JP3127246B2 - ポリペプチド，ｄｎａおよびその用途 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ヘパリンバインディング・セクレトリー・
トランスフォーミング・ファクター（以下、本明細書に
おいては「hst−１」と略称することもある。）の欠失
型ムテインおよびそれを製造するための技術に関する。

従来の技術 hst−１は、HSTF1と記載されることもある（M.Yoshid
aら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol.85,pp.4861−4864（1
988））。

hst−１遺伝子は、ヒト胃癌組織より単離されたトラ
ンスフォーミング遺伝子であり〔H.Sakamotoら,Proc.Na
tl.Acad.Sci.U.S.A.83:3997（1986）〕、その遺伝子産
物は細胞成長因子の１つである線維芽細胞成長因子（FG
F）と構造および生物活性が似ていることが判明した
〔T.Yoshidaら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83:7305（19
87）,K.Miyagawaら,Oncogene ３,383（1988）〕。ま
た、hst−１遺伝子は、胃癌のみならず大腸癌、肝癌、
エイズ患者のカポシ肉腫より分離されており〔T.Koda
ら,Jpn.J.Cancer Res.（Gann）78:325（1987）,H.Nakag
awaら,Jpn.J.Cancer Res.（Gann）78:651（1987）,Y.Yu
asaら,Jpn.J.Cancer Res.（Gann）78:1036（1987）,P.D
elli Boviら,Cell 50:729（1987）〕、この遺伝子は塩
基性FGF,酸性FGF,int−２遺伝子産物などと共にFGFファ
ミリーを形成すると考えられている。上記カポシ肉腫よ
り分離された遺伝子はＫ−FGFとも呼ばれている。この
ようにhst−１遺伝子が細胞成長因子の働きをもつトラ
ンスフォーミング遺伝子であることから、その遺伝子産
物はFGFと同様損傷の治療薬などの予防治療薬となる可
能性を持っている。

hst−１遺伝子の塩基配列は既に報告されており〔M.T
airaら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:2980（1987）,T.
Yoshidaら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84,7305（198
7）〕、同報告にはこれから推測されるhst−１の構成ア
ミノ酸も示されている。

しかし天然に存在するhst−１は極めて微量であると
考えられ、未だに生体材料よりhst−１を取得した報告
はない。

一方、hst−１の遺伝子組換え技術を用いた産生が報
告されている〔P.Delli Boviら,Cell 50:729（1987）お
よびK.Miyagawaら,Oncogene ３:383（1988）〕。しかし
これらの場合においても大量生産は非常に難しい。

発明が解決しようとする課題 上記のようにhst−１の性質、生物活性については不
明の点が多い。しかしhst−１は医薬品あるいは試薬と
して用いられる可能性が考えられる。

しかしながら、上記したように、これまでhst−１を
大量に生産できた例はない。

そこで本発明者らは組換えDNA技術を用い、このhst−
１をその活性に悪影響を及ぼさないが、微生物学的に大
量生産できるように改変することを考えた。このような
改変により、上記した細胞における産生能の上昇のみな
らずhst−１の安定性，分子当りの細胞増殖活性の上
昇、さらに未知の生物活性の賦活化がなされる可能性が
あることを考えた。

課題を解決するための手段 本発明者らは、組換えDNA技術により、hst−１遺伝子
の一部を欠失したムテイン遺伝子を作製し、微生物中で
発現されることにより、このhst−１ムテインの細胞内
での産性能、活性の上昇および生物活性の変化につき鋭
意研究し、これらを目的に叶うムテインを見い出した。
さらにこれらの知見に基づいて研究した結果、本発明を
完成した。

本発明は、 （１）、ヘパリンバインディング・セクレトリー・トラ
ンスフォーミング・ファクター（hst−１）の欠失型ム
テイン， （２）、上記（１）のムテインをコードをする塩基配列
を有する組換えDNA, （３）、上記（２）の組換えDNAを含むベクター， （４）、上記（３）のベクターを保持する形質転換体，
および （５）、上記（４）の形質転換体を培地に培養する上記
（１）のムテインの製造法である。

本発明の欠失型ムテインの基となるhst−１は、第１
図に示された175個のアミノ酸配列からなる蛋白質であ
る。

hst−１は、Tairaら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,298
0−2984（1987）においては、206個のアミノ酸配列から
なるものと示されている。該アミノ酸配列を第２図に示
す。しかしながら、Delli−Boviらは、Molecular and C
ellular Biology,８,2933−2941（1988）において、サ
ルCOS−１細胞で発現させる（目的物をＫ−FGFと称して
いる。）と、Ｎ末から30個あるいは31個のアミノ酸が脱
離されたものが得られることを示している。したがっ
て、hst−１の成熟タンパクとしては、上記206個のアミ
ノ酸配列のＮ末から31個のアミノ酸が脱離されたアミノ
酸配列（第１図に示す。）を有するものとするのが最も
妥当であると考えられる。

本発明の欠失型ムテインとしては、hst−１の構成ア
ミノ酸のうち少なくとも１個のアミノ酸が欠失してお
り、hst−１活性を有するものが挙げられる。

該欠失型ムテインとしては、hst−１の連続した構成
アミノ酸が１ないし47個欠失しているものが好ましく、
さらに、１ないし43個欠失しているものが好ましく、１
ないし27個欠失しているものが好ましい。

本発明の欠失型ムテインのさらに好ましい例として
は、上記欠失がＮ末端より連続した構成アミノ酸が欠失
しているものが挙げられる。

本発明の欠失型hst−１ムテインの化学構造は種々の
要因に負うことがある。たとえば、本ムテインは酸性
塩，塩基性塩または中性塩として得られることもある。
さらに、本ムテインは、糖鎖，脂質，アセチル基などが
付加した誘導体となっていてもよい。本発明のムテイン
は、hst−１の欠失型のものであって、上述の誘導体と
なっていてもよく、hst−１活性を有するものであれ
ば、本発明のムテインに含まれる。

本発明の欠失型hst−１ムテインの生物活性の測定
は、たとえば、佐々田らの方法（Mol.Cell Biol.８:588
−594（1988））に従い、マウスBALB/c3T3細胞のDNA合
成誘起を［³H］チミジンの取り込みを指標として測定す
ることにより、多田らの方法（Journal of Immunologic
al Methods,93,157（1986））に従い、血管内皮細胞の
増殖促進を測定することにより、またはAuerbachらの方
法（Developmental Biology,41,391（1974））に従い、
ニワトリ胚漿尿膜上の血管新生を測定することにより、
行なうことができる。

本発明のhst−１ムテインをコードする塩基配列を有
するDNAを含有する発現型ベクターは、例えば （イ）hst−１タンパクをコードするRNAを分離し、 （ロ）該RNAから単鎖の相補DNA（cDNA）を、次いで二重
鎖DNAを合成し、 （ハ）該相補DNAをプラスミドに組み込み、 （ニ）得られた組み換えプラスミドで宿主を形質転換
し、 （ホ）得られた形質転換体を培養後、形質転換体から適
当な方法、例えばDNAプローブを用いたコロニーハイブ
リダイゼーション法、により目的とするDNAを含有する
プラスミドを単離し、 （ヘ）そのプラスミドから目的とするクローン化DNAを
切り出し、 （ト）該クローン化DNA上に目的に叶う欠失を生じさ
せ、 （チ）場合によりATGコドンを含むオリゴヌクレオチド
を結合させ、 （リ）該DNAをビークル中のプロモーターの下流に連結
する、ことにより製造することができる。

hst−１をコードするRNAは、ヒトの種々の癌細胞、例
えば、胃癌，大腸癌，肝癌，カポシ肉腫，ヒト胚細胞性
腫瘍，ヒトhst−１遺伝子によるNIH3T3トランスフォー
マントなどから得ることができる。

ヒトの癌からRNAを調製する方法としては、グアニジ
ンチオシアネート法〔J.M.Chirgwinら，バイオケミスト
リー（Biochemistry），18 5294（1979）〕などが挙げ
られる。

このようにして得られたRNAを鋳型としてcDNAを合成
し、例えばWastonとJacksonの方法（Watson,C.J.and Ja
ckson,J.F.,DNAクローニング・ア・プラクティカル・ア
プローチ（DNA Cloning,A Practical Approach）IRL
Press,Oxford,p79,1985）に従って例えばλファージベ
クター λgt10（Huynh,T.V.ら,DNAクローニング・ア・
プラクティカル・アプローチ,IRL Press,Oxford,p49,19
85）に組みこみ、これを大腸菌，例えばC600,HflA（Huy
nh,T.V.ら，同上）に感染させ、cDNAライブラリーを作
成することができる。

このようにして得られたcDNAライブラリーより、自体
公知の方法、例えばプラーク・ハイブリダイゼーション
法（Maniatisら，モレキュラー・クローニング（Molecu
lar Cloning）Cold Spring Habor Laboratory,p320,198
2）およびDNA塩基配列決定法〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA
74,560（1977），ニュークレイック アシッズ・リサ
ーチ（Nuclueic Acids Research）９,309（1981）〕を
用い、求めるファージクローンを選出する。

次に、該ファージクローンを集め、例えばDavisらの
方法（Davisら，アドバンスト・バクテリアル・ジェネ
ティクス（Advanced Bacterial Genetics）、Cold Spri
ng Harbor Laboratory 1980）により、ファージDNAを抽
出して、そのcDNA部分を制限酵素を用いて切り出し、こ
れをプラスミド例えばpUC13等に組みこみ直して、使用
するのも好都合である。

上記クローン化されたhst−１をコードする塩基配列
を含有するDNAを有するプラスミドはそのまま、または
所望により制限酵素で切り出す。

クローン化された遺伝子は、発現に適したビークル
（ベクター）中のプロモーターの下流に連結して発現型
ベクターを得ることができる。

本発明のムテインを製造するためには、従来の組換え
DNA技術に加え、特定部位指向性変異誘発技術（Site−d
ireeted mutagenesis）が採用される。該技術は周知で
あり、アール・エフ・レイサー（Lather,R.F.）及びジ
ェイ・ピー・レコック（Lecoq.J.P.），ジェネティック
・エンジニアリング（Genetic Engineering）、アカデ
ミックプレス社（1983年）第31−50頁、に示されてい
る。オリゴヌクレオチドに指示された変異誘発はエム・
スミス（Smith,M.）及びエス・ギラム（Gillam,S.）、
ジェネティック・エンジニアリング：原理と方法、プレ
ナムプレス社（1981年）３巻 １−32頁に示されてい
る。

本発明のムテインをコードする構造遺伝子を製造する
ためには、たとえば、 （ａ）hst−１の構造遺伝子の１本鎖からなる１本鎖のD
NAを突然変異オリゴヌクレオチドプライマーと雑種形成
させる、 （ｂ）DNAポリメラーゼによりプライマーを伸長させ、
突然変異性ヘテロ二量体（heteroduplex）を形成させ
る、及び （ｃ）この突然変異性ヘテロ二量体を複製する。

オリゴヌクレオチドフライマーの大きさは、突然変異
を導入すべき遺伝子領域へのプライマーの安定な雑種形
成に必要な条件により、また現在利用可能なオリゴヌク
レオチド合成法の限界によって決まる。オリゴヌクレオ
チドで指示される突然変異誘発に使用するオリゴヌクレ
オチドを設計するに当たって、考慮すべき因子（例えば
全体の大きさ、突然変異サイトを迂回する部分の大き
さ）は、エム・スミス及びエス・ギラム（前掲）によっ
て記述されている。概して、オリゴヌクレオチドの全長
は、突然変異サイトでの安定でユニークな雑種形成を最
適化するような長さであり、突然変異サイトから５′及
び３′末端までの伸長部分（extensions）は、DNAポリ
メラーゼのエキソヌクレアーゼ活性による突然変異の編
集をさけるのに十分な大きさとする。本発明に従って突
然変異誘発に使用されるオリゴヌクレオチドは、通常、
約12個ないし約24個の塩基、好ましくは約14個ないし約
20個の塩基、更に好ましくは約14個ないし約18個の塩基
を含有する。これらは通常、変更されるコドンの少なく
とも約３個の３′側塩基を含有する。

hst−１構成アミノ酸が欠失しているムテインを得る
目的の場合における変異hst−１遺伝子を作る方法とし
ては、三つの場合が考えられる。ひとつはhst−１のア
ミノ末端を欠失させる場合、二つめはhst−１の中央部
分を欠失させる場合、三つにはhst−１のカルボキシル
末端を欠失させる場合である。

アミノ末端を欠失させる場合には欠失させようとする
アミノ酸配列のカルボキシル末端をコードする遺伝子の
コドンをMetをコードするATGに特性部位指向性変異法を
用いて変更し、さらにそのコドンの５′末端側に適当な
制限酵素の認識部位を生成せしめ、プロモーターとの連
結（ligation）を容易にさせるか、あるいは制限酵素で
アミノ末端を欠失させた遺伝子にATGをもつオリゴヌク
レオチドを読み取り枠を合わせて結合させる。

アミノ酸配列をその中央部分で失欠させる場合には欠
失させたい配列をコードする遺伝子の５′および３′末
端側にユニークな制限酵素の認識部位を特性部位指向性
変異性を用いて生成し、この部位を酵素によって消化し
て抜きとり、再連結によって遺伝子をもとにつなげば目
的のアミノ酸を欠失したhst−１をコードする遺伝子が
でき上る。このとき制限酵素消化により読み取り枠がず
れないようにすることは云うまでもない。

カルボキシル末端側のアミノ酸配列を欠失させる場合
には、欠失させたい配列のアミノ末端側のアミノ酸をコ
ードする遺伝子のコドンを特定部位指向性変異によって
ストップコドンに変更すればよい。

本発明の欠失型ムテインは、hst−１の構成アミノ酸
が欠失し、さらにその中の少なくとも１個のアミノ酸が
別のアミノ酸で置換されているものであってもよい。

置換される前の構成アミノ酸の例としては、システイ
ン，システイン以外のもの（例、アスパラギン酸，アル
ギニン）が挙げられる。

置換される前の構成アミノ酸がシステインである場合
には、置換されたアミノ酸としては、たとえば中性アミ
ノ酸が好ましい。該中性アミノ酸の具体例としては、た
とえば、グリシン，バリン，アラニン，ロイシン，イソ
ロイシン，チロシン，フェニルアラニン，ヒスチジン，
トリプトファン，セリン，スレオニン，メチオニンなど
が挙げられる。特に、セリン，スレオニンが好ましい。

置換される前の構成アミノ酸がシステイン以外のもの
である場合には、置換された別のアミノ酸としては、た
とえば、アミノ酸の親水性，疎水性あるいは電荷の点
で、置換される前のアミノ酸とは異なる性質をもつもの
を選ぶ。具体的には置換される前のアミン酸がアスパラ
ギン酸の場合には、置換されたあとのアミノ酸としてア
スパラギン，スレオニン，バリン，フェニルアラニン，
アルギニンなどが挙げられるが、特にアスパラギン，ア
ルギニンが好ましい。

置換される前のアミノ酸がアルギニンの場合には置換
されたあとのアミノ酸としてグルタミン，スレオニン，
ロイシン，フェニルアラニン，アスパラギン酸が挙げら
れるが、特にグルタミンが好ましい。

特定部位指向性変異により本発明のhst−１の欠失ム
テインを産生させる時に、DNA配列に複数個の変異を行
ってもよいこと、すなわち、アミノ酸に対応しているDN
Aのコドンは縮退していることを認識しておかなければ
ならない。

たとえば、構成アミノ酸がシステイン以外のアミノ酸
であってこれを他のアミノ酸に置換したムテインを得る
目的の場合における変異hst−１遺伝子を作る方法とし
ては、システインの場合と同様にして、オリゴヌクレオ
チドプライマーによるコドンの変更を行う。

ただしオリゴヌクレオチドプライマーのデザインはど
のアミノ酸を変更するかで異なることは云うまでもな
い。

プライマーは、hst−１遺伝子の１本鎖がクローン化
されたM13〔Yanisch−Prror,C.,Vieira,J.Messing,ジー
ン（Gene），33 103−119（1985）,Messing J.メソッ
ズ・イン・エンジーモロジー（Methods in Enzymolog
y），101 20−78（1983）〕,fd〔R.Herrman et al.
モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティック
（Mol.Gen.Genet,），177 231（1980）〕，又はφ×17
4〔M.Smith and S.Gillam,ジェネティック・エンジニ
アリング（Genetic Engineering）,Plenum Press,Vo
l.３,pp1−32（1981）〕のような１本鎖ファージへ雑種
形成される。ファージが遺伝子のセンス鎖、アンチセン
ス鎖のいずれでも運搬できることは認められる。ファー
ジがアンチセンス鎖を運搬する時には、別のアミノ酸を
暗号づけたトリプレットを決定するこのコドンとの不一
致以外にもプライマーは突然変異させるコドンを含有す
るセンス鎖の領域とコドンの縮退のために同一でない場
合があってもよい。同様にファージがセンス鎖を運搬す
る時には、欠失させるコドンと対合をつくるトリプレッ
ト中の適当な不一致以外は、突然変異させるコドンを含
有するセンス鎖の領域に対して相補的でない場合があっ
てもよい。雑種形成に使用される条件はエム・スミス及
びエス・ギラム（前掲）によって記述されている。温度
は通常、約０℃ないし70℃、もっと一般的には約10℃な
いし50℃の範囲にある。雑種形成後、プライマーは大腸
菌DNAポリメラーゼＩ、T4DNAポリメラーゼ、逆転写酵素
又は他の適当なDNAポリメラーゼとの反応によってファ
ージDNA上で伸長される。生ずるdsDNAは、T4DNAリガー
ゼのようなDNAリガーゼでの処理によって閉鎖環dsDNAへ
変換される。１本鎖領域を含有するDNAB分子はS1エンド
ヌクレアーゼ処理によって破壊できる。

生ずる突然変異形成ヘテロ二量体は、被感染能力をも
つ宿主生物又は細胞を形質転換するのに使用される。宿
主によるヘテロ二量体の複製では、双方の鎖から子孫が
できる。複製に続いて、突然変異株の鎖の子孫から突然
変異株遺伝子を単離し、適当なベクターへ挿入し、この
ベクターを適当な宿主生物又は細胞の形質転換に使用す
る。

次に、突然変異化された遺伝子を運搬するファージDN
Aを単離し、プラスミドへ組み込む。

DNAを組み込むプラスミドとしては、たとえば大腸菌
由来のpBR322［ジーン（gene），２,95（1977）］,pBR3
25［ジーン，４,121（1978）］,pUC12［ジーン，19,259
（1978）］,pUC13［ジーン，19,259（1982）］、枯草菌
由来のpUB110［バイオケミカル・バイオフィジカル・リ
サーチ・コミュニケーション（Biochemical and Biop
hysical Research Communication），112,678（198
3）］などが挙げられるが、その他のものであっても、
宿主内で複製保持されるものであれば、いずれをも用い
ることができる。

プラスミドに組み込む方法としては、たとえば、T.Ma
niatisら，モレキュラー・クローニング（Molecular C
loning）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー（Cold Spring Harbor Laboratory），第239頁（1
982）に記載の方法などが挙げられる。

クローン化された遺伝子は、発現に適したビークル
（ベクター）中のプロモーターの下流に連結して発現型
組換えベクターを得ることができる。

組換えベクターを作成するためのビークル（ベクタ
ー）としては、たとえば大腸菌由来のプラスミドpBR32
2,［ジーン（gene），２,95（1977）］,pBR325［ジー
ン，４,121（1978）］,pUC12［ジーン,19,259（198
2）］,pUC13［ジーン，19,259（1982）］、枯草菌由来
のpUB110［バイオケミカル・バイオフィジカル・リサー
チ・コミュニケーション（Biochemical and Biophysica
l Research Communication），112,6678（1983）］,pTP
5,pC194），酵母由来プラスミド（例、pSH19,pSH15），
あるいはλファージなどのバクテリオファージおよびレ
トロウイルス，ワクシニアウイルスなどの動物ウイルス
などがあげられる。

該遺伝子はその５′末端に翻訳開始コドンとしてのAT
Gを有し、また３′末端には翻訳終止コドンとしてのTA
A、TGAまたはTAGを有していてもよい。さらに該遺伝子
を発現させるにはその上流にプロモーターに接続する。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発
現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであれば
いかなるものでもよい。

また、形質転換する際の宿主がエシェリヒア属菌であ
る場合は、trpプロモーター,lacプロモーター,rec Aプ
ロモーター，λpLプロモーター,lppプロモーター,T7プ
ロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、
SPO1プロモーター,SPO2プロモーター,penPプロモーター
など、宿主酵母である場合は、PHO5プロモーター,PGKプ
ロモーター,GAPプロモーター,ADHプロモーターなどが好
ましい。とりわけ宿主がエシェリヒア属菌でプロモータ
ーがtrpプロモーターまたはT7プロモーターであること
が好ましい。

宿主が動物細胞である場合には、SV40由来のプロモー
ター、レトロウイルスのプロモーターなどが挙げられ、
とりわけSV40由来のプロモーターが好ましい。

このようにして構築されたDNAを含有するベクターを
用いて、形質転換体を製造する。

宿主としては、たとえばエシェリヒア属菌，バチルス
属菌，酵母，動物細胞などが挙げられる。

上記エシェリヒア属菌の例としては、エシェリヒア・
コリ（Escherichia coli）K12DH1［Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA,60,160（1968）］,M103［ヌクレイック・アシッ
ズ・リサーチ，（Nucleie Acids Research）９,309
（1981）］,JA221［ジャーナル・オブ・モレキュラー・
バイオロジー（Journal of Molecular Biology）12
0,517（1978）］,HB101［ジャーナル・オブ・モレキュ
ラー・バイオロジー，41,459（1969）］,C600［ジェネ
ティックス（Genetics），39,440（1954）］などが挙げ
られる。

上記バチルス属菌としては、たとえばバチルス・サチ
ルス（Bacillus subtilis）MI114［（ジーン，24,255
（1983）］,207−21［ジャーナル・オブ・バイオケミス
トリー（Journal of Biochemistry）95,87（1984）］
などが挙げられる。

上記酵母としては、たとえばサッカロイマイセス セ
レビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）AH22R^-,NA87
−11A,DKD−5Dなどが挙げられる。

動物細胞としては、株化したもの（cell line）が好
ましく、たとえばサル細胞COS−７［セル（cell），23,
157（1981）］,Vero,チャイニーズハムスター細胞CHO,
マウスＬ細胞，ヒトFL細胞などが挙げられる。

上記エシェリヒア属菌を形質転換するには、たとえば
Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69,2110（1972），ジーン，1
7,107（1982）などに記載の方法に従って行なわれる。

バチルス属菌を形質転換するには、たとえばモレキュ
ラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecu
lar ＆ General Genetics），168,111（1979）など
に記載の方法に従って行なわれる。

酵母を形質転換するには、たとえばProc.Natl.Acad.S
ci.USA 75;1929（1978）に記載の方法に従って行なわ
れる。

動物細胞を形質転換するには、たとえばヴィロロジー
（Virology）52,456（1973）に記載の方法に従って行な
われる。

このようにして、hst−１の欠失型ムテインcDNAを含
有するベクターで形質転換された形質転換体が得られ
る。

宿主がエシェリヒア属菌，バチルス属菌である形質転
換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体
培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必
要な炭素源，窒素源，無機物その他が含有せしめられ
る。炭素源としては、たとえばグルコース，デキストリ
ン，可溶性澱粉，ショ糖など、窒素源としては、たとえ
ばアンモニウム塩類，硝酸塩類，コーンスチープ・リカ
ー，ペプトン，カゼイン，肉エキス，大豆粕，バレイシ
ョ抽出液などの無機または有機物質，無機物としてはた
とえば塩化カルシウム，リン酸二水素ナトリウム，塩化
マグネシウムなどがあげられる。また、酵母エキス，ビ
タミン類，生長促進因子などを添加してもよい。

培地のpHは約６〜８が望ましい。

エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例え
ばグルコース、カザミノ酸を含むM9培地［Miller,ジャ
ーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー
・ジェネティックス（Journal of Experiments in
Molecular Genetics）,431−433,Cold Spring Harbo
r Laboratory,New York 1972）］が好ましい。ここ
に必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、
たとえば３β−インドリル アクリル酸のような薬剤を
加えることができる。

宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約15〜43
℃で約３〜24時間行い、必要により、通気や撹拌を加え
ることもできる。

宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約30〜40℃で
約６〜24時間行ない、必要により通気や撹拌を加えるこ
ともできる。

宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地とし
ては、たとえばバークホールダー（Burkholder）最小培
地［Bostian,K.L.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,4505
（1980）］が挙げられる。培地のpHは約５〜８に調整す
るのが好ましい。培養は通常約20℃〜35℃で約24〜72時
間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。

宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地
としては、MEM培地［サイエンス（Science）122,501（1
952）］,DMEM培地［ヴィロロジー（Virology），８,396
（1959）］,RPMI1640培地［ジャーナル・オブ・ザ・ア
メリカン・メディカル・アソシエーション（The Journ
al of the American Medical Association）199,5
19（1967）］,199倍地［プロシーディング・オブ・ザ・
ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディス
ン（Proceeding of the Society for the Biolog
ical Medicine）73,1（1950）］などが挙げられる。こ
れにさらに約５〜20％の胎児牛血清を添加しても良い。
pHは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約30〜40
℃、培養時間は約15〜60時間行い、必要に応じて通気や
撹拌を加える。

上記培養物からhst−１欠失型ムテインを分離精製す
るには、例えば下記の方法により行うことができる。

hst−１の欠失型ムテインを培養菌体あるいは細胞か
ら抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体ある
いは細胞を集め、これを塩酸グアニジンなどの蛋白質変
性剤を含む緩衝液に懸濁して菌体外に目的の蛋白を溶出
させる方法、フレンチプレス、超音波、リゾチームおよ
び（または）凍結融解によって菌体あるいは細胞を破壊
したのち、遠心分離によりhst−１の欠失型ムテインを
得る方法などが適宜用い得る。とりわけ、リゾチームと
超音波処理を併用する方法が好ましい。

上記上澄液からhst−１の欠失型ムテインを精製する
には、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行
なうことができる。これらの公知の分離、精製法として
は、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透
析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびSDS−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を
利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷
電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフ
ィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体
クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、
等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法など
が挙げられる。

さらに具体的には、上記上澄液をDEAEセルロースなど
を担体としたイオン交換クロマトグラフィーにかけるこ
とにより、夾雑する核酸や酸性蛋白質等を除くことがで
きる。たとえば、中性附近のトリスなどの緩衝液で平衡
化したDEAEセルロースカラムに上澄液をかけ、素通り画
分を集めることは有効である。また、さらにCMセルロー
スなどを担体としたイオン交換クロマトグラフィーにか
けることにより、hst−１の欠失型ムテインを担体に吸
着させ、塩溶液を用いてこれを溶出させることにより精
製することができる。

CMセファデックス等の酸性樹脂のカラムクロマトグラ
フィーにより、菌体抽出液から直接、hst−１の欠失型
ムテインを精製することができる。たとえば、上清液
を、弱酸性緩衝液（例、リン酸緩衝液）で平衡化したCM
−セルロースカラムにかけることにより、効率良く行な
うことができる。カラムを同じ緩衝液で洗浄後、カラム
を、塩（例、NaCl）をさらに含有する緩衝液を用いて溶
出することにより、hst−１の欠失型ムテインを溶出さ
せることができる。これらの溶出液は透析後、凍結乾燥
することができる。

また、ヘパリン−セファロースを担体としたアフィニ
ティークロマトグラフィー法を、hst−１の欠失型ムテ
インの精製法として、大腸菌抽出液中のhst−１の欠失
型ムテインにも適用すると好都合である。たとえば中性
附近のトリス，リン酸などの緩衝液で平衡化したヘパリ
ン・セファロースカラムに、上記溶出液をかけ、十分洗
った後、NaClなどの直線勾配溶出を行うことによりhst
−１の欠失型ムテインを精製することができる。

特に、高速液体クロマトグラフィー用に開発されたヘ
パリンカラム（たとえばShodex AF−pak HR・894,昭和
電工製など）は有効である。

上記ヘパリンセファロースカラムと同様に、中性附近
の緩衝液でサンプルをかけ、十分洗ったのちNaClなどの
直線勾配溶出を行うと、hst−１の欠失型ムテインはほ
ぼ均一な標品として回収することができる。

この様にして得られた標品は透析、凍結乾燥を行い、
乾燥粉末とすることもできる。さらに、担体として血清
アルブミンなどを添加して保存することは、標品の容器
への吸着を防ぐことができ好適である。

また、精製過程、あるいは保存過程での微量の還元剤
の共存は、該標品の酸化を防ぐのに好適である。還元剤
としてはβ−メルカプトエタノール，ジチオスレイトー
ル，グルタチオンなどが挙げられる。

このようにして、実質的にパイロジエンもエンドトキ
シンも含まない、実質的に純粋なhst−１の欠失型ムテ
インが得られる。本発明の実質的に純粋なhst−１の欠
失型ムテインとしては、蛋白質含量としてhst−１の欠
失型ムテインが95％（w/w）以上であるもの、さらに好
ましくはhst−１の欠失型ムテインが98％（w/w）以上で
あるものが挙げられる。該ポリペプチドはそのＮ末端に
Metを有していてもよい。

かくして生成するhst−１の欠失型ムテインの活性
は、公知のBALBA/c3T3細胞の増殖促進効果などにより測
定することができる。

本発明のDNAで遺伝子感染または形質転換した細胞で
は、本来わずかのhst−１の欠失型しか合成されない、
あるいは全く合成されない各種細胞においても大量のhs
t−１の欠失型ムテインを産生せしめることができ、hst
−１の欠失型ムテインを有利に導くことができる。

本発明のhst−１の欠失型ムテインをコードする遺伝
子を含有する発現型プラスミドは、これを各種細胞に導
入することにより該細胞にhst−１の欠失型ムテインを
産生させることができるため、hst−１の欠失型ムテイ
ンを大量に取得することができる。

ここに製造されるhst−１の欠失型ムテインは、血管
内皮細胞などの細胞の増殖促進活性や血管新生促進作用
を有し、毒性は低いので、火傷，創傷，術後組織などの
治癒促進剤などの治療薬として用いることができる。ま
た、細胞培養を促進させるための試薬として用いること
ができる。

本発明のhst−１の欠失型ムテインを医薬として用い
るには、そのまま粉末として、または他の薬理学的に許
容されうる担体，賦形剤，希釈剤とともに医薬組成物
（例、注射剤，錠剤，カプセル剤，液剤，軟膏）とし
て、温血哺乳動物（例、ヒト，マウス，ラット，ハムス
ター，ウサギ，犬，ネコ）に対して非経口的または経口
的に完全に投与することができる。

注射剤の製剤化はたとえば生理食塩水またはブドウ糖
やその他の補助薬を含む水溶液を用い、常法に従って行
なわれる。錠剤，カプセル剤等の医薬組成物を常法に従
って調製しうる。さらに、医薬組成剤としての注射剤，
液剤，錠剤，カプセル剤等を製造する際には、無菌条件
下で行なう。

本発明のhst−１の欠失型ムテインを上記した医薬と
して用いる場合には、たとえば上記した温血動物に、投
与ルート，症状などを考慮して、１日量約1ngないし100
μg/kgの中から適当量を選んで投与される。

また、本発明のhst−１の欠失型ムテインを細胞培養
を促進させるための試薬として用いる場合、培地１あ
たり約0.01〜10μｇ、さらに好ましくは約0.1〜10μｇ
となるように培地に加えることが好ましい。

本発明のムテインは、すぐれた細胞増殖促進活性など
を示し、また酸性条件下で安定であるので、潰瘍たとえ
ば消化管の潰瘍症の治療薬としても用いることができ
る。

本発明明細書および図面において、塩基やアミノ酸な
どを略号で表示する場合、IUPAC−IUB Commision on
Biochemical Nomenclatureによる略号あるいは当該
分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下
記する。また、アミノ酸に関し光学異性体がありうる場
合は、特に明示しなければＬ−体を示すものとする。

DNA :デオキシリボ核酸 cDNA:相補的デオキシリボ核酸 A :アデニン T :チミン G :グアニン C :シトシン RNA :リボ核酸 dATP:デオキシアデノシン三リン酸 dTTP:デオキシチミジン三リン酸 dGTP:デオキシグアノシン三リン酸 dCTP:デオキシシチジン三リン酸 ATP :アデノシン三リン酸 Tdr :チミジン EDTA:エチレンジアミン四酢酸 SDS :ドデシル硫酸ナトリウム Gly :グリシン Ala :アラニン Val :バリン Lcu :ロイシン Ile :イソロイシン Ser :セリン Thr :スレオニン Cys :システイン Met :メチオニン Glu :グルタミン酸 Asp :アスパラギン酸 Lys :リジン Arg :アルギニン His :ヒスチジン Phe :フェニールアラニン Tyr :チロシン Trp :トリプトファン Pro :プロリン Asn :アスパラギン Gln :グルタミン 後述の実施例で得られた形質転換体は、財団法人発酵
研究所（IFO）に寄託され、また、通商産業省工業技術
院微生物工業技術研究所（FRI）にブダペスト条約に基
づく寄託として寄託されている。受託番号および受託日
を次の第１表に示す。

以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明す
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。

以下の実施例で得られたＮ末端よりアミノ酸番号27ま
でが欠失したムテインをhst−１ムテインN27と称し、そ
のアミノ酸配列を第３図に示す。

実施例１ ａ） 発現プラスミドの構築 ヒトhst−1cDNAを含むプラスミドpKOc5（Proc.Natl.A
cad.Sci.USA 84,2980−2984（1937））をHind IIIで切
断し、E.coli DNAポリメラーゼＩ Klenow断片反応によ
り平滑化した。ここにBamH IリンカーをT4リガーゼ反応
により連結したのち、BamH I−Sty Iで切断して0.49kbD
NA断片を得た。合成オリゴヌクレオチド５′TATGCCGGTG
GCAGCGCAGCC3′および５′CTTGGGCTGCGCTGCCACCGGCA3′
を上記0.49kbDNAの５′末端側に連結して得られたP.51k
b Nde I−BamH I DNA断片（開始コドンATG,ヒトhst−
１ cDNAのヌクレオチドNo.413〜916を含む）を、T4フ
ァージのφ10プロモーターを有する大腸菌用発現ベクタ
ーpET3c（Gene 53,125−135（1987））のNde I−BamH I
間に組み込んでpTB1051を得た（第４図）。

ｂ） cDNAの大腸菌での発現 大腸菌MM294株にT7ファージのRNAポリメラーゼ遺伝子
を組み込んだλファージDE3（Studier,F.W.らJ.Mol.Bio
l.189:113−130（1986））を溶原化させ、さらにT7ファ
ージのリゾチーム遺伝子をもつプラスミドpLysS（Studi
er,F.W.らJ.Mol.Biol.189:113−130（1986））を導入
し、大腸菌MM294（DE3）/pLysS株を作製した。

上記（ａ）で得られたプラスミドpTB1051を、この大
腸菌MM294（DE3）/pLysS株に導入し、大腸菌MM294（DE
3）/pLysS,pTB1051（IFO 14952,FERM BP−2621）を作
製した。この菌を10μg/mlクロラムフェニコール,35μg
/mlアンピシリンを含むＬ培地で培養し、Klett値が約12
0の時点で、イソプロピルβ−Ｄチオガラクトピラノシ
ド（IPTG）を最終濃度が0.4mMになるように加え更に４
時間培養を継続した。菌体を遠心により集め、氷冷した
フォスフェートバッファードセライン（PBS）で洗った
後、再修菌し使用時まで−20℃に保存した。

ｃ） 組換え型hst−１ムテインの精製 10 liter培養から集めた菌体を250mlの氷冷10mM Tri
s−HCl（pH7.4）,10mM EDTA,0.5M NaCl,10％ショ糖,1mM
PMSFに懸濁し、卵白リゾチームを0.5mg/mlとなるよう
に添加した。１時間氷中に放置後37℃で５分間インキュ
ベートし、氷冷下で超音波処理（20秒間,2回）を行い、
遠心（SORVALL,18Krpm,30min,4℃）して上清を得、これ
を菌体抽出液とした。

菌体抽出液250mlを20mM Tris−HCl pH7.6,0.5M NaCl
溶液で平衡化したＱセファロース（ファルマシア）カラ
ム（径５×5cm）に通し、抽出液中の核酸成分を除去し
た。カラムからの素通り液および20mM Tris−HCl,pH7.
6,0.5M NaCl溶液でのカラム洗液を合わせて集めた（Ｑ
セファロース素通り画分450ml）。この画分をヘパリン
カラムShodex AF−pak HR−2094,（2cm ID×25cm,昭和
電工製）を装備した高速液体クロマトグラフィー装置
（ギルソン社）にかけた。カラムを、20mM Tris−HCl p
H7.6溶液，次いで20mM Tris−HCl pH7.6,0.5M NaCl溶液
で洗った後、20mM Tris−HCl pH7.6,バッファー中、0.5
Mから2MのNaClの直線勾配溶出（linear gradient eluti
on,180min,流速6.0ml/min）を行った。

溶出パターンを第５図に示す。第５図において、縦軸
はOD₂₈₀の吸収値、およびグラジエント中のNaCl濃度を
示している。横軸はフラクション番号を示しており、ti
me0でグラジエント溶出を開始した。0.75分毎の画分を
分取した。これらの蛋白質の比活性、及びhst−１ムテ
イン回収量を第２表に示した。また、ピークを与えた各
フラクションのSDS−PAGE（12.5％ポリアクリルアミド
ゲル）を第６図に示した。

ｄ） 逆相C4HPLC ヘパリンHPLCカラムの溶出画分＃56の約半量（タンパ
ク300μｓ）を逆相C4カラム（VYDAC）にアプライし、0.
1％TFA存在下に０％から90％アセトニトリルの直線的濃
度勾配をかけ溶出パターンを調べた。流速1ml/min.、勾
配時間60分で行った（第７図）。36〜37分に検出された
ピーク画分のSDS−PAGE（12.5％ポリアクリルアミドゲ
ル）をヘパリンカラムからの溶出画分56と共に第８図に
示す。

なお、第８図において、１は分子量マーカー（50ng）
の、２はヘパリンHPLCカラムより溶出されたフラクショ
ン56（50ng）の、３はヘパリンHPLCカラムより溶出され
たフラクション56（100ng）の、４は逆相HPLC溶出画分
（50ng）の、５は逆相HPLC溶出画分（100ng）の12.5％
ポリアクリルアミドゲル電気泳動のパターンをそれぞれ
示す。また、これらの蛋白の比活性は組換え型ヒトbFGF
（rhbFGF）（ヨーロッパ特許公開第237,966号公報）を
1.00とした場合0.43と測定された。これら精製過程の比
活性の変化、およびhst−１ムテインN27の回収量を第３
表に示した。なお、第３表において、比活性は、ウシ脳
下垂体由来FGF（宝酒造製）の活性を１とした。

このようにして、第３図に示すアミノ酸配列を有する
hst−１ムテインN27を得た。

ｅ） 生物活性 hst−１ムテインの活性は佐々田らの方法（Sasadaら,
Mol.Cell Biol.８:588−594（1988））に従い、マウスB
ALB/c3T3細胞のDNA合成誘起を［³H］チミジンの取り込
みを指標として測定した。結果を上述の第２表に示し
た。

実施例２ （血管内皮細胞増殖の促進） 実施例１で得られたhst−１ムテインN27について、細
胞の増殖におよぼす作用について以下のように測定を行
なった。本検定に用いられた細胞は、ヒト臍帯より単離
された静脈血管内皮細胞（以下HUVE細胞）である。ま
た、細胞増殖度の測定には以下に述べるMTTアッセイ法
を用いた。MTTアッセイの手法は多田らの方法［ジャー
ナル オブ イムノロジカル メソッド（J.Immunol.Me
thods）、93、157（1986）］に若干の変更を加えた。即
ち、継代維持されているHUVE細胞を0.002％EDTA（同仁
化学株式会社製,345−01882）を含む0.125％トリプシン
酵素溶液（ベーリンガーマンハイム社製）を用いて単一
細胞に解離し、得られた細胞を、牛胎児血清（ウイタカ
ーバイオプロダクト社製）を2.5％含む、GIT培地（日本
製薬製,398−00515）からなるHUVE細胞培地に懸濁し
た。この細胞懸濁液に含まれる細胞数をコールター細胞
数計測機（コールター社,ZM型）を用いて算出し、以下
の培養に供した。２×10³個のHUVE細胞を含む100μの
HUVE細胞懸濁液を96穴培養皿（ヌンク社,F96）に加え、
37℃で培養した（日立炭酸ガス−窒素ガス制御培養機CH
−16型、CO₂:5％、O₂:7％）。培養翌日に、各々のサン
プルを、HUVE細胞培地を用いて調製し、それぞれ100μ
ずつを、96穴培養皿で培養されたHUVE細胞に加えた。
検定に用いたサンプルは、hst−１ムテインN27を終濃
度、0.004ng/mlから2.0ng/mlになるよう調製されたもの
を用いた。上記hst−１ムテインN27にたいして、さら
にヘパリン（シグマ社製）を終濃度5.0μs/mlになるよ
うに添加したものである。各サンプルを加えたのち、さ
らに培養を３日間行ない、培養皿より培地を除し、1.0m
g/mlのMTT試薬（同仁化学株式会社製,34101823）を含む
HUVE培地を100μ加え、37℃で４時間保温した。その
後、10％SDS水溶液（和光純薬工業製,191−07145）を10
0μを加え、４時間保温を続けた。反応終了の後、反
応後を含む96穴培養皿を振盪し、反応液の波長590nmに
おける吸収を、マイクロタイタープレート吸光度測定機
（タイターテック社製,MCC341）を用いて測定した。得
られた結果を第９図に示す。

第９図において、横軸は、血管内皮細胞の培養液に加
えたhst−１ムテインN27の濃度を示す。縦軸は培養終了
の後、MTT試薬を加えて反応させ、SDS溶液で反応産物を
可溶化させた後に測定された溶液の波長590nmにおける
吸光度であり、その量は細胞量に対応する。hst−１ム
テインN27単独を添加した場合を■の実線で示し、各濃
度のhst−１ムテインN27にヘパリンを加えた場合を●の
破線で示した。このように、hst−１ムテインN27は、検
討した濃度の範囲で、それ単独ではHUVE細胞にたいする
細胞増殖促進の活性を示さず、5.0μg/mlのヘパリンと
共存させた場合には、HUVE細胞の増殖を促進した。

実施例３ （CAMアッセイ） 実施例１で得られたhst−１ムテインN27についてCAM
（Chorio Allantoic Membrane）アッセイを行なった。C
AMアッセイの手法はオウルバッハ（Auerbach）の方法
［デベロプメンタル・バイオロジー（Developmental Bi
ology），41,391（1974）］に若干の変更を加えた。即
ち、ニワトリ有精卵を３日間37℃のふ卵器中でインキュ
ベートしたのち、卵殻をはずし、さらに１週間37℃でイ
ンキュベートした（ナプコ炭酸ガスインキュベーター63
00使用、CO₂:0％,H₂O飽和）。直径6mmのポリプロピレン
製デイスクに、種々の濃度のhst−１ムテインN27溶液
（hst−１ムテインN27を20mMトリス塩酸（pH7.4）、1.0
M NaClの組成からなる緩衝液に溶解したもの）を、200n
g、50ngになるようにスポットし、クリーンベンチ内で
風乾した後、ニワトリ漿尿膜（CAM）上に静置してさら
に３日間37℃でインキュベートし、血管形成の状況を観
察した。また、hst−１ムテインN27溶液に、ヘパリン
（シグマ社製）水溶液を、10μｇになるようにスポット
したもの、さらに対照としてhst−１ムテインN27を含ま
ずにウシ血清アルブミン（シグマ社製）を等量含む溶液
をスポットし、同様に風乾した後、漿尿膜上に静置した
ものを作製した。得られた結果を第４表に示す。hst−
１ムテインN27 200ngでは単独で血管新生がみられた。
ヘパリンを併用した場合には、hst−１ムテインN27 20
0ngだけでなく、50ngでも血管新生がみられた。しかし
緩衝液のみ、およびヘパリン単独では血管新生は殆どみ
られなかった。

実施例４ （アミノ酸組成） 実施例１−ｄ）で得られたhst−１ムテインN27の精製
蛋白質（14μｇ）をガラス製加水分解用試験管にとり、
200倍量（v/w）の、４％チオグリコール酸を含む定沸点
塩酸を加えて減圧下に封管したのち、110℃で24時間加
水分解した。加水分解後、開管し、塩酸を減圧下で除去
し、残渣を0.02N塩酸に溶解して日立製作所製835型高速
アミノ酸分析計によりアミノ酸分析を行った。なお、シ
スチンおよびシステインは計測していない。各アミノ酸
の残基数を算出し、その結果を第５表に示した。

第５表に示したアミノ酸の残基数は、cDNAの塩基配列
より推定されるhst−１ムテインN27のアミノ酸組成とき
わめてよく一致した。

実施例５ （アミノ末端部のアミノ酸配列とカルボキシ
ル末端のアミノ酸残基） 実施例１−ｄ）で得られたhst−１ムテインN27の精製
蛋白質28μｇについて気相プロテインシークエンサー
（Applied Biosystems Inc.製，モデル470A）を用い
て、Ｎ末端部のアミノ酸配列分析を行った。生成したフ
ェニルチオヒダントイン−アミノ酸（PTH−アミノ酸）
はMicropak sp−Ｃ−18−３カラムを用い、バリアン製
高速液体クロマトグラフで同定、定量した。その結果を
第６表に示した。この結果より、hst−１ムテインN27の
アミノ末端部のアミノ酸配列は発現プラスミドのDNAの
塩基配列より期待される配列と一致した。なお翻訳開始
コドンに由来するメチオニンは除去されていることがわ
かった。

またカルボキシル末端のアミノ酸残基をヒドラジン分
解法により検討した結果、cDNA配列から予測されるロイ
シンが検出された。

実施例６ （精製hst−１ムテインN27のDNA合成誘起活
性） 先の実施例１−ｃ）で得られた精製hst−１ムテインN
27のカラムBALB/c3T3細胞に対するDNA合成誘起活性を、
実施例１−ｅ）に記載の方法により検討し、結果を第10
図に示した。

第10図において、−□−はウシ脳下垂体由来FGFの結
果を、−○−はhst−１ムテインN27の結果を、−△−は
ヘパリン（50μg/ml）存在下におけるhst−１ムテインN
27の結果を、それぞれ示す。第10図より、hst−１ムテ
インN27はウシ脳下垂体由来FGF（宝酒造製）と同様の活
性を有し、またヘパリン依存性を示さないことが判明し
た。

実施例７ （精製hst−１ムテインN27の細胞増殖促進活
性） ５％FCS（MBA製）を加えたDMEM培地（Flow社製）でBA
LB/c3T3細胞をリンブロディッシュ（Flow社製）にま
き、翌日、0.5％FCSを加えたDMEM培地で液交換し、同時
にサンプルを添加した、３日後の細胞数を計測し、第11
図に示した。

第11図において、−●−はhst−１ムテインN27の結果
を、 はヘパリン（50μg/ml）存在下におけるhst−１ムテイ
ンN27の結果を、それぞれ示す。第11図より、hst−１ム
テインN27は細胞増殖促進活性を有すること、またこの
活性は、ヘパリン添加により増強されることがわかっ
た。

実施例８ （酸性条件下における安定性） 実施例１−ｃ）で得られたhst−１ムテインN27（１μ
g/ml）およびrhbFGFをそれぞれpH4.0,37℃におき、経時
的に残存活性を実施例１−ｅ）の方法により測定し、結
果を第12図に示した。

第12図において、−○−はhst−１ムテインN27の結果
を、 はbFGFの結果を、それぞれ示す。また、第12図ではイン
キュベーション開始時の活性を100％として表わした。
この結果からhst−１ムテインN27は酸性条件下でbFGFよ
り安定であることがわかった。

実施例９ （hst−１ムテインN27のトランスフォーミン
グ活性） hst−１ムテインN27 10ng/mlをマウスBALB/c3T3 A1
細胞に添加して培養するとトランスフォーム細胞様の顕
著な形態変化が認められた。また同時にヘパリン（25μ
g/ml）を添加した場合には、hst−１ムテインN27 1ng/
mlで同様の形態変化が認められた。

さらに、hst−１ムテインN27は、軟寒天培地でのコロ
ニー形成活性を有することが明らかになった。すなわ
ち、リンブロデイッシュを用い0.5％寒天（バクトアガ
ー,Difco社）を含む10％FCS−DMEM培地0.5mlの上に、BA
LB/c3T3 A31細胞10³個を懸濁した0.3％寒天培地を重層
した。このとき、hst−１ムテインN27 100〜1000ng/ml
を寒天培地に添加してCO₂インキュベーターにて培養す
ると、約２週間後に0.5〜１×10^-2の頻度で、コロニー
形成が観察された。

実施例10 （bFGFと受容体の結合にたいする作用） 本発明のhst−１ムテインN27は、bFGFと相同性が高
い。bFGFは、いくつかの細胞株にその受容体が存在し、
その細胞増殖活性が発現される。bFGFが、細胞のもつそ
の受容体に結合するのを、本発明のhst−１ムテインN27
が阻害するか否か検討した。bFGFと受容体との結合実験
は、ウェークフィールド（Wakefield）による別の細胞
増殖因子（TGF−Ｂ）の結合実験の方法を援用した［メ
ソッド イン エンザイモロジー（Methods in Enzymol
ogy）、146、167（1987）］。標的細胞としては、ラッ
トC6グリオーマ細胞（大日本製薬より購入）を用いた。
放射標識bFGFはアマシャム社のヨード標識ウシbFGFを用
いた。対照には、ヨーロッパ特許公開第237,966号公報
に記載の方法で得られた組換え型ヒトbFGF（rhbFGF）を
用いた。24穴培養プレートにC6グリオーマ細胞を培養
し、培養液を除いて、結合実験のための緩衝液（イーグ
ルMEM培地、25mM HEPES（pH7.5）、0.15％ gelatin、
5.0μg/ml dextran sulfate）を加えた。1.7KBqのヨー
ド標識bFGFと、種々の濃度のhst−１ムテインN27または
対照としてのrhbFGFを添加して、反応液量を300μと
して、４℃で３時間反応を行なった。反応終了の後、反
応液を除き、Hank's平衡塩類溶液で洗浄し、0.5％Trito
n−X100溶液により細胞膜を可溶化し、その中に含まれ
る放射活性を、アロカ社製ガンマー線量計測機により測
定した。反応溶液に大過剰のrhbFGF4.0μg/mlを共存さ
せた場合の放射活性を別に求め、その値を非特異的結合
量として、先に得られた放射活性量より差し引いて特異
的結合量を算出した。この特異的結合量を、放射標識体
の放射比活性で除してrhbFGFの濃度を算出し、また反応
に用いた細胞数を別に細胞数計測機（コールター社、コ
ールターカウンターZM型）により定量して、rhbFGFの細
胞当たり結合量を求めた。得られた結果を第13図に示
す。第13図において、横軸は、結合実験の反応液中に加
えたhst−１ムテインN27、ならびに対照として加えたrh
bFGFの濃度を示す。縦軸は、反応の後、測定された放射
標識rhbFGF量より算出された。反応に用いられた細胞10
⁶個当たりのrhbFGF結合量（フェムトモル（fmol））を
示す。その量は、rhbFGFの受容体にたいするrhbFGFの結
合量に対応する。hst−１ムテインN27を添加した場合を
●の実線で示し、rhbFGFを添加した場合を■の破線で示
した。

第13図から明らかな如く、本発明のhst−１ムテインN
27は、検討した濃度の範囲で、rhbFGFが受容体に結合す
ることを阻害する作用は示さなかった。

発明の効果 本発明のhst−１ムテインは、高い生体組織の損傷の
治癒促進作用を有するので、火傷，創傷などの治癒促進
剤などの治療薬として有利に用いることができ、また、
消化管の潰瘍症の治療薬としても用いることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、hst−１の成熟タンパクのアミノ酸配列を示
す。 第２図は、hst−1cDNAのオープンリーディングフレーム
を構成するリーダー配列を含むhst−１のコーディング
領域より予想されるアミノ酸配列を示す。 第３図は、実施例１で得られた、hst−１ムテインN27の
アミノ酸配列を示す。 第４図は、実施例１で得られた、プラスミドpTB1051の
構築図を示す。 第５図は、実施例１で得られた、溶出パターンを示す。 第６図は、実施例１で得られた、SDS−PAGEの泳動パタ
ーンを示す。 第７図は、実施例１で得られた、溶出パターンを示す。 第８図は、実施例１で得られた、SDS−PAGEの泳動パタ
ーンを示す。 第９図は、実施例２で得られた、hst−１ムテインN27の
ヒト血管内皮細胞の細胞増殖におよぼす促進作用の測定
の結果を示す。 第10図は、実施例６で得られた、マウスBALB/c3T3細胞
に対するDNA合成誘起活性についての結果を示す。 第11図は、実施例７で得られた、細胞増殖促進活性の結
果を示す。 第12図は、実施例10で得られた、酸性条件下における残
存活性を示す。 第13図は、実施例10で得られた、放射標識rhbFGFの結合
実験に対するhst−１ムテインN27の作用の測定の結果を
示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 吉田 輝彦 東京都練馬区光が丘７丁目７番５―603 号 (72)発明者 五十嵐 貢一 京都府京都市左京区下鴨宮崎町66番地の ３ (72)発明者 香西 義雄 大阪府豊中市清風荘１丁目９番５号 (56)参考文献 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．84，（1987）, ｐ．2980−2984 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌ ｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ. ８，Ｎｏ．７，（1988），ｐ．2933− 2941 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 14/00 - 14/825 C12N 15/00 - 15/90 C12N 1/00 - 1/38 C12P 21/00 - 21/08 A61K 38/00 A61P 1/00 - 43/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (9)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】成熟ヘパリンバインディング・セクレトリ
   ー・トランスフォーミング・ファクター（hst−１）の
   Ｎ末端より連続した構成アミノ酸が１ないし47個欠失し
   ているムテイン。
2. 【請求項２】hst−１のＮ末端より連続した構成アミノ
   酸が１ないし27個欠失している請求項１記載のムテイ
   ン。
3. 【請求項３】hst−１のＮ末端より連続した構成アミノ
   酸が27個欠失している請求項１記載のムテイン。
4. 【請求項４】請求項１記載のムテインをコードする塩基
   配列を有する組換えDNA。
5. 【請求項５】請求項４記載の組換えDNAを含むベクタ
   ー。
6. 【請求項６】請求項５記載のベクターで形質転換された
   形質転換体。
7. 【請求項７】請求項６記載の形質転換体を培地に培養す
   ることを特徴とする請求項１記載のムテインの製造法。
8. 【請求項８】請求項１記載のムテインを含有してなる細
   胞増殖促進剤。
9. 【請求項９】請求項１記載のムテインを含有してなる血
   管新生促進剤。