WO2002004111A2 - Polymer-chip - Google Patents

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WO2002004111A2
WO2002004111A2 PCT/EP2001/007726 EP0107726W WO0204111A2 WO 2002004111 A2 WO2002004111 A2 WO 2002004111A2 EP 0107726 W EP0107726 W EP 0107726W WO 0204111 A2 WO0204111 A2 WO 0204111A2
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polymer chip
chip
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Roland Kirchner
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Giovanna Morelli
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07B2200/11—Compounds covalently bound to a solid support
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures

Definitions

  • the invention relates to a polymer chip.
  • Polymer chips are essentially DNA chips and protein chips.
  • the DNA chip technology analyzes sequence information in order to understand, for example, cellular functions and their regulation.
  • Sensor molecules are arranged in orderly grids on surfaces on DNA chips.
  • the material to be examined is usually isolated from the sample, mostly cells. This is usually followed by nucleic acid isolation with subsequent amplification, for example in the form of a PCR (polymerase chain reaction) or selective enrichment, for example by mRNA isolation.
  • PCR polymerase chain reaction
  • selective enrichment for example by mRNA isolation.
  • the mRNA is transcribed into a cDNA using a reverse transcriptase. This step conventionally involves marking the later hybridization sample so that post-hybridization can be carried out.
  • a DNA chip consists of a carrier and the necessary molecules for the experiment. During production, these molecules are either synthesized in situ using photolithographic techniques using physical masks on the matrix, or printed on using various methods, such as the contact method using capillary needles or the non-contact method based on piezoelectric inkjet nozzles. The production of printed DNA micro-arrays is divided into the activation or the coating of the solid chip matrix, to which biomolecules are fixed using a suitable coupling chemistry.
  • Basic patent applications for DNA chips are e.g. B. EP 0 619 321 A,
  • EP 0373 203 A, EP 0476 014 A and EP 0 386 229 A are examples of EP 0373 203 A, EP 0476 014 A and EP 0 386 229 A.
  • Covalent couplings allow multiple hybridizations of biochips.
  • hybridization of DNA microarrays has only been possible with little complexity. This means that a reasonably simple hybridization is only possible with a low probe density.
  • oligonucleotide chips become more expensive, which is particularly important in the case of high integration densities.
  • various fluorescent dyes are used as labeling agents for nucleic acid or DNA studies.
  • MALDI-TOF analysis mass absorption laser desorption ionization time of flight spectrometry
  • a computer system for evaluating DNA chips is known from EP 0 923 050 A.
  • pentamers and octamers are produced and immobilized on polyacrylamide gel pads (DNA sequence analysis by hybridization with oligonucleotide microchips AA Stomakhin, Richard J. Cotter et al. Nucleic Acids Research, 2000, Vol. 28 No.5 1193- 1198). It is also described that 10 different immobilized octamers with a 28 base long DNA section and then each with a mixture of 10 different pentamers be implemented. This leads to a total of 13 bp long double strands, which are composed of neighboring 8 and 5 bp long hybrids, the latter containing the labeling agent and being stabilized by the vicinity of the former and thus being detectable.
  • the pentamer that has undergone hybridization is preferably examined by MALDI spectrometry, since in this case the fluorescence spectrometry is comparatively less sensitive and meaningful.
  • the sensitivity and measuring range of this method is so small that it cannot be used routinely.
  • Hybridization is an essential basis of DNA chip technology.
  • Single strands of deoxyribo- (DNA) or ribo- (RNA) nucleic acid are composed of bases such as adenine (A), thymine (T), cytosine (C), guanine (G), uracil (U) or inosine (I). They are able to hybridize to double strands.
  • A is linked with T or with U, C with G or with I via hydrogen bonds.
  • So-called base pairs are formed, e.g. AT or CG.
  • there may be non-complementary base pairs e.g. B. AG, GU.
  • nucleic acids The hybridization of nucleic acids is used in the detection of certain nucleic acid sequences from sample material that has to be prepared beforehand. In this case, oligonucleotides complementary to the nucleic acid sequence sought are produced which hybridize with the sequence sought. The formation of such a double strand must then be demonstrated using suitable methods.
  • either the nucleic acid sample to be examined or the oligonucleotide sequence complementary to the nucleic acid sequence sought is immobilized on a solid phase.
  • the product can be washed.
  • Detection is usually carried out by means of radioisotopes, coloring agents or other marking agents which are incorporated in the hybridization or which later ultimately detect a signal based on physical possible (CR Cantor, CL Smith, Genomics, John Wiley and Sons, New York 1999, p. 67).
  • CR Cantor, CL Smith, Genomics, John Wiley and Sons, New York 1999, p. 67 CR Cantor, CL Smith, Genomics, John Wiley and Sons, New York 1999, p. 67.
  • the stability of a nucleic acid duplex is expressed in its melting temperature.
  • the melting temperature is the temperature at which a potential hybrid is present in equal parts double-stranded and single-stranded. It depends on the type and composition of the base pairs from which a double strand is composed, as well as the concentration of the nucleic acid strands present and the type and composition of the medium in which the double strand is present.
  • hybridization ie the degree of hybrids that do not contain any misbinding in the sense of non-complementary base pairs, is closely related to the stability of the hybrids formed. Adjacent complementary base pairs make a contribution to the overall stability of a hybrid, depending on their type and composition. If there is a misbinding within a hybrid in the sense of a non-complementary base pair, the contribution of a base pair and two such interactions to the enthalpy of formation of those malformed hybrids is missing in comparison to a faultlessly designed hybrid. This is expressed in the lower melting temperature of the malformed Hybrids versus hybrids without mismatch.
  • a completely complementary DNA / DNA-14mer has a melting temperature that is about 7 ° C higher than that of a 14mer with a faulty binding (CR Cantor, CL Smith, Genomics, John Wiley and Sons, New York 1999, Chapter 3).
  • a share of 1% misbinding in a given hybrid lowers its melting temperature by approx. 1 ° C. Therefore, in addition to the type and composition of the reaction medium, the temperature selected for carrying out a hybridization is a control parameter for the specificity of a hybridization (RJ Britten, EH Davidson, Hybridization strategy in Nucleic acid hybridization: a practical approach, ed. BD James, SJ Higgins, IRL Press 1985).
  • the specificity of a hybridization depends on the length of the base fragments entering the hybrid. The more neighboring base pairs hybridize, the faster the actual hybridization proceeds. Mismatch, on the other hand, slows the formation of a hybrid. This difference in speed increases with the number of base pairs forming a hybrid. 10% mismatch in a given hybrid usually slows down the reaction rate by half (R.J. Britten, E.H. Davidson, Hybridization strategy in Nucleic acid hybridization: a practical approach, ed. B.D. James, S.J. Higgins, IRL Press 1985).
  • Examples of applications for hybridization experiments are, for example, the detection of Mycoplasma Pneumoniae (EP 0 173 920 A2), the detection of the protein human telomerase O reverse transcriptase (hTRT) (EP 0 841 396 A1), the detection of certain polymorphisms (eg EP 0812 922 A2 ).
  • the present invention has for its object to provide a polymer chip which is suitable for the analysis of short sequences.
  • the polymer chip according to the invention contains a large number of probes. Different probes are each arranged at a different probe point on a support and each probe has an oligomer sequence.
  • the oligomer sequence is composed of a known number of monomers.
  • the polymer chip according to the invention is characterized in that several oligomer sequences are arranged at each probe point, each of which is composed of a probe sequence and a wobble sequence, the probe sequence of a probe point being identical to one another and the probe represent and the wobble sequences of a probe point each include permutations of the monomers.
  • a single oligomer sequence has significantly more monomers than if only one probe sequence were present.
  • the oligomer sequences can be designed with a length sufficient for a stable hybridization. Since the wobble sequence of a probe point comprises permutations of the monomers, only the probe sequence is specific for a specific sample material with which it hybridizes, since any wobble sequence suitable for the respective sample sequence can hybridize with it.
  • a preferred embodiment of the polymer chip according to the invention is specified in claim 2, in which the wobble sequences of each probe point have the same number of monomers and comprise all permutations of the monomers.
  • the probe sequence is complementary to a section of the sample sequence, an oligomer sequence is specified which is shown in all monomers are complementary to the corresponding portion of the sample sequence.
  • the development according to claim 3 relates to a polymer chip in which the probes include all permutations of the probe sequences.
  • a probe point is provided on the polymer chip for each permutation.
  • Such a chip can be referred to as a universal chip, because any sample sequences can be examined with this chip, since all theoretically possible probes of a certain length are present on the chip.
  • the probe consists of a hexamer and the wobble sequence consists of 3 to 8 monomers, even more preferred is a hexamer probe with a wobble sequence with 4 to 7 monomers.
  • FIG. 2 is a table which shows the intensities of the samples of the DNA chip from FIG.
  • FIG. 3 shows a schematic section of the chip according to the invention
  • the exemplary embodiment of the polymer chip according to the invention is a DNA chip, as shown in detail in FIG. 3.
  • the chip has a carrier plate 1, which is formed from glass in the exemplary embodiment.
  • the carrier plate 1 has probe points 2 to which oligonucleotides 3 are attached. These are composed of three sections, namely a spacer 4, a wobble sequence 5 and a probe sequence 6. The entirety of the wobble sequences 5 and the probe sequences 6 of a probe point 2 each represent a probe 8.
  • probe sequences 6 of each probe point 2 are identical.
  • the probe sequences 6 each consist of a hexamer XXXXX, in which X represents one of the four bases A, T, G and C, and which has a specific sequence consisting of these bases.
  • the spacers 4 consist of thymidine decamers which are attached to the carrier plate 1 via the 5 ′ end by means of NH 2 binding.
  • the wobble sequences 5 consist of polymers Nj, in which N stands for one of the four bases A, T, G and C.
  • each probe point 2 has at least one streptavidin molecule 7.
  • the streptavidin molecules 7 are attached to the carrier plate 1 in such a way that DNA sample provided with biotin can be bound to it and thus selectively immobilized in close proximity to the oligonucleotides 3 at each probe point 2.
  • No streptavidin molecules 7 are provided on the carrier plate 1 outside the areas of the probe points 2.
  • a nucleic acid section to be examined is amplified from the biological material to be examined by means of PCR and, for example, purified on QIAquick columns (from QIAgen).
  • a primer is used for one of the strands formed, which is provided with biotin 12 at the 5 'end. This primer is chosen so that it is extended by the sequence to be examined.
  • the PCR product 9 contains two complementary strands 10 and 11, one of which is provided with a biotin 12 at the 5 'end.
  • the PCR product 9 is incubated on the chip (FIG. 4a) and immobilized on the probe points 2 by means of a biotin-streptavidin coupling (FIG. 4b).
  • the immobilized PCR product 9 is denatured by rinsing with denaturing solution and then washed with binding buffer. As a result, the non-biotinylated and therefore not immobilized strands 11 are removed. What remains are individual immobilized DNA strands 10 attached to the probe points 2, each of which represents a sample 13 immobilized in this way (FIG. 4c). If the sample 13 contains a region DNA which is complementary to the probe sequence 6, the oligonucleotide 3 and sample 13 can be hybridized.
  • a sample 13 hybridizes with an oligonucleotide 3, up to 12 bases of the oligonucleotide 3 each attach to up to twelve complementary bases of this sample 13.
  • the sample 13 has six bases which are adjacent to the probe sequence 6 and up to six bases which are complementary to the wobble sequence 5. Since two wobble sequences 5 with all 4096 permutations of six bases are present at one probe point, the section of sample 13 which hybridizes with the wobble sequence 5 can comprise any sequence of up to six bases.
  • the section of the sample 13 that hybridizes with the probe sequence 6 should be complementary to the probe sequence 6 of the respective probe point 2. Therefore, at a probe point 2, only a sample 13 can hybridize completely with an oligonucleotide 3, which has a section complementary to the probe sequence 6.
  • the wobble sequences 5 and the probe sequences 6 of the oligonucleotides 3 of each probe point 2 thus form probes 8 specific for each hexamer, although these hybridize with the sample over a length of up to twelve bases. Since the probe 8 is specific for only six bases, 4096 probe points 2 are sufficient for all possible permutations of probe 8 to be provided on a chip. This is a universal chip that can be used to analyze any sample divided into hexamers.
  • the stability and specificity of the hybrids 14 formed from matching samples 13 and probes 8 are increased by immobilizing the samples 13 in the probe points.
  • the provision of the wobble sequence 5 enables stable hybridization, although the probe 8 is only specific for a sequence of a few bases (4-8 bases).
  • a PCR reaction mixture is applied which contains polymerase, dGTP, dATP, dCTP and cy3-dUTP (FIG. 4 d) -e)).
  • the chip is sealed and subjected to a temperature profile typical of the PCR.
  • a temperature of 94 ° C denaturation of the double strands formed) for a period of 30 s
  • a temperature of 30 ° C hybridization of the samples 13 with probes 8
  • a temperature of 50 ° C Elongation of the hybridized probes
  • the PCR is ended by cooling the sample to a temperature at which the polymerase is no longer active, for example 4 ° C.
  • a temperature at which the polymerase is no longer active for example 4 ° C.
  • stable hybridization products 14 which contain corresponding complementary bases over the entire length of the probe sequence 6, the probe sequence 6 is elongated by the polymerase in each cycle step.
  • the sample 13 has a section corresponding to the probe sequences 6 of all oligonucleotides 3 of the probe point 2, so that it can hybridize with a multiplicity of oligonucleotides 3 which either have an exactly matching wobble sequence 5 or an only slightly different wobble sequence. Own sequence 5. Sequences that contain less than four pre-defined can preferably hybridize less than two non-complementary base pairs.
  • oligonucleotides 3 of a probe point 2 are usually elongated by the polymerase if there is complementarity with respect to the probe sequence 6 and a section of the sample 13.
  • dNTPs - in the present case cy3-dUTP - equipped with a fluorescence marker are successively incorporated into the PCR products 15, which can be detected, for example, with a scanner. The more markers are incorporated in a probe point 2, the stronger the corresponding signal.
  • oligonucleotide chip according to the invention and its use in the detection of nucleic acid material of different lengths can be seen in the fast reaction of the chip as well as the direct evaluation by fluorescence spectroscopy and the universal applicability of the chip and its cost reduction compared to the known methods.
  • a polymer chip of the type described above it is possible to carry out mutation analyzes easily, quickly and very effectively, which lead to rapid identification of unknown sequence variations.
  • oligonucleotide chip according to the invention is in epidemiological areas of medicine.
  • a polymer chip according to the invention with 100 different hexamer sequences was produced using a commercial system (Spotting Robot, Beecher Instruments, Silver Springs, USA).
  • the oligonucleotides were present in a concentration of 50 ⁇ mol in 0.5M streptavidin (from Sigma).
  • streptavidin from Sigma.
  • the binding chemistry over NH 2 modified surfaces was adequately described ("Versatile derivatization of solid support media for covalent bonding on DNA microchips", M. Beier, JD Hoheisel, Nucleic Acids Research, 1999, Vol. 27, No. 9, 1970-1977) using commercially available glass surfaces (eg from Perkin Elmer).
  • the oligonucleotides 3 to be immobilized generally had the following structure: 5 ' - T 10 - N 6 - XXXXXX where XXXXX represents the probe sequence 6 and, according to the exemplary embodiment, stands for a hexamer.
  • N stands for one of the 4 bases G, A, T or C, N 6 for the wobble sequence 5 and T for thymidine.
  • Homologous gene segments from Neisseria meningitis with a length of 300 bp were amplified by PCR.
  • the primer which was extended by the sequence complementary to the probe sequences 6 carries a biotin label 12 at the 5 ' end.
  • the PCR products were purified after amplification on columns, for example by QIAquick (from QIAGEN).
  • the array was framed with a commercially available adhesive tape (from Biozym).
  • the PCR product 9 to be examined was measured after cleaning and an aliquot of 10 ng 30 min at room temperature in binding buffer (5mM Tris-HCl pH 7.5; 0.5mM EDTA, 1M NaCI) was incubated on the chip. Denaturation was carried out by rinsing with 1 ml of denaturing solution (0.1 M NaOH). It was then washed with the same volume of binding buffer. 25 ⁇ l of PCR reaction mixture were then added (200 ⁇ M dGTP, dATP, dCTP, cy3-dUTP, 1x PCR reaction buffer, 1 U Red Taq polymerase, from Sigma)
  • reaction mixture was sealed with a film (from Biozym) and then subjected to the following thermal profile in a commercial thermal cycler for in situ PCR (from Biozym):
  • reaction mixture was heated to 94 ° C for 30 seconds.
  • the mixture was then cooled to 30 ° C. for 30 seconds and then heated to 50 ° C. for 1 minute. This process was repeated thirty times.
  • the mixture was then cooled to 4 ° C.
  • the signals are evaluated using a commercially available laser scanner (e.g. from MWG BIOTECH AG).
  • the gene sequence pgm-14 shown in FIG. 3 was applied as a sample to the DNA chip.
  • the DNA chip provided with the sample is using the PCR method described above (a PCR reaction approach: polymerase, dGTP, dATP, dCTP and cy3-dUTP; 94 ° C - 30 s, 30 ° C - 30 s and 50 ° C - 1 minute, 30 cycles), the dye cy3 being incorporated for later detection.
  • the DNA chip prepared in this way was scanned with a laser scanner. A section of the scanned image of the DNA chip is shown in FIG. 1.
  • Light areas represent strongly fluorescent probe points 2, gray areas weakly fluorescent probe points 2 and dark areas not or hardly fluorescent probe points 2 and the area outside of probe points 2.
  • the probe points 2 are arranged in the form of a grid, which is formed by horizontal rows and vertical columns is spanned.
  • the probe points 2 with identical probes arranged on the chip are each adjacent in one column.
  • two probe points 2 which are arranged one below the other in the same column, and the upper one of which is in an odd row and the lower one in an even row (FIG. 1), since these two probe points 2 each contain the same probe 8 , .
  • the detectable nucleotide sequences complementary to the probe sequences 6 of the probe points 2, the row (row) and column (column), the light intensity of the respective probe point 2 (determined by means of fluorescence spectrometry) S # 1 Mean) and the number of pixels measured (S # 1 area).
  • the scanner's pixel size was 20x20 microns, but other pixel sizes (e.g. 10x10 microns) are also common.
  • the individual probe points 2 are designated Sr / s, where r stands for row and s for column, and these uniquely assign each probe point 2 (S).
  • S1 / 1 and S2 / 1 both contain the same probe 8, the probe sequence 6 of which is complementary to the sought-after sequence TTCGCG.
  • Light intensities of 4271.02 units for S1 / 1 and 3582.22 units for S2 / 1 were determined, in each case in the order of 10 3 units. These were intensities of 56.95 (S1 / 1) and 48.42 (S2 / 1) units per pixel.
  • S3 / 1 and S4 / 1 containing the probe complementary to the hexamer TTCGCC gave light intensities of 839.09 (S3 / 1) and 983.77 (S4 / 1) units. This is a power of ten lower than in the detection example mentioned above. Bezo- Regarding the number of pixels, the values are 10.48 (S3 / 1) and 18.22 (S4 / 2) units, i.e. significantly less than half compared to S1 / 1 (56.95, see above) and S2 / 1 (48.42, see above) ,
  • the invention has been explained in more detail above using an exemplary embodiment.
  • the invention is not restricted to this specific exemplary embodiment.
  • it is e.g. B. possible to use a radioactive label or a MALDI-TOF analysis instead of a fluorescent label to select the elongations of the probes.
  • other covalent couplings can be used instead of the streptavidin-biotin coupling.
  • the carrier material used in the above exemplary embodiment is a glass plate.
  • other carrier materials such as e.g. B. ceramic plates or the like to use.
  • it can e.g. For example, it may also be advisable not to provide all permutations of a wobble sequence at one probe point, in particular if certain sequences occur preferentially in the sample material.
  • the present invention naturally also encompasses a type of polymer which has a carrier which is formed, for example, on two, three or four carrier platelets. The corresponding probe points are then distributed over the individual carrier plates.

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Abstract

Vorgeschlagen wird ein Polymer-Chip enthaltend eine Vielzahl von Sonden, wobei unterschiedliche Sonden jeweils an einem anderen Sondenpunkt auf einem Träger angeordnet sind und jede Sonde eine Oligomer-Sequenz aufweist und die Oligomer-Sequenz aus einer bekannten Anzahl Monomeren zusammengesetzt ist und an jedem Sondenpunkt mehrere Oligomer-Sequenzen angeordnet sind, die jeweils aus einer Sonden-Sequenz und einer Wobbel-Sequenz zusammengesetzt sind, wobei die Sonden-Sequenzen eines Sondenpunktes identisch zueinander sind und die Sonde darstellen und die Wobbel-Sequenzen eines Sondenpunktes jeweils Permutationen der Monomere aufweist.

Description

Polvmer-Chip
Die Erfindung betrifft einen Polymer-Chip.
Polymer-Chips sind im wesentlichen DNA-Chips und Protein-Chips.
Mit der DNA-Chip Technologie werden Sequenzinformationen analysiert, um z.B. zelluläre Funktionen und deren Regulation zu verstehen. Auf DNA-Chips sind Sensormoleküle in geordneten Rastern auf Oberflächen angeordnet. Die Art wie diese Raster erstellt werden, und die verschiedenen Anwendungsmöglichkeiten variieren jedoch so stark, dass von einer Vielzahl verschiedener Techniken gesprochen werden kann. Üblicherweise wird das zu untersuchende Material aus der Probe, zumeist Zellen, isoliert. Danach erfolgt meist eine Nukleinsäureisolation mit daran anschließender Amplifikation, zum Beispiel in Form einer PCR (Polymerase Chain Reaction) oder einer selektiven Anreicherung zum Beispiel über eine mRNA Isolation. In der Regel wird die mRNA mittels einer reversen Transkriptase in eine cDNA umgeschrieben. Dieser Schritt beinhaltet herkömmlicherweise eine Markierung der späteren Hybridisierungsprobe, so dass nach der Hybridisierung werden kann. Daran schließt sich die Datenanalyse an, die bei Mikroarray-Hybridisierungen in Abhängigkeit von der Integrationsdichte häufig den zeitaufwendigsten Schritt darstellt. Diese Chip Technologien haben den Vorteil, dass sie die Verfahren der Probenaufbereitung über die Hybridisierung und .Detektion bis hin zur Datenanalyse integrieren. Durch die weitest gehende Parallelisierung von Analysenschritten kann der Probendurchsatz erhöht werden (Medizinische Genetik Nr.1 März 1999 Jahrgang 11 S.1-32).
Ein DNA-Chip besteht aus einem Träger und den für das jeweilige Experiment not- wendigen, darauf fixierten Molekülen. Bei der Herstellung werden diese Moleküle entweder in situ mittels photolithographischer Techniken unter Verwendung physikalischer Masken auf der Matrix synthetisiert, oder durch verschiedene Verfahren aufgedruckt, wie beispielsweise das Kontaktverfahren mit Hilfe von Kapillarnadeln oder die Nichtkontaktverfahren auf Basis von piezoelektronischen Tintenstrahldü- sen. Die Herstellung von aufgedruckten DNA-Mikro-Arrays gliedert sich in die Aktivierung bzw. die Beschichtung der festen Chipmatrix, an die Biomoleküle über eine geeignete Kopplungschemie fixiert werden. Grundlegende Patentanmeldungen zu DNA-Chips sind z. B. EP 0 619 321 A,
EP 0373 203 A, EP 0476 014 A und EP 0 386 229 A.
Kovalente Kopplungen lassen Mehrfachhybridisierungen von Biochips zu. Die Hybridisierung von DNA-Mikroarrays gelingt bis jetzt nur bei geringer Komplexität. Dies bedeutet, dass nur bei einer geringen Sondendichte eine vernünftige einfache Hybridisierung ermöglicht wird. Oligonukleotid-Chips werden mit wachsender Kom- plexität des Chips teurer, die besonders bei hohen Integrationsdichten zum Tragen kommt. Im allgemeinen werden für Nukleinsäure- oder DNA-Untersuchungen verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe als Markierungsagenzien verwendet. Eine andere Variante ist die Detektion mit der MALDI-TOF-Analyse (Mass Absorption Laser De- sorption lonization-Time of Flight Spektrometrie) auf Basis der Massenspektro- metrie, bei der auf Markierungszusätze verzichtet werden kann.
Aus der EP 0 923 050 A ist ein Computer-System zur Auswertung von DNA-Chips bekannt.
Bekannt ist z.B. das Pentamere und Octamere auf Polyacrylamid-Gelpads hergestellt und immobilisiert werden (DNA sequence analysis by hybridization with oligo- nucleotid microchips A.A. Stomakhin, Richard J. Cotter et al. Nucleic Acids Research, 2000, Vol. 28 No.5 1193-1198). Es ist außerdem beschrieben, dass 10 verschiedene immobilisierte Octamere mit einem 28 Basen langen DNA-Abschnitt und im Anschluss jeweils mit einem Gemisch aus 10 unterschiedlichen Pentameren umgesetzt werden. Dies führt zu insgesamt 13 bp langen Doppelsträngen, die sich aus benachbarten 8 und 5 bp langen Hybriden zusammensetzen, wobei letztere das Markierungsagens enthalten und durch die Nachbarschaft zu ersteren stabilisiert und damit detektierbar werden. Das Pentamer, das die Hybridisierung einge- gangen ist, wird vorzugsweise MALDI-spektrometrisch untersucht, da die Fluores- zenzspektrometrie in diesem Fall vergleichsweise wenig sensitiv und aussagekräftig ist. Allerdings ist die Sensitivität und der Messbereich dieses Verfahrens so gering, dass es nicht routinemäßig verwendet werden kann.
Eine wesentliche Grundlage der DNA-Chip Technologie ist die Hybridisierung. Einzelstränge der Desoxyribo- (DNA) oder Ribo- (RNA) nukleinsäure sind aus Basen wie Adenin (A), Thymin (T), Cytosin (C), Guanin (G), Uracil (U) oder Inosin (I) zusammengesetzt. Sie sind in der Lage, zu Doppelsträngen zu hybridisieren. Dabei werden A mit T oder mit U, C mit G oder mit I über Wasserstoffbrücken verknüpft. Es bilden sich sogenannte Basenpaare, z.B. AT oder CG. Darüber hinaus können nicht komplementäre Basenpaare vorliegen, z. B. AG, GU.
Bringt man unter geeigneten Bedingungen zwei verschiedene Einzelstränge zusammen, die genügend benachbarte komplementäre Basenpaare enthalten, hybri- disieren sie zu einer doppelsträngigen Nukleinsäure. Unter geeigneten Bedingungen erhält man so DNA/DNA-, DNA/RNA- und RNA/RNA-Hybride.
Die Hybridisierung von Nukleinsäuren findet Anwendung in der Detektion bestimmter Nukleinsäuresequenzen aus Probenmaterial, das zuvor aufbereitet wer- den muss. Dabei werden zur gesuchten Nukleinsäuresequenz komplementäre Oli- gonukleotide hergestellt, die mit der gesuchten Sequenz hybridisieren. Die Bildung eines solchen Doppelstrangs muss dann mittels geeigneter Methoden nachgewiesen werden.
In Hybridisierungsexperimenten ist entweder die zu untersuchende Nukleinsäure- Probe oder die zur gesuchten Nukleinsäuresequenz komplementäre Oligonukleo- tidsequenz an einer festen Phase immobilisiert. Nach erfolgreicher Hybridisierung kann das Produkt gewaschen werden. Der Nachweis erfolgt i.d.R. über bei der Hybridisierung oder später eingebaute Radioisotope, Färbemittel oder andere Mar- kierungsagenzien, die letztendlich die spätere Detektion eines Signals auf physika- lischem Wege ermöglichen (C. R. Cantor, C. L. Smith, Genomics, John Wiley and Sons, New York 1999, S. 67). Auf diese Weise können viele Einzel- Untersuchungen auf sogenannten Polymer-Chips parallel ausgeführt werden, was den möglichen Probendurchsatz pro Zeiteinheit erhöht.
Die Analyse von biologischem Probenmaterial durch Reaktion mit Polymer-Chips führt zu an der Chip-Oberfläche immobilisierten Molekülen, deren Topologie und Quantitäten auf dem Poiymer-Chip Aussagen über die Menge einer bestimmten Nukleinsäuresequenz, eines Gens oder eines Genprodukts in diesem Probenmate- rial ermöglichen. Daraus lassen sich biologische Informationen z.B. über Genexpressionen und Mutationen in einem Genom ableiten. Diese haben einen potentiellen, beschleunigenden Nutzen bei der Entwicklung neuer Medikamente, in der Diagnose und anderen Bereichen der biomedizinischen und biochemischen Forschung (M. Schena, R. W. Davis, Genes, genomes and chips in DNA Microar- rays, Hrsg. M. Schena, Oxford University Press 1999).
Um eine Hybridisierung fehlerfrei detektieren zu können, muss diese unter den jeweils üblichen Bedingungen hinreichend stabil und spezifisch sein.
Die Stabilität eines Nukleinsäuredoppelstrangs drückt sich in seiner Schmelztemperatur aus. Die Schmelztemperatur ist die Temperatur, bei der ein potentielles Hybrid zu gleichen Teilen doppelsträngig und einzelsträngig vorliegt. Sie hängt von der Art und Zusammensetzung der Basenpaare ab, aus denen ein Doppelstrang zusammengesetzt ist, sowie der Konzentration der vorhandenen Nukleinsäurestränge und der Art und Zusammensetzung des Mediums, in dem der Doppelstrang vorliegt.
Die Spezifität einer Hybridisierung, also der Grad an Hybriden die keine Fehlbindung im Sinne von nicht komplementären Basenpaaren enthalten, hängt eng mit der Stabilität der gebildeten Hybride zusammen. Benachbarte komplementäre Ba- senpaare leisten in Abhängigkeit von ihrer jeweiligen Art und Zusammensetzung einen Beitrag zur Gesamtstabilität eines Hybrids. Liegt innerhalb eines Hybrids eine Fehlbindung im Sinne eines nicht komplementären Basenpaares vor, so fehlt im Vergleich zu einem fehlerfrei ausgebildeten Hybrid der Beitrag eines Basenpaares sowie zweier solcher Wechselwirkungen zur Bildungsenthalpie jener fehlgebildeten Hybride. Dies drückt sich in der niedrigeren Schmelztemperatur der fehlgebildeten Hybride gegenüber den Hybriden ohne Fehlbindung aus. So weist z.B. ein vollständig komplementäres DNA/DNA-14mer gegenüber einem 14mer mit einer Fehlbindung eine um ca. 7°C erhöhte Schmelztemperatur auf (C. R. Cantor, C. L. Smith, Genomics, John Wiley and Sons, New York 1999, Kap.3). Ein Anteil von 1% Fehl- bindung in einem gegebenen Hybrid erniedrigen dessen Schmelztemperatur um ca. 1 °C. Deshalb ist die für die Durchführung einer Hybridisierung gewählte Temperatur neben der Art und Zusammensetzung des Reaktionsmediums ein Kontrollparame- ter für die Spezifität einer Hybridisierung (R.J. Britten, E. H. Davidson, Hybridization strategy in Nucleic acid hybridization: a practical approach, Hrsg. B. D. James, S. J. Higgins, IRL Press 1985).
Ferner hängt die Spezifität einer Hybridisierung von der Länge der in das Hybrid eingehenden Basenfragmente ab. Je mehr benachbarte Basenpaare hybridisieren, desto schneller verläuft die eigentliche Hybridisierung. Eine Fehlbindung hingegen verlangsamt die Bildung eines Hybrids. Dieser Geschwindigkeitsunterschied wächst mit der Anzahl der ein Hybrid bildenden Basenpaare. 10% Fehlbindung in einem gegebenen Hybrid verlangsamen die Reaktionsgeschwindigkeit i.d.R. um die Hälfte (R.J. Britten, E. H. Davidson, Hybridization strategy in Nucleic acid hybridization: a practical approach, Hrsg. B. D. James, S. J. Higgins, IRL Press 1985).
Können zwei DNA-Einzelstränge acht oder mehr Basenpaare bilden, gilt wegen der realisierbaren Spezifität und äer Bindungsstärke der einzelnen Basenpaare die Bildung fehlerfreier Doppelstränge in der überwiegenden Zahl der Hybridisierungen als sicher (C. R. Cantor, C. L. Smith, Genomics, John Wiley and Sons, New York 1999, S. 11).
Will man eine kurze Nukleotidsequenz in einer Probe mit Hilfe eines einzelnen DNA-Chips detektieren (z.B. eine Punktmutation eines Gens oder ein Allel), so ist dies aus den o.a. Gründen nur möglich, wenn die letztendlich zu detektierenden Hybride eine bestimmte Mindestlänge aufweisen.
Anwendungsbeispiele für Hybridisierungsexperimente sind z.B. der Nachweis von Mycoplasma Pneumoniae (EP 0 173 920 A2), die Detektion des Proteins human telomerasθ reverse transkriptase (hTRT) (EP 0 841 396 A1), die Detektion von be- stimmten Polymorphismen (z.B. EP 0812 922 A2). Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen Polymer-Chip zu schaffen, der zur Analyse von kurzen Sequenzen geeignet ist.
Die Aufgabe wird durch einen Polymer-Chip mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den Unteransprüchen angegeben.
Der erfindungsgemäße Polymer-Chip enthält eine Vielzahl von Sonden. Unterschiedliche Sonden sind jeweils an einem anderen Sondenpunkt auf einem Träger angeordnet und jede Sonde weist eine Oligomer-Sequenz auf. Die Oligomer- Sequenz ist aus einer bekannten Anzahl von Monomeren zusammengesetzt.
Der erfindungsgemäße Polymer-Chip zeichnet sich dadurch aus, dass an jedem Sondenpunkt mehrere Oligomer-Sequenzen angeordnet sind, die jeweils aus einer Sonden-Sequenz und einer Wobbel-Sequenz zusammengesetzt sind, wobei die Sonden-Sequenz eines Sondenpunktes identisch zu einander sind und die Sonde darstellen und die Wobbel-Sequenzen eines Sondenpunktes jeweils Permutationen der Monomere umfassen.
Durch das Vorsehen der Wobbel-Sequenzen, die Permutationen der Monomere umfassen, weist eine einzelne Oligomer-Sequenz deutlich mehr Monomere auf, als wenn lediglich eine Sonden-Sequenz vorhanden wäre. Durch die Erhöhung der Anzahl der Monomere in den Oligomer-Sequenen mittels der Wobbel-Sequenzen können die Oligomer-Sequenzen mit einer für eine stabile Hybridisierung ausrei- chende Länge ausgebildet sein. Da die Wobbel-Sequenz eines Sondenpunktes Permutationen der Monomere umfassen, ist lediglich die Sonden-Sequenz für ein bestimmtes Probenmaterial, mit dem es hybridisiert spezifisch, da eine beliebige, für die jeweilige Probensequenz geeignete Wobbel-Sequenz mit dieser hybridisieren kann.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Polymer-Chips ist in Anspruch 2 angegeben, bei dem die Wobbel-Sequenzen eines jeden Sondenpunktes die gleiche Anzahl Monomere aufweisen und alle Permutationen der Monomere umfassen. Hierdurch wird bei Komplementarität der Sonden-Sequenz mit einem Abschnitt der Proben-Sequenz eine Oligomer-Sequenz vorgegeben, die in allen Monomeren komplementär zu dem korrespondierenden Abschnitt der Probensequenz ist.
Die Weiterbildung nach Anspruch 3 betrifft einen Polymer-Chip, bei dem die Sonden alle Permutationen der Sonden-Sequenzen umfassen. Für jede Permutation ist ein Sondenpunkt auf dem Polymer-Chip vorgesehen. Ein solcher Chip kann als Universal-Chip bezeichnet werden, denn mit diesem Chip können beliebige Probensequenzen untersucht werden, da alle theoretisch möglichen Sonden einer bestimmten Länge auf dem Chip vorhanden sind.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform besteht die Sonde aus einem Hexamer und die Wobbel-Sequenz besteht aus 3 bis 8 Monomeren, noch bevorzugter ist eine Hexamer-Sonde mit einer Wobbel-Sequenz mit 4 bis 7 Monomeren.
Im folgenden wird die vorliegende Erfindung mehr im Detail mit Bezug auf das in den Zeichnungen gezeigte Beispiel beschrieben, das jedoch nicht angegeben sein soll, um den Bereich der vorliegenden Erfindung zu beschränken.
In den Zeichnungen zeigen:
Fig.1 einen mittels Fluoreszenzspektrometrie ausgewerteten DNA-Chip,
Fig. 2 eine Tabelle, die die Intensitäten der Proben des DNA-Chips aus Fig.
1 enthält, Fig. 3 einen schematischen Ausschnitt des erfindungsgemäßen Chips, und
Fig. 4a) - e) jeweils schematisch die Abfolge der auf dem erfindungsgemäßen
Chip ausgeführten Reaktionsschritte, Fig. 5a) - e) Auflistung von im Ausführungsbeispiel, untersuchten Sequenzen.
Das Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Polymerchips ist ein DNA-Chip, wie in Fig. 3 ausschnittweise dargestellt. Der Chip weist eine Trägerplatte 1 auf, die im Ausführungsbeispiel aus Glas ausgebildet ist. Die Trägerplatte 1 weist Sondenpunkte 2 auf, an denen Oligonukleotide 3 angebracht sind. Diese setzen sich aus drei Abschnitten zusammen, nämlich einem Spacer 4, einer Wobbel-Sequenz 5 und einer Sonden-Sequenz 6. Die Gesamtheit der Wobbel-Sequenzen 5 und der Sonden-Sequenzen 6 eines Sondenpunktes 2 stellen jeweils eine Sonde 8 dar.
Alle Sonden-Sequenzen 6 eines jeden Sondenpunktes 2 sind identisch. Die Son- den-Sequenzen 6 bestehen aus jeweils einem Hexamer XXXXXX, in dem X für je eine der vier Basen A, T, G und C steht, und das eine spezifische Sequenz bestehend aus diesen Basen besitzt.
Im vorliegenden Ausführungsbeispiel bestehen die Spacer 4 aus Thymidin- Decameren, die über das 5'-Ende mittels NH2-Bindung auf der Trägerplatte 1 angebracht sind.
Die Wobbel-Sequenzen 5 bestehen aus Polymeren Nj, in denen N für je eine der vier Basen A, T, G und C steht. Die Wobbel-Sequenzen 5 der Oligonukleotide 3 eines jeden Sondenpunktes umfassen sämtliche 41 Permutationen, wobei i die Anzahl der Basen der Wobbel-Sequenzen 5 ist. Bei aus sechs Monomeren (i = 6) bestehenden Wobbel-Sequenzen 5 ergeben sich somit 46 = 4096 Permutationen, weshalb entsprechend viele Oligonukleotide 3 auf jedem Sondenpunkt 2 angebracht sind.
Ferner weist jeder Sondenpunkt 2 mindestens ein Streptavidinmolekül 7 auf. Dabei sind die Streptavidinmoleküle 7 derart auf der Trägerplatte 1 angebracht, dass mit Biotin versehene DNA-Probe an diese gebunden und somit in räumlich unmittelbarer Nähe zu den Oligonukleotiden 3 selektiv an einem jeden Sondenpunkt 2 immo- bilisiert werden kann. Außerhalb der Bereiche der Sondenpunkte 2 sind keine Streptavidinmoleküle 7 auf der Trägerplatte 1 vorgesehen.
Die Fig. 4a bis 4e zeigen schematisch an einem einzelnen Oligonukleotid 3 die im folgenden durchgeführten Reaktionsschritte.
Aus dem zu untersuchenden biologischen Material wird ein zu untersuchender Nukleinsäureabschnitt mittels PCR amplifiziert und z.B. an QIAquick-Säulen (von QIAgen) gereinigt. Dabei wird für einen der entstehenden Stränge ein Primer verwendet, der am 5'-Ende mit Biotin 12 versehen ist. Dieser Primer wird so gewählt, dass er um die zu untersuchende Sequenz verlängert wird. Das PCR-Produkt 9 enthält zwei komplementäre Stränge 10 und 11 , von denen einer am 5'-Ende mit einem Biotin 12 versehen ist. Das PCR-Produkt 9 wird auf dem Chip inkubiert (Fig. 4a) und mittels einer Biotin-Streptavidin-Kopplung an den Sondenpunkten 2 immobilisiert (Fig. 4b). Das immobilisierte PCR-Produkt 9 wird durch Spülen mit Denaturierungslösung denaturiert und anschließend mit Bindepuffer gewaschen. Hierdurch werden die nicht biotinylierten und deshalb nicht immobilisierten Stränge 11 entfernt. Zurück bleiben einzelne an den Sondenpunkten 2 angebrachte immobilisierte DNA-Stränge 10, die derart immobilisiert jeweils eine Probe 13 darstellen (Fig. 4c). Enthält die Probe 13 einen zur Sonden-Sequenz 6 komplementären Bereich DNA, so lassen sich Oligonukleotid 3 und Probe 13 hybridisieren.
Wie oben angeführt, sind in einem jedem Sondenpunkt 2 4096 verschiedene Oli- gonukleotide 3 angebracht, die sich untereinander lediglich in ihrer Wobbel- Sequenz 5 unterscheiden, und diese Wobbel-Sequenz 5 beinhaltet alle möglichen Permutationen der 4 Basen A, T, C und G.
Hybridisiert eine Probe 13 mit einem Oligonukleotid 3, so lagern sich jeweils bis zu 12 Basen des Oligonukleotids 3 an bis zu zwölf komplementäre Basen dieser Probe 13 an. Die Probe 13 weist sechs Basen auf, die zur Sonden-Sequenz 6, und dazu benachbart bis zu sechs Basen, die zur Wobbel-Sequenz 5 komplementär sind. Da an einem Sondenpunkt 2 Wobbel-Sequenzen 5 mit allen 4096 Permutationen von sechs Basen vorhanden sind, kann der Abschnitt der Probe 13, der mit der Wobbel-Sequenz 5 hybridisiert eine beliebige Sequenz aus bis zu sechs Basen umfassen. Der Abschnitt der Probe 13, der mit der Sonden-Sequenz 6 hybridisiert, soll komplementär zu der Sonden-Sequenz 6 des jeweiligen Sondenpunktes 2 sein. Deshalb kann an einem Sondenpunkt 2 nur eine Probe 13 vollständig mit einem Oligonukleotid 3 hybridisieren, die einen zur Sonden-Sequenz 6 komplementären Abschnitt aufweist. Die Wobbel-Sequenzen 5 und die Sonden-Sequenzen 6 der Oligonukleotide 3 eines jeden Sondenpunktes 2 bilden somit für jeweils ein Hexa- mer spezifische Sonden 8, obwohl diese über eine Länge von bis zu zwölf Basen mit der Probe hybridisieren. Da die Sonde 8 lediglich für sechs Basen spezifisch ist, genügen 4096 Sondenpunkte 2, um alle möglichen Permutationen von Sonden 8 auf einem Chip vorzusehen. Dies ist ein Universalchip, mit dem jede beliebige Probe in Hexamere untergliedert analysiert werden kann.
Zur Darstellung eines Universalchips wäre es prinzipiell auch möglich an jedem Sondenpunkt lediglich ein einzelnes Oligonukleotid mit sechs Basen vorzusehen, das die jeweilige Sonde darstellt. Derart kurze Oligonukleotide können jedoch nicht ausreichend stabil mit einer Probe hybridisieren (C.R. Cantor, C.L. Smith, Genomics, Wiley-Interscience, New York 1999, S. 11).
Es hat sich gezeigt, dass der Beitrag des Basenpaares G-C zur Schmelztemperatur einer doppelsträngigen DNA etwa 4°C und eines Basenpaares A-T etwa 2°C beträgt. Für eine Sequenz von sechs Basenpaaren ergibt sich somit eine Schmelztemperatur von 12-24°C. Dies zeigt, dass bei den üblichen Reaktionsbedingungen mit Temperaturen von zumindest 30°C Hexamere keine stabilen Hybridisie- rungsprodukte bilden können.
Ferner wird die Stabilität und Spezifität der aus zueinander passenden Proben 13 und Sonden 8 entstehenden Hybride 14 durch die Immobilisierung der Proben 13 in den Sondenpunkten erhöht.
Durch das Vorsehen der Wobbel-Sequenz 5 wird eine stabile Hybridisierung möglich, obwohl die Sonde 8 lediglich für eine Sequenz von wenigen Basen (4-8 Basen) spezifisch ist.
In einem weiteren Schritt wird ein PCR Reaktionsansatz aufgetragen, der Polyme- rase, dGTP, dATP, dCTP und cy3-dUTP enthält (Fig. 4 d)-e)). Man versiegelt den Chip und unterwirft ihn einem für die PCR typischen Temperaturprofil. Hierbei wird z. B. eine Temperatur von 94°C (Denaturierung der gebildeten Doppelstränge) für eine Dauer von 30 s, eine Temperatur von 30°C (Hybridisierung der Proben 13 mit Sonden 8) für eine Dauer von 30 s und eine Temperatur von 50°C (Elongation der hybridisierten Sonden) für eine Dauer von einer Minute eingestellt. Dieser Zyklus wird beispielsweise dreißig mal wiederholt. Die PCR wird beendet, indem man die Probe auf eine Temperatur abkühlt, bei der die Polymerase nicht mehr aktiv ist, z.B. 4°C. In stabilen Hybridisierungsprodukten 14, die über die gesamte Länge der Sonden- Sequenz 6 korrespondierende komplementäre Basen beinhalten, wird die Sonden- Sequenz 6 von der Polymerase in jedem Zyklusschritt elongiert.
In stabilen Hybridisierungsprodukten 14, bei denen zur 3'-endigen Base der Sonden-Sequenz 6 keine passende komplementäre Base auf der Probe 13 vorliegt, erfolgt keine Elongation der Sonden-Sequenz 6, da das 3'-Ende der Base nicht mit der Sonde hybridisieren kann.
Wenn nicht-komplementäre Basenpaare (als komplementär gelten Watson-Crick- Basenpaare GC und AT) innerhalb des Doppelstrangs vorliegen, und das 3'-Ende der Sonde 8 komplementär an eine Base der Probe 13 gebunden ist, und das Hybridisierungsprodukt 14 dennoch ausreichend stabil ist, wird die Sonden- Sequenz 6 elongiert.
Besteht zwischen der Sonden-Sequenz 6 und der Probe 13 während eines PCR- Zyklus eine Fehlbindung im Sinne eines nicht-komplementären Basenpaars, so kann dennoch eine stabile Hybridisierung erreicht werden, wenn die Wobbel- Sequenz 5 weitgehend zu dem korrespondierenden Abschnitt der Probe 13 kom- plementär ist. Liegt eine derartige Fehlbindung im Bereich der Sonden-Sequenz 6 vor, hat dies zur Folge, dass bei den Hybridisierungen in den einzelnen PCR-Zyklen die Wahrscheinlichkeit deutlich geringer ist, dass ein stabiles Hybridisierungsprodukt 14 erzielt wird. Deshalb werden bei Vorhandensein eines nicht komplementären Basenpaars im Bereich der Sonden-Sequenz 6 im Verlauf der PCR-Reakion nur wenige oder keine Elongationen der Sonden-Sequenz 6 erfolgen.
Liegt ein nicht komplementäres Basenpaar nur im Bereich der Wobbel-Sequenz 5 während eines PCR-Zyklus vor, so ist die Wahrscheinlichkeit hoch, dass im nachfolgenden PCR-Zyklus wiederum eine stabile Hybridisierung erzielt wird. Die Probe 13 besitzt einen zu den Sonden-Sequenzen 6 aller Oligonukleotide 3 des Sondenpunkts 2 korrespondierenden Abschnitt, so dass sie mit einer Vielzahl von Oligo- nukleotiden 3 hybridisieren kann, die entweder eine exakt passende Wobbel- Sequenz 5 oder eine nur geringfügig abweichende Wobbel-Sequenz 5 besitzen. Als geringfügig abweichend werden Sequenzen beurteilt, die mit weniger als vier, vor- zugsweise weniger als zwei nicht komplementären Basenpaaren hybridisieren können.
Da die Probe 13 mit unterschiedlichen Oligonukleotiden in den einzelnen PCR- Zyklen hybridisieren kann, werden in der Regel mehrere unterschiedliche Oligonukleotide 3 eines Sondenpunktes 2 durch die Polymerase elongiert, wenn eine Komplementarität bezüglich der Sonden-Sequenz 6 und einem Abschnitt der Probe 13 vorliegt. Im Verlauf dieser Elongationen werden sukzessive mit einem Fluores- zenzmarker ausgestattete dNTPs - im vorliegenden Fall cy3-dUTP - in die PCR- Produkte 15 eingebaut, die beispielsweise mit einem Scanner detektierbar sind. Je mehr Marker in einem Sondenpunkt 2 inkorporiert werden, desto stärker ist das entsprechende Signal.
Mit fortschreitender Elongation und Zyklenzahl steigt die Anzahl der eingebauten fluoreszenzmarkierten Basen. Nach einer gewählten Anzahl von Zyklen wird die PCR-Reaktion abgebrochen, überschüssige dNTPs werden durch Waschen entfernt und der Chip mittels Fluoreszenzspektrometrie ausgewertet. Dabei fluoreszieren diejenigen Sondenpunkte 2 auf dem DNA-Chip am stärksten, deren Sonde 8 spezifisch für die jeweilige Probe 13 ist, weil aus den o.a. Gründen vor allem deren Oligonukleotide 3 zu Hybridisierungsprodukten 15 elongiert werden.
Die Vorteile des erfindungsgemäßen Oligonukleotid-Chips und dessen Einsatz bei der Detektion von Nukleinsäurematerial unterschiedlicher Länge sind in der schnellen Reaktion des Chips sowie der direkten Auswertung durch die Fluores- zenzspektroskopie und der universellen Einsetzbarkeit des Chips und seiner Kostenreduktion gegenüber den bekannten Verfahren zu sehen. Mit einem Polymer-Chip der oben beschriebenen Art ist es möglich, Mutationsanalysen einfach, schnell und sehr effektiv durchzuführen, die zu einer schnellen Identifikation auch unbekannter Sequenzvariationen führen.
Eine Verwendung des erfindungsgemäßen Oligonukleotid-Chips liegt in epidemiologischen Bereichen der Medizin.
Anhand eines konkreten Ausführungsbeispiels wird die Benutzung des erfindungs- gemäßen DNA-Chip erläutert. Beispiel
Ein erfindungsgemäßer Polymer-Chip mit 100 verschiedenen Hexamersequenzen wurde mit einem mit einem kommerziellen System (Spotting Robot, Beecher Instruments, Silver Springs, USA) hergestellt.
Die Oligonukleotide lagen beim Spotting in einer Konzentration von 50 μmol in 0.5M Streptavidin (von Sigma) vor. Die Bindungschemie über NH2 modifizierte O- berflächen war hinreichend beschrieben („Versatile derivatization of solid support media for covalent bonding on DNA-microchips", M. Beier, J.D. Hoheisel, Nucleic Acids Research, 1999, Vol. 27, Nr. 9, 1970-1977). Hierzu wurden kommerziell erhältliche Glasoberflächen (z.B. von Perkin Eimer) verwendet.
Die zu immobilisierenden Oligonukleotide 3 hatten generell folgende Struktur: 5'- T10 - N6 - XXXXXX wobei XXXXXX die Sonden-Sequenz 6 darstellt und gemäß dem Ausführungsbeispiel für ein Hexamer steht. N steht für je eine der 4 Basen G, A, T oder C, N6 für die Wobbel-Sequenz 5 und T für Thymidin.
Homologe Genabschnitte von Neisseria Meningitis mit einer Länge von 300bp wurden per PCR amplifiziert. Derjenige Primer, der um die zu den Sonden-Sequenzen 6 komplementäre Sequenz verlängert wurde, trägt 5'- endig einen Biotinlabel 12. Die PCR Produkte wurden nach Amplifikation an Säulen z.B. von QIAquick (von QIAGEN) gereinigt.
Mit einem kommerziell erhältlichen Klebstreifen (von Biozym) wurde der Array ein- gerahmt.
Das zu untersuchende PCR Produkt 9 wurde nach der Reinigung vermessen und ein Aliquot von 10 ng 30 min bei Raumtemperatur in Bindepuffer (5mM Tris-HCI pH 7.5; 0.5mM EDTA, 1M NaCI) auf dem Chip inkubiert. Die Denaturierung erfolgte durch Spülen mit 1 ml Denaturierungslösung (0.1 M Na- OH). Anschließend wurde mit dem gleichen Volumen Bindepuffer gewaschen. Es wurden dann 25 μl PCR Reaktionsansatz zugegeben (200μM dGTP, dATP, dCTP, cy3-dUTP, 1x PCR Reaktionspuffer, 1 U Red Taq Polymerase, von Sigma)
Der Reaktionsansatz wurde mit einer Folie (von Biozym) versiegelt und anschließend in einem kommerziellen Thermocycler für in situ PCR (von Biozym) folgendem Thermoprofil unterworfen:
Zuerst wurde der Reaktionsansatz für 30 Sekunden auf 94°C erhitzt. Danach wurde 30 Sekunden auf 30°C gekühlt und hieran anschließend auf 50 C° für 1 Minute erhitzt. Dieser Vorgang wurde dreißig Mal wiederholt. Anschließend wurde auf 4°C abgekühlt.
Nach diesem Prozess wurden Klebestreifen und Folie entfernt und der Objektträger mit Bindepuffer gewaschen, anschließend zum Trocknen zentrifugiert.
Die Auswertung der Signale erfolgt mittels eines kommerziell erhältlichen Laser Scanners (z.B. von MWG BIOTECH AG).
Der oben erläuterte Prototyp eines DNA-Chips mit 100 verschiedenen Hexamersequenzen, wird nachfolgend anhand der Figuren 1 , 2 und 3 näher erläutert. Zu Testzwecken sind jedoch jeweils zwei benachbarte Sondenpunkte mit der gleichen Sonde ausgebildet, weshalb der vorliegende DNA-Chip 300 Sondenpunkte um- fasst. Ein solcher Sondenpunkt 2 besitzt einen Durchmesser von ca. 200 Mikro- metern.
Bei den mit dem Prototypen ausgeführten Untersuchungen ist die in Figur 3 gezeigte Gensequenz pgm-14 als Probe auf den DNA-Chip aufgetragen worden.
Der mit der Probe versehene DNA-Chip ist mit dem oben beschriebenen PCR- Verfahren (ein PCR Reaktionsansatz: Polymerase, dGTP, dATP, dCTP und cy3- dUTP; 94°C - 30 s, 30°C - 30 s und 50°C - 1 Minute, 30 Zyklen) aufbereitet worden, wobei der Farbstoff cy3 zur späteren Detektion eingebaut worden ist. Der derart aufbereitete DNA-Chip wurde mit einem Laser-Scanner abgetastet. Ein Ausschnitt des abgetasteten Bildes des DNA-Chips ist in Fig. 1 gezeigt.
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Helle Bereiche stellen dabei stark fluoreszierende Sondenpunkte 2, graue Bereiche schwach fluoreszierende Sondenpunkte 2 und dunkle Bereiche nicht oder kaum fluoreszierende Sondenpunkte 2 sowie den Bereich außerhalb der Sondenpunkte 2 dar. Die Sondenpunkte 2 sind in Form eines Rasters angeordnet, das durch waagerechte Reihen und senkrechte Spalten aufgespannt wird. Die auf dem Chip angeordneten Sondenpunkte 2 mit identischen Sonden sind jeweils in einer Spalte be- nachbart. Somit bilden zwei Sondenpunkte 2, die in derselben Spalte untereinander angeordet sind, und von denen sich der obere in einer ungeraden und der untere in einer geraden Reihe befindet eine Einheit (Fig.1), da diese beiden Sondenpunkte 2 jeweils die gleiche Sonde 8 beinhalten. ,
In der Tabelle (Fig. 2) sind die zu den Sonden-Sequenzen 6 der Sondenpunkte 2 komplementären, detektierbaren Nukleotid-Sequenzen (Sequence), die Reihe (Row) und Spalte (Column), die mittels Fluoreszenzspektrommetrie ermittelte Lichtintensität des jeweiligen Sondenpunktes 2 (S#1 Mean) und die Anzahl der dabei gemessenen Pixel (S#1 Area) eingetragen. Die Pixelgröße des Scanners betrug 20x20 Mikrometer, es sind jedoch auch andere Pixelgrößen (z. B. 10x10 Mikrometer) gebräuchlich.
Im folgenden werden die einzelnen Sondenpunkte 2 mit Sr/s bezeichnet, wobei r für Reihe, und s für Spalte stehen, und diese jeden Sondenpunkt 2 (S) eindeutig zuordnen.
S1/1 und S2/1 enthalten beide die gleiche Sonde 8, deren Sonden-Sequenz 6 zur gesuchten Sequenz TTCGCG komplementär ist. Es wurden Lichtintensitäten von 4271.02 Einheiten für S1/1 und 3582.22 Einheiten für S2/1 ermittelt, also jeweils in der Größenordnung von 103 Einheiten. Pro Pixel waren dies Intensäten von 56.95 (S1/1) bzw. 48.42 (S2/1) Einheiten.
Auf S3/1 und S4/1 , die die zu dem Hexamer TTCGCC komplementäre Sonde enthalten, ergaben Lichtintensitäten von 839.09 (S3/1) und 983.77 (S4/1) Einheiten. Das ist eine Zehnerpotenz niedriger als im vorgenannten Detektionsbeispiel. Bezo- gen auf die Anzahl der Pixel betragen die Werte 10.48 (S3/1) und 18.22 (S4/2) Einheiten, also deutlich weniger als die Hälfte im Vergleich zu S1/1 (56.95, s.o.) und S2/1 (48.42, s.o.).
Die Erfindung ist oben anhand eines Ausführungsbeispiels näher erläutert worden. Die Erfindung ist jedoch nicht auf dieses konkrete Ausführungsbeispiel beschränkt. Im Rahmen der Erfindung ist es z. B. möglich, anstelle einer fluoreszierenden Markierung eine radioaktive Markierung oder eine MALDI-TOF-Analyse zur Selektion der Elongationen der Sonden zu verwenden. Weiterhin können anstelle der Strep- tavidin-Biotin-Kopplung andere kovalente Kopplungen verwendet werden. Das in obigem Ausführungsbeispiel verwendete Trägermaterial ist ein Glasplättchen. Im Rahmen der Erfindung ist es selbstverständlich auch möglich, andere Trägermaterialien wie z. B. Keramikplättchen oder dergleichen zu verwenden. Im Rahmen der Erfindung kann es z. B. auch zweckmäßig sein, nicht alle Permutationen einer Wobbel-Sequenz an einem Sondenpunkt vorzusehen, insbesondere wenn gewisse Sequenzen im Probenmaterial bevorzugt auftreten.
Die vorliegende Erfindung umfasst selbstverständlich auch einen Polymer-Typ, der einen Träger aufweist, der beispielsweise auf zwei, drei oder vier Trägerplättchen ausgebildet ist. Die entsprechenden Sondenpunkte sind dann auf die einzelnen Trägerplättchen verteilt angeordnet.

Claims

Patentansprüche
1. Polymer-Chip enthaltend eine Vielzahl von Sonden, wobei unterschiedliche Sonden jeweils an einem anderen Sondenpunkt auf einem Träger angeordnet sind und jede Sonde eine Oligomer-Sequenz aufweist und die Oligomer-
Sequenz aus einer bekannten Anzahl Monomeren zusammengesetzt ist, dadurch gekennzeichnet, dass an jedem Sondenpunkt mehrere Oligomer-Sequenzen angeordnet sind, die jeweils aus einer Sonden-Sequenz und einer Wobbel-Sequenz zusammen- gesetzt sind, wobei die Sonden-Sequenzen eines Sondenpunktes identisch zueinander sind und die Sonde darstellen und die Wobbel-Sequenzen eines Sondenpunktes jeweils Permutationen der Monomere aufweist.
2. Polymer-Chip nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Wobbel-Sequenzen eines jeden Sondenpunktes jeweils die gleiche Anzahl Monomere aufweisen und alle Permutationen der Monomere umfassen.
3. Polymer-Chip nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonden alle Permutationen der Sonden-Sequenz umfassen.
4. Polymer-Chip nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligomer-Sequenzen die folgende Struktur aufweisen:
- (N)m - (X)n
worin X eine der vier Basen G, A, T oder C in der Sonden-Sequenz und
N eine der vier Basen G, A, T oder C in der Wobbel-Sequenz ist, n eine ganze Zahl im Bereich von 4 bis 10 und m eine ganze Zahl, die größer als 3 ist, bedeuten.
5. Polymer-Chip nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligomer-Sequenz folgende Struktur hat:
-sp-(N)m-(X)n ,
wobei sp ein Spacer ist.
6. Polymer-Chip nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Spacer sp folgende Struktur aufweist:
Figure imgf000020_0001
7. Polymer-Chip, insbesondere nach einem der Ansprüche 1 bis 6, enthaltend eine Vielzahl von Sonden, wobei unterschiedliche Sonden jeweils an einem anderen Sondenpunkt auf einem Träger angeordnet sind und jede Sonde eine Oligomer-Sequenz aufweist und die Oligomer-Sequenz aus einer bekannten Anzahl Monomeren zusammengesetzt ist, dadurch gekennzeichnet, dass jeder Sondenpunkt zumindest ein Bindungselement zum Immobilisieren von Probenmaterial enthält.
8. Polymer-Chip nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Bindungselemente jeweils durch ein Streptavidinmolekül dargestellt sind.
9. Verfahren zur Detektion von Nukleinsäurematerial unter Verwendung eines Polymer-Chips, insbesondere nach einem der Ansprüche 1-7, umfassend folgende Schritte:
Aufbringen des Nukleinsäurematerials auf den als Oligonukleotid-Chip ausgebildeten Polymer-Chip, Hybridisieren des Nukleinsäurematerials mit Sonden des Oligonukleotid-Chips, Durchführen eines PCR-Verfahrens, wobei die Sonde durch dNTP und modifizierte dNTP, wobei die modifizierten dNTP Marker beinhalten, verlängert wird, und Detektion der Marker.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die dNTP durch zumindest eines der Gruppe aus dATP, dGTP, dTTP, dCTP, dUTP und dITP dargestellt sind.
11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Marker ein Fluoreszenzmarker ist.
12. Verfahren nach Anspruch 9 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, dass der Fluoreszenzmarker cy3 ist.
13. Verfahren nach Anspruch 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleinsäurematerial mit einem Bindungselement ausgestattet ist, das eine Immobilisierung des Nukleinsäurematerials in den Sondenpunkten eines nach Anspruch 7 oder 8 ausgebildeten Polymer-Chips ermöglicht.
14. Verfahren nach Anspruch 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Bindungselement am Nukleinsäurematerial Biotin ist.
15. Verfahren nach Anspruch 9 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektion der Marker durch Ermittlung der Fluoreszenz mittels eines Scanners erfolgt.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1593425A1 (de) * 2004-05-04 2005-11-09 Eppendorf Array Technologies SA Verfahren zur Herstellung und Anwendung von Mikroarrays zum hochempfindlichen Nachweis von mehreren Polynukleotidsequenzen

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002090516A2 (en) * 2001-05-07 2002-11-14 Amersham Biosciences Corp Design of artificial genes for use as controls in gene expression analysis systems

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5795714A (en) * 1992-11-06 1998-08-18 Trustees Of Boston University Method for replicating an array of nucleic acid probes
US5605798A (en) * 1993-01-07 1997-02-25 Sequenom, Inc. DNA diagnostic based on mass spectrometry
US6027880A (en) * 1995-08-02 2000-02-22 Affymetrix, Inc. Arrays of nucleic acid probes and methods of using the same for detecting cystic fibrosis
US6060288A (en) * 1994-08-03 2000-05-09 Mosaic Technologies Method for performing amplification of nucleic acid on supports
GB9620749D0 (en) * 1996-10-04 1996-11-20 Brax Genomics Ltd Identifying antisense oligonucleotides
DE69839734D1 (de) * 1997-12-22 2008-08-28 Hitachi Chemical Co Ltd Direkte rt-pcr auf mikrotiterplatten mit immobilisierten oligonukleotid

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1593425A1 (de) * 2004-05-04 2005-11-09 Eppendorf Array Technologies SA Verfahren zur Herstellung und Anwendung von Mikroarrays zum hochempfindlichen Nachweis von mehreren Polynukleotidsequenzen

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