WO2002011759A1 - Vaccin contre les cytokines ou facteurs de croissance issus de tumeurs malignes - Google Patents

Vaccin contre les cytokines ou facteurs de croissance issus de tumeurs malignes Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to the use of medicinal vaccine preparations for therapeutic or prophylactic use intended to treat or prevent immune disorders in malignant tumors, in particular immunosuppression and apoptosis of immune or vascular cells such as angiogenesis, induced by extracellular factors, cytokines or other regulatory factors in particular transcriptional, abnormally produced by cancer cells or stromal cells.
  • TAA and TSA as antigens, have been carried out, aiming to specifically destroy the malignant cells carrying these antigens thanks to the action of killer cells, particularly of cytolytic lymphocytes (CTL), carriers of specific receptors, induced by the vaccine immune reaction.
  • CTL cytolytic lymphocytes
  • TAA or TSA presented in different forms were well tolerated and generally did not cause regional or systemic complications.
  • Such vaccine preparations can induce a CTL-type immune response in patients (Tsunoda T, Tanimura H, Yamaue H, Tanaka H, Matsuda K. Tumor specifies CTL therapy for advanced cancer and development for cancer vaccine. Hepatogastroenterology (1999) 1: 1287-1292,
  • the Applicant has surprisingly discovered that the immunosuppression and angiogenesis of the microenvironment of cells infected with certain viruses such as HIV-1 and of the microenvironment of cancer cells provide a rational explanation for the lack of efficacy of these vaccine strategies. because these previous strategies target the cancer cell and not the disruption of its micro environment.
  • tissue or tumor is made up of parenchymal cells that are immersed in a micro environment called a stroma.
  • This stroma is itself made up of stromal cells (which can be immune, endothelial, or fibroblastic cells) and an extra cellular medium.
  • soluble factors secreted by cells infected with HIV-1 in particular the Tat protein or by the immune cells of patients infected with VI H, in particular IFN ⁇ and TGF ⁇ or produced by cancer cells, such as the HPV E7 protein in cervical cancer or the HTLV1 Tax protein in ATL leukemia or the p53 protein in colorectal cancer, had immunosuppressive properties that could inhibit immune reactions cells in tumors and therefore explained the ineffectiveness of previous vaccines.
  • Glioblastoma cells release interleukin 1 and factors inhibiting interleukin 2-mediated effects.
  • J Immunol. (1984 ) 132: 1837-44) melanomas (30.Hersey P, Bindon C, Czemiecki M, Spurling A, Wass J, McCarthy WH. Inhibition of interleukin 2 production by factors released from tumor cells. J Immunol. (1983) 131 : 2837-42), or malignant ascites (Tamura K, Shibata Y, Matsuda Y, Ishida N. Isolation and characterization of an immunosuppressive acidic protein from ascitic fluids of cancer patients. Cancer Res.
  • transcriptional regulatory factors are of cellular origin such as the protein p53, accumulated in certain malignant tumors, in particular colorectals (Remvikos Y, Tominaga).
  • Cytokines such as the notoriously immunosuppressive TGF ⁇ ; angiogenic growth factor VEGF, pro-inflammatory IL 6 or also immunosuppressive IL 10, are abnormally secreted and released in the extracellular environment of certain cancer cells.
  • the Applicant has itself shown that the cells of the SIHA cancer line, like the DU145 cells of the prostate cancer and the MT2 cells of the leukemic lines produce abnormally and release in the extracellular medium cytokines such as VEGF and / or the IL 6 while RAJI cells of leukemic lines secrete in the extracellular medium of
  • the subject of the present invention is the use as an anticancer drug of new vaccine preparations devoid of toxicity and intended to neutralize: either immunosuppressive, apoptotic or angiogenic cytokines produced in the extra cellular stromal compartment in excess by cancer cells or stromal malignancies.
  • the examples of anti-cytokine vaccines described in EP-591,281 particularly concerned anti-IFN ⁇ vaccines used against AIDS and other immune disorders. or cellular regulatory factors, particularly transcriptional or other factors with immunosuppressive, apoptotic or angiogenic properties abnormally produced in the extra cellular stromal compartment by cancer cells.
  • the examples of immunogens described in WO-A-00/03732 were derived from viral regulatory factors such as the E7 proteins of HPV 16, Tax of HTLV-1 and Tat of HIV-1.
  • 1- consists of cytokinic factors or derives from cytokinic factors or particularly transcriptional cellular regulation factors or other factors with immunosuppressive / apoptotic / angiogenic properties abnormally produced by cancer cells or stromal malignant tumors in the extra cellular environment.
  • 2- is preferably presented in a galenical form allowing to induce an immune reaction preferentially inducing class antibodies
  • IgG and / or IgA capable of locally antagonizing the immunosuppressive / apoptotic / angiogenic factors abnormally present in the extracellular environment of tumors and of inhibiting their effects.
  • the present invention proposes in particular the use as an anticancer drug of vaccines directed particularly against pathogenic factors produced abnormally in the extracellular matrix of malignant tumors and in particular the protein TGF ⁇ : TGF ⁇ being a major immunosuppressive cytokine produced by numerous cancer cells; - the protein IL 10: IL 10 being also a major immunosuppressive cytokine the protein p53: If the regulatory protein p53 produced abnormally by cancer cells and accumulated in tumors can represent an associated tumor antigen (TAA) as it has been shown in the prior art, the applicant has discovered that it can also act in its extracellular configuration as an immunosuppressive and apoptogenic factor on the immune cells as illustrated below in the examples.
  • TAA tumor antigen
  • VEGF growth factor of endothelial cells
  • VEGF cytokine being a major cytokine of angiogenesis, activating the proliferation of endothelial cells.
  • IL 6 pro inflammatory cytokines also participating in angiogenesis processes, by activating the expression of adhesion molecules of endothelial cells (ICAM, VCAM, E selectin).
  • IgA for epithelial cancers
  • pathogenic factors which are particularly immunosuppressive / apoptotic / angiogenic and block their effects, thus allowing natural immunity or a vaccine directed against the TAA or TSA antigens to function normally and to eliminate sick cells.
  • the present application relates to a vaccine characterized in that it contains, as active principle, an immunogen which is a factor or which derives from a cytokinic factor or a cell regulatory factor which is particularly transcriptional or d '' another type of factor with immunosuppressive / apoptotic / angiogenic properties abnormally produced by cancer cells or stromal malignant tumors, as well as a pharmaceutically acceptable excipient allowing the induction of a systemic or mucosal immune reaction with formation of antibodies class IgG or secretory IgA directed against the native factor and more particularly a vaccine characterized in that it contains, as active principle, an immunogen which is - a cytokinic factor or a particularly transcriptional cellular regulatory factor or another type of factor abnormal immunosuppressive / apoptotic / angiogenic properties ent released into the extracellular (stromal) medium by cancer cells or stromal cells of malignant tumors, as well as a pharmaceutically acceptable excipient allowing the induction of
  • the immunogen is derived from a cytokinic factor or a particularly transcriptional cellular regulatory factor or from another type of factor with immunosuppressive / apoptotic / angiogenic properties abnormally produced by cancer cells or stromal malignant tumors by chemical, physical treatment , by genetic mutation, by adjuvant conditioning or is the product of a genetic vaccination (DNA vaccine) or is a protein or peptide fragment of such a factor or is derived from such a protein or peptide fragment.
  • the immunogen will preferably be coupled to a carrier protein. Indeed, the Applicant has discovered that such a measure increases the number of auxiliary sites (helper) and therefore increases the antibody response neutralizing the targeted extracellular factor.
  • the immunogen is derived from a cytokinic factor or from a particularly transcriptional cellular regulatory factor or from another type of factor with immunosuppressive / apoptotic / angiogenic properties abnormally produced by the cells. cancerous or stromal malignant tumors or a protein or peptide fragment of such a factor by coupling to a carrier protein which is KLH.
  • the immunogen is chosen from TGF ⁇ , IL 10, protein p53, VEGF, IL 6, IFN ⁇ , IFN ⁇ , Fas ligand and TNF ⁇ or derived from it.
  • the immunogen of these vaccine preparations may derive from an immunosuppressive / apoptotic / angiogenic factor or one of its peptide fragments by chemical, physical treatment, by genetic mutation, by adjuvant packaging or be the product of genetic vaccination (DNA vaccine).
  • immunogen treatments which have been described in WO-A-00/03732 can be used in the present invention for obtaining a vaccine devoid of any toxicity and in particular devoid of any immunosuppressive character. But immunogens can also be used in their native state.
  • Chemical treatments consist, for example, in detoxifying the native or recombinant protein by a treatment with aldehydes in particular formaldehyde, monofunctional aldehyde and therefore not acting by coupling of molecules, in accordance with the detoxification of tetanus or diphtheria toxins, or still consist of treatments blocking sulfidryl groups, such as carboxamidation , maleimidation or carboxymethylation or in any other treatment blocking other amino residues as described in previous applications of the applicant.
  • the immunogen is a mutant of the native factor or a fragment of the native factor.
  • a factor mutant having at least 70%, preferably at least 80% and most particularly at least 90%, may be used.
  • a carrier protein such as KLH or the tetanus toxoid.
  • it will also be possible to use a carrier protein in the case of the native protein factor or else a protein fragment thereof.
  • a DNA vaccine may comprise a plasmid comprising an expression promoter gene such as that of CMV and the gene coding for an immunogen defined above (native factor or derivative including fragments).
  • the immunogenic compound can consist of all or a fragment of the starting protein or even little in particular can be coupled to a protein carrier like KLH (keyhole limpet hemocyanin) or toxoid tetanus, directly or preferably by a bifunctional coupling reagent.
  • KLH keyhole limpet hemocyanin
  • toxoid tetanus directly or preferably by a bifunctional coupling reagent.
  • modifications in the amino acids of this protein or fragment such as deletions, substitutions, additions, or functionalizations such as acylation of amino acids, insofar as these modifications remain within the framework specified above. (absence of toxicity, immunological characteristics).
  • the replacement of a leucine residue by an isoleucine residue does not modify such properties; the modifications must generally relate to less than 40% of amino acids, in particular less than 30% preferably less than 20% and very particularly less than 10% of the protein factor. It is important that the modified protein or fragment is not denatured as can be done for example by a physical treatment such as heat in order to preserve its conformational sites so that the antibodies induced by the modified derivatives are active with respect to the protein native.
  • the homology or the similarity between the modified immunogen and the protein or part of native immunosuppressive protein, as well as the dimensions of the immunogenic compound, as well as the methods of use, or for coupling the immunogenic compound according to the invention to an immunogenic protein such as the tetanus toxoid reference may in particular be made to WO-A-86/06 414 or to EP-A-0.220.273 or also to PCT / US. 86/00831, equivalent.
  • a fragment may contain from 8 to 110 amino acids for example, preferably from 20 to 110, in particular from 12 to 60, particularly from 25 to 60, more particularly from 12 to 40 and very particularly from 30 to 50 amino acids. Such a fragment may also have on the C or N terminal side (s) from 1 to 5 additional amino acids, that is to say different from the original segment.
  • a fragment must also contain at least one cysteine in order to be able to be the subject of carboxymethylation.
  • a protein fragment may comprise all of the amino acids of the native sequence, deleted from less than 25 amino acids, preferably less than 15 amino acids, particularly less than 10 amino acids and very particularly less than 5 amino acids, or even just one. amino acid.
  • the immunogen may in particular be included in a water-in-oil emulsion, using for example ISA 51.
  • a vaccine preparation containing the anti immunosuppressive / apoptotic / angiogenic immunogen may be administered in a dosage form suitable for inducing an immune response of the systemic type by the Intra Muscular (IM), Subcutaneous (SC), Intra Dermal (ID) or mucosal type by intranasal, oral, vaginal or rectal routes.
  • IM Intra Muscular
  • SC Subcutaneous
  • ID Intra Dermal
  • mucosal type by intranasal, oral, vaginal or rectal routes.
  • a vaccine preparation containing the anti immunosuppressive / apoptotic / angiogenic immunogen may also contain other immunogens, such as the TAA or TSA cancer antigens or adjuvants such as cytokines or enterotoxin proteins, CTB type or mutant Lt (LT ⁇ ) (Freytag LC, Clclu JD, Bacterial toxins as mucosal adjuvants Curr Top Microbiol Immunol; (1999) 236: 215-36).
  • TAA or TSA cancer antigens or adjuvants such as cytokines or enterotoxin proteins, CTB type or mutant Lt (LT ⁇ ) (Freytag LC, Clclu JD, Bacterial toxins as mucosal adjuvants Curr Top Microbiol Immunol; (1999) 236: 215-36).
  • a galenic preparation for systemic administration, administered by the SC, IM, ID route, may be a water emulsion containing the immunogen, in oil, or a suspension of calcium phosphate embedding the immunogen, or adsorbent aluminum hydroxide the immunogen.
  • a galenic preparation aimed at a mucosal immune response administered preferentially by nasal or oral route, but also by vaginal or rectal route, especially for reminders, may in particular consist of microspheres of biodegradable polymers, such as PLGs. (poly (lactide-co-glycolides)), PLA ((poly (lactides)) and PCLs, (poly (epsilon- caprolactones)) in delayed form (Baras B. et al, Single-dose mucosal immunization with biodegradable microparticles containing a Schistosoma mansoni antigen. Infect Immun.
  • the vaccine preparations may be packaged for the intranasal route in the form of a gel with carbopol as an excipient, for nasal drops or a spray and for the oral route in the form of gastro-resistant capsules, dragees or gastro-resistant granules.
  • the plasmids can be included in microspheres of biodegradable polymers (PLG, PLA, PCL) and administered in enteric capsules for ingestion (oral).
  • DNA may also be expressed in a living bacterial vector, such as salmonella or viral, such as adenovirus or poxvirus.
  • the present application also relates to the use as an immunogen of a factor which is a cytokinic factor or a cell transcription factor particularly transcriptional or another type of factor with immunosuppressive / apoptotic / angiogenic properties abnormally released in the medium extra cellular (stromal) by cancer cells or malignant tumor stromal cells or derived from such a factor.
  • a factor which is a cytokinic factor or a cell transcription factor particularly transcriptional or another type of factor with immunosuppressive / apoptotic / angiogenic properties abnormally released in the medium extra cellular (stromal) by cancer cells or malignant tumor stromal cells or derived from such a factor.
  • the present application also relates to the use of an immunogen which is a factor or which derives from a cytokinic factor or from a particularly transcriptional cellular regulatory factor or from another type of factor with immunosuppressive / apoptotic / abnormally produced angiogenic by cancer cells or malignant tumor stromal cells to obtain a medicament for use as an anti-cancer agent by mechanism of reduction of effects, on the microenvironment of said cancer cells or stromal malignant tumors, of a cytokinic factor or of a particularly transcriptional cellular regulatory factor or of another type of factor with immunosuppressive / apoptotic / angiogenic properties abnormally produced by said cancer cells or stromal malignant tumors.
  • the present application finally relates to an immunogen which is a factor or which derives from a cytokinic factor or from a particularly transcriptional cellular regulatory factor or from another type of factor with abnormally released immunosuppressive / apoptotic / angiogenic properties.
  • extra cellular medium by cancer cells or stromal malignant tumors for use in a method of therapeutic treatment of the human or animal body, that is to say as a medicament, in particular a curative or preventive vaccine.
  • the immunogens which are the subject of the present invention have very advantageous pharmacological properties. They are endowed in particular with remarkable antagonistic, reducing, inhibiting or in particular neutralizing properties, immunosuppressive / apoptotic / angiogenic properties of factors abnormally produced in the extracellular environment (stromal) by cancer cells or stromal of malignant tumors unlike compounds of l art which act directly on cancer cells of malignant tumors.
  • the medicaments according to the present invention find their use for example in both curative and preventive treatment of cancers of epithelial origin such as for example colorectal cancer, prostate cancer, breast cancer and of conjunctive origin such as sarcomas or of blood origin such as Epstein-Barr type lymphomas or leukemias.
  • the present application also relates to a method of active immunization of patients characterized in that an immunogenic compound as defined above is used as the immunogen advantageously combined with a mineral, oily or synthetic immunity adjuvant, or alternatively an immunogenic compound as defined above, advantageously coupled for example using a dialdehyde or associated with a protein increasing its immunogenicity.
  • an immunogenic compound as defined above is used as the immunogen advantageously combined with a mineral, oily or synthetic immunity adjuvant, or alternatively an immunogenic compound as defined above, advantageously coupled for example using a dialdehyde or associated with a protein increasing its immunogenicity.
  • FIG. 1 shows the inhibition of cell proliferation by TGF ⁇ expressed in% of cell proliferation ((control cpm / sample cpm) ⁇ 100) at three concentrations (30, 10 and 3 ng / ml) of TGF ⁇ and protein p24 .
  • the control corresponds to a concentration of recombinant protein used equal to 0.
  • Figure 2 shows the effect of serum from mice immunized with the VEGF immunogen uncoupled or coupled to KLH according to different coupling techniques and at 4 different dilutions indicated at the top of the table.
  • the experiments were carried out from left to right with naive mice, mice immunized with VEGF on day D 60, mice immunized with KLH-glutaraldehyde-VEGF pH 9 at day D 60, mice immunized with KLH-SMCC -VEGF on day D 60, mice immunized with KLH-SIAB-VEGF on day D 60.
  • the percentage of neutralization is given on the ordinate.
  • Example 1 Vaccine based on the immunogen VEGF intended to induce a systemic immune reaction with preferential formation of specific antibodies of class IgG.
  • the vaccine consists of a water-in-oil emulsion consisting of 50% ISA 51 (Seppic, Paris) and 50% of an aqueous solution of VEGF (20 to 200 ⁇ g / dose).
  • ISA 51 Seppic, Paris
  • VEGF aqueous solution of VEGF (20 to 200 ⁇ g / dose).
  • Example 2 Vaccine based on the plasmid immunogen for DNA vaccination of the IL 10 systemic type.
  • the plasmids coding for IL 10 (50 to 200 ⁇ g / dose) are suspended in 0.2 to 1 ml of PBS for intramuscular administration.
  • Example 3 Vaccine based on the immunogen p53 intended to induce an immune reaction of mucosal type with preferential formation of anti p53 antibodies of class IgA.
  • the immunogen p53 (20 to 100 ⁇ g / dose) is included in a calcium phosphate gel in the presence or not of LT ⁇ adjuvant (5 to 20 ⁇ g / dose) for intra-nasal instillation.
  • the preparation is administered intranasally either in the form of nasal drops or in the form of a gel by addition of carbopol.
  • EXAMPLE 4 Vaccine based on the immunogen IL 10 intended to induce an immune reaction of the mucosal reaction type with preferential formation of anti IL 10 antibodies of class IgA:
  • PLG microspheres containing the immunogen (100 to 300 ⁇ g / dose) and a mutant of the toxin LT (5-25 ⁇ g / dose) were prepared.
  • the inclusion of IL 10 and LT ⁇ is carried out in the biodegradable microspheres according to the protocol of Baras B. et al (Baras B. et al, Single-dose mucosal immunization with biodegradable microparticles containing a Schistosoma mansoni antigen. Infect Immun. (1999) 67: 2643-8).
  • Example 5 Vaccine based on the plasmid immunogen IFN ⁇ for DNA vaccination of the mucosal type.
  • IFN ⁇ plasmids (100-500 ⁇ g / dose) in the presence of LT ⁇ (5-
  • Example 6 Vaccine based on the immunogen VEGF intended to induce a systemic immune reaction with preferential formation of specific antibodies of class IgG.
  • the vaccine consists of a water-in-oil emulsion consisting of 50% ISA 51 (SEPPIC) and 50% of an aqueous solution of VEGF (20 to 200 ⁇ g / dose).
  • the immunogen comes from preparation 3 of VEGF stabilized with glutaraldehyde.
  • Example 7 Vaccine based on the VEGF immunogen coupled to KLH intended to induce a systemic immune reaction with preferential formation of specific antibodies of class IgG.
  • the vaccine consists of a water-in-oil emulsion consisting of 50% ISA 51 (SEPPIC) and 50% of an aqueous solution of VEGF (20 to 200 ⁇ g / dose).
  • Example 8 Vaccine based on the immunogen E7 of HPV16 coupled with KLH to induce a systemic immune reaction.
  • the vaccine consists of a water-in-oil emulsion of 50% ISA (SEPPIC, Paris) and 50% of an aqueous solution of E7 coupled to KLH (20 to 200 ⁇ g / dose).
  • the immunogens used in the preparation of the above vaccines were prepared as follows:
  • Immunogen IL 6 derived from the recombinant cytokine IL 6 by treatment with formalin followed by treatment with glutaraldehyde:
  • the antigenicity of the recombinant cytokine IL 6 treated relative to that of the native recombinant protein was measured using an R&D ELISA test (D6050): the detoxified recombinant cytokine IL 6 has an antigenicity equal to the antigenicity of the corresponding native protein.
  • the absence of toxicity in vitro is measured by a cell proliferation test.
  • Human peripheral blood mononuclear cells are cultured in the presence of the super antigen SEB and in the presence of a dose of the recombinant native or detoxified protein IL 6 corresponding to 10 times and 30 times the physiological dose of the native cytokine.
  • Cell proliferation is expressed in% of cell proliferation [cpm (counts per minute) control / sample cpm] x 100).
  • the control corresponds to a concentration of recombinant protein used equal to 0.
  • the results are presented in the following table:
  • the treated IL 6 used at doses 10 times and 30 times greater than the physiological doses does not modify the proliferation of human peripheral blood mononuclear cells activated by SEB.
  • the immunogen p53 was detoxified by treatment with formalin according to the protocol described by Ramon (Ramon G, On the flocculating power and the immunizing properties of a diphtheria toxin rendered anatoxic (Toxoid). Weekly Cr. Acad. Sci. (1923) 177: 1338-1340), followed by treatment with glutaraldehyde of the recombinant p53 protein (sc-4246, Santa Cruz) under the following conditions: at 10 ⁇ l of a native p53 solution at 1 mg / ml , add 3 ⁇ l of a formalin solution diluted 1/100 in sterile phosphate buffer. The mixture is placed for 2 days in an oven at 37 ° C. 25 ⁇ l of 1/100 glutaraldehyde is then added. After 15 minutes of reaction at laboratory temperature, 2 ⁇ l of 2M glycine are added to block the excess aldehyde groups.
  • the antigenicity of the recombinant protein p53 treated compared to that of the native recombinant protein was measured using an ELISA test from Amersham Pharmacia Biotech (p53 Rapid Format Pantropic Human ELISA, VQIA26): Native p53 proteins and treated have equivalent antigenicity.
  • the treated p53 protein used at doses ten times and 30 times greater than physiological doses does not modify the proliferation of human peripheral blood mononuclear cells activated by SEB or by anti CD3 antibodies.
  • the proliferation was measured by the 3 H-thymidine test.
  • the VEGF immunogen derived from VEGF (293-VE-010; R&D) is obtained by treatment with glutaraldehyde under the following conditions: to 100 ⁇ l of a solution of native VEGF at 5 ⁇ g / ml in phosphate buffer, 5 ⁇ l of a glutaraldehyde solution diluted 1/500 in sterile phosphate buffer. After 5 minutes of reaction at room temperature, 2 ⁇ l of 1M glycine are added to block the reaction.
  • the antigenicity of the treated VEGF cytokine compared to that of the native recombinant cytokine was measured using an R&D ELISA test.
  • DVE00 the native and treated cytokines have equivalent antigenicity.
  • the treated VEGF cytokine used at doses 10 times and 30 times greater than physiological doses does not modify the proliferation of human peripheral blood mononuclear cells activated by SEB.
  • Immunogen TGF ⁇ derived from TGF ⁇ is detoxified by treatment with formalin according to the protocol described by Ramon (Ramon G, On the flocculating power and the immunizing properties of a diphtheria toxin rendered anatoxic (toxoid). Weekly Cr. Acadian Sessions. (1923 ) 177: 1338-1340), followed by treatment with glutaraldehyde, in accordance with the protocol described for the immunogen p53.
  • the antigenicity of the treated TGF ⁇ cytokine compared to that of the native recombinant protein was measured using an R&D ELISA test (DB100): The native and treated TGF ⁇ cytokines have antigenicity equivalent.
  • TGF ⁇ cytokine The absence of toxicity of the treated TGF ⁇ cytokine was measured by a T cell proliferation test described in Example A1. This test shows that the detoxified TGF ⁇ used at physiological doses of 0.5 to 5 ng / ml does not decrease the proliferation of lymphocytes.
  • IL 10 is obtained from the fusion protein of IL 10 by treatment with formalin at 37 ° C. followed by a short treatment with glutaraldehyde, in accordance with the protocol described for the immunogen p53.
  • the fusion protein IL 10 was produced in E. Coli from a cDNA cloned in the bacterial expression plasmid prSetA and purified in the form of a fusion protein with Tag His. This purified fusion protein is homogeneous in acrylamide electrophoresis and in Western blotting.
  • the antigenicity of the treated IL 10 cytokine compared to that of the native recombinant protein was measured using an R&D ELISA test (D1000): The native and treated IL 10 cytokines have equivalent antigenicity.
  • the absence of toxicity in vitro is measured by a cell proliferation test.
  • the treated cytokine IL 10 used at doses 10 times and 30 times greater than physiological doses does not modify the proliferation of human peripheral blood mononuclear cells activated by SEB.
  • the plasmid immunogen IL 10 is represented by an IL 10 cDNA cloned into the bacterial expression plasmid prSetA.
  • Preparation 6 TNF ⁇ vaccine a) TNF ⁇ immunogen derived from TNF ⁇ by chemical treatment
  • the immunogen derived from TNF ⁇ (Péprotech Inc., Rocky Hill) is obtained by treatment with formalin at 37 ° C followed by a short treatment with glutaraldehyde, in accordance with the protocol described for the immunogen p53.
  • the antigenicity of the treated TNF ⁇ cytokine compared to that of the native recombinant protein was measured using an R&D ELISA test (DTA50): The native and treated TNF ⁇ cytokines have equivalent antigenicity.
  • TNF ⁇ cytokine used at doses 10 times and 30 times higher than physiological doses does not modify the proliferation of human peripheral blood mononuclear cells activated by SEB.
  • the TNF ⁇ plasmid immunogen is represented by a TNF ⁇ cDNA cloned into the bacterial expression plasmid prSetA.
  • IFN ⁇ immunogens a) The IFN ⁇ immunogen derived from IFN ⁇
  • This immunogen (Péprotech Inc., Rocky Hill) is obtained by treatment with formalin at 37 ° C followed by a short treatment with glutaraldehyde, in accordance with the protocol described for the immunogen p53.
  • the antigenicity of the IFN ⁇ cytokine treated with respect to that of the native recombinant protein was measured using an R&D ELISA test (DTA50): The native and treated IFN ⁇ cytokines have equivalent antigenicity. The absence of toxicity in vitro is measured by a cell proliferation test. The treated IFN ⁇ cytokine used at doses 10 times and 30 times greater than physiological doses does not modify the proliferation of human peripheral blood mononuclear cells activated by SEB.
  • the plasmid immunogen IFN ⁇ is represented by a cloned IFN ⁇ cDNA
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • the coupling was carried out by reaction of reduced VEGF with KLH activated by treatment with sulfosuccinimidyl [4-iodoacetyl] aminobenzoate (called sulfo-SlAB).
  • Step 1 Reduction of VEGF by DTT
  • Step 2 Treatment of KLH with sulfo-SlAB Sulfo-SlAB is a spacer arm which makes it possible to link the carrier protein, here KLH, with the VEGF immunogen to make a conjugate.
  • the antigenicity of conjugated VEGF was found to be comparable to that of isolated VEGF.
  • the absence of toxicity in vitro was measured by a cell proliferation test.
  • the KLH-SIAB-VEGF conjugate used at doses 10 times and 30 times greater than physiological doses does not modify the proliferation of human peripheral blood mononuclear cells activated by SEB.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • the coupling was carried out by reaction of the reduced VEGF with the KLH activated by treatment with (sulfosuccinimidyl [4-N-maleimidomethyl] - cyclohexane-1-carboxylate) (sulfo-SMCC).
  • Step 1 Reduction of VEGF by DTT
  • the sulfo-SMCC is a spacer arm which makes it possible to link the carrier protein, here KLH, with VEGF to form a conjugate.
  • Step 3 Coupling of reduced VEGF to KLH-SMCC
  • the antigenicity of conjugated VEGF was found to be comparable to that of isolated VEGF.
  • the coupling has the effect of potentiating the immunogenicity of the VEGF protein.
  • the coupling was carried out by reaction of the VEGF molecule with KLH activated by glutaraldehyde.
  • the coupling has the effect of potentiating the immunogenicity of the protein E7.
  • the coupling was carried out by reaction of the molecule E7 with KLH activated by glutaraldehyde from 1 ml of KLH solution at 10 mg / ml in PBS according to the same protocol as that described for preparation 10.
  • the antigenicity of the E7 protein in the conjugate was found to be slightly higher than that of isolated E7.
  • IFN ⁇ was conjugated to KLH under the same conditions as those described in preparation 11 for the protein E7.
  • the antigenicity of IFN ⁇ conjugate was slightly higher than that of IFN ⁇ treated with glutaraldehyde alone.
  • Macrophages which come from the differentiation of elutriated monocytes cultivated for 5 days in teflon bags in the presence of GMC-SF (F. Sallusto et al, Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte / macrophage colony -stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med (1994) 179, 1109), are activated with LPS for 16 hours.
  • macrophages thus activated are then cultured in the presence of increasing doses (0-10 ⁇ g / ml) of the recombinant native p53 protein (sc-4246, Santa Cruz) and of control protein) in medium without serum for 24 hours.
  • the control protein was the recombinant protein p24 (H1V-1 protein, origin ANRS)
  • the measurement of the APC overproduction of IFN ⁇ and TNF ⁇ in the supernatants (SN) of APC culture is carried out respectively by the standard IFN ⁇ biological test, using lysis of MDBK cells by VSV
  • the titer of IFN ⁇ in the supernatants corresponds to the reverse of the highest dilution of the supernatants inducing 50% of cell protection against the cytopathic effect of VSV.
  • the measurement of TNF ⁇ in the supernatants is carried out according to the protocol described by the producer and is expressed in pg / ml. The results are shown in the following table
  • the recombinant native protein p53 induces the overproduction of IFN ⁇ and TNF ⁇ , while the recombinant protein p24 used in the controls does not induce any synthesis.
  • a culture lysate of baculovirus insect cells expressing the p53 protein gave results similar to those described for the recombinant protein p53 produced in E. Coli.
  • Human peripheral blood mononuclear cells isolated on a Ficoll gradient from the peripheral blood of a healthy subject, are cultured in the presence of the anti-CD3 antibody and in the presence of increasing doses (0-30 ng / ml) of the protein recombinant active TGF ⁇ (240-B-002, R&D) and increasing doses (0-30 ng / ml) of a control protein, the recombinant protein p24.
  • the inhibition of T cell proliferation is measured using a cell proliferation test (Lachgar A., Bernard J., Bizzini B., Astgen A., Le Coq H., Fouchard M., Chams V ., Feldman M., Richardson M., Rappaport J., Burny A. & JF Zagury: Repair of the in vitro HIV-1-induced immunosuppression and blockade of the generation of functional suppressive CD8 cells by anti-alpha interferon and anti- Tat antibodies. Biomed & Pharmacother. (1996) 50: 13-18).
  • the activation of IFN ⁇ production by macrophages is measured according to the protocol described in experiment A1.
  • the activated macrophages are cultured in the presence of increasing doses (0-1 ⁇ g / ml) of the active recombinant protein TGF ⁇ and of a control protein, the recombinant protein p24, in medium without serum for 24 hours.
  • Cell proliferation is expressed as% cell proliferation ((control cpm / sample cpm) x 100) at three concentrations (30, 10 and 3 ng / ml) of TGF ⁇ and of protein p24.
  • the control corresponds to a concentration of recombinant protein used equal to 0.
  • the results are presented in FIG. 1:
  • the active recombinant protein TGF ⁇ induces the overproduction of IFN ⁇ , while the recombinant protein p24 induces no synthesis.
  • Vaccination experience 1 Anti-IL 10 vaccination of mice for the induction of systemic and mucosal immunity with preferential formation of specific antibodies of classes IgG and IgA.
  • Day 0 IM injection of a suspension of plasmid immunogen expressing IL 10 (100 ⁇ g) in 0.2 ml of PBS prepared in Example 2.
  • Day 7, day 8, day 9 Administration by gavage of suspensions aqueous microspheres (PLGA) including the immunogen IL 10 (100 ⁇ g / dose) and the adjuvant LT ⁇ (5 ⁇ g / dose).
  • PLGA suspensions aqueous microspheres
  • mice receive the same preparations without immunogenic.
  • the animals are sacrificed 15 days after the last immunization and there is the absence of toxicity (measured by the absence of clinical signs (behavior; hair; weight) and by anatomical examination after autopsy.
  • Immune reaction tested by the presence in the serum of antibodies of the IgG and IgA type, measured by ELISA and expressed by the optical density 15 days after the last gavage.
  • Day 0 IM injection of a suspension of VEGF immunogen (20 ⁇ g) in ISA 51 prepared in Example 1.
  • day 14, day 21 Intranasal administration using a Hamilton pipette of 10 ⁇ l of an aqueous suspension containing 20 ⁇ g of immunogen and 5 ⁇ g of LT ⁇ embedded in a calcium phosphate gel.
  • mice receive the same preparations without immunogen
  • the animals are sacrificed 15 days after the last immunization and there is the absence of toxicity (measured by the absence of clinical signs (behavior; hair; weight) and by anatomical examination after autopsy.
  • Immune reaction tested by the presence in the serum of antibodies of the IgG and IgA type, measured by ELISA and expressed by the optical density 15 days after the last instillation.
  • Day 7, day 14, day 21 Intra-nasal administration using a Hamilton pipette of 10 ⁇ l of an aqueous suspension containing 20 ⁇ g of immunogen and 5 ⁇ g of LT ⁇ embedded in a calcium phosphate gel.
  • the animals are sacrificed 15 days after the last immunization and there is the absence of toxicity (measured by the absence of clinical signs (behavior; hair; weight) and by anatomical examination after autopsy. Immune reaction tested by the presence in the serum and in the saliva of IgG and IgA type antibodies, measured by ELISA and expressed by the optical density 15 days after the last instillation.
  • mice receive the same preparations without immunogen
  • the animals are sacrificed 15 days after the recall and there is the absence of toxicity (measured by the absence of clinical signs (behavior; hair; weight) and by anatomical examination after autopsy.
  • Immune reaction tested by the presence in the serum of antibodies of the IgG and IgA type, measured by ELISA and expressed by the optical density 7 days after the booster.
  • Vaccination experience 5 Anti IL 6 vaccination of mice by induction of systemic and mucosal immunity with preferential formation of specific antibodies of class IgG and IgA.
  • Immunization protocol - Day 0 IM injection of an IL 6 immunogen suspension (20 ⁇ g) in ISA 51 prepared as in Example 1.
  • Day 7, day 8, day 9 Administration by gavage of microspheres of PLG containing the immunogen (100 ⁇ g / dose) and the adjuvant LT ⁇ (5 ⁇ g / dose).
  • mice receive the same preparations without immunogen
  • the animals are sacrificed 15 days after the last force-feeding and there is an absence of toxicity (measured by the absence of clinical signs (behavior; hair; weight) and by anatomical examination after autopsy.
  • Immune reaction tested by the presence in the serum of antibodies of the IgG and IgA type, measured by ELISA and expressed by the optical density 15 days after the last gavage.
  • Vaccination example 6 anti-VEGF vaccination with the KLH-SIAB-VEGF conjugate.
  • the immunogenic (humoral) activity of the KLH-SIAB-VEGF conjugate compared to that of native VEGF was studied in 18-20 g balb c mice.
  • mice On day D 0, a group of 3 mice receives an injection of 0.2 ml (50 ⁇ g) of an emulsion in complete Freund's adjuvant by the intramuscular route. A booster injection of 5 ⁇ g in incomplete Freund's adjuvant is given on D 21 and D 60.
  • a retro-orbital blood sample is taken from each mouse before the first injection on D -2
  • mice receive the same preparations without immunogen. 3 mice receive 100 ⁇ g of the preparation and the absence of disease symptoms is studied for the 7 days following the injection.
  • mice are sacrificed 12 days after the last immunization.
  • the absence of toxicity is measured by the absence of clinical signs: (behavior, hair, weight) and by anatomical examination after autopsy.
  • mice immunized with 100 ⁇ g of the preparation showed symptoms of disease during the 7 days following the injection.
  • Mice immunized with both the KLH-SIAB-VEGF conjugate and with VEGF only show no clinical signs and no anatomical lesions.
  • the immune reaction is measured by: a) the presence in the serum of antibodies of the IgG type directed against the recombinant native VEGF protein, measured by ELISA and expressed in title (inverse of the dilution giving an optical density greater than 0.3)
  • mice immunized with the KLH-SIAB-VEGF conjugate have higher anti-VEGF IgG antibody titers than those immunized with VEGF only.
  • Example 7 comparison of the neutralizing activities of the sera of mice immunized with the KLH-SIAB-VEGF conjugate or with native VEGF.
  • VEGF activity was measured using the standard biological test for VEGF activity.
  • Different dilutions of sera (1/100 - 1/800) taken on D -2 and D 72 are incubated for 2 hours with 10 ng / ml of native VEGF. These dilutions are then deposited on endothelial cells (HUVEC) cultivated in flat bottom wells of a micro-culture plate at the rate of 3000 cells / well. Cell culture is continued at 37 ° C. in a humid atmosphere charged with 5% CO 2 for 6 days. 18 hours before the end of the incubation, 0.5 ⁇ Ci of tritiated thymidine / well are added.
  • the antibodies induced by the KLH-VEGF conjugate have a greater neutralizing power than that of the antibodies induced by VEGF.
  • EXAMPLE 9 Comparison of the neutralizing activities of the mice immunized with either the native VEGF, or the conjugate KLH-SIAB-VEGF, or the conjugate KLH-SMCC-VEGF, or the KLH-gluta-VEGF. The neutralizing activity is determined according to the same experimental protocol as that described in Example 8. As in the experimental protocol of Example 7, the mice were immunized on D0, D21 and D60.
  • FIG. 2 summarizes the results obtained: We see that from D 30, significant neutralizations appear for the conjugates KLH-SIAB-VEGF and KLH-SMCC-VEGF. It is necessary to " wait D 70 to obtain neutralizations with the conjugate KLH-glutaraldehyde-VEGF. On the other hand, no neutralization is observed for the native VEGF.
  • Example 10 vaccination with the KLH - glutaraldehyde - E7 conjugate.
  • the immunogenic activity (humoral and cellular) of the KLH-E7 conjugate compared to that of the E7 protein was studied in 18-20 g balb c mice.
  • mice On day D 0, a group of 3 mice receives an injection of 0.2 ml (50 ⁇ g) of an ACF emulsion by the intramuscular route. A booster injection of 5 ⁇ g in AIF is given on D 21 and D 60.
  • a retro-orbital blood sample is taken from each mouse before the first injection on D -2
  • mice receive 100 ⁇ g of the preparation and the absence of disease symptoms is studied for the 7 days following the injection.
  • mice are sacrificed 12 days after the last immunization.
  • the immune reaction is measured by: 1- the presence in the serum of antibodies of the IgG type directed against the native recombinant protein E7, measured by ELISA and expressed in title (inverse of the dilution giving an optical density greater than 0.3)
  • mice immunized with the KLH-E7 conjugate have higher anti-E7 IgG antibody titers than mice immunized with the E7 protein only.

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Abstract

Vaccines renfermant à titre de principe actif un immunogène qui est un facteur cytokinique ou un facteur de régulation cellulaire particulièrement transcriptionnel ou un autre type de facteur à propriétés immunosuppressives/apoptotiques/angiogéniques anormalement relâché dans le milieu extracellulaire (stromal) par les cellules cancéreuses ou stromales de tumeurs malignes, ainsi qu'un excipient pharmaceutiquement acceptable permettant l'induction d'une réaction immuniataire systèmique ou mucosale avec formation d'anticorps neutralisants de classe IgG ou IgA sécrétoire dirigée contre le facteur natif, ou qui dérive d'un tel facteur et utilisation d'un tel immunogène pour l'obtention d'un médicament destiné à une utilisation en tant qu'anticancéreux.

Description

Utilisation d'immunogènes pour traiter ou prévenir au sein des tumeurs malignes les dérèglements immunitaires ou vasculaires induits par des facteurs extracellulaires
La présente invention concerne l'utilisation de préparations vaccinales médicamenteuses à usage thérapeutique ou prophylactique destinées à traiter ou prévenir au sein des tumeurs malignes les dérèglements immunitaires en particulier l'immunosuppression et l'apoptose des cellules immunitaires ou vasculaires comme l'angiogénèse, induits par des facteurs extracellulaires, cytokines ou autres facteurs de régulation en particulier transcriptionnels, anormalement produits par les cellules cancéreuses ou les cellules stromales.
Les traitements conventionnels des cancers qu'ils soient d'origine virale, induits par des rétrovirus, ou l'EBV ou l'HPV ou encore les virus de l'hépatite, ou d'origine chronique, dus à l'amiante ou à des dérivés benzéniques, qu'ils soient de type épithélial (carcinomes) ou conjonctif (sarcomes) ou encore sanguin (lymphomes) comportent l'ablation chirurgicale des tumeurs le plus souvent associée à une chimiothérapie et/ou une radiothérapie.
Bien qu'efficaces pour certains cancers, particulièrement pris à des stades précoces, ces traitements souvent difficilement tolérés sont insuffisants et des récidives et des métastases compromettent l'évolution des malades.
C'est pourquoi lorsque les scientifiques dans les années 80 et 90 ont clone et purifié des antigènes de tumeurs associés (TAA) ou spécifiques (TSA) aux cellules cancéreuses provenant de nombreuses tumeurs malignes (cancer du sein, de la prostate, colorectal, du col utérin ; lymphome ATL), de nombreuses expérimentations et essais cliniques de vaccination anti-cancer (Dvorak E. Expérimental design for vaccine préparations against human malignant tumors. Med Hypothèses (1986) 20:429-52, Houghton AN. On course for a cancer vaccine. Lancet (1995) 345:1384-5, Herlyn D, Linnenbach A, Koprowski H, Herlyn M. Epitope-and antigen-specific cancer vaccines. Int Rev Immunol (1991) 7:245-57, Ostankovitch M, Choppin J, Guillet JG. Tumor cell antigenicity: cancers and vaccines. Rev Prat (1995) 45:1921-6, Zhu MZ, Marshall J, Cole D, Schlom J, Tsang KY. Spécifie cytolytic T-cell responses to human CEA from patients immunized with recombinant avipox-CEA vaccine. Clin Cancer Res (2000) 6:24-33, Tsunoda T, Tanimura H, Yamaue H, Tanaka H, Matsuda K. Tumor spécifie CTL therapy for advanced cancer and development for cancer vaccine. Hepatogastroenterology (1999) 46 : 1287-92), utilisant comme antigènes les TAA et TSA ont été réalisés, visant à détruire spécifiquement les cellules malignes porteuses de ces antigènes grâce à l'action de cellules tueuses, particulièrement de lymphocytes cytolytiques (CTL), porteurs de récepteurs spécifiques, induits par la réaction immunitaire vaccinale.
Les essais cliniques utilisant de tels vaccins réalisés chez les malades porteurs de différentes tumeurs (mélanome, cancer du sein, cancer colorectal, cancer de la vessie, ...) ont permis d'établir les faits suivants : - Les préparations vaccinales anti-cancer contenant les antigènes tumoraux
(TAA ou TSA) présentés sous différentes formes ont été bien tolérées et n'ont généralement pas provoqué de complications régionales ou systémiques.
De telles préparations vaccinales peuvent induire chez les malades une réponse immunitaire de type CTL (Tsunoda T, Tanimura H, Yamaue H, Tanaka H, Matsuda K. Tumor spécifie CTL therapy for advanced cancer and development for cancer vaccine. Hepatogastroenterology (1999) 1:1287-92,
Schwaab T, Heaney JA, Schned AR, Harris RD, Cole BF, Noëlle RJ, Phillips
DM, Stempkowski L, Ernstoff MS. A randomized phase II trial comparing two différent séquence combinations of autologous vaccine and human recombinant interferon gamma and human recombinant interferon alpha2B therapy in patients with metastatic rénal cell carcinoma: clinical outeome and analysis of immunological parameters. J Urol (2000) 163:1322-7, Steller MA,
Gurski KJ, Murakami M, Daniel RW, Shah KV, Celis E, Sette A, Trimble EL,
Park RC, Marincola FM. Cell-mediated immunological responses in cervical and vaginal cancer patients immunized with a lipidated epitope of human papillomavirus type 16 E7. Clin Cancer Res (1998) 4:2103-9, susceptible in vitro de détruire spécifiquement les cibles cellulaires porteuses d'épitopes de TAA ou TSA complexés au Complexe Majeur d'Histocompatibilité.
Par contre à ce jour aucun essai clinique de phase III n'a pu montrer que ces préparations vaccinales, visant à détruire spécifiquement les cellules cancéreuses par la différentiation de cellules tueuses, étaient efficaces. Ainsi dès 1992, après que Levine (The p53 tumor suppressor gène and gène product. Princess Takamatsu Symp (1989) 20:221-30) ainsi que d'autres équipes scientifiques eurent montré que la protéine p53 native qui a des effets de réparation sur les brins d'ADN et des effets immunosuppressifs du cycle cellulaire ou un mutant de cette protéine était abondamment produite et accumulée dans les tumeurs malignes, le même Levine propose de réaliser une vaccination utilisant la protéine p53, apparaissant comme étant un antigène de tumeur associé (TAA). Celle-ci était présentée à la surface de cellules dendritiques (DC) ou adjuvantée dans un vecteur bactérien (type BCG) de manière à induire une réponse immunitaire de type CTL dirigée contre les cellules cancéreuses (Voir aussi WO-A-94/02167).
A l'appui de cette demande de brevet, des publications scientifiques montrent le rôle bénéfique des cellules tueuses et le rôle péjoratif des anticorps spécifiques dans l'évolution des tumeurs malignes (Theobald M, Biggs J, Dittmer D, Levine AJ, Sherman LA. Targeting p53 as a gênerai tumor antigen. Proc Natl Acad Sci U S A (1995) 92:11993-7, Roth J. et al, p53 as a target for cancer vaccines: recombinant canarypox virus vectors expressing p53 protect mice against lethal tumor cell challenge, 1996, Proc Natl Acad Sci USA.; 93:4781-6).
A la suite de Levine, d'autres équipes modifiant le vecteur ou l'adjuvant de l'immunogène p53 ont déposé une dizaine de demandes de brevets sur l'utilisation de nouvelles présentations galéniques de vaccin anti p53 visant également à induire la formation de cellules tueuses CTL ciblant les cellules cancéreuses exprimant la protéine p53.
Les essais expérimentaux associés à ces vaccins anti p53 ont montré l'innocuité et l'immunogénicité évaluée par l'apparition de cellules tueuses anti p53. Plus, le seul essai clinique de vaccination anti p53 réalisé et publié a confirmé l'innocuité et l'immunogénicité du vaccin. Cependant aucun essai de phase III n'a pu valider l'efficacité de cette stratégie vaccinale.
La demanderesse a découvert avec étonnement que l'immunosuppression et l'angiogénèse du micro environnement des cellules infectées par certains virus tel le VIH-1 et du micro environnement des cellules cancéreuses apportent une explication rationnelle à l'absence d'efficacité de ces stratégies vaccinales car ces stratégies antérieures ciblent la cellule cancéreuse et non le dérèglement de son micro environnement.
Or, alors que jusqu'à présent les traitements ont tous visé à tuer directement les cellules cancéreuses elles-mêmes, c'est à dire les cellules parenchymateuses, la demanderesse a trouvé qu'il était autant ou même plus judicieux de lutter contre les molécules produites dans le micro environnement extra cellulaire (stromal) de la tumeur et favorisant le développement de cette dernière.
Rappelons que tout tissu ou tumeur est formée de cellules parenchymateuses qui baignent dans un micro environnement appelé stroma.
Ce stroma est lui-même constitué de cellules stromales (qui peuvent être des cellules immunitaires, endothéliales, ou fibroblastiques) et d'un milieu extra cellulaire.
Les travaux de la demanderesse ont montré en effet que des facteurs solubles sécrétés par les cellules infectées par le VIH-1 , en particulier la protéine Tat ou par les cellules immunitaires de patients infectés par le VI H en particulier l'IFNα et le TGFβ ou produits par des cellules cancéreuses, telles la protéine E7 de l'HPV dans le cancer du col utérin ou la protéine Tax du HTLV1 dans les leucémies ATL ou la protéine p53 dans le cancer colorectal , avaient des propriétés immunosuppressives susceptibles d'inhiber les réactions immunitaires cellulaires au sein des tumeurs et de ce fait expliquaient l'inefficacité des vaccins antérieurs.
L'étude bibliographique a permis de conforter ces observations de la demanderesse, en confirmant la présence de facteurs immunosuppressifs relâchés dans le milieu extracellulaire de tumeurs malignes :
Certains de ces facteurs non encore identifiés ont été produits par - des cellules de cancer colorectal (Ebert EC, Roberts Al, O'Connell SM, Robertson FM, Nagase H. Characterization of an immunosuppressive factor derived from colon cancer cells. J Immunol. (1987) 138:2161-8 ou Remacle- Bonnet MM, Pommier FJ, Kaplanski S, Rance RJ, Depieds RC. Inhibition of normal allogenic lymphocyte mitogenesis by a soluble inhibitor extracted from human colonie carcinoma. J Immunol (1976) 117:1145-51, des cellules de glioblastome (29-Fontana A, Hengartner H, de Tribolet N, Weber E. Glioblastoma cells release interleukin 1 and factors inhibiting interleukin 2-mediated effects. J Immunol. (1984) 132:1837-44), des mélanomes (30.Hersey P, Bindon C, Czemiecki M, Spurling A, Wass J, McCarthy WH. Inhibition of interleukin 2 production by factors released from tumor cells. J Immunol. (1983) 131:2837-42), ou des ascites malignes (Tamura K, Shibata Y, Matsuda Y, Ishida N. Isolation and characterization of an immunosuppressive acidic protein from ascitic fluids of cancer patients. Cancer Res. (1981) 41:3244-52, Oh SK, Moolten FL. Non spécifie immunosuppressive factors in malignant ascites : further characterization and possible relationship to erythrocyte receptors of human peripheral T cells. J Immunol. (1981) 127:2300-7).
D'autres facteurs de régulation transcriptionnelle, comme rapporté plus haut, sont d'origine cellulaire telle la protéine p53, accumulée dans certaines tumeurs malignes, en particulier colorectales (Remvikos Y, Tominaga
O, Hammel P, Laurent-Puig P, Salmon RJ, Dutrillaux B, Thomas G. Increased p53 protein content of colorectal tumours correlates with poor survival. Br J
Cancer 1992 66:758-64, Gan H, Ouyang Q, Wang Y. Expression of p53 protein in colorectal cancer and its relationship to cell proliferative activity and prognosis. Chung Hua Chung Liu Tsa Chih (1996) 18:244-6). La protéine p53, relâchée par transport actif par des voies de sécrétion n'utilisant pas le signal peptide ou par diffusion passive est présente dans le milieu extracellulaire, et elle a été isolée par chromatographie sur fibre de verre à partir de sérum de cancéreux (Zus an I, Sandler B, Gurevich P, Zusman R, Smimoff P, Tendler Y, Bass D, Shani A, Idelevich E, Pfefferman R, Davidovich B, Huszar M, Glick J.
Comparative study of the rôle of sérum levels of p53 antigen and its tumor cell concentration in colon cancer détection. Hum Antibodies Hybridomas. (1996) : 123-8, Sandler B, Smimoff P, Tendelr Y, Zinder O, Zusman R, Zusman I. Specificity of polyclonal anti-p53 IgG for isolation of the soluble p53 antigen from human sérum. Int J Mol Med. 1998 1:767-70).
Des cytokines, telles le TGFβ notoirement immunosuppressif; le VEGF facteur de croissance angiogenique, l'IL 6 pro-inflammatoire ou l'IL 10 également immunosuppressive, sont anormalement sécrétées et relâchées dans le milieu extracellulaire de certaines cellules cancéreuses. La demanderesse a elle-même montré que les cellules de lignée cancéreuses SIHA, tout comme les cellules DU145 du cancer de la prostate et les cellules MT2 de lignées leucémiques produisent anormalement et relâchent dans le milieu extracellulaire des cytokines telles le VEGF et/ou l'IL 6 tandis que les cellules RAJI de lignées leucémiques sécrètent dans le milieu extracellulaire de
Dans ce contexte, la présente invention a pour objet l'utilisation comme médicament anticancéreux de nouvelles préparations vaccinales dénuées de toxicité et destinées à neutraliser : soit des cytokines immunosuppressives, apoptotiques ou angiogéniques produites dans le compartiment stromal extra cellulaire en excès par les cellules cancéreuses ou stromales de tumeurs malignes. Les exemples de vaccins anti-cytokines décrits dans EP-591.281 concernaient particulièrement des vaccins anti-IFNα utilisés contre le SIDA et d'autres affections immunitaires. soit des facteurs de régulation cellulaire, particulièrement transcriptionnels ou d'autres facteurs à propriétés immunosuppressives, apoptotiques ou angiogéniques anormalement produits dans le compartiment stromal extra cellulaire par les cellules cancéreuses. Les exemples d'immunogènes décrits dans WO-A-00/03732 dérivaient de facteurs de régulation d'origine virale telles les protéines E7 du HPV 16, Tax du HTLV-1 et du Tat du HIV-1.
Dans ces nouvelles préparations vaccinales non toxiques, l'immunogène
1- est constitué par des facteurs cytokiniques ou dérive de facteurs cytokiniques ou de facteurs de régulation cellulaire particulièrement transcriptionnels ou d'autres facteurs à propriétés immunosuppressives / apoptotiques / angiogéniques anormalement produits par les cellules cancéreuses ou stromales de tumeurs malignes dans le milieu extra cellulaire. 2- est de préférence présenté sous une forme galénique permettant d'induire une réaction immunitaire induisant préférentiellement des anticorps de classe
IgG et/ou IgA capables d'antagoniser localement les facteurs immunosuppressifs / apoptotiques / angiogéniques anormalement présents dans le milieu extracellulaire des tumeurs et d'en inhiber les effets.
La présente invention propose notamment l'utilisation comme médicament anticancéreux de vaccins dirigés particulièrement contre des facteurs pathogènes produits anormalement dans la matrice extracellulaire des tumeurs malignes et notamment la protéine TGFβ : Le TGFβ étant une cytokine immunosuppressive majeure produite par de nombreuses cellules cancéreuses ; - la protéine IL 10 : L'IL 10 étant également une cytokine immunosuppressive majeure la protéine p53 : Si la protéine de régulation p53 produite anormalement par les cellules cancéreuses et accumulée dans les tumeurs peut représenter un antigène de tumeur associé (TAA) comme cela a été montré dans l'art antérieur, la demanderesse a découvert qu'elle peut également agir dans sa configuration extracellulaire comme facteur immunosuppressif et apoptogène sur les cellules immunitaires comme illustré ci-après dans les exemples. Le VEGF, facteur de croissance des cellules endothéliales : La cytokine VEGF étant une cytokine majeure de l'angiogénèse, activant la prolifération des cellules endothéliales.
L'IL 6, l'IFNγ et le TNFα, cytokines pro inflammatoires participant également aux processus d'angiogénèse, en activant l'expression des molécules d'adhérence des cellules endothéliales (ICAM, VCAM, E sélectine).
Tous ces vaccins visent à induire une réaction immunitaire avec formation d'anticorps de classe IgG (pour tous les cancers) et surtout de classe
IgA (pour les cancers épithéliaux) de manière à neutraliser localement, au sein de la tumeur, les facteurs pathogènes particulièrement immunosuppressifs / apoptotiques / angiogéniques et à en bloquer leurs effets, permettant ainsi à l'immunité naturelle ou à un vaccin dirigé contre les antigènes TAA ou TSA de fonctionner normalement et d'éliminer les cellules malades.
C'est pourquoi la présente demande a pour objet un vaccin caractérisé en ce qu'il renferme à titre de principe actif un immunogène qui est un facteur ou qui dérive d'un facteur cytokinique ou d'un facteur de régulation cellulaire particulièrement transcriptionnel ou d'un autre type de facteur à propriétés immunosuppressives / apoptotiques / angiogéniques anormalement produit par les cellules cancéreuses ou stromales de tumeurs malignes, ainsi qu'un excipient pharmaceutiquement acceptable permettant l'induction d'une réaction immunitaire systèmique ou mucosale avec formation d'anticorps de classe IgG ou IgA sécrétoire dirigée contre le facteur natif et plus particulièrement un vaccin caractérisé en ce qu'il renferme à titre de principe actif un immunogène qui est - un facteur cytokinique ou un facteur de régulation cellulaire particulièrement transcriptionnel ou un autre type de facteur à propriétés immunosuppressives / apoptotiques / angiogéniques anormalement relâché dans le milieu extracellulaire (stromal) par les cellules cancéreuses ou les cellules stromales de tumeurs malignes, ainsi qu'un excipient pharmaceutiquement acceptable permettant l'induction d'une réaction immunitaire systèmique ou mucosale avec formation d'anticorps neutralisants de classe IgG ou IgA sécrétoire dirigés contre le facteur natif, ou qui dérive d'un tel facteur, à l'exception de : - l'IL 6, un fragment d'IL 6 ou un analogue d'IL 6 sous une forme produisant une immunité non mucosale et non couplé à une protéine porteuse comme le KLH, un épitope de p53 trop court pour être immunogène et couplé à une protéine porteuse comme le KLH, - une composition d'une protéine p53 ou peptide de p53, d'IL 12 et d'un adjuvant.
Dans des conditions préférentielles de mise en œuvre, l'immunogène dérive d'un facteur cytokinique ou d'un facteur de régulation cellulaire particulièrement transcriptionnel ou d'un autre type de facteur à propriétés immunosuppressives / apoptotiques / angiogéniques anormalement produit par les cellules cancéreuses ou stromales de tumeurs malignes par traitement chimique, physique, par mutation génétique, par conditionnement adjuvant ou est le produit d'une vaccination génétique (vaccin à ADN) ou est un fragment protéique ou peptidique d'un tel facteur ou encore dérive d'un tel fragment protéique ou peptidique.
L'immunogène sera de préférence couplé à une protéine porteuse. En effet la demanderesse a découvert qu'une telle mesure augmente le nombre des sites auxiliaires (helper) et de ce fait augmente la réponse anticorps neutralisant le facteur extra cellulaire ciblé.
Dans encore d'autres conditions préférentielles de mise en œuvre l'immunogène dérive d'un facteur cytokinique ou d'un facteur de régulation cellulaire particulièrement transcriptionnel ou d'un autre type de facteur à propriétés immunosuppressives / apoptotiques / angiogéniques anormalement produit par les cellules cancéreuses ou stromales de tumeurs malignes ou d'un fragment protéique ou peptidique d'un tel facteur par couplage à une protéine porteuse qui est le KLH. Dans d'autres conditions préférentielles de mise en œuvre, l'immunogène est choisi parmi la TGFβ, l'IL 10, la protéine p53, le VEGF, l'IL 6, l'IFN α, l'IFNγ, le Fas ligand et le TNFα ou en dérive.
L'immunogène de ces préparations vaccinales, dénuées de toxicité comme tout médicament, pourra dériver d'un facteur immunosuppressif / apoptotique / angiogenique ou d'un de ses fragments peptidiques par traitement chimique, physique, par mutation génétique, par conditionnement adjuvant ou être le produit d'une vaccination génétique (vaccin à ADN). De tels traitements de l'immunogène qui ont été décrits dans WO-A-00/03732 peuvent être utilisés dans la présente invention pour l'obtention d'un vaccin dénué de toute toxicité et en particulier dépourvu de tout caractère immunosuppressif. Mais les immunogènes peuvent aussi être utilisés à l'état natif.
Les traitements chimiques consistent par exemple à détoxiquer la protéine native ou recombinante par un traitement aux aldéhydes notamment le formaldéhyde, aldéhyde monofonctionnel et donc n'agissant pas par couplage de molécules, conformément à la détoxication des toxines tétaniques ou diphtériques, ou consistent encore en des traitements bloquant les groupements sulfidryles, tels la carboxamidation, la maléimidation ou la carboxyméthylation ou en tout autre traitement bloquant d'autres résidus aminés comme décrit dans des demandes antérieures de la demanderesse.
Dans toujours d'autres conditions préférentielles de mise en oeuvre, l'immunogène est un mutant du facteur natif ou un fragment du facteur natif. On pourra utiliser un mutant du facteur possédant au moins 70 %, de préférence au moins 80 % et tout particulièrement au moins 90 %. d'homologie avec le facteur protéique natif ou encore un fragment protéique ou peptidique du facteur. Dans le cas d'un peptide, celui-ci sera de préférence porté par une protéine porteuse tel le KLH ou le toxoïde tétanique. On pourra avantageusement utiliser aussi une protéine porteuse dans le cas du facteur protéique natif ou encore d'un fragment protéique de celui-ci.
Les produits décrits ci-dessus utilisés comme immunogènes, à l'exception des facteurs natifs, sont nouveaux, au moins pour la plupart d'entre eux. Ils entrent donc dans le cadre de l'invention. Les traitements physiques peuvent être réalisés par la chaleur, les radiations U.V., les rayons X ou le contact avec une atmosphère riche en O2. Ces traitements physiques générant des modifications intramoléculaires entre radicaux chimiques (groupement thiols par exemple), peuvent de manière appropriée changer la conformation de la molécule, Pinactiver fonctionnellement tout en conservant ses propriétés immunogènes.
Les modifications génétiques peuvent être obtenues par ingénierie génétique opérant des insertions, des délétions ou des substitutions de résidus. Les mutants génétiques pourront ou non subir un traitement chimique et/ou physique complémentaire. Les protéines modifiées ci-dessus peuvent par exemple être préparées à partir d'une protéine ayant une séquence identique ou similaire à une séquence peptidique d'un facteur ci-dessus. Tous ces procédés sont bien connus de l'état de la technique. Un vaccin à ADN (vaccination génétique) pourra comprendre un plasmide comportant un gène promoteur d'expression comme celui du CMV et le gène codant pour un immunogène défini ci-dessus (facteur natif ou dérivé dont fragments). Par "dérivent" ou "dériver" de facteurs immunosuppressifs / apoptotiques / angiogéniques, l'on entend aussi que le composé immunogène peut être constitué de la totalité ou d'un fragment de la protéine de départ ou encore peu notamment être couplé à une protéine porteuse comme le KLH (keyhole limpet hemocyanin) ou le tétanos toxoïde, directement ou de préférence par un réactif bifonctionnel de couplage.
Il peut comporter une ou plusieurs modifications dans les acides aminés de cette protéine ou fragment telles que des délétions, substitutions, additions, ou fonctionnalisations telles qu'acylation d'acides aminés, dans la mesure où ces modifications restent dans le cadre précisé ci-dessus (absence de toxicité, caractères immunologiques). Par exemple, en général le remplacement d'un résidu leucine par un résidu isoleucine ne modifie pas de telles propriétés; les modifications doivent généralement concerner moins de 40% d'acides aminés, notamment moins de 30% de préférence moins de 20% et tout particulièrement moins de 10% du facteur protéique. Il est important que la protéine ou fragment modifié ne soit pas dénaturé comme on peut le faire par exemple par un traitement physique comme la chaleur afin de préserver ses sites conformationnels pour que les anticorps induits par les dérivés modifiés soient actifs vis à vis de la protéine native.
De manière générale, en ce qui concerne les modifications, l'homologie ou la similitude entre l'immunogène modifié et la protéine ou partie de protéine immunosuppressive native, ainsi que les dimensions du composé immunogène, de même que les modalités d'utilisation, ou de couplage du composé immunogène selon l'invention à une protéine immunogène telle que le toxoïde tétanique, on peut en particulier se référer à WO-A-86/06 414 ou à EP-A-0.220.273 ou encore à PCT/US.86/00831 , équivalents.
Un fragment peut comporter de 8 à 110 acides aminés par exemple, de préférence de 20 à 110, notamment de 12 à 60, particulièrement de 25 à 60, plus particulièrement de 12 à 40 et tout particulièrement de 30 à 50 acides aminés. Un tel fragment peut comporter aussi du ou des côtés C ou N terminal de 1 à 5 acides aminés supplémentaires c'est-à-dire différents du segment d'origine. Un fragment doit en outre comporter une cystéine au moins pour pouvoir faire l'objet de la carboxyméthylation.
Un fragment protéique pourra comporter la totalité des acides aminés de la séquence native, délétée de moins de 25 acides aminés, de préférence moins de 15 acides aminés, particulièrement moins de 10 acides aminés et tout particulièrement moins de 5 acides aminés, voire même un seul acide aminé.
Pour le conditionnement adjuvant, l'immunogène pourra notamment être inclus dans une émulsion eau dans huile, en utilisant par exemple l'ISA 51.
Une préparation vaccinale contenant l'immunogène anti immunosuppressif / apoptotique / angiogenique pourra être administrée sous une forme galénique appropriée à induire une réponse immunitaire de type systèmique par voie Intra Musculaire (IM), Sous Cutanée (SC), Intra Dermique (ID) ou de type mucosal par voies intra nasale, orale, vaginale ou rectale.
Une préparation vaccinale contenant l'immunogène anti immunosuppressif / apoptotique / angiogenique pourra également contenir d'autres immunogènes, tels les antigènes TAA ou TSA de cancer ou des adjuvants telles des cytokines ou des protéines d'entérotoxines, type CTB ou Lt mutant (LTμ) (Freytag LC, Cléments JD, Bacterial toxins as mucosal adjuvants Curr Top Microbiol Immunol; (1999) 236:215-36). Une préparation galénique à visée systèmique, administrée par voie SC, IM, ID, pourra être une émulsion eau renfermant l'immunogène, dans huile, ou une suspension de phosphate de calcium enchâssant l'immunogène, ou de l'hydroxyde d'aluminium adsorbant l'immunogène.
Une préparation galénique visant une réponse immunitaire mucosale administrée preferentiellement par voie nasale ou orale, mais aussi par voie vaginale ou rectale surtout pour des rappels, pourra être notamment constituée de micro sphères de polymères biodégradables, tels les PLG (poly(lactide-co-glycolides)), PLA ((poly(lactides)) et les PCL, (poly(epsilon- caprolactones)) à forme retard (Baras B. et al, Single-dose mucosal immunization with biodégradable microparticles containing a Schistosoma mansoni antigen. Infect Immun. (1999) 67:2643-8) dans lesquelles sont incluses les molécules d'antigènes, de suspensions aqueuses de phosphate de calcium enchâssant ou adsorbant l'antigène, de nanoparticules, telles les nanoparticules de chitosan.
Les préparations vaccinales pourront être conditionnées pour la voie intra nasale sous forme de gel avec comme excipient le carbopol, de gouttes nasales ou de spray et pour la voie orale sous forme de capsules gastrorésistantes, de dragées ou de granules gastrorésistants.
Dans le cas de vaccin ADN administré par voie systèmique ou mucosale, la présentation galénique du plasmide pourra être une suspension dans un liquide physiologique tel le PBS physiologique (tampon phosphate = PBS). Les plasmides pourront être inclus dans des microsphères de polymères biodégradables (PLG, PLA, PCL) et administrées dans des capsules gastrorésistantes pour ingestion (voie orale). L'ADN pourra également être exprimé dans un vecteur vivant bactérien, type salmonelle ou viral type adénovirus ou poxvirus. La présente demande a aussi pour objet l'utilisation à titre d'immunogène d'un facteur qui est un facteur cytokinique ou un facteur de régulation cellulaire particulièrement transcriptionnel ou un autre type de facteur à propriétés immunosuppressives / apoptotiques / angiogéniques anormalement relâché dans le milieu extra cellulaire (stromal) par des cellules cancéreuses ou stromales de tumeurs malignes ou qui dérive d'un tel facteur.
La présente demande a encore pour objet l'utilisation d'un immunogène qui est un facteur ou qui dérive d'un facteur cytokinique ou d'un facteur de régulation cellulaire particulièrement transcriptionnel ou d'un autre type de facteur à propriétés immunosuppressives / apoptotiques / angiogéniques anormalement produit par des cellules cancéreuses ou stromales de tumeurs malignes pour l'obtention d'un médicament destiné à une utilisation en tant qu'anticancéreux par mécanisme de réduction des effets, sur le micro environnement desdites cellules cancéreuses ou stromales de tumeurs malignes, d'un facteur cytokinique ou d'un facteur de régulation cellulaire particulièrement transcriptionnel ou d'un autre type de facteur à propriétés immunosuppressives / apoptotiques / angiogéniques anormalement produit par lesdites cellules cancéreuses ou stromales de tumeurs malignes.
La présente demande a enfin pour objet un immunogène qui est un facteur ou qui dérive d'un facteur cytokinique ou d'un facteur de régulation cellulaire particulièrement transcriptionnel ou d'un autre type de facteur à propriétés immunosuppressives / apoptotiques / angiogéniques anormalement relâché dans le milieu extra cellulaire par les cellules cancéreuses ou stromales de tumeurs malignes pour son utilisation dans une méthode de traitement thérapeutique du corps humain ou animal, c'est-à-dire à titre de médicament, notamment de vaccin curatif ou préventif.
Les immunogènes objets de la présente invention possèdent de très intéressantes propriétés pharmacologiques. Ils sont doués notamment de remarquables propriétés antagonistes, réductrices, inhibitrices ou notamment neutralisantes, des propriétés immunosuppressives / apoptotiques / angiogéniques de facteurs anormalement produits dans le milieu extracellulaire (stromal) par les cellules cancéreuses ou stromales de tumeurs malignes à la différence de composés de l'art antérieur qui agissent directement sur les cellules cancéreuses de tumeurs malignes.
Ces propriétés sont illustrées ci-après dans la partie expérimentale. Elles justifient l'utilisation des vaccins et immunogènes ci-dessus décrits à titre de médicament. Les médicaments selon la présente invention trouvent leur emploi par exemple dans le traitement tant curatif que préventif de cancers d'origine épithéliale comme par exemple le cancer colorectal, le cancer de la prostate, le cancer du sein et d'origine conjonctive tels les sarcomes ou d'origine sanguine tels les lymphomes type Epstein-Barr ou les leucémies. La présente demande a également pour objet un procédé d'immunisation active de patients caractérisé en ce que l'on utilise à titre d'immunogène un composé immunogène tel que défini ci-dessus avantageusement associé à un adjuvant d'immunité minéral, huileux ou de synthèse, ou encore un composé immunogène tel que défini ci-dessus, avantageusement couplé par exemple à l'aide d'un dialdéhyde ou associé à une protéine augmentant son immunogénicité. Ces immunisations peuvent être réalisées tant à titre curatif qu'à titre préventif.
Les conditions préférentielles de mise en œuvre des vaccins ci- dessus décrits s'appliquent également aux autres objets de l'invention visés ci- dessus. Les exemples qui suivent illustrent la présente invention.
La figure 1 montre l'inhibition de la prolifération cellulaire par le TGFβ exprimée en % de prolifération cellulaire ((cpm contrôle / cpm échantillon) x 100) à trois concentrations (30, 10 et 3 ng/ml) de TGFβ et de protéine p24. Le contrôle correspond à une concentration de protéine recombinante utilisée égale à 0.
La figure 2 montre l'effet de sérum de souris immunisées avec l'immunogène VEGF non couplé ou couplé au KLH selon différentes techniques de couplage et à 4 dilutions différentes indiquées en haut du tableau. Les expériences ont été menées de gauche à droite avec des souris naïves, des souris immunisées avec du VEGF au jour J 60, des souris immunisées avec du KLH-glutaraldéhyde-VEGF pH 9 au jour J 60, des souris immunisées avec du KLH-SMCC-VEGF au jour J 60, des souris immunisées avec du KLH-SIAB- VEGF au jour J 60. Le pourcentage de neutralisation est donné en ordonnées.
Exemple 1 : Vaccin à base de l'immunogène VEGF destinée à induire une réaction immunitaire systèmique avec formation préférentielle d'anticorps spécifiques de classe IgG.
Le vaccin est formé d'une émulsion eau dans huile constituée de 50 % d'ISA 51 (Seppic, Paris) et de 50 % d'une solution aqueuse de VEGF (20 à 200 μg/dose). Exemple 2 : Vaccin à base de l'immunogène plasmidique pour vaccination ADN de type systèmique IL 10.
Les plasmides codant pour l'IL 10 (50 à 200 μg/dose) sont mis en suspension dans 0,2 à 1 ml de PBS pour administration intramusculaire.
Exemple 3 : Vaccin à base de l'immunogène p53 destinée à induire une réaction immunitaire de type mucosale avec formation préférentielle d'anticorps anti p53 de classe IgA .
L'immunogène p53 (20 à 100 μg/dose) est inclus dans un gel de phosphate de calcium en présence ou non d'adjuvant LTμ (5 à 20 μg/dose) pour l'instillation intra nasale. La préparation est administrée par voie intranasale soit sous forme de gouttes nasales, soit sous forme d'un gel par addition de carbopol.
Exemple 4 : Vaccin à base de l'immunogène IL 10 destinée à induire une réaction immunitaire de type réaction mucosale avec formation préférentielle d'anticorps anti IL 10 de classe IgA :
On a préparé des micro sphères de PLG contenant l'immunogène (100 à 300 μg/dose) et un mutant de la toxine LT (5-25 μg/dose) L'inclusion de l'IL 10 et du LTμ est réalisée dans les micro sphères biodégradables selon le protocole de Baras B. et al (Baras B. et al, Single-dose mucosal immunization with biodégradable microparticles containing a Schistosoma mansoni antigen. Infect Immun. (1999) 67:2643-8).
Exemple 5 : Vaccin à base de l'immunogène plasmidique IFNγ pour vaccination ADN de type mucosale.
Les plasmides d' IFNγ (100-500 μg/dose) en présence de LTμ (5-
20 μg/dose) sont inclus dans des microsphères de PLG selon le protocole décrit par Baras B. et al. L'administration par voie orale se fait par gavage ou par ingestion de capsules gastrorésistantes contenant les microsphères et un excipient à base d'alginate. Exemple 6 : Vaccin à base de l'immunogène VEGF destinée à induire une réaction immunitaire systèmique avec formation préférentielle d'anticorps spécifiques de classe IgG.
Le vaccin est formé d'une émulsion eau dans l'huile constituée de 50 % d'ISA 51 (SEPPIC) et de 50 % d'une solution aqueuse de VEGF (20 à 200 μg/dose).
L'immunogène provient de la préparation 3 de VEGF stabilisée par du glutaraldéhyde.
Exemple 7 : Vaccin à base de l'immunogène VEGF couplé au KLH destinée à induire une réaction immunitaire systèmique avec formation préférentielle d'anticorps spécifiques de classe IgG.
Le vaccin est formé d'une émulsion eau dans l'huile constituée de 50 % d'ISA 51 (SEPPIC) et de 50 % d'une solution aqueuse de VEGF (20 à 200 μg/dose).
Exemple 8 : Vaccin à base de l'immunogène E7 de HPV16 couplé au KLH pour induire une réaction immunitaire systèmique.
Le vaccin est formé d'une émulsion eau dans huile de 50 % d'ISA (SEPPIC, Paris) et de 50 % d'une solution .aqueuse de E7 couplé au KLH (20 à 200 μg/dose).
Les immunogènes servant à la préparation des vaccins ci-dessus ont été préparés comme suit :
Préparation 1 : Immunogène anti IL 6
Immunogène IL 6 dérivé de la cytokine recombinante IL 6 par traitement au formol suivi d'un traitement par le glutaraldéhyde :
A 1 ml d'une solution d'IL 6 à 1 mg/ml dans du tampon phosphate stérile, on ajoute 28 μl d'une solution de formol (35 %) dilué au 1/10 dans du tampon phosphate stérile. Après addition de merthiolate au 1/10.000, le mélange est placé 9 jours à l'étuve à 37°C. Il est ensuite additionné de glutaraldéhyde à la concentration 0,0026 M. Après 3 minutes, le mélange est additionné de 100 μl de glycine à 50 mg/ml pour bloquer les groupements aldéhydiques en excès et il est dialyse contre un grand volume de tampon phosphate. L'immunogène est ainsi stabilisé.
Caractéristiques de l'IL 6
L'antigénicité de la cytokine recombinante IL 6 traitée par rapport à celle de la protéine recombinante native a été mesurée à l'aide d'un test ELISA de R&D (D6050) : la cytokine recombinante IL 6 détoxiquée présente une antigénicité égale à l'antigénicité de la protéine native correspondante. L'absence de toxicité in vitro est mesurée par un test de prolifération cellulaire. Des cellules mononucléées du sang périphérique humain sont cultivés en présence du super antigène SEB et en présence d'une dose de la protéine recombinante IL 6 native ou détoxiquée correspondant à 10 fois et 30 fois la dose physiologique de la cytokine native. La prolifération cellulaire est exprimée en % de prolifération cellulaire [cpm (coups par minute) contrôle/cpm échantillon] x 100). Le contrôle correspond à une concentration de protéine recombinante utilisée égale à 0. Les résultats sont présentés dans le tableau suivant :
Figure imgf000019_0001
L'IL 6 traitée utilisée à des doses 10 fois et 30 fois supérieures aux doses physiologiques ne modifie pas la prolifération des cellules mononucléées du sang périphérique humain activés par le SEB.
Préparation 2 : Immunogène anti p53
L'immunogène p53 a été détoxiqué par traitement au formol selon le protocole décrit par Ramon (Ramon G, Sur le pouvoir floculant et les propriétés immunisantes d'une toxine diphtérique rendue anatoxique (anatoxine). C.r. hebd. Séances Acad. Sci. (1923) 177 : 1338-1340), suivi d'un traitement au glutaraldéhyde de la protéine p53 recombinante (sc-4246, Santa Cruz) dans les conditions suivantes : à 10 μl d'une solution de p53 native à 1 mg/ml, on ajoute 3 μl d'une solution de formol dilué au 1/100 dans du tampon phosphate stérile. Le mélange est placé 2 jours à l'étuve à 37 °C. Il est ensuite additionné de 25 μl de glutaraldéhyde au 1/100. Après 15 minutes de réaction à température de laboratoire, on ajoute 2 μl de glycine 2M pour bloquer les groupements aldéhydiques en excès.
Caractéristique de l'immunogène p53
L'antigénicité de la protéine recombinante p53 traitée par rapport à celle de la protéine recombinante native a été mesurée à l'aide d'un test ELISA d'Amersham Pharmacia Biotech (p53 Rapid Format Pantropic Human ELISA, VQIA26) : Les protéines p53 native et traitée présentent une antigénicité équivalente.
Absence de toxicité in vitro : la protéine p53 traitée utilisée à des doses dix fois et 30 fois supérieures aux doses physiologiques (0,5 à 5 ng/ml) ne modifie pas la prolifération de cellules mononucléées du sang périphérique humain activées par le SEB ou par les anticorps anti CD3. La mesure de la prolifération a été réalisée par le test à la 3H-thymidine.
Préparation 3 : Immunogène anti VEGF
L'immunogène VEGF dérivé de VEGF (293-VE-010 ; R&D) est obtenu par traitement à la glutaraldéhyde dans les conditions suivantes : à 100 μl d'une solution de VEGF natif à 5 μg/ml dans du tampon phosphate, on ajoute 5 μl d'une solution de glutaraldéhyde dilué au 1/500 dans du tampon phosphate stérile. Après 5 minutes de réaction à température ambiante, on ajoute 2 μl de glycine 1M pour bloquer la réaction.
Caractéristique du VEGF
L'antigénicité de la cytokine VEGF traitée par rapport à celle de la cytokine recombinante native a été mesurée à l'aide d'un test ELISA de R&D (DVE00) : les cytokines native et traitée présentent une antigénicité équivalente.
L'absence de toxicité in vitro a été mesurée à l'aide d'un test de prolifération cellulaire. Des cellules mononucléées du sang périphérique humain sont cultivées en présence du super antigène SEB et en présence d'une dose de la protéine recombinante VEGF native ou traitée correspondant à 10 fois et 30 fois la dose physiologique de la cytokine native. La prolifération cellulaire est exprimée en % de prolifération cellulaire ((cpm contrôle/cpm échantillon) x 100). Le contrôle correspond à une concentration de protéine recombinante utilisée égale à 0. Les résultats sont présentés dans le tableau suivant :
Figure imgf000021_0001
La cytokine VEGF traitée utilisée à des doses 10 fois et 30 fois supérieures aux doses physiologiques ne modifie pas la prolifération des cellules mononucléées du sang périphérique humain activées par le SEB.
Préparation 4 : Immunogène anti TGFβ
Immunogène TGFβ dérivé du TGFβ est détoxiqué par traitement au formol selon le protocole décrit par Ramon (Ramon G, Sur le pouvoir floculant et les propriétés immunisantes d'une toxine diphtérique rendue anatoxique (anatoxine). C.r. hebd. Séances Acad. Sci. (1923) 177 : 1338-1340), suivi d'un traitement à la glutaraldéhyde, conformément au protocole décrit pour l'immunogène p53.
Caractéristique de l'immunogène TGFβ
L'antigénicité de la cytokine TGFβ traitée par rapport à celle de la protéine recombinante native a été mesurée à l'aide d'un test ELISA de R&D (DB100) : Les cytokines TGFβ native et traitée présentent une antigénicité équivalente.
L'absence de toxicité de la cytokine TGFβ traitée a été mesurée par un test de prolifération de cellules T décrit dans l'exemple A1. Ce test montre que le TGFβ détoxiqué utilisé à des doses physiologiques de 0,5 à 5 ng/ml ne diminue pas la prolifération des lymphocytes.
Préparation 5 : Immunogène anti IL 10 a) Immunogène IL 10 dérivé de l'IL 10 par traitement au formol
L'IL 10 est obtenu à partir de la protéine de fusion de l'IL 10 par traitement au formol à 37°C suivi d'un traitement court à la glutaraldéhyde, conformément au protocole décrit pour l'immunogène p53. La protéine de fusion IL 10 a été produite chez E. Coli à partir d'un ADNc clone dans le plasmide d'expression bactérien prSetA et purifié sous forme d'une protéine de fusion avec Tag His. Cette protéine de fusion purifiée est homogène en électrophorèse d'acrylamide et en Western blot.
Caractéristique de l'immunogène IL 10
L'antigénicité de la cytokine IL 10 traitée par rapport à celle de la protéine recombinante native a été mesurée à l'aide d'un test ELISA de R&D (D1000) : Les cytokines IL 10 native et traitée présentent une antigénicité équivalente.
L'absence de toxicité in vitro est mesurée par un test de prolifération cellulaire. La cytokine IL 10 traitée utilisée à des doses 10 fois et 30 fois supérieures aux doses physiologiques ne modifie pas la prolifération des cellules mononucléées du sang périphérique humain activées par le SEB.
b) Immunogène plasmidique IL 10 pour vaccination d'ADN
L'immunogène plasmidique IL 10 est représenté par un ADNc de IL 10 clone dans le plasmide d'expression bactérien prSetA. Préparation 6 : Vaccin anti TNFα a) Immunogène TNFα dérivé du TNFα par traitement chimique
L'immunogène dérivé du TNFα (Péprotech Inc., Rocky Hill) est obtenu par traitement au formol à 37°C suivi d'un traitement court à la glutaraldéhyde, conformément au protocole décrit pour l'immunogène p53.
Caractéristique du TNFα :
L'antigénicité de la cytokine TNFα traitée par rapport à celle de la protéine recombinante native a été mesurée à l'aide d'un test ELISA de R&D (DTA50) : Les cytokines TNFα native et traitée présentent une antigénicité équivalente.
L'absence de toxicité in vitro est mesurée par un test de prolifération cellulaire. La cytokine TNFα traitée utilisée à des doses 10 fois et 30 fois supérieures aux doses physiologiques ne modifie pas la prolifération des cellules mononucléées du sang périphérique humain activés par le SEB.
b) Immunogène plasmidique TNFα pour vaccination ADN
L'immunogène plasmidique TNFα est représenté par un ADNc de TNFα clone dans le plasmide d'expression bactérien prSetA.
Préparation 7 : Immunogènes IFNγ a) L'immunogène IFNγ dérivé de l' IFNγ
Cet immunogène (Péprotech Inc., Rocky Hill) est obtenu par traitement au formol à 37 °C suivi d'un traitement court à la glutaraldéhyde, conformément au protocole décrit pour l'immunogène p53.
Caractéristique de l'immunogène :
L'antigénicité de la cytokine IFNγ traitée par rapport à celle de la protéine recombinante native a été mesurée à l'aide d'un test ELISA de R&D (DTA50) : Les cytokines IFNγ native et traitée présentent une antigénicité équivalente. L'absence de toxicité in vitro est mesurée par un test de prolifération cellulaire. La cytokine IFNγ traitée utilisée à des doses 10 fois et 30 fois supérieures aux doses physiologiques ne modifie pas la prolifération des cellules mononucléées du sang périphérique humain activés par le SEB.
b)lmmunogène plasmidique IFNγ pour vaccination ADN
L'immunogène plasmidique IFNγ est représenté par un ADNc de l'IFNγ clone
Préparation 8 : Immunogène KLH-SIAB-VEGF
Le couplage du VEGF à la protéine KLH, utilisée comme carrier a pour effet de potentialiser l'immunogénicité du VEGF.
Le couplage a été réalisé par réaction du VEGF réduit avec KLH activé par traitement par le sulfosuccinimidyl [4-iodoacétyl] aminobenzoate (appelé sulfo-SlAB).
Etape 1 : Réduction du VEGF par le DTT
1 mg de VEGF en solution dans 500 μl de PBS a été additionné de 40 μl d'une solution de DTT (Dithiotréitol) à 50 mg/ml. Le mélange a été conservé pendant 2 heures à température ambiante, à l'abri de la lumière, et le mélange réactionnel a été filtré à travers une colonne de Sephadex G25 (1 x
15 cm) équilibrée en PBS contenant EDTA-Na2 5 mM, pH 7,0.
Etape 2 : Traitement du KLH par le sulfo-SlAB Le sulfo-SlAB est un bras écarteur qui permet de lier la protéine porteuse, ici KLH, avec l'immunogène VEGF pour faire un conjugué.
150 μl d'une solution de KLH à 20 mg/ml ont été additionnés de 50 μl de tampon borate 0,1 M - EDTA Na2-5 mM, pH 8,5, suivi de l'addition de 20 μl d'une solution dans l'eau de sulfo-SlAB à 3,4 mg/ml, la réaction a eu lieu pendant 30 min. à température ambiante et à l'abri de la lumière, sous une barrière d'azote. Le mélange réactionnel a été alors filtré à travers une colonne de Sephadex G25 (1 x 11 cm) équilibrée avec le même tampon. Etape 3 : Couplage du VEGF réduit à KLH-SIAB
1 ml de solution de VEGF réduit a été mélangé avec 500 μl de KLH-SIAB. Le mélange a été incubé, à l'abri de la lumière et à température ambiante, sous azote, pendant 1 heure, puis pendant 15 heures à 4° C.
Après que la réaction a été bloquée par addition de cystéine à concentration finale 5 mM, pendant 20 min., le mélange a été purifié par chromatographie d'exclusion.
Caractéristiques de l'immunogène KLH-SIAB-VEGF :
L'antigénicité du VEGF conjugué s'est révélée comparable à celle du VEGF isolé.
L'absence de toxicité in vitro a été mesurée par un test de prolifération cellulaire. Le conjugué KLH-SIAB-VEGF utilisé à des doses 10 fois et 30 fois supérieures aux doses physiologiques ne modifie pas la prolifération des cellules mononucléées du sang périphérique humain activés par le SEB.
Préparation 9 : Immunogène KLH-SMCC-VEGF
Le couplage du VEGF à la protéine KLH, utilisée comme carrier a pour effet de potentialiser l'immunogénicité du VEGF.
Le couplage a été réalisé par réaction du VEGF réduit avec le KLH activé par traitement par le (sulfosuccinimidyl [4-N-maléimidométhyl]- cyclohexane-1-carboxylate) (sulfo-SMCC).
Etape 1 : Réduction du VEGF par le DTT
Le sulfo-SMCC est un bras écarteur qui permet de lier la protéine porteuse, ici KLH, avec le VEGF pour former un conjugué.
1 mg de VEGF en solution dans 500 μl de PBS a été additionné de 40 μl d'une solution de DTT à 50 mg/ml. Le mélange a été conservé pendant 2 heures à température ambiante, à l'abri de la lumière, et le mélange réactionnel a été filtré à travers une colonne de Sephadex G25 (1 x 15 cm) équilibrée en PBS contenant EDTA-Na2 5 mM, pH 7,0. Etape 2 : Traitement du KLH par le sulfo-SMCC
150 μl d'une solution de KLH à 20 mg/ml ont été additionnés de 50 μl de tampon borate 0,1 M - EDTA Na2-5 mM, pH 8,5, suivi de l'addition de 20 μl d'une solution dans l'eau de sulfo-SMCC à 3,4 mg/ml, la réaction a eu lieu pendant 30 min. à température ambiante et à l'abri de la lumière, sous une barrière d'azote. Le mélange réactionnel a été alors filtré à travers une colonne de Sephadex G25 (1 x 11 cm) équilibrée avec le même tampon.
Etape 3 : Couplage de VEGF réduit à KLH-SMCC
1 ml de solution de VEGF réduit a été mélangé avec 500 μl de KLH-SMCC. Le mélange a été incubé, à l'abri de la lumière et à température ambiante, sous azote, pendant 1 heure, puis pendant 15 heures à 4° C.
Après que la réaction a été bloquée par addition de cystéine à concentration finale 5 mM, pendant 20 min., le mélange a été purifié par chromatographie d'exclusion.
Caractéristique de l'immunogène KLH-SMCC-VEGF :
L'antigénicité de VEGF conjugué s'est révélée comparable à celle du VEGF isolé.
L'absence de toxicité in vitro est mesurée par un test de prolifération cellulaire, le conjugué KLH-SMCC-VEGF utilisé à des doses 10 fois et 30 fois supérieures aux doses physiologiques ne modifie pas la prolifération des cellules mononucléées du sang périphérique humain activés par le SEB.
Préparation 10 : Immunogène KLH-glutaraldéhyde-VEGF
Le couplage a pour effet de potentialiser l'immunogénicité de la protéine VEGF.
Le couplage a été réalisé par réaction de la molécule VEGF avec KLH activé par la glutaraldéhyde.
1 ml de solution de KLH à 10 mg/ml dans PBS a été activé par dialyse contre 100 ml d'une solution de glutaraldéhyde à 0,2 % dans PBS, pendant une nuit, à 4° C. L'excès de glutaraldéhyde a été éliminé par dialyse de la protéine activée contre 3 changements de 200 ml de PBS de 2 heures chacun.
A 400 μl de KLH activé (4 mg) sont ajoutés 1 mg d'une solution à 1 mg/ml de la protéine VEGF dans PBS et le mélange réactionnel est agité, pendant 1 nuit, à 4° C. Les groupements aldéhydiques libres sont alors bloqués par réaction pendant 1 heure avec 100 μl de glycine 2.5 M et le mélange est purifié par chromatographie d'exclusion. L'antigénicité de la protéine VEGF dans le conjugué s'est révélée légèrement supérieure à celle de VEGF isolé.
Préparation 11 : Immunogène KLH- glutaraldéhyde -E7
Le couplage a pour effet de potentialiser l'immunogénicité de la protéine E7.
Le couplage a été réalisé par réaction de la molécule E7 avec KLH activé par la glutaraldéhyde à partir d'1 ml de solution de KLH à 10 mg/ml dans du PBS selon le même protocole que celui décrit pour la préparation 10.
L'antigénicité de la protéine E7 dans le conjugué s'est révélée légèrement supérieure à celle de E7 isolé.
Préparation 12 : KLH- glutaraldéhyde -IFNα
L'IFNα a été conjugué au KLH dans les mêmes conditions que celles décrites dans la préparation 11 pour la protéine E7.
L'antigénicité de l'IFNα conjugué s'est révélée légèrement supérieure à celle de l'IFNα traité au glutaraldéhyde seul.
Etude pharmacologique
A - Présence dans le milieu extracellulaire de tumeurs malignes, de molécules participant à l'immunosuppression, l'apoptose ou l'angiogénèse du micro environnement des cellules cancéreuses. Expérimentation A1 :
La protéine p53 qui s'accumule dans les tumeurs malignes et est présente dans les milieux extracellulaires dont le sérum (Zusman I, Sandler B, Gurevich P, Zusman R, Smimoff P, Tendler Y, Bass D, Shani A, Idelevich E, Pfefferman R, Davidovich B, Huszar M, Glick J. Comparative study of the rôle of sérum levels of p53 antigen and its tumor cell concentration in colon cancer détection. Hum Antibodies Hybridomas. (1996) :123-8), active la surproduction par les APC d'IFNα, médiateur de l'immunosuppression, et de TNFα, cytokine participant à l'expression des molécules d'adhérence des cellules endothéliales et à l'apoptose des cellules immunitaires.
Protocole expérimental
Des macrophages, qui proviennent de la différentiation de monocytes élutriés cultivés pendant 5 jours dans des poches de téflon en présence de GMC-SF (F. Sallusto et al, Efficient présentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med (1994) 179, 1109), sont activés avec du LPS pendant 16 heures. Ces macrophages ainsi activés sont ensuite cultivés en présence de doses croissantes (0 - 10 μg/ml) de la protéine recombinante p53 native (sc-4246, Santa Cruz) et de protéine contrôle) dans du milieu sans sérum pendant 24 heures. La protéine contrôle a été la protéine recombinante p24 (protéine du H1V-1 , origine ANRS)
Résultats :
La mesure de la surproduction APC d'IFNα et de TNFα dans les surnageants (SN) de culture des APCs s'effectue respectivement par le test biologique standard de l'IFNα, utilisant la lyse des cellules MDBK par le VSV
(S. Rubinstein et al, Convenient assay for interferons. J. Virol (1981) 37, 755) et par un test ELISA de R&D (DTA50, R&D).
Le titre d'IFNα dans les surnageant correspond à l'inverse de la plus forte dilution des surnageants induisant 50 % de protection des cellules contre l'effet cytopathique du VSV. La mesure de TNFα dans les surnageants est réalisée en suivant le protocole décrit par le producteur et est exprimée en pg/ml. Les résultats sont représentés dans le tableau suivant
Figure imgf000029_0001
La protéine recombinante p53 native induit la surproduction d'IFNα et de TNFα, alors que la protéine recombinante p24 utilisée dans les contrôles n'induit aucune synthèse.
Un lysat de culture de cellules d'insectes à baculovirus exprimant la protéine p53 a donné des résultats similaires à ceux décrits pour la protéine recombinante p53 produite chez E. Coli.
Expérimentation A2 : La cytokine TGFβ, relâchée dans le milieu extracellulaire par des cellules cancéreuses inhibe la prolifération de cellules T et active la production par les macrophages de l'IFNα, cytokine immunosuppressive majeure. Protocole expérimental
Des cellules mononucléées du sang périphérique humain, isolées sur gradient de Ficoll à partir du sang périphérique de sujet sain, sont cultivés en présence de l'anticorps anti-CD3 et en présence de doses croissantes (0-30 ng/ml) de la protéine recombinante TGFβ active (240-B-002, R&D) et de doses croissantes (0-30 ng/ml) d'une protéine contrôle, la protéine recombinante p24.
L'inhibition de la prolifération des cellules T est mesurée à l'aide d'un test de prolifération cellulaire (Lachgar A., Bernard J., Bizzini B., Astgen A., Le Coq H., Fouchard M., Chams V., Feldman M., Richardson M., Rappaport J., Burny A. & J.F. Zagury : Repair of the in vitro HIV-1-induced immunosuppression and blockade of the génération of functional suppressive CD8 cells by anti-alpha interferon and anti-Tat antibodies. Biomed & Pharmacother. (1996) 50:13-18).
L'activation de la production d'IFNα par les macrophages est mesurée selon le protocole décrit dans l'expérimentation A1. Les macrophages activés sont cultivés en présence de doses croissantes (0-1 μg/ml) de la protéine recombinante TGFβ active et d'une protéine contrôle, la protéine recombinante p24, dans du milieu sans sérum pendant 24 heures.
Résultats :
Inhibition de la prolifération cellulaire par le TGFβ :
La prolifération cellulaire est exprimée en % de prolifération cellulaire ((cpm contrôle / cpm échantillon) x 100) à trois concentrations (30, 10 et 3 ng/ml) de TGFβ et de protéine p24. Le contrôle correspond à une concentration de protéine recombinante utilisée égale à 0. Les résultats sont présentés dans la figure 1 :
Ces résultats montrent que la prolifération cellulaire est diminuée de manière dose dépendante par le TGFβ actif, alors qu'elle ne l'est pas par la p24. Activation par le TGFβ de la surproduction d'IFNα par les macrophages.
Le titre d'IFNα dans les surnageants correspond à l'inverse de la plus forte dilution des surnageants induisant 50 % de protection contre l'effet cytopathique du VSV. Les résultats sont présentés dans le tableau suivant :
Figure imgf000031_0001
La protéine recombinante TGFβ active induit la surproduction d'IFNα, alors que la protéine recombinante p24 n'induit aucune synthèse.
Expérience de vaccination 1 : Vaccination anti-IL 10 de la souris pour l'induction d'une immunité systèmique et mucosale avec formation préférentielle d'anticorps spécifiques de classes IgG et IgA.
Protocole d'immunisation
Jour 0 : Injection IM d'une suspension d'immunogene plasmidique exprimant l'IL 10 (100 μg) dans 0,2 ml de PBS préparée à l'exemple 2. Jour 7, jour 8, jour 9 : Administration par gavage de suspensions aqueuses de micro sphères (PLGA) incluant l'immunogène IL 10 (100 μg/dose) et l'adjuvant LTμ (5 μg/dose).
Les souris contrôles reçoivent les mêmes préparations sans immunogène.
Suivi :
On sacrifie les animaux 15 jours après la dernière immunisation et on constate l'absence de toxicité (mesurée par l'absence de signes cliniques (comportement ; poils ; poids) et par examen anatomique après autopsie.
Réaction immunitaire testée par la présence dans le sérum d'anticorps de type IgG et IgA , mesurée par ELISA et exprimée par la densité optique 15 jours après le dernier gavage.
Figure imgf000032_0001
Résultats :
Innocuité clinique et absence de lésions anatomiques. Présence d'anticorps (Ac) anti IL 10 de type IgG et de type IgA dans le sérum
Expérience de vaccination 2 :
Vaccination anti-VEGF de la souris par l'induction d'une immunité systèmique et mucosale avec formation préférentielle d'anticorps spécifique de classe IgG et IgA.
Protocole d'immunisation
Jour 0 : Injection IM d'une suspension d'immunogene VEGF (20 μg) dans l'ISA 51 préparée à l'exemple 1. - Jour 7, jour 14, jour 21 : Administration intranasale à l'aide de pipette Hamilton de 10 μl d'une suspension aqueuse contenant 20 μg d'immunogene et 5 μg de LTμ enchâssés dans un gel de phosphate de calcium.
Les souris contrôles reçoivent les mêmes préparations sans immunogène Suivi :
On sacrifie les animaux 15 jours après la dernière immunisation et on constate l'absence de toxicité (mesurée par l'absence de signes cliniques (comportement ; poils ; poids) et par examen anatomique après autopsie.
Réaction immunitaire testée par la présence dans le sérum d'anticorps de type IgG et IgA , mesurée par ELISA et exprimée par la densité optique 15 jours après la dernière instillation.
Figure imgf000033_0001
Résultats :
Innocuité clinique et absence de lésions anatomiques. Présence d'anticorps anti VEGF de type IgG et de type IgA dans le sérum.
Expérience de vaccination 3 :
Vaccination anti p53 de la souris par l'induction d'une immunité systèmique et mucosale avec formation préférentielle d'anticorps spécifique de classe IgG et IgA.
Protocole d'immunisation
Jour 0 : Injection IM d'une suspension d'immunogene p53 (20 μg) dans l'ISA 51 préparée comme à l'exemple 1.
Jour 7, jour 14, jour 21 : Administration intra nasale à l'aide de pipette Hamilton de 10 μl d'une suspension aqueuse contenant 20 μg d'immunogene et 5 μg de LTμ enchâssés dans un gel de phosphate de calcium.
Les souris contrôles reçoivent les mêmes préparations sans immunogène Suivi
On sacrifie les animaux 15 jours après la dernière immunisation et on constate l'absence de toxicité (mesurée par l'absence de signes cliniques (comportement ; poils ; poids) et par examen anatomique après autopsie. Réaction immunitaire testée par la présence dans le sérum et dans la salive d'anticorps de type IgG et IgA , mesurée par ELISA et exprimée par la densité optique 15 jours après la dernière instillation.
Résultats : Innocuité clinique et absence de lésions anatomiques.
Présence d'anticorps anti p53 de type IgG et de type IgA dans le sérum et dans la salive.
Figure imgf000034_0001
Expérience de vaccination 4 :
Vaccination anti IL 6 de la souris pour l'induction d'une immunité systèmique avec formation d'anticorps spécifiques de classe IgG
Protocole d'immunisation
Jour 0 : Injection IM d'une suspension d'immunogene IL 6 (20 μg) dans l'ISA
51 préparée comme à l'exemple 1.
Jour 21 : Rappel par voie IM d'une émulsion d'IL 6 (5 μg) dans l'ISA 51
Les souris contrôles reçoivent les mêmes préparations sans immunogène Suivi :
On sacrifie les animaux 15 jours après le rappel et on constate l'absence de toxicité (mesurée par l'absence de signes cliniques (comportement ; poils ; poids) et par examen anatomique après autopsie.
Réaction immunitaire testée par la présence dans le sérum d'anticorps de type IgG et IgA , mesurée par ELISA et exprimée par la densité optique 7 jours après le rappel.
Figure imgf000035_0001
Résultats :
Innocuité clinique et absence de lésions anatomiques. Présence d'anticorps anti IL 6 de type IgG dans le sérum.
Expérience de vaccination 5 : Vaccination anti IL 6 de la souris par l'induction d'une immunité systèmique et mucosale avec formation préférentielle d'anticorps spécifique de classe IgG et IgA.
Protocole d'immunisation - Jour 0 : Injection IM d'une suspension d'immunogene IL 6 (20 μg) dans l'ISA 51 préparée comme à l'exemple 1.
Jour 7, jour 8, jour 9 : Administration par gavage de micro sphères de PLG contenant l'immunogène (100 μg/dose) et l'adjuvant LTμ (5 μg/dose).
Les souris contrôles reçoivent les mêmes préparations sans immunogène
Suivi :
On sacrifie les animaux 15 jours après le dernier gavage et on constate l'absence de toxicité (mesurée par l'absence de signes cliniques (comportement ; poils ; poids) et par examen anatomique après autopsie.
Réaction immunitaire testée par la présence dans le sérum d'anticorps de type IgG et IgA , mesurée par ELISA et exprimée par la densité optique 15 jours après le dernier gavage.
Figure imgf000036_0001
Résultats :
Innocuité clinique et absence de lésions anatomiques. Présence d'anticorps anti IL 6 de type IgG et de type IgA dans le sérum.
Exemple de vaccination 6 : vaccination antî-VEGF par le conjugué KLH- SIAB-VEGF.
L'activité immunogénique (humorale) du conjugué KLH-SIAB- VEGF par rapport à celle du VEGF natif a été étudiée chez la souris balb c de 18-20 g.
Au jour J 0, un groupe de 3 souris reçoit une injection de 0,2 ml (50 μg) d'une émulsion en adjuvant complet de Freund par voie intramusculaire. Une injection de rappel de 5 μg en adjuvant incomplet de Freund est donnée à J 21 et J 60.
Un prélèvement sanguin au niveau rétro-orbital est effectué sur chaque souris avant la première injection à J -2
3 souris contrôles reçoivent les mêmes préparations sans immunogène. 3 souris reçoivent 100 μg de la préparation et l'absence de symptômes de maladie est étudiée pendant les 7 jours suivant l'injection.
Les souris sont sacrifiées 12 jours après la dernière immunisation.
L'absence de toxicité est mesurée par l'absence de signes cliniques : (comportement, poils, poids) et par examen anatomique après autopsie.
Résultats :
Aucune des 3 souris immunisées avec 100 μg de la préparation ne manifeste de symptômes de maladie pendant les 7 jours suivant l'injection. Les souris immunisées aussi bien par le conjugué KLH-SIAB- VEGF que par le VEGF uniquement ne présentent aucun signe clinique et aucune lésions anatomiques.
La réaction immunitaire est mesurée par : a) la présence dans le sérum d'anticorps de type IgG dirigés contre la protéine recombinante VEGF native, mesurée par ELISA et exprimée en titre (inverse de la dilution donnant une densité optique supérieure à 0.3)
Figure imgf000037_0001
Les souris immunisées avec le conjugué KLH-SIAB-VEGF présentent des titres d'anticorps de type IgG anti-VEGF plus importants que ceux des souris immunisées avec le VEGF uniquement. Exemple 7 : comparaison des activités neutralisantes des sérums de souris immunisées par le conjugué KLH-SIAB-VEGF ou par du VEGF natif.
L'activité neutralisante de ces anticorps a été mesurée à l'aide du test biologique standard de l'activité du VEGF. Différentes dilutions de sérums (1/100 - 1/800) prélevés à J -2 et J 72 sont incubées pendant 2 heures avec 10 ng/ml de VEGF natif. Ces dilutions sont ensuite déposées sur des cellules endothéliales (HUVEC) cultivées dans des puits à fond plat d'une plaque de micro-culture à raison de 3000 cellules/puits. La culture cellulaire est poursuivie à 37 °C en atmosphère humide chargée à 5 % de CO2 pendant 6 jours. 18 heures avant la fin de l'incubation, 0.5 μCi de thymidine tritiée / puits sont ajoutés.
Les résultats sont donnés en % de neutralisation.
Figure imgf000038_0001
Les anticorps induits par le conjugué KLH-VEGF ont un pouvoir neutralisant plus important que celui des anticorps induits par le VEGF. Exemple 9 : Comparaison des activités neutralisantes des souris immunisées avec soit le VEGF natif, soit le conjugué KLH-SIAB-VEGF, soit le conjugué KLH-SMCC-VEGF, soit le KLH-gluta-VEGF. L'activité neutralisante est déterminée selon le même protocole expérimental que celui décrit dans l'exemple 8. Comme dans le protocole d'expérimentation de l'exemple 7, les souris ont été immunisées à J 0, J 21 et à J 60.
La figure 2 résume les résultats obtenus : On voit que dès J 30, des neutralisations importantes apparaissent pour les conjugués KLH-SIAB- VEGF et KLH-SMCC-VEGF. Il faut" attendre J 70 pour obtenir des neutralisations avec le conjugué KLH-glutaraldéhyde-VEGF. Par contre, on n'observe pas de neutralisation pour le VEGF natif.
Exemple 10 : vaccination avec le conjugué KLH - glutaraldéhyde - E7.
L'activité immunogénique (humorale et cellulaire) du conjugué KLH-E7 par rapport à celle de la protéine E7 a été étudiée chez la souris balb c de 18-20 g.
Au jour J 0, un groupe de 3 souris reçoit une injection de 0,2 ml (50 μg) d'une émulsion en ACF par voie intramusculaire. Une injection de rappel de 5 μg en AIF est donnée à J 21 et J 60.
Un prélèvement sanguin au niveau rétro-orbital est effectué sur chaque souris avant la première injection à J -2
3 souris contrôles reçoivent les mêmes préparations sans immunogène.
3 souris reçoivent 100 μg de la préparation et l'absence de symptômes de maladie est étudiée pendant les 7 jours suivant l'injection.
Les souris sont sacrifiées 12 jours après la dernière immunisation.
L'absence de toxicité est mesurée par l'absence de signes cliniques : (comportement, poils, poids) et par examen anatomique après autopsie. Résultats :
Aucune des 3 souris immunisées avec 100 μg de la préparation ne manifeste de symptômes de maladie pendant les 7 jours suivant l'injection.
Les souris immunisées aussi bien par le conjugué KLH-E7 que par la protéine E7 uniquement ne présentent aucun signe clinique et aucune lésion anatomique.
La réaction immunitaire est mesurée par : 1- la présence dans le sérum d'anticorps de type IgG dirigée contre la protéine recombinante E7 native, mesurée par ELISA et exprimée en titre (inverse de la dilution donnant une densité optique supérieure à 0.3)
Figure imgf000040_0001
Les souris immunisées avec le conjugué KLH-E7 présentent des titres d'anticorps de type IgG anti-E7 plus importants que ceux des souris immunisées avec la protéine E7 uniquement.

Claims

REVENDICATIONS
1. Un vaccin caractérisé en ce qu'il renferme à titre de principe actif un immunogène qui est - un facteur cytokinique ou un facteur de régulation cellulaire particulièrement transcriptionnel ou un autre type de facteur à propriétés immunosuppressives / apoptotiques / angiogéniques anormalement relâché dans le milieu extracellulaire (stromal) par les cellules cancéreuses ou les cellules stromales de tumeurs malignes, ainsi qu'un excipient pharmaceutiquement acceptable permettant l'induction d'une réaction immunitaire systèmique ou mucosale avec formation d'anticorps neutralisants de classe IgG ou IgA sécrétoire dirigés contre le facteur natif, ou qui dérive d'un tel facteur, à l'exception de : - l'IL 6, un fragment d'IL 6 ou un analogue d'IL 6 sous une forme produisant une immunité non mucosale et non couplé à une protéine porteuse comme le KLH, un épitope de p53 trop court pour être immunogène et couplé à une protéine porteuse comme le KLH, - une composition d'une protéine p53 ou peptide de p53, d'IL 12 et d'un adjuvant.
2. Un vaccin selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'immunogène dérive d'un facteur cytokinique ou d'un facteur de régulation cellulaire particulièrement transcriptionnel ou d'un autre type de facteur à propriétés immunosuppressives / apoptotiques / angiogéniques anormalement produit par les cellules cancéreuses ou stromales de tumeurs malignes par traitement chimique, physique, par mutation génétique, par conditionnement adjuvant ou est le produit d'une vaccination génétique (vaccin à ADN) ou est un fragment protéique ou peptidique d'un tel facteur ou encore dérive d'un tel fragment protéique ou peptidique.
3. Un vaccin selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que l'immunogène dérive d'un facteur cytokinique ou d'un facteur de régulation cellulaire particulièrement transcriptionnel ou d'un autre type de facteur à propriétés immunosuppressives / apoptotiques / angiogéniques anormalement produit par les cellules cancéreuses ou stromales de tumeurs malignes ou d'un fragment protéique ou peptidique d'un tel facteur par couplage à une protéine porteuse qui est le KLH.
4. Un vaccin selon la revendication 1 , 2 ou 3 caractérisé en ce que l'immunogène est choisi parmi la TGFβ, l'IL 10, la protéine p53, le VEGF, l'IL 6, l'IFNγ, l'IFNα, le Fas ligand et le TNFα ou en dérive.
5. Un vaccin selon la revendication 1 , 2 ou 3 caractérisé en ce que l'immunogène est la TGFβ ou en dérive .
6. Un vaccin selon la revendication 1 , 2 ou 3 caractérisé en ce que l'immunogène est l'IL 6 couplée à une protéine porteuse qui est le KLH.
7. Un vaccin selon la revendication 1, 2 ou 3 caractérisé en ce que l'immunogène est la protéine p53 ou en dérive .
8. Un vaccin selon la revendication 1 , 2 ou 3 caractérisé en ce que l'immunogène est le VEGF ou en dérive.
9. Un vaccin selon la revendication 1 , 2 ou 3 caractérisé en ce que l'immunogène est l'IL 6 ou en dérive.
10. Un vaccin selon la revendication 1, 2 ou 3 caractérisé en ce que l'immunogène est l'IFNγ ou l'IFNα ou en dérive.
11. Un vaccin selon la revendication 1 , 2 ou 3 caractérisé en ce que l'immunogène est le TNFα ou en dérive.
12. Un vaccin selon l'une des revendications 1 à 11 caractérisé en ce qu'il renferme à titre de principe actif un immunogène qui est un mutant du facteur natif ou un fragment du facteur natif.
13. Utilisation d'un immunogène qui est un facteur cytokinique ou qui dérive d'un facteur cytokinique ou d'un facteur de régulation cellulaire particulièrement transcriptionnel ou d'un autre type de facteur à propriétés immunosuppressives / apoptotiques / angiogéniques anormalement produit dans le milieu extracellulaire (stromal) par des cellules cancéreuses ou stromales de tumeurs malignes pour l'obtention d'un médicament destiné à une utilisation en tant qu'anticancéreux par mécanisme de réduction des effets, sur le micro environnement desdites cellules cancéreuses ou stromales de tumeurs malignes, d'un facteur cytokinique ou d'un facteur de régulation cellulaire particulièrement transcriptionnel ou d'un autre type de facteur à propriétés immunosuppressives / apoptotiques / angiogéniques anormalement produit par lesdites cellules cancéreuses ou stromales de tumeurs malignes.
14. Utilisation selon la revendication 13, caractérisée en ce que l'immunogène est choisi parmi la parmi la TGFβ, l'IL 10, la protéine p53, le VEGF, l'IL 6, l'IFNγ, l'IFNα, le Fas ligand et le TNFα ou en dérive.
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