische Zielstruktur bindende Moleküle im Blut zirkulieren, zum unspezifischen Hintergrund beitragen, teilweise in die Leber aufgenommen werden und die Interpretation von nuklearmedizinischen Befunden erschweren. Im Falle von radiomarkierten therapeutischen Antikörpern tragt der Anteil nicht an das Zielgewebe gebundener MAk-Moleküle zur unspezifischen und unerwünschten Bestrahlung von Nicht-Zielgeweben bei.
Daher ist es vor allem für die Herstellung von radiomarkierten monoklonalen Antikörpern von größter Bedeutung, ökonomisch und regulatorisch akzeptable in vitro Verfahren zu entwickeln, die eine Herstellung von MAk- Präparationen mit möglichst hohem immunreaktivem Anteil erlauben.
Zur Zeit ist es nur durch den Einsatz aufwendiger und für eine nachfolgende Pharmaherstellung nicht geeigneter, immunaffinitäts- chromatographischer Verfahren möglich, einen sehr hohen immunreaktiven Anteil zu erreichen. Hierbei werden die funktionell aktiven Moleküle von den funktionell inaktiven Molekülen, die sich proteinchemisch von den aktiven Molekülen nicht unterscheiden, durch Bindung an Antigensäulen getrennt und dadurch auch aufkonzentriert. Trotz des hohen Aufwandes bei der Herstellung der für die Immunaffinitätschromatographie benötigten Reagenzien sowie der hohen Verluste bei der Reinigung, ist der Anteil an funktionell aktiven MAk in solchen, für Forschungszwecke verwendeten Präparationen < 81 %.
Um sowohl den immunreaktiven Anteil von nicht markierten MAk als auch von radiomarkierten MAk unbeeinflusst durch unspezifische Bindungen sicher messen zu können, wurde ein "modifizierter Lindmo-Test" entwickelt, der in Beispiel 3 detailliert beschrieben ist. In diesem modifizierten Lindmo-Test beeinfiusst der Anteil unspezifisch bindender MAk-Moleküle (wie z.B. nach Radiomarkierung im Beisein eines 1 0.000fachen Überschusses an kaltem MAk gefunden, Schubiger et al. , Euro J . Nucl. Med., 1 5 ( 1 989), 605-608) den berechneten Immunreaktivitatswert nicht.
Im Rahmen der Arbeiten zur Optimierung der Herstellung des Produktionsverfahrens für den monoklonalen Antikörper BW 250/1 83 (Eur. J . Nucl. Med. 1 4 ( 1 988) , 523-528 und Int. J. Cancer 36 ( 1 985) , 75-84) ist es überraschenderweise gelungen, ein Fermentationsverfahren aufzubauen, welches Zellkulturüberstände erzeugt, die MAk enthalten, deren Immunreaktivität im modifizierten Lindmo-Test in der Regel > 95 % beträgt.
Aus diesen Zellkulturüberständen können unter Verwendung von konventionellen Reinigungsverfahren MAk-Präparationen hergestellt werden (auch GMP-gerecht) , die eine Immunreaktivität zwischen 80 und 90 % haben. Der hier zu beobachtende Verlust an Immunreaktivität von ca. 1 0 % im Verlauf der Reinigung ist durch die Vielzahl von säulen- chromatographischen Schritten bedingt.
Weiterhin ist es gelungen, ein "säulenarmes" Reinigungsverfahren zu entwickeln, welches es erlaubt, MAk-Präparationen herzustellen (auch GMP-gerecht), die im modifizierten Lindmo-Test eine Immunreaktivität haben, die sich von der der ungereinigten MAk-Moleküle im Zellkulturüberstand nicht signifikant unterscheidet (Verlust von ca. 1 -2 %).
Diese Verfahren lassen sich auf eine Vielzahl von MAk unterschiedlicher Spezifität und proteinchemischer Zusammensetzungen sowie auf andere immunreaktive Proteine anwenden und führen auch in diesen Fällen zu vergleichbar überraschenden Ergebnissen.
Die Erfindung betrifft somit eine Präparation von immunreaktiven Proteinen, wobei der in einem modifizierten Lindmo-Test bestimmte prozentuale Anteil an immunreaktiven Molekülen > 81 %, vorzugsweise > 90 % und besonders bevorzugt > 95 % bezüglich der Gesamtzahl von Molekülen ist. Die immunreaktiven Proteine sind durch Herstellung in Zellkultur, insbesondere in eukaryontischen Wirtszellen, erhältlich. Die immunreaktiven Proteine können ohne Aktivitätsverlust mit einer Markierung, insbesondere mit einer radioaktiven Markierung, gekoppelt werden. Immunreaktive Proteine im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Proteine, die mindestens eine Antikorper-Bindedomane enthalten Beispiele für solche Proteine sind Antikörper, insbesondere monoklonale Antikörper, chimaπsierte Antikörper, humanisierte Antikörper, rekombinante Antikörper, wie etwa Einzelketten-Antikorper oder Fragmente davon, z B. proteolytische Fragmente, wie etwa Fab-, Fab'- oder F(ab)2-Fragmente oder rekombinante Antikorperfragmeπte, wie etwa Einzelketten Fv-Fragmente
Neben Antikörpern und Antikorperfragmenten können auch Fusionsproteine eingesetzt werden, die mindestens eine Antikorper-Bindedomane und eine weitere Domäne, z.B. eine Effektordomane, wie etwa ein Enzym oder Cytokin, enthalten. Beispiele hierfür sind scFv-Cytokine, z.B. scFv-lL1 , scFv-IL2, scFv-IL6, scFv-IL1 0, scFv-IL1 1 , scFv-IL1 2, scFv-TNF, SCFV-I FN , scFv-lFNß, scFv-lFNσ oder scFv-Koagulanzien, z.B. scFv-tTF, scFv-(Deoxy) Ribonukleaseπ oder Fusionen mit Enzymen, wie etwa das in Bπtish J . Cancer 654 (1 992), 234-238, beschriebene Fusionsprotein, bestehend aus der VH-CH 1 schweren Kette des humanisierten MAk BW 431 /26 fusioniert über einen Hingelinker an ß-Glucuronidase sowie der humanisierten VL-CL leichten Kette des gleichen humanisierten MAk.
Die erfindungsgemaßen Proteinpraparationen sind durch Fermentation in ei nem Wirbelschichtreakto r erhältlich . I n einem so lchen Wirbelschichtreaktor wachsen die kultivierten Wirtszellen, z. B. Hybπdomzellen oder andere eukaryontische Zellen, in sehr hoher Dichte auf Glaskugeln und können optimal mit Sauerstoff und Nährstoffen versorgt werden. Absterbende Zellen losen sich von den Glaskugeln ab und werden kontinuierlich mit dem geernteten Medium aus dem Fermentationssystem entfernt. Hierbei können die Mengen von Proteasen und Zelldebπs im Fermentationssystem gering gehalten und die Integrität des erzeugten Proteins gewährleistet werden. Ein Beispiel für einen geeigneten Wirbeischicht-Fermentationsreaktor ist der Bioreaktor Pilot B 500 (Papaspyrou Biotechnologie GmbH) . Die Messung der Immunreaktivität der erfindungsgemäßen Proteinpräparationen erfolgt durch den in Beispiel 3 beschriebenen modifizierten Lindmo-Test. Bei der Durchführung dieses Tests ist wesentlich, dass das Antigen-enthaltende Material im Überschuss eingesetzt wird, um das immunreaktive Protein, z.B. den MAk, quantitativ zu binden. Desweiteren ist wichtig, dass das Antigen-enthaltende Material eine ausreichende Menge an Epitopen enthält, damit unspezifische, durch große Oberflächen bedingte Adsorptionseffekte vernachlässigt werden können. So sind Epitopdichten von > 104 pro fixierter Zelle bevorzugt. Der Ablesepunkt für die Immunreaktivität ist dabei derjenige Punkt, bei dem ein Kontroll-MAk (gleicher Isotyp wie der Test-MAk, aber irrelevante Binderegion) keine signifikante unspezifische Adsorption zeigt.
Im Folgenden werden neben dem erfindungsgemäßen Fermentationsverfahren und dem erfindungsgemäßen "säulenarmen" Reinigungsverfahren auch die erhaltenen erfindungsgemäßen Proteinpräparationen sowie deren vorteilhafte Verwendung als Diagnostikum und Therapeutikum beschrieben.
Die beiden erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren I und II bestehen je aus zwei Abschnitten, die sich in mehrere Einzelschritte unterteilen lassen:
Herstellungsverfahren 1 Herstellungsverfahren II
(allgemein) (allgemein)
• Anzucht von Anzucht von eukaryotischen Zellen und eukaryontischen Zellen und deren Fermentation in deren Fermentation in einem Wirbelschichtreaktor einem Wirbelschichtreaktor
» Proteinchemische Proteinchemische
Reinigung mit einem Reinigung mit einem konventionellen "säulenarmen"
Reinigungsverfahren Reinigungsverfahren Herstellungsverfahren I (speziell):
Anzucht von eukaryontischen Zellen und deren Fermentation in einem Wirbelschichtreaktor
5 1 . Auftauen von Zellen aus der Zellbank und Kultivierung, z. B. in T-
Flaschen
2. Expandieren der Zellen, z.B. in Spinner-Kulturen
3. Fermentation im Wirbelschichtreaktor
o Proteinchemische Reinigung miteinem konventionellen Reinigungsverfahren
1 . Ernte des Zellkulturmediums, Zellabtrennung, z. B. durch Mikrofiltration, Sterilfiltration und Lagerung, z.B. bei -20°C
2. Ankonzentrierung, z.B. durch Ammoπiumsulfatfällung und anschließender Zentrifugation 5 3. Lösung; Virusinaktivierung mittels Detergenz-Behandlung; Sterilfiltration
4. Affinitätschromatographie mit Protein A oder vergleichbarem Affinitätssystem
5. Ankonzentrierung, z.B. durch Ammoniumsulfatfällung und 0 anschließender Zentrifugation
6. Lösung; Umpufferung mittels Gelchromatographie
7. Anionenaustausch-Chromatographie
8. Ankonzentrierung, z.B. durch Ammoniumsulfatfällung und anschließender Zentrifugation 5 9. Lösung; Umpufferung mittels Gelchromatographie
1 0. Einstellung der gewünschten Endkonzentration des Bulks
1 1 . Sterilfiltration
Herstellungsverfahren II (speziell) 0
Anzucht von eukaryontischen Zellen und deren Fermentation in einem Wirbelschichtreaktor 1 . Auftauen von Zellen aus der Zellbank und Kultivierung, z. B. in T- Flaschen
2. Expandieren der Zellen, z. B. in Spinner-Kulturen
3. Fermentation im Wirbelstromreaktor
Proteinchemische Reinigung mit einem "säulenarmen" Reinigungsverfahren
1 . Ernte des Zellkulturmediums, Zellabtrennung, z. B. durch Mikrofiltration, Sterilfiltration und Lagerung, z.B. bei -20 °C
2. Auftauen der sterilen und zellfreien Kultur; Ernte, gefolgt von Mikrofiltration und Ultrafiltration
3. Verdünnung
4. Behandlung mit Detergenz
5. Affinitätschromatographie mit Protein A oder vergleichbarem Affinitätssystem 6. Verdünnung und Sterilfiltration
7. Anionenaustausch-Membranadsorption
8. Virusfiltration mittels Ultrafiltration
9. Ultrafiltration und Diafiltration
1 0. Filtration und Verdünnung 1 1 . Sterilfiltration
Die oben aufgezeigten individuellen Herstellungsschritte sind als jeweilige Einzelschritte dem Fachmann (Zellbiologen/Proteinchemiker) methodisch bekannt und bedürfen keiner nähreren Beschreibung. Trotzdem ist das Verfahren ausführlich in Beispiel 2 beschrieben.
Neu an Herstellungsverfahren I ist die Fermentation im Wirbelschichtreaktor in Kombination mit einem konventionellen Reinigungsverfahren.
Überraschenderweise beträgt die Immunreaktivität des MAk in ungereinigten Zellkulturüberständen (T-Flaschen, Wirbelschichtreaktor) > 90 % im modifizierten Lindmo-Test. Nach konventioneller Reinigung werden Immunreaktivitäten von > 80 % erreicht.
Neu an Herstellungsverfahren II ist die Fermentation mittels Wirbelschichtreaktor in Kombination mit dem "säulenarmen " Reinigungsverfahren, in dem nur eine Säulenchromatographie (Affinitätschromatographie an Protein A) verwendet wird. Alle sonstigen Schritte stellen schonende Filtrationsschπtte durch Membranen oder einfache Verdünnungsschritte dar. Trotzdem werden mit dem Verfahren die von den Zulassungsbehörden festgelegten Forderungen bezüglich proteinchemischer Reinheit und Virusabreicherung/-inaktivierung erfüllt.
Überraschenderweise beträgt die Immunreaktivität des herzustellenden (Glyko-) Proteins, z.B. eines MAk, auf allen getesteten Stufen (T-Flaschen, Wirbeschichtreaktor, gereinigtes Protein) > 90 % im Lindmo-Test, meist sogar 95 %, wie beispielhaft in Beispiel 1 für den MAk BW 250/1 83 gezeigt. Vergleichbar hohe Immunreaktivitätswerte sind unseres Wissens mit keinem in dem Stand der Technik beschriebenen in vitro Herstellungsverfahren erreicht worden.
Ähnlich hohe Immunreaktivitätswerte wurden mit dem erfindungsgemäßen Verfahren für andere MAk, wie z.B. den MAk BW 431 /26 (selektiv für CD66e) (Eur. J. Nucl. Med. 14 (1 988), 523-528 und Int. J. Cancer 36 ( 1 985), 75-84) , MAk BW 278/1 05 (selektiv für eine Subpopulation von FVIII RAG) (J. Histochem. Cytochem. 34 ( 1 986) , 209-21 4) , MAk BW 575/931 (selektiv für N-CAM) (....) und MAk YTH 24.5 (selektiv für CD45) (J. Immunol. 1 34 ( 1 985) , 3056-3061 und Leucocyte Typing III : White Cell Differentiation Antigens (Hrsg. Mc Michael et al.), Oxford University Press, Oxford, pp 788-803) sowie einige der in der Deutschen Patentanmeldung 1 97 44 531 .4 beschriebenen MAk (selektiv für den VEGF/VEGF-Rezeptor- Komplex, binden aber weder an VEGF noch an VEGF-Rezeptor alleine) gefunden. Diese Befunde belegen, dass die erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren es erlauben, (Glyko-) Proteine zu fermentieren, die zu annähernd 1 00 % immunreaktiv sind, und diese schonend und schnell, im Falle von Herstellungsverfahren II sogar ohne nachweisbare Verluste an Immunreaktivitat kostengünstig zu reinigen
Desweiteren sind die erfindungsgemaßen Herstellungsverfahren für die GMP-gerechte Herstellung einer Vielzahl von (Glyko-) Proteinen, die keine Fc-Teiie haben, einsetzbar, unter anderem für das von Bosslet et al beschriebene Fusionsprotein (Bπtish Journal of Cancer, 645 ( 1 992), 234- 238) , wobei anstelle der Protein A-Affinitatschromatographie ein alternatives affmitatschromatographisches Verfahren eingesetzt wird (anti- Idiotyp, Lektinsaule, Protein L, Nickelsaure etc.)
Neben der Immunreaktivitat werden auf den jeweiligen Herstellungsstufen eine Vielzahl von Qualitätskontrollen (Sterilität, DNA-Gehalt, Protein-Gehalt, Spezifitat, pH-Wert, Proteinzusammensetzung, Isoelektrischer Punkt, Pyrogene, Protein A-Gehalt im Endprodukt) durchgeführt, welche es erlauben, die mikrobiologischen, immunologischen und proteinchemischen Eigenschaften des herzustellenden (Glyko-) Proteins (MAk) zu testen. Auf diese Tests wird hier nicht eingegangen, da sie Stand der Technik sind
Weiterhin soll die Erfindung durch die nachfolgenden Beispiele in Verbindung mit den Figuren erläutert werden. Es zeigen:
Figur 1 die Beschreibung eines Wirbeischicht-Fermentationsreaktors
Der Reaktor (2) ist mit Tragerkugeln (4) , z. B. Kugeln aus offenporigem gesinterten Glas mit einem Durchmesser von vorzugsweise 0,4 bis 0,7 mm, die einer Saurebehandlung (z. B. 2, 5 N HCI und 5 % Salpetersaure) unterzogen und nach Neutra sierung durch Hitzebehandlung (z. B. 220 °C, 6 h) sterilisiert wurden, teilweise gefüllt. Der Reaktor enthalt weiterhin ein Belüftungsmodul (6), mit dem eine Gasmischung (8) zur Verwirbelung der Trägerkugeln in den Reaktor eingeblasen und wieder herausgeleitet wird. Weiterhin ist der Reaktor mit pH-Elektroden, Sauerstoffelektroden, Temperatursonden etc. ausgestattet. Das Medium wird mit einer Fließgeschwindigkeit von beispielsweise 450 bis 500 ml/min in einem Kreislauf (10) rezirkuliert. Der Kreislauf kann einen Einlass frisches Medium (12), eine Pumpe (14) und ein Probenentnahmeventil (16) enthalten. Durch die Leitung (18) wird Medium zur Ernte des darin enthaltenen Proteins entnommen.
Figur 2
Ergebniskurven für Antikörperpräparationen in einem modifizierten Lindmo- Test
Figur 3 und 4
Szintigramme mit TC-99m-markierten monoklonalen Antikörpern aus Präparationen des Standes der Technik.
Figur 5 bis 7 Szintigramme von TC-99m-markierten monoklonalen Antikörpern aus erfindungsgemäßen Präparationen.
Im Folgenden sind die Ergebnisse einer typischen Immunreaktivitätsbestimmung für einen MAk, im Beispiel für den MAk BW 250/183, aufgeführt.
Beispiel 1
Verglichen wird die Immunreaktivität des MAk BW 250/183 (Eur. J. Nucl. Med. 14 (1988), 523-528), gemessen mit dem modifizierten Lindmo-Test
(Durchführung siehe Beispiel 3), bei konventioneller Fermentation und
Reinigung gegenüber den beiden neuen, hier beschriebenen Fermentations- und Reinigungsverfahren (Herstellverfahren I und Herstellverfahren II) jeweils vor Beginn der Reinigung (Zellkulturüberstand) und nach Ende der Reinigung (gereinigtes MAk-Endprodukt) .
Die MAk-haltigen Proben der Zellkulturüberstände bzw. der gereinigten MAk-Endprodukte wurden, wie in Beispiel 3 genau beschrieben, behandelt und der modifizierte Lindmo-Test laut Anweisung durchgeführt. Als Negativ-Kontrolle wurde ein MAk vom gleichen Isotyp (IgG- ) , gleicher leichter Kette {K) , vergleichbarem isoelektrischem Punkt und irrelevanter Spezifität eingesetzt. Die Positivkontrolle ist ein über eine Antigensäule im analytischen Maßstab gereinigte Charge des MAk BW 250/1 83 mit einer Immunreaktivität von 91 bis 94 %.
Im Folgenden sind die Ergebnisse der einzelnen Immunreaktivitäts- bestimmungen der Zellkulturüberstände sowie der gereinigten MAk- Endprodukte aufgeführt:
1 . Konventionelles Fermentationsverfahren und konventionelles Reinigungsverfahren (Stand der Technik)
a) Nichtqereiniqter Zellkulturüberstand (ZKÜ) nach koventioneller Fermentation (KF)
Tabelle 1
Figure imgf000016_0001
Die Ergebniskurve ist in Figur 2A dargestellt.
b) Gereinigtes MAk-Endprodukt (MAk) nach konventioneller
Fermentation (KF) und konventioneller Reinigung (KR)
Tabelle 2:
Figure imgf000016_0002
Die Ergebniskurve ist in Figur 2B dargestellt. 2. Fermentation im Wirbelschichtreaktor und konventionelles
Reinigungsverfahren oder "säulenarmes" Reinigungsverfahren (Erfindung)
a) Zellkulturüberstand (ZKÜ) nach Wirbelschicht-Fermentation (WF)
Tabelle 3:
Figure imgf000017_0001
Die Ergebniskurve ist in Figur 2C dargestellt.
b) Gereinigtes MAk-Endprodukt (MAk) nach Wirbelschicht-Fermentation
(WF) und konventioneller Reinigung (KR) Tabelle 4:
Figure imgf000017_0002
Die Ergebniskurve ist in Figur 2D dargestellt.
Gereinigtes MAk-Endprodukt (MAk) nach Wirbelschicht-Fermentation (WF) und "säulenarmer" Reinigung (SR)
Tabelle 5:
Figure imgf000018_0001
Die Ergebniskurve ist in Figur 2E dargestellt.
Die Endergebnisse des Beispiels 1 sind in folgender Tabelle 6 zusammengefasst:
Immunreaktivität des MAk BW 250/183
Figure imgf000019_0001
Die Immunreaktivität des MAk BW 250/1 83 ist deutlich von den Fermentations- und Reinigungsbedingungen abhängig. Bei konventioneller Fermentation werden zwar immerhin schon typischerweise bis zu 80 % Immunreaktivität im Zellüberstand erreicht - im neuen Fermentationsverfahren mittels Wirbelschichtreaktor aber ist die Immunreaktivität mit 97 % deutlich höher.
Auch das Reinigungsverfahren beeinfiusst die Immunreaktivität von MAk. Das neue "säulenarme" Reinigungsverfahren ist deutlich schonender als das konventionelle Reinigungsverfahren (8 % Abfall der Immunreaktitivät beim konventionellen Verfahren gegenüber nur 1 % Abfall beim neuen "säuienarmen" Reinigungsverfahren) .
Vergleichbare Ergebnisse konnten ebenfalls mit anderen MAk, z.B. mit MAk BW 431 /26 (Eur. J. Nucl. Med. 14 ( 1 988), 523-528 und Int. J. Cancer 36 ( 1 985), 75-84), MAk BW 575/931 (Pediatr. Hematol. Oncol. 6 ( 1 989), 73- 83), MAk YTH 24.5 (J. Immunol. 1 34 ( 1 985) , 3056-3061 und Leucocyte Typing III: White Cell Differentiation Antigens (Hrsg. Mc Michael et al.), Oxford University Press, Oxford, pp 788-803), MAk BW 278/105 (J. Histochem. Cytochem.34 (1986), 209-214), den in der Patentanmeldung 19744531.4 beschriebenen MAk sowie dem British J. Cancer 645, 234- 238, 1992, beschriebenen Fusionsprotein erzielt werden (siehe Tabelle 7).
Tabelle 7:
Immunreaktivität in Abhängigkeit vom Fermentations- und Reinigungsverfahren
Figure imgf000021_0001
ZKÜ: Zellkulturüberstand GME: gereinigtes MAk-Produkt Da vergleichbare Befunde mit allen gestesteten MAk und einem sehr komplexen (Glyko-) Protein, dem Fusionsprotein (Molekulargewicht des Tetramers unter nativen Bedingungen 500 kDA) erzielt wurden, darf davon ausgegangen werden, dass vergleichbare Werte mit allen in prokaryontischen und eukaryontischen Systemen fermentierbaren MAk und (Glyko-) Proteinen erhalten werden und die vorteilhaften Befunde generalisierbar sind.
Sowohl die nach dem konventionellen Herstellverfahren als auch den Herstellverfahren I und II gereinigten MAk-Chargen zeigten nach Radiomarkierung entsprechend der von Schwarz und Steinstraesser geschriebenen Methode (J Nucl. Med. , 28 ( 1 987), 721 ) eine Immunreaktivitat, die mit der des gereinigten MAk-Proteins im Rahmen der Genauigkeit des modifizierten Lindmo-Tests identisch war. Die Daten sind in der nachstehenden Tabelle 8 zusammengefasst:
Figure imgf000022_0001
Unerwartete klinische Befunde
Aliquots von Praparationen des MAk BW 250/183, welche entweder nach dem konventionellen Herstellungsverfahren (Batchfermentation in gerührten Fermentern gefolgt von konventioneller proteinchemischer Reinigung, Immunreaktivitat 72 %) oder dem neuartigen Herstellungsverfahren II (Wirbelschichtreaktor gefolgt von "saulenarmem" Reinigungsverfahren, Immunreaktivitat 96 %) GMP-gerecht produziert wurden, wurden entsprechend der von Schwarz und Stremstraesser beschriebenen Methode (J Nucl. Med., 28 (1987), 721) mit Tc-99m markiert. Der Anteil des an den MAk gebundenen Isotops betrug in beiden Praparationen 99,9 % Von diesen radiochemisch identischen MAk-Praparationen wurden Patienten mit dem Verdacht auf entzündliche Erkrankungen bzw Knochenmarkmetastasen eine Dosis von 10-20 mCi i.v verabreicht. Mittels einer j/-Kamera wurden Ganzkorperszintigramme im Zeitraum von 2 bis 25 Stunden nach i.v.-Gabe des radiomarkierten MAk aus frontaler und dorsaler Sicht aufgenommen.
Überraschenderweise stellte sich bei Szintigrammen nach Injektion mit MAk-Chargen, die eine Immunreaktivitat von <90 % hatten
(Herstellungsverfahren II), vorteilhafterweise praferentiell das Knochenmark scharf kontuiert und die Milz mehr oder weniger deutlich dar (siehe Beispiel
3: Abbildungen GRAN 91, GRAN 81 und GRAN 71). Bei MAk-Chargen, die nach einem konventionellen Fermentations- und Reinigungsverfahren hergestellt wurden (Immunreaktivitat 70-80 %), war neben einer
Knochenmarkdarstellung ganz deutlich die Leber und die Milz zu erkennen
(siehe Beispiel 3: Abbildungen GRAN 11 und GRAN 21) Desweiteren zeigen diese Aufnahmen einen höheren Hintergrund, der sich in einem leichten Schleier und einer gewissen Unscharfe der Szintigramme bemerkbar macht. Als Konsequenz wurden die Epitop-negativen Normalgewebe von Patienten, die MAk-Chargen mit einer Immunreaktivitat > 90 % erhielten, wesentlich weniger belastet als von Patienten , die mit MAk-Chargen mit einer Immunreaktivitat < 80 % behandelt wurden. Diese Beobachtungen an Patienten belegen die Bedeutung der Hohe der Immunreaktivitat eines spezifischen MAk gegen Granulozyten für die Bildgebung (Szintigraphie) in der Nuklearmedizin. Aber nicht nur für die Bildgebung, sondern auch für die Therapie mit a- und ß-Strahlern zeigen die MAk-Chargen mit einer Immunreaktivitat > 90 % deutliche Vorteile. So ist es z.B. nach Markierung von MAk-Chargen mit einer Immunreaktivitat > 90 % möglich, mittels literaturbekannter Methoden Re188 186, Y90 oder Astatin anzukoppeln, um eine praferentielle Knochenmarkbestrahlung vorzunehmen.
So wurde im Rahmen eines Heilversuches ein Kollektiv von 1 9 Patienten mit akuter myeloischer Leukämie oder chronisch myeloischer Leukämie behandelt. Hierzu wurden Chargen des MAk BW 250/1 83 (Immunreaktivitat > 90 %) mit Re188 markiert (spezifische Aktivität; 5-7, 5 GBq/mg) und 6,5-1 2,4 GBq i.v. appliziert.
Dosiometrische Untersuchungen lieferten die in der folgenden Tabelle zusammengefassten Daten.
Tabelle 9:
Dosiometrische Untersuchungen nach Radioimmunotherapie mit Re-188 markiertem MAk BW 250/183
Figure imgf000025_0001
Die Daten zeigen, dass es möglich ist, mittels Radioimmuntherapie mit dem Re-1 88 markierten MAk BW 250/1 83 (Immunreaktivitat > 90 %) hohe Strahlendosen auf dem Knochenmark und der Milz von Patienten mit Leukämie zu lokalisieren
Das Patientenkollektiv bestand aus Personen mit einem Rezidiv-Risiko von 40-50 % innerhalb von 2 Jahren Überraschenderweise induzierte die Radioimmuntherapie keine signifikanten Nebenwirkungen Danach folgte eine Standardtherapie bestehend aus 1 2 Gray Ganzkorperbestrahlung und Cyclophosphamid-Gabe. Alle 1 9 Patienten konnten in eine komplette Remission gebracht werden, was Hinweise für eine zukunftige Rolle der Radioimmuntherapie mit MAk BW 250/1 83 bei der Behandlung von Leukämien in Verbindung mit Standardtherapien gibt. Hierbei erscheint es denkbar, dass die Radioimmuntherapie die nebenwirkungsreiche Ganzkorperbestrahlung ersetzen wird.
Ein weiterer Vorteil der Verwendung des MAk BW 250/1 83 mit einer Immunreaktivitat > 90 % besteht dann, dass die verabreichte MAk-Menge von 1 mg pro Applikation auf 0,5 mg pro Applikation verringert werden konnte. Diese Reduktion führte zu einer HAMA (human-anti-mouse- antιbody)-Frequenz, die unter 2 % lag, und damit nicht signifikant von den Hintergrund-HAMA-Werten von Normalpersonen abweicht
Weiterhin konnten überraschenderweise auch frühe Metastasen im RES (retikuloendothelialen System) des Knochenmarks mit MAk-Praparaten, die eine Immunreaktivitat von > 90 % hatten, entdeckt werden, die bei dem Präparat mit ca. 80 % Immunreaktivitat aufgrund der Uberstrahlung durch Lungen- und Leber-Aktivitatsanreicherung nicht eindeutig nachweisbar waren.
Zusammenfassend darf hier festgehalten werden, dass die überraschenden Vorteile bezüglich Bildqualitat, diagnostischer Effizienz, Dosiometπe und therapeutischer Effizienz, die durch die Verwendung von hoch immunreaktiven Chargen des MAk BW 250/1 83 in Verbindung mit a , ß- oder y- Strahlern entstehen, weder qualitativ noch quantitativ zu erwarten waren und den Weg zu einer effizienteren Diagnostik entzündlicher Prozesse und von Metastasen sowie zur Therapie von Leukämien und anderen Erkrankungen des hamatopoetischen Systems öffnet.
Beispiel 2
Herstellverfahren I
Anzucht von eukaryontischen Zellen und deren Fermentation in einem Wirbelschichtreaktor
Eine Ampulle aus der Arbeitszellbank, die in flussigem Stickstoff gelagert ist, wird aufgetaut und die darin befindlichen Zellen werden unter Standard- Zellkulturbedingungen (synthetisches proteinfreies Zellkultur-Medium) in T- Flaschen kultiviert. Nachdem eine Gesamtzellzahl von 6-1 0 x 1 07 Zellen erreicht ist, wird der Inhalt von 4 bis 6 T-Flaschen in einem 500 ml - Spinnergefaß unter Standard-Zellkulturbedingungen weiter kultiviert. Nachdem eine Zellzahl von 1 , 5-2 x 1 08 Zellen erreicht ist, werden die Zellen in 2 Spinnergefaße mit je 1 000 ml Volumen transferiert und weiterkultiviert. Nach Erreichen einer Zellzahl von 1 ,2-1 ,5 x 109 Zellen werden die Zellen in einen 900 ml Zellkulturmedium und 200 ml SιranR- Carπer enthaltenden Wirbelschichtreaktor (Bioreaktor Pilot B 500, Papaspyrou Biotechnologie GmbH, Technologiezentrum Julich, D-52428 Julich) inokuliert und entsprechend der Handhabungsvorschrift der Fa Papaspyrou Biotechnologie für 60 Tage bei 36, 5 °C kultiviert Sauerstoffgehalt, pH-Wert, Glukosekonzentration sowie der MAk-Gehalt werden in 1 -4tagιgen Abstanden kontrolliert. Wahrend der Fermentatition wird der Zellkulturüberstand kontinuierlich geerntet und bei 4 ° C gelagert Proteinchemische Reinigung mit einem konventionellen Verfahren
Das Volumen des aufzuarbeitenden Kulturultrakonzentrates wird mit festgestellt und unter Rühren die 1 , 5fache Menge gesättigter Ammoniumsulfat-Lösung langsam zugefügt. Die Suspension bleibt bei 4 °C bis zu drei Tagen stehen bis ein klarer Überstand entstanden ist. Dieser wird abdekantiert, das Präzipitat in der verbleibenden Menge des Überstandes suspendiert und bei > 5000 g über 30 Minuten bei Raumtemperatur abzentrifugiert. Sedimente werden in einem Zentrifugenbecher vereinigt (=> MAk-Ammoniumsulfatpaste) und anschließend mit Startpuffer gelöst ( 1 bis 4 Teile Puffer auf 1 Teil Sediment) .
Die für einen Protein-A-Lauf errechnete Menge an gelöstem Sediment wird unter Rühren mit einer wässrigen Triton X-1 OO-Lösung, 100 g/l versetzt, so dass die Endkonzentration an Triton X-1 00 0,5 % beträgt (50 ml Triton X- 1 OO-Lösung auf 1 000 ml gelöstes Sediment) . Der Ansatz wird über einen Spritzenfilter, 0,2 μm, sterilfiltriert. Der Ansatz wird für 2 bis 1 8 Stunden bei 4 °C stehen gelassen (= virusinaktive MAk-Lösung) .
Anschließend wird sofort die Protein-A Fraktionierung durchgeführt. Das Auftragen der Probe erfolgt unter möglichst aseptischen Bedingungen und mittels einer Pumpe, wobei die Fließgeschwindigkeit dem ein- bis zweifachen Säulenvolumen pro Stunde entsprechen kann, so dass ein Kontakt zwischen MAk und Protein A von mindestens 30 Minuten gewährleistet ist. Nach dem vollständigen Auftragen der Lösungen werden die nicht an Protein-A bindenden Proteine und Triton mit Startpuffer von der Säule gewaschen und so lange gespült, bis die Extinktion/Transmission des Durchflusses den Ausgangswert des Startpuffers wieder erreicht (Dauer: 0, 5 bis 3 Stunden) . Die Elution des MAk erfolgt mit Elutionspuffer, pH 3,0. Das Eluat wird in einem mit Fiockeneis gekühlten Gefäß (gewogene Glasflasche) aufgefangen, in dem ca. 1 /1 0 des Säulenvolumens an 2 M Tris/HCI, pH 8,0 vorgelegt wurde. Die Elution erfolgt so lange, bis der Ausgangswert des Schreibers nahezu wieder erreicht wird (=> gereinigte MAk-Lösung) .
Nach Bestimmung des Volumens wird unter Rühren 1 , 5fache Menge gesättigter Ammoniumsulfat-Lösung langsam zugefügt und 60 Minuten gerührt. Anschließend bleibt die Suspension bei 4 °C bis zu drei Tagen stehen bis ein klarer Überstand entstanden ist. Der Ansatz wird aufgeschüttelt und bei > 5000 g über 30 Minuten bei Raumtemperatur abzentrifugiert. Der Überstand wird abdekantiert und die Sedimente werden in einem Zentrifugenbecher vereinigt (=* MAk-Ammoniumsulfatpaste) und möglichst konzentriert mit Tris/HCI-NaCI-Puffer gelöst ( 1 -3 Teile Puffer auf 1 Teil Sediment).
Die gekläre Proteinlösung wird sofort auf eine regenerierte mit Tris/HCI- NaCI-Puffer, pH 7, 5 äquilibrierte Säule mit Sephadex G-25 aufgetragen. Das Volumen der umzusalzenden Proteinlösung soll höchstens 1 5 % des Säulenvolumens betragen. Die von der Säule kommende Lösung wird über ein Durchflussphotometer und anschließend über einen pHJIonenmonitor geleitet. Nachdem die MAk-Lösung vollständig aufgetragen ist, wird die Säule mit Tris/HCI-NaCI-Puffer, pH 7, 5 bei einer Fließgeschwindigkeit in der Säule von ca. 20 ml pro cm2 und pro Stunde nachgespült. Der im Ausschlussvolumen der Säule laufende MAk wird in einer sterilen Vorlage entsprechend des UV-Linienschreiber-Profils so lange gesammelt, bis auf dem Linienschreiber annähernd der Ausgangswert der Extinktion/ Transmission (ca. 95 %) wieder registriert wird. Der pH-/lonenmonitor darf noch keine Veränderung der Leitfähigkeit anzeigen (=» umgepufferte MAk- Lösung) .
Die Leitfähigkeit der Lösung wird kontrolliert und gegebenenfalls durch Zugabe von Natriumchlorid-Lösung, 1 0 g/l oder Wasser für Injektionszwecke auf die Leitfähigkeit des Puffers eingestellt. Das Produkt wird auf eine vorbereitete Q-Sepharose-Säule unter möglichst aseptischen Bedingungen mit einer Auftragsgeschwindigkeit von 1 50 ml pro Stunde aufgegeben (pro ml Q-Sepharose 2 bis 5 mg Protein) . Die El utio n erfolgt mit Tris/H CI-N a CI-Puffer, p H 7, 5 bei ei n er Fließgeschwindigkeit von ca. 25 ml pro cm2 und pro Stunde. Die von der Säule kommende Lösung wird über ein Durchflussphotometer und anschließend über einen pH-/lonenmonitor geleitet. Der im Durchfluss von der Säule laufende MAk wird in einer sterilen Vorlage entsprechend des UV-Linienschreiber-Profils so lange gesammelt, bis auf dem Linienschreiber annähernd der Ausgangswert der Extinktion/Transmission (ca. 95 %) wieder registriert wird (■= entpyrogenisierte MAk-Lösung).
Der pH-Wert des MAk-haltigen Eluates nach der Anionenaustausch- Chromatographie wird mit 1 N HCI oder 1 N Natriumhydroxid-Lösung auf pH 6,9 eingestellt.
Nach Bestimmung des Volumens wird unter Rühren erneut die 1 ,5fache Menge gesättigter Ammoniumsulfat-Lösung langsam zugefügt und 60 Minuten gerührt. Anschließend bleibt die Suspension bei 4 °C über Nacht stehen bis ein klarer Überstand entstanden ist. Der Ansatz wird aufgeschüttelt und bei 8525 g über 60 Minuten bei Raumtemperatur abzentrifugiert. Der Überstand wird abdekantiert, die Sedimente in einem Zentrifugenbecher vereinigt (=■ MAk-Ammoniumsulfatpaste) und möglichst konzentriert mit Natriumphosphat-NaCI-Sorbit-Puffer, pH 7,2 gelöst ( 1 bis 3 Teile Puffer auf 1 Teil Sediment).
Die geklärte Proteinlösung wird sofort auf eine regenerierte, mit Natriumphosphat-NaCI-Sorbit-Puffer, pH 7,2, äquilibrierte Säule mit Sephadex G-25 unter möglichst aseptischen Bedingungen aufgetragen (höchstens 1 5 % des Säulenvolumens) . Die von der Säule kommende Lösung wird über ein Durchflussphotometer und anschließend über einen pH-/lonenmonitor geleitet. Die Säule wird mit Natriumphosphat-NaCI-Sorbit- Puffer, pH 7,2 (Fließgeschwindigkeit ca. 20 ml pro cm2 und pro Stunde) nachgespült. Der im Ausschussvolumen der Säule laufende MAk wird in einer sterilen Vorlage entsprechend des UV-Linienschreiber-Profils so lange gesammelt, bis auf dem Linienschreiber annähernd der Ausgangswert der Extinktion/Transmission (ca. 95 %) wieder registriert wird. Der pH-/ lonenmonitor darf noch keine Veränderung der Leitfähigkeit anzeigen (= MAk-Bulklösung, konzentriert) .
Der pH-Wert der Lösung wird kontrolliert und mit 1 N HCI oder 1 N Natriumhydroxid-Lösung auf pH 7,2 eingestellt.
Anhand der ermittelten Werte für die Maus-lgG-Konzentration und des Volumens wird der "final bulk" mit Natriumphosphat-NaCI-Sorbit-Puffer, pH 7,2 auf die gewünschte End-Konzentration verdünnt.
Das Produkt wird über einen 0,2 μm-Einmalfilter sterilfiltriert, aliquotiert und der "final bulk" bei -20 °C gelagert.
Herstellverfahren II
Anzucht von eukaryontischen Zellen und deren Fermentation in einem Wirbelschichtreaktor
Eine Ampulle aus der Arbeitszellbank, die in flüssigem Stickstoff gelagert ist, wird aufgetaut und die darin befindlichen Zellen werden unter Standard- Zellkulturbedingungen (synthetisches proteinfreies Zellkultur-Medium) in T- Flaschen kultiviert. Nachdem eine Gesamtzellzahl von 6-1 0 x 1 07 Zellen erreicht ist, wird der Inhalt von 4 bis 6 T-Flaschen in einem 500 ml - Spinnergefäß unter Standard-Zellkulturbedingungen weiter kultiviert. Nachdem eine Zellzahl von 1 , 5-2 x 1 08 Zellen erreicht ist, werden die Zellen in 2 Spinnergefäße mit je 1 000 ml Volumen transferiert und weiterkultiviert. Nach Erreichen einer Zellzahl von 1 ,2- 1 , 5 x 1 09 Zellen werden die Zellen in einen 900 ml Zellkulturmedium und 250 ml SiranR- Carrier enthaltenden Wirbelschichtreaktor (Bioreaktor Pilot B 500, Papaspyrou Biotechnologie GmbH, Technologiezentrum Julich, D-52428 Julich) inokuliert und entsprechend der Handhabungsvorschrift der Fa. Papaspyrou Biotechnologie für 60 Tage bei 36, 5 ° C kultiviert. Sauerstoffgehalt, pH-Wert, Glukosekonzentration sowie der MAk-Gehalt werden in 1 -4tägigen Abständen kontrolliert. Während der Fermentation wird der Zellkulturüberstand kontinuierlich geerntet und bei 4 °C gelagert.
Proteinchemische Reinigung mit einem "säulenarmen" Verfahren
Nachdem 1 8 I Zellkulturmedium geerntet sind, wird eine Zellabtrennung mittels "Tangential Flow"-Mikrofiltration gefolgt von einer Sterilfiltration durch einen 0,2 μm-Filter durchgeführt. Die zellfreie und sterile Zellkultur- Ernte wird bei -20 °C gelagert bis genügend Zellkultur-Ernte für die weitere Aufreinigung vorliegt (Zellkultur-Ernte von ca. 250 I Zellkulturmedium) . Nach Erreichen der vorgegebenen Batchgröße wird die sterile Zellkultur- Ernte aufgetaut, durch Mikrofiltration geklärt und mittels Ultrafiltration 1 00 bis 1 50fach ankonzentriert. Danach wird das Ultrakonzentrat mit einem gleichen Volumen von 2 Mal konzentriertem Startpuffer (pH 8, 6) versetzt und sterilfiltriert. Unter sterilen Bedingungen wird eine sterile Triton X- 1 00 Lösung ( 1 00 g Triton/I) ad 0,5 % Triton Endkonzentration unter Rühren hinzugegeben. Zur Inaktivierung hüllhaltiger Viren wird die Lösung 4 bis 1 8 Stunden bei 4 °C stehen gelassen.
Danach wird das mit Triton behandelte Ultrakonzentrat auf eine Protein A- Sepharose-4-Fast-Flow-Säule gepumpt, die zuvor mit 5 Säulenvolumen Startpuffer äquilibriert wurde. Nicht-bindende Proteine und Triton X- 1 00 werden mit 5 Säulenvolumen Startpuffer von der Säule gewaschen. Anschließend wird der an Protein A gebundene MAk mit dem Elutionspuffer (pH 3,0) von der Säule gewaschen und in 1 30 ml Neutralisationspuffer (pH 8) aufgefangen. Danach wird der pH des in Neutralisationspuffer aufgefangenen MAk bei Bedarf mit NaOH auf pH 7-7, 5 eingestellt, mit einem gleichen Volumen 2x Membran-Adsorber Puffer (pH 7; 5) verdünnt und sterilfiltriert. Anschließend wird die MAk-Lösung unter sterilen Bedingungen durch einen Membranadsorber gepumpt, der vorher mit WFI und dem Adsorberpuffer (pH 7, 5) äquilibriert wurde. Der den MAk enthaltende Durchfluss, der nun von eventuell kontaminierenden Pyrogenen und DNA befreit ist, wird in einem sterilen Behälter gesammelt und mit einem Puffer (pH 7, 5) auf 500 μg MAk/ml eingestellt. Danach wird die verdünnte MAk-Lösung durch Ultrafiltration mit einem Viragard Hohlfaser- Modul von potentiell kontaminierenden Viren befreit. Das den virusfreien MAk enthaltende Permeat wird mittels Ultrafiltration auf eine Konzentration von 4-5 mg MAk/ml ankonzentriert und gegen Endpuffer (pH 7, 2) diafiltriert. Nach einer Sterilfittration, einer Verdünnung im Endpuffer und einer erneuten Sterilfiltration wird der MAk als Bulkware abgefüllt.
Beispiel 3
Modifizierter quantitativer Immunreaktivitätstest nach Lindmo
Einleitung
Um den Gehalt immunreaktiver monoklonaler Antikörper in Hybridomüberständen bestimmen zu können, wurde ein Bindungs-Assay mit Antigenüberschuss in Kombination mit einem empfindlichen ( 1 -2 ng Maus-lg/ml) ELISA-System zur Bestimmung des Anteils ungebundener monoklonaler Antikörper verwendet. Dieser Test hat im Wesentlichen zwei Vorteile gegenüber dem von Lindmo entwickelten Immunreaktivitätstest:
a) Er erlaubt die Bestimmung der Immunreaktivität von sowohl ungereinigten als auch gereinigten πicht-radiomarkierten und radiomarkierten MAk. b) Er erlaubt die Bestimmung der Immunreaktivität in Abwesenheit unspezifischer Bindung.
Material
1 . 1 Chemikalien und Materialien
Bezeichnung Besteiler Bestell-Nr
Formaldehyd-Lösung, 37 % Merck 81 8708
Natriumdihydrogenphosphat-1 -hydrat Merck 6346 di-Natriumhydrogenphosphat-2-hydrat Merck 3041 2
PBS Behringw erke
Glycin Merck 1 04201
96 well Mikrotiterplatten, Typ B Nunc 4-60445
Ziege-anti-Maus-IgG ("Fänger") Sigma M 8642
Tween/PBS für Enzygnost Behringw erke OSWE96
Casein Sigma C 5890
Ziege-anti-Maus-IgG, -Antikörper, mit alkalischer Phosphatase gekoppelt SBS 107-04
4-Methyl-Umbelliferyl-Phosphat Sigma M 8276 SDS Sigma L 5750
1 .2 Geräte
Zentrifuge Heraeus Minitubes, 1 ,0 ml Kühn & Bayer 64698446 Rotationsgerät Heidolph Reo x 2 Analysenwaage Mettler DE 1 00 Magnetrührer IKA RCT pH-Meter WTW
Moulinette moulinex
Fluoroskan 1 1 Merlin
Herstellung der benötigten Lösungen
4 % Formaldehvd-Lösung nach Lilly
Zu 1 00 ml 37 % Formaldehyd-Lösung wird - 900 ml Aqua bidest. gegeben. In dieser Lösung werden
4 g Natriumdihydrogenphosphat und
6.5 g di-Natriumhydrogenphosphat unter Rühren gelöst. Der pH-Wert der Lösung beträgt pH 7,0.
Waschlösung: 0,05 M Tris-Citrat-Puffer, pH 7,4
6.06 g Tris,
1 9, 5 g Zitronensäure-1 -hydrat und
4,25 g Natriumhydroxid werden ad 1 I Aqua bidest. gelöst.
Blocklösunα: 1 % Casein in PBS. PH 7.2 1 0 g Casein in
1 I kaltem PBS, pH 7,2 + Phenolrot 30 Minuten rühren lassen, - anschließend bei 3000 rpm zentrifugieren und den Überstand über einen Faltenfilter filtrieren. Der pH-Wert der Lösung wird mit NaOH eingestellt.
Substratpuffer: 0,5 M Tris, 0,01 % MgCI, ph 9,6 - 60,57 g Tris und
0, 1 g Magnesiumchlorid werden ad 1 I Aqua bidest. gelöst. 4-Methyl-Umbelliferyl-Phosphat (MUP)-Lösunq
Die Konzentration der MUP-Lösung beträgt 1 mg4-MPU/4, ml Substratpuffer.
Stopp-Lösung: 0.2 M Glycin , 0,2 % SDS, pH 1 1 , 7
1 5 g Glycin und
2 g SDS werden ad 1 I Aqua bidest. gelöst.
Der pH-Wert der Lösung wird mit 5 N NaOH eingestellt.
Durchführung des modifizierten quantitativen Immunreaktivitätstest nach Lindmo
1 . Herstellung des Antiqen-enthaltenden Materials ("antiqen containing material" ; ACM)
Gewebe von humanen Tumor-Xenografts ( MZ-STO 1 ,
Magenkarzimon) , die das Epitop des BW 250/1 83 exprimieren (auf der Membran von Granulozyten exprimiertes "nonspecific cross reacting antigen" (NCA-95)) , werden mit einer Moulinette in 2 bis 5 mm Stücke geschnitten und für mindestens 1 6 Stunden beim Raumtemperatur in 4 %
Formaldehyd-Lösung nach Lilly fixiert.
Nach dem Waschen werden die fixierten Gewebe durch ein rostfreies Edelstahlnetz passiert.
Die fixierten Zellen werden mindestens 1 0 Mal in PBS gewaschen bis der Überstand einigermaßen klar ist und anschließend
1 Mal in Formalin gewaschen.
Diese Präparation wird bei 4 °C in Formalin nach Lilly gelagert ( 1 Teil ACM und 1 Teil Formalin nach Lilly) und als "ACM " bezeichnet. 2. Bindungs-Assay mit Antigen-Überschuss
Das ACM wird mindestens 10 Mai mit PBS gewaschen und anschließend wird das Pellet suspendiert und in 1 00 mM Glycin (4faches Pelletvolumen) für 30 Minuten bei 4 °C inkubiert.
Danach werden die Zellen noch 4 Mal mit PBS gewaschen.
Steigende Mengen von ACM (0, 1 bis 50 mg) werden in 1 ml
Minitubes gegeben und jedes Röhrchen mit 500 μl
Hybridomüberstand, der 25 ng MAk BW 250/1 83 enthält, über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert (Über-Kopf-Rotation) .
Negativ-Kontrollen werden mit 25 ng des anti-Mykoplasmen MAk
BW 227/7, der den gleichen Isotyp besitzt (IgG*, ), inkubiert.
Das ACM wird abzentrifugiert, der Überstand entfernt und - auf verbleibende Maus-lgG-Moleküle, die nicht an das ACM-Pellet gebunden haben, analysiert.
3. Bestimmung des Anteils ungebundener Maus-lgG-Moleküle im ELISA-Svstem
Beschichtunq der Mikrotiterplatten mit Antiqen
96 well-Polystyrol-Mikrotiterplatten werden bei Raumtemperatur mit 50 μl Ziege-anti-Maus-lgG-Antiserum, 2,5 μl/ml, pro well über Nacht inkubiert. - Das Kaninchen-anti-Maus-lgG-Antiserum wird anschließend abgesaugt und die Platten 4 Mal mit 0,05 M Tris-Citrat-Puffer, pH 7,4 gewaschen (ein Waschvorgang = 200 μl Waschlösung pro well pipettieren und absaugen) . Die Mikrotiterplatten werden invers auf Zellulose über Nacht getrocknet.
Mit Trockenpatronen eingeschweißt beträgt die Lagerzeit der so vorbehandelten Mikrotiterplatten mindestens 6 Monate. Blocken freier Bindunqsstellen
200 μl Blocklösung werden pro well pipettiert und die Platten bei Raumtemperatur für 60 Minuten inkubiert. Anschließend wird die Blocklösung abgesaugt.
Probenauftraq
50 μl der ACM-Überstände, die auf die Anzahl der ungebundenen Maus-lgG-Moleküle analysiert werden sollen, werden pro well aufgetragen und bei Raumtemperatur für 60 Minuten inkubiert. - Danach werden die Mikrotiterplatten 3 Mal wie oben beschrieben mit Waschlösung gewaschen.
Amplifikation und Nachweis
50 μl eines mit alkalischer Phosphatase gekoppelten Ziege-anti- Maus-lgG-Antikörpers, 1 :250 verdünnt, werden pro well aufgetragen und bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert.
Die Mikrotiterplatten werden 3 Mal mit Waschlösung wie oben beschrieben gewaschen.
50 μl MUP-Lösung wird pro well aufgetragen und bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert.
Die Substratreaktion wird nach Inkubation bei Raumtemperatur für
30 Minuten durch Zugabe von 1 00 μl Stopp-Lösung gestoppt.
Anschließend wird die Fluoreszenz gemessen: die
Anregungswellenlänge beträgt 355 nm und die Emissionswellenlänge 460 nm.
Die Empfindlichkeit dieses Tests liegt im Bereich von 1 bis 2 ng Maus- IgG/ml. Mathematische Bestimmung der Immunreaktivität
|R[%] = 100 %-[100 % x (MAk-Konz. im Überstand/MAk-Ausgangskonz.)]
Die Berechnung der Immunreaktivität erfolgt am Ablesepunkt. Dieser Punkt liegt bei demjenigen ACM-Volumen (X-Achse der ELISA-Verlaufskurve), bei dem gerade noch kein Abfall des Plateauwertes der unspezifischen Kontrolle (unspezifische Bindung) vorhanden ist.
Beispiel 4
Szintigramme, aufgenommen nach Injektion von Tc-99m-markiertem MAk BW 250/183
Die für die Markierung mit Tc-99m verwendeten MAk-Chargen unterscheiden sich aufgrund des Herstellungsverfahrens in ihrer Immunreaktivität. Die Daten sind in der nachstehenden Tabelle 10 zusammengefasst:
Figure imgf000039_0001

Claims

Ansprüche
1 . Präparation von immunreaktiven Proteinen, dadurch gekennzeichnet, dass der in einem modifizierten Lindmo-Test bestimmte prozentuale Anteil an immunreaktiven Molekülen > 81 % bezüglich der Gesamtzahl von Molekülen ist.
2. Präparation nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der im modifizierten Lindmo-Test bestimmte prozentuale Anteil an immunreaktiven Molekülen > 90 % ist.
3. Präparation nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die immunreaktiven Proteine durch Herstellung in Zellkultur, insbesondere durch Expression in rekombinanten eukaryontischen Wirtszellen, erzeugt wurden.
Präparation nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die immunreaktiven Proteine eine Markierung, insbesondere eine radioaktive Markierung, tragen.
Präparation nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die immunreaktiven Proteine mindestens eine Antikörper- Bindedomäne enthalten.
6. Präparation nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die immunreaktiven Proteine aus Antikörpern und Antikörperfragmenten ausgewählt sind.
7 Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die immunreaktiven Proteine aus Fusionsproteinen ausgewählt sind, umfassend mindestens eine Antikörper-Bindedomäne und mindestens eine Effektordomäne.
8. Präparation nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das immunreaktive Protein an ein Epitop auf der Zellmembran von malignen und/oder nicht malignen Zellen bindet.
9. Präparation nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das immunreaktive Protein an ein zytoplasmatisches oder extrazelluläres Epitop auf normalen und/oder malignen Zellen bindet.
1 0. Präparation nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem immunreaktiven Protein um einen monoklonalen Antikörper handelt, der an ein Epitop auf CD66, vorzugsweise CD66 a, b, c, e und besonders bevorzugt CD 66 e, bindet.
1 . Präparation nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem immunreaktiven Protein um einen monoklonalen Antikörper handelt, der an ein Epitop auf CD45 bindet.
2. Präparation nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem immunoreaktiven Protein um einen monoklonalen Antikörper handelt, der an ein Epitop auf N-CAM bindet.
3. Präparation nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem immunoreaktiven Protein um einen monoklonalen Antikörper handelt, der an ein Epitop auf dem VEGF/VEGF-Rezeptor-Komplex bindet, und der weder an VEGF noch an den VEGF-Rezeptor bindet.
4. Präparation nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem immunoreaktiven Protein um einen monoklonalen Antikörper handelt, ausgewählt aus BW 431 /26, BW 250/1 83, YTH 24.5 und BW 278/1 05.
5. Verfahren zur Herstellung einer Präparation von immunreaktiven Proteinen, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Wirbelschichtreaktor-Fermentation einer das immunreaktive Protein exprimierenden Wirtszelle in einem geeigneten Kulturmedium und die Gewinnung des Proteins aus der Wirtszelle und/oder aus dem Kulturmedium umfasst.
1 6. Verfahren nach Anspruch 1 5, dadurch gekennzeichnet, dass man eine eukaryontische Wirtszelle verwendet.
1 7. Verfahren nach Anspruch 1 5 oder 1 6, dadurch gekennzeichnet, dass das immunreaktive Protein durch eine säulenarme
Reinigungsprozedur aus der Wirtszelle und/oder dem Kulturmedium gewonnen wird.
1 8. Verfahren nach Anspruch 1 6, dadurch gekennzeichnet, dass das immunreaktive Protein durch eine konventionelle Reinigungsprozedur aus der Wirtszelle und/oder dem Kulturmedium gewonnen wird.
1 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 5 bis 1 8, dadurch gekennzeichnet, dass der in einem modifizierten Lindmo-Test bestimmte prozentuale Anteil an funktionell aktiven Molekülen > 81 % bezüglich der Gesamtzahl von Molekülen ist.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 5 bis 1 9, dadurch gekennzeichnet, dass der in einem modifizierten Lindmo-Test bestimmte prozentuale Anteil an funktionell aktiven Molekülen > 90 % bezüglich der Gesamtzahl von Molekülen ist.
21 . Verfahren nach Anspruch 1 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Präparation entsprechend dem Herstellungsverfahren I hergestellt wird .
22. Verfahren nach Anspruch 1 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Präparation entsprechend dem Herstellungsverfahren I I hergestellt wird.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 5 bis 22, wobei das Protein ein monoklonaler Antikörper ausgewählt aus BW 250/1 83, BW 41 3/26, YTH 24.5 und BW 278/1 05 oder einem vergleichbaren murinen, humanisierten oder rekombinant manipulierten monoklonalen Antikörper oder einem Fragment davon ist.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 5 bis 22, wobei das Protein ein monoklonaler Antikörper, der an ein Epitop auf dem VEGF/VEGF-Rezeptor-Komplex bindet, und der weder an VEGF noch an den VEGF-Rezeptor bindet, oder ein vergleichbarer muriner, humanisierter oder rekombinant manipulierter monoklonaler Antikörper oder ein Fragment davon ist.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 5 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Protein um ein Fusionsprotein umfassend mindestens eine Antikörper-Binderdomäne und mindestens eine Effektordomäne handelt.
26. Verwendung von Protein-Präparationeπ nach einem der Ansprüche 1 bis 1 4 als Träger von ^-Strahlern, wie z.B. Tc-99m, zur Herstellung eines Mittels für die Diagnose entzündlicher Prozesse und von das Knochenmark verdrängenden Prozessen, beispielsweise Metastasen von Prostata-Karzinomen, Mamma-Karzinomen und Lymphomen.
27. Verwendung von Protein-Präparationen nach einem der Ansprüche 1 bis 1 4 als Träger von a- und ?-Strahlem zur Herstellung eines Mittels für die Therapie von Erkrankungen des hämatopoietischen Systems, vorzugsweise von Leukämien.
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