WO2002004509A2 - Genexpression, genomalteration und reporterexpression in myofibroblasten und myofibroblast-ähnlichen zellen - Google Patents

Genexpression, genomalteration und reporterexpression in myofibroblasten und myofibroblast-ähnlichen zellen Download PDF

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Definitions

  • the invention relates to specific regulatory sequence regions of alpha smooth muscle actin gene ( ⁇ -SMA) gene, fusion constructs, where such regulatory sequence regions of the ⁇ -SMA gene are "operatively linked to another functional nucleic acid sequences, as well as the use of such regulatory sequence regions for cell type and differentiation-specific reporter expression (especially in myofibroblasts and myofibroblast-like cells), for cell type and differentiation-specific gene changes (alteration, mutation) and for gene expression changes in cells and organisms.
  • ⁇ -SMA alpha smooth muscle actin gene
  • the present invention relates to fusion constructs in which the specific sequence region mentioned, which essentially consists of sequences which are located in the 5 ' -terminal region of the ⁇ -SMA gene, with a further functional nucleic acid sequence, preferably with peptide- or protein-coding Nucleic acid sequences, regulatory DNA sequences or functional RNA coding sequences is operatively linked; a method in which the above-mentioned fusion constructs are surgically inserted into a vector and the vector construct is introduced into eukaryotic cells; a method in which the cells which are transiently or stably transfected or transformed with the vector construct express a reporter under the control of the regulatory sequences of the ⁇ -SMA gene mentioned and the reporter expression for isolation or for screening embryonic or transient ⁇ -SMA- positive cells, in particular myofibroblasts or myofibroblast-like cells from a cell mixture, a cell population, a cell aggregate or an organism are used; as well as a Method in which the fusion constructs in which
  • the ⁇ -SMA gene is a member of the actin multigen family that encodes various isoforms of the cytoskeletal actins.
  • the expression of the different actins is highly regulated depending on the cell type and differentiation.
  • the adult skeletal ⁇ -actin is expressed in the skeletal muscles, the cardial ⁇ -actin in the heart muscles and the ⁇ -SMA in the smooth muscles.
  • the transcriptional regulation of the ⁇ -SMA gene is mediated by an interaction of positive and negative regulatory elements of the 5 'region (Blank, RS et al., J. Biol. Chem. 267: 984-989 (1992); Carrol , SL et al., 3. Biol. Chem.
  • the 5 'region of the ⁇ -SMA gene contains various conserved c / s elements such as two CArG elements (CArG-A and B) (Carrol, S. L et al., Mol. Cell. Biol. 8 : 241-250 (1988) and Blank, RS et al., J. Biol. Chem. 267: 984-989 (1992)).
  • CArG motifs consist of an A / T repeat flanked by CC / GG and are discussed as key elements of muscle-specific gene regulation (Chow, K. L, Schwartz, RJ, Mol. Cell. Biol., 10, 528 - 538 (1990) and Sobuc, K. et al., Mol. Cell. Biochem. 190: 105-118 (1999)). Reporter studies on male reporter mice showed that a further CArG box (0) in the first intron of the ⁇ -SMA gene is necessary for in vivo expression of ⁇ -SMA in smooth muscle cells (Mack, CP, Owens, GK, Circ. Res ., 84: 852-861 (1999)).
  • the 5 ' region of the ⁇ -SMA gene also contains two E-Box consensus sequences (CA NN TG), potential binding sites for basic helix-loop-helix transcription factors (Johnson, AD, Owens, GK, Am. J. Physiol., 276, C1420-C1431 (1999)) and other consensus sequences (Hautmann, MB et al., J. Biol. Chem., 272: 10948-10956 (1997) and McNamara, CA et al., Am. J. Physiol ., 268: C1259-C1266 (1995)), the meaning of which has not been clarified in detail.
  • the ⁇ -SMA gene is expressed cell-specific in smooth muscle cells (SMC) (Vanderkerckhove J. and Weber K., Differentiation 14: 123-133 (1979) Skalli, O. et al., J. Cell. Biol., 103: 2787-2796 (1986) and idem, 3. Histochem. Cytochem., 37: 315-321 (1989)).
  • SMC smooth muscle cells
  • WO 00/24254 discloses a method in which the regulatory sequences of the 5 ' region and the first intron of the ⁇ -SMA are used for the expression of heterologous genes in SMC.
  • WO 00/24254 discloses a general sequence of the ⁇ -SMA gene (SEQ. ID. NO: 1: from -2558 bp to + 2784 bp of the rat ⁇ -SMA gene, ie the -2558 bp 5 region and the range +1 to +2784 bp of the first exon and the first intron) and the sequence ranges of the first intron (+ 773 to +1098; see SEQ ID NO: 2), which is necessary for in vivo expression in SMC.
  • SEQ. ID. NO: 1 from -2558 bp to + 2784 bp of the rat ⁇ -SMA gene, ie the -2558 bp 5 region and the range +1 to +2784 bp of the first exon and the first intron
  • the ⁇ -SMA gene In addition to cell-specific expression in SMC, the ⁇ -SMA gene also becomes transient in embryogenesis during the differentiation of skeletal and cardiac muscle cells (Ruzicka, DL et al., J. Ceil Biol., 107: 25775-25786 (1988 ); Woodcock-Mitchell, J., Mitchell, JJ, Differentiation 39: 161-166 (1988)), but also in myofibroblasts during the Wound healing as well as after myofibroblastic changes of different cell types in scarring and tissue restructuring processes after chronic organ damage are expressed (Desmouliere A. et al., Exp. Nephrol. 3: 134-139 (1995); Gabbiani G., Cardiovasc. Res. 38: 545-548 (1998); idem, Pathol. Res. Pract. 190: 851-853 (1994); idem, Am. J. Pathol. 83: 457-474 (1976)).
  • Myofibroblasts are cell types of mesodermal origin, which are characterized by a pronounced matrix production, a heterogeneous intermediate filament pattern with desmin or vimentin and which have the ability to contractility due to the ⁇ -SMA expression (Desmouliere, A. et al., Exp. Nephrol 3: 134-139 (1995); Gabbiani, G., Cardiovasc. Res. 38: 545-548 (1998); idem, Pathol. Res. Pract. 190: 851-853 (1994); idem, Am. J Pathol. 83: 457-474 (1976)). They occur temporarily during wound healing, while persistent myofibroblasts are involved in connective tissue and organ restructuring in chronic scarring processes.
  • myofbroblasts are the main matrix producers (Friedman, S. L, New. Engl. J. Med. 328: 1828-35 (1993); Gressner , AM, Kidney Int. 49: 39-45 (1996); MacPherson, BR et al., Hum. Pathol., 24: 710-716 (1993); Alpers, CE et al., Kidney Int. 41: 1134- 1142 (1992); Thiele J. et al., J. Submicrosc. Cytol. Pathol.
  • myofibroblasts have also been referred to as modulated fibroblasts; however, their progenitor cell types are very different depending on the organ type. Chronic kidney damage leads to transdifferentiation from mesangial cells to myofibroblastic cells (Johnson RJ et al., J. Clin. Invest. 87: 847-858 (1991); MacPherson BR et al., Hum. Pathol. 24: 710-716 (1993 )).
  • liver fibrosis in which hepatic stellate cells (HSC) transdifferentiate to myofibroblasts (Friedman SL, New. Engl. J. Med. 328; 1828-35 (1993); Gressner AM, Kidney Int. 49: 39-45 (1996); Ramadori G. et al., Virch. Arch. [B] 59: 349-357 (1990)).
  • HSC hepatic stellate cells
  • Hepatic star cells have pericytic properties and store 80% of the body's own vitamin A when at rest (Friedman SL, New. Engl. J. Med.
  • myofibroblastic transdifferentiation which is characterized not only by matrix production and the ⁇ -SMA expression mediated contractility, but also by proliferation, vitamin A loss and a changed growth factor profile, they are significantly involved in the maintenance and progression of liver fibrosis (Friedman, SL, New. Engl. J. Med. 328: 1828-35 (1993); Gressner, AM, Kidney Int. 49: 39-45 (1996)).
  • Myofibroblasts are the main matrix producers in bronchial asthma and fibrotic lung diseases (Tremblay, GM et al., Can. Respir. J. 5 (1): 59-61 (1998); Gizycki, MJ et al., Am.
  • Myofibroblasts with the typical properties of induced extracellular matrix production and contractility also occur in the transition from in situ carcinomas to invasive carcinomas (Cintorino, M. et al., Int. J. .. Cancer 47: 832-836 (1984); Gabbiani, G et al., Am. J. Pathol. 83: 457-474 (1976)).
  • the stromal cells are myofibroblasts (Terada, T. et al., J. Hepatol.
  • tumor cells themselves can also consist of myofibroblastic derivatives, such as myofibroblastomas and myofibrosarcomas from various organs (Gocht, A. et al., Pathol. Res Pract. 195 (1): 1-10 (1999); Unden, AB et al., J. Invest. Dermatol. 107 (2): 147-53 (1996); Auger, M. et al., Arch. Pathol. Lab. Med. 113 (11): 1231-5 (1989)).
  • myofibroblastic derivatives such as myofibroblastomas and myofibrosarcomas from various organs (Gocht, A. et al., Pathol. Res Pract. 195 (1): 1-10 (1999); Unden, AB et al., J. Invest. Dermatol. 107 (2): 147-53 (1996); Auger, M. et al., Arch. Pathol. Lab. Med. 113 (11): 1231-5 (1989)).
  • myofibroblasts are the central cell types in many sclerosing diseases and some tumor diseases, they are ideal target cells of therapy, including gene therapy.
  • a cell type-specific, differentiation-dependent control of the expression (a) of genes coding for e.g. intracellular signal mediators (Walther, W., Stein, U., Mol. Biotechnol. 13 (1): 21 - 28 (1999)) or (b) RNA-coding sequence regions that influence the transcription or translation of certain genes by attachment ( Bai, J. et al., Mol. Ther. 1 (3): 244-254 (2000)) or
  • c an enzyme for a cyclic recombination (CRE) that changes floxP-flanked gene regions (Sauer, B. Methods 14: 381-392 (2998)), gene therapy of certain target cells is made possible.
  • Viral vesicles such as adenoviral or retroviral derivatives are often used as vectors (Miller, N. Whelan, J. Hum. Gene Ther. 8, 803-815; Mountain, A., Tibtech. 18: 119-128 (2000); Schiedner, G. et al., Nat. Genet. 18, 180-183 (1998); Parr, MJ, Nat. Med. 3, 1145-1149 (1997); Ory, DS et al., Proc. Natl.
  • DNA of a plasmid construct can also be administered bare or in aggregates with liposomes or polymer bodies (Hengge, U. et al., Nat Genet. 10: 161-166 (1995); Gottschalk, S. et al., Gene Ther. 3 : 3410-3414 (1990); Wagner, E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 3410-3414 (1990)).
  • suitable regulatory sequences or a promoter are necessary which / or the corresponding cell function interventions and Conducting changes in expression in myofibroblasts may be a prerequisite, but has not yet been met. It is only through the use of regulatory sequences within a promoter that appropriately direct the cell function properties (a) through a changed gene expression, (b) through an effect on protein synthesis or (c) through genomalteration of myofibroblasts, can myofibroblastic cells be addressed by gene therapy ,
  • ⁇ -SMA-5 'sequence region the regulating sequence region of the ⁇ -SMA gene
  • individual regions herein namely within -698 to +18 of the ⁇ -SMA- 5 'sequence region (numbering, unless otherwise stated, based on the ⁇ -SMA gene from rattus norvegicus shown in FIG. 7A) have activities which differ from the activity of the overall region.
  • the region -189 to + 18 of the ⁇ -SMA gene is transcription-activating, whereas the region -698 to -190 has cell-type-specific and differentiation-dependent regulatory properties, i. H.
  • a system for myofibroblastic control was developed based on the finding that gene expression and / or cell function in myofibroblasts, myofibroblast-like cells or also embryonic, transient or induced cells can control SMA-expressing cells.
  • the present invention accordingly relates
  • the regulating sequence region originating from the rat and the nucleic acid sequence preferably one or more functional regions from the sequence shown in FIG. 5A (SEQ ID NO: 1), in particular from the 7A (SEQ ID NO: 5);
  • nucleic acid sequence defined in (2) the functional region being a transcription-activating nucleic acid sequence and in particular from the sequence -189 to +18 of FIG. 7A (ie from the sequence of FIG. 7C; SEQ ID NO: 7) comes;
  • nucleic acid sequence defined in (2) the functional region being a cell type-specific nucleic acid sequence and in particular from the sequence -698 to -190, particularly preferably from the sequence -698 to -215, FIG. 7A originates;
  • nucleic acid sequence defined in (1) the regulating sequence region originating from the mouse and the nucleic acid sequence preferably one or more functional regions of the sequence shown in FIG. 5B (SEQ ID NO: 2), in particular from the sequence shown in SEQ ID NO: 18;
  • (a) is a transcription-activating nucleic acid sequence and in particular originates from nucleotides 490 to 697 of the sequence shown in SEQ ID NO: 18 and / or
  • (b) is a cell type-specific nucleic acid sequence and in particular originates from nucleotides 1 to 489 of the sequence shown in SEQ ID NO: 18;
  • nucleic acid sequence defined in (1) the regulating sequence region originating from humans and the nucleic acid sequence preferably having one or more functional nelle areas of the sequence shown in FIG. 5C (SEQ ID NO: 3), in particular from the sequence shown in SEQ ID NO: 19;
  • nucleic acid sequence defined in (7) being a transcription activating nucleic acid sequence and in particular originating from nucleotides 513 to 715 of the sequence shown in SEQ ID NO: 19 and / or
  • (b) is a cell type-specific nucleic acid sequence and in particular comes from nucleotides 1 to 512 of the sequence shown in SEQ ID NO: 19;
  • nucleic acid sequence defined in (1) the regulating sequence region originating from the chicken and the nucleic acid sequence preferably having one or more functional regions of the sequence shown in FIG. 5D, in particular from the sequence shown in SEQ ID NO: 20;
  • (a) is a transcription-activating nucleic acid sequence and in particular originates from nucleotides 497 to 699 of the sequence shown in SEQ ID NO: 20 and / or
  • (b) is a cell type-specific nucleic acid sequence and in particular derives from nucleotides 1 to 496 of the sequence shown in SEQ ID NO: 20;
  • (13) as defined a vector containing a nucleic acid sequence in (11) and / or (12); (14) a vector in which a nucleic acid sequence as defined in (1) to (10) is inserted;
  • eukaryotic cells or organisms which have a nucleic acid sequence as defined in (1) to (10) or a vector as in (13) or (14) defined, transiently or stably transfected, transformed or infected;
  • (16) a method for producing the eukaryotic cells as defined in (15), comprising transfecting, transforming or infecting starting cells with the nucleic acid sequences as defined in (1) to (10) or with vectors as in (13) or (14) defined;
  • the invention is explained in more detail below with reference to the attached figures and examples.
  • FIG. 1 Description of the figures: Measurement of the luciferase reporter activity in resting and myofibroblastically activated hepatic star cells (HSC) under the control of the PRL-700 reporter construct.
  • HSC hepatic star cells
  • Fig. 2a Immunocytology after single cell dissociation of differentiated EB and cultivation of the cells detached from the dressing.
  • ⁇ -SMA-negative cells IC
  • GFP expression 1B
  • pSMA-GFP-700 transfected cells GFP expression (2B) was limited to ⁇ -SMA expressing cells (2C).
  • Fiq 2b Construction of the SMA-GFP-700 or SMA-GFP-190 reporter vector for stable transfections into embryonic stem cells or transgenic reporter mouse models.
  • the constructs is between the GFP reporter (EGFP variant) and the 716bp (SEQ ID NO: 5) and 207bp (SEQ ID NO: 7) from the 5 'region of the ⁇ -SMA gene as a heterologous regulatory sequence cloned the first intron of the chicken ß-actin.
  • the construct has a further resistance to neomycin for the selection of stable transfectants, which allows a G418 selection in eukaryotic cells.
  • FIG. 3a Luciferase reporter activities of SMA constructs of different lengths (SMA-125 to SMA-700; compare also FIG. 7) which were determined after transient transfection in embryonic myotubes and myoblasts of the cell line L6.
  • L6 cells that differentiate into ⁇ -SMA-expressing myotubes after serum withdrawal showed a 4 to 5-fold induction of all constructs compared to the precursor L6 myoblasts.
  • the SMA-190 construct has a strong transactivating influence.
  • the SMA-700 construct conducts a differentiation-dependent reporter ex- pressure.
  • the activities of the SMA constructs were related to the activity of the SV40 promoter (100%). The experiments were carried out in three independent experiments with double approaches.
  • Figure 3b Plasmid construct for expressing a peptide or polypeptide of interest under control of the 716 bp-5 'sequence (SEQ ID NO: 5) of the ⁇ -SMA gene.
  • one or more recognition sequences can be built into the consensus of the reading frame (ORF), such as the coding sequence for streptavidin (SEQ ID NO: 34) and / or an epitope recognized by an antibody (9E10) such as myc ( SEQ ID: 35), and / or for purification also contain a sequence coding for five histidines (SEQ ID NO: 36).
  • ORF the reading frame
  • SEQ ID NO: 34 the coding sequence for streptavidin
  • 9E10 an antibody
  • myc SEQ ID: 35
  • SEQ ID NO: 36 an antibody
  • Both the sequence of the peptide of interest and the associated TAG sequences are subject to the cell type-specific and differentiation-dependent control of the regulatory sequence region of the ⁇ -SMA gene.
  • Figure 4 LoxP-mediated Cre recombination under control of the ⁇ -SMA-5 'gene region: a. : Due to the transcriptional control of the Cre gene (SEQ ID NO: 32) by the 5 ' region of the ⁇ -SMA-5' sequence region (SEQ ID NO: 5) in combination with the first intron of the ⁇ -actin (SEQ ID NO: 31) after myofibroblastic differentiation, the Cre gene is expressed in myofibroblasts (1), the Cre-mediated excision of the loxP-flanked neomycin gene (neo) (2) and the subsequent expression of the gene of interest (3 ). b.
  • nS means: nuclear signal peptide sequence
  • hatched area intron sequence
  • LP left peptide sequence
  • ER TM Sequence for altered estrogen receptor with high affinity for the synthetic ligand, 4-hydroxytamoxifene (4-OHT), but which does not bind endogenously produced 17ß-estradiol
  • ⁇ -A ⁇ -actin intron (SEQ ID NO: 31); and 4-OHT: 4-hydroxytamoxifene
  • Fiq 5 5 'upstream region and beginning exonl of the ⁇ -SMA in different species (region -713 to +52, numbering related to sequence A)
  • Rat Rat (Rattus norvegicus; SEQ ID NO: 1; Acc. No S76011; Blank, R.S. et al., J. Biol. Chem. 267 (2): 984-989 (1992)).
  • FIG. 6 Alignment of the sequences shown in Fig. 5.
  • Figure 7 shows the preferred ⁇ originating from rat (Rattus norvegicus)
  • G 5 ' gene region of the ⁇ -SMA gene: -521 to +18 (11)
  • H 5 ' gene region of the ⁇ -SMA gene: -189 to -125 (12)
  • Figure 8A ⁇ -1 globin gene from Oryctoiagus cuniculus; Intron II / exon III transition; Acc.No: V00882: Sequence 1250-1343 (SEQ ID NO: 30)
  • Fiq. 8C Sketch of a floxP site: The FloxP sequence (see also SEQ ID NO: 33) consists of 13 bp inverted repeats (horizontal arrows) flanking an 8 bp asymmetrical core region, which is located at two locations (vertical arrows) is cut by cre.
  • the present invention is based on the surprising finding that specific regulatory sequences of the .alpha.-SMA gene, in particular those which one or more of the in Fig. A to M of Fig. 7 (SEQ ID NOs: 5 to 17) shown sequences contain the gene expression of the operatively linked functional nucleic acid sequence so z.
  • the nucleic acid sequence of embodiment (1) of the invention contains one or more functional regions from the regulating sequence region of the ⁇ -SMA gene.
  • This regulating sequence region can originate from mammals, in particular from primates or rodents or birds and particularly preferably from rats, mice, humans or chickens (Blank, RS et al., J. Biol. Chem. 267 (2): 984-989 ( 1992); Min, BH et al., J. Biol. Chem. 265: 16667-16675 (1990); Reddy, S. et al., J. Biol. Chem. 265 (3): 1683-1687 (1990) ; Carroll, SL et al., J. Biol. Chem. 261 (19): 8965-8976 (1986)).
  • the regulatory sequence region comes from the rat (Blank, RS et al., J. Biol. Chem. 267: 984-989 (1992)). It is particularly preferred that the functional region has a transcription-activating nucleic acid sequence and particularly preferably comes from the sequence shown in FIG. 7C. In particular, those transcription-activating sequences are preferred which have at least 10, preferably at least 40 and particularly preferably at least 60 consecutive bases from the sequence shown in FIG. 7C and particularly preferably the sequences shown in FIG. 7B or 7C (SEQ ID NOs: 6 or 7) include.
  • the functional region can be a nucleic acid sequence regulating cell type-specific or differentiation-dependent, preferably one which consists of the sequence -698 to -190 of FIG. 7A (nucleotides 1 to 509 of SEQ ID NO: 5), particularly preferably the sequence -698 to -215 of Fig. 7A.
  • Preferred cell type-specific sequences are those which have at least 25, preferably at least 35, consecutive bases from the sequence -698 to -190 of FIG. 7A and particularly preferably comprise the sequences shown in FIG. 71 or 7M.
  • the regulatory sequence region alternatively comes from the mouse, human or chicken (Min, BH et al., J. Biol. Chem. 265: 16667-16675 (1990); Reddy, S. et al., J. Biol. Chem. 265 (3): 1683-1687 (1990); Carroll, SL et al., J. Biol. Chem. 261 (19): 8965-8976 (1986) ), the functional ranges being defined above under (5) to (10).
  • the transcription-activating nucleic acid sequence has at least 10, preferably at least 40 and particularly preferably at least 60 consecutive bases from the transcription-activating sequence defined under (6), (8) or (10) or has at least 25, preferably at least 35, consecutive bases from the cell type-specific sequence defined above under (6), (8) or (10).
  • those partial sequences from sequences shown in SEQ ID NOs: 18, 19 and 20 are preferred which correspond to sequences 7A-7M of the sequence from rat (according to the alignment in FIG. 6).
  • the further functional nucleic acid sequence according to embodiment (1) of the invention can be a peptide or protein coding DNA sequence (including but not limited to reporter genes, sequences that code for pharmacologically active proteins and regulatory DNA sequences) or a functional RNA coding sequence (including but not limited to a ribozyme).
  • Suitable reporter genes for myofibroblastic control are e.g. B. the genes listed in Table 1 below.
  • Other functional genes within the meaning of the present invention are e.g. B. genes coding for pharmacologically active proteins or peptides, and regulatory DNA and RNA sequences.
  • Tab. 1 Examples of possible reporters whose expression can be controlled by the ⁇ -SMA 5 'sequence
  • AEC 3-amino-9-ethylcarbazole
  • the vector according to embodiment (13) comprises conventional transfection vectors and vectors suitable for gene transfer.
  • the eukaryotic cells or organisms according to embodiment (15) of the present invention can be obtained by transfection, transformation or infection methods of starting cells or infection of ES cells in blastocysts of the organisms and insertion into the surrogate mother well known to the person skilled in the art.
  • the determination of the myofibroblastic transition on cells which contain the vector with the ⁇ -SMA-5-sequence reporter fusion construct also offers the possibility of carrying out therapeutic drug screening; a reduction in myofibroblastic activation, e.g. induced by a toxin or fibrogenic growth factor such as Transforming growth factor beta (TGF ß), can be read using the ⁇ -SMA-5 'sequence controlled reporter.
  • TGF ß Transforming growth factor beta
  • the method according to the invention in which ⁇ -SMA-5 'sequence regions (-698 to +18) are used for reporter control, comprises, in addition to the sighting of the myofibroblastic activation, the isolation of certain cells on the basis of the ⁇ -SMA-5 ' -controlled reporter expression ,
  • this is preferably carried out by operatively linking ⁇ -SMA-5 'sequence regions with a fluorescent reporter (for example GFP see Table 1), so that after the vector construct has been introduced into an organism or a cell population, the isolation of transient embryonic SMA-positive cells or myofibroblastically induced cells from a cell mixture or bandage due to the fluorescence can be carried out using a FACS device (FACS: Fluorescence activated cell sorting).
  • FACS Fluorescence activated cell sorting
  • the linking of the ⁇ -SMA-5 ' sequence region with other reporters allows the isolation of myofibroblasts and areas with myofibroblast-like cells by microdissection under light or fluorescence microscopic control.
  • the present invention also includes the role of sequence region -698 to +18 of the ⁇ -SMA gene for the specific gene expression in embryonic stem cells (ES), which can differentiate in embryoid bodies to embryonic cardiomyocytes, smooth muscle cells or skeletal muscle cells (Evans, MJ, Kaufmann, MH, Nature, 292, 154-156 (1981)).
  • ES embryonic stem cells
  • the invention also relates to the operative linkage of the ⁇ -SMA-5 'sequence region or partial regions of the sequences (Seq. A to M of FIG. 7) with other nucleic acid sequences which influence expression.
  • examples are intron sequences such as that of the ⁇ -globin (see FIG. 8a, SEQ ID NO: 30) or the chicken ⁇ -actin gene (see FIG. 8b, SEQ ID NO: 31), but also other enhancer sequences such as that of the viral CMV as in the vector from FIG. 3.
  • other expression-influencing sequences not mentioned here can also be operatively linked to the ⁇ -SMA-5 ' sequences or domains from those (Seq. A to M of FIG. 7) become.
  • sequence A of Figure 7 is used to control expression of the gene region of interest.
  • FIG. 1 or FIG. 3 shows the differentiation-dependent expression under transcriptional control of sequence A from FIG. 7: the transcriptional control by Sequence A prevents expression in myoblasts or dormant myofibroblastic precursors, while after myotube differentiation or after myofibroblastic transdifferentiation it leads to expression of the linked gene region.
  • sequence C from FIG. 1 shows the transcriptional control by Sequence A prevents expression in myoblasts or dormant myofibroblastic precursors, while after myotube differentiation or after myofibroblastic transdifferentiation it leads to expression of the linked gene region.
  • the phenotype of myofibroblastic cells can be functionally interfered with.
  • a vector that is suitable for gene therapy such as different generations of adenoviral, retroviral or lentiviral vectors and their descendants (Ory, DS et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 11400-11406 ( 1996); Feng, M. et al., Nat. Biotechnol.
  • transfected ES cells are injected into blastocysts of a host organism and used in the surrogate mother (V. Papaioannou, R. Johnson, Gene Targeting. A Practical Approach, ed. AL: Joyner, Oxford UK (1993); T. Doetschman, Transgenis Animal Technology, A Laboratory Handbook, Academic Press Inc. San Diego, USA (1994)). After back-crossing the born and grown-up transgenic chimera, homozygous animals are intoxicated and examined for their transgenic gene expression.
  • the constructs without vector backwheel can be introduced into the promotor by miocro-injection and lead to transgenic organisms (JW Gordon et al., Methods Enzymol.
  • Organisms according to embodiments (15) and (17) of the present invention include mammals including, but not limited to, primates, rodents, and ungulates (which, if human organisms are not protectable under the relevant national or regional patent requirements, are mammals) non-human mammals).
  • the eukaryotic cells according to embodiment (15) comprise all possible cells and cell lines from the above-mentioned mammals.
  • the "pharmaceuticals” according to embodiments (20) and (21) of the present invention (depending on the task, application, type of further functional nucleic acid sequence, etc., it can also be a diagnostic agent) - depending on the form of application -
  • the medicaments are suitable for manipulating the gene expression and / or the cell function of myofibroblates or myofibroblast-like cells, ie they are useful for the treatment and diagnosis of a variety of diseases (as set out in the "Background of the Invention" section) including fibrosis diseases due to chronic organ damage (such as hepatitis, glomerulonephritis, myelofibrosis or fibrosing lung diseases) and tumor diseases ,
  • PBluescript-SKII + (Clontech, Heidelberg) and pGEM3Z (Promega, Mannheim) served as general cloning vectors. Areas of the ⁇ -SMA promoter were then cloned into the promoterless Lucife rase vector pRL-null (Promega, Mannheim). In order to compare the activity of generated constructs, pRL-SV40 and pRL-CMV or also vectors from the pGL3 family (Promega, Heidelberg) from the pRL family were additionally used.
  • a 736 bp fragment from the 5 'promoter region of the ⁇ -SMA gene was first amplified and cloned from isolated rat DNA. For this purpose, a PCR amplification of the range from -708 to +28 was carried out from rat genomic DNA with the primers SMA-710F (Hindill) and SMA-30R (EcoRI), which contain the specified restriction sites in their sequence. After restriction, the fragment (-698 to +18) was inserted into pRL-null by ligation and the resulting vector pRL-SMA-700 was amplified for studies on eukaryotic cells in E. coli K12 strains (see also sequence from FIG. 7A).
  • Example 2 Sighting of the myofibroblastic differentiation by reporter expression under control of the 5 ' region of the ⁇ -SMA gene
  • A. Production of reporter vectors regulated by ⁇ -SMA-5 ' sequence regions Different 5 ' gene regions of the ⁇ -SMA were inserted in reporter vectors for the production of the ⁇ -SMA-5 gene region reporter constructs.
  • the amplificate (see above) of rat genomic DNA produced with the primers SMA-710-F and SMA-30-R was mixed with EcoRI and Cut HindI and cloned into pBSSK + (Stratagene) to produce pB-SMA-700.
  • the fragments SMA-480 (PstI), SMA-215 (PvuII) and SMA-125 (Swirl) were generated by using EcoRI and the specific restriction enzyme pB-SMA-700 were cut and were first cloned in pGEM (Promega) or pB-SK (Stratagene). The following plasmids were formed: pGEM-SMA-480, pGEM-SMA-215 and pB-SMA-125.
  • Transfections were carried out using the FuGENE TM 6 transfection reagent (Röche Molecular Biochemicals, Mannheim). 1.5 ⁇ g plasmid DNA was used per approach, which was composed of 1.2 ⁇ g pRL-700 and 0.3 ⁇ g pGL3 control plasmid, which corresponds to a DNA / reagent ratio of 1: 3. Resting hepatic star cells (HSC), which were isolated from the rat liver by enzymatic liver perfusion and density gradient centrifugation (Knock, DS, de Leeuw, AM, Exp. Cell.
  • HSC Resting hepatic star cells
  • Example 3 Reporter under control of an ⁇ -SMA 5 ' sequence in stably transfected organisms and cells
  • Construction of a reporter vector under control of the ⁇ -SMA From a modified GFP expression vector (pCAGGS) (Ikawa, M. et al ., Develop. Growth Differ.
  • the immunohistology of EB transfected with the pSMA-GFP-190 promoter fragment showed that GFP-positive cell areas did not always have ⁇ -SMA expression and not all of the ⁇ -SMA-positive cells expressed GFP.
  • GFP-positive cells could be assigned to actinin-expressing cardiac or skeletal muscle cell types. Caldesmon positive smooth muscle cells showed no GFP expression.
  • the pSMA-GFP-700 construct showed a specific GFP expression, the GFP expression could be found in cardiac and skeletal areas as well as in caldesmon-positive smooth muscle cells.
  • the sighted reporter pattern under control of sequence A in FIG. 5 of the ⁇ -SMA gene corresponds to that during embryogenesis in differentiated ES cells. Therefore, the SMA-700 fragment (SEQ ID NO: 5) is a functional control sequence for the embryonic and transient SMA-positive cells. Based on the reporter activity, cells could be isolated by trypsinization (FIG. 2.a) and examined separately.
  • A. Stable transfection of the construct shown in Fig. 2b / 3 in ES cells To produce stably transfected embryonic stem cells, the ⁇ -SMA transgene vectors were first linearized by a restriction process, the interface of which lies in the ampicillin gene, and then a purification dissolved in H 2 0 (1 ⁇ g / ⁇ l). Then an electroporation was carried out. For this purpose, 5 ⁇ 10 6 ES cells were taken up in 0.7 ml PBS, resuspended and transferred into a cuvette. 30 ⁇ g of linearized plasmid DNA in a volume of 100 ⁇ l were used per electroporation.
  • the ES cells were injected into blastocysts of a host mouse and inserted into the surrogate mother (V. Papaioannou, R. Johnson, in Gene Targeting. A Practical Approach, ed. AL: Joyner, Oxford UK (1993); T. Doetschman, Transgenis Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press Inc San Diego, USA (1994)). After back-crossing the born and grown-up transgenic chimera, homozygous animals were intoxicated and examined for their transgenic gene expression.
  • constructs without a vector backwheel can be introduced into the pronucleus by micro-injection and lead to transgenic mice (JW Gordon et al., Methods Enzymol. 101: 411-33 (1983); B. Hogan et al., Manipulating the mouse embryo. A laboratory manual, Gold Spring Harbor, NY (1994)).

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Abstract

Die Erfindung betrifft spezifische, regulatorische Sequenzbereiche des alpha Smooth Muscle Aktin-Gens (a-SMA-Gens), Fusionskonstrukte, in denen solche regulatorische Sequenzbereiche des a-SMA-Gens mit weiteren funktionellen Nukleinsäuresequenzen operativ verknüpft sind, sowie die Verwendung solcher regulatorischer Sequenzbereiche zur zelltyp- und differenzierungspezifischen Reporterexpression, zu zelltyp- und differenzierungsspezifischen Genveränderungen (Alteration, Mutation) und zu Genexpressionsveränderungen in Zellen und Organismen.

Description

Genexpression, Genomalteratϊon und Reporterexpression in Myofibroblasten und myofibroblast-ähnlichen Zellen
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft spezifische, regulatorische Sequenzbereiche des alpha Smooth Muscle Aktin-Gens (α-SMA-Gens), Fusionskonstrukte, in denen solche regulatorische Sequenzbereiche des α-SMA-Gens mit weiteren funktioneilen Nukleinsäuresequenzen operativ verknüpft" sind, sowie die Verwendung solcher regulatorischer Sequenzbereiche zur zelltyp- und differenzierungspezifischen Reporterexpression (insbesondere in Myofibroblasten und myofibroblast-ähnlichen Zellen), zu zelltyp- und differenzierungsspezifischen Genveränderungen (Alteration, Mutation) und zu Gen- expressionsveränderungen in Zellen und Organismen.
Im einzelnen betrifft die vorliegende Erfindung Fusionskonstrukte, in denen der genannte spezifische Sequenzbereich, der im wesentlichen aus Sequenzen besteht, die sich im 5 '-terminalen Bereich des α-SMA-Gens befinden, mit einer weiteren funktionellen Nukleinsäuresequenz, vorzugsweise mit peptid- oder proteinkodierenden Nukleinsäuresequenzen, regulatorischen DNA-Sequenzen oder funktionellen RNA-kodierenden Sequenzen operativ verknüpft ist; ein Verfahren, in dem die oben genannten Fusionskonstrukte in einen Vektor operativ inseriert werden und das Vek- torkonstrukt in eukaryontische Zellen eingebracht wird; ein Verfahren, in dem die mit dem Vektorkonstrukt transient oder stabil transfi zierten, transformierten oder infizierten Zellen, einen Reporter unter Kontrolle der genannten regulatorischen Sequenzen des α-SMA-Gens exprimieren und die Reporterexpression zur Isolierung oder zur Sichtung embryonal oder transient α-SMA-positiver Zellen, insbesondere von Myofibroblasten oder myofibroblastähnlichen Zellen aus einem Zellgemisch, einer Zellpopulation, einem Zellaggregat oder einem Organismus genutzt wird; sowie ein Verfahren, bei dem mittels der genannten Fusionskonstrukte (die regulatorische Sequenzen des α-SMA-Gens und peptid- oder proteinkodierende bzw. RNA-kodierende Sequenzen enthalten) die Genexpression bzw. die Zellfunktion von α-SMA-positiven Zellen, insbesondere Myofibroblasten und myofibroblastähnlichen Zellen in Organismen bzw. in Organen unter Nutzung transgener oder knock-out/-in-Technologie oder gentherapeutischer Fusionsvektorapplikation manipuliert werden.
Hintergrund der Erfindung Das α-SMA-Gen ist ein Mitglied der Aktin-Multigenfamilie, die für verschiedene Isoformen der zytoskeletalen Aktine kodiert. Die Expression der verschiedenen Aktine ist in hohem Grade zelltypspezifisch und differenzierungsabhängig reguliert. So wird adult das skelettale α-Aktin in der Skelettmuskulatur, das cardiale α-Aktin in der Herzmuskulatur und das α- SMA in der glatten Muskulatur exprimiert. Die transkriptioneile Regulation des α-SMA-Gens wird durch ein Zusammenspiel von positiv und negativ wirkenden regulatorischen Elementen des 5 '-Bereiches vermittelt (Blank, R. S. et al., J. Biol. Chem. 267: 984-989 (1992); Carrol, S. L. et al., 3. Biol. Chem. 261: 8955-8976 (1986); Carrol, S. L et al., Mol. Cell. Biol. 8: 241-250 (1988); Nakano, Y. et al., Gene. 99: 275-289 (1991); Min et al., J. Biol. Chem. 265: 16667-16675 (1990)). Der 5 '-Bereich des α-SMA- Gens enthält verschiedene konservierte c/s-Elemente wie zwei CArG-Ele- mente (CArG-A und B) (Carrol, S. L et al., Mol. Cell. Biol. 8: 241-250 (1988) und Blank, R. S. et al., J. Biol. Chem. 267: 984-989 (1992)). Die CArG-Motive bestehen aus einem A/T Repeat, das von CC/GG flankiert wird, und werden als maßgebliche Elemente der muskelspezifischen Genregulation diskutiert (Chow, K. L, Schwartz, R. J., Mol. Cell. Biol., 10, 528 - 538 (1990) und Sobuc, K. et al., Mol. Cell. Biochem. 190:105-118 (1999)). Reporterstudien an trangenen Reportermäusen zeigten, daß eine weitere CArG-Box (0) im ersten Intron des α-SMA-Gens für eine in vivo Expression von α-SMA in glatten Muskelzellen notwendig ist (Mack, C. P., Owens, G. K., Circ. Res., 84: 852 - 861 (1999)). Der 5 '-Bereich des α-SMA-Gens enthält ebenfalls zwei E-Box Konsensussequenzen (CA NN TG), potentielle Bindestellen für basic helix-loop-helix Transkriptionsfaktoren (Johnson, A. D., Owens, G. K., Am. J. Physiol., 276, C1420 - C1431 (1999)) und weitere Konsensussequenzen (Hautmann, M. B. et al., J. Biol. Chem., 272: 10948-10956 (1997) und McNa- mara, C. A. et al., Am. J. Physiol., 268: C1259-C1266 (1995)), deren Bedeutung im einzelnen nicht geklärt ist.
Das α-SMA-Gen wird zelltypspezifisch in glatten Muskelzellen (SMC) exprimiert (Vanderkerckhove J. and Weber K., Differentiation 14: 123-133 (1979) Skalli, O. et al., J. Cell. Biol., 103: 2787-2796 (1986) und idem, 3. Histochem. Cytochem., 37: 315-321 (1989)). WO 00/24254 offenbart ein Verfahren, in dem die regulatorische Sequenzen des 5 '-Bereichs und des ersten Introns des α-SMA für die Expression von heterologen Genen in SMC genutzt werden. Diese Druckschrift beschreibt ebenfalls die Verwendung dieser Sequenzen innerhalb von Vektoren für die Sichtung von Gewebeumstrukturierungen, die SMC involvieren, die mögliche Sichtung von Agonisten und Antagonisten der SMC assoziierte Gewebeumstrukturie- rungen sowie die Sichtung von therapeutischen Agenzien der SMC- assoziierten Gewebeumstrukturierungen. Im einzelnen offenbart die WO 00/24254 eine allgemeine Sequenz des α-SMA-Gens (SEQ. ID. NO: l : von -2558 bp bis + 2784 bp des Ratten α-SMA-Gens, d. h. den -2558 bp 5- Bereich und den Bereich +1 bis +2784 bp des erste Exons und des ersten Introns) und den Sequenzbereiche des ersten Introns (+ 773 bis +1098; siehe SEQ ID NO: 2), die für eine in vivo -Expression in SMC notwendig ist.
Neben der zellspezifischen Expression bei SMC wird aber auch das α-SMA- Gen transient in der Embryogenese während der Differenzierung von ske- lettalen und cardialen Muskelzellen (Ruzicka, D. L. et al., J. Ceil Biol., 107: 25775 - 25786 (1988); Woodcock-Mitchell, J., Mitchell, J. J., Differentiation 39: 161 - 166 (1988)), aber auch in Myofibroblasten während der Wundheilung sowie nach myofibroblastischen Veränderungen verschiedener Zelltypen in Vernarbungs- und Gewebeumstrukturierungsprozessen nach chronischer Organschädigung exprimiert (Desmouliere A. et al., Exp. Nephrol. 3: 134-139 (1995); Gabbiani G., Cardiovasc. Res. 38: 545-548 (1998); idem, Pathol. Res. Pract. 190: 851-853 (1994); idem, Am. J. Pathol. 83: 457-474 (1976)).
Myofibroblasten sind Zelltypen mesodermalen Ursprungs, die sich durch eine ausgeprägte Matrixproduktion, ein heterogenes Intermediatfilament- muster mit Desmin oder Vimentin auszeichnen und durch die α-SMA-Ex- pression die Fähigkeit zur Kontraktilität besitzen (Desmouliere, A. et al., Exp. Nephrol. 3: 134-139 (1995); Gabbiani, G., Cardiovasc. Res. 38: 545- 548 (1998); idem, Pathol. Res. Pract. 190: 851-853 (1994); idem, Am. J. Pathol. 83: 457-474 (1976)). Sie treten temporär bei der Wundheilung auf, während persistierende Myofibroblasten bei chronischen Vernar- bungsprozessen an der Bindegewebs- und der Organumstrukturierung beteiligt sind. In verschiedenen Fibroseerkrankungen aufgrund chronischer Organschädigung wie z.B. der Hepatitis, der Glomerulonephritis, der Mye- lofibrose oder fibrosierenden Lungenerkrankungen sind Myofbroblasten die Hauptmatrixproduzenten (Friedman, S. L, New. Engl. J. Med. 328: 1828- 35 (1993); Gressner, A. M., Kidney Int. 49: 39-45 (1996); MacPherson, B. R. et al., Hum. Pathol., 24:710 - 716 (1993); Alpers, C. E. et al., Kidney Int. 41 : 1134-1142 (1992); Thiele J. et al., J. Submicrosc. Cytol. Pathol. 23(1): 109-21 (1991); Johnson, R. J. et al., J. Clin. Invest. 87: 847-858 (1991); Kapanci, Y. et al., Mod. Pathol. 10: 1134-42 (1997)). Daher wurden Myofibroblasten auch als modulierte Fibroblasten bezeichnet; ihre Vorläuferzelltypen sind jedoch abhängig vom Organtyp sehr unterschiedlich. Chronische Nierenschädigungen führen zu einer Transdifferenzierung von Mesangialzellen zu myofibroblastischen Zellen (Johnson R. J. et al., J. Clin. Invest. 87: 847-858 (1991); MacPherson B. R. et al., Hum. Pathol. 24: 710-716 (1993)). In der Leber kommt es nach chronischer Schädigung unabhängig, ob die Ursache chronischer Alkoholabusus, virale Hepa- titis B oder C-Infektionen oder andere chronische Schädigungen sind, zur Leberfibrose, in der Hepatische Sternzellen (HSC) zu Myofibroblasten transdifferenzieren (Friedman S. L., New. Engl. J. Med. 328; 1828-35 (1993); Gressner A.M., Kidney Int. 49: 39-45 (1996); Ramadori G. et al., Virch. Arch. [B] 59: 349-357 (1990)). Hepatische Sternzellen besitzen perizytäre Eigenschaften und speichern im ruhenden Zustand 80 % des körpereigenen Vitamin A (Friedman S. L., New. Engl. J. Med. 328: 1828- 35 (1993)). Nach myofibroblastischer Transdifferenzierung, die neben der Matrixproduktion und der α-SMA-Expression vermittelten Kontraktilität durch eine einsetzende Proliferation, Vitamin A-Verlust und ein verändertes Wachstumsfaktorenprofil gekennzeichnet ist, sind sie maßgeblich an der Aufrechterhaltung und dem Fortlauf der Leberfibrose beteiligt (Friedman, S. L., New. Engl. J. Med. 328: 1828-35 (1993); Gressner, A. M., Kidney Int. 49: 39-45 (1996)). Bei bronchialen Asthma-Erkrankungen und fibrotischen Lungenerkrankungen sind Myofibroblasten die wesentliche Matrixproduzenten (Tremblay, G.M. et al., Can. Respir. J. 5(1):59-61 (1998); Gizycki, M.J. et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 16(6):664-73 (1997); Gabbrielli, S. et al., Patholo- gica.86(2) : 157-60) (1994)). Beim Übergang von in situ Karzinomen in invasive Karzinome treten ebenfalls Myofibroblasten mit den typischen Eigenschaften von induzierter extrazellulärer Matrixproduktion und Kontraktilität auf (Cintorino, M. et al., Int. J.. Cancer 47: 832 - 836 (1984); Gabbiani, G. et al., Am. J. Pathol. 83:457 - 474 (1976)). In einer Vielzahl von Karzinomen sind die Stromazellen Myofibroblasten (Terada, T. et al., J. Hepatol. 24: 706-12(1996); Faouzi, S. et al., J. He- patol. 30(2): 275-84 (1999); Kosmehl, H. et al., Br. J. Cancer. 81(6) : 1071-9 (1999); Pujuguet, P. et al., Am. J. Pathol. 148: 579-92. (1996); Chomette, G. et al., Pathol. Res. Pract. 186(1): 70-9 (1990); Ronnov-Jes- sen, L. et al., J. Clin. Invest. 95(2): 859-73 (1995)), die in parakriner Abhängigkeit das Tumorwachtum beeinflußen (Neaud, V. et al., Hepatology 26: 1458-66 (1997); Tomlinson J. et al., Clin. Cancer Res. 5(11) : 3516-22 (1999). Aber die Tumorzellen können auch selber aus myofibroblastischen Abkömmlingen bestehen wie z.B. bei Myofibroblastomen und Myofibrosar- comen verschiedener Organe (Gocht, A. et al., Pathol. Res Pract. 195(1): 1-10 (1999);Unden, A.B. et al., J. Invest. Dermatol. 107 (2) : 147-53 (1996); Auger, M. et al., Arch. Pathol. Lab. Med. 113(11) : 1231-5 (1989)).
Gentherapeutische Ansätze für chronische Fibroseerkrankungen und Tumorerkrankungen: Da Myofibroblasten die zentralen Zelltypen in vielen sklerosierenden Erkrankungen und mancher Tumorerkrankungen sind, sind sie ideale Zielzellen der Therapie, auch der Gentherapie. Durch eine zelltypspezifische, differenzierungsabhängige Kontrolle der Expression (a) von Genen kodierend für z.B. intrazellulären Signalmediatoren (Walther, W., Stein, U., Mol. Biotechnol. 13(1): 21 - 28 (1999)) oder (b) RNA-kodierenden Sequenzbereiche, die durch Anlagerung die Transkription oder die Translation bestimmter Gene beinflussen (Bai, J. et al., Mol. Ther. 1(3): 244 - 254 (2000)) oder
(c) eines Enzyms für eine zyklische Rekombination (CRE), das floxP-flan- kierte Genbereiche verändert (Sauer, B. Methods 14: 381 - 392 (2998)), wird eine Gentherapie bestimmter Zielzellen ermöglicht. Als Vekoren werden vielfach virale Vesikel wie z.B. adenovirale oder retrovirale Abkömmlinge (Miller, N. Whelan, J. Hum. Gene Ther. 8, 803 - 815; Mountain, A., Tibtech. 18: 119 - 128 (2000); Schiedner, G. et al., Nat. Genet. 18, 180 - 183 (1998); Parr, M. J., Nat. Med. 3, 1145 - 1149 (1997); Ory, D. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 93: 11400 - 11406 (1996); Feng, M. et al., Nat. Biotechnol. 15: 866 - 870 (1997)) benutzt. Aber auch die DNA eines Plasmidkonstruktes kann blank oder in Aggregaten mit Liposomen oder Polymerkörpern verabreicht werden (Hengge, U. et al., Nat Genet. 10: 161 - 166 (1995); Gottschalk, S. et al., Gene Ther. 3:3410 - 3414 (1990); Wagner, E. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 87:3410 - 3414 (1990)). Für gentherapeutische Ansätze und Veränderungen der myofibroblastischen Zellfunktion sind geeignete regulatorische Sequenzen bzw. ein Promoter notwendig, die/der die entsprechenden Zellfunktionseingriffe und Veränderungen in der Expression in Myofibroblasten dirigieren kann, voraussetzende Bedingung, die aber bislang nicht erfüllt ist. Denn erst durch den Einsatz regulatorischer Sequenzen innerhalb eines Promoters, die die Zeilfunktionseigenschaften (a) durch eine veränderte Genexpres- sion, (b) durch eine Einwirkung in die Proteinsynthese oder (c) durch Genomalteration myofibroblastensprechend dirigieren, können myofibro- blastische Zellen gentherapeutisch angesprochen werden.
Zusammenfassung der Erfindung Bei der Charakterisierung des regulierenden Sequenzbereichs des α-SMA- Gens (nachfolgend auch "α-SMA-5'-Sequenzbereich") wurde überraschenderweise gefunden, dass einzelne Bereiche hierin, nämlich innerhalb -698 bis +18 des α-SMA-5'-Sequenzbereichs (Nummerierung, falls nicht anders angegeben, bezogen auf das in Fig. 7A gezeigte α-SMA-Gen aus rattus norvegicus) Aktivitäten aufweisen, die sich von der Aktivität des Gesamtbereiches unterscheiden. So wurde gefunden, dass der Bereich -189 bis + 18 des α-SMA-Gens transkriptionsaktivierend ist, wohingegen der Bereich -698 bis -190 zelltypspezifische und differenzierungsabhängige regulative Eigenschaften aufweist, d. h. in Verbindung mit dem Core-Bereich (-189 bis +18) für die zelltypspezifische Kontrolle zuständig ist. Aufbauend auf den Befund, dass die Genexpression und/oder Zellfunktion in Myofibroblasten, myofibroblastähnlichen Zellen oder auch embryonal, transient oder induziert SMA-exprimierenden Zellen steuern können, wurde ein System für eine myofibroblastischen Steuerung erarbeitet. Die vorlie- gende Erfindung betrifft demgemäss
(1) eine Nukleinsäuresequenz, umfassend
(i) einen oder mehrere funktioneile Bereiche aus dem regulierenden Sequenzbereich des alpha-Smooth-Musde-Actin-Gens (α-SMA-Gens)- und (ii) wenigstens eine weitere funktionelle Nukleinsäuresequenz, die mit der Sequenz (i) operativ verknüpft ist, wobei vorzugsweise der regulatorische Sequenzbereich aus den Nukleotiden -698 bis +18 des α-SMA-Gens besteht (wobei die Nummerierung auf die in Fig. 5A und 7A gezeigte Se- quenz aus rattus norvegicus bezogen ist), und wobei die weitere funktio- nelle Nukleinsäuresequenz nicht für das natürliche α-SMA kodiert;
(2) eine bevorzugte Ausführungsform der in (1) definierten Nukleinsäuresequenz, wobei der regulierende Sequenzbereich von der Ratte stammt und die Nukleinsäuresequenz vorzugsweise einen oder mehrere funktioneile Bereiche aus der in Fig. 5A gezeigten Sequenz (SEQ ID NO: l), insbesondere aus der in Fig. 7A gezeigten Sequenz (SEQ ID NO:5), umfasst;
(3) eine bevorzugte Ausführungsform der in (2) definierten Nukleinsäuresequenz, wobei der funktioneile Bereich eine transkriptionsaktivierende Nukleinsäuresequenz ist und insbesondere aus der Sequenz -189 bis +18 der Fig. 7A (d.h. aus der Sequenz der Fig. 7C; SEQ ID NO:7) stammt;
(4) eine bevorzugte Ausführungsform der in (2) definierten Nukleinsäuresequenz, wobei der funktioneile Bereich eine zelltypspezifische Nukleinsäuresequenz ist und insbesondere aus der Sequenz -698 bis -190, be- sonders bevorzugt aus der Sequenz -698 bis -215, der Fig. 7A stammt;
(5) eine bevorzugte Ausführungsform der in (1) definierten Nukleinsäuresequenz, wobei der regulierende Sequenzbereich von der Maus stammt und die Nukleinsäuresequenz vorzugsweise einen oder mehrere funktioneile Bereiche der in Fig. 5B gezeigten Sequenz (SEQ ID NO:2) insbeson- dere aus der in SEQ ID NO: 18 gezeigten Sequenz aufweist;
(6) eine bevorzugte Ausführungsform der in (5) definierten Nukleinsäuresequenz, wobei der funktionelle Bereich
(a) eine transkriptionsaktivierende Nukleinsäuresequenz ist und insbesondere aus den Nukleotiden 490 bis 697 der in SEQ ID NO: 18 gezeigten Se- quenz stammt und/oder
(b) eine zelltypspezifische Nukleinsäuresequenz ist und insbesondere aus den Nukleotiden 1 bis 489 der in SEQ ID NO: 18 gezeigten Sequenz stammt;
(7) eine bevorzugte Ausführungsform der in (1) definierten Nukleinsäure- sequenz, wobei der regulierende Sequenzbereich vom Menschen stammt und die Nukleinsäuresequenz vorzugsweise einen oder mehrere funktio- nelle Bereiche der in Fig. 5C gezeigten Sequenz (SEQ ID N0:3) insbesondere aus der in SEQ ID NO: 19 gezeigten Sequenz aufweist;
(8) eine bevorzugte Ausführungsform der in (7) definierten Nukleinsäuresequenz, wobei der funktioneile Bereich (a) eine transkriptionsaktivierende Nukleinsäuresequenz ist und insbesondere aus den Nukleotiden 513 bis 715 der in SEQ ID NO: 19 gezeigten Sequenz stammt und/oder
(b) eine zelltypspezifische Nukleinsäuresequenz ist und insbesondere aus den Nukleotiden 1 bis 512 der in SEQ ID NO: 19 gezeigten Sequenz stammt;
(9) eine bevorzugte Ausführungsform der in (1) definierten Nukleinsäuresequenz, wobei der regulierende Sequenzbereich vom Huhn stammt und die Nukleinsäuresequenz vorzugsweise einen oder mehrere funktioneile Bereiche der in Fig. 5D gezeigten Sequenz insbesondere aus der in SEQ ID NO:20 gezeigten Sequenz aufweist;
(10) eine bevorzugte Ausführungsform der in (9) definierten Nukleinsäuresequenz, wobei der funktioneile Bereich
(a) eine transkriptionsaktivierende Nukleinsäuresequenz ist und insbesondere aus den Nukleotiden 497 bis 699 der in SEQ ID NO: 20 gezeigten Sequenz stammt und/oder
(b) eine zelltypspezifische Nukleinsäuresequenz ist und insbesondere aus den Nukleotiden 1 bis 496 der in SEQ ID NO:20 gezeigten Sequenz stammt;
(11) eine transkriptionsaktivierende Nukleinsäuresequenz, wie in (3), (6), (8) oder (10) definiert;
(12) eine zelltypspezifische Nukleinsäuresequenz, wie in (4), (6), (8) oder (10) definiert;
(13) einen Vektor, enthaltend eine Nukleinsäuresequenz, wie , in (11) und/oder (12) definiert; (14) einen Vektor, in dem eine Nukleinsäuresequenz, wie in (1) bis (10) definiert, inseriert ist;
(15) eukaryontische Zellen oder Organismen, die mit einer Nukleinsäuresequenz, wie in (1) bis (10) definiert oder einem Vektor, wie in (13) oder (14) definiert, transient oder stabil transfiziert transformiert oder infiziert sind;
(16) ein Verfahren zur Herstellung der eukaryontischen Zellen, wie in (15) definiert, umfassend das Transfizieren, Transformieren oder Infizieren von Ausgangszellen mit den Nukleinsäuresquenzen, wie in (1) bis (10) definiert oder mit Vektoren, wie in (13) oder (14) definiert;
(17) ein Verfahren zur Herstellung der Organismen, wie in (15) definiert, umfassend das Injizieren von ES-Zellen, die mit den Nukleinsäuresquenzen, wie in (1) bis (10) definiert oder mit Vektoren, -wie in (13) oder (14) definiert, transfiziert sind, in Blastozysten der Organismen und Einsetzen in die Leihmutter;
(18) ein Verfahren zur Isolierung oder zur Sichtung von Glatten Muskelzellen, Myofibroblasten oder myofibroblastähnlichen Zellen aus einem Zellgemisch, einer Zellpopulation, einem Zellaggregat oder einem Orga- nismus, umfassend die Expression eines Reportergens in einer eukaryontischen Zelle oder einen Organismus, wie in (15) definiert;
(19) ein Verfahren zur Manipulation der Genexpression und/oder der Zellfunktion von glatten Muskelzellen oder Myofibroblasten in Organismen oder Organen, umfassend Einbringen von Nukleinsäuresequenzen, wie in (1) bis (10) definiert oder einem Vektor, wie in (14) definiert, in die Organismen oder Organe;
(20) ein Arzneimittel, enthaltend eine Nukleinsäuresequenz, wie in (1) bis (10), (11) oder (12) definiert, oder einen Vektor, wie in (13) oder (14) definiert und (21) die Verwendung eines funktionellen Bereichs aus dem regulierenden Sequenzbereich des α-SMA-Gens, wie vorstehend unter (1) bis (12) definiert, zur Herstellung eines Arzneimittels zur zelltyp- und differenzierungsspezifischen Reporterexpression, zur zelltyp- und differenzierungsspezifischen Genveränderung und zur Manipulation der Genexpression und/oder Zellfunktion, insbesondere in transient embryonal SMA-positiven Zellen, in Myofibroblasten und myofibroblastähnlichen Zellen. Die Erfindung wird nachfolgend anhand der beigefügten Figuren und Beispiele näher erläutert.
Figurenbeschreibung Fiq 1: Messung der Luziferasereporteraktivität in ruhenden und myofibro- blastisch-aktivierten Hepatischen Sternzellen (HSC) unter Kontrolle des PRL-700-Reporterkonstruktes.
Fiq 2a : Immuncytologie nach Einzelzelldissoziation von differenzierten EB und Kultivierung der vom Verband gelösten Zellen. In pSMA-GFP-190 transfizierten Zellen zeigten auch α-SMA-negative Zellen (IC) eine GFP- Expression (1B). In pSMA-GFP-700 transfizierten Zellen war die GFP-Ex- pression (2B) auf α-SMA-exprimierenden Zellen begrenzt (2C).
Fiq 2b: Aufbau des SMA-GFP-700 bzw. SMA-GFP-190 Reportervektor für stabile Transfektionen in embryonale Stammzellen oder transgene Reportermausmodelle. In die Konstrukte ist zwischen den GFP-Reporter (EGFP-Variante) und den 716bp (SEQ ID NO:5) bzw. 207bp (SEQ ID NO:7) aus der 5 '-Region des α-SMA-Gen als heterologe regulatorische Sequenz das erste Intron des chicken ß-Actins kloniert. Zur Selektion von stabilen Transfektanten hat das Konstrukt, neben der Ampicillinresistenz eine weitere Resistenz gegen Neomycin, die in eukaryotischen Zellen eine G418 Selektion erlaubt.
Fiq 3a: Luciferasereporteraktivitäten unterschiedlich langer SMA-Kon- strukte (SMA-125 bis SMA-700; vergleiche auch Fig. 7) die nach tran- sienter Transfektion in embryonalen Myotuben und Myoblasten der Zellinie L6 ermittelt wurden. L6-Zellen, die nach Serumentzug in α-SMA-exprimie- rende Myotuben differenzieren, zeigten eine 4- bis 5fache Induktion aller Konstrukte im Vergleich zu den Vorläufer L6-Myoblasten. Das SMA-190- Konstrukt besitzt einen stark transaktivierenden Einfluss. Das SMA-700- Konstrukt dirigiert dagegen eine differenzierungsabhängige Reporterex- pression. Die Aktivitäten der SMA-Konstrukte wurden mit der Aktivität des SV40-Promoter (100%) in Relation gesetzt. Die Versuche wurden in drei unabhängigen Experimenten mit Doppelansätzen durchgeführt.
Fiq 3b: Plasmidkonstrukt zur Expression eines Peptids oder Polypeptids von Interesse unter Kontrolle der 716 bp-5'-Sequenz (SEQ ID NO:5) des α -SMA-Gens. Zur Detektion der Expression kann in den Consensus des Leserasters (ORF) ein oder mehrere Erkennungssequenzen (Tags) eingebaut werden wie die kodierende Sequenz für Streptavidin (SEQ ID NO:34) und/oder ein von einem Antikörper (9E10) erkanntes Epitop wie myc (SEQ ID:35), und/oder zur Aufreinigung auch eine für fünf Histidine kodierende Sequenz (SEQ ID NO:36) enthalten. Sowohl die Sequenz des Peptids von Interesse als auch die damit verknüpften TAG-Sequenzen unterliegen der zelltypspezifischen und differenzierungsabhängigen Kontrolle des regulati- ven Sequenzbereichs des α-SMA-Gens.
Fiq 4: LoxP- vermittelte Cre-Rekombination unter Kontrolle des α-SMA-5 '- Genbereichs: a. : Aufgrund der transkriptionellen Kontrolle des Cre-Gens (SEQ ID NO:32) durch den 5 '-Bereich des α-SMA-5 ' -Sequenzbereichs (SEQ ID NO:5) in Kombination mit dem ersten Intron des ß-Actins (SEQ ID NO:31) kommt es nach myofibroblastischer Differenzierung zur Expression des Cre-Gens in Myofibroblasten (1), der Cre- vermittelten Excision des loxP- flankierten Neomycin-Gens (neo) (2) und der anschließenden Expression des Gens von Interesse (3). b. : Aufgrund der transkriptionellen Kontrolle des Cre-Gens (SEQ ID NO:32) durch den 5 '-Bereich des α-SMA-5 '-Sequenzbereichs (SEQ ID NO:5) in Kombination mit dem ersten Intron des ß-Actins (SEQ ID NO:31) kommt es nach myofibroblastischer Differenzierung zur Expression des Cre-Gens in Myofibroblasten (1), der Cre-vermittelten Excision des loxP- flankierten Gens von Interesse (2), sodaß eine anschließende Expression des Gens von Interesse unterbrochen wird (3). c : Aufgrund der transkriptionellen Kontrolle des Cre-ER-Fusionsgens (SEQ ID NO:32 +ER™, Danielian PS et al., Mol. Endocrinol. 7:' 232-240, 1993) durch den 5 '-Bereich des α-SMA-5 '-Sequenzbereichs (SEQ ID NO:5) in Kombination mit dem ersten Intron des ß-Actins (SEQ ID NO:31) kommt es nach myofibroblastischer Differenzierung zur Expression des Cre-ER- Fusionsgens in Myofibroblasten (1). Nach Zusatz bzw. Injektion von 0,1 bis 2 mg 4-OHT kann im nächsten Schritt die Bindung des Liganden durch das ER-Peptid erfolgen und sich ein Cre-ER/4-OHT-Komplex bilden. Anschließend transloziert der Kompex in den Kern und es werden durch Cre die in Fig. 4a und b gezeigten genetischen Veränderungsschritte (2) und (3) durchgeführt.
In Fig. 4 bedeutet: nS: nukleare Signalpeptidsequenz; schraffierte Fläche: Intronsequenz; LP: Linker Peptidsequenz; ER™:Sequenz für alterierten Östrogenrezeptor mit hoher Affinität für den synthetischen Liganden, 4- Hydroxytamoxifen (4-OHT), der aber endogen produziertes 17ß-Estradiol nicht bindet; ß-A: ß-Aktin-Intron (SEQ ID NO:31); und 4-OHT: 4-Hydro- xytamoxifen
Fiq 5: 5 '-upstream Region und Anfang Exonl des α-SMA in verschiedenen Spezien (Region -713 bis +52, Nummerierung bezogen auf Sequenz A)
A: Ratte (Rattus norvegicus; SEQ ID NO:l; Acc. No S76011 ; Blank, R.S. et al., J. Biol. Chem . 267(2): 984 -989 (1992)).
B: Maus (Mus musculus; SEQ ID NO:2; Acc. Nos. M57409 M35194; Min,
B.H. et al., J. Biol. Chem. 265: 16667-16675 (1990)). C: Mensch (Homo sapiens; SEQ ID NO:3; Acc. No. J05193; Reddy, S. et al., J. Biol. Chem. 265(3): 1683-1687 (1990)).
D: Huhn (Gallus gallus; SEQ ID NO:4; Acc. M13756 D00041 N00041;
Carroll, S.L et al., J. Biol. Chem. 261(19): 8965-8976 (1986)).
Fig. 6: Alignment der in Fig. 5 gezeigten Sequenzen. Fig. 7: zeigt die bevorzugte, aus Ratte (Rattus norvegicus) stammenden α
-SMA Sequenzen der vorliegenden Erfindung (SEQ ID NO:)
A: 5 'Genbereich des α-SMA-Gens: -698 bis +18 (5)
B: 5 ' Genbereich des α-SMA-Gens: -124 bis +18 (6) C: 5 'Genbereich des α-SMA-Gens: -189 bis +18 (7)
D: 5 ' Genbereich des α-SMA-Gens: -214 bis +18 (8)
E: 5 'Genbereich des α-SMA-Gens: -244 bis +18 (9)
F: 5 'Genbereich des ατSMA-Gens: -484 bis +18 (10)
G: 5 'Genbereich des α-SMA-Gens: -521 bis +18 (11) H : 5 'Genbereich des α-SMA-Gens: -189 bis -125 (12)
I: 5 'Genbereich des α-SMA-Gens: -214 bis -190 (13)
J : 5 'Genbereich des α-SMA-Gens: -244 bis -215 (14)
K: 5 'Genbereich des α-SMA-Gens: -484 bis -245 (15)
L: 5 ' Genbereich des α-SMA-Gens: -521 bis -485 (16) M : 5 'Genbereich des α-SMA-Gens: -698 bis -522 (17)
Fig. 8A: ß-1-Globin-Gen von Oryctoiagus cuniculus; Intron II /Exon III- Übergang; Acc.No: V00882: Sequenz 1250-1343 (SEQ ID NO:30)
Fig. 8B: Cytoplasmisches ß-Actin-Gen von Gallus gallus; Acc. No: X00182, Intron I (544-1542); gezeigt ist die Sequenz von 550 bis 1503 (SEQ ID NO:31).
Fiq. 8C: Skizze einer floxP-site: Die FloxP-Sequenz (siehe auch SEQ ID NO: 33) besteht aus 13 bp invertierten Repeats (horizontale Pfeile), die eine 8 bp asymmetrische Core-Region flankieren, welche an zwei Stellen (vertikale Pfeile) durch Cre geschnitten wird.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung Die vorliegende Erfindung beruht auf den überraschenden Befund, dass durch spezifische regulatorische Sequenzen des α-SMA-Gens, insbesondere solche die eine oder mehrere der in Fig. A bis M von Fig. 7 (SEQ ID NOs:5 bis 17) gezeigten Sequenzen enthalten, die Genexpression der hiermit operativ verknüpften funktionellen Nukleinsäuresequenz so z. B. eines Reportergens oder eines anderen funktionellen Gens in. Myofibroblasten oder myofibroblastähnlichen Zellen gesteuert wird.
Die Nukleinsäuresequenz der Ausführungsform (1) der Erfindung enthält einen oder mehrere funktionelle Bereiche aus dem regulierenden Sequenzbereich des α-SMA-Gens. Dieser regulierende Sequenzbereich kann dabei von Säugern, insbesondere von Primaten oder Nagern oder Vögeln und besonders bevorzugt von Ratte, Maus, Mensch oder Huhn stammen (Blank, R.S. et al., J. Biol. Chem . 267(2): 984 -989 (1992); Min, B.H. et al., J. Biol. Chem. 265: 16667-16675 (1990); Reddy, S. et al., J. Biol. Chem. 265 (3) : 1683-1687 (1990); Carroll, S.L et al., J. Biol. Chem. 261 (19): 8965-8976 (1986)).
In der bevorzugten Ausführungsform (2) stammt der regulierende Sequenzbereich, wie vorstehend erwähnt, von der Ratte (Blank, R. S. et al., J. Biol. Chem. 267: 984-989 (1992)). Besonders bevorzugt ist dabei, dass der funktionelle Bereich eine transkriptionsaktivierende Nukleinsäurese- quenz aufweist und besonders bevorzugt aus der in Fig. 7C gezeigten Sequenz stammt. Hierbei sind insbesondere solche transkriptionsaktivierende Sequenzen bevorzugt, die wenigstens 10, vorzugsweise wenigstens 40 und besonders bevorzugt wenigstens 60 konsekutive Basen aus der in Fig. 7C gezeigten Sequenz aufweisen und besonders bevorzugt die in Fig. 7B oder 7C gezeigten Sequenzen (SEQ ID NOs:6 oder 7) umfassen. Alternativ oder zusätzlich hierzu kann der funktionelle Bereich eine zelltypspezifisch oder differenzierungsabhängig regulierende Nukleinsäuresequenz sein, bevorzugt eine solche, die aus der Sequenz -698 bis -190 der, Fig. 7A (Nukleotide 1 bis 509 von SEQ ID NO: 5), besonders bevorzugt aus der Sequenz -698 bis -215 der Fig. 7A, stammt. Dabei sind solche zelltypspezifische Sequenzen bevorzugt, die wenigstens 25, vorzugsweise wenigstens 35, konsekutive Basen aus der Sequenz -698 bis -190 der Fig. 7A aufweisen und besonders bevorzugt die in Fig. 71 oder 7M gezeigten Sequenzen umfassen.
Gemäß der bevorzugten Ausführungsformen (5) - (10) stammt der regu- lierende Sequenzbereich alternativ von der Maus, dem Menschen oder dem Huhn (Min, B.H. et al., J. Biol. Chem. 265: 16667-16675 (1990); Reddy, S. et al., J. Biol. Chem. 265 (3) : 1683-1687 (1990); Carroll, S.L et al., J. Biol. Chem. 261 (19): 8965-8976 (1986)), wobei die funktionellen Bereich vorstehend unter (5) bis (10) definiert sind. Besonders bevor- zugt im Sinne der vorliegenden Erfindung ist auch hier, dass die transkriptionsaktivierende Nukleinsäuresequenz wenigstens 10, bevorzugt wenigstens 40 und besonders bevorzugt wenigstens 60 konsekutive Basen aus der unter (6), (8) oder (10) definierten transkriptionsaktivierenden Sequenz aufweist bzw. wenigstens 25, vorzugsweise wenigstens 35, konse- kutive Basen aus der vorstehend unter (6), (8) oder (10) definierten zell- typspezifischen Sequenz aufweist. Insbesondere sind solche Teilsequenzen aus in den SEQ ID NOs: 18, 19 und 20 gezeigten Sequenzen bevorzugt, die den Sequenzen 7A - 7M der Sequenz aus Ratte entsprechen (gemäss dem Alignment in Fig. 6).
Die weitere funktionelle Nukleinsäuresequenz gemäß Ausführungsform (1) der Erfindung kann dabei eine peptid- oder proteinkodierende DNA-Sequenz (einschließlich jedoch nicht eingeschränkt auf Reportergene, Sequenzen, die für pharmakologisch aktive Proteine kodieren und regulatori- sehe DNA-Sequenzen) oder eine funktionelle RNA-kodierende Sequenz (einschließlich jedoch nicht eingeschränkt auf ein Ribozym) sein.
Frühere Arbeiten haben die Verknüpfung von α-SMA-Gen-Fragmenten mit Reportergenen gezeigt (u.a. Nakano, Y. et al., Gene 99(2): 285-9 (1991); Blank, R.S. et al., J. Biol. Chem. 15, 267(2): 984-9 (1992); Johnson, A.D. und Owens, G.K., Am. J. Physiol. 276: C1420-31 (1999); Hautmann, M.B. et al., J Biol Chem. 272(16): 10948-56, (1997); Simonson, M.S. et al., Am. J. Physiol. 268(4 Pt 2): F760-9 (1995); Kim, J.H. et al., Biochem. Bi- ophys. Res. Commun. 190(3): 1115-21 (1993); McNamara, CA. et al., Am. J. Physiol. 268: C1259-66 (1995) sowie WO 00/24254 und- US-Patent 5,885,769). Geeignete Reportergene für eine myofibroblastische Steuerung sind z. B. die in der nachfolgenden Tabelle 1 aufgeführten Gene. Andere funktionelle Gene im Sinne der vorliegenden Erfindung sind z. B. Gene, die für pharmakologisch aktive Proteine oder Peptide kodieren, und regulatorische DNA- und RNA-Sequenzen.
Tab. 1 : Beispiele möglicher Reporter, deren Expression durch die α-SMA- 5 '-Sequenz kontrolliert werden kann
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1 SEAP: secreted alkaline phosphatase
2 BCIP: 5-Bromo-4-chloro-3-Indolylphosphat
3 NBT: Nitroblue-Tetrazolium
4 CAT: Chloramphenicol-Acetyltransferase
5 hGH: human growth hormone
6 DAB: 3,3'-Diaminobenzidin
7 AEC: 3-Amino-9-Ethylcarbazol Der Vektor gemäß Ausführungsform (13) umfasst konventionelle Trans- fektionsvektoren und für den Gentransfer geeignete Vektoren.
Die eukaryontischen Zellen oder Organismen gemäß Ausführungsform (15) der vorliegenden Erfindung können durch dem Fachmann wohlbekannte Transfektions-, Transformations- oder Infektionsverfahren von Ausgangszellen bzw. Infizieren von ES-Zellen in Blastozysten der Organismen und Einsetzen in die Leihmutter erhalten werden.
Bislang war es nicht möglich den Vorgang der myofibroblastischen Aktivierung durch einen Reporter zu sichten, da ein regulierender Sequenzbereich, der spezifisch auf den Aktivierungsübergang von ruhenden Zellen zu myofibroblastischen Zellen anspricht, nicht gefunden wurde. Durch die Fusion des Sequenzbereichs von -698 bis +18 (SEQ ID NO:5) mit einem Reportergen (siehe Tabelle 1) und Insertion in einen Transfervektor und anschließender Transfektion kann die myofibroblastische Aktivierung gesichtet werden (Fig. 1). In bisherigen Methoden wurde für eine Sichtung des myofibroblastischen Aktivierungsvorgangs immunzytologische oder immunhistologische Verfahren gewählt, die mehrere Arbeitschritte wie Fixieren der Zellen, Antigenblocken, Antikörperinkubation und Detektion beinhalteten (F. Hofman, Current protocols in immunology, Chapt. 5.8: Immunohistochemistry; Eds. J.E. Coligan et al., National Institute of Health, USA (1996)). Zur immunzytologischen bzw. immunhistologischen Detektion von Myofibroblasten konzentrierten sich die Verfahren auf die immunochemisehe Anfärbung des α-SMA-Proteins. Quantitative Aussagen über die Aktivierung z.B. durch ein toxikologisches Reagenz waren allerdings auf diese Weise nicht möglich. In der vorgelegten Erfindung wurde als α-SMA-5 ' -Sequenz kontrollierter Reporter des myofibroblastischen Transformationsprozeß vorzugsweise lumineszierende Reporterproteine gewählt und die Aktivierung der Zellen quantitativ und sehr empfindlich durch ein Luminometer (MLX Microplate Luminometer der Fa. Dynex Technologies, Chantilly, USA) gemessen (Fig. 1). Durch eine quantitative Reporterbestimmung ergibt sich durch das Verfahren erstmals die Möglichkeit toxikologische und pharmakologische Studien quantitativ durchzuführen, die dann Aussagen über das myofibroblastische Aktivierungspotential der Substanz ergeben und damit die Möglichkeit der Detektion des chronisch relevanten Organschädigungspotential.
Die Bestimmung des myofibroblastischen Übergangs an Zellen, die den Vektor mit dem α-SMA-5-Sequenz-Reporterfusionkonstrukt beinhalten, birgt auch die Möglichkeit, therapeutische Medikamentsichtungen durch- zuführen; hier kann eine Verminderung der myofibroblastischen Aktivierung, z.B. induziert durch ein Toxin oder einen fibrogenen Wachtumsfaktor wie z.B. Transforming Growth Factor beta (TGF ß), anhand des α-SMA-5 '- Sequenz kontrollierten Reporters ausgelesen werden.
Das erfindungsgemäße vorgelegte Verfahren, in dem α-SMA-5 ' -Sequenzbereiche (-698 bis +18) zur Reportersteuerung genutzt werden, umfaßt neben der Sichtung der myofibroblastischen Aktivierung die Isolierung von bestimmten Zellen anhand der α-SMA-5 '- gesteuerten Reporterexpression. Dies wird in dem vorgestellten Verfahren vorzugsweise durch opera- tive Verknüpfung von α-SMA-5 '-Sequenzbereichen mit einem fluoreszierenden Reporter (z.B. GFP siehe Tabelle 1) durchgeführt, so daß nach Einbringen des Vektorkonstruktes in einen Organismus oder einer Zellpopulation die Isolierung von transient embryonal SMA-positiver Zellen oder von myofibroblastisch induzierten Zellen aus einem Zellgemisch oder Verbandes aufgrund der Fluoreszenz mithilfe eines FACS-Gerätes (FACS: Fluorescence activated cell sorting) durchgeführt werden kann. Alternativ erlaubt die Verknüpfung des α-SMA-5 '- Sequenzbereichs mit anderen Reportern die Isolierung von Myofibroblasten und Arealen mit myofibroblastähnlichen Zellen durch Mikrodissektion unter licht- oder fluores- zenzmikroskopischer Kontrolle. Die vorgelegte Erfindung umfaßt ebenfalls die Rolle des Sequenzbereichs -698 bis +18 des α-SMA-Gens für die spezifische Genexpression in embryonalen Stammzellen (ES), die in Embryoid Bodies zu embryonalen Kar- diomyozyten, glatten Muskelzellen oder Skelettmuskelzellen differenzieren können (Evans, M. J., Kaufmann, M. H., Nature, 292, 154 - 156 (1981)). Der Vergleich verschiedener stabil in ES-transfezierter Konstrukte mit unterschiedlichen Domänen des α-SMA-5 '- gelegenen Sequenzbereichs zeigte, daß für eine Selektion von Kardiomyozyten, Skelettmuskelzellen und Glatten Muskelzellen aus embryonalen Zellaggregaten eine Reporter- Steuerung durch den Sequenzbereich -189 bis +18 (Fig. 7C; SMA-190) nicht ausreicht, sondern zusätzliche 5-gelegene Domänen im Bereich - 698 bis -190 des α-SMA-Gens ( Seq. I, J, K, L und M der Fig. 7) notwendig sind (Fig. 2 ).
Die Erfindung betrifft ebenfalls die operative Verknüpfung des α-SMA-5 '- Sequenzbereichs oder Teilbereiche der Sequenzen (Seq. A bis M von Fig. 7) mit anderen die Expression beeinflußenden Nukleinsäuresequenzen. Beispiel sind Intronsequenzen wie die des ß-Globin- (siehe Fig. 8a, SEQ ID NO:30) oder des Huhn-ß-Aktin-Gens (siehe Fig. 8b, SEQ ID NO:31), aber auch andere Enhancersequenzen wie die des viralen CMV wie in dem Vektor von Fig. 3. Aber auch andere hier nicht genannte expressions- beeinflußende Sequenzen können mit den α-SMA-5 '- Sequenzen oder Domänen aus denen (Seq. A bis M von Fig. 7) operativ verknüpft werden.
Wird nicht ein Reportergen, sondern ein anderer peptid- oder proteinkodierender Genbereich mit den α-SMA-5 '- Sequenzbereichen (SEQ ID NOs:5 bis 17) verknüpft, kommt es zu einer α-SMA-5 '-gesteuerten Expression des operativ verknüpften Genbereichs. In der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird Sequenz A von Fig. 7 für eine Steuerung der Expression des Genbereichs von Interesse benutzt. Fig. 1 oder Fig. 3 zeigt die differenzierungsabhängige Expression unter transkriptioneller Kontrolle der Sequenz A von Fig. 7: Die transkriptioneile Kontrolle durch Sequenz A verhindert die Expression in Myoblasten oder ruhenden myofibroblastischen Vorläufer, während sie nach Myotubendifferenzierung oder nach myofibroblastischer Transdifferenzierung zur Expression- des verknüpften Genbereichs führt. Wird Sequenz C von Fig. 7 mit dem Zielgen verknüpft, kommt es auch zur Expression in vielen Zelltypen wie z.B. in Fibroblasten, bei Verknüpfung der Sequenzen A, F, G von Fig. 7 in myofibroblastischen Zellen oder SMC-Abkömmlingen. Der durch α-SMA-5 '- Sequenzbereiche (Seq. A bis M von Fig. 7) transkriptionell gesteuerte Genbereich kann wiederum ebenfalls mit zusätzlichen Sequenzdomänen verknüpft werden. Die Verknüpfung unter Berücksichtigung des Leserasters mit kodierenden Sequenzen für bestimmte Tags oder Reporterdomänen (Fig. 3b) ermöglicht die Verfolgung der Genexpression oder die Aufreinigung Proteins oder Peptids des durch α-SMA-Sequenzen transkriptionell gesteuerten Genbereichs.
Durch die operative Verknüpfung der α-SMA-5 '- Sequenzbereiche (Seq. A bis M von Fig. 7) mit Sequenzen, die RNA kodierende DNA oder Genbereiche für Signalmediatoren enthalten, kann funktioneil in den Phänotyp myofibroblastischer Zellen eingegriffen werden. Nach Insertion solcher Konstrukte in einen Vektor, der sich zur Gentherapie eignet (wie z.B. verschiedene Generationen von adenoviralen, retroviralen oder lentiviralen Vektoren und deren Abkömmlinge (Ory, D. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 93: 11400 - 11406 (1996); Feng, M. et al., Nat. Biotechnol. 15: 866 - 870 (1997)) bzw. nackte oder in Aggregaten mit geladenen Polymeren oder Liposomen zusammengefaßte Plasmidvektoren) (Hengge, U. et al., Nat. Genet. 10: 161-166 (1995); Gottschalk, S. et al., Gene Ther. 3: 448 - 457 (1996)) wird die Voraussetzung für gentherapeutische Ansätze myofibroblastischer Zellen und myofibroblastähnlicher Zellen geschaffen, die bei sklerosierenden Erkrankungen (Desmouliere, A. et al., Exp. Nephrol. 3: 134-139 (1995); Gabbiani, G., Cardiovasc. Res. 38: 545-548 (1998); idem, Pathol. Res. Pract. 190: 851-853; idem Am. J. Pathol. 83: 457-474 (1976)) und Tumorerkrankungen (Terada, T et al., J. Hepatol. 24: 706- 12(1996); Faouzi, S. et al., J. Hepatol. 30(2): 275-84 (1999); Kosmehl, H. et al., Br. J Cancer. 81(6): 1071-9 (1999); Pujuguet, P. et al., Am. J. Pathol. 148: 579-92 (1996); Chomette, G. et al., Pathol. Res. Pract. 186(1): 70-9 (1990); Ronnov-Jessen, L et al, J. Clin. Invest. 95(2): 859- 73 (1995); Gocht, A et al., Pathol. Res. Pract. 195(1): 1-10 (1999)) genutzt werden können.
Die operative Verknüpfung von Sequenzbereichen aus Sequenz A bis M aus Fig. 7, wobei in dieser Erfindung vorzugsweise die Sequenz A aus Fig. 7 benutzt wurde, mit dem Enzym für die zyklische Rekombination (Cre) (SEQ ID NO:32) ermöglicht es, in myofibroblastisch-differenzierten Zellen Genbereiche, die mit einer floxP-Sequenz (Fig. 8c, SEQ ID NO:33) flankiert wurden, neu zu rekombinieren. Hier kann nach Funktion des Cre-En- zyms und der Orientierung der floxP-Sequenzen eine Inversion, eine Excision, Integration oder Translokation des gefloxten Genbereichs unter Kontrolle der gewählten regulierenden α-SMA-5 '- Sequenzbereiche erfolgen. In dieser Erfindung gewählte mögliche Konstruktionen des Vektors sind in Fig. 4 dargestellt.
In dem Verfahren (17) gemäß der vorliegenden Erfindung werden transfi- zierte ES-Zellen in Blastozysten eines Wirtsorganismus injiziert und in die Leihmutter eingesetzt (V. Papaioannou, R. Johnson, Gene Targeting. A Practical Approach, ed. A.L: Joyner, Oxford UK (1993); T. Doetschman, Transgenis Animal Technology. A Laboratory Handbook, Academic Press Inc. San Diego, USA (1994)). Nach Rückkreuzungen der geborenen und herangewachsenen transgenen Chimäre werden homozygote Tiere intoxi- ziert und auf ihre transgene Genexpression untersucht. Alternativ können in dem Verfahren (17) die Konstrukte ohne Vektorrückrad durch Miokroinjektion in den Vorkern eingebracht werden und zu transgenen Organismen führen (J.W. Gordon et al., Methods Enzymol. 101 : 411-33 (1983); B. Hogan et al., Manipulating the mouse embryo. A laboratory manual, Gold Spring Harbor, NY (1994)). Organismen gemäß der Ausführungsformen (15) und (17) der vorliegenden Erfindung umfasst Säuger einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf Primaten, Nager und Huftiere (wobei es sich - falls humane Organismen unter den betreffenden nationalen oder regionalen Patentvoraussetzungen nicht schutzfähig sind - bei den Säugern um nicht-humane Säuger handelt). Die eukaryotischen Zellen gemäß Ausführungsform (15) umfassen alle möglichen Zellen und Zelllinien aus den obengenannten Säugern.
Die "Arzneimittel" gemäß Ausführungsformen (20) und (21) der vorliegen- den Erfindung (je nach Aufgabenstellung, Anwendung, Art der weiteren funktionellen Nukleinsäuresequenz usw. kann es sich dabei auch um ein Diagnostikum handeln) können - in Abhängigkeit von der Applikationsform - neben den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen/Vektoren noch handelsübliche Zusatzstoffe, Verdünnungsmittel und dergleichen enthal- ten. Die Arzneimittel sind dabei zur Manipulation der Genexpression und/oder der Zellfunktion von Myofibroblaten oder myofibroblastähnlichen Zellen geeignet, d.h. sie sind für die Behandlung und Diagnose einer Vielzahl von Erkrankungen (wie in dem Abschnitt "Hintergrund der Erfindung" ausgeführt) einschließlich Fibroseerkrankungen aufgrund chronischer Or- ganschädigung (wie z.B. der Hepatitis, der Glomerulonephritis, der Myelo- fibrose oder fibrosierenden Lungenerkrankungen) und Tumorerkrankungen einsetzbar.
Die Erfindung wird anhand der folgenden, nicht einschränkenden Beispiele näher erläutert.
Beispiele
Materialien Und Methoden Tabelle 2: Verwendete Primer
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Folgende kommerziell erhältliche Vektoren wurden im Verlauf der Arbeit benutzt:
Als allgemeine Klonierungsvektoren dienten pBluescript-SKII+ (Clontech, Heidelberg) und pGEM3Z (Promega, Mannheim). Bereiche des α-SMA-Pro- moter wurden anschließend in den promoterlosen Lucife rase- Vektor pRL- null (Promega, Mannheim) kloniert. Um die Aktivität erzeugter Konstukte zu vergleichen wurden aus der pRL-Familie zusätzlich pRL-SV40 und pRL- CMV oder auch Vektoren der pGL3-Familie (Promega, Heidelberg) verwendet.
Beispiel 1: Herstellen der α-SMA-5 '-Sequenz
Aus isolierter Ratten-DNA wurde zunächst ein 736bp langes Fragment aus dem 5 '-Promoterbereich des α-SMA-Gens amplifiziert und kloniert. Dazu erfolgte zunächst eine PCR-Amplifikation des Bereichs von -708 bis +28 aus genomischer Ratten-DNA mit den Primer SMA-710F (Hindill) und SMA-30R (EcoRI), die die angegebenen Restriktionsschnittstellen in ihrer Sequenz beinhalten. Nach Restriktion wurde das Fragment (-698 bis +18) in pRL-null durch Ligation inseriert und der resultierende Vektor pRL-SMA- 700 für Untersuchungen an eukaryontischen Zellen in E. coli K12-Stäm- men amplifiziert (siehe auch Sequenz von Fig. 7A).
Beispiel 2: Sichtung der myofibroblastischen Differenzierung durch Re- Porterexpression unter Kontrolle des 5 '- Bereichs des α- SMA-Gens
A. Herstellen von durch α-SMA-5 '-Sequenzbereiche regulierten Reportervektoren: Für die Herstellung der α-SMA-5-Genbereich-Reporterkonstrukte wurden in Reportervektoren unterschiedliche 5 '-Genbereichen des α-SMA inseriert. Das mit den Primern SMA-710-F und SMA-30-R hergestellte Amplifikat (s. o.) von genomischer Ratten-DNA wurde mit EcoRI und Hindill geschnitten und in pBSSK + (Stratagene) kloniert und so pB-SMA- 700 erzeugt. Unter Nutzung der vorhandenen Restriktionschnittstellen im 5'-Bereich des α-SMA-Gens wurden die Fragmente SMA-480 (PstI), SMA- 215 (PvuII) und SMA-125 (Drall) erzeugt, indem sie mit EcoRI und dem spezifischen Restriktionsenzym aus pB-SMA-700 geschnitten wurden und zunächst in pGEM (Promega) oder pB-SK (Stratagene) kloniert wurden. Dabei entstanden folgende Plasmide: pGEM-SMA-480, pGEM-SMA-215 und pB-SMA-125. Mit den Primer SMA-245F (PstI) oder SMA-190F(HindIII) als sense Primer und SMA-30R als antisense Primer wurden spezifische Frag- mente generiert, die anschließend über ihre primer-assoziierten Restriktionsschnittstellen kloniert wurden, dadurch entstanden pGEM-SMA-245 und pB-SMA 190.
Alle Promoterfragmente des α-SMA-Promoter wurden über EcoRI/Hindlll oder EcoRI/SacI in pRL-null kloniert, wodurch 6 unterschiedliche lange Deletionsreporterkonstukte SMA-700 bis SMA-125 erzeugt wurden.
B. Transiente Transfektion: Transfektionen wurden mit dem Transfekti- onsreagenz FuGENE™6 (Röche Molecular Biochemicals, Mannheim) durchgeführt. Pro Ansatz wurde 1,5 μg Plasmid-DNA verwendet, die sich aus 1,2 μg pRL-700 und 0,3μg pGL3-Kontrollplasmid zusammensetzten, was einem DNA/Reagenz-Verhältnis von 1 : 3 entspricht. Für die Tranfektionen wurden ruhende Hepatische Sternzellen (HSC), die durch enzymatische Leberperfusion und Dichtegradientenzentrifugation aus der Rattenleber isoliert wurden (Knock, D. S., de Leeuw, A. M., Exp. Cell. Res., 139, 468 471 (1982)) und nach Kultur auf Plastikschalen (Falcon) in Myofibroblasten differenzierte HSC verwendet (Geerts, A. et al., J. Hepatology, 9, 59 - 68 (1989)).
C. Bestimmung der Reporteraktivität unter Kontrolle von Sequenz A in ru- henden HSC und in myofibroblastischen HSC: Eine Messung der Aktivitäten erfolgte mit dem Dualen-Luciferase Reporter-Assay-System (DLR™, Promega, Mannheim). In den transienten Transfektionen zeigten nur my- • ofibroblastische Zellen eine deutliche Aktivität des pRL-700-Reporterkon- strukt. α-SMA-negative Zellen zeigen Reporteraktivitäten, die unterhalb von einem Prozent der relativen Aktivität lagen. In Myofibroblasten wurde der Reporter um den Faktor 14 induziert. Ruhende Zellen hatten keine Aktivitäten (>1%) (Fig. 1). Damit kann das Konstrukt nach Transfektion zur Sichtung der myofibroblastischen Differenzierung verwendet werden.
Beispiel 3: Reporter unter Kontrolle einer α-SMA 5 '-Sequenz in stabil transfizierten Organismen und Zellen A. Konstruktion eines Reporter-Vektors unter Kontrolle des α-SMA: Aus einem modifizierten GFP-Expressionvektor (pCAGGS) (Ikawa, M. et al., Develop. Growth Differ. 37: 455 - 459 (1995)) mit einem Fragment des Chicken-ß-Actin-Promoter und dem ersten Intron des Chicken-ß-Actins (SEQ ID NO:31) wurde das kardiale Promoterelement durch einen Restriktionsverdau mit SnaBI und Apal exzidiert und mit den jeweiligen α- SMA-5'-Sequenzbereichen (SEQ ID NO:5 oder SEQ ID NO:7) nach Verdau von pRL-700 oder pRL-190 mit Xhol und EcoRI ersetzt. Nach Aufreinigung der Banden über ein Agarosegel wurden die Enden aufgefüllt, um eine Blunt End '-Klonierung durchführen zu können. Um eine Religation des Vektors zu verhindern, wurden bei diesem zusätzlich eine Dephosphory- lierung der 5 '-Enden durchgeführt. Nach einer Ligationsreaktion und Transformation in E. coli wurden positive Klone isoliert, deren Plasmid- DNA aufgereinigt und sequenziert und so der Einbau der α-SMA-5'-Se- quenzbereiche in der richtigen Orientierung überprüft. Die Sequenzierung wurde unter Verwendung des markierten Primers SMA-100 (TM=63°C), der im Bereich -100 des α-SMA-Promoter bindet, durchgeführt. Die Konstrukte sind in Fig. 2b dargestellt.
B. Sichtung und Isolierung von stabilen Transfektanten anhand der α- SMA-5-Sequenz (Sequenzen von Fig. 7A und 7C) kontrollierten Reporteraktivität: Zur Erzeugung von stabilen ES-Transfektanten wurden die beiden GFP-Reporterkonstrukte pSMA-GFP-700 und -190 (Abb.2b) hergestellt und in embryonale murine D3-Stammzellen transfiziert. Die stabil transfizierten Klone wurden mittels ihrer Neomycin (G418)-Resistenz, die im GFP-Konstrukt beinhaltet ist, selektioniert. Dazu wurde 24 Stunden nach der Transfektion zum erstenmal 50 μg/ml Neomycin (10 mg/ml, Gib- coBRL, Eggenstein) zugesetzt.
Zur Differenzierung von Stammzellen wurden diese ohne Feederzellen und ohne Zugabe von LIF in DMEM (440 mg D-Glukose, 110 mg Natriumpyru- vat, L-Glutamin, Sigma) mit 20 % FCS (GibcoBRL, Gaithersburg, MD), lx nicht-essentiellen Aminsäuren (GibcoBRL), lx Penicillin-Streptomycin (GibcoBRL) und 0,1 mM ß-Mercaptoethanol (Sigma) kultiviert. Für den Ansatz von Embryoid Bodies (EB) wurden 2,25 x 105 bzw. 4,25 x 105 Zellen in 1 ml Kulturmedium verdünnt. Jeweils 20 μl der Zellsuspension (450 oder 800 Zellen) wurden als hängende Tropfen kultiviert (Drab, M. et al., FASEB, 11 : 905-911 (1997) und Kolossov, E. et al., J. Cell. Biol., 143: 2045-2056 (1998)).
Die Immunhistolgie an EB, die mit dem pSMA-GFP-190 Promoterfragment transfiziert wurden, zeigte, daß GFP-positive Zellareale nicht immer eine α -SMA-Expression hatten und nicht alle α-SMA-positiven Zellen GFP expri- mierten. GFP-positive Zellen konnten Actinin-exprimierenden kardialen oder skelettalen Muskelzelltypen zugeordnet werden. Caldesmon-positive glatte Muskelzellen wiesen keine GFP-Expression auf.
Im Gegensatz dazu zeigte das pSMA-GFP-700 Konstrukt eine spezifische GFP-Expression, die GFP-Expression konnte dabei sowohl in kardialen und skelettalen Bereichen als auch in caldesmonpositiven glatten Muskelzellen gefunden werden. Das gesichtete Reportermuster unter Kontrolle der Sequenz A in Fig. 5 des α-SMA-Gens entspricht in differenzierten ES-Zel- len demjenigen während der Embryogenese. Daher ist das SMA-700- Fragment (SEQ ID NO:5) eine funktionsfähige Steuerungssequenz für die embryonal und transient SMA-positiven Zellen. Anhand der Reporteraktivität konnten Zellen durch Trypsinierung vereinzelt werden (Fig. 2.a) und getrennt untersucht werden.
Beispiel 4: Herstellen von Mäusen mit transgener Genexpression in myofibroblastischen Zellen
A. Stabile Transfektion des in Fig. 2b/3 gezeigten Konstrukts in ES-Zellen: Zur Herstellung von stabil transfizierten embryonalen Stammzellen wurden die α-SMA-Transgen-Vektoren zunächst durch einen Restriktionsver- dau, dessen Schnittstelle im Ampicillingen liegt, linearisiert und nach einer Aufreinigung in H20 gelöst (1 μg/μl). Anschließend wurde eine Elektropo- ration vorgenommen. Dazu wurden 5 x 106 ES-Zellen in 0,7 ml PBS aufgenommen, resuspendiert und in eine Küvette überführt. Pro Elektropora- tionen wurden 30 μg linearisierte Plasmid-DNA in einem Volumen von 100 μl verwendet. Nach Zugabe der DNA in die Küvette erfolgte zunächst eine Inkubation für 10 min auf Eis, die der Bildung von Präkomplexen diente. Danach wurde mit einem Elektroporator der Firma Biorad (München) bei 500 μF und 0,24 V ein Impuls erzeugt. Zur Regeneration wurden die Zellen zunächst für 20 Minuten auf Eis inkubiert und anschließend auf neo- mycinresistene Feederzellen plattiert.
Die ES- Zellen wurden in Blastozysten einer Wirtsmaus injeziert und in die Leihmutter eingesetzt (V. Papaioannou, R. Johnson, in Gene Targeting. A Practical Approach, ed. A.L: Joyner, Oxford UK (1993); T. Doetschman, Transgenis Animal Technology. A Laboratory Handbook, Academic Press In.c San Diego, USA (1994)). Nach Rückkreuzungen der geborenen und herangewachsenen transgenen Chimäre wurden homozygote Tiere intoxi- ziert und auf ihre transgene Genexpression untersucht. Alternativ können Konstrukte ohne Vektorrückrad (siehe Fig.2b) durch Mi- okroinjektion in den Vorkern eingebracht werden und zu transgenen Mäusen führen (J.W. Gordon et al., Methods Enzymol. 101: 411-33 (1983); B. Hogan et al., in Manipulating the mouse embryo. A laboratory manual, Gold Spring Harbor, NY (1994)).
B: Chronische Leberschädigung durch Intoxikation und myofibroblastische Sichtung
Zur Induktion einer chronischen Leberschädigung wurden zwei wöchentliche Gaben von 4 % igem Tetrachlorkohlenstoff in Mineralöl (6 ml/kg Körpergewicht) den Mäusen intraperitoneal 2, 4, 6 oder 8 Wochen lang verabreicht. Die Mäuse wurden auf eine Pulmonitis und Nephritis sowie auf das Auftreten myofibroblastischer Zellen in der Lunge und der Niere untersucht. Da Tetrachlorkohlenstoff vor allem zu einer Hepatitis führt, wurde in den Lebern transgener GFP-Mäuse die Aktivierung von myofibroblastischen Zellen gesichtet.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz, umfassend
(i) einen oder mehrere funktionelle Bereiche aus dem regulierenden Se- quenzbereich des alpha-Smooth-Musde-Actin-Gens (α-SMA-Gens), der aus Nukleotiden -698 bis +18 des α-SMA-Gens besteht, wobei die Nummerierung auf die in Fig. 5A und 7A gezeigte Sequenz aus rattus norvegi- cus bezogen ist, und
(ii) wenigstens eine weitere funktionelle Nukleinsäuresequenz, die nicht für das natürliche α-SMA kodiert und die mit der Sequenz (i) operativ verknüpft ist zur Herstellung eines Arzneimittels zur Manipulation der Genexpression und/oder der Zellfunktion von transient- oder nach Aktivierung SMA-posi- tiver Zellen, von Myofibroblasten oder myofibroblastähnlichen Zellen.
2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei in der Nukleinsäuresequenz der regulierende Sequenzbereich des α-SMA-Gens
- wenigstens 10, vorzugsweise wenigstens 20 konsekutive Basen aus den Nukleotiden -698 bis +18 des α-SMA-Gens aufweist und/oder - von Säugern, insbesondere von Primaten oder Nagern, oder Vögeln stammt und besonders bevorzugt von Ratte, Maus, Mensch oder Huhn stammt.
3. Verwendung nach Anspruch 2, wobei der regulierende Sequenzbereich von der Ratte stammt und die Nukleinsäuresequenz vorzugsweise einen oder mehrere funktionelle Bereiche aus der in Fig. 5A gezeigten Sequenz (SEQ ID NO: l), insbesondere aus der in Fig. 7A gezeigten Sequenz (SEQ ID NO: 5), umfasst.
4. Verwendung nach Anspruch 3, wobei der funktionelle Bereich
(i) eine transkriptionsaktivierende Nukleinsäuresequenz ist und insbesondere aus der in Fig. 7C gezeigten Sequenz (SEQ ID NO:7) stammt, und wobei vorzugsweise die transkriptionsaktivierende Sequenz wenigstens 10, bevorzugt wenigstens 40 und besonders bevorzugt wenigstens 60 konsekutive Basen aus der in Fig. 7C gezeigten Sequenz aufweist und besonders bevorzugt die in Fig. 7B oder 7C gezeigte Sequenz (SEQ ID NOs:6 oder 7) umfasst; oder
(ii) eine zelltypspezifische Nukleinsäuresequenz ist und insbesondere aus der Sequenz -698 bis -190 der Fig. 7A (Nukleotide 1 bis 509 von SEQ ID NO:5), besonders bevorzugt aus der Sequenz -698 bis -215 der Fig. 7A (Nukleotide 1 bis 484 von SEQ ID NO:5) oder aus der Sequenz der Fig. 71 (SEQ ID NO: 13) stammt, und wobei vorzugsweise die zellspezifische Sequenz wenigstens 25, bevorzugt wenigstens 35 konsekutive Basen aus der Sequenz -698 bis -190 der Fig. 7A aufweist und besonders bevorzugt die in Fig. 71 oder 7M (SEQ ID NO: 13 oder 17) gezeigte Sequenz umfasst.
5. Verwendung nach Anspruch 3 oder 4, wobei die Nukleinsäuresequenz sowohl eine transkriptionsaktivierende als auch eine zelltypspezifische Nukleinsäuresequenz umfasst und/oder eine der in SEQ ID NOs:5 bis 17 gezeigten Sequenzen aufweist.
6. Verwendung nach Anspruch 2,. wobei der regulierende Sequenzbereich von der Maus stammt und die Nukleinsäuresequenz vorzugsweise einen oder mehrere funktionelle Bereiche der in Fig. 5B gezeigten Sequenz (SEQ ID NO:2) insbesondere aus der in SEQ ID NO: 18 gezeigten Sequenz aufweist.
7. Verwendung nach Anspruch 6, wobei der funktionelle Bereich (a) eine transkriptionsaktivierende Nukleinsäuresequenz ist und insbesondere aus den Nukleotiden 490 bis 697 der in SEQ ID NO: 18 gezeigten Sequenz stammt und/oder (b) eine zelltypspezifische Nukleinsäuresequenz ist und insbesondere aus den Nukleotiden 1 bis 489 der in SEQ ID NO: 18 gezeigten Sequenz stammt.
8. Verwendung nach Anspruch 2, wobei der regulierende Sequenzbereich vom Menschen stammt und die Nukleinsäuresequenz vorzugsweise einen oder mehrere funktionelle Bereiche der in Fig. 5C gezeigten Sequenz (SEQ ID NO:3) insbesondere aus der in SEQ ID NO: 19 gezeigten Sequenz aufweist.
9. Verwendung nach Anspruch 8, wobei der funktionelle Bereich
(a) eine transkriptionsaktivierende Nukleinsäuresequenz ist und insbesondere aus den Nukleotiden 513 bis 715 der in SEQ ID NO: 19 gezeigten Sequenz stammt und/oder
(b) eine zelltypspezifische Nukleinsäuresequenz ist und insbesondere aus den Nukleotiden 1 bis 512 der in SEQ ID NO: 19 gezeigten Sequenz stammt.
10. Verwendung nach Anspruch 2, wobei der regulierende Sequenzbereich vom Huhn stammt und die Nukleinsäuresequenz vorzugsweise einen oder mehrere funktionelle Bereiche der in Fig. 5D gezeigten Sequenz (SEQ ID NO:4) insbesondere aus der in SEQ ID NO:20 gezeigten Sequenz aufweist.
11. Verwendung nach Anspruch 10,, wobei der funktionelle Bereich
(a) eine transkriptionsaktivierende Nukleinsäuresequenz ist und insbesondere aus den Nukleotiden 497 bis 699 der in SEQ ID NO:20 gezeigten Sequenz stammt und/oder
(b) eine zelltypspezifische Nukleinsäuresequenz ist und insbesondere aus den Nukleotiden 1 bis 496 der in SEQ ID NO:20 gezeigten Sequenz stammt.
12. Verwendung gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 11, wobei die weitere funktionelle Nukleinsäuresequenz eine peptid- oder proteinkondierende DNA-Sequenz, insbesondere ausgewählt ist aus Reportergenen, Sequenzen, die für pharmakologisch aktive Proteine kodieren, und regulatorische DNA-Sequenzen, oder eine funktionelle RNA-kodierende Sequenz, insbesondere ein Ribozym, ist.
13. Verfahren zur Manipulation der Genexpression und/oder der Zellfunktion von Myofibroblasten oder myofibroblastähnlichen Zellen in Organismen oder Organen, umfassend das Einbringen von Nukleinsäuresequen- zen, wie in Ansprüchen 1 bis 12 definiert, oder von Vektoren, in die solche Nukleinsäuresequenzen inseriert sind, in die Organismen oder Organe.
14. Verfahren nach Anspruch 13, das ein in vivo oder in vitro Verfahren ist und wobei insbesondere (i) das Einbringen in die Organismen oder Organe unter Nutzung transge- ner oder knock-out /-in Technologie erfolgt, oder (ii) das Verfahren eine gentherapeutischer Fusionsvektorapplikation ist.
15. Nukleinsäuresequenz, umfassend (i) einen oder mehrere funktionelle Bereiche aus dem regulierenden Sequenzbereich des alpha-Smooth-Musde-Actin-Gens (α-SMA-Gens), der aus Nukleotiden -698 bis +18 des α-SMA-Gens besteht, wobei die Nummerierung auf die in Fig. 5A und 7A gezeigte Sequenz aus rattus norvegi- cus bezogen ist, und (ii) wenigstens eine weitere funktionölle Nukleinsäuresequenz, die mit der Sequenz (i) operativ verknüpft ist und die nicht für das natürliche α-SMA kodiert und ausgewählt ist aus DNA-Sequenzen, die für pharmakologisch aktive Proteine kodieren, regulatorische DNA-Sequenzen und funktionellen RNA-kodierenden Sequenzen.
16. Nukleinsäureseqenz nach Anspruch 15, die wie in denAnsprüchen 2 bis 11 definiert ist.
17. Transkriptionsaktivierende Nukleinsäuresequenzen oder zelltypische Nukleinsäuresequenzen, wie in Ansprüchen 4, 7, 9, oder 11 definiert.
18. Vektor, umfassend eine Nukleinsäuresequenz, wie in Anspruch 17 definiert, oder in dem eine Nukleinsäuresequenz, wie in Anspruch 15 oder 16 definiert, inseriert ist.
19. Eukaryontische Zellen oder Organismen, die mit einer Nukleinsäuresequenz, wie in Anspruch 15, 16 oder 17 definiert, oder einem Vektor, wie in Anspruch 18 definiert, transient oder stabil transfiziert, transformiert oder infiziert sind, und die vorzugsweise (i) einen Reporter unter Kontrolle der regulatorischen Sequenzen des α- SMA-Gens exprimieren; oder
(ii) ein pharmakologisch aktives Protein, eine regulatorische DNA-Sequenz oder eine funktionelle RNA-Sequenz unter Kontrolle des α-SMA-Gens exprimieren oder aufweisen.
20. Verfahren zur Herstellung der eukaryontischen Zellen, wie in Anspruch 19 definiert, umfassend das Transfizieren, Transformieren oder Infizieren von Ausgangszellen mit den Nukleinsäuresquenzen, wie in Anspruch 15, 16 oder 17 definiert, oder mit Vektoren, wie in Anspruch 18 definiert.
21. Verfahren zur Herstellung der Organismen, wie in Anspruch 19 definiert, umfassend das Injizieren von ES-Zellen, die mit den Nukleinsäuresquenzen, wie in Anspruch 15, 16 oder 17 definiert, oder mit Vektoren, wie in Anspruch 18 definiert, transfiziert sind, in Blastozysten der Organismen und Einsetzen in die Leihmutter.
22. Verfahren zur Manipulation der Genexpression und/oder der Zellfunktion von Glatten Muskelzellen oder Myofibroblasten in Organismen oder Organen, umfassend das Einbringen von Nukleinsäuresequenzen, wie in Anspruch 15, 16 oder 17 definiert, oder Vektoren, wie in Anspruch 18 definiert, in die Organismen oder Organe,
(i) wobei das Einbringen in die Organismen oder Organe vorzugsweise unter Nutzung transgener oder knock-out /-in Technologie erfolgt, oder (ii) wobei das Verfahren vorzugsweise eine gentherapeutischer Fusionsvektorapplikation ist.
23. Arzneimittel, enthaltend eine Nukleinsäuresequenz, wie in Ansprüchen 1 bis 12, 15, 16 oder 17 definiert, oder einen Vektor, wie in Anspruch 18 definiert, wobei das Arzneimittel vorzugsweise zur Manipulation der Genexpression und/oder der Zellfunktion von glatten Muskelzellen oder Myofibroblasten in Organismen oder Organen geeignet ist.
24. Verwendung eines funktionellen Bereichs aus dem regulierenden Sequenzbereich des α-SMA-Gens zur myofibroblastischen und differenzierungsabhängigen Reporterexpression und zur myofibroblastischen und differenzierungsabhängigen Genveränderung, wobei vorzugsweise der funktionelle Bereich des α-SMA-Gens (i) eine Nukleinsäuresequenz, wie in Anspruch 17 definiert, ist;
(ii) eine Nukleinsäuresequenz, wie in Ansprüchen 1 bis 12 oder 15 bis 16 definiert, ist und/oder
(iii) in einem Vektor , wie in Anspruch 18 definiert, vorliegt.
25. Verfahren zur Isolierung oder zur Sichtung von transienten oder nach Aktivierung SMA-positiven Zellen, von Myofibroblasten oder myofibroblastähnlichen Zellen aus einem Zellgemisch, einer Zellpopulation, einem Zellaggregat oder einem Organismus, umfassend
- die Expression eines Reportergens in einer eukaryontischen Zelle oder ein Organismus, die/der einen Reporter unter Kontrolle der regulatorischen Sequenzen des α-SMA-Gens, wie in Ansprüchen 1 bis 12 oder 15 bis 16 definiert, exprimiert und
- die Detektion des Reporters.
26 Verwendung der regulatorischen Sequenzen des α-SMA-Gens, wie in Ansprüchen 1 bis 12 oder 15 bis 16 definiert zur Herstellung eines Di- agnostikums zur Isolierung oder zur Sichtung von transienten oder nach Aktivierung SMA-positiven Zellen, von Myofibroblasten oder myofibroblastähnlichen Zellen aus einem Zellgemisch, einer Zellpopulation, einem Zellaggregat oder einem Organismus
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2000024254A1 (en) * 1998-10-23 2000-05-04 University Of Virginia Patent Foundation Compositions and methods for modulating expression within smooth muscle cells

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005021752A1 (ja) * 2003-08-29 2005-03-10 Takara Bio Inc. 機能的ヌクレオチド分子の検索方法

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