DE3587724T2

DE3587724T2 - Antikörper verwendende diagnostische Methoden.

Info

Publication number: DE3587724T2
Application number: DE3587724T
Authority: DE
Inventors: Barbara C Furie; Bruce E Furie
Original assignee: New England Medical Center Hospitals Inc
Current assignee: Tufts Medical Center Inc
Priority date: 1984-11-15
Filing date: 1985-11-15
Publication date: 1994-05-19
Anticipated expiration: 2005-11-16
Also published as: US4783330A; JPS61192285A; CA1276574C; EP0182634A2; DE3587724D1; EP0182634B1; EP0182634A3; ATE100209T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Antikörper und ihre Verwendung für die Diagnose. Insbesondere betrifft sie eine solche Verwendung für die Diagnose von Gefäßschädigungen, Gefäßerkrankungen und ähnlichen Zuständen bei menschlichen Patienten, charakterisiert durch aktivierte Blutplättchen enthaltende Stellen im Körper, und für die Auswertung der Effizienz thrombolytischer Mittel bei menschlichen Patienten.
Blutplättchen sind kernlose Zellen, die im Blut in einer ruhenden, inaktiven Form zirkulieren. Während der Einleitung der Hämostase werden diese Zellen aktiviert und erfahren größere funktionelle Veränderungen, die biochemisch und morphologisch beobachtet werden können. Untersuchungen, in denen die Oberflächenstrukturen auf ruhenden und aktivierten Blutplättchen verglichen wurden, führten zum Nachweis von Actin und einem weiteren hochmolekularen Protein, aufgebracht auf aktivierten Blutplättchen (George et al., (1980) J. Clin. Invest. 66, 1-9).
Niewenhuis et al., (1983) Thromb. Haemostasis 50, 100 beschreibt einen monoklonalen Antikörper, von dem gesagt wird, daß er mit aktivierten menschlichen Blutplättchen, Azurogranula von Granulozyten und Monocyten reagiert.
Ein Artikel mit dem Titel "A Platelet Membrane Protein Expressed during Platelet Activation and Secretion", (1984) J. Biol. Chem. 259(14), 9121-9126, bei dem auch die Verfasser der vorliegenden Erfindung mitgewirkt haben, beschreibt die in vitro Bindung von ¹²&sup5;J-markiertem KC4-Ak an ein Membran-Protein auf thrombinaktivierten Blutplättchen-Präparationen und die Herstellung des Proteins.
Zum Zeitpunkt vor der Erfindung war keine einfache und im wesentlichen nicht invasive Technik zum Auffinden aktivierte Blutplättchen enthaltender Stellen im menschlichen Körper verfügbar, die zur Diagnose von Gefäßschädigungen und Gefäßerkrankungen oder zur Auswertung der Effizienz thrombolytischer Mittel bei menschlichen Patienten hätte dienen können.
Die vorliegende Erfindung stellt sozusagen als ersten Aspekt einen monoklonalen Antikörper bereit, der reaktiv gegenüber aktivierten menschlichen Blutplättchen und im wesentlichen nichtreaktiv gegenüber ruhenden menschlichen Blutplättchen und den Azorogranula von Monozyten und Granulozyten ist, der markiert und bevorzugt radioaktiv markiert oder als NMR-Kontrastmittel mit einem paramagnetischen Ion komplexiert ist, zur Verwendung für die Diagnose von Gefäßschädigungen, Gefäßerkrankungen und ähnlichen Zuständen bei menschlichen Patienten, die durch aktivierte Blutplättchen enthaltende Stellen im Körper charakterisiert sind, und für die Auswertung der Effizienz thrombolytischer Mittel bei menschlichen Patienten mittels einer Methode, welche die Verabreichung des markierten Antikörpers an diese Patienten und den anschließenden Nachweis markierter Immunkomplexe in diesen Patienten umfaßt.
Gemäß einem alternativen zweiten Aspekt stellt die Erfindung einen monoklonalen Antikörper bereit, der reaktiv gegenüber aktivierten menschlichen Blutplättchen und im wesentlichen nichtreaktiv gegenüber ruhenden menschlichen Blutplättchen und den Azurogranula von Monozyten und Granulozyten ist, zur Verwendung bei der Herstellung eines diagnostischen Mittels, das markiert und bevorzugt radioaktiv markiert, oder mit einem paramagnetischen Ion komplexiert ist, um ein NMR-Kontrastmittel zur Diagnose von Gefäßschädigungen, Gefäßerkrankungen und ähnlichen Zuständen bei menschlichen Patienten zu bilden, die charakterisiert sind durch aktivierte Blutplättchen enthaltende Stellen im Körper, und zur Auswertung der Effizienz thrombolytischer Mittel bei menschlichen Patienten mittels einer Methode, welche die Verabreichung dieses diagnostischen Mittels an diese Patienten und den anschließenden Nachweis markierter Immunkomplexe in diesen Patienten umfaßt.
Gemäß einem dritten, alternativen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur in vivo Abbildung beim Nachweis und der Ortung von aktivierte Blutplättchen enthaltenden Stellen bei menschlichen Patienten bereitgestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß ein monoklonaler Antikörper, der reaktiv gegenüber aktivierten menschlichen Blutplättchen und im wesentlichen nichtaktiv gegenüber ruhenden menschlichen Blutplättchen und gegenüber den Azorogranula von Monozyten und Granulozyten ist, wobei dieser monoklonale Antikörper markiert und bevorzugt radioaktiv markiert, ist oder als NMR-Kontrastmittel mit einem paramagnetischen Ion komplexiert ist, den Patienten verabreicht wird, und daß ein deutliches Bild von der rage der aktivierte Blutplättchen enthaltenden Stellen innerhalb der Patienten erstellt wird mittels einer nichtinvasiven Methode, die durch die Natur dieser Markierung festgelegt wird.
Der Antikörper kann wegen seiner Spezifität nur für eine auf aktivierten, nicht aber ruhenden Blutplättchen aufgebrachte Antigendeterminante eine hochgenaue Information hinsichtlich der Lage der aktivierte Blutplättchen enthaltenden Stellen (z. B. Thromben) bei sehr wenig Hintergrund von ruhenden Blutplättchen oder anderen biologischen Teilchen, wie Monozyten und Granulozyten, liefern.
Monoklonale Antikörper zur erfindungsgemäßen Verwendung für die Diagnose können mittels Hybridzellen, die unter Anwendung herkömmlicher Hybridisierungs- und Screening- Techniken produziert werden, hergestellt werden. Wie auf dem Gebiet der monoklonalen Antikörper wohlbekannt ist, ist jede unabhängig produzierte Hydridzellen-Linie, die einen für dieselbe Antigendeterminante spezifischen monoklonalen Antikörper produziert, von allen anderen jedoch so verschieden, wie jeder der so gebildeten monoklonalen Antikörper untereinander. Während so die Wiederholung der hierin beschriebenen Arbeitsweise zur Herstellung einer Hybridzellen-Linie führt, die einen für die erfindungsgemäße Diagnose geeigneten monoklonalen Antikörper produziert, der spezifisch für die beschriebene Antigendeterminante auf aktivierten Blutplättchen ist, ist es höchst unwahrscheinlich, daß sie eine Zellenlinie ergibt, die einen monoklonalen Antikörper produziert, der chemisch eine genaue Kopie der besonderen unten beschriebenen monoklonalen Antikörper ist.
Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen nur unter Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen näher beschrieben, in denen
Fig. 1 eine graphische Darstellung ist, die die vergleichende Wechselwirkung eines Beispiels unseres Antikörpers mit ruhenden und aktivierten Blutplättchen zeigt;
Fig. 2 ein Paar von Immunfluoreszenz-Mikrophotos ist, die die Bindung eines Beispiels unseres Antikörpers an ruhende (A) und thrombinaktivierte (B) Blutplättchen veranschaulicht;
Fig. 3 eine graphische Darstellung einer Scatchard-Analyse der Wechselwirkung unsere Antikörpers mit aktivierten Blutplättchen ist;
Fig. 4 eine graphische Darstellung ist, die die Einflüsse von Calcium und EDTA auf die Bindung eines Beispiels unseres Antikörpers an aktivierte und ruhende Blutplättchen veranschaulicht.
Fig. 5 eine graphische Darstellung ist, welche die Beziehung zwischen sekretabsondernder Funktion und für aktivierte Blutplättchen spezifischer Antigen-Aufbringung auf aktivierten Blutplättchen veranschaulicht; und
Fig. 6 ein Gelelektrophorese-Diagramm ist, welches zeigt, daß das von einem Beispiel unseres Antikörpers erkannte Antigen von Glykoprotein IIa verschieden ist.

Herstellung von aktivierten Blutplättchen

Ein monoklonaler Antikörper wurde wie folgt hergestellt, beginnend mit der Isolierung von aktivierten Blutplättchen.
Es wurde Blut von normalen menschlichen Spendern besorgt und mit Ware-Lösung (0,1 M Citrat-Puffer) bei einem Volumen-Verhältnis von 9 : 1 antikoaguliert. Blutplättchenreiches Plasma (platelet-rich plasma PRP) hergestellt durch 15 minutenlanges Zentrifugieren des mit Citrat versetzten Blutes bei 160 g wurde einem stufenweisen BSA-Gradienten zugeführt, und die Blutplättchen-Konzentrate wurden isoliert. Die Blutplättchen wurden weiter durch Gelfiltration auf einer mit HEPES-Puffer bei pH 7,35 äquilibrierten Sepharose-2B- Säule gereinigt.
Thrombinaktivierte Blutplättchen wurden durch Zusatz von Thrombin bis zu einer Endkonzentration von 0,15 Einheiten/ml zur gelfiltrierten Blutplättchen-Suspension hergestellt und ohne Rühren 2 minutenlang inkubiert. Thrombinaktivierte Blutplättchen wurden durch Zusatz von 3% Glutaraldehyd fixiert. Die Suspension wurde 30 Minuten langsam gerührt, zweimal mit TBS 0,02 M Tris-HCl, 0,15 M NaCl, pH 7,5) gewaschen und bei -70ºC in 60 volumenprozentigem Glycerin gelagert.

Herstellung von Anti-Blutplättchen-Monoklonalen Antikörpern, die für aktivierte Blutplättchen spezifisch sind

Es wurden Balb/c Mäuse intraperitoneal mit 1-5·10&sup9; thrombinaktiverten aggregierten Blutplättchen in 250 ul HEPES-Puffer, pH 7,35 immunisiert. Diese Mäuse wurden mit einer ähnlichen Blutplättchen-Präparation von verschiedenen Spendern 2 Monate lang einer zweiwöchentlichen Booster-Injektion unterzogen. Die Mäuse ließ man 3 Monate lang ruhen; eine letzte Booster-Injektion wurde drei Tage vor der Zellfusion durchgeführt. Die Zellfusion wurde mittels der in Kohler and Milstein, Nature (1975) 256, 495-497 beschriebenen Methode unter Verwendung von sp2/0-Zellen als Fusions-Partner durchgeführt. Das überstehende Medium von fusionierten Zellen wurde auf Anti-Blutplättchen-Antikörper-Produktion geprüft. Ausgewählte positive Kulturen wurden mittels der von R.H. Kennett, T.J.McKearn und Bechtol, "Monoclonal Antibodies", Plenum Press, New York (1980), beschriebenen Grenzverdünnungs-Methode (limiting dilution method) geklont und ein als "KC4" bezeichneter Klon unter Ausführung eines ELISA-Antikörper-Screening-Verfahrens wurde wie folgt isoliert:
Glutaraldehyd- fixierte thrombinaktiverte Blutplättchen oder mit Acetylsalicylat behandelte ruhende Blutplättchen wurden in TBS, pH 7,5, bei einer Konzentration von 1·10&sup8; Blutplättchen/ml suspendiert. Die Blutplättchen- Suspension (100 ul) wurde jedem Mikrotiter-Gefäß (Immulon II, Dynatech Laboratories, Inc.) zugefügt und bei 1000 g 5 Minuten lang zentrifugiert. Nachdem die Platten mit TBS gewaschen waren, wurden 200 ul TBS mit 0,5% Gelatine und 50 ug/ml menschliches IgG zugefügt und die Plättchen 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Mikrotiter- Gefäße wurden dreimal mit TBS gewaschen, mit 100 ul an überstehender Hybridom-Kultur (hybridoma culture supernatant) versetzt und 1 Stunde lang bei 37ºC inkubiert. Die Mikrotiter-Gefäße wurden dreimal mit TBS, 2 mM B-Mercaptoethanol, 1,5 mM MgCl&sub2; gewaschen und dann mit 50 ul Schafs-Antimaus-Immunglobulin, konjugiert mit B-Galactosidase (Bethesda Research Laboratories) versetzt und 2 Stunden lang bei 22ºC inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit TBS und 2 mM B-Mercaptoethanol wurden 100 ul p-Nitrophenyl-B-D-galactosid (1 mg/ml) in 0,05 M Natriumphosphat und 1,5 mM MgCl&sub2; bei pH 7,2 zugesetzt. Die Freisetzung von p-Nitrophenol als Maß für die Blutplättchen- Antikörper-Bindung wurde über 30-60 Minuten bei 405 nm auf einem Dynatech-MR580-MICRO-ELISA-Autoreader abgelesen. Der KC4-Klon wurde als produzierender Antikörper isoliert, der bevorzugt reaktiv gegenüber aktivierten im Vergleich zu ruhenden Blutplättchen ist.
Hybridzellen des KC4-Klons, die den Anti-Blutplättchen- Antikörper ("KC4-Antikörper") produzierten, wurden intraperitoneal in Balb/c Mäuse gespritzt. Die sich entwickelnde Aszites wurde wieder geheilt und der KC4-Antikörper wurde unter Anwendung der Protein-A-Sepharose- Affinitätschromatographie isoliert. Das gebundene Immunglobulin wurde mittels 0,1 M Natriumcitrat, pH 6,0, eluiert. Diese Antikörper-Präparation ergab eine einzige Bande in SDS-Gelen (Sodium dodecylsulfat = Natriumdodecylsulfat) unter nichtreduzierenden Bedingungen und zwei Banden entsprechend der schweren und leichten Kette in SDS-Gelen unter reduzierenden Bedingungen. Der gereinigte Antikörper war IgG&sub1;k, bestimmt mittels Ouchterlony-Immundiffusion unter Anwendung artspezifischer Antiseren.

Bindungs-Spezifität des KC4-Antikörpers

Gereinigter KC4-Monoklonal-Antikörper wurde mit ¹²&sup5;J unter Anwendung von Chloramin-T markiert. Die Wechselwirkungen dieses Antikörpers mit nicht fixierten gelfiltrierten thrombinaktivierten Blutplättchen und nichtfixierten gelfiltrierten ruhenden Blutplättchen wurden in einem Lösungsphasen-Radioimmuntest untersucht. Wie in Fig. 1 gezeigt wird, gab der monoklonale Antikörper den aktivierten Blutplättchen deutlich den Vorzug. Die Wechselwirkung des KC4-Antikörpers mit thrombinaktivierten Blutplättchen war sättigungsfähig. Die Bindung des KC4-Antikörpers an ruhende Blutplättchen war jedoch minimal. Sowohl unbehandelte als auch mit Adenosin und Acetylsalicylat behandelte Blutplättchen ergaben gleichwertige Resultate.
Die Präferenz des monoklonalen Antikörpers für aktivierte statt ruhenden Blutplättchen wird auch in den Mikrophotos von Fig. 2 veranschaulicht. Die Bindung des KC4-Antikörpers an ruhende und thrombinaktivierte Blutplättchen wurde unter Anwendung eines zweiten fluoreszenzmarkierten Antikörpers bestimmt. Wie in Fig. 2 gezeigt wird, gab es im Grunde genommen keine Bindung an ruhende Blutplättchen (Tafel A im Vergleich zur Bindung an aktivierte Blutplättchen Tafel B).
Die Bindung des KC4-Antikörpers an thrombinaktivierte Blutplättchen wurde auch unter Anwendung einer Scatchard- Analyse ausgewertet. Unter Anwendung der repräsentativen Daten aus Versuch 4 in Tabelle I, unten, ergab eine Auftragung der Konzentration an gebundenen Antikörpern, dividiert durch die Konzentration an freien Antikörpern, gegen die Konzentration an gebundenen Antikörpern eine gerade Linie (Fig. 3). Diese Ergebnisse weisen auf eine einzige Klasse von Antikörper-Bindungsstellen auf der Blutplättchen-Oberfläche hin. Aufgrund der Analyse dieses Versuches betrug die Bindungskonstante KD für die Wechselwirkung des Antikörpers mit thrombinaktivierten Blutplättchen 6,9 nM. Jedes Blutplättchen enthielt etwa 10.000-17.000 (im Falle des vorliegenden Spenders 10.000) Bindungsstellen, die vom KC4-Antikörper erkannt wurden. Diese Ergebnisse bestätigen ferner die monoklonale Natur des Antikörpers, verdeutlicht durch die Einheitlichkeit der gemessenen scheinbaren Bindungskonstante.
Die Ergebnisse von vier unabhängigen Versuchen, die an Blutplättchen von vier verschiedenen Spendern durchgeführt wurden, werden in Tabelle I gezeigt. Es besteht eine hervorragende Übereinstimmung dieser Daten bei einer mittleren Bindungskonstante K von 7,2 + 0,4 nM. Die mittlere Anzahl an Bindungsstellen je Blutplättchen war 13.400 + 3.000.

Tabelle 1

Bindung des KC4-Monoklonal-Antikörpers an thrombinaktivierte Blutplättchen.
Jeder Versuch umfaßt doppelt durchgeführte Tests bei 10 verschiedenen Antikörper-Konzentrationen. Die Antikörper- Konzentrationen variierten zwischen 10&supmin;¹&sup0; M und 2 · 10&supmin;¹ M. Versuch Bindestellen/Blutplättchen Wechselwirkungs-Koeffizient F Mittel
Da die Aktivierung der Blutplättchen mit der Absonderung von Proteinen, wie Thrombospondin, verbunden ist, welche sich an die Plasmamembran in Gegenwart von Calciumionen binden, wurde die Wirkung von Calcium oder EDTA auf die Wechselwirkung zwischen KC4-Antikörper und Blutplättchen untersucht. Wie in Fig. 4 gezeigt wird, werden die Bindungskurven der KC4-Antikörper-Blutplättchen-Wechselwirkung durch Calciumionen oder EDTA nicht verändert. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß der KC4-Antikörper nicht gegen ein Blutplättchen-Antigen gerichtet ist, dessen Antigenstruktur durch Metallionen stabilisiert wird, und daß ebensowenig dieses Antigen durch die Einwirkung von Metallionen mit der Blutplättchen-Oberfläche verbunden wird. Außerdem hat menschliches Plasma nicht die Antikörper-Bindung an Blutplättchen gehemmt, was darauf hinweist, daß normales menschliches Plasma dieses Blutplättchen-Antigen nicht enthält. Puffer hoher Ionenstärke (1 M NaCl enthaltender Tris-Puffer) oder Puffer mit einem pH von 4 bis 10 veränderten nicht die Bindung des KC4-Antikörpers an Blutplättchen.

Sekretionsabhängiges Aufnehmen des Blutplättchen-Antigens

Es wurden die Wechselwirkungen von KC4-Antikörper mit thrombinaktivierten Blutplättchen und mit durch andere Agonisten aktivierten Blutplättchen verglichen. In Vorversuchen band sich der KC4-Antiköper an Blutplättchen, die mit Collagen, ADP, Adrenalin oder Thrombin aktiviert und aggregiert waren (Tabelle II). Diese Wechselwirkung wurde auch in nicht gerührten thrombinaktivierten gelfiltrierten Blutplättchen beobachtet, die nicht aggregierten. Daher erschien die Bindung von KC4-Antikörper an Blutplättchen als im wesentlichen unabhängig von Agonist und Blutplättchen-Aggregation.

Tabelle II

Bindung von KC4-Antikörpern an mittels verschiedener Agonisten aktivierte Blutplättchen

gebundene Antikörper
Thrombin (0,15 Einheiten/ml) 100
ADP (10 uM) 46
Adrenalin (10 uM) 66
Collagen (0,45 mg/ml) 72
Kein Agonist 0
Um festzustellen, ob die Aufnahme des für aktivierte Blutplättchen spezifischen Antigens mit Sekretion verbunden war, wurden die Blutplättchen mit ¹&sup4;C-Serotonin beladen. Die Abgabe von ¹&sup4;C -Serotonin von Blutplättchen bei Aktivierung mittels verschiedener Agonisten wurde mit der Bindung von ¹²&sup5;J-markiertem KC4-Antikörper an diese Blutplättchen verglichen. Wie in Fig. 5 gezeigt wird, besteht zwischen Antikörper-Bindung an die aktivierten Blutplättchen und Sekretion eine direkte Wechselbeziehung. Thrombinaktivierte Blutplättchen zeigten maximale Antikörper-Bindung und maximale Sekretion. Stimulierung mit ADP, Adrenalin oder Collagen führte zu einem geringeren Grad an Sekretion und Antikörper-Bindung. Blutplättchen, die anfangs mit Acetylsalicylat behandelt (was die Sekretion beeinträchtigt) und mit ADP, Collagen oder Adrenalin aktiviert wurden, nahmen das aktivierungsspezifische Antigen nicht auf. Diese Ergebnisse lassen annehmen, daß die Aufnahme des aktivierungsspezifischen Antigens sekretionsabhängig, aber agonist- und aggregationsunabhängig ist.
Das aktivierungsspezifische Antigen wird als "PADGEM"- Glykoprotein bezeichnet (für Platelet Activation-Dependent Granule to External Membrane). Man nimmt an, daß das PADGEM- Glykoprotein als Teil einer internen Granulmembran in ruhenden Blutplättchen vorliegt, und daß das PADGEM-Glykoprotein freigesetzt wird, wenn während Aktivierung und Sekretion die Granulmembran mit der externen Plasmamembran verschmilzt.

Antigen-Spezifität

Die Antigenspezifität des KC4-Antikörpers für ein Blutplättchen-Antigen wurde unter Anwendung der Western-Blot-Methode bestimmt. Blutplättchen-Proteine von Blutplättchen wurden in SDS gelöst und analysiert, Der KC4-Antikörper band sich an eine einzige Bande in den löslich gemachten Blutplättchen. Diese Bande wanderte mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 139.000. Vergleichstests mit Blutplättchen, die mit ¹²&sup5;J unter Anwendung der Lactoperoxidase-Methode oberflächenmarkiert waren, wurden durchgeführt. Das charakteristische Bandenmuster der ¹²&sup5;J-markierten Blutplättchen zeigte GPIIb, GPIIa, GPIII. Das Glykoprotein-Antigen des KC4-Antikörpers wanderte zwischen den Glykoproteinen IIb und IIa und unterschied sich von diesen ebenso wie von Glykoprotein III. Rote Blutzellen, Neutrophile, Monozyten, Lymphozyten, GM4672 (eine Lymphozyten-Zell-Linie) und Alexander PLC/PRF/5 (eine menschliche Hepatoma-Zell-Linie) wurden in SDS gelöst und ihre Proteine ähnlich auf Bindung an den KC4-Antikörper unter Anwendung der Western-Blot- Methode geprüft. Keine dieser Zellen enthielt Proteine, die sich an diesen Antikörper banden.

Reinigung des PADGEM-Glykoproteins

Das PADGEM-Glykoprotein wurde von rohen Blutplättchen- Membranen mittels Affinitätschromatographie gereinigt. Die Proteine wurden von den Membranen unter Verwendung von Triton X-100 extrahiert und danach auf eine Affinitätssäule appliziert, die den kovalent an Agarose gekoppelten KC4-Antikörper enthielt. Das auf die Säule applizierte Material war heterogen und die meisten dieser Proteine vermochten sich nicht an die KC4-Agarose zu binden. Das gebundene, mittels Diethylamin herausgelöste Protein wanderte als eine größere diffuse Bande auf SDS-Gelen bei Elektrophorese unter nichtreduzierenden Bedingungen, was auf wesentliche Reinheit (höher als 80%) hinweist. Die dominierende Proteinbande entsprach einem scheinbaren Molekulargewicht von 140.000. Der Charakter dieser Bande blieb in Anwesenheit von Ca&spplus;&spplus; oder EDTA unverändert. In SDS-Gelen, die unter reduzierenden Bedingungen liefen, wanderte das gereinigte PADGEM-Glykoprotein als eine einzige enge Bande, ebenfalls mit einem Molekulargewicht von 140.000. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß das PADGEM-Glykoprotein aus einer einzigen Polypeptid-Kette besteht. Das Protein wird mit Perjodsäure-Schiffs-Reagens gefärbt, um zu zeigen, daß es ein Glykoprotein ist.

Unterscheidbarkeit von PADGEM-Glykoprotein

Unter Bezugnahme auf Fig. 6 wurde die Unterscheidbarkeit des PADGEM-Glykoproteins von GPIIb und GPIIa unter Anwendung der Gelelektrophorese wie folgt veranschaulicht. Gereinigtes PADGEM-Glykoprotein wurde mit ¹²&sup5;J zu einem ¹²&sup5;J-markierten PADGEM-Glykoprotein markiert. Ruhende Blutplättchen wurden mit ¹³¹J unter Anwendung der Lactoperoxidase-Methode markiert, um die Blutplättchenmembran- Proteine einschließlich GPIIb, GPIIa und GPIII mit ¹³¹J an der Oberfläche zu markieren. Nach Behandlung mit Natriumdodecylsulfat wurden die ¹³¹J-markierten Blutplättchen-Glykoproteine (o) und die ¹²&sup5;J-markeirten PADGEM-Glykoproteine (o) mittels Gelelektrophorese zusammen analysiert. Das PADGEM-Glykoprotein wanderte zwischen GPIIb und GPIIa, was seine physikalische Unterscheidbarkeit von GPIIa veranschaulicht.

PADGEM-Glykoprotein-Verwendung

Das PADGEM-Glykoprotein kann als ein Immunogen zum Herstellen monoklonaler Antikörper, die für die Diagnose gemäß vorliegender Erfindung geeignet sind, verwendet werden. Die Herstellung von Antikörpern unter Verwendung von PADGEM-Glykoproteins hat im Vergleich zu derjenigen unter Verwendung von aktivierten Blutplättchen als Immunogen den Vorteil, daß Antikörper nur zum PADGEM-Glykoprotein, nicht aber zu Antigenen, die auf der Oberfläche sowohl von aktivierten als auch von ruhenden Blutplättchen aufgebracht sind, hergestellt werden.
Das PADGEM-Glykoprotein ist zur Immunisierung von Mäusen verwendet worden, um monoklonale Antikörper produzierende Hybridom-Zellen mit funktionellen Eigenschaften, die denen des KC4-Antikörpers ähnlich sind, herzustellen. Eine Balb/c Maus wurde interperitoneal einmal mit 25 ug PADGEM-Glykoprotein in komplettem Freundschen Adjuvans und dann zweimal in zweiwöchentlichen Intervallen mit 20 ug PADGEM-Glykoprotein in Salzlösung immunisiert. Nach einem weiteren, sechswöchigen Zeitraum wurde den Mäusen eine letzte Booster-Injektion mit 20 ug PADGEM-Glykoprotein in Salzlösung intravenös verabreicht. Eine Primärkultur dieser monoklonale Antikörper produzierenden Zellen wurde in der American Type Culture Collection, Rockville, MD, hinterlegt; ihr wurde die ATCC-Eingangs-Nr. HB 8670 gegeben.

Antikörper-Verwendung

Die Antikörper können verwendet werden zum Nachweisen und Orten von aktivierten Blutplättchen in vivo, insbesondere von Aggregaten blockierter aktivierter Blutplättchen, die sich bekanntlich zu Thromben zusammenballen, als Folge von Gefäßschädigungen und Gefäßerkrankungen, z. B. Thrombose, ischämischen Herzleiden, Gastrointestinal-Blutungen sowie peripheren und zerebralen Leiden. Hintergrund und fälschliche positive Ergebnisse werden vermieden, weil der Antikörper nicht nur mit ruhenden Blutplättchen, sondern auch nicht mit anderen Blutkomponenten, wie Granulozyten, reagiert. Die hohe Bindungsaffinität des Antikörpers bewirkt eine günstige Empfindlichkeit.
Die Antikörper werden unter Anwendung jeder üblichen Markierung, beispielsweise einer Radioaktiv-Markierung oder eines Fluoreszenzerzeugers, markiert. Eine bevorzugte Radioaktiv-Markierung ist ¹¹¹In, das eine Halbwertszeit aufweist, die zur Definition der Blutplättchen-Dynamik im Menschen angemessen ist. ¹¹¹In-markierte Antikörper können durch Modifizieren des Antikörpers mit Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA)-Anhydrid und anschließende Chelierung von ¹¹¹In nach der in Eckelman et al., (1975) Pharm. Sci., 64, 704 beschriebenen Methode hergestellt werden. Es ist gezeigt worden, daß sich solche ¹¹¹Indium-markierte Antikörper an aktivierte Blutplättchen in vitro binden.
Um die Abbildung in vivo beim Nachweis und bei der Ortung von Thromben und aktivierten Blutplättchen auszuführen, kann einem Patienten eine intravenöse Injektion von annähernd 500 uCi von sterilem, pyrogenfreiem ¹¹¹In-Antikörper in physiologischer Salzlösung gegeben werden. Es können dann Ganzkörper-Scan-Szintigramme unter Anwendung einer Gammakamera gemacht werden, die mit einem Computer kombiniert und mit einem Parallelloch-Kollimator für mittlere Energie ausgerüstet ist, und die ¹¹¹Indium-Abbildungen werden über die ¹¹¹Indium-Photopeaks erhalten.
Unsere Antikörper können auch mit einem paramagnetischen Ion, beispielsweise Gd&spplus;&spplus;&spplus; oder Mn&spplus;&spplus;, markiert werden, um ein zu erkennendes NMR-Kontrastmittel zu liefern. Das paramagnetische Ion kann mit dem Antikörper mittels eines Chelatbildners, wie DTPA, unter Anwendung üblicher Techniken, z. B. der in Khaw et al., (1982) J. Nucl. Med 23(11), 1011-1019 beschriebenen Methode, komplexiert werden.
Das Kontrastmittel kann einem Patienten verabreicht und die NMR-Aufnahme ausgeführt werden. Das Mittel wird einen NMR-Kontrast zwischen aktivierten Blutplättchen, an welche die markierten Mittel gebunden sind, und anderen Bereichen des Kreislaufsystems liefern.
Zusätzlich zur Eignung für die Ortung und Charakterisierung von aktivierten Blutplättchen kann die Abbildung in vivo unter Verwendung unseres markierten Antikörpers auch ein empfindliches Mittel zur Auswertung der Effizienz von thrombolytischen Mitteln liefern, beispielsweise von Urokinase, Streptokinase und Gewebeplasminogen-Aktivator bei der Herabsetzung des Ausmaßes an myokardialer Nekrose im Anschluß an akute Koronar-Thrombose.

Claims

1. Monoklonaler Antikörper, der reaktiv gegenüber aktivierten menschlichen Blutplättchen und im wesentlichen nichtreaktiv gegenüber ruhenden menschlichen Blutplättchen und den Azurogranula von Monozyten und Granulozyten ist, und der markiert und bevorzugt radioaktiv markiert ist oder mit einem paramagnetischen Ion komplexiert ist, um ein NMR-Kontrastmittel zu bilden, zur Verwendung für die Diagnose von Gefäßschädigungen, Gefäßerkrankungen und ähnlichen Zuständen bei menschlichen Patienten, die durch aktivierte Blutplättchen enthaltende Stellen im Körper charakterisiert sind, und für die Auswertung der Effizienz thrombolytischer Mittel bei menschlichen Patienten mittels einer Methode, welche die Verabreichung des markierten Antikörpers an diesen Patienten und den anschließenden Nachweis markierter Immunkomplexe in diesen Patienten umfaßt.

2. Monoklonaler Antikörper, der reaktiv gegenüber aktivierten menschlichen Blutplättchen und im wesentlichen nichtreaktiv gegenüber ruhenden menschlichen Blutplättchen und den Azurogranula von Monozyten und Granulozyten ist, zur Verwendung bei der Herstellung eines diagnostischen Mittels, das markiert und bevorzugt radioaktiv markiert ist oder mit einem paramagnetischen Ion komplexiert ist, um ein NMR-Kontrastmittel zur Diagnose von Gefäßschädigungen, Gefäßerkrankungen und ähnlichen Zuständen bei menschlichen Patienten zu bilden, die charakterisiert sind durch aktivierte Blutplättchen enthaltende Stellen im Körper, und zur Auswertung der Effizienz thrombolytischer Mittel bei menschlichen Patienten mittels einer Methode, welche die Verabreichung dieses diagnostischen Mittels an diesen Patienten und den anschließenden Nachweis markierter Immunkomplexe in diesen Patienten umfaßt.

3. Antikörper nach Anspruch 1 bzw. Anspruch 2 zur Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei dieser Antikörper reaktiv ist gegenüber einer Antigendeterminante auf den Oberflächen von aktivierten menschlichen Blutplättchen und sich nicht auf den Oberflächen von ruhenden menschlichen Blutplättchen und Azurogranula von Monozyten oder Granulozyten befindet.

4. Antikörper nach Anspruch 1 bzw. Anspruch 2 zur Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei dieser Antikörper eine Antigendeterminante auf aktivierten menschlichen Blutplättchen erkennt, wobei die Antigendeterminante ein von Glykoprotein IIa verschiedenes Protein ist.

5. Antikörper nach Anspruch 1 und Anspruch 3 oder 4 bzw. nach Anspruch 2 und Anspruch 3 oder 4 zur Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Antigendeterminante ein Glykoprotein auf der Oberfläche aktivierter Blutplättchen ist, das ein Molekulargewicht von etwa 140.000 aufweist.

6. Antikörper nach Anspruch 1 und einem der Ansprüche 3, 4 oder 5 bzw. nach Anspruch 2 und einem der Ansprüche 3, 4 oder 5 zur Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Antigendeterminante einer Stabilisierung auf aktivierten menschlichen Blutplättchen durch Calciumionen nicht zugänglich ist.

7. Antikörper nach Anspruch 1 und einem der Ansprüche 3 bis 6 bzw. nach Anspruch 2 und einem der Ansprüche 3 bis 6 zur Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Antigendeterminante kein Bestandteil normalen menschlichen Plasmas ist.

8. Antikörper nach Anspruch 1 bzw. Anspruch 2 zur Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Antikörper vom IgG-Isotyp und bevorzugt vom IgG&sub1;-Isotyp ist.

9. Antikörper nach Anspruch 1 und einem der Ansprüche 3 bis 8 bzw. nach Anspruch 2 und einem der Ansprüche 3 bis 8 zur Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Antikörper zwischen 10.000 und 17.000 Bindungsstellen auf aktivierten menschlichen Blutplättchen erkennt.

10. Antikörper nach Anspruch 1 und einem der Ansprüche 3 bis 9 bzw. nach Anspruch 2 und einem der Ansprüche 3 bis 9 zur Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Bindung des Antikörpers an aktivierte Blutplättchen im wesentlichen unabhängig von Blutplättchen-Aggregation ist.

11. Verfahren zur Abbildung in vivo beim Nachweis und bei der Ortung von aktivierte Blutplättchen enthaltenden Stellen bei menschlichen Patienten, gekennzeichnet durch die Anwendung eines monoklonalen Antikörpers, der reaktiv ist gegenüber aktivierten menschlichen Blutplättchen und im wesentlichen nichtreaktiv ist gegenüber ruhenden menschlichen Blutplättchen und gegenüber den Azurogranula von Monozyten und Granulozyten, wobei dieser monoklonale Antikörper markiert und bevorzugt radioaktiv markiert ist oder mit einem paramagnetischen Ion komplexiert ist, um ein NMR-Kontrastmittel zu bilden.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der monoklonale Antikörper reaktiv ist gegenüber einer Antigendeterminante auf den Oberflächen von aktivierten menschlichen Blutplättchen und sich nicht auf den Oberflächen von ruhenden menschlichen Blutplättchen und Azurogranula von Monozyten oder Granulozyten befindet.

13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der monoklonale Antikörper eine Antigendeterminante auf aktivierten menschlichen Blutplättchen erkennt, wobei die Antigendeterminante ein von Glykoprotein IIa verschiedenes Protein ist.

14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Antigendeterminante ein Glykoprotein auf der Oberfläche aktivierter Blutplättchen ist, das ein Molekulargewicht von etwa 140.000 aufweist.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 12, 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Antigendeterminante einer Stabilisierung auf aktivierten menschlichen Blutplättchen durch Calciumionen nicht zugänglich ist.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Antigendeterminante kein Bestandteil normalen menschlichen Plasmas ist.

17. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper vom IgG-Isotyp und bevorzugt vom IgG&sub1;-Isotyp ist.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper zwischen 10.000 und 17.000 Bindungsstellen auf aktivierten menschlichen Blutplättchen erkennt.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindung der Antikörper an die aktivierten Blutplättchen im wesentlichen unabhängig von Blutplättchen-Aggregation ist.