WO2002010759A2

WO2002010759A2 - Beschichtung für verschiedenartige substrate sowie verfahren zu deren herstellung

Info

Publication number: WO2002010759A2
Application number: PCT/EP2001/008701
Authority: WO
Inventors: Erk Gedig; Lutz Haalck
Original assignee: Institut fuer Chemo und Biosensorik Muenster eV ICB
Current assignee: Institut fuer Chemo und Biosensorik Muenster eV ICB
Priority date: 2000-07-28
Filing date: 2001-07-27
Publication date: 2002-02-07
Anticipated expiration: 2003-01-28
Also published as: GB2381482A; GB2381482B; US20050042455A1; DE10036907A1; GB0304305D0; US8012587B2; DE10036907B4; WO2002010759A3; AU2001282034A1

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf Beschichtungen von verschiedenartigen Substraten, wobei eine hydrophile Polymerschicht über eine polymere Haftvermittlerschicht an ein Substrat gebunden wird. Ebenso wird ein Verfahren zur Herstellung dieser Schichtsysteme vorgestellt. Als Anwendung dieser erfindungsgemässen Schichten bietet sich der Einsatz z.B. als Immobilisierungsmatrix und zur Unterdrückung unspezifischer Proteinadsorption in Biosensoren, MALDI Targets und anderen bioanalytischen Geräten an. Weiterhin können sie zur Biokompatibilisierung von Implantaten und zur Beschichtung von Kontaktlinsen verwendet werden. Optische Elemente, die mit derartigen Beschichtungen versehen sind, beschlagen nicht mehr. Darüber hinaus sind die Schichten schmutzabweisend bzw. selbstreinigend.

Description

Beschichtung für verschiedenartige Substrate sowie Verfahren zu deren Herstellung

Die vorliegende Erfindung betrifft polymere Beschichtungen für verschiedenartige Substratoberflächen, um deren bioinerten Charakter zu erhöhen. Derartige Sub- stratbeschichtungen werden häufig für Vorrichtungen verwendet, die in Kontakt mit biologischen Medien ^•' stehen, wie z.B. bioanalytische Vorrichtungen oder

Implantate. Hierfür werden weitestgehend bioinerte - also möglichst wechselwirkungsarme - Oberflächen bevorzugt.

Nach dem Stand der Technik finden meist hydrophile

Polymere als Substratbeschichtung Verwendung. Hierzu zählen Polyether, wie z.B. Polyethylenglycol; Poly- saccharide, wie Heparin oder Dextran; Polyalkohole, wie z.B. Polyvinylalkohol; oder auch Polyamide, wie z.B Polyacrylamid. Für biosensorische Zwecke haben h-¹ o cπ σ cπ o cπ

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genüber z.B. Biomolekülen eingestellt werden.

Dabei kann sich die hydrophile Polymerschicht aus unterschiedlichen Polymeren zusammensetzen. Dies hat den Vorteil, dass die Permeabilität der hydrophilen Polymerschicht für Biomoleküle mit unterschiedlichem Molekulargewicht gesteuert werden kann. Dies erfolgt, indem das Konzentrationsverhältnis zwischen nieder- und hochmolekularen Polymeren, welche die hydrophile Polymerschicht ausbilden, den zu untersuchenden Molekülen entsprechend eingestellt wird.

Vorzugsweise kann auf der hydrophilen Polymerschicht mindestens eine weitere Polymer- und/oder Partikel- schicht aufgetragen sein. Diese legt sich dabei wie ein poröser Film über die bürstenartige Struktur.

Als hydrophile Polymere können bevorzugt Polysaccha- ride, Polyalkohole, Polyether , Polyamiden, Polycar- bonsäuren, Polysulfaten/-sulfonaten, Polyphosphaten/- phosphonaten und/oder Kombinationen dieser eingesetzt werden, die zusätzlich noch durch weitere Reaktionsschritte chemisch funktionalisiert werden können. Hierzu zählen z.B. mit Isothiocyanat-, Isocyanat-, Carbonsäureazid-, N-Hydroxysuccinimidester-, N-

Acylimidazol-, Sulfonylchloridderivat-,Aldehyd-, Ke- to-, Glyoxal-, Oxiran-, Carbonat-, Arylhalogenid-, Imidoester-, Anhydrid-, Halogenalkyl-, Halogenacyl-, Maleimid-, Aziridin-, Acryloyl-, Sulhydryl-, Disul- fid-, Diazoalkan-, Diazoacetyl-, Imidazolylcarbamat-, Hydrazid-, Diazonium-, Arylazid-, Benzophenon-, Dia- zopyruvat- oder Diaziringruppen. Eine vorteilhafte Weiterbildung stellt eine Funktionalisierung z.B. mit Nitrilotriessigsäurederivaten dar, wodurch Liganden über ein Metallchelat immobilisert werden können. Die Ankopplung von Molekülen, die anhand einer biospezi- CO CO r-υ μ» cπ o cπ o Cπ o cπ

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als polymere Haftvermittlerschicht auch amphiphile Polymere oder Polyamine eingesetzt werden. Diese könne dabei Disulfid-, Sulfid-, Diselenid-, Selenid-, Thiol-, Isonitril-, Nitro-, Selenol-, P(III)-, Isothiocyanat-, Xanthat-, Thiocarbamat-, Phosphin- Thioacetat- oder Dithioacetatgruppen tragen.

Die erfindungsgemäßen Beschichtungen können mit unterschiedlichen Substraten kombiniert werden. Für den elektrochemischen Einsatz stellt der Einsatz leitfähiger Substratmaterialien eine vorteilhafte Weiterbildung dar. Die Schichten sind zudem elektrochemisch und für Ionen begrenzt permeabel. Dies führt dazu, daß Biomoleküle durch Anlegen eines Potentials an ein darunterliegendes Metallsubstrat unter bestimmten Bedingungen selektiv und reversibel in der bürstenartigen Polymerschicht angereichert werden können. Immobilisiert man Enzyme in der Polymerschicht, erhält man bei Anlegen eines geeigneten Potentials einen ex- trem schnell ansprechenden Enzymsensor.

Ebenso kann als Substrat ein Glas- und/oder anderes oxidisches Material eingesetzt werden, wobei dieses durch einen zusätzlichen Reaktionsschritt silanisiert werden kann.

Bei der Verwendung von Edelmetallen, wie z.B. Ag, Au, Pt oder Pd ist eine Substratbeschichtung ebenso möglich. Die Haftvermittlerschicht läßt sich hierbei so- wohl direkt auf die Substratoberfläche aufbringen, als auch über ein bifunktionelles Alkylmercaptan koppeln.

Die Beschichtung von auf Kunststoffmaterialien basie- renden Substraten läßt sich erfindungsgemäß umsetzen, wobei die Kunstoffsubstrate vor der Beschichtung durch die Behandlung mit Oxidationsmitteln, durch den Einsatz von oberflächenmodifizierenden Plasmamethoden oder ionisierende Strahlung zusätzlich funktionali- siert werden können. In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung können hydrophobe Oberflächen mit einer hinreichend niedrigen Oberflächenenergie mit einer Haftvermittlerschicht aus amphiphilen Polymeren beschichtet werden.

Eine zusätzliche Alternative des zu verwendenden Substrates für die erfindungsgemäße Beschichtung stellen Natur- oder Kunstfasern oder eine Kombination von beiden dar.

Die Adsorption des Haftvermittlerpolymers sowie die kovalente Anbindung der bürstenartig angeordneten zweiten Polymerschicht können hierbei einfach aus wässerigen Lösungen erfolgen. Da der Aufbau dieses Schichtelements durch Selbstorganisation resp. unter vollständiger Umsetzung der funktioneilen Gruppen erfolgt, besitzt das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren eine systemimmanent hohe Fehlertoleranz, die zu konstanten Schichtqualitäten führt.

Bevorzugt weist die Beschichtung eine Schichtdicke zwischen 10 und 500 nm und besonders bevorzugt zwischen 10 und 100 nm auf.

Für die Verwendung der Beschichtung gemäß den Ansprü- chen 32 bis 40 bieten sich vielfältige Möglichkeiten.

Hierzu zählt die Immobilisierung von Liganden in einem Affinitätssensor ebenso wie die Immobilisierung von Enzymen in amperometrischen Enzymsensoren. Aber auch eine Selektivitätssteigerung von Sensoren wird ermöglicht, indem Moleküle oberhalb eines bestimmten Molekulargewichts ausgeschlossen werden können, wobei die Grenze durch die Struktur der Beschichtung eingestellt werden kann.

Die erfindungsgemäßen Schichten lassen sich besonders vorteilhaft zur Beschichtung von Biochips, hier besonders von Proteinchips anwenden, da sie zum einen unspezifische Anbindungen an die Chipoberfläche unterdrücken und auf der anderen Seite eine hohe Immo- bilisierungskapazität gewährleisten.

In der Massenspektro etrie, insbesondere für MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) können die erfindungsgemäßen Hydrogelschichten nicht nur eingesetzt werden, um die zu analysierenden Biomoleküle auf der Targetoberfläche durch elektrostatische Adsorption aufzukonzentrieren, sondern auch, um an kovalent immobilisierten Liganden biospezifische Erkennungsreaktionen durchzuführen. Konventionell be- schichtete MALDI Targets, wie sie beispielsweise in

WO 98/59360 beschrieben werden, eignen sich wegen der geringen Immobilisierungskapazität der planar beschichteten Oberflächen hierfür schlecht, da das resultierende Signal-/ Rausch Verhältnis der hiermit vorgenommenen Messungen zu gering ist. Dasselbe trifft auf Hydrogeloberflächen zu, die gemäß der in US Patent 5,436,161 beschriebenen Methode hergestellt werden, da diese neben anderen, bereits weiter oben beschriebenen Nachteilen, Hydrogele mit einer viel zu kleinen Immobilisierungskapazität liefert. Im Gegensatz hierzu können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren Hydrogelschichten mit einer vielfach höheren Immobilisierungskapazität hergestellt werden. Die an diese Schichten adsorbierten Biomoleküle liefern in der nachfolgenden MALDI Analyse eine sehr gute Signalqualität. Da die bereits erwähnte elektrostatische Aufkonzenz- trierung in der geladenen Hydrogelmatrix nur dann stattfinden kann, wenn die aufzukonzentrierenden Bio- moleküle eine dem Hydrogel entgegengesetzte Ladung tragen, und die Ladung der Biomoleküle wiederum von deren pl (isoelektrischen Punkt) und dem pH der Probenlösung abhängt, können die erfindungsgemäßen Schichten genutzt werden, um den pl von unbekannten Biomolekülen ggf. auch in Mischungen zu bestimmen. Hierzu löst man die unbekannte Probe in Puffern mit verschiedenen pH Werten und läßt diese Lösungen auf diskrete hydrogelbeschichtete Substrate einwirken. Da sich z.B. in einer negativ geladenenen Hydrogelmatrix nur die Moleküle anreichern werden, deren pl oberhalb des eingestellten pHs liegt, kann man bei geeigneter Abstufung des pH Gradienten durch eine nachfolgende MALDI Analyse oder andere Methode zur Quantifizierung der adsorbierten Biomoleküle den pl der Einzelkompo- nenten einer Mischung recht genau eingrenzen.

In einer weiteren Ausführung können die Hydrogelschichten zur Sequenzanalyse von Biomolekülen, insbesondere von Proteinen genutzt werden. Hierzu immobilisert man zunächst ein geeignetes, z.B. proteoly- tisch wirkendes Enzym in der Hydrogelmatrix und läßt dieses auf in einem späteren Schritt adsorbierte Biomoleküle einwirken. Die Massen der resultierenden Abbauprodukte können dann mittels MALDI bestimmt werden.

Durch die Verwendung eines geeigneten polymeren Haftvermittlers besteht in einer weiteren Ausführungsform die Möglichkeit, für MALDI Messungen üblicherweise unmittelbar vor der Messung aufgetropfte UV absorbie- rende Substanzen, wie z.B. 3, 5-Dimethoxy-4- hydroxyzi tsäure durch kovalente Kopplung in den Haftvermittler zu integrieren. Hierdurch wird die energieadsorbierende Wirkung des UV Absorbers nicht nur gleichmäßiger über die Targetfläche verteilt, sondern es wird auch eine eventuelle Denaturierung der untersuchten Biomoleküle verhindert, da diese mit dem UV Adsorber nicht in Kontakt kommen. Eine größere Menge UV absorbierenden Materials läßt sich auf die Oberfläche aufbringen, indem man diese Substanzen in Partikel, Vesikel oder Liposomen einschließt und die- se als Haftvermittler verwendet.

Bei der Verwendung leitfähiger Substrate besteht die Möglichkeit, die Beschichtungen durch Anlegen eines Potentiales für die Immobilisierung von Biomolekülen, in einer weiterführenden Variante auch für die stationäre Chromatographie einzusetzen. Hierbei kann durch Änderung des angelegten Potentials eine stationäre Phase mit variablen Adsorptionseigenschaften realisiert werden.

Auf der anderen Seite ist es möglich, die erfindungsgemäßen Schichten zur Optimierung chromatografischer Prozesse oder zur Charakterisierung unbekannter Substanzgemische einzusetzen. Hierfür immobilisert man auf einem Träger nebeneinander mehrere Schichten mit unterschiedlichen Adsorptionseigenschaften. Dies können zum Beispiel unterschiedlich geladene, hydrophob, mit Metallionen oder mit chelatisierenden Gruppen de- rivatisierte Hydrogelschichten sein. Gibt man nun die Lösung einer zu untersuchenden Substanz auf einen derartigen Träger und analysiert mit einer geeigneten Analysenmethode, wie z.B. MALDI oder SPR die an die unterschiedlichen Schichten adsorbierte Menge, so können sehr schnell substanzspezifische Adsorptions- profile erstellt werden. Diese können dann beispielsweise verwendet werden, um chromatografische Reini- gungsprozesse zu entwickeln bzw. zu optimieren. Beaufschlagt man einen derartigen Träger mit einem unbekannten Probengemisch, so werden die Einzelbestandteile je nach Affinität in unterschiedlichem Maß an die verschiedenen Schichten adsorbiert. Durch nachfolgende MALDI Analyse können die sich hierdurch ergebenden spezifischen Adsorptionsmuster dann ermittelt werden.

Weitergehende Verwendungsmöglichkeiten bestehen auch im Einsatz als schmutzabweisende Beschichtungen oder Antihaftbeschichtungen in wäßrigen Medien. Dazu zählt auch die Beschichtung von Füllkörpern von Bioreaktoren, ebenso wie die bioinerte Beschichtung von medi- zinischen Geräten oder auch Implantaten, die in Kontakt mit Körperflüssigkeiten und/oder Gewebe stehen. Besonders interessant ist für letztere Anwendung die Möglichkeit, die Beschichtungen mit anderen Biomolekülen zu derivatisieren. So können beispielsweise ge- webespezifische Adhäsions- oder Wachstumsfaktoren in die Beschichtungen immobilisiert werden. Dies kann z.B. das gewünschte Einwachsen von Implantaten erheblich beschleunigen oder gar erst ermöglichen. Immobilisert man blutgerinnungshemmende Biomoleküle, wie z.B. Heparin an die Beschichtungen, so wird die Hämo- kompatibilität erheblich verbessert. Gegenüber konventionellen Verfahren zur Heparinimmobilisierung hat diese Methode den Vorteil, daß bei geringerem Hepa- rinverbrauch dickere und stabilere Schichten reali- siert werden können.

Eine weitere Variante stellt die Kopplung von pharmazeutisch aktiven Wirkstoffen an Haftvermittler- oder Hydrogelschicht dar. Werden diese beispielsweise über hydrolysierbare Bindungen, wie z.B. Estergruppen angebunden, werden sie durch allmähliche Hydrolyse co o IV) cπ o Cπ o Cπ o Cπ

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den höhermolekularen Ketten, wodurch ein Hydrogel mit einstellbarer Porengröße entsteht. Diese läßt sich vorteilhaft zur Steigerung der Selektivität in Sensoren verwenden. Werden Polymere unterschiedlicher Ladungsdichte gemischt und Liganden in einem zweiten Arbeitsgang bevorzugt an die höhergeladenen Ketten gekoppelt, so kann die herabgesetzte Ladung der dazwischenliegenden Bereiche zu deutlich reduzierten unspezifischen Wechselwirkungen führen.

Fig. 4 zeigt schematisch ein Fig. 1 ähnliches Schichtelement, in dem über der hydrophilen Polymerschicht in Bürstenkonformation (4) noch eine weitere vorzugsweise ungeladene in Train Konfiguration vorliegende indifferente Polymerschicht (5) gelegt wurde. Solche Architekturen stellen nach Immobilisierung eines Liganden innerhalb Schicht (4) eine diffusionslimitier- te Beschichtung dar, die sich besonders vorteilhaft zur Konzentrationsbestimmung von Analyten in Affini- tätssensoren eignet. Des weiteren schirmt Schicht (5) die eigentliche sensitive Schicht (4) gegen unspezifische Wechselwirkungen aus der Probenmatrix ab und kann ebenfalls als molekularer Filter genutzt werden.

Beispiel 1:

Carboxymethyl (CM) Dextran mit reduziertem Carboxyme- thylierungsgrad

Zu einer Lösung von 0,5 g Dextran MW 60 kDa (Sigma) in 10 ml 3 M NaOH werden unter ständigem Rühren 0,74 g Iodessigsäure gegeben. Nach 70 min bei Raumtemperatur neutralisiert man mit Phosphorsäure und dialy- siert gegen dest. Wasser. Die Carboxymethyldextranlö- sung wird anschließend auf 1-2 ml eingeengt, mit 5 ml Methanol versetzt und anschließend mit 25 ml Ethanol gefällt. Nach Zentrifugation, zweimaligem Waschen mit Ethanol und Trocknung im Vakuum erhält man 410 mg weißes Pulver. Der Carboxymethylierungsgrad, der sich beispielsweise durch Rücktitration eines mittels sauren Ionenaustauschern in die freie Säure überführten Aliquots ermitteln läßt, beträgt 1 COOH Gruppe pro sechs Anhydroglucoseeinheiten.

Beispiel 2:

CM Dextran Monoschichten auf carboxylfunktionalisier- ten Oberflächen

1 mm dicke einseitig mit Gold bedampfte Glasplättchen werden gereinigt, mit einer Lösung aus 0,1 % Poly (ethylen-co-maleinsäure-co-maleinsäuremono (carboxy- methylethylsulfid) ester) in Wasser überschichtet und 1 h lang geschwenkt. Die derart carboxylfunktionali- sierten Glasplättchen werden durch einstündige Beaufschlagung mit 20 mM N- (3-Dimethylaminopropyl) -N ^λ- ethylcarbodiimid (Fluka) und 10 M N- Hydroxysuccinimid (Merck) in 0,1 M Natrium 2- Morpholino-ethansulfonatpuffer, pH 6,0 (Fluka) in die aktiven NHS Ester überführt. Man überschichtet die getrockneten Substrate mit wenigen μl einer Lösung aus 20% 1/6 CM Dextran MW 60 kDa (aus Beispiel 1), 2% Glucuronsäure und 1% Dimethylaminopyridin (Merck) , zieht das Lösungsmittel im Vakuum ab und inkubiert 10 min bei 50 °C. Abschließend wird nicht gebundenes Dextran durch 5 minütige Behandlung mit 0,1 M HC1 abgelöst . Beispiel 3 :

CM Dextran Mono- und Multischichten auf aminofunktio- nalisierten Oberflächen

1 mm dicke einseitig mit Gold bedampfte Glasplättchen werden gereinigt und mit einer Lösung aus 5% Polye- thylenimin MW 600 - 1000 kDa (Fluka) in Wasser 15 min lang geschwenkt. Nach Spülen mit dest. Wasser werden die aminofunktionalisierten getrockneten Substrate mit einer Lösung aus 15% 1/6 CM Dextran MW 60.000 (aus Beispiel 1) in je 0,1 M N- (3-Dimethylamino- propyl) -N^λ-ethylcarbodiimid (Fluka), N- Hydroxysuccinimid (Merck) und Natriumphosphat, pH 6,0 , (Fluka) beaufschlagt und eine Stunde stehengelassen. Das zu einer gelartigen Masse erstarrte CM Dextran behandelt man 10 bis 20 Stunden mit 0,1 M Na- Carbonatpuffer pH 9,4, worauf sich nicht kovalent gebundenes CM Dextran ablöst. Die verbleibende Mo- noschicht weist einen Kontaktwinkel von unter 5° auf.

Beispiel 4:

Stabilisierung gegen unspezifische Proteinadsorptionen durch CM Dextran Beschichtungen

Das goldbeschichtete, CM Dextran modifizierte Glassubstrat aus Beispiel 2 wird in einen Oberflächen- plasmonenresonanz (SPR) Biosensor (IBIS, XanTec) montiert und durch Beaufschlagung mit verschiedenen pro- teinhaltigen Lösungen auf unspezifische Wechselwirkungen geprüft (s. Fig. 5). An eine unbeschichtete Vergleichsfläche werden bereits aus einer Lösung von 1 mg Rinderserumalbumin (BSA) / ml physiologischer Kochsalzpuffer (PBS), pH 7,4 innerhalb kurzer Zeit ca. 5 ng Protein / mm² irreversibel adsorbiert, was einer nahezu vollständigen Belegung entspricht. An die mit Carboxymethyldextran beschichtete Oberfläche findet dagegen selbst bei Beaufschlagung mit unverdünntem foetalen Kälberserum keine Adsorption statt.

Beispiel 5:

Erhöhung der Immobilisierungskapazität durch dreidimensionale Hydrogelstrukturen

Ein analog zu Beispiel 3 mit Carboxymethyldextran MW 500 kDa beschichtetes goldbedampftes Glassubstrat wird in einen Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) Biosensor (IBIS, XanTec) montiert und die Immobilisierungskapazität der Sensoroberfläche gemessen (s. Fig. 6) . Bei Beaufschlagung mit einer Lösung von 50 μg BSA / ml 10 mM Natriumacetatpuffer pH 5,0 findet eine ca. fünffach höhere elektrostatische Adsorption statt, als .an eine vergleichbare carboxylierte planare Oberfläche. Im vorliegenden Beispiel wird das angereicherte BSA durch Elutionspuffer (2 M NaCl, pH 13) wieder quantitativ desorbiert. Überführt man vor der Proteinanreicherung einen Teil der Carboxylgruppen mittels 20 mM N- (3-Dimethylaminopropyl) - ^Λ- ethylcarbodiimid (Fluka) und 10 mM N- Hydroxysuccinimid (Merck) in 0,1 M Natrium 2- Morpholino-ethansulfonatpuffer, pH 6,0 (Fluka) in die aktiven NHS Ester, werden die zunächst elektrostatisch angereicherten Proteine kovalent gebunden und lassen sich folglich nicht mehr eluieren. Beispiel 6 :

Dreidimensional - fraktale Hydrogelstrukturen

Die Goldsensordiscs werden gemäß Beispiel 3 mit Carboxymethyldextran beschichtet. Statt Polyethylenimin wird hierbei Polyallylamin (Aldrich Nr. 28,322-3) hohes Molekulargewicht und statt 1/6 Cm Dextran MW60 kDa wird diesmal vollständig carboxyliertes CM Extran MW 5 kDa verwendet. Dieses spült man einmal mit 2 M

NaCl, 10 mM NaOH und eine andere Charge mit 2 M NaCl, 10 mM HC1. Im Fall der sauren Spülung beträgt die Immobilisierungskapazität ca. 8,5 ng BSA/mm², bei der alkalischen Elution hingegen nur 5,3 ng BSA/mm². Zu- rückgeführt werden kann diese Beobachtung auf eine lockere, teilabgelöste Struktur der Polyallylaminket- ten nach der sauren Elution, die letztlich eine höhere Oberfläche und damit auch eine höhere Immobilisierungskapazität zur Folge hat.

Beispiel 7:

Gemischte Hydrogelschichten

Die Goldsensordiscs werden gemäß Beispiel 3 mit Carboxymethyldextran beschichtet, wobei man statt 1/6 CM Dextran MW 60.000 diesmal jedoch eine Mischung aus 7,5 % 1/6 CM Dextran MW 5.000 und 7,5 % vollständig carboxyliertes Dextran MW 60.000 verwendet. Die resultierenden Beschichtungen zeigen eine deutlich geringere Diffusionslimitierung bei der Anbindung von Biomolekülen an immobilisierte Liganden sowie verbesserte Stabilisierung gegen unspezifische Wechselwir- kungen. Beispiel 8 :

Diffusionslimitierte HydrogelStrukturen

Die Goldsensordiscs werden gemäß Beispiel 3 mit Carboxymethyldextran beschichtet. Anschließend aktiviert man die Carboxylgruppen erneut mit jeweils 0,2 M N- (3-Dimethylaminopropyl) -N -ethylcarbodiimid und N- Hydroxysuccinimid und beaufschlagt die Chips mit ei- ner Lösung von 10% Dextran MW 500.000 in 0,1 M PBS Puffer pH 7,5. Nach einer Reaktionszeit von 2 bis 4 Stunden wäscht man ungebundenes Dextran mit 0,1 M Na- triumcarbonatpuffer pH 9,4 über 4 Stunden ab. Die resultierenden Doppelschichten zeigen eine deutlich hö- here Diffusionslimitierung bei der Anbindung von Biomolekülen an immobilisierte Liganden als die in Beispiel 3 beschriebenen Monoschichten. Sie eignen sich deshalb vorzugsweise zur Durchführung von Konzentrationsbestimmungen. Fig. 11 zeigt die elektrostatische Adsorption von BSA in diese Doppelschichtstruktur.

Der lineare, diffusionskontrollierte Bereich ist mit Pfeilen gekennzeichnet.

Beispiel 9:

Reversible Antikörperanbindungen an immobilisierte Haptene

Um die Eignung der in den obigen Beispielen beschriebenen Hydrogelstrukturen als Immobilisierungsmatrix zur Durchführung von Immunassays zu testen, wurde 2,4 Dichlorphenoxyessigsäure-3-Aminopropylamid kovalent an einen mit CM Dextran derivatisierten SPR Sensor- chip gekoppelt. Die derart mit Haptenen versehene Oberfläche beaufschlagte man anschließend mit Anti 2.4 Dichlorphenoxyessigsäure Antikörpern in den Konzentrationen 1 μg/ml (1), 16 μg/ l (2), 2 μg/ml (3),

1.5 μg/ml (4) und 3 μg/ml (5) (Fig. 7). Die Antikörper waren jeweils in PBS Puffer, pH 7,4 gelöst; nach der Antikörperbeaufschlagung wurde zunächst jeweils mit einer Lösung von 100 μg 2,4 Dichlorphenoxyessig- säure-3-Aminopropylamid/ml PBS Puffer die Dissoziation gemessen und die Chipoberfläche anschließend mit 0,5 M NaOH vollständig regeneriert. Vor dem nächsten Assay stellte man mit PBS Puffer jeweils wieder das

Grundsignal ein. Nach jedem Assay wurden die gebundenen Antikörper mit denaturierender Regenerationslösung nahezu quantitativ wieder abgelöst.

Beispiel 10:

Elektrodeposition in Carboxy ethyldextranhydrogel- schichten

Fig. 8 zeigt die irreversible Anbindung von Avidin an dextranbeschichtete Sensoroberflächen durch Anlegen eines ausreichend negativen Potentials unter Bedingungen, bei denen ohne Potential keine Adsorption er- folgen würde. Zunächst wird die Oberfläche durch Behandlung mit 1 M NaCl regeneriert (100 sec) . Zur Kontrolle legt man anschließend in Abwesenheit von Avidin eine negatives Potential von - 0.4 und - 0.6 V an (bei ca. 300 sec), wobei sich keine Veränderung des SPR Signals zeigt. Nach 400 sec. werden zunächst 500 μg Avidin / ml 2 mM Natriu acetatpuffer pH 4,7 zugegeben, worauf ca. 8 ng/mm² adsorbiert werden. Durch Anlegen verschiedener negativer Potentiale wird zusätzlich Avidin abgeschieden (bei 600 sec) . Wie ein Elutionsversuch durch Behandlung mit 1 M NaCl zeigt (bei 800 sec) , verbleibt das Protein irreversibel in der Matrix. Avidin ist biologisch voll aktiv, was durch Bindung von biotinylierter Glucoseoxidase belegt wird (bei 900 sec) . Die Bindung widersteht einer Elution von 10 mM NaOH in 2 M NaCl.

Beispiel 11:

Herstellung von ultradünnen Enzymschichten sowie Ver- wendung in einem Enzymsensor

In Fig. 9 wird beispielhaft die Bestimmung von Glukose mit GOD-Pt-Elektroden auf der Basis von Carboxyme- thyldextranmonolagen gezeigt. Die Pt-Elektroden, Maße 800 x 800 μm werden zunächst gemäß Beispiel 3 mit einer Monoschicht 1/6 CM-Dextran 60 kDa auf PEI Haftvermittler versehen.

Avidin wird aus einer Lösung von 500 μg/ml Avidin in 2 mM Natriumacetat, pH 4.7 gemäß Beispiel 8 bei einem Potential von - 0.8 V (1 h) auf der Elektrodenoberfläche abgeschieden. Anschließend inkubiert man mit biotinylierter Glukoseoxidase (50 μg/ml) in PBS Puffer, pH 7,4 über 1 Stunde. Die so derivatisierten Elektroden werden mit verschieden konzentrierten Glu- coselösungen (100, 250, 500, 1000 u. 2000 μmol/1 Glc) in PBS Puffer, pH 7.4 kalibriert (s. Fig. 10). Gemessen wird dabei das enzymatisch gebildete H₂0₂ bei + 700 mV gegen eine Ag/AgCl-Referenzelektrode (3 M KC1) . Beispiel 12 :

Verbesserung der Signalqualität von MALDI Messungen durch Aufkonzentration der Analytmoleküle in Hydro- gelschichten

Herstellung des Referenztargets: Ein goldbedampftes MALDI Target (Micromass Ltd., Manchester, GB) wird gereinigt und 2 h mit einer 0,5% Lösung von 1- Dodecanthiol in Ethanol beaufschlagt. Anschließend wäscht man mit Ethanol und Wasser. Die hydrophobe Oberfläche beaufschlagt man anschließend mit einer Lösung von 1 mg BSA / ml 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,0. Nach 2 h ist auf der hydrophoben Oberfläche eine Mo- nolage BSA adsorbiert worden. Es wird gespült und getrocknet .

Herstellung des hydrogelbeschichteten Targets: Ein goldbedampftes MALDI Target (Micromass Ltd., Manche- ster, GB) wird gereinigt und gemäß Beispiel 3 mit

Carboxymethyldextran MW 2 Mio. Da beschichtet. Die so derivatisierte Oberfläche wird 1 h mit einer Lösung von 0,1 mg BSA / ml 10 mM Natriumacetatpuffer pH 5,0 beaufschlagt. Anschließend spült man mit gleichem Na- triumacetatpuffer oder Wasser und trocknet.

Auf beide Targets wird je Meßpunkt 0,5 μl 10 mg/ml Sinapinsäurelösung getropft, getrocknet und die Targets anschließend einer MALDI ToF Analyse unterzogen. Fig. 12 zeigt das Signal der hydrophoben Vergleichsoberfläche, Fig. 13 das hydrogelbeschichtete Target. Das Signal/Rauschverhältnis des hydrogelbeschichteten Targets ist ca. sechsmal besser als das des Vergleichstargets. Beispiel 13:

Separation von Proteinen unterschiedlichen pls aus Zelllysaten und nachfolgende MALDI Analyse

Herstellung des hydrogelbeschichteten Targets: Ein goldbedampftes MALDI Target (Micromass Ltd., Manchester, GB) wird gereinigt und gemäß Beispiel 3 mit Carboxymethyldextran MW 20 Mio. Da beschichtet. Ein Teil der so derivatisierten Oberfläche wird 1 h mit einer auf pH 4,8 gepufferten Lösung eines vorher entsalzten Monocytenlysats beaufschlagt. Der andere Teil wird 1 h mit einem analog hergestellten Monocytenly- sat pH 7,3 inkubiert. Beide Oberflächen werden mit Wasser gespült, kurz getrocknet und gemäß Beispiel 13 einer MALDI Analyse unterworfen. Fig. 14 zeigt das Spektrum des pH 4,8 Lysats, Fig. 15 das des pH 7,3 Lysats. Die Pfeile in Fig. 14 kennzeichnen einige Pe- aks, die bei pH 7,3 nicht mehr erscheinen. Hieraus kann geschlossen werden, daß die zugehörigen Moleküle einen pl zwischen 4,8 und 7,3 haben.

Claims

Patentansprüche

1. Beschichtung auf einem Substrat, enthaltend eine polymere Haftvermittlerschicht und eine weitere, mindestens einen Polymer enthaltende, hydrophile Polymerschicht, deren Polymerketten zumindest teilweise bürstenartig ausgerichtet sind.

2. Beschichtung nach Anspruch 1, dadurch gekenn- zeichnet, dass auf der hydrophilen Polymerschicht mindestens eine weitere Polymer- und/oder Partikelschicht aufgetragen ist.

3. Beschichtung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die hydrophile Po- lymerschicht aus mindestens zwei unterschiedlichen Polymeren besteht, die sich in der chemischen Zusammensetzung, der Ladung und/oder ihrem Molekulargewicht unterscheiden.

4. Beschichtung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die hydrophile Schicht ausgewählt ist aus Polysacchari- den, Polyalkoholen, Polyethern, Polyamiden, Po- lycarbonsäuren, Polysulfaten/-sulfonaten, Poly- phosphaten/-phosphonaten und/oder Kombinationen dieser.

5. Beschichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die hydrophile Polymerschicht zur kovalenten Immobilisierung eines Liganden zusätzlich funktionalisiert ist.

6. Beschichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die hydrophile Polymerschicht mit Isothiocyanat-, Isocyanat-, Carbonsäureazid-, N-Hydroxysuccinimidester-, N- Acylimidazol-, Sulfonylchloridderivat-,Aldehyd-, Keto-, Glyoxal-, Oxiran-, Carbonat-, Arylhaloge- nid-, Imidoester-, Anhydrid-, Halogenalkyl-, Ha- logenacyl-, Maleimid-, Aziridin-, Acryloyl-,

Sulfhydryl-, Disulfid-, Diazoalkan-, Diazoace- tyl-, Imidazolylcarbamat-, Hydrazid-, Diazonium- , Arylazid-, Benzophenon-, Diazopyruvat- oder Diaziringruppen funktionalisiert ist.

7. Beschichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die hydrophile Polymerschicht für die Immobilisierung eines Liganden über ein Metallchelat zusätzlich funktionalisiert ist, wie z.B. durch die Reaktion mit Nitrilotriessigsäurederivate.

8. Beschichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass an die hydrophile Polymerschicht zusätzlich Moleküle für die Immobilisierung eines Liganden über eine biospezifi- sehe Erkennungsreaktion gebunden sind.

9. Beschichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 dadurch gekennzeichnet, dass an die hydrophile Polymerschicht Biomoleküle, Proteine, Nukleinsäuren, (Poly-) saccharide, Antikörper, Adhäsi- onsfaktoren, Wachstumsfaktoren, gerinnungshem- mende Faktoren, wie z.B. Heparin und/oder andere biologische Effektormoleküle gebunden sind.

10. Beschichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Haftvermittler- schicht aus mindestens einem Polymer, dessen Polymerketten parallel zur Substratoberfläche angeordnet sind, oder mindestens einem globulären Polymer besteht.

11. Beschichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Haftvermittlerschicht aus Partikeln, Vesikeln oder Liposomen besteht.

12. Beschichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Haftvermittlerschicht eine im Nanomaßstab und/oder Mikromaß- stab aufgerauhte Oberfläche bildet.

13. Beschichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Haftvermittlerschicht aus einem amphiphilen Polymer, z.B. einem Polyamin besteht, das Disulfid-, Sulfid-, Diselenid-, Selenid-, Thiol-, Isonitril-, Nitro- , Selenol-, P(III)-, Isothiocyanat-, Xanthat-, Thiocarbamat-, Phosphin-, Thioacetat-, Silanol-,

Silylether-, Silylester-, Silylthioester-, Silylthioether-, oder Dithioacetatgruppen tragen kann.

14. Beschichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, bei der der polymere oder partikelförmige Haftvermittler energieabsorbierende, bevorzugt UV absorbierende Gruppen trägt.

15. Beschichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass der polymere Haft- Vermittler Sinapinsäure-, Sinapinsäureamid-, Di- methoxyhydroxysinapinsäure, Sinapinsäurebromid-, Dihydroxybenzoesäure- oder Cyanohydroxysinapin- säuregruppen trägt oder diese Substanzen in einem partikel-, vesikel- oder liposomenartigen Haftvermittler eingeschlossen sind.

16. Beschichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass der polymere und/oder partikelförmige Haftvermittler pharma- zeutisch aktive Wirkstoffe, in kovalent und/oder nichtkovalent gebundener Form enthält.

17. Beschichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Haftvermittlerschicht aus al- ternierenden Polymer- und/oder Partikelschichten besteht .

18. Beschichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat aus einem leitfähigen Material, einem Glasmaterial oder anderem oxidischem Material, das zusätzlich silanisiert sein kann, einem Edelmetall, das zusätzlich mit einem Alkylmercaptan funktionali- siert sein kann, einem Kunststoffmaterial, aus Naturfasern und/oder Kunstfasern besteht.

19. Beschichtung nach Anspruch 18, bei der das Substrat durch Behandlung mit Oxidationsmitteln, mit Plasma und/oder ionisierender Strahlung funktionalisiert und/oder gesäubert ist.

20. Beschichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 19, bei der das Substrat aus Nano- und/oder Mikro- partikeln besteht.

21. Verfahren zur Herstellung einer Beschichtung auf einem Substrat, bestehend aus einer Haftvermittlerschicht und einer weiteren hydrophilen Poly- merschicht aus mindestens einem weiteren Polymer,

d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t,

dass über die Molekularmasse und/oder die Konzentration des hydrophilen Polymers die Ausrichtung der Polymerketten gesteuert und dadurch die Immobilisierungskapazität der Beschichtung ein- gestellt wird.

22. Verfahren zur Herstellung einer Beschichtung auf einem Substrat nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die hydrophile Polymerschicht ausgewählt ist aus Polysacchariden, Polyalkoho- len, Polyethern, Polyamiden, Polycarbonsäuren, Polysulfaten/-sulfonaten, Polyphosphaten/- phosphonaten und/oder Kombinationen dieser, wobei eine zusätzliche Funktionalisierung der hy- drophilen Polymerschicht erfolgen kann.

23. Verfahren zur Herstellung einer Beschichtung auf einem Substrat nach Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Permeabilität der hydrophilen Polymerschicht für Substanzen mit unter- schiedlichem Molekulargewicht durch das Konzentrationsverhältnis mindestens jeweils eines hoch- und eines niedermolekularen Polymers gesteuert wird.

24. Verfahren zur Herstellung einer Beschichtung auf einem Substrat nach einem der Ansprüche 21 bis

23 , dadurch gekennzeichnet, dass die Haftvermittlerschicht vor und/oder während der Kopplung der hydrophilen Polymerschicht und/oder der Aufbringung auf die Haftvermittlerschicht mit kupp- lungsfähigen Gruppen aktiviert wird und das hydrophile Polymer durch diese Gruppen kovalent gekoppelt wird.

25. Verfahren zur Herstellung einer Beschichtung auf einem Substrat nach Anspruch 21 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Haftvermittlerschicht und/oder das hydrophile Polymer vor, während und/oder nach der Kopplung mit Isothiocyanat-, Isocyanat-, Carbonsäureazid-, N-Hydroxy- succinimidester-, N-Acylimidazol-, Sulfonylchlo- . ridderivat-,Aldehyd-, Keto-, Glyoxal-, Oxiran-, Carbonat-, Arylhalogenid-, Imidoester-, Anhydrid-, Halogenalkyl-, Halogenacyl-, Maleimid-, Aziridin-, Acryloyl-, Sulhydryl-, Disulfid-,

Diazoalkan-, Diazoacetyl-, Imidazolylcarbamat-, Hydrazid-, Diazonium-, Arylazid-, Benzophenon-, Diazopyruvat- oder Diaziringruppen funktionali- siert werden.

26. Verfahren zur Herstellung einer Beschichtung auf einem Substrat nach Anspruch 21 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass das hydrophile Polymer während der Beaufschlagung auf das haftvermittler- beschichtete Substrat mit einer Mischung aus 1- Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimid und

N-Hydroxysuccinimid aktiviert wird.

27. Verfahren zur Herstellung einer Beschichtung auf einem Substrat nach einem der Ansprüche 21 bis 26 dadurch gekennzeichnet, dass der pH und die Salzkonzentration bei der Adsorption der Haftvermittlerschicht an das Substrat so gewählt wird, dass sich eine im Nanomaßstab angerauhte Oberfläche bildet.

28. Verfahren zur Herstellung einer Beschichtung auf einem Substrat nach einem der Ansprüche 21 bis

27, dadurch gekennzeichnet, dass die Haftvermittlerschicht aus einem amphiphilen Polymer, z.B. einem Polyamin, das Disulfid-, Sulfid-, Di- selenid-, Selenid-, Thiol-, Isonitril-, Nitro-, Selenol-, P(III)-, Isothiocyanat-, Xanthat-,

Thiocarbamat-, Phosphin- Thioacetat- oder Dit- hioacetatgruppen tragen kann, gebildet wird.

29. Verfahren zur Herstellung einer Beschichtung auf co IV) μ» o Cπ o Cπ O Cπ

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tung mit Lösungen unterschiedlichen pHs der betreffenden Moleküle beaufschlagt wird und die Adsorption der Moleküle an die Beschichtung bestimmt wird.

35. Verwendung der Beschichtung nach Anspruch 1 bis 20 zur Optimierung chromatographischer Prozesse.

36. Verwendung der Beschichtung nach Anspruch 1 bis 20 zur Auf onzentration von Biomolekülen und/oder die Immobilisierung von Biomolekülen, z.B. als Beschichtungsmaterial für stationäre chromatographische Phasen, wobei das Substrat leitfähig sein kann und hieran zusätzlich ein Potential angelegt werden kann.

37. Verwendung der Beschichtung auf einem Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 20 zur Beschichtung von Nano-, Mikropartikeln, intrakorporalen Wirstoffdepots und/oder Füllkörper von Bioreaktoren.

38. Verwendung der Beschichtung auf einem Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 20 als schmutzabweisende Beschichtung oder als Antihaftbeschich- tung in wäßrigen Medien.

39. Verwendung der Beschichtung auf einem Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 20 als bioinerte und/oder bioaktive Beschichtung für mit biologischen Medien in Kontakt stehende medizinische Geräte und/oder Implantate .

40. Verwendung der Beschichtung auf einem Substrat nach einem der Ansprüche 1 bis 20 als Antibe- schlagsbeschichtung für optische Elemente, z.B.

Gläser, oder für die Retention von Flüssigkeiten auf optischen Geräten in der Ophthalmiatrie. Zusammenf ssung

Die Erfindung bezieht sich auf Beschichtungen von verschiedenartigen Substraten, wobei eine hydrophile Polymerschicht über eine polymere Haftvermittlerschicht an ein Substrat gebunden wird. Ebenso wird ein Verfahren zur Herstellung dieser Schichtsysteme vorgestellt.

Als Anwendung dieser erfindungsgemäßen Schichten bietet sich der Einsatz z.B. als Immobilisierungsmatrix und zur Unterdrückung unspezifischer Proteinadsorption in Biosensoren, MALDI Targets und anderen bioanalytischen Geräten an. Weiterhin können sie zur Bio- kompatibilisierung von Implantaten und zur Beschichtung von Kontaktlinsen verwendet werden. Optische Elemente, die mit derartigen Beschichtungen versehen sind, beschlagen nicht mehr. Darüber hinaus sind die Schichten schmutzabweisend bzw. selbstreinigend.