WO2002009793A1 - Vorrichtung zur behandlung von immunerkrankungen - Google Patents

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Definitions

  • the invention relates to a device for the treatment of immune diseases and the use of substances to which autoantibodies bind, such as e.g. of antigens, for the production of an agent for the treatment of immune diseases and a kit containing such agents.
  • the immune system's task is to ward off attacks on the organism and to fight foreign objects that have penetrated. It must not only differentiate between dangerous and harmless foreign bodies, but also be able to recognize the body's own substances. Dangerous attacks on the organism are, for example, the penetration of microorganisms, whereas the penetration of food antigens into the bloodstream when eating or the inhalation of bee pollen is harmless. In the defense, the destruction of foreign cell material is e.g. in the case of a parasitic infestation, as desirable as the destruction of the body's own malignant cells, whereas the attack on healthy body's own tissue, such as in autoimmune diseases, is undesirable. This means that the immune system has regulatory processes that prevent destructive self-reactivity. This ability is called "tolerance". If this tolerance is lost, immune diseases develop.
  • Immune diseases based on an unwanted immune response or response are playing an increasingly common role. For example, it is known that the frequency of immune reactions, which are directed against harmless foreign bodies such as grass pollen and animal hair, but also against food components, increases and leads to sensitization and thus to an allergy of an organism, which lead to serious diseases if sufficiently exposed.
  • Another Re unwanted immune disease is the rejection reaction of the host versus graft type or in organ transplants, which are recognized as foreign by the body's immune system and are attacked and destroyed accordingly like a bacterium.
  • autoimmune diseases Another important undesirable malfunction of the immune system are the so-called autoimmune diseases.
  • the body's own tissue or body's own cell substances or cells are wrongly regarded as foreign and are combated accordingly.
  • the development of such autoimmune diseases is diverse. They can be triggered, for example, by intracellular substances entering the bloodstream as a result of injuries. Since these substances were previously hidden or enclosed in a cell, their antigens or epitopes could not be known to the immune system and could not be recognized as the body's own. They are therefore considered foreign to the body. For this reason, they are able to trigger an immune response.
  • An example of such an autoimmune disease is sympathetic ophthalmia, in which a traumatic event releases an endogenous substance or an antigen that is normally enclosed in the eye.
  • autoimmune diseases Another cause for the development of autoimmune diseases is, for example, that antigens recognized by the immune system as the body's own, so-called “own” antigens, are changed by chemical, physical or biological effects and are therefore no longer regarded as “own” but as “foreign” In this way, they become immunogenic and can trigger an immune attack on your own body. It is known, for example, that some chemicals bind to the body's own proteins and thus make them immunogenic, as can be seen, for example, in contact dermatitis. In so-called sun allergy, skin proteins are changed by ultraviolet light so that they are no longer recognized by the immune system and trigger an immune response, making the patient allergic.
  • immunosuppressive substances such as anti-inflammatory glucocorticoids, e.g. B. cortisone, non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs), which intervene in the prostaglandin metabolism, immunosuppressive cytochins such as interleukin 10, antimetabolites such as metotrexate, cytostatics such as cyclophosphamide or inhibitors of inflammation-stimulating cytokines such as cyclosporin A or mycophenolinol, also mycophenolunol.
  • NSAIDs non-steroidal anti-inflammatory drugs
  • WO-97/14964 describes a procedure according to which the immune complexes circulating in it are isolated from the patient's blood using conventional methods and these are separated into their antigen and antibody components by methods known per se. The antigens and antibodies thus obtained are then covalently coupled individually or as a mixture to suitable carriers and used as an immune absorber for precisely those patients from whom the immune complexes have been isolated. In this way, specifically acting immune absorbers for patients suffering from autoimmune diseases are to be produced.
  • the aim of the invention is therefore to overcome the disadvantage of the prior art and to provide a means and a device with which undesirable immune diseases can be treated without completely suppressing the patient's immune system.
  • the agent should be quick and inexpensive to manufacture, easy to store and quick to assemble, ready to use, and moreover, it should also be quickly adaptable to the patient's immunological needs on site.
  • the invention is also intended to treat particularly fatal immune diseases such as sprue, celiac disease, Goodpasture syndrome, myasthenia gravis, Wegner's granulomatosis, asthma and heart diseases, IgE-mediated allergies, pemphigus vulgaris, autoimmune hepatitis, Rasmussen's encephalitis, Schnitz / or enable chronic urticaria.
  • the invention also aims to preventively prevent the development of immune diseases and / or to reduce or to avoid the consequential damage of such diseases.
  • the invention thus relates to a device for the treatment of immune diseases which has substances immobilized on a solid phase which bind gressive immunoglobulins, preferably selectively.
  • substances are, in particular, antigens which trigger the immune disease.
  • the blood or its aqueous constituents are washed around the carrier, the pathogenic immunoglobulins being removed from the blood.
  • Those immunocompetent cells and precursor cells which form the aggressive antibodies, in particular B cells are preferably also removed.
  • This effect on which the invention is based is all the more surprising because it was to be expected that the exposure of antigens to the immune system of the blood should increase the immune response, ie the formation and post-production of immunoglobulins directed against it (so-called booster Effect).
  • the aggressive immune response can be reduced or even down-regulated in a targeted manner if the undesired aggressive antibodies or immunoglobulins are selectively removed.
  • This selective removal is preferably achieved according to the invention by means of an antigen directed against the aggressive antibodies, against which the aggressive immunoglobulin is directed.
  • these are in particular the foreign HLA or MHC antigens.
  • these are the antigens which trigger autoimmunity.
  • the antigens bound in the device according to the invention are immobilized on a solid phase by methods known to the person skilled in the art.
  • the immunoglobulin-binding substances can be bound to the solid phase either directly or indirectly. They are preferably connected to one another by means of a non-covalent coupling consisting of at least 2 complementary coupling members.
  • the coupling member attached to the immobilized agent is referred to as the anchor and the complementary coupling member bound to the solid phase is referred to as the counter anchor. Examples include only immobilization using cyanogen bromide or fixation using glutaraldehyde (direct binding), and biotinylation and the formation of avidin or streptavidin complexes.
  • the antigens are bound to the surface or solid phase by means of a spacer, ie an arm or spacer.
  • a spacer ie an arm or spacer.
  • preferred spacers allow a distance of the antigen from the solid surface or the solid phase of preferably at least 5 A, in particular at least 10 ⁇ , with at least 15 A and in particular at least 20 ⁇ being particularly preferred.
  • Spacer arms which allow a distance of at least 28 A, in particular at least 30 A, are very particularly preferred.
  • the spacers are expediently constructed from a long carbon chain, but they are preferably constructed from repetitive units of smaller hydrocarbon chains, which in particular have heteroatoms. Preferred repetitive units are in particular C 2 -C 8 units, with C to C 6 being particularly preferred.
  • the individual units are preferably linked to one another via the heteroatoms.
  • Preferred heteroatoms are nitrogen, oxygen and sulfur atoms.
  • the repetitive units are preferably connected to one another via amino acid functions.
  • the spacer arms preferably have different reactive groups at their two ends, one group of which reacts with the antigen to be bound, ie to be immobilized, and the other binds to the surface and, where appropriate, reacts there with it.
  • Preferred functional groups which react with the antigens are, in particular, N-hydroxysuccinimide, sulfo-N-hydroxysuccinimide groups which react, for example, with a primary amine to form an amide group with the antigen or maleimide groups, for example with a free sulfhydryl group of an antigen to form a thioether bridge.
  • haloacetyl especially an iodoacetyl group, which also reacts with sulfhydryl to form a thioether bridge.
  • Other important reactive reagents are, for example, hydrazide groups, which react with an oxidized carbohydrate group, for example an aldehyde group to form a hydrazone bond, further important groups are, for example, photoactivatable azido groups, for example aromatic azido groups, which contain nucleic acids and protein carbohydrates react with a primary amine to form a ring expansion.
  • amino groups are used which react to form a free carboxylic acid or carboxy group to form an amido bond.
  • Many such reagents are commercially available. In the case of the aforementioned functional reagents, the reagents containing N-hydroxysuccinimide and the maleimide containing reagents and the amino groups and the photoactivatable azido groups are preferred.
  • the spacer arm has an anchor group which, in particular non-covalently, couples with a counter anchor immobilized on the solid surface.
  • the anchor on the spacer arm is preferably arranged at the point opposite the binding point of the spacer with the antigen.
  • Anchors preferred according to the invention are biotin, thioredoxin, and / or polyhistidine tags, in particular those with 4 to 6 histidine residues adjacent to one another.
  • Preferred counter anchors are avidin and in particular streptavidin as counter anchor to biotin, a chelato-immobilized metal ion, in particular nickel and / or cobalt, expediently as counter anchor to polyhistidine tags, and an antibody directed against the anchor.
  • Such antibodies are easy to produce and in some cases also as monoclonal antibodies e.g. from ACC-2207 (antipentahistidyl antibody) commercially available from Quiagen.
  • Such anchors and spacers containing reactive groups can be readily produced by a person skilled in the art and are also commercially available, for example.
  • Pierce, Rockford, IL, 61105, USA sells them under the name EZ-Link TM and under the name Sulfo-LC-SPDP, LC-SPDP and SPDP. Fissile crosslinking reagents are also commercially available under this name.
  • the procedure according to the invention makes it possible to provide the surface of the solid phase with the counter-anchor first, even under reaction-hostile protein and nuclein conditions. Since it is not necessary to pay attention to biologically compatible reaction conditions, very high densities of counter anchors can also be achieved on the surface of the solid phase, as was previously not possible with the direct immobilization of antigens. After completion of the solid phase thus provided with the counter anchor, it can be loaded with the antigen under physiological conditions using its anchor day. In this way it is possible to achieve loading densities of> 0.01 pmol / cm 2 > 0.1 pmol / cm 2 and in particular> 1 pmol / cm 2 . Even densities of> 5 pmol / cm 2 can be easily achieved.
  • densities of> 10 nmol / cm 3 , in particular> 20 nmol / cm 3 and beyond, can be produced, for example, in the case of beads with a diameter of 40-90 ⁇ m.
  • streptavidin The biotinylin system, which can bind up to four biotinylin anchors, enables exceptionally high loading densities. In this way, small, highly effective immune absorbers can be produced.
  • the procedure according to the invention also makes it possible to produce the required immune absorbers on site, ie. H. For example, in a clinic or other therapy center to manufacture yourself if necessary. Since it is no longer necessary to store the entire required devices, but only the non-specific solid phases provided with the anchor, i. H. Columns, dialysis tubes, hollow fibers etc. as well as the respective antigens provided with the spacer arm and anchor, it is possible, if necessary, to immediately produce a specific immune absorber for the particular disease required by producing a solution of the antigen provided with spacer and anchor and in contact with the surface of the solid phase. Since the respective antigens can be stored for a long time, for example in the lyophilized state, no large, voluminous storage is necessary in order to provide a large number of absorbers for various diseases.
  • Another advantage is that it is designed by providing a general prefabricated absorber that can be quickly prepared for a variety of different diseases.
  • the procedure according to the invention thus makes it possible to bind the antigens in their native physiological conformation without being sterically hindered by the immobilization on the surface, as a result of which almost all epitopes of the antigen are accessible to the antibodies to be removed or to the cells producing them .
  • the anchor systems used according to the invention bind the antigen to the absorber with a high affinity, thereby preventing detachment or bleeding.
  • the binding of the antigen according to the invention to the column enables washing of the bound autoagressive substances after use, for. B. by using high salt solutions and / or changes in pH. In this way, the respective immune absorbers can be used multiple times, i. H. be recycled.
  • carrier materials are all substances to which antigens or components thereof can be bound.
  • Usual carrier materials to which the antigens are bound are also known from the manufacture of diagnostic test kits and for the manufacture of dialysis tubes. In principle, they are not subject to any restrictions, they may only be non-toxic and not themselves be allergic.
  • Suitable carrier materials are, for example, silica gels as used for packed columns, latex particles, in particular non-allergenic latex particles, glass beads, gel matrices and hollow body matrices such as filter materials and dialysis tubes.
  • particles made of polystyrenes, polyvinyl alcohols, Sepharose etc. can also be used.
  • the solid phases preferably have a large surface area around which the blood serum or an aqueous solution of components thereof flows, so that a maximum contact area between antigens and the immunoglobulins circulating in the blood is created.
  • antigens means all substances against which aggressive antibodies are directed. These are usually proteins, nucleic acids, and complexes of these two, possibly also with membrane components. This includes not only the complete antigens, but also parts or fragments of them that have bindable epitopes, such as peptides, oligopeptides and oligonucleotides, which can possibly also be produced artificially.
  • Preferred antigens to be immobilized according to the invention are double-stranded DNA, single-stranded DNA, nucleosomes, centromeres (kinetochore antigen), Jo-1 (histidyl synthetase), SCL-70 (topoisomerase I), PCNA (proliferating cell nuclear antigen) , SS-B / La, SS-A (Ro), U1-RNP, SN antigen (small nuclear antigen), histones, PR3 (proteinase 3), F c fragment of immunoglobulin, citrulline, phospholipids such as cardiolipin, ANA , ribosomal protein, RA 33, PM-Scl, ANCA, GBM (basement membrane of the kidney glomeruli), acetylcholine receptors, insulin receptors, antibody-sensitized platelets.
  • centromeres kinetochore antigen
  • Jo-1 histidyl synthetase
  • antigens are, for example, antigens of sympathetic ophthalmia and B5 for Behcet's disease, B 27 for ankylosing spondylitis, Reiter's disease, and acute anterior uveitis, B 35 for subacute thyroiditis, Cw 6 for psoriasis vulgaris, DR 3 and possibly DR 4 for dermatitis herpetiformis, celiac disease, and Graves' disease, type I diabetes mellitus, myasthenia gravis, systemic lupus erythematosus (SLE), idiopathic membranous nephropathy; DR 2 for narcolepsy and multiple sclerosis, DR 4 for rheumatoid arthritis, and DR 5 for Hashimoto's thyroiditis and pernicious anemia and DRw8 for juvenile chronic arthritis; as well as the class of the spectrins, in particular ⁇ - and ⁇ -fodrin.
  • the procedure according to the invention it is also possible to immobilize the respective antigens which trigger the autoaggressive reaction. It has been shown that these do not occur in the serum, particularly in the case of particularly fatal diseases.
  • the respective main antigens such as the C-terminal end of the ⁇ -3 chain of the Isolate type IV collagen of the glomerular basement membrane separately and provide it with the appropriate spacer arm having an anchor. As already mentioned, this can also be done recombinantly.
  • membrane-bound antigens of this type into phospholipid vesicle membranes and then to bind them to the surface of the absorber in the manner described above.
  • Such important antigens that are identical for most affected patients are in particular transglutaminase and gliadin for celiac disease or sprue, and the aforementioned III collagen, in particular its C-terminal end for Goodpasture syndrome.
  • Further special antigens to be used according to the invention are, for example, the acetylcholine receptor and the ⁇ -2-adrenergic receptor for the treatment of myasthenia gravis and the proteinase 3 which occurs in the ⁇ -granules of the neutrophilic granulocytes for the treatment of Wegner's granulomatosis.
  • ⁇ -adrenergic receptors in particular ⁇ 1 and ⁇ 2 receptors
  • IgE receptors can be used according to the invention as antigens for severe cases of IgE-mediated allergies.
  • Another antigen of the desmosome in particular desmocholine, which is special and not present in the serum and which is used for the treatment of pemphigus vulgaris.
  • Further special antigens to be used according to the invention are the asialoglycoprotein receptor for autoimmune hepatis, the glutamate receptor for Rasmussen encephalitis, the interleukin-1- ⁇ receptor for Schnitzler's syndrome, and the IgE receptor for chronic urticaria.
  • the autoantibodies involved in the formation of tissue-damaging immune complexes are removed, but also the removal of such autoantibodies which can cause tissue damage per se.
  • the application thus affects more diseases and can also be used as a preventive measure that removes the autoantibodies before the formation of immune complexes.
  • not only real autoantibodies, but also other pathogenic antibodies can be removed, such as B. Allergy Antibodies.
  • Such a device according to the invention is now connected to a blood collection point arranged on a patient via a feed line analogous to dialysis. the blood being drawn from this and passed over the device according to the invention.
  • the blood being drawn from this and passed over the device according to the invention.
  • the immunoglobulins which cause illness, but also these producing cells and precursors thereof are preferably bound to the immobilized antigens and the blood is freed of them.
  • this "liberated” or “cleaned” blood is returned to the patient via a drain by means of a blood return point.
  • the removal, filtration and recycling are preferably carried out continuously.
  • Blood sampling or blood return point are devices such as are known, for example, from dialysis or from blood donation.
  • the device according to the invention it is not only possible to remove immunoglobulins, but it is also possible to selectively remove immunocompetent cells, which are responsible for the excessive immune reaction, without depriving the patient of his remaining protection, which is necessary for sufficient immunity to pathogens ,
  • immunocompetent cells which are responsible for the excessive immune reaction
  • IMS magnet
  • Such particles are available, for example, from Bekton-Dickensen under the name Dynabeads.
  • Another possibility is, for example, to provide the antigens with a cytometrically recognizable marker, in particular fluorescent marker, and then to remove corresponding unwanted immune cells by means of flow cytometry.
  • a cytometrically recognizable marker in particular fluorescent marker
  • the invention thus also relates to a therapy kit which device according to the invention or the agent produced according to the invention together with an immunosuppressant.
  • the invention it is also possible to connect a plurality of devices having different antigens in series and to remove a number of different aggressive immunoglobulins in this way. This can be done, for example, by filling the antigens immobilized on particles in columns and connecting several columns coated with different antigens in series. In principle, this is also possible with appropriate dialysis tubes or with filter matrices or hollow fibers.
  • the diseases to be treated with the device according to the invention are in particular all allergic and autoimmune diseases in which antibodies play a role relevant to the disease, i.e. have a pathogenic effect.
  • diseases include, in particular, systemic lupus ery-thematodes (SLE), Sjogren's syndrome, scleroderma, polymyositis, dermatomyositis and mixed collagen disease (MCTD) as well as rheumatoid arthritis, primary vasculitis, and antiphospholipid syndrome, gypsum , Polychondritis, uveitis, Behcet's disease and especially the Goodpasture syndrome (AK against renal basal membrane), as well as myasthenia (myasthenia gravis), multiple sclerosis, cardiomyopathy, heart failure and pemphigus vulgaris.
  • SLE systemic lupus ery-thematodes
  • MCTD mixed collagen disease
  • gypsum Polychondritis, uveitis, Be
  • purified proteinase 3 (PR 3) is concentrated to about 10 mg / ml by means of ultrafiltration over a 10 kDa membrane (made of polyether sulfone or regenerated cellulose).
  • concentration is estimated by means of the absorbance at 280 nm by dilution of 1: 100 in PBS, using pure PBS as the basic value.
  • the measured extinction value is to be multiplied by 100, a value of 1 corresponding to approximately 1 mg / l protein.
  • the solution thus concentrated is buffered on a 5 ml hightrap desalination column (Pharmacia, Sweden) in PBS, with a maximum of 1 ml sample per run being charged.
  • the protein solution thus obtained is contained with a 10 mg / ml
  • the reagent is added to the protein in about 4-fold excess and incubated on ice for two hours.
  • Unreacted reagent is separated by means of gel filtration, as previously described for the buffering.
  • the biotinylated antigen obtained in this way can be stored with 0.1% sodium azide at 4 ° C. and soon processed further or lyophilized for longer storage.
  • the PR3 antigen thus obtained which was provided with a biotin anchor, was placed on a column containing polymethacrylate beads, which are coated with monomeric avidin.
  • avidin-coated polymethacrylate beads are available, for example, under the name Softlink TM from Promega, Wl, USA.
  • the material is incubated for 15 minutes at room temperature with 5 mM biotin in order to suppress non-specific bindings.
  • the column was eluted with 10% acetic acid and then with PBS.
  • the biotinylated PR3 antigen was then loaded onto the column and then washed.
  • the column thus obtained was charged with 500 ml of plasma from a Wegner patient.
  • the antibody titer of the plasma showed an OD of 1.9 in an anti-PR3 ELISA test from Aesku.lab Diagnostika before application to the column. After passing through this column (10 ml column) it still showed an OD of 0.15. This means that with a single pass on such a tiny column, 92.1% of the disease-causing agent has already been removed.

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Abstract

Es wird eine Vorrichtung zur Behandlung von Immunerkrankungen beschrieben, die eine mit einer an einem menschlichen Körper angeordneten Blutentnahmestelle verbindbare Zuleitung für Blut und/oder wässrigen Bestandteilen davon, eine mit einer an dem menschlichen Körper angeordneten Blutrückführstelle verbindbare Ableitung sowie einen zwischen Zuleitung und Ableitung angeordneten, eine Oberfläche aufweisenden Träger, umfasst. Die Vorrichtung zeichnet sich dadurch aus, dass die Oberfläche des Trägers immobilisierte Antigene aufweist, welche aggressive Immunglobuline selektiv binden. Die immobilisierten Antigene, die vorzugsweise nicht im Serum vorliegen, sind insbesondere mittels einer nicht kovalenten Kupplung an dem Träger gebunden.

Description

Beschreibung
VORRICHTUNG ZUR BEHANDLUNG VON IMMUNERKRANKUNGEN
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Behandlung von Immunerkrankungen sowie die Verwendung von Substanzen, an die Autoantikörper binden, wie z.B. von Antige- nen, zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung von Immunerkrankungen sowie einen Kit, der solche Mittel enthält.
Das Immunsystem hat zur Aufgabe, Angriffe auf den Organismus abzuwehren und eingedrungene Fremdkörper zu bekämpfen. Dabei muss es nicht nur zwischen gefährlichen und ungefährlichen Fremdkörpern unterscheiden, sondern auch körpereigene Substanzen erkennen können. Gefährliche Angriffe auf den Organismus sind beispielsweise das Eindringen von Mikroorganismen, wogegen das Eindringen von Nahrungsmittel-Antigenen in die Blutbahn bei der Nahrungsaufnahme oder auch das Einatmen von Blütenpollen ungefährlich ist. Bei der Abwehr ist das Zerstören von fremdem Zellmaterial z.B. bei einem parasitären Befall ebenso erwünscht, wie das Zerstören von körpereigenen malignen Zellen, wogegen der Angriff auf gesundes körpereigenes Gewebe wie etwa bei den Autoimmunerkrankungen allerdings unerwünscht ist. Dies bedeutet, dass das Immunsystem über Regulationsprozesse verfügt, durch die eine zerstörerische Selbstreaktivität vermieden wird. Diese Fähigkeit wird als "Toleranz" bezeichnet, geht diese Toleranz verloren, entstehen Immunerkrankungen.
Immunerkrankungen auf der Basis einer unerwünschten Immunreaktion bzw. -antwort spielen eine immer häufigere Rolle. So ist es beispielsweise bekannt, dass die Häufigkeit von Immunreaktionen zunimmt, die gegen harmlose Fremdkörper wie Gräserpollen und Tierhaare, aber auch gegen Nahrungsbestandteile gerichtet sind und zu einer Sensibilisierung und damit zu einer Allergisierung eines Organismus führen, die bei ausreichender Exposition zu ernstzunehmenden Erkrankungen führen. Eine weite- re unerwünschte Immunerkrankung ist die Abstoßungsreaktion vom Host-versus- Graft-Typ bzw. bei Organtransplantaten, die vom körpereigenen Immunsystem als fremd erkannt und dementsprechend analog einem Bakterium angegriffen und vernichtet werden.
Eine weitere wichtige unerwünschte Fehlleistung des Immunsystems sind die sogenannten Autoimmunerkrankungen. Dabei werden körpereigenes Gewebe bzw. körpereigene Zellsubstanzen oder Zellen fälschlicherweise als fremd angesehen und dementsprechend bekämpft. Die Entstehung solcher Autoimmunerkrankungen ist vielfältig. Sie können beispielsweise dadurch ausgelöst werden, dass durch Verletzungen intrazelluläre Substanzen in die Blutbahn gelangen. Da diese Substanzen vorher versteckt oder in einer Zelle eingeschlossen waren, konnten deren Antigene bzw. Epitope vom Immunsystem nicht kennengelernt und auch nicht als körpereigen erkannt werden. Sie werden daher als körperfremd angesehen. Aus diesem Grunde sind sie in der Lage, eine Immunantwort auszulösen. Ein Beispiel für eine solche Autoimmunerkrankung ist die sympathische Ophthalmie, bei der durch ein traumatisches Ereignis eine körpereigene Substanz bzw. ein Antigen freigesetzt wird, welches normalerweise im Auge eingeschlossen ist.
Eine weitere Ursache für die Entstehung von Autoimmunerkrankungen besteht beispielsweise darin, dass vom Immunsystem als körpereigen erkannte Antigene, sogenannte "eigen"-Antigene durch chemische, physikalische oder biologische Einwirkung verändert werden und damit nicht mehr als "eigen", sondern als "fremd" angesehen werden, Auf diese Weise werden sie immunogen und können einen Immunangriff auf den eigenen Körper auslösen. So ist es bekannt, dass manche Chemikalien an körpereigene Proteine binden und diese dadurch immunogen machen, wie dies beispielsweise bei der Kontaktdermatitis zu beobachten ist. Bei der sogenannten Sonnenallergie werden durch ultraviolettes Licht Hautproteine so verändert, dass sie vom Immunsystem nicht mehr als eigen erkannt werden und eine Immunantwort auslösen, so dass der Patient allergisch wird.
Schließlich besteht auch noch die Möglichkeit, dass Fremdantigene, beispielsweise von Bakterien und Viren eine Immunreaktion auslösen, bei der Antikörper entstehen, die zufälligerweise mit normalen körpereigenen Antigenen kreuzreagieren. So ist es beispielsweise bekannt, dass zwischen dem Streptococcen-M-Protein und Herzmuskelproteinen Kreuzreaktionen auftreten können. Ein weiteres Beispiel hierfür ist die in seltenen Fällen durch eine Tollwutimpfung ausgelöste Enzephalitis, bei der die autoimmune Kreuzreaktion durch nicht reinen, mit tierischem Hirngewebe verunreinigtem Impfstoff ausgelöst wird. Schließlich können Autoantikörper auch das Ergebnis einer durch Mutation veränderten Antikörperbildung von immunkompetenten Zellen sein. Die Entstehung von Autoimmunerkrankungen sowie das Versagen der körpereigenen Immuntoleranz ist noch nicht vollständig verstanden zumal auch genetische Faktoren bei Autoimmunerkrankungen eine Rolle spielen.
Es ist bereits eine Vielzahl von Versuchen unternommen worden, derartige durch das Immunsystem ausgelöste Überempfindlichkeitsreaktionen zu behandeln. So wird beispielsweise zur Behandlung von Allergien versucht, die Histaminfreisetzung von Mastzellen zu verhindern.
Zur Verhinderung der Abstoßungsreaktionen von Organ- und Gewebetransplantaten werden üblicherweise immunsuppressive Substanzen eingesetzt, wie entzündungshemmende Glukokortikoide, z. B. Kortison, nichtsteroidale Antirheumatika (NSAR), welche in den Prostaglandinstoffwechsel eingreifen, immunsuppressive Zytochine wie Interleukin 10, Antimetaboliten wie Metotrexat, Zytostatika wie Cyclophosphamid oder auch Hemmer von entzündungsstimulierenden Zytokinen wie Ciclosporin A, Myco- phenolat oder auch Leflunomid. Es ist auch bereits versucht worden zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen polyklonale Antikörper zu verabreichen, um die Aufnahme von unerwünschten Antigenen durch Antigen präsentierende Zellen (APC) sowie die Präsentation dieser Antigene an T-Zellen zu verhindern. Auch ist es möglich, mittels polyklonalen Antikörpern pathogene Auto-antikörper abzufangen.
Schließlich ist auch bereits versucht worden, die zellulären Immunreaktionen bei Autoimmunerkrankungen dadurch einzudämmen, dass man zur Hemmung der MHC- Erkennung Anti-MHC-Antikörper oder zur Hemmung der T-Zell-Aktivierung Anti-TCR- und Anti-CD4-Antikörper einsetzt. Dabei wird mit Peptiden geimpft, die spezifisch für die an der Krankheit beteiligten T-Zellklone sind. Diese verdrängen kompetitiv die pathogenen Peptide am MHC-Molekül und führen so im Tiermodell zu einer Reduktion der Krankheitsaktivität. Schließlich ist auch schon versucht worden, zur Verringerung von Abstoßungsreaktionen das mehr oder weniger gesamte Immunglobulin unspezifisch zu entfernen, d.h. alle Arten von Immunglobulinen. Dies hat jedoch zum Nachteil, dass der so behandelte Patient über keinerlei Immunschutz mehr verfügt. Dies ist besonders riskant, da insbesondere bei Transplantationen und Autoimmunerkrankungen der Patient ohnehin immunsuppressive Substanzen erhält. Ein derart behandelter Patient ist praktisch jedem Angriff von infektiösen Mikroorganismen schutzlos ausgesetzt.
Es ist bereits versucht worden, die zuvor beschriebenen Nachteile mittels einem patientenspezifischen Immunabsorber zu überwinden. Dieser soll an Patienten eingesetzt werden, die an Erkrankungen leiden, welche durch eine Disregulation des Immunsystems bedingt sind. So beschreibt beispielsweise die WO-97/14964 eine Vorgehensweise, wonach mittels herkömmlicher Verfahren aus dem Patientenblut die darin zirkulierenden Immunkomplexe isoliert und diese durch an sich bekannte Methoden in ihre Antigen- und Antikörperkomponenten aufgetrennt werden. Die so erhaltenen Antigene und Antikörper werden dann einzeln oder als Gemisch kovalent an geeignete Träger gekoppelt und als Immunabsorber für genau diejenigen Patienten eingesetzt, von denen die Immunkomplexe isoliert wurden. Auf diese Weise sollen spezifisch wirkende Immunabsorber für Patienten hergestellt werden, die an Autoimmunerkrankungen leiden.
Es hat sich jedoch gezeigt, dass diese Vorgehensweise für eine Vielzahl von wichtigen lebensbedrohlichen Erkrankungen, wie z. B. dem Goodpasture-Syndrom, der Myasthenia gravis und/oder der Wegnerschen Granulomatose sowie einer Reihe von autoimmunen Asthma- und Herzerkrankungen oder auch der Zöliakie nicht funktioniert. Die WO97/14964 geht nämlich davon aus, dass mit den aus dem Blut isolierten Immunkomplexen auch das krankmachende bzw. krankheitsauslösende Agens erhalten wird. Es hat sich nun gezeigt, dass dies in der Regel nicht richtig ist, so dass in vielen Fällen eine Behandlung mit derart hergestellten Absorbern versagt.
Darüber hinaus ist die Herstellung solcher patientenspezifischer Immunabsorber äußerst zeitaufwendig. Bedenkt man, dass in vielen kritischen Fällen, wie beispielsweise der Wegnerschen Granulomatose und/oder dem Goodpasture-Syndrom die Patienten häufig in 1 bis 2 Tagen versterben, ist dieses Verfahren nicht anwendbar. Darüber hinaus wird, wie bereits zuvor erwähnt, in einer Vielzahl der Fälle nicht die krankmachenden, d. h. die Autoimmunerkrankung auslösenden Antigene erhalten. Ebenfalls nicht erhalten werden zum Beispiel Antigene, die schwere Allergien wie z. B. die Zöliakie auslösen.
Darüber hinaus ist es auch mit den dort beschriebenen Verfahren nicht möglich, die Entstehung von Immunerkrankungen zu verhindern.
Die Erfindung hat daher zum Ziel, den Nachteil des Standes der Technik zu überwinden und ein Mittel sowie eine Vorrichtung bereitzustellen, mit dem unerwünschte Immunerkrankungen behandelt werden können ohne dabei das Immunsystem des Patienten vollständig zu unterdrücken. Das Mittel soll dabei schnell und kostengünstig herzustellen sein, einfach zu lagern und schnell gebrauchsfertig zu konfektionieren sein und darüber hinaus auch noch vor Ort schnell an die immunologischen Bedürfnisse des Patienten anpaßbar sein. Darüber hinaus soll die Erfindung eine Behandlung von besonders fatalen Immunerkrankungen wie Sprue, Zöliakie, das Goodpasture-Syndrom, Myasthenia gravis, Wegnersche Granulomatose, Asthma- und Herzerkrankungen, IgE-vermittelte Allergien, Pemphigus vulgaris, eine Autoimmunhepatitis, eine Rasmussen-Enzephalitis, Schnitzlersyndrom und/oder chronische Urtikaria ermöglichen. Die Erfindung hat auch zum Ziel, präventiv die Entstehung von Immunerkrankungen zu verhindern und/oder die Folgeschäden solcher Erkrankungen zu verringern oder ganz zu vermeiden.
Dieses Ziel wird durch die in den Ansprüchen definierten Merkmale erreicht.
Es wurde nämlich erfindungsgemäß gefunden, dass sich fehlgesteuerte Immunreaktionen sowie die Toleranzausbildung dadurch verbessern läßt, indem die autoaggressiven Immunglobuline selektiv entfernt werden. Erfindungsgemäß werden insbesondere auch solche B-Zellen entfernt, die solche Immunglobuline bilden, sowie deren Immunglobuline bzw. Antikörper präsentierende Vorstufen bzw. Vorläuferzellen.
Die Erfindung betrifft somit eine Vorrichtung zur Behandlung von Immunerkrankungen, die an einer festen Phase immobilisierte Substanzen aufweist, welche autoag- gressive Immunglobuline binden und zwar vorzugsweise selektiv. Derartige Substanzen sind insbesondere die Immunerkrankung auslösenden Antigene. Dabei wird der Träger vom Blut bzw. seinen wässrigen Bestandteilen umspült, wobei die krankmachenden Immunglobuline aus dem Blut entfernt werden. Vorzugsweise werden dabei auch diejenigen immunkompetenten Zellen sowie Vorläuferzellen davon entfernt, welche die aggressiven Antikörper bilden, insbesondere B-Zellen. Diese der Erfindung zugrundeliegende Wirkung ist um so überraschender, weil es zu erwarten war, dass durch die Exposition von Antigenen an das Immunsystem des Blutes die Immunantwort, d. h. die Ausbildung und Nachproduktion von hiergegen gerichteten Immunglo- bulinen gerade verstärkt werden sollte (sog. Booster-Effekt). Erfindungsgemäß wurde jedoch überraschenderweise gefunden, dass sich die aggressive Immunantwort verringern bzw. sogar gezielt herunterregulieren läßt, wenn man die unerwünschten aggressiven Antikörper bzw. Immunglobuline selektiv entfernt. Diese selektive Entfernung wird vorzugsweise erfindungsgemäß mittels einem gegen die aggressiven Antikörper gerichteten Antigen erreicht, gegen welches das aggressive Immunglobulin gerichtet ist. Zur Behandlung von Transplantationsabstoßungen sind dies insbesondere die fremden HLA- bzw. MHC-Antigene, zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen sind dies die Autoimmunität-auslösenden Antigene z. B. bei der Wegnerschen Granulomatose die Proteinase 3. Die in der erfindungsgemäßen Vorrichtung gebundenen Antigene werden mittels dem Fachmann bekannten Verfahren an einer festen Phase immobilisiert. Derartige Immobilisierungsreaktionen sind von der Herstellung diagnostischer Testkits wie ELISA oder von der Affinitätschromato- grafie dem Fachmann bestens bekannt. Die Immunglobulin-bindenden Substanzen können an der festen Phase sowohl direkt als auch indirekt gebunden sein. Vorzugsweise sind sie mittels einer nicht kovalenten Kupplung bestehend aus mindestens 2 komplementären Kupplungsgliedern, miteinander verbunden. Dabei wird das am immobilisierten Agens hängende Kupplungsglied als Anker und das an der festen Phase gebundene komplementäre Kupplungsglied als Gegenanker bezeichnet. Beispielhaft seien hier lediglich die Immobilisierung mittels Bromcyan oder auch die Fixierung mittels Glutaraldehyd (direkte Bindung) sowie die Biotinylierung und Ausbildung von Avidin- bzw. Streptavidin-Komplexen genannt.
Erfindungsgemäß werden die Antigene mittels eines Abstandshalters, d. h. eines Armes oder Spacers an die Oberfläche bzw. feste Phase gebunden. Erfindungsgemäß bevorzugte Spacer ermöglichen einen Abstand des Antigens zur festen Oberfläche oder zur festen Phase von vorzugsweise mindestens 5 A, insbesondere mindestens 10 Ä, wobei mindestens 15 A und insbesondere mindestens 20 Ä besonders bevorzugt sind. Ganz besonders bevorzugt sind Spacerarme, welche einen Abstand von mindestens 28 A, insbesondere mindestens 30 A ermöglichen. Die Spacer sind zweckmäßigerweise aus einer langen Kohlenstoffkette aufgebaut, vorzugsweise sind sie jedoch aus repetitiven Einheiten kleinerer Kohlenwasserstoffketten aufgebaut, die insbesondere Heteroatome aufweisen. Bevorzugte repetitive Einheiten sind insbesondere C2 - C8-Einheiten, wobei C bis C6 besonders bevorzugt sind. Die einzelnen Einheiten sind vorzugsweise über die Heteroatome miteinander verknüpft. Bevorzugte Heteroatome sind Stickstoff, Sauerstoff und Schwefelatome. Vorzugsweise sind die repetitiven Einheiten über Aminosäure-Funktionen miteinander verbunden.
Die Spacerarme weisen an ihren beiden Enden vorzugsweise unterschiedliche reaktive Gruppen auf, wovon eine Gruppe mit dem zu bindenden, d. h. zu immobilisierenden Antigen reagiert, und die andere an die Oberfläche bindet und ggfs. dort mit ihr reagiert. Bevorzugte, mit den Antigenen reagierende funktioneile Gruppen sind insbesondere N-Hydroxysuccinimid-, Sulfo-N-hydroxysuccinimid-Gruppen, welche beispielsweise mit einem primären Amin unter Ausbildung einer Amidgruppe mit dem Antigen reagieren oder Maleimid-Gruppen, welche beispielsweise mit einer freien Sulfhydryl-Gruppe eines Antigens unter Ausbildung einer Thioether-Brücke reagiert. Weitere reaktive Gruppen sind Halogenacetyl-, insbesondere eine Jodacetyl-Gruppe, welche ebenfalls mit Sulfhydryl unter Bildung einer Thioether-Brücke reagiert. Andere wichtige reaktive Reagenzien sind beispielsweise Hydrazid-Gruppen, welche mit einer oxidierten Carbohydrat-Gruppe, beispielsweise einer Aldehyd-Gruppe unter Ausbildung einer Hydrazon-Bindung reagiert, weitere wichtige Gruppen sind beispielsweise fotoaktivierbare Azidogruppen, beispielsweise aromatische Azidogruppen, welche mit Nukleinsäuren sowie Protein-Carbohydraten unter Ausbildung einer Ringexpansion mit einem primären Amin reagieren. Schließlich werden noch Aminogruppen verwendet, welche unter Ausbildung mit einer freien Carbonsäure bzw. Carboxygruppe unter Ausbildung einer Amidobindung reagieren. Viele solcher Reagenzien sind handelsüblich erhältlich. Bei den zuvor genannten funktionellen Reagenzien sind erfindungsgemäß insbesondere die N-Hydroxysuccinimid-haltigen Reagenzien, die Maleimid- haltigen Reagenzien sowie die Aminogruppen und die fotoaktivierbaren Azidogruppen bevorzugt.
In einer weiteren erfindungsgemäß bevorzugten Ausführungsform weist der Spacerarm eine Ankergruppe auf, die mit einem an der festen Oberfläche immobilisierten Gegenanker insbesondere nicht-kovalent kuppelt. Dabei ist der Anker am Spacerarm vorzugsweise an derjenigen Stelle angeordnet, welcher der Bindungsstelle des Spacers mit dem Antigen gegenüberliegt. Erfindungsgemäß bevorzugte Anker sind Biotin, Thioredoxin, und/oder Polyhistidin Tags, insbesondere solche mit 4 bis 6 aneinander liegenden Histidinresten. Bevorzugte Gegenanker sind Avidin und insbesondere Streptavidin als Gegenanker zum Biotin, ein chelato-immobilisiertes Metallion, insbesondere Nickel und/oder Cobalt, zweckmäßigerweise als Gegenanker zu Polyhistidin Tags, sowie ein gegen den Anker gerichteter Antikörper. Derartige Antikörper sind leicht herstellbar und zum Teil auch als monoklonale Antikörper z.B. aus ACC- 2207 (Antipentahistidyl-Antikörper) kommerziell von Quiagen erhältlich. Derartige Anker und reaktive Gruppen enthaltende Spacer sind vom Fachmann ohne weiteres herzustellen und beispielsweise auch kommerziell erhältlich. So werden beispielsweise von Pierce, Rockford, IL, 61105, USA unter der Bezeichnung EZ-Link™ sowie unter der Bezeichnung Sulfo-LC-SPDP, LC-SPDP und SPDP vertrieben. Auch spaltbare crosslinkende Reagenzien sind unter dieser Bezeichnung kommerziell erhältlich.
Durch die erfindungsgemäße Vorgehensweise ist es möglich, auch unter Protein- und Nuclein-feindlichen Reaktionsbedingungen zuerst die Oberfläche der festen Phase mit dem Gegenanker zu versehen. Da hierbei nicht auf biologisch verträgliche Reaktionsbedingungen geachtet werden muß, können auch sehr hohe Dichten an Gegenankern an der Oberfläche der festen Phase erreicht werden, wie sie bei der direkten Immobilisierung von Antigenen bislang nicht möglich war. Nach Fertigstellung der so mit dem Gegenanker versehenen festen Phase kann diese unter physiologischen Bedingungen mit dem Antigen mittels dessen Ankertag beladen werden. Auf diese Weise ist es möglich, Beladungsdichten von > 0,01 pMol/cm2 > 0,1 pMol/cm2 und insbesondere > 1 pMol/cm2 zu erreichen. Sogar Dichten von > 5 pMol/cm2 sind ohne weiteres erreichbar. Werden Säulen verwendet, so lassen sich beispielsweise bei Kügelchen von 40 - 90 μm Durchmesser Dichten von > 10 nMol/cm3, insbesondere > 20 nMol/cm3 und darüber hinaus herstellen. Bei Verwendung des Streptavidin- Biotinylin-Systems, welches bis zu vier Biotinylin-Anker binden kann, sind außergewöhnlich hohe Beladungsdichten möglich. Auf diese Weise können kleine hocheffektive Immunabsorber hergestellt werden.
Dies hat zum Vorteil, dass bei der Behandlung, d. h. bei einer extrakorporalen Aphe- rese sich nur ein geringes Blutvolumen außerhalb des Körpers im Absorber befindet, wodurch die Gefahr einer Anämie bei den ohnehin stark geschwächten Patienten vermieden wird. Des weiteren ist es möglich, mit solchen kleinen Absorbern Aphere- se-Vorrichtungen herzustellen, die so klein sind, dass sie am Körper des Patienten während der Behandlung getragen werden können. Der Patient wird daher nicht an ein Krankenhaus oder eine andere medizinische Versorgungseinrichtung gebunden, sondern kann während der Behandlungszeit zuhause verbleiben. Des weiteren ist es möglich, Langzeitbehandlungen und Dauerbehandlungen durchzuführen, während der der Patient auch mobil bleibt und sich im häuslichen Bereich völlig ungehindert bewegen kann. Bei mehr oder weniger bereits geheilten Patienten ermöglicht eine derartige mobile bzw. transportable Vorrichtung sogar, dass diese ihren gewohnten Beschäftigungen und Bedürfnissen nachgehen.
Schließlich ermöglicht es die erfindungsgemäße Vorgehensweise auch, die Herstellung der jeweils benötigten Immunabsorber vor Ort, d. h. beispielsweise in einer Klinik oder einem anderen Therapiezentrum bei Bedarf selbst herzustellen. Da nicht mehr die gesamten benötigten Vorrichtungen gelagert werden müssen, sondern lediglich die mit dem Anker versehenen unspezifischen Festphasen, d. h. Säulen, Dialyseschläuche, Hohlfasern etc. sowie hiervon getrennt die jeweiligen mit dem Spacerarm und Anker versehenen Antigenen, ist es möglich, bei Bedarf sofort einen spezifischen Immunabsorber für die jeweilige benötigte Erkrankung herzustellen, indem man eine Lösung des mit Spacer und Anker versehenen Antigens herstellt und mit der Oberfläche der festen Phase in Kontakt bringt. Da die jeweiligen Antigene beispielsweise im lyophilisierten Zustand lange gelagert werden können, wird keine große voluminöse Lagerhaltung notwendig, um eine Vielzahl von Absorbern für verschiedene Erkrankungen bereitzustellen.
Darüber hinaus ist es auch möglich, bei Patienten welche gleichzeitig verschiedene Autoimmunerkrankungen aufweisen, rasch kombinatorische Säulen bzw. Absorber herzustellen, bei denen der Absorber mit einer Kombination von verschiedenen Antigenen beladen ist. Dies ermöglicht es, Patienten mit heterogenen Autoantikörpern wie beispielsweise bei gleichzeitigem Auftreten von Lupus erythematodes und gleichzeitigem Antiphospholipid-Syndrom mittels DS-DNA, ß-2-Glykoprotein und Kardiolipin als vorgefertigtes Antigen in einem Schritt kostengünstig und effektiv zu therapieren.
Ein weiterer Vorteil ist es, dass man durch die Bereitstellung eines allgemeinen präfabrizierten Absorbers konzipiert wird, welcher rasch für eine Vielzahl unterschiedlicher Erkrankungen hergerichtet werden kann.
Durch die erfindungsgemäße Vorgehensweise ist es somit möglich, die Antigene in ihrer nativen physiologischen Konformation zu binden, ohne dass sie durch die Immobilisierung an der Oberfläche sterisch gehindert werden, wodurch nahezu alle Epitope des Antigens für die zu entfernenden Antikörper bzw. diese produzierenden Zellen zugänglich sind. Durch die erfindungsgemäß verwendeten Ankersysteme wird das Antigen hochaffin an den Absorber gebunden, wodurch ein Ablösen bzw. Bluten verhindert wird. Des weiteren ermöglicht die erfindungsgemäß feste Bindung des Antigens an die Säule ein Abwaschen der gebundenen autoagressiven Substanzen nach Gebrauch z. B. durch die Verwendung hoher Salzlösungen und/oder Veränderungen des pH-Wertes. Auf diese Weise können die jeweiligen Immunabsorber mehrfach verwendet, d. h. recycelt werden.
Trägermaterialien sind erfindungsgemäß alle Stoffe, an die Antigene oder Bestandteile davon gebunden werden können. Übliche Trägermaterialien, an welche die Antigene gebunden werden, sind ebenfalls aus der Herstellung diagnostischer Testkits sowie zur Herstellung von Dialyseschläuchen bekannt. Sie unterliegen prinzipiell keiner Beschränkung, sie dürfen lediglich nicht toxisch sein und nicht selbst allergisie- rend wirken. Geeignete Trägermaterialien sind beispielsweise Kieselgele, wie sie für Füllkörperkolonnen verwendet werden, Latexpartikel, insbesondere nicht-aller- gisierende Latexpartikel, Glasbeads, Gelmatrizes sowie Hohlkörpermatrizes wie Filtermaterialien und Dialyseschläuche. Auch Partikel aus Polystyrolen, Polyvinylalko- holen, Sepharosen etc. sind prinzipiell verwendbar. Die Festphasen weisen vorzugsweise eine große Oberfläche auf, die vom Blutserum oder einer wässrigen Lösung aus Bestandteilen davon umströmt wird, so dass eine maximale Kontaktfläche von Antigenen und den im Blut zirkulierenden Immunglobuli- nen geschaffen wird. Erfindungsgemäß sind unter dem Begriff Antigene alle Substanzen zu verstehen, gegen die aggressive Antikörper gerichtet sind. Üblicherweise sind dies Proteine, Nukleinsäuren, sowie Komplexe dieser beiden ggfs. auch mit Membranbestandteilen. Hierzu zählen nicht nur die kompletten Antigene, sondern auch Teile oder Bruchstücke davon, die bindefähige Epitope aufweisen, wie z.B. Peptide, Oligopeptide und Oligonukleotide, die ggfs. auch künstlich hergestellt sein können. Bevorzugte erfindungsgemäß zu immobilisierende Antigene sind dabei Doppelstrang- DNA, Einzelstrang-DNA, Nukleosome, Centromere (Kinetochor-Antigen), Jo-1 (Histi- dyl-Synthetase), SCL-70 (Topoisomerase I), PCNA (proliferating cell nuclear antigen), SS-B/La, SS-A(Ro), U1-RNP, SN-Antigen (small nuclear antigen), Histone, PR3 (Proteinase 3), Fc-Fragment von Immunglobulin, Citrulline, Phospholipide wie z.B. Kardiolipin, ANA, ribosomales Protein, RA 33, PM-Scl, ANCA, GBM (Basalmembran der Nierenglomeruli), Acetylcholinrezeptoren, In-sulinrezeptoren, Antikörper- sensibilisierte Trombozyten. Weitere Antigene sind beispielsweise Antigene der sympathischen Ophthalmie sowie B5 für Morbus Behcet, B 27 für die ankylosierende Spondylitis, Morbus Reiter, sowie die akute anteriore Uveitis, B 35 für die subakute Thyreoiditis, Cw 6 für Psoriasis Vulgaris, DR 3 sowie ggf. DR 4 für Dermatitis Herpe- tiformis, Zöliakie, und die Morbus Basedow, Diabetis mellitus Typ I, Myasthenia Gravis, systemi-scher Lupus Erythematodes (SLE), idiopathische membranöse Ne- phropathie; DR 2 für die Narkolepsie und Multiple Sklerose, DR 4 für die rheumatoide Arthritis, sowie DR 5 für die Hashimoto-Thyreoiditis und die perniziöse Anemie und DRw8 für die juvenile chronische Arthritis; sowie die Klasse der Spektrine, insbesondere α- und ß-Fodrin. Erfindungsgemäß besonders bevorzugt sind dabei nichtlösliche membrangebundene Antigene.
Mittels der erfindungsgemäßen Vorgehensweise ist es auch möglich, die jeweiligen die autoaggressive Reaktion auslösenden Antigene zu immobilisieren. Es hat sich nämlich gezeigt, dass diese insbesondere bei den besonders fatal verlaufenden Erkrankungen nicht im Serum auftreten. So lassen sich beispielsweise mit der erfindungsgemäßen Vorgehensweise die jeweiligen hauptauslösenden Antigene, wie beispielsweise das an die Zellmembran gebundene C-terminale Ende der α-3-Kette des Typ IV Kollagens der glomerulären Basalmembran getrennt isolieren und mit dem entsprechenden einen Anker aufweisenden Spacerarm zu versehen. Dies kann wie bereits zuvor erwähnt auch rekombinant erfolgen. Prinzipiell ist es auch möglich, derartige membrangebundene Antigene in Phospholipid-Vesikelmembranen einzubringen und diese dann an die Oberfläche des Absorbers auf die zuvor beschriebene Weise zu binden. Derartige wichtige für die meisten betroffenen Patienten identischen Antigene sind insbesondere die Transglutaminase sowie Gliadin für die Zöliakie bzw. Sprue sowie das bereits zuvorgenannte III Kollagen insbesondere dessen C- terminales Ende für das Goodpasture-Syndrom. Weiteren spezielle erfindungsgemäß zu verwendende Antigene sind beispielsweise der Acetylcholin-Rezeptor sowie der ß- 2-adrenerge Rezeptor zur Behandlung der Myasthenia gravis und die in den α- Granula der neutrophilen Granulozyten auftretende Proteinase 3 zur Behandlung der Wegnerschen Granulomatose. Die Verwendung von ß-adrenergen Rezeptoren, insbesondere von ß1- und ß-2-Rezeptoren haben sich zur Behandlung der Asthma- und Herzerkrankungen als besonders geeignet erwiesen. Des weiteren IgE-Rezeptoren als Antigene für schwere Fälle von IgE-vermittelte Allergien erfindungsgemäß eingesetzt werden. Ein weiteres erfindungsgemäß spezielles, nicht im Serum vorliegendes Antigen des Desmosome, insbesondere Desmocholin, welche zur Behandlung des Pemphigus vulgaris verwendet werden. Weitere spezielle erfindungsgemäß zu verwendende Antigene sind der Asialoglykoprotein-Rezeptor für autoimmune Hepatis, der Glutamat-Rezeptor für die Rasmussen-Enzephalitis, der Interleukin-l-α-Rezeptor für das Schnitzlersche Syndrom, und der IgE-Rezeptor für die chronische Urtikaria.
Erfindungsgemäß werden dabei nicht nur die Autoantikörper, die an der Bildung von gewebeschädigenden Immunkomplexen beteiligt sind, entfernt, sondern auch zusätzlich die Entfernung von solchen Autoantikörpern, die per se Gewebeschädigungen verursachen können. Die Anwendung betrifft somit mehr Erkrankungen und kann zudem als präventive Maßnahme eingesetzt werden, welche die Autoantikörper bereits vor der Bildung von Immunkomplexen entfernt. Zudem können hiermit nicht nur echte Autoantikörper, sondern auch andere krankmachenden Antikörper, entfernt werden, wie z. B. Allergie-Antikörper.
Eine derartige erfindungsgemäße Vorrichtung wird nun über eine Zuleitung analog einer Dialyse mit einer an einen Patienten angeordneten Blutentnahmestelle verbun- den, wobei diesem Blut abgenommen und über die erfindungsgemäße Vorrichtung geleitet wird. Dabei werden erfindungsgemäß vorzugsweise nicht nur die krank machenden Immunglobuline sondern auch diese produzierende Zellen sowie Vorläufer hiervon an die immobilisierten Antigene gebunden und das Blut hiervon befreit. Dieses "befreite" bzw. "gereinigte" Blut wird nach dieser "Dialyse bzw. Filtration" über eine Ableitung dem Patienten mittels einer Blutrückführstelle wieder zugeführt. Vorzugsweise wird die Entnahme, Filtration und Rückführung kontinuierlich durchgeführt. Blutentnahme bzw. Blutrückführstelle sind Vorrichtungen, wie sie beispielsweise von der Dialyse oder auch von der Blutspende bekannt sind.
Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist es nicht nur möglich Immunglobuline zu entfernen, sondern es ist auch möglich immunkompetente Zellen, die für die überschießende Immunreaktion verantwortlich sind, selektiv zu entfernen ohne dabei den Patienten seines restlichen, für eine ausreichende Immunität gegenüber Krankheitserregern notwendigen, Schutzes zu berauben. So ist es beispielsweise erfindungsgemäß auch möglich, die immobilisierten Antigene an feine Eisenpartikel zu immobilisieren und die daran gebundenen Immunglobuline oder solche Immunglobuline tragenden Zellen mittels eines Magnetes aus dem Blut bzw. dem Serum herauszufischen (Immunmagnetische Separation, IMS). Derartige Partikel sind beispielsweise von Bekton-Dickensen unter der Bezeichnung Dynabeads erhältlich. Eine weitere Möglichkeit ist beispielsweise die Antigene mit einem zytometrisch erkennbaren Marker, insbesondere Fluoreszenzmarker zu versehen und dann entsprechende unerwünschte Immunzellen mittels einer Durchflusszytometrie zu entfernen. Zur Behandlung von Allergien ist es beispielsweise besonders erwünscht IgE-Mast- Zellenkomplexe aus dem Blut zu entfernen.
Obwohl bei einem erfindungsgemäß derart behandeltem Patienten allein durch die Entfernung der aggressiven Immunglobuline die Immuntoleranz wieder ins Gleichgewicht gebracht wird, wodurch der Patient primär geheilt ist, kann es sich in einzelnen Fällen als sinnvoll erweisen zusätzlich über einen Zeitraum immunsuppressive Substanzen wie Glykokortikoide oder auch entsprechende Antimetaboliten, Zytostatika etc. zu verabreichen. Es hat sich jedoch gezeigt, dass hierfür nie die hohe Dosis notwendig ist, die sonst üblicherweise zur Behandlung von Immunerkrankungen appli- ziert werden muss. Die Erfindung betrifft somit auch einen Therapiekit, der die erfin- dungsgemäße Vorrichtung bzw. das erfindungsgemäß hergestellte Mittel zusammen mit einem Immunsuppressiva enthält.
Erfindungsgemäß ist es auch möglich mehrere verschiedene Antigene aufweisende Vorrichtungen hintereinander zu schalten und auf diese Weise gleich mehrere unterschiedliche aggressive Immunglobuline zu entfernen. Dies kann beispielsweise dadurch geschehen, dass man die auf Partikel immobilisierten Antigene in Säulen füllt und mehrere mit verschiedenen Antigenen beschichtete Säulen hintereinander schaltet. Dies ist prinzipiell auch mit entsprechenden Dialyseschläuchen oder mit Filtermatrizes oder auch Hohlfasern möglich.
Die mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung zu behandelnden Erkrankungen sind insbesonders alle allergischen und Auto-immunerkrankungen, bei denen Antikörper eine krankheitsre-levante Rolle spielen, d.h. eine pathogene Wirkung aufwei-sen. Hierzu zählen insbesonders der systemische Lupus Ery-thematodes (SLE), das Sjö- gren-Syndrom, die Sklerodermie, die Polymyositis, die Dermatomyositis und die gemischte Kollagenerkrankung (MCTD) sowie die rheumatoide Arthritis, primäre Vaskulitiden, sowie das Antiphospholipid-Syndrom, Gicht, Polychondritis, Uveitis, Morbus Behcet und vor allem das Goodpasture-Syndrom (AK gegen Nierenbasalmem-bran), sowie die Myasthenie (Myasthenia gravis), Multiple-sklerose, Cardiomyopathie, Herzinsuffizienz und die Pemphigus vulgaris.
Die Erfindung soll anhand des folgenden Beispieles kurz erläutert werden.
Zur Behandlung der Wegnerschen Granulomatose wird gereinigte Proteinase 3 (PR 3) mittels Ultrafiltration über eine 10 kDa-Membran (aus Polyethersulfon oder regenerierter Cellulose) auf etwa 10 mg/ml konzentriert. Dabei wird die Konzentration mittels der Extinktion bei 280 nm durch Verdünnung von 1:100 in PBS abgeschätzt, wobei reines PBS als Basiswert dient. Der gemessene Extinktionswert ist mit 100 zu multiplizieren, wobei ein Wert von 1 etwa 1 mg/l Protein entspricht.
Die so konzentrierte Lösung wird auf eine 5 ml Hightrap Entsalzungssäule (Pharmacia, Schweden) in PBS umgepuffert, wobei maximal 1 ml Probe pro Lauf aufgeladen werden sollte. Die so erhaltene Proteinlösung wird mit einer 10 mg/ml enthalte- nen Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin (Pierce, USA) in Wasser mit 10 mM PR3 (M = 670 Dal- ton) versetzt, und zwar pro mg PR3 mindestens 110 μg Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin. Da dieses Reagenz sehr hydrolyseempfindlich ist, sollte es möglichst rasch verarbeitet werden. Das Reagenz wird in etwa 4-fachem Überschuß zum Protein zugegeben und zwei Stunden auf Eis inkubiert. Nicht reagiertes Reagenz wird mittels Gelfiltration abgetrennt, wie dies zuvor für das Umpuffern beschrieben ist. Das so erhaltene biotinylierte Antigen kann mit 0,1 % Natriumazid bei 4 °C gelagert werden und bald weiterverarbeitet oder auch zur längeren Lagerung lyophilisiert werden.
Das so erhaltene mit einem Biotinanker versehene PR3-Antigen wurde auf eine Po- lymethacrylatkügelchen enthaltende Säule gegeben, die mit monomerem Avidin beschichtet sind. Derartige Avidin-beschichtete Polymethacrylat-Beads sind beispielsweise unter der Bezeichnung Softlink™ von Promega, Wl, USA erhältlich. Dazu wird das Material 15 Minuten bei Raumtemperatur mit 5 mM Biotin inkubiert, um unspezifische Bindungen zu unterdrücken. Dann wurde die Säule mit 10 % Essigsäure eluiert und anschließend mit PBS. Danach wurde das biotinylierte PR3-Antigen auf die Säule geladen und anschließend gewaschen.
Die so erhaltene Säule wurde mit 500 ml Plasma eines Wegner-Patienten beschickt. Der Antikörpertiter des Plasmas zeigte bei einem Anti-PR3-ELISA-Test der Firma Aesku.lab Diagnostika vor dem Auftrag auf die Säule einen OD von 1 ,9. Nach dem Durchlauf auf dieser Säule (10 ml Säule) zeigte es noch eine OD von 0,15. Dies bedeutet, dass mit einem einmaligen Durchlauf auf einer derartig winzigen Säule bereits 92,1% des krankmachenden Agens entfernt wurde.

Claims

Patentansprüche:
1. Vorrichtung zur Behandlung von Immunerkrankungen umfassend eine mit einer an einem menschlichen Körper angeordneten Blutentnahmestelle verbindbare Zuleitung für Blut und/oder wässrigen Bestandteilen davon, eine mit einer an dem menschlichen Körper angeordneten Blutrückführstelle verbindbare Ableitung sowie einen zwischen Zuleitung und Ableitung angeordneten, eine Oberfläche aufweisenden Träger, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche des Trägers immobilisierte die Immunerkrankung auslösende Antigene aufweist, welche aggressive Immunglobuline selektiv binden, wobei die Antigene mittels eines Abstandshalters (Spacers) an die Oberfläche gebunden sind.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Antigene mittels eines Abstandshalters an die Oberfläche gebunden sind.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen mittels einer nicht-kovalenten Bindung, umfassend einen Anker und einen komplementären Gegenanker, an die Oberfläche gebunden ist.
4. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Abstandshalter mittels einer reaktiven Gruppe umfassend eine N- Hydroxysuccinimid-, Sulfo-N-Hydroxysuccinimid-, Maleimid-, Haloacetyl-, Hydrazid-, eine Aminogruppe und/oder eine photoaktivierbare Azidogruppe an das Antigen gebunden ist.
5. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Anker Biotin, Thioredoxin, und/oder ein Polyhistidin Tag ist.
6. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der komplementäre Gegenanker Avidin, Streptavidin, ein chelato-immobilisiertes Metallion und/oder ein gegen den Anker gerichteter Antikörper ist.
7. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Abstandshalter eine Kette von mindestens 5 A Länge umfaßt, die ggfs. Heteroatome im Kohlenstoffrückgrat aufweisen.
8. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die C-Kette aus repetitiven Einheiten bestehend aus C2 - C8., insbesondere C4 - C6 -Gruppen, vorzugsweise aus Aminohexangruppen, Hexansulfid- und/oder Oxy- hexangruppen bestehen.
9. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Säule eine Antigendichte von größer als 0,01 pmol/cm2 Festphasenoberflä- che aufweist.
10. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Immunerkrankung Sprue, Zöliakie, das Goodpasture-Syndrom, Myasthenia gravis, Wegnersche Granulomatose, Asthma- und Herzerkrankungen, IgE- vermittelte Allergien, Pemphigus vulgaris, eine Autoimmunhepatitis, eine Rasmussen- Enzephalitis, Schnitzlersyndrom und/oder chronische Urtikaria ist und das Antigen Transglutaminase, Typ IV Kollagen der glomerulären Basalmembran, Acetylcholinre- zeptor, Proteinase 3 der Alpha-Granula der neutrophilen Granulozyten, beta- andrenerge Rezeptoren, insbesondere beta-2- und beta-1 -Rezeptoren, IgE- Rezeptoren, Desmocholin, insbesondere Desmosome, Asialoglykoprotein-Rezeptor, Glutamatrezeptor, Interleukin-l-alpha-Rezeptor, IgE-Rezeptor ist.
11. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger einen Dialyseschlauch, eine Filtermatrix, eine Hohlfaser, Kieselgelpartikel, Glasbeads, Latexpartikel, Polyacrylat- sowie Polymethacrylatpartikel und/oder Polystyrolpartikel umfasst.
12. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine oder mehrere hintereinander geschaltete Träger umfasst.
13. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen Nierenglomeruli, Einzelstrang-DNA, Doppelstrang-DNA, Proteinase 3, Acetylrezeptoren, Spektrine, Nukleosomen, Histone, nukleare Proteine sowie Antigene des Augeninneren umfasst.
14. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie immobilisierte Proteasen enthält, welche die gebundenen Immunglobuline verdauen.
15. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass diese eine Dosierungseinrichtung zum Zudosieren von Additiven enthält.
16. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Additive Immunsuppressiva sind.
17. Verwendung von Antigenen zur Herstellung eines Mittels zur Behandlung und zur Vorbeugung von aggressiven Immunerkrankungen nach einem der Ansprüche 1 - 16, bei der das Antigen mit Blut, Serum oder Bestandteilen davon eines zu behandelnden Patienten in Kontakt gebracht wird, wobei das Antigen mit den aggressiven Immunglobulinen reagiert und das Reaktionsprodukt entfernt wird.
18. Verwendung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Immunerkrankung eine Autoimmunerkrankung, eine Transplantatabstoßung und/oder eine Allergie ist.
19. Therapiekit umfassend eine Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 - 16 und/oder ein nach einem der Ansprüche 17 - 18 hergestelltes Mittel sowie ein immun- suppressives Pharmakon.
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