WO2002014367A1 - Facteur de croissance chimere de cellules endotheliales vasculaires de type humain - Google Patents

Facteur de croissance chimere de cellules endotheliales vasculaires de type humain Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to chimeric vascular endothelial cell growth factor. More specifically, the present invention provides
  • Binds KDR (VEGF receptor-2) but does not bind to Fit-1 (VEGF receptor-1) Partial sequence of VEGF analog having angiogenesis activity corresponds to human VEGF analog
  • a chimeric protein having vascular endothelial cell growth activity obtained by substituting
  • the present invention also provides a pharmaceutical containing the chimeric protein, a DNA encoding the chimeric protein, an expression vector containing the DNA, a pharmaceutical containing the expression vector, a transformant having the expression vector, and a transformant.
  • the present invention also relates to a method for producing the chimeric protein to be used. Background art
  • Circulation disorders due to vascular abnormalities are observed in a large number of diseases.
  • diseases include angina pectoris, myocardial infarction, lower limb circulatory insufficiency due to diabetes, and arterial cramps.
  • Can be These diseases not only cause tremendous distress to the patient, but also often result in death.
  • VEGF Vascular endothelial growth factor
  • KDR Fit-1, (KDR) has been shown to play a central role (Ferrara N and Davis-Smyth T. Endocrine Review, 18, -25, 1997, Shibuya M. Advances in Cancer Research, 67, 281-316, 1995).
  • VEGF In order to improve various circulatory disorders, VEGF or a protein similar thereto or a vector expressing the same is administered to the subcutaneous tissue or muscle tissue of the myocardium or lower limb, and angiogenesis is caused by these angiogenic factors. There is a way to encourage them.
  • VEGF has t-1 (VEGF receptor-1) and KDR (VEGF It is known that it binds to receptor-2) and activates both (Shibuya M, et al. Current Topics in Microbiology and Immunology, 37, 59-83, 1999) o 90% of angiogenic signals The degree is transmitted from KDR (VEGF receptor-2) (Takahashi T, et al.
  • VEGF- E NZ-7 to closely related VEGF- E D17Q1 and VEGF-E 2 likewise KDR (VEGF receiving member one 2) to bind is reported only (FIG. 1) (Meyer M, et al, EMBO Journal 18, 363-374, 1999).
  • KDR VEGF receptor - 2
  • VEGF-E NZ-7 is considered to be a protein with extremely high clinical utility value, but there are points to be overcome. It is the reduction or elimination of antigenicity. Ie Since the VEGF-E NZ — 7 gene is not derived from the human genome, its product, the VEGF-E NZ-7 protein, is recognized as a foreign substance having some antigenicity to the human immune system, and the antibody May be produced. Therefore, a strong angiogenic effect is expected in early administration, if if the antibody is produced individual patient, even if re-administered VEGF-E NZ _ 7 is absorbed by the antibody, the effect is reduced Is expected.
  • an object of the present invention is to provide a chimeric VEGF-E with reduced antigenicity while maintaining the activity of VEGF-E. Further, the present invention is to solve the problem of providing a medicine containing the above-described chimeric VEGF-E, a DNA encoding the above-mentioned chimeric VEGF-E, and a method for producing the chimeric VEGF-E using the DNA. It was an issue.
  • the present inventors have result of intensive studies to solve the above problems, to separate the part is expected to relatively high portion and antigenicity Azukasuru concerning VEGF-E NZ _ 7 activity by domain analysis, antigenicity
  • the inventors succeeded in reducing and eliminating only antigenicity and foreignness while maintaining the activity, thereby completing the present invention.
  • a chimeric protein having vascular endothelial cell growth activity which is obtained by substituting the corresponding sequence of a human VEGF analogous protein.
  • a chimeric protein having vascular endothelial cell growth activity which is obtained by substituting the carboxyl terminus with the amino and / or carboxyl terminus of a human-derived VEGF analogous protein.
  • 10 to 50 amino acid residues at the amino terminus of a VEGF analogous protein having an angiogenic activity that binds to KDR (VEGF receptor-2) but does not bind to F-1 (VEGF receptor-1) Is substituted with the amino terminus of the VEGF-related protein derived from hide, and / or the carboxyl-terminus of the VEGF-related protein.
  • a chimeric protein having vascular endothelial cell growth activity which is obtained by substituting the above sequence with the corresponding sequence of human-derived VEGF analogous protein.
  • a partial sequence of a VEGF analog having angiogenesis activity that binds to KDR (VEGF receptor-2) but does not bind to F-1 (VEGF receptor-1) is at least the VEGF analog. Obtained by substituting a human VEGF-related protein so that the sequences of the loop 1 region (amino acid residues 47-80) and loop 3 (amino acid residues 89-1132) are maintained.
  • a chimeric protein is provided.
  • the VEGF analogous protein having angiogenic activity that binds to KDR (VEGF receptor-2) but does not bind to Fit-1 (VEGF receptor-1) is a protein belonging to VEGF-E family. , more preferably, Ran - E 7 Ru ⁇ VEGF-E C1701 or VEGF-E NZ-2 der.
  • the human VEGF-related protein is PIGF.
  • the quinula protein of the present invention has a carboxyl-terminus of a VEGF analogous protein having an angiogenic activity that binds to KDR (VEGF receptor-2) but does not bind to Frt-1 (VEGF receptor-1). It is a protein obtained by substituting 10 to 50 amino acid residues with the carboxyl terminus of human-derived VEGF analogous protein.
  • the chimeric protein of the present invention is a VEGF analog having angiogenic activity that binds to KDR (VEGF receptor-2) but does not bind to Fit-1 (VEGF receptor-1), It is a protein belonging to the family, and substantially retains the loop 1 region of amino acid residues 47-80 and the loop 3 region of amino acid residues 89-132 in the protein belonging to the VEGF-E family. Is a chimeric protein.
  • a chimeric protein having any of the following amino acid sequences.
  • an amino acid having a vascular endothelial cell growth activity comprising an amino acid sequence in which one to several amino acids have been deleted, substituted and / or added in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 8, 9 or 10; Array;
  • (C) an amino acid sequence comprising an amino acid sequence having 60% or more homology with the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 8, 9 or 10, and having vascular endothelial cell growth activity.
  • one to several amino acids are deleted in any one of the following amino acid sequences (A) to (F) and any one of the following amino acid sequences (A) to (F): Having an amino acid sequence having a proliferative activity on vascular endothelial cells, or having an amino acid sequence of any of the following (A) to (F), which has a homology of 60% or more.
  • a chimeric protein comprising an amino acid sequence having an amino acid sequence having a proliferative activity for proliferating vascular endothelial cells.
  • a medicine comprising any one of the above-described chimeric proteins of the present invention.
  • a KDR receptor-2) receptor activator comprising any one of the above-described chimeric proteins of the present invention.
  • vascular endothelial cell proliferating agent comprising the chimeric protein of any of the above-mentioned present invention.
  • an expression vector containing the above-described DNA of the present invention is provided.
  • KDR VEGF receptor-22 receptor activator comprising the above-described expression vector of the present invention.
  • vascular endothelial cell proliferating agent comprising the above-described expression vector of the present invention.
  • Figure 1 shows the correlation between VEGF-E N27 evening protein and VEGF receptor.
  • FIG. 2 shows the structure of the VEGF-E N27 chimeric protein (VEGF-E-NP, VEGF-E-CP, VEGF-E-NP / CP).
  • FIG. 3 shows the preparation of the VEGF-E N27 chimeric protein.
  • FIG. 4 shows the results of an experiment of VEGF-E N27 chimeric protein competitive inhibition of KDR receptor.
  • FIG. 5 shows the results of a KDR receptor autophosphorylation measurement experiment.
  • FIG. 6 shows the results of a vascular endothelial cell proliferation experiment.
  • FIG. 7 shows the base sequence and the amino acid sequence of VEGF-E-His.
  • FIG. 8 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of VEGF-E-NP-His.
  • FIG. 9 shows the base sequence and the amino acid sequence of VEGF-E-CP-His.
  • FIG. 10 shows the nucleotide sequence and the amino acid sequence of VEGF-E-NP / CP-His.
  • FIG. 11 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of hPIGF-1-His.
  • FIG. 12 shows the structures of the VEGF-E chimeric proteins # 19 to # 27, and the outline of the results of the KDR receptor autophosphorylation measurement experiment and the vascular endothelial cell proliferation experiment.
  • FIG. 13 shows the results of a competitive inhibition experiment on the KDR receptor using VEGF-E chimeric proteins # 19 to # 27.
  • FIG. 14 shows the results of a vascular endothelial cell proliferation experiment using VEGF-E chimeric proteins # 19 to # 27.
  • FIG. 15 shows the structures of VEGF-E chimeric proteins # 31 to # 33, and outlines of the results of the KDR receptor autophosphorylation measurement experiment and vascular endothelial cell proliferation experiment.
  • FIG. 16 shows the results of an experiment of competitive inhibition of the KDR receptor using VEGF-E chimeric proteins # 31 to # 33.
  • Figure 17 shows the results of a vascular endothelial cell proliferation experiment using VEGF-E chimera protein # 31- # 33. The results are shown.
  • the chimeric protein having a vascular endothelial cell growth activity of the present invention is a VEGF analogous protein having an angiogenic activity that binds to KDR (VEGF receptor-2) but does not bind to Flt-1 (VEGF receptor-1). It can be obtained by substituting a part of the sequence with the corresponding sequence of human-derived VEGF analogous protein.
  • VEGF- include E family foremost belongs protein, more specifically, VEGF- E NZ -.. 7 , VEGF-E D1701 or VEGF-E NZ 2, and the like (Oga a S, et al Journal of Biological chemistry, 273, 31273-31282, 1998; and Meyer M, et al, EMBO Journal 18, 363-374, 1999).
  • the amino-terminal and / or carboxyl-terminal of the VEGF analog having angiogenesis activity is substituted with the amino-terminal and Z- or carboxyl-terminal of the human VEGF analog.
  • the region to be replaced by the human-derived VEGF analog protein may be only the amino terminus or only the carboxy terminus of the VEGF analog protein, or may be both the amino terminus and the carboxyl terminus.
  • the length of the substituted amino terminal is not particularly limited as long as the obtained chimeric protein retains the vascular endothelial cell growth activity, but is preferably 10 to 50 amino acid residues at the amino terminal, more preferably 20 to 4 amino acids.
  • 0 amino acid residues are substituted with the amino terminal of human VEGF analogous protein.
  • the length of the substituted carboxyl terminal is not particularly limited as long as the obtained chimeric protein retains the vascular endothelial cell growth activity, but is preferably 10 to 50 amino acid residues at the carboxyl terminal, more preferably Is 10 to 40 amino acid residues, more preferably 10 to 3 amino acid residues.
  • 0 amino acid residues, particularly preferably 10 to 20 amino acid residues are substituted with the carboxyl terminus of human VEGF analog protein.
  • a VEGF analogous protein having an angiogenic activity that binds to KDR (VEGF receptor-2) but does not bind to Fit-1 (VEGF receptor-1) Some of the internal sequences have been replaced by corresponding sequences from human VEGF analogs. Preferably, at least a part of the sequence of a VEGF analogous protein having angiogenic activity that binds to K-dish (VEGF receptor-2) but does not bind to Fit-1 (VEGF receptor-1) is at least the VEGF analog. It has been replaced by a human VEGF-related protein such that the sequences of loop 1 region (amino acid residues 47-80) and loop 3 (amino acid residues 89-132) of the protein are maintained.
  • the amino terminal and Z or carboxyl terminal of the VEGF analog protein S having angiogenic activity are substituted with the amino terminal and / or carboxyl terminal of human VEGF analog protein.
  • a part of the sequence inside the VEGF analog is replaced by the corresponding sequence of the human VEGF analog.
  • the VEGF analogous protein having an angiogenic activity in the present invention is preferably a protein belonging to VEGF-E family.
  • VEGF-E is a protein consisting of 149 amino acids;
  • the chimeric protein of the present invention comprises VEGF-E amino acid residues 89 —Substantially retains loop 3 region of 1 3 2 Is preferred.
  • the chimeric protein of the present invention can be obtained by substituting the amino terminal and / or carboxyl terminal of VEGF analog protein with the amino terminal and / or carboxyl terminal of human VEGF analog protein. Thereby, the antigenicity of VEGF analogous protein can be reduced.
  • the type of VEGF analogous protein derived from human is not particularly limited, and examples include PIGF, particularly hPIGf.
  • the chimeric protein as described above may have carotenoid, deletion, substitution and / or modification in a part of its amino acid sequence as long as it retains the vascular endothelial cell growth activity.
  • chimeric protein of the present invention include a chimeric protein having any one of the following amino acid sequences.
  • (C) An amino acid sequence comprising an amino acid sequence having 60% or more homology with the amino acid sequence defined in (A) above, and having a vascular endothelial cell growth activity.
  • an amino acid sequence in which one to several amino acids have been deleted, substituted and / or added means, for example, 1 to 20 amino acids, preferably 1 to 15 amino acids, more preferably 1 to 1 amino acids. It means an amino acid sequence in which 0, more preferably 1 to 5 amino acids have been deleted, substituted and / or added.
  • amino acid sequence having 60% or more homology with the amino acid sequence means having at least 60% or more homology, and the homology is preferably 70% or more. It is more preferably at least 80%, further preferably at least 90%, particularly preferably at least 95%.
  • amino acids are deleted or replaced in a certain amino acid sequence.
  • An amino acid sequence consisting of a substituted and / or added amino acid sequence and having an activity of proliferating vascular endothelial cells; or an amino acid sequence having 60% or more homology with a certain amino acid sequence and having an activity of proliferating a vascular endothelial cell Proteins having an amino acid sequence are described in, for example, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), or Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997). It can be produced or obtained using a DNA encoding a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 to 11, using a conventional recombinant gene method (including site-directed mutagenesis, etc.). .
  • Binds KDR (VEGF receptor-2) but does not bind to Fit-1 (VEGF receptor-1)
  • Gene encoding VEGF analogous protein having angiogenic activity e.g. VEGF-E gene
  • a DNA fragment encoding a desired VEGF analogous protein is prepared by using a modified product of the gene as a starting material and cutting out a DNA fragment using an appropriate restriction enzyme, or by a method such as PCR.
  • DNA encoding the amino-terminal and Z- or carboxy-terminal of the human-derived VEGF analog protein to be substituted or the partial sequence therein is separately prepared.
  • DNA encoding the amino-terminal and / or carboxyl-terminal of human VEGF-related protein or a sequence therein is obtained by cutting out a desired DNA fragment from a gene encoding human VEGF-related protein using an appropriate restriction enzyme. Or a desired DNA fragment may be amplified using PCR, or may be obtained by chemical synthesis using a DNA synthesizer.
  • the DNA fragments obtained above may be ligated using an appropriate DNA ligase.
  • an oligonucleotide may be inserted to adjust the reading frame, or a part of the base sequence may be modified to create the same restriction enzyme site.
  • Any plasmid that incorporates DNA can be used as long as it can be replicated and maintained in the host.For example, pBR322 and pUC18 derived from Escherichia coli, and pET-3c constructed based on these, And the like.
  • Methods for incorporating DNA into plasmid include, for example, the method described in T. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, p: 239 (1982).
  • the gene encoding the cloned chimeric protein can be ligated downstream of a promoter in a vector suitable for expression to construct an expression vector.
  • a promoter in a vector suitable for expression to construct an expression vector.
  • Expression base Kuta one that can be used in the present invention, bra Sumi de from above E. coli (pBR322, pBR325, pUC12, pUC13 , pET- 3), plasmids derived from Bacillus subtilis (pUB110, ⁇ 5 ⁇ pC194) from yeast Plasmids derived from plasmids (pSH19, pSH15), or bacteriophage such as ⁇ phage and its derivatives and retroviruses, animal viruses such as xinnia virus, and insect viruses (such as baculovirus). .
  • the gene may have ATG as a translation initiation codon at its 5 'end and TAA, TGA or TAG as a translation termination codon at its 3' end.
  • a promoter is connected upstream thereof.
  • the promoter used in the present invention may be any promoter suitable for the host used for gene expression.
  • the host to be transformed is Escherichia coli, trp promoter overnight, lac promoter overnight, rec A promoter evening, XPL promoter evening, lpp promoter evening, T7 promoter evening, etc.
  • the host is Bacillus subtilis, the SP01 promoter and SP02 promoter
  • yeast such as Yuichi, penP Promo Yoichi, PH05 Promo Yoichi
  • the promoter includes SV40-derived promoter and the retrovirus promoter.
  • Hosts include Escherichia coli (e.g., BL21, BL2KDE3), BL21 (DE3) pLysS, BL21 (DE3) pLysE, etc., Bacillus subtilis (e.g., Bacillus subtilis DB105), yeast (e.g., Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae) And the like, animal cells (eg, COS cells, CH0 cells, BHK cells, NIH3T3 cells, BALB / c3T3 cells, HUVE cells, LEII cells, etc.), and insect cells. '
  • the above transformation can be performed by a method generally performed for each host.
  • a vector containing recombinant DNA is introduced into a competent cell prepared by a calcium method or other methods by a temperature shock method or an electroporation method.
  • the host is yeast, a vector containing recombinant DNA is introduced into a competent cell prepared by a lithium method or other methods by a temperature shock method or an electroporation method.
  • the host is an animal cell, a vector containing the recombinant DNA is introduced into the cell by a calcium phosphate method, a lipofection method, or an electroporation method.
  • a transformant having an expression vector containing DNA encoding the chimeric protein of the present invention can be obtained.
  • the chimeric protein of the present invention can be produced by culturing the transformant in an appropriate medium.
  • a medium generally used for each host can be used as a culture medium.
  • LB medium or the like can be used for E. coli
  • YPD medium or the like can be used for yeast
  • Dulbecco 5 s MEM supplemented with animal serum can be used for animal cells.
  • the cultivation of the transformant can be performed under conditions generally used for each host. For example, if the host is Escherichia coli, cultivation is carried out at about 30 to 37 ° C for about 3 to 24 hours, and aeration and stirring can be applied as necessary. If the host is yeast If this is the case, the culture can be performed at about 25 to 37 ° C for about 12 hours to 2 weeks, and aeration and stirring can be added as necessary. Host of about 3 2 to 3 7 ° C so long as it is an animal cell, performed about 2 4 hours to 2 weeks of culture under the condition of 5% C0 2, 100% humidity, and stirring changing the conditions of the vapor phase if necessary Can be added.
  • the chimeric protein of the present invention to express the insect cell as the host cell, eg if baculovirus Ickx pre Uz Chillon vector Ichizu, ⁇ Laboratory Ma two Yuare (Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual ) s
  • the protein can be expressed by the method described in the current-protocols 'in''Molecular' Biol, Bio / Technology, 6, 47 (1988).
  • the recombinant gene transfer vector and baculovirus are co-transfected into insect cells to obtain recombinant virus in the culture supernatant of insect cells, and then the recombinant virus is infected into insect cells to express the protein.
  • the recombinant gene transfer vector and baculovirus are co-transfected into insect cells to obtain recombinant virus in the culture supernatant of insect cells, and then the recombinant virus is infected into insect cells to express the protein.
  • Examples of the gene transfer vector used in the method include pVL1392, PVL1393, pBlueBacII I (all manufactured by Invitrogen) and the like.
  • the baculovirus for example, Autographa calif ornica nuclear polyhedrosis virus, which is a virus that infects night moth insects, Autographa calif ornica nuclear polyhedrosis virus, etc., can be used.
  • baculovirus for example, Autographa calif ornica nuclear polyhedrosis virus, which is a virus that infects night moth insects, Autographa calif ornica nuclear polyhedrosis virus, etc.
  • Sf9 an ovarian cell of Spodoptera frugiperda Sf9, Sf21 [Baki Yurowirusu 'expression ⁇ Vectors, ⁇ Laboratory' or two Your Lumpur, AW one 'Eichi' pretend one man 'and' Company H. Freeman and Company) ⁇ New York (New York) ⁇ (1992
  • Examples of a method for co-transferring the above-described recombinant gene transfer vector and insect baculovirus into insect cells to prepare a recombinant virus include a calcium phosphate method (Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075), a ribofusion method [Proc. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)].
  • a medium for culturing transformants obtained using insect cells as host cells As a medium for culturing transformants obtained using insect cells as host cells, general TNM-FH medium (Pharmingen), Sf-900 II SFM medium (Gibco BHL), ExCell400, ExCell405 (all from JRH Biosciences), Grace's Insect Medium (Grace, TCC, Nature, 195, 788 (1962)], etc. Culture is usually performed for 1 to 5 days under conditions of pH 6 to 7, 25 to 30 ° C, etc. Also, as needed during the culture Then, an antibiotic such as genyumycin may be added to the medium.
  • an antibiotic such as genyumycin may be added to the medium.
  • cells can be extracted from cells by directly purifying from the culture supernatant, or after culturing the transformant, using a homogenizer, a French press, By disrupting the cells or cells by means such as ultrasonication, lysozyme and / or freeze-thawing, the target chimeric protein can be eluted out of the cells, and the chimeric protein can be obtained from the soluble fraction. If the target quinula protein is contained in the insoluble fraction, the cells or cells are disrupted, and the insoluble fraction is collected by centrifugation.Then, it is made soluble with a buffer containing guanidine hydrochloride, etc., and collected. Can be used. In addition, there is a method in which cells or cells are directly destroyed by a buffer containing a protein denaturant such as guanidine hydrochloride, and the desired chimeric protein is eluted outside the cells.
  • the histidine fragment fusion chimeric protein is specifically adsorbed and recovered using a nickel carrier such as Ni-NTA agarose. Can also.
  • a medicament comprising a chimeric protein having vascular endothelial cell proliferation activity or a development vector containing DNA encoding a chimeric protein having vascular endothelial cell enhancing activity
  • the chimeric protein of the present invention has vascular endothelial cell proliferation activity. Due to vascular abnormalities Circulatory disorders are observed in a large number of diseases, and specific examples of such diseases include angina pectoris, myocardial infarction, lower limb circulatory insufficiency due to diabetes, and arterial cramps.
  • vascular endothelial cells Due to vascular abnormalities Circulatory disorders are observed in a large number of diseases, and specific examples of such diseases include angina pectoris, myocardial infarction, lower limb circulatory insufficiency due to diabetes, and arterial cramps.
  • the chimeric protein of the present invention has an activity of activating the KDR (VEGF receptor-2) receptor, it can be used as a therapeutic or preventive agent for diseases associated with abnormal KDR (VEGF receptor-2) receptor activity. It is also useful as an agent. As described above, the chimeric protein of the present invention is useful as a medicine.
  • the chimeric protein of the present invention uses pharmaceutically acceptable solvents, excipients, carriers, auxiliaries, and the like, and according to ordinary methods, solutions, injections, powders, granules, tablets, suppositories, enteric solvents, and the like. It can be prepared into a pharmaceutical composition such as a capsule.
  • the content of the chimeric protein of the present invention, which is an active ingredient, in the pharmaceutical composition may be about 0.0001 to 1.0% by weight.
  • a pharmaceutical composition is preferably used as a KDR (VEGF receptor-2) receptor activator or a vascular endothelial cell proliferating agent in mammals such as humans, mice, rats, puppies, dogs, and cats, particularly preferably It can be safely administered to humans.
  • the administration route can be any of topical, oral, parenteral, intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, and transdermal routes.
  • the dose of the chimeric protein of the present invention should be appropriately adjusted depending on the conditions such as the age, sex, weight, symptoms, and administration route of the patient.For example, when administered to mammals including humans, The chimeric protein can be administered in an amount of about 0.01 g to 10 mg / kg body weight per day.
  • the expression vector containing DNA encoding the chimeric protein of the present invention can be administered by any administration route such as topical, oral, parenteral, intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, or transdermal. It can be formulated for administration.
  • the expression vector is used in an injectable form.
  • the expression vector of the present invention can be mixed with a pharmaceutically acceptable excipient to prepare an injection. Examples of the injection include a sterile solution and an isotonic solution. Or with a dry composition, especially a lyophilized composition These may be formulated into a preparation, and when used, sterile water or physiological saline may be added to prepare an injection.
  • the dose of the expression vector of the present invention should be appropriately adjusted according to conditions such as the age, sex, body weight, symptoms, and administration route of the patient.
  • the DNA amount of the active ingredient is in the range of about l ⁇ g / kg to about 100 mg / kg, preferably in the range of about 1 to about 100 mg / kg.
  • Example 1 Cells and culture conditions
  • EX-Cell 400 JRH Biosciences, Lenexa, KS was used as a culture medium for Sf9 insect cells (Invitrogen, CA, USA).
  • NIH3T3-KDR a cell line in which KDR (VEGFR-2) was strongly expressed, was used in experiments to measure KDR autophosphorylation due to ligand binding.
  • NIH3T3-KDR cells were generated by Sawano et al. (Sawano, A, et al. Cell growth and Differentiation, 7, 213-221, 1996).
  • NIH3T3 cells and NIH3T3-KDR cells were obtained from Dulbecco's modifield Eagle's medium (Dulbeco conversion DMEM medium; Nissui, Tokyo) in 10% serum, mML-glumin, 200 mg / ml G418 (Geneticin; Life Technologies, Inc., Grand island, NY).
  • Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) (Morinagajoyo) were maintained in HUVE culture medium (Morinaga, Tokyo) and used for endothelial cell proliferation.
  • Recombinant human VEGF 165 was forcibly expressed in Sf9 cells in a baculovirus system, and then purified from the culture supernatant using a heparin column before use.
  • Fc-fused 7N-s KDR free KDR
  • Example 2 Mutant chimeric VEGF-protein (VEGF-E-NP, VEGF-E-CP, VEGF-E-NP / CP)
  • hPlGF-1 VEGF-E N27 / human PlGF-1
  • VEGF-E-NP a chimeric protein VEGF-E-NP in which the amino terminal 34 amino acid residue of VEGF-E N27 is substituted with the amino terminal 40 amino acid residue of hPlGF-1;
  • VEGF-E-CP in which 18 amino acid residues at the carboxyl terminus of VEGF-E N27 are substituted with 21 amino acid residues at the carboxyl terminus of hPlGF-1;
  • VEGF-to replace the two ends of the Amino-terminus and the carboxyl terminus of E N27 to hPlGF-1 VEGF-ENP / CP :
  • a histidine tag was fused to the above three types of chimeric proteins for easy purification.
  • the method of preparing DNAs encoding the respective chimeric proteins and subcloning them into the vector PUC18 is described below.
  • FIG. 7 and SEQ ID NO: 7 show the nucleotide sequence and amino acid sequence of VEGF-E-His
  • FIG. 8 and SEQ ID NO: 8 show the nucleotide sequence and amino acid sequence of VEGF-E-NP-His
  • FIG. SEQ ID NO: 9 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of VEGF-E-CP-His
  • FIG. 10 and SEQ ID NO: 10 show the nucleotide sequence and amino acid sequence of VEGF-E-NP / CP-His
  • FIG. And SEQ ID NO: 11 show the nucleotide sequence and amino acid sequence of hPIGF-1-His.
  • VEGF-E-CP and VEGF-E-NP VEGF-E-CP
  • pUC18-VEGF-E-His a plasmid DNA obtained by subcloning full-length DNA of the VEGF-E gene with a histidine tag fused to the carboxyl terminus into pUC18, was digested with restriction enzymes.
  • a 3 kb fragment obtained by cutting with Drall and EcoRI, and about 3 kb obtained by cutting with PflMI and BamHI were purified by the Gene clean method.
  • six oligo nucleotides were prepared and purified by HPLC. (Amersha Pharmacia Biotech (Tokyo);
  • VEGF-E-CP binds a DNA fragment of Drall l / EcoM
  • VEGF-E-NP binds a DNA fragment of PflMI / BajnHI and S166 Oligonucleotide of / S167 was ligated with DNA ligase.
  • histidine was fused to the carboxyl terminal.
  • VEGF-E-CP and VEGF-E-NP Full-length DNA encoding VEGF-E-CP and VEGF-E-NP was subcloned into a pUC18 plasmid vector.
  • the respective plasmids are named pUCE-CP and pUCE-NP.
  • pUCE-CP and pUCE-NP were cut with BsrGI and EcoRI, and the resulting 200 bp
  • the 3 kb and 3 kb DNA fragments were purified by the Gene clean method and ligated with MA ligase. This fused the histidine tag to the carboxyl terminus.
  • the full-length DNA encoding CEGF-E-NP / CP was subcloned into pUC18, and this plasmid DNA was named pUCE-NP / CP.
  • each subcloned DNA was cut out and subcloned into a baculovirus vector.
  • the DNAs of pUCE-CP, pUCE-NP and pUCE-NP / CP were cut with BamHI and EcoRI, and the 450 bp fragment was purified by Gene clean.
  • BamHI and EcoRI sites in the multi-cloning region of the baculovirus vector pVL1393 (Invitrogen) were cloned, and these plasmid DNAs were named pVL3E-CP, pVL3E-NP, and pVL3E-NP / CP.
  • Example 3 Preparation of VEGF-E chimeric protein
  • a filter was used (MILLIP0RE, USA), and the concentrated solution was charged with 20 mM sodium phosphate buffer (Sodium Phosphate Buffer) to negatively charge the histidine tag fused to the recombinant protein. 3 pH8.0) 5 lOmM imidazo Ichiru. After dialysis was dialyzed against 300 mM NaCl, 20% glycerol, was specifically adsorbed histidine Taku fusion evening protein using Ni-NTA Agarosu (QIAGEN, Germany).
  • Ni-NTA agarose to which the recombinant protein has been adsorbed is introduced into the column, and washed with 20 mM sodium phosphate buffer (pH 8.0), 50 mM imidazole, 300 mM NaCl, and 20% glycerol. Rin Elution was performed with sodium acid buffer (pH 8.0), 250 mM imidazole, 300 mM NaCl, and 20% glycerol. Finally, the eluate was dialyzed against 20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4), 50 mM NaCl, 20% glycerol.
  • the purified chimeric protein was electrophoresed on 15% SDS-PAGE, Coomassie stained and western-produced using anti-histidine-tag monoclonal antibody (anti-His-tagmAb), anti-VEGF-E serum and anti-PIGF antibody Analyzed by the method. The purity of the chimeric protein was over 80% ( Figure 3).
  • Example 4 Inhibition experiment of VEGF-E chimeric protein against KDR receptor
  • the Fc-fused 7N-sKDR was diluted to 3 zg / ml in physiological saline (abbreviated as PBS), and each 50 z was added to a 96-Pell cell culture plate (Ibil unon (registered trademark) 2HB, DYNEX TECHNOLOGIES , INC, VA) was added, placed for 12 hours at 4 ° C, to adsorb the S KDR to the plate. The plate was washed twice with a blocking buffer (PBS containing 1% psi serum albumin), and blocked at 25 ° C for 30 minutes using a blocking buffer.
  • PBS physiological saline
  • Triton X-100 lysis buffer 50mM HEPES ⁇ 7 ⁇ 4, 150 ⁇ CI, 10% glycerol, l% tritonX- 100, 1.5 ⁇ MgCl, 2% Trasylol, ImM PMSF, dissolved in 50mM NaF, lOmM Na 4 P 2 0 7, 2mM Na 3 V0 4). The dissolved sample was centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was collected. The concentration of the protein in the supernatant was measured using the Bio-Rad Protein Measurement Kit (Richmond, CA), and an equal amount of protein was used for the analysis.
  • the lysed sample was electrophoresed on 7.5% SDS-PAGE and then transferred to a nitrocellulose membrane.
  • the transferred nitrocellulose membrane is blocked with a blocking buffer (washing buffer containing 5% BSA C20 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl 5 0.1% Tween 20), and then bound with a blocking buffer containing the primary antibody. Go / this
  • VEGF-E N27 proteins activate the KDR receptor tyrosine kinase in a dose-dependent manner.
  • Fig. 5 vascular endothelial cell proliferation experiment
  • VEGF-E-NP VEGF-E-CP
  • VEGF-E-NP / CP VEGF-E-NP / CP
  • FIG. 12 shows the structure of chimeric VEGF-E proteins # 19- # 27.
  • Amino acid sequence # 62-64 (STN) of VEGF-E was replaced with the amino acid sequence (EVE) of the corresponding region of human P1GF.
  • VEGF-E # 37-43 Amino acid sequence of VEGF-E # 37-43 (WMRTLDK) was added to the corresponding region of human P1GF. Replaced with amino acid sequence (FQEVWGR).
  • VEGF-E # 98-101 (VTVS) ( ⁇ y ⁇ chain # 6, between cysteine 6 and cysteine 7) to amino acid sequence (MQLL) of the corresponding region of human P1GF
  • VGT Amino acid sequence of VEGF-E # 102-104 (VTG) (part of loop 3) was replaced with the amino acid sequence (KTR) of the corresponding region of human P1GF.
  • VEGF-E amino acid sequence # 111-118 (TNSGVSTN) (VEGF-E-specific amino acid sequence) was removed (deletion mutation).
  • the structure of the chimeric protein is shown below as a base sequence.
  • the structure of chimeric VEGF-E protein # 31— # 33 is shown in FIG.
  • Example 7 Using the VEGF-E chimeric protein (# 19 to # 27 and # 31 to 3) prepared in Example 7, an experiment to inhibit competition with the KDR receptor (the method is the same as in Example 4) An autophosphorylation measurement experiment (the method was the same as in Example 5) and a vascular endothelial cell proliferation experiment (the method was the same as in Example 6) were performed.
  • Figure 12 shows the structures of VEGF-E chimeric proteins # 19 to # 27 and the outline of the results of the KDR receptor autophosphorylation measurement experiment and vascular endothelial cell proliferation experiment. Are shown in FIG. 13 and the measurement results of the vascular endothelial cell proliferation experiment are shown in FIG.
  • Figure 15 shows the structures of VEGF-E chimeric proteins # 31 to # 33, and the results of the KDR receptor autophosphorylation measurement experiment and the results of the vascular endothelial cell proliferation experiment. The results of the measurement are shown in FIG. 16, and the results of the vascular endothelial cell proliferation experiment are shown in FIG.
  • the chimeric VEGF-E of the present invention has reduced antigenicity while maintaining vascular endothelial cell proliferation activity, it can be used as a safe angiogenic factor.

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Description

キメラヒト型化血管内皮細胞増殖因子 技術分野
本発明は、 キメラ血管内皮細胞増殖因子に関する。 より詳細には、 本発明は、
KDR (VEGF受容体- 2) と結合するが Fit - 1 (VEGF 受容体- 1) とは結合しない 血管新生活性を有する VEGF類縁蛋白質の一部の配列をヒト由来 VEGF類縁蛋白質 の対応する配列と置換することにより得られる、 血管内皮細胞増殖活性を有する キメラ蛋白質に関する。 本発明はまた、 該キメラ蛋白質を含む医薬、 該キメラ蛋 白質をコードする D NA、 該 D N Aを含む発現ベクター、 該発現ベクターを含む 医薬、 該発現ベクターを有する形質転換体、 該形質転換体を用いる該キメラ蛋白 質の製造方法にも関する。 背景技術
血管系の異常による循環障害は非常に多くの疾患で認められ、 このような疾患 の具体例としては、 例えば、 狭心症、 心筋梗塞、 糖尿病による下肢循環不全、 動 脈閉寒症などが挙られる。 これらの疾患は患者に多大の苦痛を与えるばかりでな く、 しばしば患者を死に至らしめる。 これらを克服するために血管新生に関する 多くの研究が進められた結果、 血管内皮細胞増殖因子 （Vascular endothelial growth factor, 本明細書中以下において、 VEGFと略する） とその受容体 (Fit - 1， KDR) が中心的役割を果たすことが明らかとなってきた （Ferrara N and Davis - Smyth T. Endocrine Review, 18, -25, 1997, Shibuya M. Advances in Cancer Research, 67,281-316, 1995)。
さまざまな循環不全症を改善するためには、 VEGF又はそれに類似したタンパク 質あるいはそれらを発現するべクタ一を心筋や下肢の皮下組織や筋肉組織に投与 し、 これらの血管新生因子により血管新生を促す方法が考えられる。 VEGFの臨床 実験は既に開始されているが、 VEGFは t - 1 (VEGF 受容体- 1) と KDR (VEGF 受容体- 2)に結合してその両者を活性化することが知られている（ShibuyaM, et al. Current Topics in Microbiology and Immunology, 37, 59 - 83, 1999) o 血管新生シグナルの 9 0 %程度は KDR (VEGF受容体- 2)から発信され（Takahashi T， et al. Oncogene, 18, 2221-2230, 1999)、 一方、 Fit - 1 (VEGF受容体 - 1) は単 球及びマクロファージの遊走と比較的弱い血管新生シグナルを発信する（Barleon B, et al. Blood, 87， 3336-3343, 1996, Clauss M, et al. Journal of Biological Chemistry, 271, 17629 - 17634, 1996)。 単球及びマクロファージ系細胞はさまざ まなサイトカインなどを分泌し炎症を誘起することが知られており、 血管新生療 法には障害となる可能性が考えられる。 従って、 血管新生療法には KDR (VEGF受 容体- 2)のみと結合し、 それを活性化できる 類似タンパク質が、 より目的に かなうと理解される。 KDR (VEGF 受容体- 2) のみと結合するタンパク質として、 VEGF-ENZ.7 が報告 さ れ た （ Ogawa S, et al. Journal of Biological chemistry, 273, 31273-31282, 1998)。この遺伝子自身は 1 9 9 4年にパラボックス の Orf ウィルスゲノムに見出されたものであるが、その性質は不明のままであり、 Ogawaらにより初めて KDR (VEGF受容体 - 2)のみと結合し、 かつ強力な血管新生 活性をもっとの特徴的な性質が明らかにされた （Lyttle,D，J， et al. Journal of Virology, 68， 84-92, 1994， Ogawa S， et al. Journal of Biological Chemistry, 273, 31273-31282, 1998)。
その後、 VEGF- ENZ-7に近縁の VEGF- ED17Q1や VEGF-E 2も同様に KDR (VEGF受体一 2) のみと結合することが報告されている （図 1 ) (Meyer M, et al, EMBO Journal 18， 363-374, 1999)。 このように VEGF-E NZ 7は KDR (VEGF受容体- 2) のみと結合し、 VEGFとほぼ同程度の血管新生活性をもち、 しかも単球 ·マクロファージの遊走を 刺激しない。 発明の開示
以上のように VEGF- ENZ-7は臨床的な利用価値が極めて高いタンパク質と考えら れるが、 克服すべき点がある。 それは抗原性の軽減または除去である。 すなわち VEGF-ENZ_7遺伝子はヒ トゲノム由来の遺伝子ではないため、 その産物である VEGF-ENZ-7タンパク質はヒトの免疫系にとつてある程度抗原性をもつ外来物と認 識され、 抗体が産生される可能性がある。 従って、 投与初期には強い血管新生効 果が期待されるが、 もし患者個体に抗体が産生されれば、 VEGF- ENZ_7を再投与して も抗体によって吸収され、 効果が低下することが予想される。
即ち、本発明は、 VEGF- Eの活性を維持しつつ、抗原性を軽減したキメラ VEGF- E を提供することを解決すべき課題とした。 さらに、 本発明は、 上記したキメラ VEGF-Eを含む医薬、 上記したキメラ VEGF-Eをコードする D N A、 並びに該 D N Aを用いて該キメラ VEGF- E を製造する方法を提供することを解決すべき課題と した。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、 VEGF- ENZ_7活性に関 与する部分と抗原性の比較的高いと予想される部分をドメイン解析により分離し、 抗原性の比較的高いと予想される部分を既知のヒトタンパク質に置き換え、 活性 を保持したまま抗原性、 異物性のみを軽減 ·除去することに成功し、 本発明を完 成するに至った。
即ち、 本発明によれば、 KDR (VEGF受容体- 2) と結合するが Fit - 1 (VEGF受 容体- 1)とは結合しない血管新生活性を有する VEGF類縁蛋白質の一部の配列を、 ヒト由来 VEGF類縁蛋白質の対応する配列と置換することにより得られる、血管内 皮細胞増殖活性を有するキメラ蛋白質が提供される。
本発明の一態様によれば、 KDR (VEGF 受容体- 2) と結合するが Fit - 1 (VEGF 受容体 - 1 ) とは結合しない血管新生活性を有する VEGF類縁蛋白質のアミノ末端 及び/又はカルボキシル末端をそれぞれヒト由来 VEGF 類縁蛋白質のァミノ末端 及び/又はカルボキシル末端と置換することにより得られる、 血管内皮細胞増殖 活性を有するキメラ蛋白質が提供される。好ましくは、 KDR (VEGF受容体- 2) と 結合するが F - 1 (VEGF受容体- 1) とは結合しない血管新生活性を有する VEGF 類縁蛋白質のァミノ末端の 1 0〜5 0アミノ酸残基をヒド由来 VEGF類縁蛋白質 のァミノ末端と置換するか、及び/又は上記 VEGF類縁蛋白質のカルボキシル末端 の 1 0〜5 0アミノ酸残基をヒト由来 VEGF 類縁蛋白質のカルボキシル末端と置 換することにより得られるキメラ蛋白質が提供される。
本発明の別の態様によれば、 KDR (VEGF受容体- 2) と結合するが ilt - 1 (VEGF 受容体- 1) とは結合しない血管新生活性を有する VEGF類縁蛋白質の内部の一部 の配列を、ヒト由来 VEGF類縁蛋白質の対応する配列と置換することにより得られ る血管内皮細胞増殖活性を有するキメラ蛋白質が提供される。 好ましくは、 KDR (VEGF受容体- 2) と結合するが F - 1 (VEGF受容体- 1) とは結合しない血管 新生活性を有する VEGF類縁蛋白質の一部の配列を、 少なくとも該 VEGF類縁蛋白 質のループ 1領域 （アミノ酸残基 4 7— 8 0 ) 及びループ 3 (アミノ酸残基 8 9 一 1 3 2 )の配列が維持されるように、 ヒト由来 VEGF類縁蛋白質と置換すること により得られるキメラ蛋白質が提供される。
好ましくは、 KDR (VEGF受容体- 2) と結合するが Fit - 1 (VEGF受容体- 1) と は結合しない血管新生活性を有する VEGF類縁蛋白質は、 VEGF- E フアミリーに属 する蛋白質であり、 さらに好ましくは、 蘭- E 7ヽ VEGF-EC1701又は VEGF-ENZ-2であ る。
好ましくは、 ヒト由来 VEGF類縁蛋白質は PIGFである。
好ましくは、本発明のキヌラ蛋白質は、 KDR (VEGF受容体 - 2)と結合するが Frt - 1 (VEGF受容体- 1) とは結合しない血管新生活性.を有する VEGF類縁蛋白質の カルボキシル末端の 1 0〜5 0アミノ酸残基をヒト由来 VEGF 類縁蛋白質のカル ボキシル末端と置換することにより得られる蛋白質である。
好ましくは、本発明のキメラ蛋白質は、 KDR (VEGF受容体 - 2) と結合するが Fit - 1 (VEGF受容体― 1)とは結合しない血管新生活性を有する VEGF類縁蛋白質は、 VEGF- E フアミリーに属する蛋白質であり、 かつ該 VEGF-E フアミリーに属する蛋 白質におけるアミノ酸残基 4 7 - 8 0のループ 1領域及びアミノ酸残基 8 9 - 1 3 2のループ 3領域を実質的に保持しているキメラ蛋白質である。
本発明の実施態様によれば、 下記の何れかのァミノ酸配列を有するキメラ蛋白 質が提供される。 (A) 配列番号 8、 9又は 1 0に記載のアミノ酸配列；
(B ) 配列番号 8、 9又は 1 0に記載にアミノ酸配列において 1から数個のアミ ノ酸が欠失、 置換及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、 かっ血管内皮 細胞増殖活性を有するアミノ酸配列；
( C) 配列番号 8、 9又は 1 0に記載のアミノ酸配列と 6 0 %以上の相同性を有 するアミノ酸配列からなり、 かっ血管内皮細胞増殖活性を有するァミノ酸配列。 本発明の実施態様によれば、下記の（A)から （F )の何れかのアミノ酸配列、 下記の （A) から （F ) の何れかのアミノ酸配列において 1から数個のアミノ酸 が欠失、 置換及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、 かっ血管内皮細胞 増殖活性を有するアミノ酸配列、 又は下記の （A) から （F ) の何れかのアミノ 酸配列と 6 0 %以上の相同性を有するァミノ酸配列からなり、 かっ血管内皮細胞 増殖活性を有するアミノ酸配列を有するキメラ蛋白質が提供される。
(A) 配列番号 7に記載のアミノ酸配列において 5 4番目から 5 7番目のァミノ 酸配列 Tyr- Leu- Gly- Gluを Asp-Val- Val- Serへ置換したアミノ酸配列；
(B ) 配列番号 7に記載のアミノ酸配列において 6 2番目から 6 4番目のァ.ミノ 酸配列 Ser-Thr- Asn を、 Glu- Va卜 Gluへ置換したアミノ酸配列；
( C ) 配列番号 7に記載のアミノ酸配列において 6 5番目から 6 8番目のァミノ 酸配列 Leu- Gin- Tyr-Asn を、 His-Met-Phe-Serへ置換したアミノ酸配列；
(D ) 配列番号 7に記載のアミノ酸配列において 3 7番目から 4 3番目のァミノ 酸配列 Trp-Met- Arg-Thr- Leu- Asp-Lysを、 Phe-Gln-Glu-Val-Trp- Gly- Argへ置換 したアミノ酸配列；
( E ) 配列番号 7に記載のアミノ酸配列において 4 7番目から 5 2番目のァミノ 酸配列 Lys- Pro- Arg-Asp- Thr-Valを、 Arg-Ala-Leu-Glu- Arg-Leuへ置換したアミ ノ酸配列；又は
( F ) 配列番号 7に記載のアミノ酸配列において 1 1 9番目から 1 2 2番目のァ ミノ酸配列 Leu- Gin - Arg- lieを、 Tyr- Val- Glu-Leuへ置換したアミノ酸配列。 本発明の実施態様によれば、 下記の何れかのアミノ酸配列を有するキメラ蛋白 質が提供される。
(A) 配列番号 1 5に記載のアミノ酸配列；
(B )配列番号 1 5に記載にアミノ酸配列において 1から数個のアミノ酸が欠失、 置換及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、 かっ血管内皮細胞増殖活'性 を有するアミノ酸配列；
( C ) 配列番号 1 5に記載のアミノ酸配列と 6 0 %以上の相同性を有するァミノ 酸配列からなり、 かっ血管内皮細胞増殖活性を有するアミノ酸配列。
本発明の別の側面によれば、 上記した本発明の何れかのキメラ蛋白質を含む医 薬が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、 上記した本発明の何れかのキメラ蛋白質を 含む、 KDR 受容体- 2) 受容体活性化剤が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、 上記した本発明の何れかのキメラ蛋白質を 含む、 血管内皮細胞増殖剤が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、 上記した本発明の何れかのキメラ蛋白質を コードする D N Aが提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、 上記した本発明の D N Aを含む発現べク夕 一が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、 上記した本発明の発現ベクターを含む医薬 が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の発現ベクターを含む、 KDR (VEGF受容体- 2) 受容体活性化剤が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、 上記した本発明の発現ベクターを含む、 血 管内皮細胞増殖剤が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、 上記した本発明の発現ベクターを有する形 質転換体が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、 上記した本発明の形質転換体を用いること を特徴とする、 上記した本発明の何れかのキメラ蛋白質を製造する方法が提供さ れる, 図面の簡単な説明
図 1は、 VEGF-EN27夕ンパク質と VEGF受容体との相互関係を示す。
図 2は、 VEGF-EN27キメラタンパク質 （VEGF- E-NP,VEGF- E- CP,VEGF-E- NP/CP) の 構造を示す。
図 3は、 VEGF- EN27キメラタンパク質の調製を示す。
図 4は、 VEGF-EN27キメラ夕ンパク質の KDR受容体への競合阻害実験の結果を示 す。
図 5は、 KDR受容体の自己リン酸化測定実験の結果を示す。
図 6は、 血管内皮細胞増殖実験の結果を示す。
図 7は、 VEGF- E-Hisの塩基配列とァミノ酸配列を示す。
図 8は、 VEGF-E-NP- Hisの塩基配列とァミノ酸配列を示す。
図 9は、 VEGF-E- CP- Hisの塩基配列とァミノ酸配列を示す。
図 1 0は、 VEGF- E- NP/CP- Hisの塩基配列とァミノ酸配列を示す。
図 1 1は、 hPIGF-1-Hisの塩基配列とアミノ酸配列を示す。
図 1 2は、 VEGF-Eキメラタンパク質 #19〜#27の構造、並びに KDR受容体の自己 リン酸化測定実験と血管内皮細胞増殖実験の結果の概要を示す。
図 1 3は、 VEGF-Eキメラ夕ンパク質 #19〜#27を用いた KDR受容体への競合阻害 実験の結果を示す。
図 1 4は、 VEGF- Eキメラタンパク質 #19〜#27を用いた血管内皮細胞増殖実験の 結果を示す。
図 1 5は、 VEGF-Eキメラタンパク質 #31〜#33の構造、並びに KDR受容体の自己 リン酸化測定実験と血管内皮細胞増殖実験の結果の概要を示す。
図 1 6は、 VEGF- Eキメラ夕ンパク質 #31〜#33を用いた KDR受容体への競合阻害 実験の結果を示す。
図 1 7は、 VEGF-Eキメラ夕ンパク質 #31〜#33を用いた血管内皮細胞増殖実験の 結果を示す。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明の実施方法及び実施態様について詳細に説明する。
( 1 ) 血管内皮細胞増殖活性を有するキメラ蛋白質
本発明の血管内皮細胞増殖活性を有するキメラ蛋白質は、 KDR (VEGF受容体 - 2) と結合するが Flt - 1 (VEGF 受容体- 1) とは結合しない血管新生活性を有する VEGF類縁蛋白質の一部の配列をヒト由来 VEGF類縁蛋白質の対応する配列と置換 することにより得ることができる。
KDR (VEGF受容体- 2) と結合するが Fit - 1 (VEGF 受容体- 1) とは結合しな い血管新生活性を有する VEGF類縁蛋白質の種類は特には限定されないが、具体的 には VEGF- Eファミ リ一に属する蛋白質が挙げられ、さらに具体的には、 VEGF- ENZ-7、 VEGF-ED1701又は VEGF-ENZ.2 などが挙げられる ( Oga a S，et al . Journal of Biological chemistry, 273, 31273-31282, 1998；並びに Meyer M， et al, EMBO Journal 18, 363-374, 1999)。
本発明のキメラ蛋白質の一実施態様によれば、血管新生活性を有する VEGF類縁 蛋白質のァミノ末端及び/又はカルボキシル末端がヒト由来 VEGF類縁蛋白質の ァミノ末端及び Z又はカルボキシル末端と置換されている。ヒト由来 VEGF類縁蛋 白質により置換される領域は、 VEGF類縁蛋白質のァミノ末端だけでもカルボキシ ル末端だけでも、 あるいはァミノ末端とカルボキシル末端の両方でもよい。 置換 されるァミノ末端の長さは得られるキメラ蛋白質が血管内皮細胞増殖活性を保持 する限り特には限定されないが、 好ましくはァミノ末端の 1 0〜 5 0アミノ酸残 基、 より好ましくは 2 0〜4 0アミノ酸残基、 特に好ましくは 2 0〜3 0アミノ 酸残基をヒト由来 VEGF類縁蛋白質のァミノ末端と置換する。同様に、置換される カルボキシル末端の長さは得られるキメラ蛋白質が血管内皮細胞増殖活性を保持 する限り特には限定されないが、 好ましくはカルボキシル末端の 1 0〜5 0アミ ノ酸残基、 より好ましくは 1 0〜4 0アミノ酸残基、 さらに好ましくは 1 0〜3 0アミノ酸残基、特に好ましくは 1 0〜2 0アミノ酸残基をヒト由来 VEGF類縁蛋 白質のカルボキシル末端と置換する。
本発明のキメラ蛋白質の別の実施態様によれば、 KDR (VEGF受容体- 2) と結合 するが Fit - 1 (VEGF受容体 - 1) とは結合しない血管新生活性を有する VEGF類縁 蛋白質の内部の一部の配列が、ヒト由来 VEGF類縁蛋白質の対応する配列により置 換されている。 好ましくは、 K皿 （VEGF 受容体- 2) と結合するが Fit - 1 (VEGF 受容体- 1) とは結合しない血管新生活性を有する VEGF類縁蛋白質の一部の配列 は、 少なくとも該 VEGF類縁蛋白質のループ 1領域（アミノ酸残基 4 7— 8 0 )及 びループ 3 (アミノ酸残基 8 9— 1 3 2 ) の配列が維持されるように、 ヒト由来 VEGF類縁蛋白質により置換されている。
本発明のキメラ蛋白質の別の実施態様によれば、 血管新生活性を有する VEGF 類縁蛋 S質のアミノ末端及び Z又はカルボキシル末端がヒト由来 VEGF 類縁蛋白 質のアミノ末端及び/又はカルボキシル末端と置換されていると同時に、 当該 VEGF類縁蛋白質の内部の一部の配列が、 ヒト由来 VEGF類縁蛋白質の対応する配 列により置換されている。
本発明における血管新生活性を有する VEGF 類縁蛋白質は好ましくは、 VEGF- E フアミリーに属する蛋白質である。 VEGF- Eは 1 4 9アミノ酸から成る蛋白質であ ；
( I ) シグナルペプチドを含むアミノ末端領域 （アミノ酸残基 1— 4 6 )；
(II) ループ 1領域 （アミノ酸残基 4 7— 8 0 )；
(III) ループ 2領域 （アミノ酸残基 8 1 - 8 8 ) ;
(IV) ループ 3領域 （アミノ酸残基 8 9— 1 3 2 ) ;及び
(V) カルボキシル末端領域 （アミノ酸残基 1 3 3— 1 4 8 )
から構成されている (Ogawa S,et al. Journal of Biological chemistry, 273， 31273-31282， 1998)。 上記各領域の中でもループ 3領域が、 KDR (VEGF受容体 - 2)との結合に重要であることが示唆されていることから、本発明のキメラ蛋白質 は、 VEGF- Eのアミノ酸残基 8 9—1 3 2のループ 3領域を実質的に保持している ことが好ましい。
本発明のキメラ蛋白質では、 VEGF類縁蛋白質のァミノ末端及び/又はカルボキ シル末端をそれそれヒト由来 VEGF 類縁蛋白質のァミノ末端及び/又はカルボキ シル末端と置換することにより得られる。これにより VEGF類縁蛋白質の抗原性を 低減することができる。ヒト由来 VEGF類縁蛋白質の種類は特には限定されないが、 例えば、 PIGF、 特には hPIGf などを挙げることができる。
また、 上記したようなキメラ蛋白質は、 血管内皮細胞増殖活性を保持する限り において、 そのアミノ酸配列の一部に、 付カロ、 欠失、 置換及び/又は修飾があつ てもよい。
本発明のキメラ蛋白質の具体例としては、 下記の何れかのアミノ酸配列を有す るキメラ蛋白質が挙げられる。
(A) 配列番号 8、 9、 1 0又は 1 5に記載のアミノ酸配列、 あるいは配列番号 7において本明細書で特定したアミノ酸配列の置換を有するアミノ酸配列；
(B )上記（A)に定義したアミノ酸配列において 1から数個のアミノ酸が欠失、 置換及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、 かっ血管内皮細胞増殖活性 を有するアミノ酸配列；
( C ) 上記 （A) に定義したアミノ酸配列と 6 0 %以上の相同性を有するァミノ 酸配列からなり、 かっ血管内皮細胞増殖活性を有するァミノ酸配列。
本明細書において 「1から数個のアミノ酸が欠失、 置換及び または付加され たアミノ酸配列」 とは、 例えば 1から 2 0個、 好ましくは 1から 1 5個、 より好 ましくは 1から 1 0個、 さらに好ましくは 1から 5個のアミノ酸が欠失、 置換及 び/または付加されたアミノ酸配列を意味する。
本明細書において、 「アミノ酸配列と 6 0 %以上の相同性を有するアミノ酸配 列」 とは、 少なくとも 6 0 %以上の相同性を有することを意味し、 相同性は好ま しくは 7 0 %以上、 より好ましくは 8 0 %以上、 さらに好ましくは 9 0 %以上、 特に好ましくは 9 5 %以上である。
上記したような、 あるアミノ酸配列において 1から数個のアミノ酸が欠失、 置 換及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、 かっ血管内皮細胞増殖活性を 有するアミノ酸配列；あるいはあるアミノ酸配列と 6 0 %以上の相同性を有する アミノ酸配列からなり、 かっ血管内皮細胞増殖活性を有するアミノ酸配列を有す る蛋白質は、 例えば、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、 または Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987- 1997)などに記載の通常の組み換 え遺伝子法 （部位特異的変異誘発法等を含む） を用いて、 配列番号 7から 1 1に 記載のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする D N Aを用いて作製または入手 することができる。
( 2 ) 血管内皮細胞増殖活性を有するキメラ蛋白質の調製方法
以下、 本発明のキメラ蛋白質の調製方法を具体的に述べる。
KDR (VEGF受容体- 2) と結合するが Fit - 1 (VEGF 受容体- 1) とは結合しない 血管新生活性を有する VEGF類縁蛋白質をコ一ドする遺伝子 (例えば、 VEGF-E遺伝 子)又は該遺伝子の改変物を出発材料として用いて、適当な制限酵素を用いて D N A断片を切り出すか、あるいは P C Rなどの方法によって、所望の VEGF類縁蛋白 質をコードする D N A断片を作成する。
また、置換すべきヒト由来 VEGF類縁蛋白質のァミノ末端及び Z又はカルボキシ ル末端又はその内部の部分配列をコードする D N Aを別途調製する。 ヒト由来 VEGF類縁蛋白質のァミノ末端及び/又はカルボキシル末端又はその内部の配列 をコードする D N Aは、ヒト由来 VEGF類縁蛋白質をコードする遺伝子から適当な 制限酵素を用いて所望の D N A断片を切り出して取得してもよいし、 P C Rを用 いて所望の D N A断片を増幅してもよいし、 あるいは D N A合成機を用い化学合 成により取得してもよい。
次いで、 上記で得た D N A断片同士を適当な D N Aリガーゼを用いて結合させ ればよい。 この場合、 読み取り枠を合わせるためにオリゴヌクレオチドを揷入さ せたり、 同じ制限酵素部位を創出するために一部の塩基配列を改変してもよい。 D N Aを組み込むプラスミ ドとしては、宿主内で複製保持されるものであれば、 いずれも使用することができるが、 例えば大腸菌由来の pBR322、 pUC18、 及びこ れらを基に構築された pET-3cなどを挙げることができる。
プラスミ ドに D NAを組み込む方法としては、例えば T.Maniatisら、 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, p: 239 (1982) に記載の方法などが 挙げられる。
クローンニングされたキメラ蛋白質をコードする遺伝子は、 発現に適したべク 夕—中のプロモー夕—の下流に連結して発現ベクターを構築することができる。 ができる。
本発明で用いることができる発現べクタ一としては、 上記の大腸菌由来のブラ スミ ド（pBR322、pBR325、pUC12、pUC13、pET- 3)、枯草菌由来のプラスミド（pUB110、 ρΤΡ5Ν pC194) 酵母由来のプラスミ ド（pSH19、 pSH15 )由来のプラスミド、 あるい は λファージなどのバクテリオファージゃこの誘導体およびレトロウィルス、 ヮ クシニアウィルスなどの動物ウィルス、 あるいは昆虫ウィルス （バキュロウィル ス等） などが挙げられる。
該遺伝子はその 5'末端に翻訳閧始コドンとしての ATGを有し、また 3'末端には 翻訳終始コドンとしての TAA、 TGAまたは TAGを有してもよい。さらに該遺伝子を 発現させるにはその上流にプロモーターを接続する。 本発明で用いられるプロモ 一夕一としては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモ一夕一であ ればいかなるものでもよい。
また、形質転換する宿主が大腸菌である場合には、 trpプロモ一夕一、 lacプロ モ一夕一、 rec Aプロモー夕一、 XPL プロモー夕一、 lpp プロモ一夕一、 T7プロ モー夕一などが、 宿主が枯草菌である場合には、 SP01プロモーター、 SP02プロモ
—夕一、 penPプロモ一夕一など、宿主が酵母である場合には、 PH05プロモ一夕一、
PGKプロモー夕一、 GAPプロモーター、 ADHプロモ一夕一などが好ましい。 また、 宿主が動物細胞である場合には、 SV40由来のプロモー夕一、 レトロウイルスのプ 口モー夕—が挙げられる。 このようにして構築された本発明のキメラ蛋白質をコードする D N Aを有する 組み換え D N Aを含むベクターを用いて、 該ベクターを保持する形質転換体を作 製する。
宿主と しては、 大腸菌 [例えば、 BL21, BL2KDE3), BL21(DE3)pLysS, BL21(DE3)pLysEなど]、枯草菌 (例えば、 Bacillus subtilis DB105など)、酵母 (例 えば、 Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae など)、 動物細胞 (例えば、 COS細胞、 CH0細胞、 BHK細胞、 NIH3T3細胞、 BALB/c3T3細胞、 HUVE細胞、 LEII細 胞など)、 昆虫細胞などが挙げられる。 '
上記の形質転換は、 それそれの宿主について一般的に行われている方法で行う ことができる。 例えば、 宿主が大腸菌ならばカルシウム法その他の方法により作 成したコンビテント細胞に組み換え D NAを含むベクタ一を温度ショック法ある いはエレクトロポレーシヨン法などにより導入する。 宿主が酵母であればリチウ ム法その他の方法により作成したコンビテント細胞に組み換え D N Aを含むべク 夕一を温度ショック法あるいはエレクトロポレーシヨン法などにより導入する。 宿主が動物細胞であれば、 細胞に組み換え D N Aを含むベクターをリン酸カルシ ゥム法、 リポフエクシヨン法あるいはエレクトロポレーシヨン法などにより導入 する。
上記の方法により、 本発明のキメラ蛋白質をコードする D N Aを含む発現べク 夕一を保持する形質転換体が得られる。 該形質転換体を適当な培地で培養するこ とにより、 本発明のキメラ蛋白質を産生させることができる。
形質転換体を培養する場合、 培養に使用される培地としては、 それそれの宿主 について一般的に用いられているものを用いることができる。 例えば、 大腸菌の 場合には L B培地など、 酵母の場合には Y P D培地など、 動物細胞の場合には Dulbecco5 s MEMに動物血清を加えたものなどを使用することができる。
形質転換体の培養は、 それそれの宿主について一般的に用いられている条件で 行うことができる。 例えば、 宿主が大腸菌ならば約 3 0〜3 7 °Cで、 約 3〜2 4 時間培養を行い、 必要により通気や攪拌を加えることができる。 宿主が酵母であ れば約 2 5〜3 7 °Cで、 約 1 2時間〜 2週間培養を行い、 必要により通気や攪拌 を加えることができる。宿主が動物細胞であれば約 3 2〜3 7 °Cで、 5 %C02、100% 湿度の条件で約 2 4時間〜 2週間培養を行い、 必要により気相の条件を変えたり 攪拌を加えることができる。
なお、 本発明のキメラ蛋白質を昆虫細胞を宿主として発現させる場合には、 例 えばバキュロウィルス ·イクスプレヅシヨン ·ベクタ一ズ ·ァ ·ラボラトリー · マ二ユアレ (Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual )s カレン卜 - プロトコールズ 'ィン 'モレキユラ一'バイオ口ジ一、 Bio/Technology， 6, 47( 1988) 等に記載された方法によって、 タンパク質を発現することができる。
即ち、 組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウィルスを昆虫細胞に共導入 して昆虫細胞培養上清中に組換えゥィルスを得た後、 さらに組換えウィルスを昆 虫細胞に感染させ、 タンパク質を発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入べクタ一としては、 例えば、 pVL1392、 PVL1393, pBlueBacII I (ともにインビトロジェン社製)等をあげることができる。 バキュロウィルスとしては、 例えば、 夜盗蛾科昆虫に感染するウィルスである アウトグラファ · カリフオル二力 · ヌクレアー ·ポリへドロシス · ウィルス (Autographa calif ornica nuclear polyhedrosis virus,等を用いることができる。 昆虫細胞としては、 Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞である Sf9、 Sf21 〔バキ ュロウィルス 'エクスプレッション■ベクターズ、 ァ ·ラボラトリー 'マ二ユア ル、 ダブリュ一 'ェイチ 'フリ一マン 'アンド ' カンパニー H. Freeman and Company )Ν ニューヨーク（New York)ヽ ( 1992)〕、 Trichoplusia niの卵巣細胞であ る High5(インビトロジェン社製)等を用いることができる。
組換えゥィルスを調製するための、 昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入べクタ —と上記バキュロウィルスの共導入方法としては、 例えば、 リン酸カルシウム法 (特開平 2-227075 )、 リボフヱクシヨン法 〔Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 84, 7413( 1987)〕 等をあげることができる。
昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、 一般 に使用されている TNM- FH培地 〔Pharmingen社製〕、 Sf-900 I I SFM培地（ギブコ BHL社製）、 ExCell400、ExCell405〔いずれも JRH Biosciences社製〕、 Grace' s Insect Medium (Grace, T. C.C. , Nature, 195,788( 1962)〕 等を用いることができる。 培 養は、 通常 pH 6〜7、 2 5〜3 0 °C等の条件下で、 1〜5日間行う。 また、 培養中 必要に応じて、 ゲン夕マイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
上記したような培養物から本発明のキメラ蛋白質を培養菌体ぁる 、は細胞から 抽出するには、 培養上清から直接精製するか、 あるいは形質転換体の培養後、 ホ モジナイザー、 フレンチプレス、 超音波、 リゾチームおよび/または凍結融解な どの手段によって菌体あるいは細胞を破壊することにより菌体外に目的のキメラ 蛋白質を溶出させ、 可溶性の画分からキメラ蛋白質を得ることができる。 また目 的のキヌラ蛋白質が不溶性画分に含まれる場合は菌体あるいは細胞を破壊後、 遠 心分離により不溶性画分を回収し、 塩酸グァニジンなどを含む緩衝液などによつ て可溶性にして回収する方法を用いることもできる。 このほか塩酸グァニジンな どの蛋白質変性剤を含む緩衝液によって直接菌体ぁるいは細胞を破壊し、 菌体外 に目的のキメラ蛋白質を溶出させる方法もある。
上記した可溶性画分から本発明のキメラ蛋白質を精製するには、 公知の分離 · 精製法を適切に組み合わせて行うことができ、 例えば、 塩析、 溶媒沈殿、 透析、 限外濾過、 ゲル濾過、 S D S—ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動、 イオン交換ク 口マトグラフィ一、 ァフィ二ティ一クロマトグラフィー、 逆相高速液体クロマト グラフィ一、 等電点電気泳動などを使用することができる。
また、 本発明のキメラ蛋白質にヒスチジンタグを融合させて発現させた場合に は、 N i-NTAァガロースなどのニヅケル担体を用いてヒスチジン夕グ融合キメラ蛋 白質を特異的に吸着させ、 回収することもできる。
( 3 ) 血管内皮細胞増殖活性を有するキメラ蛋白暫、 又は血管内皮細胞増瑭活件 を有するキメラ蛋白質をコードする D N Aを含む発琨ベクタ一を含む医薬
本発明のキメラ蛋白質は、 血管内皮細胞増殖活性を有する。 血管系の異常によ る循環障害は非常に多くの疾患で認められ、 このような疾患の具体例としては、 例えば、 狭心症、 心筋梗塞、 糖尿病による下肢循環不全、 動脈閉寒症などが挙ら れる。 本発明のキメラ蛋白質又は該キメラ蛋白質をコードする D N Aを含む発現 ベクタ一を上記疾患を罹患する患者に投与することにより、 血管内皮細胞の増殖 作用を通じて治療効果を発揮することができる。 また、 本発明のキメラ蛋白質は KDR (VEGF受容体- 2) 受容体を活性化する作用を有することから、 KDR (VEGF受 容体- 2)受容体の活性の異常を伴う疾患の治療剤又は予防剤としても有用である。 以上のように本発明のキメラ蛋白質は医薬として有用なものである。
本発明のキメラ蛋白質は、 医薬的に許容できる溶剤、 賦形剤、 担体、 補助剤な どを使用し、 常法に従って液剤、 注射剤、 散剤、 顆粒剤、 錠剤、 坐剤、 腸溶剤お よび力プセル剤などの医薬組成物に調製することができる。
医薬組成物中における有効成分である本発明のキメラ蛋白質の含有量は、 0 . 0 0 0 0 0 1〜； I . 0 重量％程度とすればよい。 このような医薬組成物は、 KDR (VEGF 受容体- 2) 受容体活性化剤又は血管内皮細胞増殖剤として、 ヒト、 マウ ス、 ラット、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ等の哺乳動物、 特に好ましくはヒトに対して安 全に投与することができる。 投与経路は、 局所的、 経口的、 非経口的、 鼻腔内、 静脈内、 筋肉内、 皮下、 経皮的などの任意の絰路を採用できる。
本発明のキメラ蛋白質の投与量は、 患者の年齢、 性別、 体重、 症状、 及び投与 経路などの条件に応じて適宜増減されるべきであるが、 例えばヒトを含む哺乳動 物に投与する場合、 当該キメラ蛋白質を 1日当たり 0 . 0 1 g〜1 0 m g/体 重 1 k g程度投与することができる。
また、 本発明のキメラ蛋白質をコードする D NAを含む発現ベクターは、 局所 的、 経口的、 非経口的、 鼻腔内、 静脈内、 筋肉内、 皮下、 経皮的などの任意の投 与経路で投与するために配合することができる。 好ましくは発現ぺク夕一は、 注 射しうる形態で用いられる。 例えば、 本発明の発現ベクターを、 医薬的に許容し うる賦形剤と混合して注射剤とすることができる。 注射剤としては、 例えば、 無 菌溶液、 等張液などが挙げられる。 あるいは乾燥組成物、 特に凍結乾燥組成物と して製剤化してもよく、 これらは、 使用の際に無菌水か生理食塩水を添加して、 注射剤を調製することができる。
本発明の発現ベクターの投与量は患者の年齢、 性別、 体重、 症状、 及び投与経 路などの条件に応じて適宜増減されるべきであるが、 一般的には、 成人 1日当た りは有効成分の D N A量として l〃g/k gから 1 0 0 Omg/k g程度の範囲で あり、 好ましくは 1 から 1 0 Omg/k g程度の範囲である。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、 本発明は実施例によ つて限定されることはない。 実施例
実施例 1 ：細胞と培養条件
Sf9 昆虫細胞 （ Invitrogen,CA，USA ) の培養液は EX-Cell 400(JRH Biosciences，Lenexa，KS)を使用した。 NIH3T3マウス線維芽細胞とヒトの VEGF受 容体である。 KDR (VEGFR-2) を強発現させた細胞株 NIH3T3- KDRは、 リガンド結合 による KDR自己リン酸化を測定する実験に用いた。 NIH3T3- KDR細胞は沢野らによ り作製された （Sawano,A， et al. Cell growth and Differentiation, 7, 213-221, 1996)。 NIH3T3 細胞及び NIH3T3-KDR細胞は、 Dulbecco' s modifield Eagle' s medium(ダルべヅコ変換 DMEM培地； Nissui, Tokyo)に 10%ゥシ血清、 mML -グル 夕ミン， 200mg/ml G418(Geneticin;Life Technologies, Inc. , Grand island, NY)を 加えて維持した。 ヒ ト臍帯静脈内細胞 （Human umbilical vein endothelial cells,HUVEC) (Morinagajoyo)は HUVE培養用倍地（Morinaga, Tokyo)で維持し、 内皮細胞増殖アツセィに使用した。組換えヒト VEGF165は Sf9細胞にバキュロウィ ルス系で強制発現させたのち、 培養上清からへパリンカラムを用いて精製して用 いた。リガンド結合実験には、 Fc-融合 7N- s KDR (遊離型 KDR)を使用した（Shinkai, A et al. J.Biol.Chem. 273, 31283-31288， 1998)。 実施例 2 ： 変異型キメラ VEGF- タンパク質 （ VEGF-E- NP， VEGF-E-CP, VEGF-E-NP/CP) の作製
以下の 3種類の VEGF- EN27/ヒト PlGF-1 (以下 hPlGF-1) キメラタンパク質を作 製した （図 2 )。
( 1 ) VEGF-EN27のァミノ末端の 3 4ァミノ酸残基を hPlGF - 1のァミノ末端の 4 0 ァミノ酸残基と置換えしたキメラタンパク質 VEGF-E-NP；
( 2 ) VEGF- EN27のカルボキシル末端の 1 8アミノ酸残基を hPlGF- 1のカルボキシ ル末端の 2 1アミノ酸残基と置換した VEGF- E-CP；及び
( 3 ) VEGF- EN27のァミノ末端とカルボキシル末端の両端を hPlGF-1に置換えした VEGF-ENP/CP：
上記 3種類のキメラタンパク質には精製を簡便にする為に、 ヒスチジンタグを 融合させた。 それそれのキメラタンパク質をコードする DNAを作製し、 ベクタ一 PUC18にサブクローニングした方法を以下に述べる。
なお、図 7と配列番号 7に VEGF-E- Hisの塩基配列とァミノ酸配列を、図 8と配 列番号 8に VEGF- E-NP- His の塩基配列とアミソ酸配列を、 図 9と配列番号 9に VEGF-E-CP-His の塩基配列とァミノ酸配列を、 図 1 0 と配列番号 1 0 に VEGF-E-NP/CP- Hisの塩基配列とアミノ酸配列を、そして図 1 1と配列番号 1 1に hPIGF-1-Hisの塩基配列とアミノ酸配列を示す。
(VEGF-E-CPと VEGF-E-NP)
まず、 ヒスチジンタグがカルボキシル末端に融合された VEGF-E 遺伝子の全長 DNAを pUC18にサブクローニングしたプラスミ ド DNAである pUC18- VEGF- E- Hisを 制限酵素で切断した。 Dral l lと EcoRIで切断して得た 3kbのフラグメント、 また PflMIと BamHIで切断して得た約 3kbを Gene clean法で精製した。 また、 6本の ォリゴォリゴヌクレオチドを作製し、 HPLC で精製した。 （Amersha Pharmacia Biotech (Tokyo)；
5155：
5， -GTGCGAATGCC-3' (配列番号 1 )
5156： 55 -CATTCGCACTTT-35 (配列番号 2 )
S150：
55 -GGCCTCTGCGGGAGAAGATGAAGCCGGAAAGGTGCGGCGATGCTGTTCGCCGGAGGCACCATCACCAT CACCATTAAG-3， （配列番号 3 )
S151：
55 -AATTCTTAATGGTGATGGTGGATGGTGCCTCCGGGGAACAGCATCGCCGCACCTTTCCGGCTTCATCT TCTCCCGCAGAGGCCGG-3， （配列番号 4 )
5166：
5' -GATCCATGCCGGTCATGAGGCTGTTCCCTTGCTTCCTGCAGCTCCTGGCCGGGCTGGCGCTGCCTGCT GTGCCCCCCCAGCAGTGGGCCTTGTCTGCTGGGAACGGCTCGTCAGAGGTGGAAGTGAATGA-35 (配列 番号 5 )
5167：
5' -TTCACTTCCACCTCTGACGAGCCGTTCCCAGCAGACAAGGCCCACTGCTGGGGGGGCACACGAGGCAG CGCCAGCCCGGCCAGGAGCTGCAGGAAGCAAGGGAACAGCCTCATGACCGGCATG-3， （配列番号 6 ) S150 と S151、 S155 と S156、 S166 と S167 それそれ 10 g/ml を ΙΟπιΜ Tris-HCl(pH7.5) 310mM MgCl2 5 lmM DTT, 100mM NaClの条件下で 10分煮沸した後、 室温で放置し会合させた。 次に Gene clean法で精製した VEGF- Eを含む DNAフラ グメントと、 会合させたオリゴヌクレオチドを DNAリガーゼで結合し、 プラスミ ドヘクター上に分子クロ一ニングした。 VEGF-E-CPには Drall l/EcoMの DNAフラ グメント、 S150/S151と S155/S156のォリゴヌクレオチドを DNAリガーゼで結合 し、 VEGF- E- NPには Pf lMI/BajnHIの DNAフラグメントと S166/S167のォリゴヌク レオチドを DNAリガーゼで結合した。 これにより、 カルボキシル末端にヒスチジ ン夕グが融合した。 VEGF-E- CPと VEGF- E- NPをコードした全長 DNAが pUC18 ブラ スミ ドベクタ一にサブクローニングされた。 それそれのプラスミ ドを pUCE-CP， pUCE-NPと命名する。
(VEGF-E-NP/CP)
pUCE-CP と pUCE- NPを BsrGIと EcoRIで切断し、 それそれより得られた 200bp と 3kbの DNAフラグメントを Gene clean法で精製した後、 MAリガーゼで結合し た。 これにより、 カルボキシル末端にヒスチジンタグが融合した。 CEGF-E- NP/CP をコードした全長 DNAが pUC18にサブク口一ニングされ、 このプラスミ ド DNAを pUCE-NP/CPと命名した。
次にサブクロ一ニングされたそれそれの DNAを切り出し、 バキュロウィルスべ クタ一にサブクロ一ニングした。 pUCE-CP, pUCE-NPと pUCE- NP/CPの DNAそれそ れを BamHI と EcoRIで切断し、 450bpのフラグメントを Gene cleanで精製した。 そしてバキュロウィルスベクターの pVL1393( Invitrogen)のマルチクロ一ニング 領域の BamHI と EcoRI のサイ トにクロ一ニングし、 これらのプラスミ ド DNAを pVL3E-CP,pVL3E-NPと pVL3E- NP/CPと命名した。 実施例 3 ： VEGF-Eキメラタンパク質の調製
PVL3E- CP，pVL3E-NP と pVL3E-NP の DNA とバキュロ ウィ スル DNA の Baculogold(Pha mingen，San Diego，CA)を用い、リポフエクチン法 ( lipofectin で Sf9細胞にトランスフエクシヨンした。 キメラタンパク質をコードする DNAを 持つ組換えウィルスの増幅は 3〜4日間のィンキュベ一シヨンを繰り返して行つ た。 キメラタンパク質を発現させる為に MOI (Multiplicity of infection,細胞 一個に対するウィルス粒子） =10で組換えウィルス Sf9細胞に感染させた。 3日間 のィンキュベ一シヨンの後、 キメラタンパク質が分泌された培養液を回収した。 次に培養液を濃縮した。 150mlの培養液を 15mlに濃縮する為、 攪拌式限外濾過 器 (MILLIP0RE,U. S.A)を使用した。組換えタンパク質に融合したヒスチジンタグを 負に電荷させる為、 濃縮液を 20mM リン酸ナトリウム緩衝液 (Sodium Phosphate Buffer3pH8.0)5 lOmMイミダゾ一ル， 300mM NaCl, 20%グリセロールで透析した。 透析後、 Ni-NTAァガロース （QIAGEN, Germany) を用いてヒスチジンタク融合夕 ンパク質を特異的に吸着させた。組換えタンパク質を吸着した Ni-NTAァガロース をカラムに導入し、 20mM リン酸ナトリゥム緩衝液（pH8.0), 50mM ィ ミダゾ一 ル， 300mM NaCl,20%グリセロールで洗浄し、 目的のキメラタンパク質を 20mMリン 酸ナトリゥム緩衝液 (pH8.0 )，250mM ィミダゾ一ル， 300mM NaCl, 20%グリセロール で溶出した。最後に、溶出液を 20mMリン酸ナトリゥム緩衝液 (pH7.4) , 50mM NaCl , 20 %グリセロールに対して透析した。 精製したキメラタンパク質は 15 % SDS-PAGE で電気泳動し、 Coomassie 染色と抗ヒスチジンタグ単クローン抗体 (anti- His- tagmAb)，抗- VEGF- E血清及び抗- PIGF抗体を用いたウエスタンプロヅ ティング法により解析した。 キメラタンパク質の精製度は 80%以上であった （図 3 )。 実施例 4 ： VEGF-Eキメラ夕ンパク質の KDR受容体への競合阻害実験
Fc-融合 7N- sKDRを 3 zg/mlとなるよう生理的食塩水 (PBSと略）に希釈し、 50 z 1 ずつ 96-ゥエルの細胞培養プレート （I讓 unon (登録商標） 2HB， DYNEX TECHNOLOGIES, INC, VA) に加え、 4°Cで 12時間置き、 SKDRをプレートに吸着さ せた。 プレ一トをブロッキング緩衝液 （1 %ゥシ血清アルブミンを含む PBS) で二 回洗浄し、 ブロッキング緩衝液を用いて 25°Cで 30分ブロッキングを行った。 競 合阻害実験には、 16 /g/ml1MI-放射性標識 VEGF (13200-1, 800Ci/mmol ;Amershajii Pharmacia Biotech) と 16-l , 000 /g/mlキメラタンパク質を含む 50 / 1のサンプ ルを SKDRでコートしたゥエルに加え、 25°Cで 3時間反応させた後、 ブロッキング 緩衝液でゥエルを洗浄した。 各ゥエルの SKDRに結合した 1251-放射性標識 VEGFの 測定はガンマカウン夕一（ァ -counter )を用いて行った。
その結果、 3種類のキメラ VECT-EN 27タンパク質 （VEGF-E- NP， VEGF-E-CP, VEGF-E-NP/CP)は効率よく VEGFの KDRへの結合を阻害することが示された。この ことはキメラ VEG(F-EN27タンパク質が KDRに高親和性に結合することを強く示唆 している （図 4 )。 実施例 5 ： KDR受容体の自己リン酸化測定実験
キメラ VEGF-E，タンパク質が直接] nmと結合して KDRを活性化することを確 認するために、 これらのタンパク質による KDR受容体の自己リン酸化測定実験を 行った。 NIH3T3-KDR細胞をキメラタンパク質で刺激する前に、 60%飽和まで培養 した後、 0.5%ゥシ血清を含む DMEMで一晩低濃縮血清条件にさらした。それそれの キメラタンパク質による細胞の刺激は卜 500ng/mlの濃度で 37° 5分で行った。 細胞は O. lmM Na3V04を含む氷冷 PBSで二回洗浄し、 1 %Triton X-100溶解緩衝 液（50mM HEPES ρΗ7·4， 150她 CI, 10%グリセロール， l %tritonX- 100, 1.5ιηΜ MgCl, 2%トラジロール， ImM PMSF, 50mM NaF, lOmM Na4P207， 2mM Na3V04)で溶解 した。溶解したサンプルを 15，000rpmで 10分遠心し、 上清を回収した。上清中の 夕ンパク質の濃度は Bio-Rad夕ンパク測定キット（Richmond, CA)で測定し、等量の タンパク質を解析に使用した。 自己リン酸化 KDRを解析する為のィムノブロッテ ィング（I誦 unoblotting)には、溶解サンプルを 7.5%SDS-PAGEで電気泳動した後、 ニトロセルロース膜に転写した。 転写したニトロセルロース膜はブロッキング緩 衝液 （5%BSA含む洗浄用緩衝液 C20mM Tris-HCl pH7.4, 150mM NaCl5 0.1% Tween 20〕 でプロッキングした後、 一次抗体を含むブロッキング緩衝液で結合反応を行 つ /こ
ウエスタンプロッティングのシグナルはホースラディッシユーペルォキシダー ゼ結合二次 ί几体 (horseradich peroxidase - conjugated secondary antibodies)と 増感型化学蛍光試薬（echanced chemi luminescence) (ECL,Amersham) を用いて解 祈した。
その結果、 3種類のキメラ VEGF-EN27タンパク質 （CEGF-E- NP， VEGF-E- CP， VEGF-E-NP/CP) いずれも KDR受容体のチロシンキナーゼを用量依存的に活性化す ることが明らかとなった （図 5 )。 実施例 6 ：血管内皮細胞増殖実験
増殖因子 FGFを加えた HUVE培養用培地 （ニッスィ） で培養した HUVEC (森永、 東京）を 24ゥヱルプレート（セルタイ ト C- 1プレート 24 F ;秋田べーク株式会社、 秋田） に 4，000個徹き、 37°Cのインキュベーターに 4時間放置し細胞を吸着させ た。 キメラ VEGF-Eタンパク質を最終濃度 50ng/mlとなるよう培地に直接添加し、 3 日間培養した。 ホルマリンで細胞を固定化したのち、 クリスタルバイオレット で染色した。細胞数をカウントして相対的に比較し、内皮細胞の増殖を解析した。 この結果、 キメラタンパク質は in vitroの条件下において VEGF-Eタンパク質と 同等な血内皮細胞増殖活性を持つことが示された （図 6 )。
(実施例 1から 6のまとめ）
以上の結果から、 3種類のキメラ VEGF-EN27 タンパク質 （VEGF- E-NP, VEGF-E-CP,VEGF-E-NP/CP) はいずれも KDRに高親和性に結合し、 KDRの自己リン 酸化を促進し、 血管内皮細胞の増殖を刺激することが明らかとなった。 タンパク 質の抗原性はァミノ末端やカルボキシル末端などの遊離末端が相対的に強いこと が知られているが、 VEGF-Eの両末端は今回の結果から KDRチロシンキナーゼの活 性化には必要でなく、上記実施例で用いた PIGFなどのヒト由来夕ンパク質と置換 できることが明らかとなった。 従って、 これらのキメラ VEGF-EN27タンパク質
(VEGF-E-NP,VEGF-E-CP,VEGF-E-NP/CP)はもとの VEGF-EN27タンパク質それ自身よ りも安全な血管新生因子として利用できるものと考えられる。 実施例 7 ：キメラ VEGF- Eタンパク質 （#19〜#27および #31〜#33) の作成
( 1 ) キメラ VEGF-E夕ンパク質 #19- #27の作成
置換領域のアミノ酸配列を以下に示す。置換領域の塩基配列は P1GFのものを用 いて作成した。また、キメラ VEGF-E夕ンパク質 #19— #27の構造を図 1 2に示す。
#19： VEGF-Eのアミノ酸配列 #54- 57 (YLGE) を、 ヒト P1GFの対応する領域のァ ミノ酸配列 (DVVS) へ置換。
#20: VEGF-Eのァミノ酸配列 #62- 64 (STN) を、 ヒト P1GFの対応する領域のアミ ノ酸配列 (EVE) へ置換。
#21 : VEGF-Eのアミノ酸配列 #65- 68 (LQYN) を、 ヒト P1GFの対応する領域のアミ ノ酸配列 （HMFS) へ置換。
#22: VEGF-Eのアミノ酸配列 #37- 43 (WMRTLDK) を、 ヒト P1GFの対応する領域の アミノ酸配列 （FQEVWGR) へ置換。
#23 : VEGF-Eのアミノ酸配列 #47- 52 (KPRDTV) (ベ一夕鎖 #1) を、 ヒト P1GFの 対応する領域のァミノ酸配列 （RALERL ) へ置換。
#24: VEGF- Eのアミノ酸配列 #98- 101 (VTVS) (ぺ一夕鎖 #6， 第 6システィン と第 7システィンの間） を、 ヒト P1GFの対応する領域のアミノ酸配列 （MQLL)へ
#25 : VEGF- Eのアミノ酸配列 #102- 104 (VTG) (ループ 3の一部） を、 ヒト P1GF の対応する領域のアミノ酸配列 （KTR) へ置換。
#26 : VEGF-Eのアミノ酸配列 #119-122 (LQRI ) (ベ一夕鎖 #7: 第 Ίシスティン から 11アミノ酸残基上流の領域） を、 ヒト P1GFの対応する領域のアミノ酸配列 (YVEL) へ置換。
#27: VEGF-Eのアミノ酸配列 #111-118 (TNSGVSTN) (VEGF-E特異的アミ ノ酸配列） を、 除去 （欠失変異)。
( 2 ) キメラ VEGF Eタンパク質 #31— #33 の作成
キメラタンパク質の構造を塩基配列として以下に示す。 また、 キメラ VEGF - E タンパク質 #31— #33 の構造を図 1 5に示す。
四角の枠の部分：システィン部位， （第 2、 3、 4、 5番目）
下線部分 ： VEGF- E配列
基本塩基配列： P1GF-I
#31 (配列番号 1 2 ) : ヒト P1GFの第 2、 3システィン間のアミノ酸配列を、 対 応する VEGF- Eのァミノ酸配列と置換。
atgccggtcatgaggctgttcccttgcttcctgcagctcctggccgggctggcgctgcctgctgtgcccccc cagcagtgggccttgtctgctgggaacggctcgtcagaggtggaagtggtacccttccaggaagtgtggggc cgcagctacmgclaaacctagagatacxgttgtttatttgggagaa¾aaxatcca¾aaagcac taacctaca
Figure imgf000025_0001
cggtggagacggccaatgtcaccatgcagctcctaaagatccgttctggggaccggccctcctacgtggagc tgacgttctctcagcacgttcgc[tgc|gaatgccggcctctgcgggagaagatgaagccggaaaggtgcggc gatgc tgttcc ccggaggtaa
#32 (配列番号 1 3 ) ： ヒト P1GFの第 4、 5システィン間のアミノ酸配列を、 対 応する VEGF- Eのァミノ酸配列と置換。
atgccggtcatgaggctgttcccttgcttcctgcagctcctggccgggctggcgctgcctgctgtgcccccc cagcagtgggccttgtctgctgggaacggctcgtcagaggtggaagtggtacccttccaggaagtgtggggc cgcagctac|tgc]cgggcgctggagaggctggtggacgtcgtgtccgagtaccccagcgaggtggagcacat gttcagcccatcc^gtlgtctccctgctgcgctgcaccggctgctgcggcgatgagaatctgcac|tgtlacag cggtt¾aaacaagaaatacaactgtaacagtttcagtaaccggcgtgtctagttcgtct¾gtactaata¾t¾ gtgtatctactaaccttcaaagaataa¾t txacagaacacacaaag|tgclgaatgccggcctctgcgggag aagatgaagccggaaaggtgcggcgaxgc tgttcc ccggaggtaa
#33 (配列番号 1 4 ) ： ヒト P1GFの第 2、 3システィン間のアミノ酸配列および 第 4、 5システィン間のアミノ酸配列を、対応する VEGF-Eのアミノ酸配列と置換。 cagcagtgggccttgtctgctgggaacggctcgtcagaggtggaagtggtacccttccaggaagtgtggggc
cggtt¾aaacaagaaatacaactgtaacagtttcagtaacc^gcgt¾tctagttcgtct¾gtactaata¾tg aagatgaagccggaaaggtgcggcgatgctgttccccggaggtaa 上記配列を有する D N A断片を常法の遺伝子組み換え技術により構築し、 実施 例 3に記載の方法と同様にして、 VEGF-Eキメラタンパク質 (#19〜 および #31 〜#33) を調製した。 実施例 8：キメラ VEGF-Eタンパク質（#19〜#27および #31〜#33) キメラ VEGF- E タンパク質の生理活性
実施例 7で調製した VEGF- Eキメラタンパク質（#19〜#27および #31〜 3) を 用いて、 KDR受容体への競合阻害実験 （方法は実施例 4と同様)、 KDR受容体の自 己リン酸化測定実験（方法は実施例 5と同様)、及び血管内皮細胞増殖実験（方法 は実施例 6と同様） を行った。
VEGF-Eキメラタンパク質 #19〜#27の構造、並びに KDR受容体の自己リン酸化測 定実験と血管内皮細胞増殖実験の結果の概要を図 1 2に示し、 KDR受容体への競 合阻害実験の測定結果を図 1 3に示し、 血管内皮細胞増殖実験の測定結果を図 1 4に示す。
VEGF-Eキメラタンパク質 #31〜#33の構造、並びに KDR受容体の自己リン酸化測 定実験と血管内皮細胞増殖実験の結果の概要を図 1 5に示し、 KDR 受容体への競 合阻害実験の測定結果を図 1 6に示し、 血管内皮細胞増殖実験の測定結果を図 1 7に示す。
図 1 2から図 1 4の結果から分かるように、 #24、 #25及び #27以外のキメラ夕 ンパク質はいずれも KDRに高親和性に結合し、 KDRの自己リン酸化を促進し、 血 管内皮細胞の増殖を刺激することが明らかとなった。従って、 VEGF- Eの両末端だ けでなく、 VEGF-Eの内部の一部の配列を P IGFなどのヒト由来タンパク質と置換 できることが明らかとなった。 - また、 図 1 5から図 1 7の結果から分かるように、 KDR受容体の自己リン酸ィ匕 能および血管内皮細胞増殖作用を示さないヒト P1GF の第 2及び第 3システィン 間のアミノ酸配列（ヒト のコア領域のループ 1を含む）および第 4及び第 5 システィン間のアミノ酸配列（ヒト P1GFのコア領域のループ 3を含む）を、対応 する VEGF-Eのアミノ酸配列 （それそれ、 VEGF-Eのコア領域のループ 1及びル一 プ 3を含む） と置換することにより得た #33は、 KDRの自己リン酸化を促進し、血 管内皮細胞の増殖を刺激することが明らかとなった。従って、 VEGF- Eの生理活性 の発現のためには、 コァ領域のループ 1及びループ 3が役割を担っている可能性 がある。 産業上の利用の可能性
本発明のキメラ VEGF-Eは、血管内皮細胞増殖活性を維持しつつ、抗原性が軽減 されているので、 安全な血管新生因子として利用できる。

Claims

請求の範囲
1 . KDR (VEGF受容体- 2) と結合するが F t - 1 (VEGF受容体- 1) とは結合し ない血管新生活性を有する VEGF類縁蛋白質の一部の配列を、 ヒト由来 VEGF類縁 蛋白質の対応する配列と置換することにより得られる、 血管内皮細胞増殖活性を 有するキメラ蛋白質。
2 . KDR (VEGF受容体- 2) と結合するが t - 1 (VEGF受容体- 1) .とは結合し ない血管新生活性を有する VEGF 類縁蛋白質のァミノ末端及び Z又はカルボキシ ル末端をそれそれヒト由来 VEGF 類縁蛋白質のァミノ末端及びノ又はカルボキシ ル末端と置換することにより得られる、 請求項 1に記載の血管内皮細胞増殖活性 を有するキメラ蛋白質。
3 . KDR (VEGF受容体- 2) と結合するが Fit - 1 (VEGF受容体- 1) とは結合 しない血管新生活性を有する VEGF 類縁蛋白質のァミノ末端の 1 0〜5 0ァミノ 酸残基をヒト由来 VEGF 類縁蛋白質のァミノ末端と置換するか、 及び/又は上記 VEGF 類縁蛋白質のカルボキシル末端の 1 0〜 5 0アミノ酸残基をヒト由来 VEGF 類縁蛋白質のカルボキシル末端と置換することにより得られる、 請求項 1に記載 のキメラ蛋白質。
4 . KDR (VEGF受容体- 2) と結合するが Fit - 1 (VEGF受容体- 1) とは結合し ない血管新生活性を有する VEGF類縁蛋白質の内部の一部の配列を、ヒト由来 VEGF 類縁蛋白質の対応する配列と置換することにより得られる、 請求項 1から 3に記 載の血管内皮細胞増殖活性を有するキメラ蛋白質。
5 . K皿（VEGF受容体- 2) と結合するが Flt - 1 (VEGF受容体- 1) とは結合 しない血管新生活性を有する VEGF類縁蛋白質の一部の配列を、少なくとも該 VEGF 類縁蛋白質のループ 1領域 （アミノ酸残基 4 7— 8 0 ) 及びループ 3 (アミノ酸 残基 8 9 - 1 3 2 )の配列が維持されるように、 ヒト由来 VEGF類縁蛋白質と置換 することにより得られる、 請求項 1から 4の何れかに記載の血管内皮細胞増殖活 性を有するキメラ蛋白質。
6 . DR (VEGF受容体 - 2) と結合するが Fit - 1 (VEGF受容体 - 1) とは結合 しない血管新生活性を有する VEGF類縁蛋白質が、 VEGF- Eフアミリーに属する蛋 白質である、 請求項 1から 5の何れか 1項に記載のキメラ蛋白質。
7 . KDR (VEGF受容体一 2) と結合するが Fit - 1 (VEGF受容体一 1) とは結合 しない血管新生活性を有する VEGF 類縁蛋白質が、 VEGF-ENZ-7 VEGF-ED 又は VEGF - ENZ_2である、 請求項 1から 6の何れか 1項に記載のキメラ蛋白質。
8 . ヒト由来 VEGF類縁蛋白質が PIGFである、 請求項 1から 7の何れかに記 載のキメラ蛋白質。
9 . KDR (VEGF受容体- 2) と結合するが Fit - 1 (VEGF受容体- 1) とは結合 しない血管新生活性を有する VEGF 類縁蛋白質のカルボキシル末端の 1 0 5 0 アミノ酸残基をヒト由来 VEGF類縁蛋白質のカルボキシル末端と置換することに より得られる、 請求項 1から 8の何れかに記載のキメラ蛋白質。
1 0 . KDR (VEGF受容体- 2) と結合するが Fit - 1 (VEGF受容体- 1) とは結 合しない血管新生活性を有する VEGF類縁蛋白質が、 VEGF- Eファミリーに属する 蛋白質であり、かつ該 VEGF-Eフアミリーに属する蛋白質におけるアミノ酸残基 4 7 - 8 0のループ 1領域、 及びアミノ酸残基 8 9 - 1 3 2のループ 3領域を実質 的に保持している、 請求項 1から 9の何れかに記載のキメラ蛋白質。
1 1 . 下記の何れかのアミノ酸配列を有するキメラ蛋白質。
(A) 配列番号 8 9又は 1 0に記載のアミノ酸配列；
( B ) 配列番号 8 9又は 1 0に記載にアミノ酸配列において 1から数個のアミ ノ酸が欠失、 置換及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、 かっ血管内皮 細胞増殖活性を有するアミノ酸配列；
( C ) 配列番号 8 9又は 1 0に記載のアミノ酸配列と 6 0 %以上の相同性を有 するアミノ酸配列からなり、 かっ血管内皮細胞増殖活性を有するァミノ酸配列。
1 2 . 下記の （A) から （F ) の何れかのアミノ酸配列、 下記の （A) から ( F ) の何れかのアミノ酸配列において 1から数個のアミノ酸が欠失、 置換及び
/または付加されたアミノ酸配列からなり、 かっ血管内皮細胞増殖活性を有する アミノ酸配列、 又は下記の （A) から （F ) の何れかのアミノ酸配列と 6 0 %以 上の相同性を有するァミノ酸配列からなり、 かっ血管内皮細胞増殖活性を有する アミノ酸配列を有するキメラ蛋白質。
(A) 配列番号 7に記載のアミノ酸配列において 5 4番目から 5 7番目のァミノ 酸配列 Tyr-Leu- Gly-Gluを Asp-Val-Val-Serへ置換したアミノ酸配列；
( B ) 配列番号 7に記載のァミノ酸配列において 6 2番目から 6 4番目のァミノ 酸配列 Ser-Thr- Asn を、 Glu- Va卜 Gluへ置換したアミノ酸配列；
( C ) 配列番号 7に記載のアミノ酸配列において 6 5番目から 6 8番目のァミノ 酸配列 Leu-Gln-Tyr- Asnを、 His- Met-Phe-Serへ置換したアミノ酸配列；
( D ) 配列番号 7に記載のアミノ酸配列において 3 7番目から 4 3番目のァミノ 酸配列 Trp-Met-Arg-Thr-Leu- Asp-Lysを、 Phe- Gln-Glu- Val-Trp- Gly-Argへ置換 したアミノ酸配列；
( E ) 配列番号 7に記載のアミノ酸配列において 4 7番目から 5 2番目のァミノ 酸配列 Lys-Pro- Arg- Asp- Thr-Valを、 Arg- Ala-Leu- Glu-Arg- Leuへ置換したアミ ノ酸配列；又は
( F ) 配列番号 7に記載のアミノ酸配列において 1 1 9番目から 1 2 2番目のァ ミノ酸配列 Leu- Gln-Arg- 1 leを、 Tyr- Va卜 Glu- Leuへ置換したアミノ酸配列。
1 3 . 下記の何れかのアミノ酸配列を有するキメラ蛋白質。
(A) 配列番号 1 5に記載のアミノ酸配列；
( B )配列番号 1 5に記載にアミノ酸配列において 1から数個のアミノ酸が欠失、 置換及び/または付加されたアミノ酸配列からなり、 かっ血管内皮細胞増殖活性 を有するアミノ酸配列；
( C ) 配列番号 1 5に記載のアミノ酸配列と 6 0 %以上の相同性を有するァミノ 酸配列からなり、 かっ血管内皮細胞増殖活性を有するァミノ酸配列。
1 4 . 請求項 1から 1 3の何れかに記載のキメラ蛋白質を含む医薬。
1 5 . 請求項 1から 1 3の何れかに記載のキメラ蛋白質を含む、 KDR (VEGF 受容体 - 2) 受容体活性化剤。
1 6 . 請求項 1から 1 3の何れかに記載のキメラ蛋白質を含む、 血管内皮細 胞増殖剤。
1 7 . 請求項 1から 1 3の何れか 1項に記載のキメラ蛋白質をコードする D NA。
1 8 . 請求項 1 7に記載の D N Aを含む発現ベクター。
1 9 . 請求項 1 8に記載の発現べクタ一を含む医薬。
2 0 . 請求項 1 8に記載の発現べク夕一を含む、 KDR (VEGF受容体- 2) 受容 体活性化剤。
2 1 . 請求項 1 8に記載の発現べクタ一を含む、 血管内皮細胞増殖剤。
2 2 . 請求項 1 8に記載の発現ぺク夕一を有する形質転換体。
2 3 . 請求項 2 2に記載の形質転換体を用いることを特徴とする、 請求項 1 から 1 3の何れかに記載のキメラ蛋白質を製造する方法。
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