WO2002012554A2 - Diagnose von mit cd24 assoziierten krankheiten - Google Patents

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WO2002012554A2
WO2002012554A2 PCT/EP2001/008969 EP0108969W WO0212554A2 WO 2002012554 A2 WO2002012554 A2 WO 2002012554A2 EP 0108969 W EP0108969 W EP 0108969W WO 0212554 A2 WO0212554 A2 WO 0212554A2
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dna
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cytosine
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Christian Piepenbrock
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Epigenomics AG
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the present invention relates to nucleic acids, oligonucleotides, PNA oligomers and a method for diagnosing diseases which are related to the genetic and / or epigenetic parameters of the cell surface antigen CD24 and in particular its methylation status.
  • the human cell surface antigen CD24 is a glycosyl phosphatidylinositol (GPI) coupled glycoprotein. GPI-linked proteins are involved in signal transduction, which is mediated by members of the protein tyrosine kinase family. CD24 is involved in the differentiation and activation of granulocytes and B-lymphocytes. Changes in the expression of CD24 occur at critical times during the development of the B stem cells. CD24 is located on the human chromosome 6p21.
  • CD24 In addition to the association of CD24 with different diseases, it can also be used as a marker for diseases (Tsutsudaasano A, Migita M, Takahashi K, Shimada T. Transduction of fibroblasts and CD34 + progenitors using a selectable retroviral vector containing cDNAs encoding arylsulfatase A and CD24. J Hum Genet. 2000; 45 (1): 18-23.).
  • CD24 is used as a marker for human breast cancer and may support metastasis during the interaction between tumor cells and platelets or enothelial cells (Fogel M, Friederichs J, Zeller Y, Husar M, Smirnov A, Roitman L, Altevogt P, Sthoeger ZM. CD24 is a marker for human breast carcinoma. Cancer Lett. 1999 Aug 23; 143 (l): 87-94.).
  • CD24 is also expressed on nasopharyngeal carcinoma cells (Karran L, Jones M, Morley G, van Noorden S, Smith P, Lampert I, Griffin BE. Expression of a B-cell marker, CD24, on nasopharyngeal carcinoma cells. Int J Cancer. 1995 Feb 8; 60 (4): 562-6.).
  • CD24 can also be used in the diagnosis of splenic lymphoma with villous lymphocytes (SLVL) (Troussard X, Valensi F, Duchayne E, Garand R, Felman P, Tulliez M, Henry-Amar M, Bryon PA, Flandrin G. Splenic lymphoma with villous lymphocytes: clinical presentation, biology and prognostic factors in a series of 100 patients. Groupe Francais d'Hematologie Cellulaire. Br J Haematol. 1996).
  • SLVL villous lymphocytes
  • SLVL could be diagnosed in one patient in connection with changed cellular phenotypes (CD24 among others) (Kuwayama M, Machii T, Yamaguchi M, Yamaguti K, Kitani T, Kanakura Y. Blastic transformation of splenic lymphoma with villous lymphocytes after a well-controlled chronic phase of more than 10 years. Int J Hematol. 2000 Feb; 71 (2): 167-71).
  • CD24 infantile spinal muscular atrophy has an abnormal expression pattern of cell surface proteins such as CD24 (Soubrouillard C, Pellissier JF, Lepidi H, Mancini J, Rougon G, Figarella-Branger D. Expression of developmentally regulated cytoskeleton and cell surface proteins in childhood spinal muscular atrophies. J Neurol Sci. 1995 Nov; 133 (1-2): 155-63). CD24 is overexpressed in lung cancer. It is believed that the CD24 promoter has strong cell-type specific activity (Pass MK, Quintini G, Zarn JA, Zimmermann SM, Sigrist JA, Stahel RA. The 5'-flanking region of human CD24 gene has cell-type-specific promoter activity in small-cell lung cancer.
  • CD24 monoclonal antibodies can be used in the diagnosis of Epstein-Barr virus-induced lymphoproliferative syndrome (EBV-LPS) (Lazarovits AI, Tibbles LA, Grant DR, Ghent CN, Wall WJ, White MJ, Joncas JH. Anti-B cell antibodies for the treatment of monoclonal Epstein-Barr virus-induced lymphoproliferative syndrome after multivisceral transplantation.Clin Invest Med. 1994 Dec; 17 (6): 621-5).
  • EBV-LPS Epstein-Barr virus-induced lymphoproliferative syndrome
  • CD24-associated complexes in lung cancer and leukemia is discussed (Zarn JA, Zimmeraiann SM, Pass MK, Waibel R, Stahel RA. Association of CD24 with the kinase c-fgr in a small cell hing cancer cell line and with the kinase lyn in an erythroleukemia cell line. Biochem Biophys Res Commun. 1996 Aug 14; 225 (2): 384-91).
  • CD24 in acute lymphoblastic leukemia is emphasized by the fact that in patients with this disease a low CD24 / CD45 antigen density is associated with a positive indication for the patient (Lavabre-Bertrand T, Duperray C, Brunet C, Poncelet P, Exbrayat C , Bourquard P, Lavabre-Bertrand C, Brochier J, Navarro M, Janossy G. Quantification of CD24 and CD45 antigens in parallel allows a precise determination of B-cell maturation stages: relevance for the study of B-cell neoplasias. Leu - kemia. 1994 Mar; 8 (3): 402-8).
  • CD24 An increased expression of CD24 was found in patients with rheumatic and reactive arthritis (Felzmann T, Gadd S, Majdic O, Maurer D, Petera P, Smolen J, Knapp W. Analysis of function-associated receptor molecules on peripheral blood and synovial fluid granulocytes from patients with rheumatoid and reactive arthritis. J Clin Immunol. 1991 Jul; ll (4): 205-12). Furthermore, a connection between CD24 and multiple myeloma (Duperray C, Bataille R, Boiron JM, Haagen IA, Cantaloube JF, Zhang XG, Boucheix C, Klein B. No expansion of the pre-B and B-cell compartments in the bone marrow of patients with multiple myeloma.
  • myeloma kills around three thousand people annually. So far there is no cure for the disease. It is a systemic disease with neoplastic multiplication of the plasma cells and formation of para- proteins with an increased total protein and usually a strong increase in the ß- to gamma-globulin fraction. In multiple myeloma, plasma cells grow uncontrollably. These cells are normally formed as "agents" of the immune system in the bone marrow and introduced into the bloodstream. There they look for pathogens, toxins or cancer cells. Due to a genetic defect, they can mutate into tumor cells themselves. The result is a weakening of the immune system, destruction of the bone structure, anemia and severe pain in the patient.
  • Reactive arthritis is one of the inflammatory rheumatic diseases.
  • the ongoing inflammation increasingly damages the joints.
  • Massive disabilities and pain are often the result. It is caused, for example, by bacteria, in particular by so-called borrellia or chlamydia. If it is chronic, the joints suffer damage similar to that of rheumatoid arthritis.
  • the cytokines produced by the immune cells make a significant contribution to the destruction of the joints.
  • the immune cells of rheumatism patients increasingly release the inflammation-promoting cytokines "Interleukin 1" and the tumor necrosis factor alpha "(TNF-alpha).
  • Tl helper cells Before one can specifically target the respective messenger substances, it is necessary to clarify which ones rheumatic disease, which cytokines are increasingly released in the case of rheumatoid arthritis, Tl helper cells in particular, whereas in reactive arthritis, T2 helper cells heat the inflammation.
  • Splenic lymphoma with villous lymphocytes is a chronic lymphoproliferative disease and is characterized by splenoma malignancy and the appearance of atypical lymphocytes with villous processes in the peripheral blood and bone marrow. SLVL mainly affects men aged 70 and over. There are none in this rare disease known chromosomal abnormalities; it is characterized by circulating lymphocytes with thin and short cytoplasmic villi and enlargement of the spleen, in two thirds of cases monoclonal gammopathy occurs. The cellular origin of the disease is subject to somatic hypermutations before the tumor transformation.
  • Macroglobulinemia Waldenström is a rare immunoproliferative disease and is characterized by an increase in serum macroglobulins. In related B-cell neoplasms, such as multiple myeloma and chronic lymphoblastic leukemia, the histological features of the bone marrow are considered to be prognostically relevant. All patients with Waldenström macroglobulinemia have a circulating tumor marker, the monoclonal IgM protein. Occasionally, high levels of monoclonal IgM protein can produce hyperviscosity syndrome, manifested by oronasal bleeding.
  • the EBV is a ubiquitous herpes virus (herpes subtype IV) with a high infection rate (approx. 95% of adults) in the population.
  • the main symptoms of the EBV infection (incubation time 4-6 weeks) are flu-like complaints such as headache, adynamy and high fever, in the further course pharyngitis, splenomegaly and lymphadenitis.
  • leukemia is the malignant degeneration and maturation disorder of white blood cells. There is usually a strong increase in immature white blood cells, which gradually replace the normal white blood cells. The result is anemia, bleeding, infections and disorders of organ functions. As with most cancers, the cause of the disease is unknown.
  • lymphatic leukemia when immature lymphocytes occur in particular.
  • Acute lymphoblastic leukemia ALL is the most common form of leukemia and also the most common type of cancer in children. With the rapidly advancing ALL, the developing lymphocytes become too numerous and they do not mature.
  • the progenitor cells of the lymphocytes from the bone marrow change cancerously and appear in the blood and in the bone marrow.
  • the cancerous lymphocytes are distributed in the body via the bloodstream, for example in the liver, spleen, spinal cord or brain.
  • Lung cancer is the most common malignancy worldwide.
  • Small cell bronchial carcinomas make up 25-30% of all lung cancers. It is a disease in which malignant cancer cells appear in the lung tissue. It is characterized by a particularly high and rapid proliferation.
  • Small cell bronchial carcinoma is extremely malignant clinically and leads to early metastasis.
  • Daughter tumors can be demonstrated in 80% of patients with the first diagnosis. Some of these tumors can release hormones into the blood and thus affect the natural hormone balance.
  • - nasopharyngeal carcinoma asopharyngeal carcinoma
  • Nasopharyngeal carcinoma is a malignant tumor of lymphoepithelial organs and consists of malignant epithelial cells. It is the most common malignant tumor of the nasopharynx and is characterized by very rapid growth. Furthermore, it is characterized by early metastasis and great sensitivity to radiation. It is endemic to some areas and also occurs decades after primary infection with the Epstein-Barr virus.
  • 5-Methylcytosine is the most common covalently modified base in the DNA of eukaryotic cells. For example, it plays a role in the regulation of transcription, in genetic imprinting and in tumorigenesis. The identification of 5-methylcytosine as a component of genetic information is therefore of considerable interest. However, 5-methylcytosine positions cannot be identified by sequencing since 5-methylcytosine has the same base pairing behavior as cytosine. In addition, in the case of PCR amplification, the epigenetic information which the 5-methylcytosines carry is completely lost.
  • a relatively new and the most frequently used method for the investigation of DNA for 5-methylcytosine is based on the specific reaction of bisulfite with cytosine, which is converted into uracil after subsequent alkaline hydrolysis, which corresponds in its base pairing behavior to thymidine.
  • 5-methylcytosine is not modified under these conditions.
  • the original DNA is thus converted in such a way that methylcytosine, which originally cannot be distinguished from the cytosine by its hybridization behavior, can now be detected by “normal” molecular biological techniques as the only remaining cytosine, for example by amplification and hybridization or sequencing.
  • Fluorescence-labeled probes have been used in many cases for scanning an immobilized DNA array.
  • the simple attachment of Cy3 and Cy5 dyes to the 5'-OH of the respective probe is particularly suitable for fluorescent labels.
  • the fluorescence of the hybridized probes is detected, for example, using a confocal microscope.
  • the dyes Cy3 and Cy5 are, among many others, commercially available Lich.
  • Matrix-assisted laser desorption / ionization mass spectrometry is a very powerful development for the analysis of biomolecules (Karas, M. and Hillenkamp, F. (1988), Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exeeding 10000 daltons. Anal. Chem. 60: 2299-2301).
  • An analyte is embedded in a light-absorbing matrix. The matrix is evaporated by a short laser pulse and the analyte molecule is thus transported unfragmented into the gas phase. The ionization of the analyte is achieved by collisions with matrix molecules.
  • An applied voltage accelerates the ions into a field-free flight tube. Due to their different masses, ions are accelerated to different extents. Smaller ions reach the detector earlier than larger ones.
  • MALDI-TOF spectrometry is ideal for the analysis of peptides and proteins.
  • the analysis of nucleic acids is somewhat more difficult (Gut, IG and Beck, S. (1995)), DNA and Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry. Molecular Biology: Current Innovations and Future Trends 1: 147-157.)
  • the sensitivity is about 100 times worse than for peptides and decreases disproportionately with increasing fragment size.
  • nucleic acids that have a backbone that is often negatively charged the ionization process through the matrix is much more inefficient.
  • the choice of the matrix plays an eminently important role.
  • Genomic DNA is obtained by standard methods from DNA from cell, tissue or other test samples. This standard methodology can be found in references such as Fritsch and Maniatis eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.
  • the invention is based on the surprising finding that genetic and epigenetic parameters and in particular the cytosine methylation pattern of the CD24 gene are particularly suitable for the diagnosis of diseases associated with CD24.
  • this object is achieved by a nucleic acid comprising an at least 18 base long sequence section of the chemically pretreated DNA of the CD24 gene according to one of the Seq. ID No.l to Seq. ID No.4 solved.
  • the chemically modified nucleic acid has so far not been associated with the determination of genetic and epigenetic parameters.
  • the object of the present invention is further achieved by an oligonucleotide or oligomer for the detection of the cytosine methylation state in chemically pretreated DNA, comprising at least one base sequence with a length of at least 9 nucleotides, which is linked to a chemically pretreated DNA of the CD24 gene according to a the Seq. ID No.l to Seq. ID No.4 hybridized.
  • the oligomer probes according to the invention represent important and effective tools which make it possible to determine the genetic and epigenetic parameters of the CD24 gene in the first place.
  • the base sequence of the oligomers preferably comprises at least one CpG dinucleotide.
  • the probes can also be in the form of a PNA (Peptide Nucleic Acid), which has particularly preferred pairing properties.
  • Oligomers according to the invention in which the cytosine of the CpG dinucleotide is approximately in the middle third of the oligomer are particularly preferred, for example oligomers in which the cytosine of the CpG dinucleotide is the 5th to 9th nucleotide from the 5 'end of a 13 mer, for example , In the case of PNA It is preferred for oligomers that the cytosine of the CpG dinucleotide is the 4th - 6th nucleotide from the 5 'end of a, for example, 9 mer.
  • the oligomers according to the invention are normally used in so-called sets which contain one of the sequences of Seq for each of the CpG dinucleotides.
  • ID No.l to Seq. ID No.4 comprise at least one oligomer.
  • a set is preferred which comprises at least one oligomer for each of the CpG dinucleotides from one of Seq ID No. 1 to Seq ID No.4.
  • the invention provides a set of at least two oligonucleotides which, as so-called primer oligonucleotides, for the amplification of DNA sequences of one of the Seq. ID No.l to Seq. ID No.4 or sections thereof can be used.
  • At least one oligonucleotide is bound to a solid phase.
  • the present invention further relates to a set of at least 10 oligomers (oligonucleotides and / or PNA oligomers) which are used to detect the cytosine methylation state in chemically pretreated genomic DNA (Seq. ID No.1 to Seq. ID No.4). With these probes, the diagnosis of genetic and epigenetic parameters of the CD24 gene is possible.
  • the set of oligomers can also be used to detect single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the chemically pretreated DNA of the CD24 gene according to one of the Seq. ID No.l to Seq. ID No.4 can be used.
  • an arrangement made of different oligonucleotides and / or PNA oligomers (a so-called “array") provided by the invention is also bound to a solid phase.
  • This array of different oligonucleotide and / or PNA oligomer sequences can be characterized in that it is arranged on the solid phase in the form of a rectangular or hexagonal grid.
  • the solid phase surface is preferably made of silicon, glass, polystyrene, aluminum, steel, iron, copper, nickel, silver or gold.
  • nitrocellulose and plastics such as nylon are also possible Balls or as resin matrices can be present.
  • the invention therefore furthermore relates to a method for producing an array fixed on a carrier material for analysis in connection with CD24-associated diseases, in which at least one oligomer according to the invention is coupled to a solid phase.
  • Methods for producing such arrays are known, for example, from US Pat. No. 5,744,305 by means of solid-phase chemistry and photolabile protective groups.
  • the invention further relates to a DNA chip for analysis in connection with CD24-associated diseases, which comprises at least one nucleic acid according to the present invention.
  • DNA chips are known, for example, from US Pat. No. 5,837,832.
  • the present invention also relates to a kit which, for example, consists of a reagent containing bisulfite, a set of primer oligonucleotides comprising at least two oligonucleotides, the sequences of which each have at least an 18 base pair section of the base sequences listed in the appendix (Seq. ID No. 1 to Seq . ID No.4) correspond to or are complementary to them, oligonucleotides and / or PNA oligomers as well as instructions for carrying out and evaluating the described method can exist.
  • a kit in the sense of the invention can also contain only parts of the aforementioned components.
  • the present invention further relates to a method for producing a diagnostic agent for diagnosing diseases associated with CD24 by analyzing methylation patterns of the CD24 gene, the diagnostic agent being characterized in that at least one nucleic acid, according to the present invention, optionally together with suitable additives and auxiliaries for its production is used.
  • Another object of the present invention relates to a diagnostic agent for diseases associated with CD24 by analysis of methylation patterns of the CD24 gene, which optionally contains at least one nucleic acid according to the invention together with suitable additives and auxiliary substances.
  • the invention further provides a method for determining genetic and / or epigenetic parameters of the CD24 gene by analyzing cytosine methylations and single nucleotide polymorphisms, which comprises the following steps:
  • a genomic DNA sample is chemically such loading; is that at the 5'-position unmethylated cytosine bases are converted into uracil, thymine or another base which is unlike the cytosine in terms of hybridization behavior. This is understood below as chemical pretreatment.
  • the genomic DNA to be analyzed is preferably obtained from the usual sources for DNA, such as cells or cell components, for example cell lines, biopsins, blood, sputum, stool, urine, brain-spinal fluid, tissue embedded in paraffin, for example tissue from Eyes, intestines, kidneys, brain, heart, prostate, lungs, chest or liver, histological slides or combinations thereof.
  • sources for DNA such as cells or cell components, for example cell lines, biopsins, blood, sputum, stool, urine, brain-spinal fluid, tissue embedded in paraffin, for example tissue from Eyes, intestines, kidneys, brain, heart, prostate, lungs, chest or liver, histological slides or combinations thereof.
  • the treatment of genomic DNA with bisulfite (hydrogen sulfite, disulfite) and subsequent alkaline hydrolysis which leads to a conversion of unmethylated cytosine nucleobases into uracil or another base which is unlike the cytosine in base pairing behavior, is preferably used for this purpose.
  • Fragments are amplified from this chemically pretreated genomic DNA using sets of primer oligonucleotides according to the invention and a preferably heat-stable polymerase. For statistical and practical considerations, more than ten different fragments that are 100-2000 base pairs long are preferably amplified.
  • the amplification of several DNA sections can be carried out simultaneously in one and the same reaction vessel. The amplification is usually carried out by means of the polymerase chain reaction (PCR).
  • the set of primer oligonucleotides comprises at least two oligonucleotides, the sequences of which are each reversely complementary or identical to a section of at least 18 base pairs long which is hang (Seq. ID No.l to Seq. ID No.4) are listed base sequences.
  • the primer oligonucleotides are preferably characterized in that they contain no CpG dinucleotide.
  • At least one primer oligonucleotide is bound to a solid phase during the amplification.
  • the different oligonucleotides and / or PNA oligomer sequences can be arranged on a flat solid phase in the form of a rectangular or hexagonal grid, the solid phase surface preferably consisting of silicon, glass, polystyrene, aluminum, steel, iron, copper, nickel, silver or gold, other materials such as nitrocellulose or plastics can also be used.
  • the fragments obtained by means of the amplification can carry a directly or indirectly detectable label. Markings in the form of fluorescent markings, radionuclides or detachable molecular fragments with typical mass, which can be detected in a mass spectrometer, are preferred, it being preferred that the fragments produced have a single positive or negative net charge for better detectability in the mass spectrometer.
  • the detection can be carried out and visualized using matrix assisted laser desorption / ionization mass spectrometry (MALDI) or using electrospray mass spectrometry (ESI).
  • the amplificates obtained in the second process step are then hybridized to a set of oligonucleotides and / or PNA probes or to an array.
  • the hybridization is carried out in the manner given below.
  • the set used in the hybridization preferably consists of at least 10 oligonucleotide or PNA oligomer probes.
  • the amplificates serve as samples that hybridize to oligonucleotides previously bound to a solid phase. The non-hybridized fragments are then removed.
  • Said oligonucleotides comprise at least one base sequence with a length of 13 nucleotides, which is reverse complementary or identical to a section of the base sequences listed in the appendix, which contains at least one CpG dinucleotide.
  • the cytosine of the CpG dinucleotide is the 5th to 9th nucleotide viewed from the 5 'end of the 13 mer.
  • the said PNA oligomers comprise at least one base sequence with a length of 9 nucleotides, which is reverse complementary or identical to a section of the base sequences listed in the appendix, which contains at least one CpG dinucleotide.
  • the cytosine of the CpG dinucleotide is the 4th to 6th nucleotide as seen from the 5 'end of the 9 mer.
  • the non-hybridized amplificates are removed.
  • the hybridized amplificates are detected. It is preferred that labels attached to the amplificates can be identified at any position on the solid phase at which an oligonucleotide sequence is located.
  • the labels of the amplified products are fluorescent labels, radionuclides or detachable molecular fragments with a typical mass, which can be detected in a mass spectrometer.
  • the detection of the amplified products, fragments of the amplified products or probes complementary to the amplified products in the mass spectrometer is preferred, whereby the detection can be carried out and visualized by means of matrix assisted laser desorption / ionization mass spectrometry (MALDI) or by means of electrospray mass spectrometry (ESI).
  • MALDI matrix assisted laser desorption / ionization mass spectrometry
  • ESI electrospray mass spectrometry
  • the fragments generated can have a single positive or negative net charge for better detectability in the mass spectrometer.
  • the aforementioned method is preferably used to determine genetic and / or epigenetic parameters of the CD24 gene.
  • the oligomers or arrays thereof according to the invention and a kit according to the invention are intended to be used to diagnose a disease associated with CD24 by analyzing methylation patterns of the CD24 gene. According to the invention, the use of the method for the diagnosis of important genetic and / or epigenetic parameters within the CD24 gene is preferred.
  • the method according to the invention is used, for example, to diagnose cancer, for example leukemia, lung cancer, or nasopharyngeal carcinoma, multiple tiplemic myeloma, reactive arthritis, spleen lymphoma, Waldenstrom macroglobulinemia, Epstein-Barr virus-induced syndrome and / or infantile spinal muscular atrophy.
  • cancer for example leukemia, lung cancer, or nasopharyngeal carcinoma
  • multiple tiplemic myeloma reactive arthritis
  • spleen lymphoma Waldenstrom macroglobulinemia
  • Epstein-Barr virus-induced syndrome and / or infantile spinal muscular atrophy.
  • the nucleic acids of Seq. ID No.l to Seq. ID No.4 can be used for the diagnosis of genetic and / or epigenetic parameters of the CD24 gene.
  • the oligomers according to the invention or an arrangement thereof can be used in a kit for diagnosing a disease associated with CD24 by analyzing methylation patterns of the CD24 gene. The analysis is carried out according to the method mentioned above and in the examples.
  • All diseases associated with a change in the methylation pattern of the CD24 gene such as, for example, cancers, for example leukemia, lung cancer, or nasopharyngeal carcinoma, multiple myeloma, reactive arthritis, spleen lymphoma, Waldenstrom macroglobulinemia, the Epstein-Barr virus can be diagnosed induced syndrome and / or infantile spinal muscular atrophy.
  • cancers for example leukemia, lung cancer, or nasopharyngeal carcinoma
  • multiple myeloma reactive arthritis
  • spleen lymphoma Waldenstrom macroglobulinemia
  • the Epstein-Barr virus can be diagnosed induced syndrome and / or infantile spinal muscular atrophy.
  • the present invention further relates to the diagnosis and / or prognosis of adverse events for patients or individuals, these adverse events being associated with methylation patterns of the CD24 gene.
  • the examining person can make the diagnosis and / or prognosis of adverse events for the patient.
  • the data determined using one of the methods according to the invention can be used for this purpose.
  • the significant genetic and / or epigenetic parameters obtained by means of the invention can be compared within the CD24 gene with another set of genetic and / or epigenetic parameters and the differences thus obtained as a basis for a diagnosis and / or prognosis of adverse events for patients or serve individuals.
  • hybridization in the sense of the present invention is to be understood as binding to form a duplex structure of an oligonucleotide to a completely complementary sequence in the sense of the Watson-Crick base pairings in the sample DNA.
  • Stringent hybridization conditions are to be understood as those conditions in which hybridization at 60 ° C. in 2.5 ⁇ SSC buffer is followed by several wash steps at 37 ° C in a lower buffer concentration and remains stable.
  • the term “functional variants” denotes all DNA sequences which are complementary to a DNA sequence, which hybridize with the reference sequence under stringent conditions and which have an activity similar to the corresponding polypeptide according to the invention.
  • Genetic parameters in the sense of this invention are mutations and polymorphisms of the CD24 gene and sequences that are still required for its regulation.
  • insertions, deletions, point mutations, inversions and polymorphisms and particularly preferably SNPs (single nucleotide polymorphisms) are to be referred to as mutations.
  • Polymorphisms can also be insertions, deletions or inversions.
  • Epigenetic parameters in the sense of this invention are, in particular, cytosine methylations and further chemical modifications of DNA bases of the CD24 gene and sequences which are also required for its regulation. Further epigenetic parameters are, for example, the acetylation of histones, which, however, cannot be analyzed directly with the method described, but in turn correlates with DNA methylation.
  • Seq. ID No. 1 shows the sequence of the chemically pretreated genomic DNA of the CD24 gene
  • Seq. ID No.2 shows the sequence of a second chemically pretreated genomic DNA of the CD24 gene
  • Seq. ID No.3 shows the reverse complementary sequence of the Seq. ID 1 of the chemically pretreated genomic DNA of the CD24 gene
  • Seq. ID No.4 shows the reverse complementary sequence of the Seq. ID 2 of the chemically pretreated genomic DNA of the CD24 gene
  • Seq. ID No.5 shows the sequence of an oligonucleotide for the amplification of CD24 from Example 1
  • Seq. ID No.6 shows the sequence of a second oligonucleotide for the amplification of CD24 from Example 1
  • Seq. ID No.7 shows the sequence of an oligonucleotide for hybridizing the amplificate of CD24 from Example 1
  • the following example relates to a fragment of the CD24 gene, in which a specific CG position is examined for its methylation status.
  • Example 1 Performing the methylation analysis in the CD24 gene
  • a genomic sequence is treated using bisulfite (hydrogen sulfite, disulfite) in such a way that all of the cytosines that are not methylated at the 5-position of the base are changed in such a way that a base which is different with regard to the base pairing behavior is formed, while the base in the 5-position methylated cytosines remain unchanged.
  • bisulfite in the concentration range between 0.1 and 6 M is used for the reaction, an addition takes place at the unmethylated cytosine bases.
  • a denaturing reagent or solvent and a radical scavenger must be present. Subsequent alkaline hydrolysis then leads to the conversion of unmethylated cytosine nucleobases into uracil.
  • This converted DNA is used to detect methylated cytosines.
  • the treated DNA sample is diluted with water or an aqueous solution. Desulfonation of the DNA (10-30 min, 90-100 oC) is then preferably carried out at alkaline pH.
  • the DNA sample is amplified in a polymer chain reaction, preferably with a heat-resistant DNA polymerase.
  • cytosines of the CD24 gene here from the promoter region, are examined.
  • GGGTAAGATGGTAGGTTT Seq ID No.5
  • CATTACTCTACCCATATCC Seq ID No.6
  • This amplificate serves as a sample which hybridizes to an oligonucleotide previously bound to a solid phase to form a duplex structure, for example TTTGTTCGTAGTT (Seq ID No.7), the cytosine to be detected being at position 125 of the amplificate.
  • the detection of the hybridization product is based on Cy3 and Cy5 fluorescence-labeled primer oligonucleotides that were used for the amplification.
  • a hybridization reaction of the amplified DNA with the oligonucleotide occurs only if a methylated cytosine was present at this point in the bisulfite-treated DNA.
  • the methylation status of the respective cytosine to be examined thus decides on the hybridization product.
  • Example 2 can be carried out, for example, for the following diseases: multiple myeloma, reactive arthritis, spleen lymphoma, Waldenstrom's macroglobulinemia, Epstein-Barr virus-induced syndrome, infantile spinal muscular atrophy, leukemia, lung cancer and nasopharyngeal carcinoma.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die chemisch modifizierte genomische Sequenz des CD24-Gens, gegen die Sequenz gerichtete Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere Detektion des Cytosin-Methylierungszustandes des CD24-Gens, sowie ein Verfahren zur Ermittlung von genetischen und/oder epigenetischen Parametern des CD24-Gens.

Description

Diagnose von mit CD24 assoziierten Krankheiten
Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuren, Oligonukleotide, PNA-Oligomere und ein Verfahren zur Diagnose von Erkrankungen, die mit dem genetischen und/oder epigenetischen Parametern des Zelloberflächenantigens CD24 und insbesondere dessen Methy- lierungsstatus in Zusammenhang stehen.
Die nach den methodischen Entwicklungen der letzten Jahre in der Molekularbiologie gut studierten Beobachtungsebenen sind die Gene selbst, die Übersetzung dieser Gene in RNA und die daraus entstehenden Proteine. Wann im Laufe der Entwicklung eines Individuums welches Gen angeschaltet wird und wie Aktivieren und Inhibieren bestimmter Gene in bestimmten Zellen und Geweben gesteuert wird, ist mit Ausmaß und Charakter der Me- thylierung der Gene bzw. des Genoms korrelierbar. Insofern äußern sich pathogene Zustände in einem veränderten Methylierungsmuster einzelner Gene oder des Genoms.
Das menschliche Zelloberflächenantigen CD24 ist ein Glykosyl-Phosphatidylinositol (GPI) gekoppeltes Glykoprotein. GPI gekoppelte Proteine sind involviert in die Signal- transduktion, die durch Mitglieder der Protein Tyrosin Kinase Familie vermittelt wird. CD24 ist involviert in die Differenzierung und Aktivierung von Granulozyten und B- Lymphocyten. Veränderungen in der Expression von CD24 treten zu kritischen Zeiten während der Entwicklung der B-Stammzellen auf. Lokalisiert ist CD24 auf dem menschlichen Chromosom 6p21.
Im Gegensatz zur Expression auf vielen B-Stammzellen sowie auf reifen Granulozyten, weisen Untersuchungen mit monoklonalen Antikörpern darauf hin, dass die meisten anderen hämatopoetischen Zellen, einschließlich T Zellen, Monozyten, roten Blutzellen und Thrombozyten das CD24-Antigen nicht exprimieren.
Neben der Assoziation von CD24 mit unterschiedlichen Erkrankungen kann es auch als Marker für Erkrankungen verwendet werden (Tsutsudaasano A, Migita M, Takahashi K, Shimada T. Transduction of fibroblasts and CD34+ progenitors using a selectable retrovi- ral vector containing cDNAs encoding arylsulfatase A and CD24. J Hum Genet. 2000;45(1): 18-23.). So wird CD24 als Marker für das menschliche Brustkarzinom verwendet und unterstützt möglicherweise die Metastasierung während der Interaktion zwischen Tumorzellen und Thrombozyten oder enothelialen Zellen (Fogel M, Friederichs J, Zeller Y, Husar M, Smirnov A, Roitman L, Altevogt P, Sthoeger ZM. CD24 is a marker for human breast carcinoma. Cancer Lett. 1999 Aug 23;143(l):87-94.).
CD24 wird auch auf nasopharyngealen Karzinom Zellen exprimiert (Karran L, Jones M, Morley G, van Noorden S, Smith P, Lampert I, Griffin BE. Expression of a B-cell marker, CD24, on nasopharyngeal carcinoma cells. Int J Cancer. 1995 Feb 8;60(4):562-6.).
Weiterhin kann CD24 auch bei der Diagnose für das Lymphom der Milz mit villösen Lymphocyten (SLVL) verwendet werden (Troussard X, Valensi F, Duchayne E, Garand R, Felman P, Tulliez M, Henry-Amar M, Bryon PA, Flandrin G. Splenic lymphoma with villous lymphocytes: clinical presentation, biology and prognostic factors in a series of 100 patients. Groupe Francais d'Hematologie Cellulaire. Br J Haematol. 1996). In Zusammenhang mit veränderten zellulären Phänotypen (u.a. CD24) konnte bei einem Patienten SLVL diagnostiziert werden (Kuwayama M, Machii T, Yamaguchi M, Yamaguti K, Kitani T, Kanakura Y. Blastictransformation of splenic lymphoma with villous lymphocytes after a well-controlled chronic phase of more than 10 years. Int J Hematol. 2000 Feb;71(2):167- 71).
Die infantile spinale Muskelatrophie weist ein abnormales Expressionsmuster von Zelloberflächenproteinen wie CD24 auf (Soubrouillard C, Pellissier JF, Lepidi H, Mancini J, Rougon G, Figarella-Branger D. Expression of developmentally regulated cytoskeleton and cell surface proteins in childhood spinal muscular atrophies. J Neurol Sei. 1995 Nov;133(l-2):155-63). CD24 ist überexprimiert bei Lungenkrebs. Es wird angenommen, dass der CD24 Promotor eine stark Zelltyp spezifische Aktivität besitzt (Pass MK, Quintini G, Zarn JA, Zimmermann SM, Sigrist JA, Stahel RA. The 5'-flanking region of human CD24 gene has cell-type-specific promoter activity in small-cell lung cancer. Int J Cancer. 1998 Nov 9;78(4):496-502). CD24 monoklonale Antikörper können bei der Diagnose des Epstein-Barr Virus induzierten lymphoproliferativen Syndroms (EBV-LPS) eingesetzt werden (Lazarovits AI, Tibbles LA, Grant DR, Ghent CN, Wall WJ, White MJ, Joncas JH. Anti-B cell antibodies for the treatment of monoclonal Epstein-Barr virus-induced lymphoproliferative syndrome after multivisceral transplantation. Clin Invest Med. 1994 Dec;17(6):621-5).
Die Beteiligung von CD24 assoziierten Komplexen an Lungenkrebs und Leukämien wird diskutiert (Zarn JA, Zimmeraiann SM, Pass MK, Waibel R, Stahel RA. Association of CD24 with the kinase c-fgr in a small cell hing cancer cell line and with the kinase lyn in an erythroleukemia cell line. Biochem Biophys Res Commun. 1996 Aug 14;225(2):384- 91).
Die Beteiligung von CD24 an akuter Lymphoblastenleukämie wird dadurch unterstrichen, dass bei Patienten mit dieser Erkrankung eine niedrige CD24/CD45 Antigen Dichte mit einer für den Patienten positiven Indikation assoziiert ist (Lavabre-Bertrand T, Duperray C, Brunet C, Poncelet P, Exbrayat C, Bourquard P, Lavabre-Bertrand C, Brochier J, Navarro M, Janossy G. Quantification of CD24 and CD45 antigens in parallel allows a precise de- termination of B-cell maturation stages: relevance for the study of B-cell neoplasias. Leu- kemia. 1994 Mar;8(3):402-8).
Eine erhöhte Expression von CD24 wurde bei Patienten mit rheumatischer und reaktiver Arthritis gefunden (Felzmann T, Gadd S, Majdic O, Maurer D, Petera P, Smolen J, Knapp W. Analysis of function-associated receptor molecules on peripheral blood and synovial fluid granulocytes from patients with rheumatoid and reactive arthritis. J Clin Immunol. 1991 Jul;ll(4):205-12). Weiterhin konnte ein Zusammenhang zwischen CD24 und multiplem Myelom (Duperray C, Bataille R, Boiron JM, Haagen IA, Cantaloube JF, Zhang XG, Boucheix C, Klein B. No expansion of the pre-B and B-cell compartments in the bone marrow of patients with multiple myeloma. Cancer Res. 1991 Jun 15;51(12):3224-8) und zwischen CD24 und Waldenströms Makroglobulinämie (Jensen G S, Andrews E J, Mant M J, Vergidis R, Ledbetter J A, Pilarski L M. Transitions in CD45 isoform expression in- dicate continuous differentiation of a monoclonal CD5+ CDl lb+ B lineage in Walden- strom's macroglobulinemia. Am J Hematol. 1991 May;37(l):20-30) nachgewiesen werden. Wichtige Erkrankungen sind wie folgt erläutert:
- multiples Myelom:
An dem multiplen Myelom (oder Plasmazytom) sterben jährlich rund dreitausend Menschen. Bisher gibt es kein Heilmittel für die Krankheit. Es handelt sich hierbei um eine Systemerkrankung mit neoplastischer Vermehrung der Plasmazellen und Bildung von Pa- raproteinen bei erhöhtem Gesamteiweiß sowie meist starker Erhöhung der ß- bis gamma- Globulinfraktion. Beim multiplen Myelom wachsen Plasmazellen unkontrolliert. Diese Zellen werden normalerweise als "Agenten" des Immunsystems im Knochenmark gebildet und in die Blutbahn eingeschleust. Dort suchen sie nach Krankheitserregern, Giftstoffen oder Krebszellen. Durch einen Gendefekt können sie aber selber zu Tumorzellen mutieren. Eine Schwächung des Immunsystems, Zerstörung der Knochenstruktur, Blutarmut und starke Schmerzen bei den Patienten sind die Folge.
- reaktive Arthritis:
Die reaktive Arthritis zählt zu den entzündlichen rheumatischen Erkrankungen. Durch die anhaltenden Entzündungen werden die Gelenke zunehmend geschädigt. Häufig sind massive Behinderungen und Schmerzen die Folge. Sie wird zum Beispiel durch Bakterien, insbesondere durch sogenannte Borrellien oder Chlamydien, verursacht. Verläuft sie chronisch, erleiden die Gelenke ähnliche Schäden wie bei der rheumatoiden Arthritis. Bei beiden Rheumaformen tragen die von den Immunzellen gebildeten Zytokine maßgeblich zur Gelenkzerstörung bei. Die Immunzellen von Rheuma-Patienten schütten vermehrt die ent- zündungsfördernden Zytokine "Interleukin 1" und denTumor-Nekrose-Faktor-alpha" (TNF-alpha) aus. Bevor man gezielt gegen die jeweiligen Botenstoffe ansteuern kann, muß geklärt sein, bei .welcher rheumatischen Krankheit welche Zytokine vermehrt ausgeschüttet werden. Bei bei der rheumatoiden Arthritis heizen vor allem Tl-Helferzellen, bei der reaktiven Arthritis dagegen T2-Helferzellen die Entzündung an.
- Milz-Lymphom mit villösen Lymphocyten:
Das Milz-Lymphom mit villösen Lymphocyten (SLVL) ist eine chronische lymphoproliferative Erkrankung und wird charakterisiert durch Splenomagalie und das Auftreten von atypischen Lymphozyten mit villösen Fortsätzen im peripheren Blut und im Knochenmark. SLVL betrifft vorwiegend Männer ab 70 Jahren. Bei dieser seltenen Erkrankung sind keine chromosomalen Abnormalitäten bekannt; sie ist charakterisiert durch zirkulierende Lymphzyten mit dünnen und kurzen zytoplasmatischen Villi und Vergrößerung der Milz, in zwei Dritteln der Fälle tritt eine monoklonale Gammopathie auf. Der zelluläre Ursprung der Erkrankung unterliegt somatischen Hypermutationen vor der Tumortransformation.
- Makroglobulinämie Waldenström:
Die Makroglobulinämie Waldenström ist eine seltene immunoproliferative Erkrankung und ist gekennzeichnet durch eine Vermehrung von Makroglobulinen im Serum. Bei verwandten B-Zell Neoplasmen, wie bei dem multiplen Myelom und der chronischen lymphatischen Leukämie, werden die histologischen Merkmale des Knochenmarks als prognostisch relevant betrachtet. Alle Patienten mit Makroglobulinämie Waldenström weisen einen zirkulierenden Tumormarker auf, das monoklonale IgM Protein. Gelegentlich können hohe Level an monoklonalem IgM Protein ein Hyperviskositätssyndrom erzeugen, manifestiert durch oronasale Blutungen.
- Epstein-Barr- Virus induziertes lymphoproliferatives Syndrom:
Das EBV ist ein ubiquitäres Herpesvirus (Herpes-Subtyp IV) mit hoher Durchseuchungsrate (ca. 95% der Erwachsenen) in der Bevölkerung. Das EBV-assoziierte Krankheitsbild ist in der Regel die Mononucleose (=Pfeiffersches Drüsenfieber), die vorwiegend in der Adoleszenz (15.-25.Lebensjahr), meist symptomarm verläuft, und eine lebenslange Anwesenheit des Virus hinterlässt. Nach Erstinfektion scheiden Erwachsene lebenslang EBV mit dem Speichel in unterschiedlichen Mengen aus. EBV besitzt eine besondere Bedeutung bei Menschen, die durch andere Erkrankungen in eine immunsuppressive Phase geraten. Hauptsymptome der EBV-Infektion (Inkubationszeit 4-6 Wochen) sind grippale Beschwerden wie Kopfschmerz, Adynamie und hohes Fieber, im weiteren Verlauf Pharyngi- tis, Splenomegalie und Lymphadenitis. In schweren Verläufen werden EBV-induzierte Thrombopenie, Hepatitis und Enzaphalitis beschrieben. Dem EBV wird jedoch auch eine mögliche Ko-kausale Rolle in der Entstehung maligner Lymophome angelastet, zumal T- und vor allem B-Lymphozyten zu den Zielzellen des Virus zählen. In Fällen chronischer EBV-Infektionen scheint das Risiko für T- und B-Zell-Lymphome deutlich erhöht. Auch verschiedene lymphoproliferative Erkrankungen wie das Guillian-Barre-, und das Budd- Chiari-Syndrom werden zu den EBV-assoziierten Krankheistbildern gerechnet. - infantile spinale Muskelatrophie:
Die spinale Muskelatrophie ist eine angeborene Degeneration der motorischen Vorder- hornzellen und Hirnnervenkerne des Hirnstammes, die zu einer schlaffen, rein motorischen Lähmung fuhrt. Das äußere Erscheinungsbild gleicht sehr dem der Muskeldystrophie. Eine Form, die infantile spinale Muskelatrophie, ist nicht geschlechtsgebunden, wahrscheinlich rezessiv vererbbar, tritt im Alter von 0 - 12 Monaten auf und schreitet rasch fort. Daneben gibt es eine chronische Form, die im Alter von 0 - 2 Jahren auftritt und langsamer fort-i schreitet.
- akute lymphatische Leukämie:
Allgemein versteht man unter einer Leukämie die maligne Entartung und Reifungsstörung weißer Blutzellen. Es kommt meist zu einer starken Vermehrung von unreifen weißen Blutzellen, die die normalen weißen Blutzellen nach und nach verdrängen. Die Folge sind Blutarmut, Blutungen, Infektionen und Störungen der Organfiinktionen. Die Ursache der Erkrankung ist, wie bei den meisten Krebserkrankungen, unbekannt. Von einer lymphatischen Leukämie spricht man, wenn vor allem unreife Lymphozyten auftreten. Die akute lymphatische Leukämie (ALL) ist die häufigste Leukämieform und auch die häufigste Krebsart bei Kindern. Bei der schnell voran schreitenden ALL werden die sich entwik- kelnden Lymphozyten zu zahlreich und sie reifen nicht aus. Die Vorläuferzellen der Lymphozyten aus dem Knochenmark verändern sich krebsartig und treten im Blut und im Knochenmark auf. Über die Blutbahn verteilen sich die krebsartigen Lymphozyten im Körper, etwa in Leber, Milz, Rückenmark oder im Gehirn.
- Lungenkrebs (kleinzelliges Bronchialkarzinom):
Lungenkrebs stellt weltweit die häufigste bösartige Erkrankung dar. Kleinzellige Bronchialkarzinome machen 25-30% aller Lungenkrebse aus. Es handelt sich hierbei um eine Erkrankung, bei der maligne Krebszellen im Lungengewebe auftreten. Es ist durch eine besonders hohe und rasche Proliferation gekennzeichnet. Das kleinzellige Bronchialkarzinom verhält sich klinisch äußerst maligne und führt zu einer frühzeitigen Metastasierung. Bei 80% der Patienten kann man schon bei der ersten Diagnose Tochtergeschwülste nachweisen. Einige dieser Tumoren können Hormone ins Blut ausschütten und dadurch den natürlichen Hormonhaushalt beeinflussen. - nasopharyngeales Karzinom:
Das nasopharyngeales Karzinom (oder Lymphoepitheliom) ist eine bösartige Geschwulst lymphoepithelialer Organe und besteht aus malignen epithelialen Zellen. Es ist der am häufigsten vorkommende maligne Tumor des Nasen-Rachen-Raums und zeichnet sich durch sehr rasches Wachstum aus. Weiterhin zeichnet er sich durch frühzeitige Metastasierung und große Strahlenempfindlichkeit aus. Er kommt in einigen Gegenden endemisch vor und tritt auch Jahrzehnte nach der Primärinfektion mit dem Epstein-Barr Virus auf.
5-Methylcytosin ist die häufigste kovalent modifizierte Base in der DNA eukaryotischer Zellen. Sie spielt beispielsweise eine Rolle in der Regulation der Transkription, beim genetischen Imprinting und in der Tumorgenese. Die Identifizierung von 5-Methylcytosin als Bestandteil genetischer Information ist daher von erheblichem Interesse. 5-Methylcytosin- Positionen können jedoch nicht durch Sequenzierung identifiziert werden, da 5- Methylcytosin das gleiche Basenpaarungsverhalten aufweist wie Cytosin. Darüber hinaus geht bei einer PCR-Amplifikation die epigenetische Information, welche die 5- Methylcytosine tragen, vollständig verloren.
Eine relativ neue und die mittlererweile am häufigsten angewandte Methode zur Untersuchung von DNA auf 5-Methylcytosin beruht auf der spezifischen Reaktion von Bisulfit mit Cytosin, das nach anschließender alkalischer Hydrolyse in Uracil umgewandelt wird, welches in seinem Basenpaarungsverhalten dem Thymidin entspricht. 5-Methylcytosin wird dagegen unter diesen Bedingungen nicht modifiziert. Damit wird die ursprüngliche DNA so umgewandelt, dass Methylcytosin, welches ursprünglich durch sein Hybridisierungs- verhalten vom Cytosin nicht unterschieden werden kann, jetzt durch „normale" molekularbiologische Techniken als einzig verbliebenes Cytosin beispielsweise durch Amplifikation und Hybridisierung oder Sequenzierung nachgewiesen werden kann. Alle diese Techniken beruhen auf Basenpaarung, welche jetzt voll ausgenutzt wird. Der Stand der Technik, was die Empfindlichkeit betrifft, wird durch ein Verfahren definiert, welches die zu untersuchende DNA in einer Agarose-Matrix einschließt, dadurch die Diffusion und Renaturierung der DNA (Bisulfit reagiert nur an einzelsträngiger DNA) verhindert und alle Fäl- lungs- und Reinigungsschritte durch schnelle Dialyse ersetzt (Olek, A. et al., Nucl. Acids. Res. 1996, 24, 5064-5066). Mit dieser Methode können einzelne Zellen untersucht werden, was das Potential der Methode veranschaulicht. Allerdings werden bisher nur einzelne Re- gionen bis etwa 3000 Basenpaare Länge untersucht, eine globale Untersuchung von Zellen auf Tausenden von möglichen Methylierungsanalysen ist nicht möglich. Allerdings kann auch dieses Verfahren keine sehr kleinen Fragmente aus geringen Probenmengen zuverlässig analysieren. Diese gehen trotz Diffusionsschutz durch die Matrix verloren. Eine Übersicht über die weiteren bekannten Möglichkeiten, 5-Methylcytosine nachzuweisen, kann aus dem folgenden Übersichtsartikel entnommen werden: Rein, T., DePamphilis, M. L., Zorbas, H., Nucleic Acids Res. 1998, 26, 2255.
Die Bisulfit-Technik wird bisher bis auf wenige Ausnahmen (z. B. Zechnigk, M. et al., Eur. J. Hum. Gen. 1997, 5, 94-98) nur in der Forschung angewendet. Immer aber werden kurze, spezifische Stücke eines bekannten Gens nach einer Bisulfit-Behandlung amplifziert und entweder komplett sequenziert (Olek, A. und Walter, J., Nat. Genet. 1997, 17, 275- 276) oder einzelne Cytosin-Positionen durch eine „Primer-Extension-Reaktion" (Gonzal- go, M. L. und Jones, P. A., Nucl. Acids Res. 1997, 25, 2529-2531, WO-Patent 9500669) oder einen Enzymschnitt (Xiong, Z. und Laird, P. W., Nucl. Acids. Res. 1997, 25, 2532- 2534) nachgewiesen. Zudem ist auch der Nachweis durch Hybridisierung beschrieben worden (Olek et al., WO 9928498).
Weitere Publikationen, die sich mit der Anwendung der Bisulfit-Technik zum Methylie- rungsnachweis bei einzelnen Genen befassen, sind: Xiong, Z. und Laird, P. W. (1997), Nucl. Acids Res. 25, 2532; Gonzalgo, M. L. und Jones, P. A. (1997), Nucl. Acids Res. 25, 2529; Grigg, S. und Clark, S. (1994), Bioassays 16, 431; Zeschnik, M. et al. (1997), Human Molecular Genetics 6, 387; Teil, R. et al. (1994), Nucl. Acids Res. 22, 695; Martin, V. et al. (1995), Gene 157, 261; WO 9746705, WO 95 15373 und WO 45560.
Eine Übersicht über den Stand der Technik in der Oligomer Array Herstellung läßt sich aus einer im Januar 1999 erschienenen Sonderausgabe von Nature Genetics (Nature Genetics Supplement, Volume 21, January 1999) und der dort zitierten Literatur entnehmen. Für die Abtastung eines immobilisierten DNA-Arrays sind vielfach fluoreszenzmarkierte Sonden verwendet worden. Besonders geeignet für Fluoreszenzmarkierungen ist das einfache Anbringen von Cy3 und Cy5 Farbstoffen am 5'-OH der jeweiligen Sonde. Die Detek- tion der Fluoreszenz der hybridisierten Sonden erfolgt beispielsweise über ein Konfokalmikroskop. Die Farbstoffe Cy3 und Cy5 sind, neben vielen anderen, kommerziell erhält- lich.
Matrix-assistierte Laser Desorptions/Ionisations-Massenspektrometrie (MALDI-TOF) ist eine sehr leistungsfähige Entwicklung für die Analyse von Biomolekülen (Karas, M. und Hillenkamp, F. (1988), Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exeeding 10000 daltons. Anal. Chem. 60: 2299-2301). Ein Analyt wird in eine lichtabsorbierende Matrix eingebettet. Durch einen kurzen Laserpuls wird die Matrix verdampft und das Analytmolekül so unfragmentiert in die Gasphase befördert. Durch Stöße mit Matrixmolekülen wird die Ionisation des Analyten erreicht. Eine angelegte Spannung beschleunigt die Ionen in ein feldfreies Flugrohr. Auf Grund ihrer verschiedenen Massen werden Ionen unterschiedlich stark beschleunigt. Kleinere Ionen erreichen den Detektor früher als größere.
MALDI-TOF Spektrometrie eignet sich ausgezeichnet zur Analyse von Peptiden und Proteinen. Die Analyse von Nukleinsäuren ist etwas schwieriger (Gut, I. G. und Beck, S. (1995)), DNA and Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry. Molecular Biology: Current Innovations and Future Trends 1: 147-157.) Für Nukleinsäuren ist die Empfindlichkeit etwa 100 mal schlechter als für Peptide und nimmt mit zunehmender Fragmentgröße überproportional ab. Für Nukleinsäuren, die ein vielfach negativ geladenes Rückgrat haben, ist der Ionisationsprozeß durch die Matrix wesentlich ineffizienter. In der MALDI-TOF Spektrometrie spielt die Wahl der Matrix eine eminent wichtige Rolle. Für die Desorption von Peptiden sind einige sehr leistungsfähige Matrices gefunden worden, die eine sehr feine Kristallisation ergeben. Für DNA gibt es zwar mittlererweile einige ansprechende Matrices, jedoch wurde dadurch der Empfindlichkeitsunterschied nicht verringert. Der Empfindlichkeitsunterschied kann verringert werden, indem die DNA chemisch so modifiziert wird, dass sie einem Peptid ähnlicher wird. Phosphorothioatnukleinsäuren, bei denen die gewöhnlichen Phosphate des Rückgrats durch Thiophosphate substituiert sind, lassen sich durch einfache Alkylierungschemie in eine ladungsneutrale DNA umwandeln (Gut, I. G. und Beck, S. (1995), A procedure for selective DNA alkylation and detection by mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 23: 1367-1373). Die Kopplung eines „charge tags" an diese modifizierte DNA resultiert in der Steigerung der Empfindlichkeit um den gleichen Betrag, wie er für Peptide gefunden wird. Ein weiterer Vorteil von „Charge tagging" ist die erhöhte Stabilität der Analyse gegen Verunreinigungen, die den Nach- weis unmodifizierter Substrate stark erschweren.
Genomische DNA wird durch Standardmethoden aus DNA von Zeil-, Gewebe- oder sonstigen Versuchsproben gewonnen. Diese Standardmethodik findet sich in Referenzen wie Fritsch und Maniatis eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die chemisch modifizierte DNA des Gens CD24, sowie Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere zur Detektion von Cytosin- Methylierungen, sowie ein Verfahren bereit zu stellen, welches sich zur Diagnose von genetischen und epigenetischen Parametern des CD24-Gens besonders eignet. Der Erfindung liegt die überraschende Erkenntnis zugrunde, dass sich genetische und epigenetische Parameter und insbesondere das Cytosin-Methylierungsmuster des CD24 Gens zur Diagnose von mit CD24 assoziierten Erkrankungen besonders eignen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch eine Nukleinsäure, umfassend einen mindestens 18 Basen langen Sequenzabschnitt der chemisch vorbehandelten DNA des Gens von CD24 gemäß einer der Seq. ID No.l bis Seq. ID No.4 gelöst. Überraschenderweise konnte gefunden werden, dass die chemisch modifizierte Nukleinsäure bisher nicht in Zusammenhang mit der Ermittlung von genetischen und epigenetische Parametern gebracht wurde.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird weiterhin durch ein Oligonukleotid oder Oligomer zur Detektion des Cytosin-Methylierungszustandes in chemisch vorbehandelter DNA, umfassend mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von mindestens 9 Nu- kleotiden gelöst, die an eine chemisch vorbehandelte DNA des Gens von CD24 gemäß einer der Seq. ID No.l bis Seq. ID No.4 hybridisiert. Die erfindungsgemäßen Oligomer- sonden stellen wichtige und effektive Werkzeuge dar, welche die Ermittlung der genetischen und epigenetischen Parameter des CD24-Gens erst ermöglichen. Bevorzugterweise umfaßt die Basensequenz der Oligomere mindestens ein CpG Dinukleotid. Die Sonden können auch in Form einer PNA (Peptide Nucleic Acid) vorliegen, die besonders bevorzugte Paarungseigenschaften aufweist. Besonders bevorzugt sind erfindungsgmäße Oligomere, bei denen sich das Cytosin des CpG Dinukleotids in etwa im mittleren Drittel des Oligomers befindet, beispielsweise Oligomere, bei denen das Cytosin des CpG Dinukleotids das 5. - 9. Nukleotid vom 5'-Ende eines z.B. 13 mers ist. Im Falle von PNA- Oligomeren ist es bevorzugt, dass das Cytosin des CpG Dinukleotids das 4. - 6. Nukleotid vom 5'-Ende eines z.B. 9 mers ist.
Die erfindungsgemäßen Oligomere werden normalerweise in sogenannten Sets eingesetzt, die für jedes der CpG Dinukleotide eine der Sequenzen der Seq. ID No.l bis Seq. ID No.4 mindestens ein Oligomer umfassen. Bevorzugt ist ein Set, das für jedes der CpG Dinukleotide aus einer der Seq ID No.l bis Seq ID No.4 mindestens ein Oligomer umfaßt.
Weiterhin stellt die Erfindung ein Set von mindestens zwei Oligonukleotiden zur Verfügung, die als sogenannte Primeroligonukleotide zur Amplifikation von DNA-Sequenzen einer der Seq. ID No.l bis Seq. ID No.4 oder Abschnitten davon eingesetzt werden können.
Im Falle der erfindungsgemäßen Sets von Oligonukleotiden ist es bevorzugt, dass mindestens ein Oligonukleotid an eine Festphase gebunden ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin einen Satz von mindestens 10 Oligomeren (Oligonukleotiden und/oder PNA-Oligomeren), die zur Detektion des Cytosin- Methylierungszustandes in chemisch vorbehandelter genomischer DNA (Seq. ID No.1 bis Seq. ID No.4) dienen. Mit diesen Sonden ist die Diagnose von genetischen und epigenetischen Parametern des CD24-Gens möglich. Das Set von Oligomeren kann auch zur Detektion von Single Nucleotide Polymorphismen (SNPs) in der chemisch vorbehandelten DNA des Gens von CD24 gemäß einer der Seq. ID No.l bis Seq. ID No.4 verwendet werden.
Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, dass eine von der Erfindung zur Verfügung gestellte Anordnung aus unterschiedlichen Oligonukleotiden und/oder PNA-Oligomeren (ein sogenanntes "Array") ebenfalls an eine Festphase gebunden vorliegt. Dies Array von unterschiedlichen Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomersequenzen kann dadurch gekennzeichnet sein, dass es auf der Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters angeordnet ist. Bevorzuterweise besteht die Festphasenoberfläche aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold. Möglich sind jedoch auch Nitrocellulose sowie Kunststoffe wie zum Beispiel Nylon, die in Form von Kugeln oder auch als Harz-Matrizes vorliegen können.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung eines auf einem Trägermaterial fixierten Arrays zur Analyse in Zusammenhang mit CD24 assoziierten Erkrankungen, bei dem mindestens ein Oligomer gemäß der Erfindung an eine feste Phase gekoppelt wird. Verfahren zur Herstellung von solchen Arrays sind zum Beispiel aus der US 5,744,305 mittels Festphasenchemie und photolabilen Schutzgruppen bekannt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft einen DNA-Chip zur Analyse in Zusammenhang mit CD24-assoziierten Erkrankungen, der mindestens eine Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt. DNA-Chips sind zum Beispiel aus der US 5,837,832 bekannt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist zudem ein Kit, das zum Beispiel aus einer Bisulfit enthaltenden Reagenz, einem Satz von Primeroligonukleotiden umfassend mindestens zwei Oligonukleotide, deren Sequenzen jeweils mindestens einen 18 Basenpaaren langen Abschnitt der im Anhang aufgeführten Basensequenzen (Seq. ID No.l bis Seq. ID No.4) entsprechen oder zu ihnen komplementär sind, Oligonukleotiden und/oder PNA- Oligomeren sowie einer Anleitung zur Durchfuhrung und Auswertung des beschriebenen Verfahrens bestehen kann. Ein Kit im Sinne der Erfindung kann jedoch auch nur Teile der vorgenannten Bestandteile enthalten.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Diagnostikums zur Diagnose von mit CD24 assoziierten Krankheiten durch Analyse von Methylierungsmustern des CD24-Gens, wobei das Diagnostikum dadurch gekennzeichnet ist, dass mindestens eine Nukleinsäure, gemäß der vorliegenden Erfindung, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen zu dessen Herstellung verwendet wird.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Diagnostikum zur von mit CD24 assoziierten Krankheiten durch Analyse von Methylierungsmustern des CD24-Gens, das mindestens eine Nukleinsäure gemäß der Erfindung, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Zusatz- und Hilfsstoffen umfaßt.
Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Ermittlung von genetischen und/oder epigenetischen Parametern des CD24-Gens durch Analyse von Cytosin-Methylierungen und Single Nucleotide Polymorphismen zur Verfügung, das folgende Schritte umfaßt:
In* einem ersten- Verfahrensschritt wird eine genomische DNA-Probe derart chemisch be-; handelt, dass an der 5'-Position unmethylierte Cytosinbasen in Uracil, Thymin oder eine andere vom Hybridisierungsverhalten her dem Cytosin unähnliche Base verwandelt werden. Dies wird im folgenden unter chemischer Vorbehandlung verstanden.
Die zu analysierende genomische DNA wird bevorzugt aus den üblichen Quellen für DNA erhalten, wie Zellen oder Zellbestandteilen, zum Beispiel Zelllinien, Biopsine, Blut, Spu- tum, Stuhl, Urin, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit, in Paraffin einbettetes Gewebe, beispielsweise Gewebe von Augen, Darm, Niere, Hirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histologische Objektträger oder Kombinationen davon.
Bevorzugt wird dazu die oben beschriebene Behandlung genomischer DNA mit Bisulfit (Hydrogensulfit, Disulfit) und anschließender alkalischer Hydrolyse verwendet, die zu einer Umwandlung nicht methylierter Cytosin-Nukleobasen in Uracil oder eine andere vom Basenpaarungsverhalten her dem Cytosin unähnliche Base führt.
Aus dieser chemisch vorbehandelten genomischen DNA werden Fragmente unter Verwendung von Sätzen von erfindungsgemäßen Primeroligonukleotiden und einer bevorzugterweise hitzestabilen Polymerase amplifiziert. Aus statistischen und praktikablen Erwägungen werden bevorzugterweise mehr als zehn unterschiedliche Fragmente amplifiziert, die 100 - 2000 Basenpaare lang sind. Die Amplifikation von mehreren DNA- Abschnitten kann simultan in ein und demselben Reaktionsgefäß durchgeführt werden. Üblicherweise wird die Amplifikation mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt.
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform des Verfahrens umfasst der Satz von Primeroligonukleotiden mindestens zwei Oligonukleotide, deren Sequenzen jeweils revers komplementär oder identisch zu einem mindestens 18 Basenpaare langen Abschnitt der im An- hang (Seq. ID No.l bis Seq. ID No.4) aufgelisteten Basensequenzen sind. Die Primeroli- gonukleotide sind vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass sie kein CpG Dinukleotid enthalten.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, dass bei der Amplifikation mindestens ein Primeroligo- nukleotid an eine Festphase gebunden ist. Die unterschiedlichen Oligonukleotid und/oder PNA-Oligomersequenzen können auf einer ebenen Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters angeordnet sein, wobei die Festphasenoberfläche bevorzugt aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold besteht, wobei auch andere Materialien, wie Nitrocellulose oder Kunststoffe verwendet werden können.
Die mittels der Amplifikation erhaltenen Fragmente können eine direkt oder indirekt nachweisbare Markierung tragen. Bevorzugt sind Markierungen in Form von Fluoreszenzmarkierungen, Radionukliden oder ablösbaren Molekülfragmenten mit typischer Masse, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden können, wobei bevorzugt ist, dass die erzeugten Fragmente zur besseren Detektierbarkeit im Massenspektrometer eine einzelne positive oder negative Nettoladung aufweisen. Der Nachweis kann mittels Matrix assistierter Laser Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie (MALDI) oder mittels Elektrospray Massenspektrometrie (ESI) durchgeführt und visualisiert werden.
Die im zweiten Verfahrensschritt erhaltenen Amplifikate werden anschließend an einen Satz von Oligonukleotiden und/oder PNA- Sonden der oder an ein Array hybridisiert. Die Hybridisierung erfolgt dabei auf die unten angegebene Art und Weise. Der bei der Hybridisierung verwendete Satz besteht bevorzugterweise aus mindestens 10 Oligonukleotid oder PNA-Oligomer Sonden. Die Amplifikate dienen dabei als Proben, die an vorher an einer Festphase gebundene Oligonukleotide hybridisieren. Die nicht hybridisierten Fragmente werden anschließend entfernt. Die besagten Oligonukleotide umfassen mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von 13 Nukleotiden, die revers komplementär oder identisch zu einem Abschnitt der im Anhang aufgeführten Basensequenzen ist, der mindestens ein CpG Dinukleotid enthält. Das Cytosin des CpG Dinukleotids ist das 5. bis 9. Nukleotid vom 5'-Ende des 13 mers aus betrachtet. Für jedes CpG Dinukleotid ist ein Oligonukleotid vorhanden. Die besagten PNA-Oligomere umfassen mindestens eine Basense- quenz mit einer Länge von 9 Nukleotiden, die revers komplementär oder identisch zu einem Abschnitt der im Anhang aufgeführten Basensequenzen ist, der mindestens ein CpG Dinukleotid enthält. Das Cytosin des CpG Dinukleotids ist das 4. bis 6. Nukleotid vom 5'- Ende des 9 mers aus gesehen. Für jedes CpG Dinukleotid ist ein Oligonukleotid vorhanden.
Im vierten Verfahrensschritt entfernt man die nicht hybridisierten Amplifikate.
Im letzten Verfahrensschritt detektiert man die hybridisierten Amplifikate. Dabei ist bevorzugt, dass an den Amplifikaten angebrachte Markierungen an jeder Position der Festphase, an der sich eine Oligonukleotidsequenz befindet, identifizierbar sind.
Erfindungsgemäss bevorzugt ist es, dass die Markierungen der Amplifikate Fluoreszenzmarkierungen, Radionuklide oder ablösbare Molekülfragmente mit typischer Masse sind, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden können. Der Nachweis der Amplifikate, Fragmente der Amplifikate oder zu den Amplifikaten komplementäre Sonden im Massenspektrometer ist bevorzugt, wobei man die Detektion mittels Matrix assistierter Laser Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie (MALDI) oder mittels Elektrospray Massenspektrometrie (ESI) durcfrfuhren und visualisieren kann.
Zur besseren Detektierbarkeit im Massenspektrometer können die erzeugten Fragmente eine einzelne positive oder negative Nettoladung aufweisen. Bevorzugt wird das vorgenannte Verfahren zur Ermittlung von genetischen und/oder epigenetischen Parametern des CD24-Gens verwendet.
Die erfindungsgemäßen Oligomere oder Arrays derselben sowie ein erfindungsgemäßes Kit sollen zur Diagnose einer mit CD24 assoziierten Krankheit durch Analyse von Methylierungsmustern des CD24-Gens verwendet werden. Erfindungsgemäss bevorzugt ist die Verwendung des Verfahrens zur Diagnose bedeutender genetischer und/oder epigenetischer Parameter innerhalb des CD24-Gens.
Das erfindungsgemäße Verfahren dient zum Beispiel der Diagnose von Krebserkrankungen, beispielsweise Leukämie, Lungenkrebs, oder dem nasopharyngalen Karzinom, mul- tiplem Myelom, reaktiver Arthritis, des Milz-Lymphoms, Waldenströms Makroglobulinämie, des Epstein-Barr- Virus induzierten Syndroms und/oder der infantilen spinalen Muskelatrophie.
Auch die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren der Seq. ID No.l bis Seq. ID No.4 können für die Diagnose von genetischen und/oder epigenetischen Parametern des CD24-Gens verwendet werden. Weiterhin können die erfindungsgemäßen Oligomere oder eine Anordnung derselben ein Kit zur Diagnose einer mit CD24 assoziierten Krankheit durch Analyse von Methylierungsmustern des CD24-Gens verwendet werden. Die Analyse erfolgt dabei nach dem oben und in den Beispielen erwähnten Verfahren. Diagnostiziert werden können alle mit einer Veränderung des Methylierungsmusters des CD24-Gens einhergehenden Erkrankungen, wie beispielsweise Krebserkrankungen, beispielsweise Leukämie, Lungenkrebs, oder dem nasopharyngalen Karzinom, multiplem Myelom, reaktiver Arthritis, des Milz-Lymphoms, Waldenströms Makroglobulinämie, des Epstein-Barr- Virus induzierten Syndroms und/oder der infantilen spinalen Muskelatrophie.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten oder Individuen, wobei diese nachteiligen Ereignisse mit Methylierungsmustern des CD24-Gens in Zusammenhang stehen. Anhand der mittels der Erfindung erhaltenen Daten über die Veränderungen des Methylierungsmusters des Patienten kann die untersuchende Person die Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für den Patienten treffen. Dazu können die mit einem der erfindungsgemäßen Verfahren ermittelten Daten verwendet werden. Beispielsweise können die mittels der Erfindung erhaltenen bedeutenden genetischen und/oder epigenetischen Parameter innerhalb des CD24- Gens mit einem anderen Satz genetischen und/oder epigenetischen Parameter verglichen werden können und die so erhaltenen Unterschiede als Basis für eine Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten oder Individuen dienen.
Unter dem Begriff "Hybridisierung" im Sinne der vorliegenden Erfindung ist eine Bindung unter Ausbildung einer Duplex-Struktur eines Oligonukleotids an eine vollständig komplementäre Sequenz im Sinne der Watson-Crick Basenpaarungen in der Proben DNA zu verstehen. Unter "stringenten Hybridisierungsbedingungen" sind solche Bedingungen zu verstehen, bei denen eine Hybridisierung bei 60°C in 2,5 x SSC-Puffer, gefolgt von mehreren Waschschritten bei 37°C in einer geringeren Pufferkonzentration erfolgt und stabil bleibt.
Mit dem Begriff "funktionelle Varianten" sind alle DNA-Sequenzen bezeichnet, die komplementär zu einer DNA-Sequenz sind, die unter stringenten Bedingungen mit der Referenzsequenz hybridisieren und eine zu dem entsprechenden erfindungsgemäßen Poly- peptid ähnliche Aktivität aufweisen.
"Genetische Parameter" im Sinne dieser Erfindung sind Mutationen und Polymorphismen des CD24-Gens und zu seiner Regulation weiterhin erforderlicher Sequenzen. Insbesondere sind als Mutationen Insertionen, Deletionen, Punktmutationen, Inversionen und Polymorphismen und besonders bevorzugt SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) zu bezeichnen. Polymorphismen können aber ebenso Insertionen, Deletionen oder Inversionen sein.
"Epigenetische Parameter" im Sinne dieser Erfindung sind insbesondere Cytosin- Methylierungen und weitere chemische Modifikationen von DNA-Basen des CD24-Gens und zu seiner Regulation weiterhin erforderliche Sequenzen. Weitere epigenetische Parameter sind beispielsweise die Acetylierung von Histonen, die jedoch mit dem beschriebenen Verfahren nicht direkt analysiert werden kann, sondern wiederum mit der DNA- Methylierung korreliert.
Die Erfindung soll nun im folgenden anhand der Seqenzen und Beispiele weiter verdeutlicht werden, ohne dass die Erfindung hierauf eingeschränkt wird.
Seq. ID No.l zeigt die Sequenz der chemisch vorbehandelten genomischen DNA des Gens CD24
Seq. ID No.2 zeigt die Sequenz einer zweiten chemisch vorbehandelten genomischen DNA des Gens CD24
Seq. ID No.3 zeigt die revers komplementäre Sequenz der Seq. ID 1 der chemisch vorbehandelten genomischen DNA des Gens CD24 Seq. ID No.4 zeigt die revers komplementäre Sequenz der Seq. ID 2 der chemisch vorbehandelten genomischen DNA des Gens CD24
Seq. ID No.5 zeigt die Sequenz eines Oligonukleotids zur Amplifizierung von CD24 aus Beispiel 1
Seq. ID No.6 zeigt die Sequenz eines zweiten Oligonukleotids zur Amplifizierung von CD24 aus Beispiel 1
Seq. ID No.7 zeigt die Sequenz eines Oligonukleotids zur Hybridisierung des Amplifikats von CD24 aus Beispiel 1
Das folgende Beispiel bezieht sich auf ein Fragment des Gens CD24, in dem eine bestimmte CG-Position auf ihren Methylierungsstatus hin untersucht wird.
Beispiel 1: Durchfuhrung der Methylierungsanalyse im CD24-Gen
Im ersten Schritt wird eine genomische Sequenz unter Verwendung von Bisulfit (Hydrogensulfit, Disulfit) derart behandelt, dass alle nicht an der 5-Position der Base methylierten Cytosine so verändert werden, dass eine hinsichtlich dem Basenpaarungsverhalten unterschiedliche Base entsteht, während die in 5-Position methylierten Cytosine unverändert bleiben. Wird für die Reaktion Bisulfit im Konzentrationsbereich zwischen 0.1 und 6 M verwendet, so findet an den nicht methylierten Cytosinbasen eine Addition statt. Zudem müssen ein denaturierendes Reagenz oder Lösungsmittel sowie ein Radikalfänger zugegen sein. Eine anschließende alkalische Hydrolyse führt dann zur Umwandlung von nicht methylierten Cytosin-Nukleobasen in Uracil. Diese umgewandelte DNA dient dazu, methy- lierte Cytosine nachzuweisen. Im zweiten Verfahrensschritt verdünnt man die behandelte DNA-Probe mit Wasser oder einer wässrigen Lösung. Bevorzugt wird anschliessend eine Desulfonierung der DNA (10-30 min, 90-100 oC) bei alkalischem pH- Wert durchgeführt. Im dritten Schritt des Verfahrens amplifiziert man die DNA-Probe in einer Polyme- rasekettenreaktion, bevorzugt mit einer hitzebeständigen DNA-Polymerase. Im vorliegenden Fall werden Cytosine des Gens CD24, hier aus der Promotorregion, untersucht. Dazu wird mit den spezifischen Primeroligonukleotiden GGGTAAGATGGTAGGTTT (Seq ID No.5) und CATTACTCTACCCATATCC (Seq ID No.6) ein definiertes Fragment der Länge 489 bp amplifiziert. Dieses Amplifikat dient als Probe, die an ein vorher an einer Festphase gebundenes Oligonukleotid unter Ausbildung einer Duplexstruktur hybridisiert, beispielsweise TTTGTTCGTAGTT (Seq ID No.7), wobei sich das nachzuweisende Cytosin an Position 125 des Amplifikats befindet. Der Nachweis des Hybridisierungsprodukts beruht auf Cy3 und Cy5 fluoreszenzmarkierten Primeroligonukleotiden, die für die Amplifikation verwendet wurden. Nur wenn in der Bisulfit behandelten DNA an dieser Stelle ein methyliertes Cytosin vorgelegen hat, kommt es zu einer Hybridisierungsreaktion der am- plifizierten DNA mit dem Oligonukleotid. Somit entscheidet der Methylierungsstatus des jeweiligen zu untersuchenden Cytosins über das Hybridisierungsprodukt.
Beispiel 2: Diagnose von CD24 assoziierten Erkrankungen
Um einen Bezug der Methylierungsmuster zu einer der mit CD24 assoziierten Erkrankungen durcfizuführen, bedarf es zunächst der Untersuchung der DNA-Methylierungsmuster einer Gruppe von erkrankten und einer Gruppe von gesunden Patienten. Diese Untersuchungen werden zum Beispiel analog dem Beispiel 1 durchgeführt. Die so erhaltenen Ergebnisse werden in einer Datenbank abgespeichert und die CpG Dinukleotide identifiziert, die zwischen den beiden Gruppen unterschiedlich methyliert sind. Dies kann durch Bestimmung einzelner CpG Methylierungsraten erfolgen, wie dies z. B. durch Sequenzieren relativ ungenau oder aber durch eine methylierungssensitive „Primer-Extension-Reaktion" sehr genau möglich ist. Auch gleichzeitige Analyse des gesamten Methylierungsstatus ist möglich, und die Muster können z.B. mittels Clustering- Analysen, die z.B. durch einen Rechner durchgeführt werden können, verglichen werden.
Nachfolgend ist es möglich, untersuchte Patienten einer bestimmten Therapiegruppe zuzuordnen und diese Patienten gezielt zu mit einer individualisierten Therapie zu behandeln.
Das Beispiel 2 läßt sich zum Beispiel für die folgenden Erkrankungen ausführen: multiples Myelom, reaktive Arthritis, Milz-Lymphom, Waldenströms Makroglobulinämie, Epstein- Barr- Virus induziertes Syndrom, infantile spinale Muskelatrophie, Leukämie, Lungenkrebs und nasopharyngeales Karzinom.

Claims

Patentansprttche
1. Nukleinsäure, umfassend einen mindestens 18 Basen langen Sequenzabschnitt der chemisch vorbehandelten DNA des Gens von CD24 gemäß einer der Seq. ID No.l bis Seq. ID No.4.
2. Oligomer (Oligonukleotid oder PNA-Oligomer) zur Detektion des Cytosin- Methylierungszustandes in chemisch vorbehandelter DNA, umfassend mindestens eine Basensequenz mit einer Länge von mindestens 9 Nukleotiden, die an eine chemisch vorbehandelte DNA des Gens von CD24 gemäß einer der Seq. ID No.l bis Seq. ID No.4 hybridisiert.
3. Oligomer gemäß Anspruch 2, wobei die Basensequenz mindestens ein CpG Dinukleotid umfaßt.
4. Oligomer gemäß Anspruch 2 oder 3 in Form einer PNA (Peptide Nucleic Acid).
5. Oligomer nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass sich das Cytosin des CpG Dinukleotids in etwa im mittleren Drittel des Oligomers befindet.
6. Set von Oligomeren gemäß Anspruch 3, umfassend mindestens ein Oligomer für mindestens eines der CpG Dinukleotide einer der Sequenzen der Seq. ID No.l bis Seq. ID No.4.
7. Set von Oligomeren gemäß Anspruch 6, umfassend für jedes der CpG Dinukleotide aus einer der' Seq ID No.l bis Seq ID No.4 mindestens ein Oligomer.
8. Set von mindestens zwei Oligonukleotiden gemäß Anspruch 2, die als Primeroligonu- kleotide zur Amplifikation von DNA-Sequenzen einer der Seq. ID No.l bis Seq. ID No.4 oder Abschnitten davon eingesetzt werden können.
9. Set von Oligonukleotiden gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Oligonukleotid an eine Festphase gebunden ist.
10. Set von Oligomersonden zur Detektion des Cytosin-Methylierungszustandes und/oder von Single Nucleotide Polymorphismen (SNPs) in der chemisch vorbehandelten DNA des Gens von CD24 gemäß einer der Seq. ID No.l bis Seq. ID No.4, umfassend mindestens zehn der Oligomere gemäß einem der Ansprüche 2 bis 5.
11. Verfahren zur Herstellung einer auf einem Trägermaterial fixierten Anordnung von, unterschiedlichen Oligonukleotiden und/oder PNA-Oligomeren (Array) zur Analyse von in Zusammenhang mit dem Methylierungszustandes des Gens CD24 stehenden Erkrankungen, bei dem mindestens ein Oligomer nach einem der Ansprüche 2 bis 5 an eine feste Phase gekoppelt wird.
12. An eine Festphase gebundene Anordnung von unterschiedlichen Oligonukleotiden und/oder PNA-Oligomeren (Array) nach einem der Ansprüche 2 bis 5.
13. Array von unterschiedlichen Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomersequenzen nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass diese auf der Festphase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters angeordnet sind.
14. Array nach einem der Ansprüche 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Festphasenoberfläche aus Silizium, Glas, Polystyrol, Nitrocellulose, Nylon, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold besteht.
15. DNA-Chip zur Analyse von in Zusammenhang mit dem Methylierungszustandes des Gens CD24 stehenden Erkrankungen, der mindestens eine Nukleinsäure gemäß einem der voranstehenden Ansprüche umfaßt.
16. Kit und/oder Diagnostikum, umfassend ein Bisulfit (= Bisulfit, Hydrogensulfit) Reagenz, sowie mindestens ein Oligomer nach einem der Ansprüche 2 bis 5, gegebenenfalls zusammen mit geeigneten Hilfs- und Zusatzstoffen.
17. Verfahren zur Ermittlung von genetischen und/oder epigenetischen Parametern des CD24-Gens durch Analyse von Cytosin-Methylierungen, umfassend folgende Schritte: a) in einer genomischen DNA-Probe werden durch chemische Behandlung an der 5"- Position unmethylierte Cytosinbasen in Uracil oder eine andere vom Basenpaarungsverhalten her dem Cytosin unähnliche Base umgewandelt;
b) aus dieser chemisch vorbehandelten genomischen DNA werden Fragmente unter Verwendung von Sätzen von Primeroligonukleotiden gemäss Anspruch 8 oder 9 und einer Polymerase amplifiziert, wobei die Amplifikate eine nachweisbare Markierung tragen;
c) die Amplifikate werden anschließend an einen Satz von Oligonukleotiden und/oder PNA-Sonden der Ansprüche 2 bis 5 oder an ein Array gemäß einem der Ansprüche 12 bis 14 hybridisiert;
d) und anschließend die hybridisierten Amplifikate nachgewiesen.
18. Verfahren gemäß Anspruch 17, wobei die chemische Behandlung mittels einer Lösung eines Bisulfits, Hydrogensulfits oder Disulfits durchfuhrt.
19. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass mehr als zehn unterschiedliche Fragmente amplifiziert werden, die 100 - 2000 Basenpaare lang sind.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Amplifikation von mehreren DNA-Abschnitten in einem Reaktionsgefäß simultan durchgeführt wird.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß die dabei verwendete DNA-Polymerase hitzestabil ist.
22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikation mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt wird.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungen der Amplifikate Fluoreszenzmarkierungen, Radionuklide oder ablösbare Molekülfragmente mit typischer Masse sind, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass die jAmplifikate oder Fragmente der Amplifikate im Massenspektrometer nachgewiesen werden.
25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass zur besseren Detektier- barkeit im Massenspektrometer die erzeugten Fragmente eine einzelne positive oder negative Nettoladung aufweisen.
26. Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, dass man die Detektion mittels Matrix assistierter Laser Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie (MALDI) oder mittels Elektrospray Massenspektrometrie (ESI) durchführt und visua- lisiert.
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass die genomische DNA aus Zellen oder Zellbestandteilen erhalten wird, welche DNA enthalten, wie zum Beispiel Zelllinien, Biopsine, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Gehirn- Rückenmarks-Flüssigkeit, in Paraffin einbettetes Gewebe, beispielsweise Gewebe von Augen, Darm, Niere, Hirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histologische Objektträger oder Kombinationen davon.
28. Verwendung einer Nukleinsäure nach Anspruch 1 zur Diagnose von mit CD24 assoziierten Krankheiten.
29. Verwendung der Oligomere nach einem der Ansprüche 2 bis 5 oder einer Anordnung derselben nach einem der Ansprüche 12 bis 14 oder eines Kits nach Anspruch 16 zur Diagnose einer mit CD24 assoziierten Krankheit durch Analyse von Methylierungsmustern des CD24-Gens.
30. Verwendung nach Anspruch 29 zur Diagnose von Krebserkrankungen, beispielsweise Leukämie, Lungenkrebs, oder dem nasopharyngalen Karzinom, multiplem Myelom, reaktiver Arthritis, des Milz-Lymphoms, Waldenströms Makroglobulinämie, des Epstein-Barr- Virus induzierten Syndroms und/oder der infantilen spinalen Muskelatrophie.
31. Verfahren zur Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten oder Individuen, wobei die mit einem Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche ermittelten Daten einer mit CD24 assoziierten Krankheit zugeordnet werden.
32. Verwendung der mit einem Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche ermittelten Daten zur Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten oder Individuen, wobei diese nachteiligen Ereignisse mit Methylierungsmustern des CD24-Gens in Zusammenhang stehen.
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