WO2002041922A1

WO2002041922A1 - Procede servant a reguler l'activite de l'expression d'un produit genetique transfere dans un organisme vivant

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Publication number: WO2002041922A1
Application number: PCT/JP2001/008575
Authority: WO
Inventors: Hiroki Maruyama; Jun-Ichi Miyazaki; Makoto Sugawa; Masato Higuchi
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2000-11-24
Filing date: 2001-09-28
Publication date: 2002-05-30
Anticipated expiration: 2003-05-24
Also published as: EP1344536A1; EP1344536A4; AU2001292310A1; US20040077573A1; JPWO2002041922A1

Description

明細書生体に導入された遺伝子の発現産物の活性を制御する方法技術分野

本発明は、生体に人為的に導入された遺伝子の発現産物の活性を制御するための方法に関する。背景技術

1990 年に米国で試みられたヒトを対象とする遺伝子治療は、その後、多くの国で幅広く行われるようになつてきた。遺伝子レベルで疾患の背景が理解することができるようになると、遺伝子治療を利用して疾患の原因となる遺伝子の発現を制御することにより、多くの疾患の治療が可能となるのではないかと期待されている。現在最も広く行われている遺伝子治療は、遺伝子の異常によって不足している蛋白質の活性を、正常な遺伝子の導入によつて補充するタイプのものである。このタイプの遺伝子治療の代表的なものが、 ADA(Adenosine deaminase)欠損症に対する ADA発現べクタ一の導入による治療方法である。同様の遺伝子治療に、癌細胞における正常な p53の導入が挙げられる。 p53遺伝子に生じた変異のためにがん化の抑制が不能になった細胞を、正常な p53の作用によって治療しょうとする試みである。

初期の遺伝子治療において人為的に導入された遺伝子の発現レベルは、期待される水準よりも低いことが多かった。そのため、. 遺伝子の導入方法やべクタ一の改良によって、導入遺伝子をより強力に発現させることが遺伝子治療の新しい研究テーマとして注目されている。ところが、これらの研究の進展により、導入した遺伝子の発現が生理的濃度をはるかに越えて長期的な上昇がみられるといった新しい問題の発生が心配される。人為的に導入された遺伝子の発現機構には、過剰な発現を抑制するフィードバック機構が伴っていない。そのため、強力な発現システムには発現過剰の問題が常に存在する。人為的に導入した遺伝子の発現の持続は、治療に伴う副作用をもたらす恐れがある。

例えば、造血ホルモンの一種であるエリスロポエチン（以下、 EP0 と省略する）は、貧血の治療に有効である。しかし EP0が過剰な場合には、逆に多血症を引き起こす原因となってしまう。その他、歩行時疼痛（間歇性破行）、下肢の組織障害を示す閉塞性動脈硬化症、慢性心不全を含む虚血性心疾患や再狭窄等に対して、血管内皮成長因子 (VEGF )を用いた遺伝子治療が試みられている。 VEGF による血管新生の遺伝子治療では、過剰の VEGF は目的部位以外にも多くの血管新生を引き起こしてしまう恐れがある。血管新生の亢進にともない、組織を異常に発達させてしまう可能性や、担癌患者における悪性腫瘍の増大の危険性等が考えられる。したがって、今後の遺伝子治療では、導入遺伝子の発現レベルや発現生成物の活性を制御可能であることが望まれる。

このような導入遺伝子の発現量を制御する方法として、導入するべク夕一に薬物に反応する制御領域を組み込み、薬物投与により発現を制御する方法が報告されている（Ye et al .， Science, 1999, 283, 88-91) 。しかしながら、この方法では投与する薬物による副作用等の問題も生じる。そのため、より安全で確実な発現遺伝子の制御方法が必要とされる。

一方、近年、様々なサイト力インが疾患に関与することが明らかとなり、これらサイトカインに対する可溶性キメラ受容体投与や、抗体投与等の anticytokin e therapy の臨床応用が進み、成果を上げつつある（Feldman AM et al .， The r ole of tumor necrosis factor in the pathophysiology of heart failure, J. American College of Cardioloy, 2000, 35, 537-544; Boehme丽 & Gao IK, P resent importance of direct immunologically based intervention strategie s using anticytokines in rheumatoid arthritis, Zeitschrift fur Rheumatol ogie, 1999, 58, 251-166 ; Choy EH et al . , Monoclonal antibody therapy in r heumatoid arthritis, British J. Rheumatology, 1998, 37, 484-490)。

例えば、心臓疾患 (Feldman AM et al. , The role of tumor necrosis factor in the pathophysiology of heart failure, J. American College of Cardiol oy₃ 2000， 35， 537-544) やリウマチ（Ohshima S et al .， Long-term follow-up of the changes in circulating cytokines, soluble cytokine receptors, and white blood cell subset counts in patients with rheumatoid arthritis (R A) after monoclonal anti-TNF alfa antibody therapy, J. Clin. Immunology. ,

1999, 19， 305-313; Choy EH et al. , Monoclonal antibody therapy in rheum atoid arthritis, British J. Rheumatology, 1998， 37, 484-490)、クローン病の関与が指摘されている TNF に対して、 TNF- のキメラ受容体投与や TNF-ひに対する抗体投与がなされ、臨床においても有効な成績が得られている。また、 Ch ronic injuryでの fibrosisへの関与が指摘されている TGF- ?の type II受容体の細胞外部分を含むキメラ IgG可溶性受容体の投与では、動物モデルで hepatic fibrosis の抑制効果が得られている（George J et al. , In vivo inhibition of rat stellate cell activation by soluble transforming growth factor be ta type I I receptor: a potential new therapy for hepatic fibrosis, Proc.

Nat. Acad. Sci.， 1999, 96， 12719-12724) 。これらの報告では、疾患の原因であるサイトカインの活性を制御するために、サイトカインの活性に干渉する成分が投与されている。

またアデノウイルス vector を投与する遺伝子治療の際、ウィルスに対する免疫反応を抑える目的で、抗- CD4 モノクローナル投与が動物で試みられた。その結果、導入遺伝子の reporter発現の持続や、ウィルスに対する抗体価の減少、 I FN-ァの上昇の抑制等の効果が得られており（Schroeder G et al. , Immune resp onse after adenoviral gene transfer in syngeneic heart transplants :ef fee ts of anti-CD-4 monoclonal antibody therapy, Transplantation, 2000， 70, 191-198) 、抗- CD4抗体療法は臓器移植等でも有効な手法であることを示唆している。

さらに、 Lymphocyteの活性化に関与する CD45に対する抗体投与は、実験的ァレルギ一脳炎である EAE の発症を抑制し、 T- cell の増殖を押さえ、 TNF- aのみならず Th- 1サイトカインである IFN-ァ、 IL- 2の産生を有意に抑制することが報告されている (Schiffenbauer J et al. , Prevention oe experimental allegic encephalomyelitis by an antibody to CD45RB, Cellular Immunology, 1998, 190， 173-182) 。しかし、こういった、標的サイトカインの抗体や可溶性受容体の組み換え型蛋白を投与する方法は、それらに対する抗体が産生され、繰り返し投与では効果が減弱してくるといった問題や、組み換え型蛋白のコストの問題が依然として解決すべき課題として考えられる。発明の鬨示

本発明は、生体に人為的に導入された遺伝子の発現産物の活性を制御する方法の提供を課題とする。

生体に人為的に導入された遺伝子には、本来生体が備えているフィードバック機構が作用しない。そこで本発明者らは、人為的に導入された蛋白質の活性を制御することができる化合物を生体に投与することにより、ある種のフィードバヅク機構を実現できるのではないかと考えた。

そして本発明者らは、生体に人為的に導入した遺伝子に対して、その発現産物の活性に干渉する物質を生体中で共存させることによって、当該活性を制御することができることを明らかにし本発明を完成した。すなわち本発明は、以下に述ベる生体に導入された遺伝子の発現産物の活性を制御する方法、並びにそのためのベクターに関する。

〔 1〕生体に導入された遺伝子の発現産物の活性に干渉する蛋白質を共存させることによって、当該発現産物の活性を制御する方法。

〔2〕発現産物の活性に干渉する蛋白質をコードする遺伝子を同じ生体内で発現させることによって共存させる〔1〕に記載の方法。

〔3〕発現産物の活性に干渉する蛋白質をコードする遺伝子が、ネーキッド M

Aからなる発現ベクターによって生体に導入される〔2〕に記載の方法。〔4〕発現ベクターが、エレクトロボレ一シヨン法により生体に導入される

〔3〕に記載の方法。

〔5〕発現産物の活性に干渉する蛋白質が、この発現産物の受容体、この発現産物の活性中和抗体、およびそれらの活性部位を含む蛋白質からなる群から選択される蛋白質である〔1〕に記載の方法。

〔6〕発現産物の活性に干渉する蛋白質をコードする遺伝子が、誘導型のプロモ

—夕一の制御下で発現するものである〔2〕に記載の方法。

〔7〕〔1〕に記載の方法によって、遺伝子治療において導入された遺伝子発現産物の活性を制御する方法。

〔8〕導入された遺伝子が、血液蛋白質、サイトカイン、およびホルモンから選択されるいずれかの群に属する蛋白質の遺伝子である〔7〕に記載の方法。〔9〕血液蛋白質、サイトカイン、およびホルモンから選択されるいずれかの群に属する蛋白質が、下記の群より選択されたいずれかの蛋白質である〔8〕に記載の方法。

エリスロポエチン顆粒球—コロニー刺激因子顆粒球マクロファ一ジ一コ口二一刺激因子ステムセルファクタ一

スロンボポェチン腫瘍壊死因子ひ

トランスフォーミング成長因子/? C D 4

C D 4 5 骨形成因子

ィンターフェロン一ひィンターフェロンーァ

ィン夕ーロイキン一 1 ィン夕一ロイキン一 2

ィン夕一ロイキン一 6 ィンターロイキン一 1

ィン夕ーロイキン一 1 2 表皮細胞成長因子酸性線維芽細胞成長因子塩基性線維芽細胞成長因子線維芽細胞成長因子一 I 血小板由来成長因子

血管内皮成長因子神経成長因子

脳由来神経栄養因子インシュリン様成長因子一インシュリン様成長因子- ヒト成長ホルモンパラサイロイドホルモン血管新生阻害因子、

色素上皮由来因子、および肝細胞成長因子

〔1 0〕蛋白質が、エリスロポエチンである〔9〕に記載の方法。

〔1 1〕発現産物の活性に干渉する蛋白質が、可溶化したエリスロポエチン受容体である〔1 0〕に記載の方法。

〔1 2〕発現物質の活性に干渉する蛋白質が、他の蛋白質との融合蛋白質である

〔1〕に記載の方法。

〔1 3〕生体に導入された遺伝子の発現産物の活性に干渉する蛋白質を同じ生体内において発現することができる、当該発現産物の活性を制御するための発現ベクター。

〔1 4〕発現産物の活性に干渉する蛋白質が、他の蛋白質との融合蛋白質である

〔1 3〕に記載の発現べク夕一。

〔1 5〕〔1 3〕に記載の発現ベクターを有効成分として含む、生体に導入された遺伝子の発現産物の活性を制御するための組成物。

〔1 6〕生体に導入された遺伝子の発現産物の活性に干渉する蛋白質を同じ生体内において発現することができる発現べクタ一の、生体に導入された遺伝子の発現産物の活性を制御するための組成物の製造における使用。

〔1 7〕発現産物の活性に干渉する蛋白質が、他の蛋白質との融合蛋白質である、

〔1 6〕に記載の発現べクタ一の使用。

本発明において、生体に導入された遺伝子とは、その目的に関わらず、人為的に生体に導入されたあらゆる遺伝子を言う。たとえば、遺伝子治療を目的として人為的に導入された遺伝子は、その代表的なものである。治療以外の目的でも、その生物が本来備えていない形質を導入するために、しばしば外来遺伝子の導入が試みられる。たとえば、動物に有用蛋白質を生産させるために導入される遺伝子なども、本発明における人為的に生体に導入された遺伝子に含まれる。

本発明は、動物の血中に遺伝子産物を発現させることにより、導入した遺伝子の目的を達成するものにおいて、特に有用である。発現産物の過剰発現が局所に限定される場合に比べ、血中に存在する発現産物は全身的な影響を与える。したがって、人為的に生体に導入される遺伝子の中でも、動物において血中に遺伝子発現産物を産生させる場合に、特にその蛋白質の活性の制御が重要になる。本発明において、発現産物の血液への供給を目的として導入される遺伝子として、血液蛋白質、サイト力イン、およびホルモンのいずれかに属する蛋白質をコードする遺伝子を示すことができる。血液蛋白質とは、アルブミン、グロプリン、フエリチン、あるいは各種酵素などの、血液中に含まれる各種の蛋白質を含む用語である。一方、サイト力イン、およびホルモンとしては、より具体的には、たとえば以下の蛋白質の遺伝子を例示することができる。

エリスロポエチン（ erythropo i et in； EP0 )

顆粒球—コロニー朿 !J激因子、 granulocyte colony stimulating factor; G- CSF )

顆粒球マクロファージーコ口二一刺激因子（granulocyte macropharge col ony stimulating factor; GM-CSF )

ステムセルファクタ一（stem cel l factor ; SCF)

スロンボポェチン（thrombopoietin; TPO)

腫煬壊死因子ひ (tumor necrosis factor; TNF- a )

トランスフォ一ミング成長因子/? (transforming growth factor ; TGF- ? ) C D 4

C D 4 5 骨开成因子 (bone morphogenetic protein; BMP)

インターフエ口ンーひ ( interferon- α ; IFN- a )

ィン夕ーフエロンーァ ( interferon—ァ； IFN- y )

イン夕一ロイキン _ 1 ( interleukin; IL-1 )

イン夕一ロイキン— 2 ( interleukin; IL-2)

イン夕一ロイキン一 6 ( interleukin; IL-6)

イン夕一ロイキン一 1 1 ( interleukin; IL-11)

イン夕一ロイキン一 1 2 ( interleukin; IL-12)

表皮細胞成長因子（epidermal growth factor; EGF)

酸性線維芽細胞成長因子（acidic fibroblast growth factor ;aFGF) 塩基性線維芽細胞成長因子（basic fibroblast growth factor ;bFGF) 線維芽細胞成長因子— I (fibroblast growth factor I ;FGF - 1) 血小板由来成長因子（platelet derived growth factor; PDGF ) 血管内皮成長因子（vascular endothelial growth factor ;VEGF) 神経成長因子 (nerve growth factor; NGF)

脳由来神経栄養因子 (brain derived neurotrophic factor; BDNF ) インシュリン様成長因子- 1 (insulin like growth factor-I ; IGF-I ) インシュリン様成長因子 - I I ( insulin like growth factor- II ; IGF- I I) ヒト成長ホルモン (human growth hormone; hGH)

パラサイロイドホルモン（parathyroid hormone; PTH)

血管新生阻害因子（angiostatin)

色素上皮由来因子 (pigment epithelial cell derived facctor;PEDF) 肝細胞成長因子 (hepatocyte growth factor; HGF )

本発明において、前記遺伝子発現産物の活性に干渉する蛋白質とは、何らかの機序により、前記遺伝子発現産物の活性を修飾することができる蛋白質を言う。本発明において、前記活性に干渉する蛋白質を干渉物質と記載する。また本発明において、前記遺伝子発現産物の活性を干渉物質の量によって変化させ、目的とするレベルに近づけることを制御と言う。本発明において制御とは、前記活性を抑制する場合のみならず、上昇させる場合も含まれる。干渉物質には、具体的には、結合、分解、あるいは競合等によって、前記活性に干渉する蛋白質を示すことができる。具体的には、前記遺伝子発現産物の受容体、前記遺伝子発現産物の受容体結合部分をプロックして両者の結合を阻害しうる抗体、あるいは前記遺伝子発現産物のアン夕ゴニストとして作用する蛋白質などを示すことができる。たとえば EP0に対しては、 EP0の受容体や、 EP0の受容体結合部分をブロックして両者の結合を阻害しうる抗体、あるいは EP0のアン夕ゴニストとして作用する蛋白質等を、本発明の干渉物質として示すことができる。また VEGF等の他のサイトカインについても同様に、そのサイトカインをリガンドとする受容体や、抗体を干渉物質として利用することができる。

これらの蛋白質は、前記活性に干渉することができる限り、その活性断片や、活性断片と他の分子との融合体であることができる。たとえば受容体は、リガンド結合領域や、結合領域を含む融合蛋白質を干渉物質として用いることができる。また抗体であれば、その抗原結合領域を含む断片、あるいは 1本鎖抗体であることができる。融合体としては、たとえば受容体と抗体の Fc部の融合体を示すことができる。抗体の Fc部との融合体とすることにより、次のような効果を期待できる。

1 ) 分子量を大きくすることによって分解を防ぎ血中の滞留性が高まる

2 ) 干渉物質の 2量体化によって、標的分子への親和性が高まる

更に受容体が宿主にとつて異種の蛋白質であるときには、宿主の蛋白質とのキメラ化によって、生体における安定性の向上が期待できる。融合体は、融合体をコードするキメラ遺伝子の発現によつて生体内に導入することができる。

干渉物質は、投与の対象となる生体に由来するものであることが望ましい。したがって、たとえばヒトに対して本発明の方法を適用する場合には、ヒトに由来する蛋白質を利用するのが望ましい。同じ生体に由来する蛋白質を用いることにより、免疫機構の攻撃を誘導することのない、より安全な製剤とすることができる。また免疫機構によって干渉物質が排除されることがないので、効果的な投与が期待できる。

干渉物質として抗体やその断片を用いるときには、その一部をヒトのィムノグロブリンの構造に置換することにより、安全性を高めることができる。すなわち、キメラ抗体,や、 CDR グラフトなどの技術により、ヒト以外の種に由来するィムノグロプリンの一部をヒト化することができる。このようにして得ることができるヒト化蛋白質は、本発明をヒ卜に適用する場合の干渉物質として好ましい。

本発明の干渉物質は、前記遺伝子産物の過剰な発現が見られたときに、当該遺伝子産物が存在する場所に投与される。たとえば血中において前記遺伝子産物の過剰な発現が見られるときには、血中において干渉物質が活性の制御に有効な量で存在できるように、経口的に、あるいは非経口的に投与される。投与方法は特に限定されない。また本発明の干渉物質を、高分子化合物との結合物として投与することによって、血中滞留性の向上を期待することもできる。高分子化合物としては、ヒアルロン酸、ポリエチレングリコ一ル、あるいはアルブミンなどを示すことができる。

本発明において、蛋白質からなる干渉物質の投与の方法として遺伝子治療を応用することができる。すなわち、干渉物質をコードする DNAを公知のベクタ一に組み込んで生体に投与することができる。遺伝子として投与し、当該生体の体内で発現される干渉物質は、その蛋白質が同じ生体に由来するものである場合には、免疫機構を刺激することが無いので安全である。また、生体内で産生が継続するうえに、免疫機構の攻撃を受けないことから、その効果を確実にかつ持続的に得ることができる。更に、蛋白質を工業的に生産し、精製するのに比べて、遺伝子治療用の製剤は、はるかに小規模な生産設備で安全な製剤を安価に製造することができる。干渉物質をコードする DNAの投与とその発現によって、生体中で干渉物質を共存させるとき、干渉物質は活性を制御すべき蛋白質が存在している場所に供給できるように発現させるのが望ましい。たとえば、血液中に存在する蛋白質の活性を制御するときには、干渉物質を分泌蛋白質として発現させることができる。本発明においては、このように分泌蛋白質として発現された干渉物質を、可溶性の蛋白質と言う。

たとえば受容体のような膜蛋白質を干渉物質として用いるときには、そのリガンド結合領域を分泌蛋白質として発現させることができる。更に具体的な例を示せば、 EP0に対して EP0受容体を用いる場合には、 EP0受容体の N末端側 1〜 2 2 2位のアミノ酸残基を含み、かつ膜貫通領域を含まないアミノ酸配列をコードする DNAを利用することができる。このようなアミノ酸配列からなる蛋白質を分泌蛋白として発現させるには、さらにその N末端に分泌シグナルを付加する。たとえば、ヒト EP0受容体の cMAによってコードされる前駆体蛋白質においては、その 1〜 2 4 6位が分泌シグナルとリガンド結合領域を含む。分泌シグナルは、 EP0 受容体に由来するアミノ酸配列であることもできるし、生体の細胞で機能することができる他の種に由来する分泌シグナルであつてもよい。本発明においては、このようにして分泌蛋白として発現された EP0受容体を、可溶性の EP0受容体という。

干渉物質をコードする DNAは、ウィルスベクターや、 DNAの直接投与によって生体に導入することができる。ウィルスベクタ一には、レトロウイルス、レンチウィルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウィルス（ V)等を利用した多くのぺク夕一が開発されている。また DNAの直接投与とは、ウィルス構造を持たない真核細胞用の発現べク夕一を in vivo in situ、あるいは ex vivoで生体に投与する方法である。生体に外来遺伝子を人為的に導入する方法は、既に多くの方法が試みられている。本発明は、公知の遺伝子導入方法によって人的に導入されたあらゆる遺伝子の発現産物に適用することができる。より具体的には、たとえば次に示すようなベクターが生体への遺伝子導入の目的で使用されている。これらのベクタ一は、いずれも本発明における干渉物質をコードする DNAの導入のために用いうる。

プラスミド発現べク夕一 (plasmid expression vector)

： pVR pCMV CAGGS,

製會欠損アデノウイソレスべク夕一（aeplication defective adenovirus)

： AdEFls AdMLP

レ卜ロウィレスべク夕——(retrovirus vector)： LrEPSN_N

アデノ随伴ウイゾレスべク夕——(Adeno associated vector) .

： rMV- ET AdCMV

これらの各種のベクタ一の中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウィルス等のウィルスベクタ一では、導入したベクタ一が他の細胞に感染していく現象が起きる可能性がある。この現象はバイスタンダー効果と呼ばれ、導入した遺伝子の持続的な発現をもたらすため、発現強度を期待するときには有効である。ところが本発明における干渉物質は、もともと治療のために導入された遺伝子の発現産物の活性を制御することが目的であるから、予想を越える持続的な発現は治療効果に対して競合的に作用する恐れがある。

ただし、ウィルスベクターを用いる方法であっても、干渉物質の発現を制御するプロモー夕一を誘導型のプロモーターとすることにより、本発明に利用することができる。具体的には、たとえば特定の薬剤によって発現を誘導できるプロモ —夕一を利用すれば、薬剤の投与によって干渉物質の発現を制御することができる。このようなウィルスベクタ一では、ベクタ一の持続感染が生じたとしても、干渉物質で制御すべき遺伝子発現産物の活性に対する必要以上の抑制を避けることができる。

したがって本発明においては、発現制御領域と、導入すべき遺伝子とを含む最低限の要素のみからなる発現ベクターを用いた遺伝子治療が、干渉物質をコ一ドする DNAの望ましい導入方法として挙げられる。

一般的な発現べクタ一は、複製起点、プロモーター、ェンハンサー、ポリアデニル化配列等の発現制御領域、そして発現させるための外来遺伝子等から構成される。ウィルスベクタ一ではなく、このような発現ベクターを利用する方法は、ネ一キヅド DNA法と呼ばれている。本発明において、ネ一キッド DNA とは、 DNA のみからなる発現べクタ一と定義される。

したがってネ一キッド DNAは、ウィルスベクターに見られるような蛋白質や糖等の生物学的な構造は持たない。ネ一キッド MA法では、遺伝子の発現が一過性で、かつ細胞から細胞へのベクターの自発的な感染（バイスタンダ一効果）が起きず、ホストの染色体に組み込まれる危険性もないことから、本発明における望ましい遺伝子導入方法である。またウィルスベクターと比較して、安価に多量のベクターを調製できる点でも、ネーキッド DNAは有利である。これらの遺伝子導入方法は、いずれも本発明の干渉物質をコードする DNAの導入方法として応用することができる。

ネーキッド DNA法を本発明における干渉物質の発現に利用するには、たとえば以下のような発現べクタ一を構築する。すなわち発現べクタ一は、干渉物質をコードする DNA、プロモーター領域、転写終了シグナルを特定する 3'に位置する領域、およびポリアデニル化部位等で構成される。このプロモー夕一領域は、干渉物質をコードする DMを発現するために当該細胞中または生体内で機能しうるものとする。

プロモーター領域は、干渉物質をコ一ドする DNAを発現させることができれば、たとえば他の生物や、他の遺伝子に由来するものであることもできる。たとえば、他の真核細胞遺伝子やゥィルス遺伝子に由来するプロモーターを用いることもできる。プロモーターの特異性は、干渉物質をコードする DNAを発現することができれば、必ずしも特異的である必要はない。プロモ一夕一として、誘導型のプロモ一夕一を用いれば、その発現を誘導条件によって制御することもできる。あるいはプロモ一夕一として組織特異性を有するものを用いれば、臓器特異的に干渉物質を.発現させることもできる。したがって、遺伝子発現産物の過剰発現が実際に障害を与える組織において、干渉物質を発現させるといった応用も可能である。更に、例えば EP0過剰発現で組織の酸素供給が飽和している場合は、逆に高酸素に応答するプロモー夕一領域を、導入する干渉物質をコードする遺伝子の上流に組み込んでおくことによって人工的なフィ一ドバックル一プを構成することができる。具体的には、たとえば以下のような遺伝子のプロモー夕一を用いることができる。

非特異的プロモー夕一

ニヮトリの/?ァクチン、平滑筋のひァクチン、チミジンキナ一ゼ、メタ口チォネイン、イン夕一フエロン、免疫グロブリン誘導型のプロモー夕一

ステロイドホルモンのレセプ夕一

ウィルス由来のプロモー夕一

SV40、 B型肝炎ウィルス、

アデノウィルス主要後期遺伝子

プロモ一夕一は、他の発現制御領域を構成する塩基配列の導入によって改変されたものであっても良い。たとえばニヮトリ/?ァクチンプロモ一夕一では、その一部をゥサギの/?—グ口ビン遺伝子由来のスブラインシングァクセプ夕一に改変することにより、遺伝子の転写効率が向上することが知られている（特許第 282 4434号， 1998年）。

発現べクタ一は、プロモー夕一以外にも夕一ミネ一夕一ゃェンハンサ一を含むことができる。これらの発現制御領域についても、プロモー夕一と同様に、導入すべき遺伝子のもののみならず、他の遺伝子や、他の種に由来する発現制御領域を用いることもできる。

干渉物質をコードする DNAを発現することができるネーキッド DNAは、公知の方法により生体に導入することができる。たとえば、発現べクタ一を導入した皮膚細胞や血液細胞を生体に移植することにより、 ex vivoでの DNAの導入が行われる。皮膚細胞を利用した場合には、これを取り除くことで容易に干渉物質の発現レベルを調整することができる。細胞への発現ベクターの導入には、エレクトロボレ一シヨン法等を利用することができる。生体へのエレクトロポレーシヨンによるネーキッド DNAの導入は、例えば以下のようにして行われる。すなわち、 DNA を脚部の筋肉に注射後、その注入部位を挟むように電極をセットし、エレクトロポレーシヨン法でパルスで電圧を与える。また、移植臓器に導入する場合は、 DNA注入した臓器を生理食塩水等の溶液中で浸した状態で、電極を臓器に直接当てず溶液液全体をパルス刺激するエレクトロポレーシヨン法を用いた組織の損傷を抑えた方法で、効率のよい導入が可能となる。あるいはハイドロゲル法によつて、静脈内投与法により、肝臓 ·腎臓等の臓器で干渉物質をコードする DNAを発現させることもできる。 TransIT In Vivo Gene Delivery System(Mirus社）等を用いた静脈内投与による遺伝子導入を応用することもできる。

更に、干渉物質をコードする DMの導入にあたり、取り扱いの容易なリポゾ一ム法と、効率の高いウィルスべク夕一の特徴をあわせもつ HVJ(Hemagglutinatin g Virus of Japan) -リボゾーム法を利用することもできる。この手法は、非分裂細胞にも効率よく DNAを導入 ·発現可能であり、発現期間は一過性であるが、ホストのゲノムには挿入されない特徴を有する。したがって、本発明における干渉物質をコードする DNAの発現系として、ネ一キッド DNAと同様に望ましい発現系であると言うことができる。

このようにして導入された干渉物質をコードする DNAは、導入された細胞で発現し、生体内において干渉物質を産生する。産生された干渉物質は、人為的に導入された遺伝子の発現産物の活性を抑制する。干渉物質の発現は、形質転換された細胞の寿命とともに弱まり、やがて消失するので、人為的に導入された遺伝子の発現産物の活性を必要以上に弱める作用は無い。図面の簡単な説明

図 1は、発現べクタ一の構造を模式的に示した図である。

図 2は、 pCAGGS-EPO及び pCAGGSを導入したラットの血液におけるへマトクリヅト値の変化を示したグラフである。縦軸はへマトクリット値（％) を、横軸は pCAGGS-EPO後の経過時間（週）を示す。図中、 * :ρ<0· 05、 **:ρ<0.01、 ***:ρ <0.001、 ****:ρ<0.0001

図 3は、血中へマトクリツトレベルの変化を示したグラフである。縦軸はへマトクリツト値（％) を、横軸は経過時間（週）を示す。各群ともに η=9。図中、 *:ρく 0.05、 ***:ρく 0.001、 ****:ρく 0.0001、 #:ρく 0.05、 ##:ρく 0.01、 ###:ρ<0. 0001、 ####:ρ<0.0001、 &: ρ<0.05, &&:ρ<0.001

図 4は、血中網状赤血球数の変化を示したグラフである。縦軸は網状赤血球数 ( 107^1) を、横軸は経過時間（週）を示す。各群ともに η=9。図中、 * : ρ< 0.05、 **:ρ<0.01、 ***:ρ<0.001、 ****:ρ<0.0001、 #:ρ<0.05、 ###:ρ<0.0001、 ####:ρ<0.0001, &&&:ρ< 0.001 発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。本実施例で用いた動物は、 8週齢の雄性ラヅト（SD, Cha rles River Inc東京）を実験開始前に pathogen- freeの条件下 12時間の明暗サィクルで一週間以上飼育した。全ての動物は水と標準食（23.8% protein; 0.24% sodium; 0.0154% iron含有、 MF, Oriental Yeast, 東京）を自由に摂取させた。

[実施例 1 ] プラスミドベクターの調製

プラスミド pCAGGS-Epoはラット EP0 cDNAを発現ベクターである pCAGGS (Ni a H et al.， Gene, 1991， 108， 193-199) の Xhol siteに揷入することで構築した。またプラスミド pCAGGS-hSEP0R2 は、ヒト可溶性 EP0 受容体（特許公開番号： W0 99-53313、 hSEP0R2) の cDNAを、同じく発現ぺク夕一である pCAGGSの X hoi site に挿入することで構築した。各プラスミドは、 Qiagen EndoFree plasm id Giga kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany)を用いて精製した（Maruyama H e t al. , Human Gene Therapy, 2000, 11,429-437) 。本実施例で構築した発現べク夕一の構造を図 1に示した。その塩基配列は、ヒト可溶性 EP0受容体をコードする場合の塩基配列は配列番号： 1に示した。またラット EP0をコ一ドする場合の塩基配列は配列番号： 2に示した。

対照として pCAGGS plasmidを用いた。得られた DNAは滅菌した phosphate-bu ffered saline(PBS)で溶解し、注入時の濃度が 2〃g/〃lとなるように調製した。

[実施例 2 ] pCAGGS-Epo及び pCAGGSの導入

エレクトロポレーシヨン（Electroporation)法による筋肉内への plasmid DNA の注入は以前報告した方法（Ma yama H et al . , Human Gene Therapy, 2000, 11, 429-437) に準じて行った。 pCAGGS-Epo及び pCAGGSの、 50〃g plasmid DNAを左右の下肢の内側 (medial) 及び外側部分 (lateral site) に注入した (total 20 0 ig) 。次に pairになった幅 10匪、長さ 5腿の 2本の stainless steel電極を DNA注入部位が中心となるよう設置し、 electric pulse generator (Electro Se equre Porator T820; BTX)を用いて、電気 pulse (duration 50 msec, 謂, 1 pulse/sで 8 pulses) を与えた。

遺伝子導入後、動物をジェチルエーテルで軽く麻酔し、 Ohwada らの方法（Ohw ada K. , Exp. Anim.， 1986, 35, 353-355) で心臓から 2ml採血し、血清中の EP 0 レベルを Recombigen EP0 kit(Nippon DPC,千葉）を用いて測定した。赤血球、へマトクリット、へモグロビン、白血球、血小板は Sysmex SE- 900(Sysmex兵庫）で、網状赤血球 (Reticulocytes) は Sysmex R - 3500で測定した。

結果を図 2に示す。実験結果は平均値 ±標準誤差で表示し、統計的有意差は対応のない t検定で検定し、 pく 0.05を有意とした。 EP0を遺伝子導入すると、その後へマトクリヅト値が上昇し、 3週間後でほぼビークとなった（図 2 ) 。一方、対照 plasmid DNA導入群は導入前と比べ 4週間後にへマトクリット値の上昇が見られたが、 EP0遺伝子導入群と比べるとその程度は僅かなものであった。

[実施例 3 ] pCAGGS-hSEP0R の導入

実施例 2でへマトクリツトの上昇を確認できた個体に、週間目にヒト EP0可溶性受容体発現べクタ一（pCAGGS-hSEP0R2) を遺伝子導入した。 pCAGGS-hSEP0R2 は左右の大腿部筋肉内に、実施例 2と同様に計 8 0 0〃g となるよう注入した。エレクトロポレーシヨンおよび血液採取も実施例 2と同様にして行った。

ヒト EP0可溶性受容体発現べクタ一を導入した群のへマトクリッ卜値は、非導入群と比べ減少傾向を示し、 5 週間目及び 13週目には有意なへマトクリットの減少が確認された。対照群に 4週間後 EP0可溶性受容体を導入した場合はその後へマトクリット値は変化せず、更に低下して貧血症状を呈することは無かった。以上の結果から、可溶性受容体を生体内に導入することで、治療目的で導入した遺伝子による過剰な作用を確実に制御できることが明らかとなった。また、導入遺伝子の発現レベルが減少している時期（本実験では 15 週以降）や、対照群のような外部由来の導入遺伝子の発現レベルがゼロである正常な conditionに対して、さらにそのレベルを低下させるような強い副作用は確認されず、安全性の高い制御法と考えられる。

[実施例 4 ] ヒト EP0受容体- IgG Fcキメラ遺伝子導入によるラット EP0レペルの制御

先の実施例では、ラヅト EP0の作用をヒト可溶性 EP0受容体で抑制した。本実施例においては、ヒト可溶性受容体を、ラヅトの IgGFcとのキメラ蛋白質とすることによって、その作用がどのように変化するかを確かめた。 IgGlFcの cDNAを、市販のラット脾臓のライブラリ一（Quick Clone、クローンテック社）から PCR法によりクロ一ニングした。 IgGlFcの cDNAを実施例 1と同様にして発現べクタ一 pCAGGSに挿入して、ラヅト IgGFc発現プラスミド pCAGG S-IgGlFcを構築した。更に、 IgGlFcの cDNAと hEPORを連結したキメラの cDNA を実施例 1記載の方法と同様の方法で発現ベクター pCAGGSの Xhol siteに挿入してキメラ蛋白質発現プラスミド pCAGGS- hSEP0R2- IgGlFcを構築した。キメラ蛋白質発現ブラスミド pCAGGS- hSEP0R2- IgGlFcのインサートの塩基配列を配列番号： 3に示す。各プラスミドは、実施例 1と同様に精製し、以下の実験に用いた。エレクトロボレ一シヨン法により動物（ラヅト）の筋肉内に pCAGGS- Epo 100 〃gを左右下肢の内側、外側部に注入した (total 400ug) o pCAGGS- Epoは、ラットの Epoを発現するプラスミドである。遺伝子導入 1週間後、および 2週間後に血中 EP0レベルの上昇を確認後、 3週間後に pCAGGS- IgGlF (；、 pCAGGS-hSEP0R2 及び pCAGGS- hSEP0R2-IgGlFcプラスミドのそれぞれ 800 gを T画 ίΊ¹¹ In Vivo Gene Delivery System (Mirus, MIR5125 )を用いてラット尾静脈より導入した (Liu F, Song YK, Liu D, Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA, Gene Therapy, 1999, 6, 1258-126 6) 。

その後、経時的に採血を行い、血中 EP0レベル、へマトクリット値、網状赤血球数（reticulocyte) を 24週間後まで計測した。統計的な有意差検定は対応の無い t検定を行い、 5%以下の危険率を有意とみなした。

pCAGGS-hEPOプラスミッドを導入後 EP0の上昇した動物について、上昇の程度が各群同程度となるよう群分けし、尾静脈から各可溶性ヒト EP0受容体を導入した。その結果、導入 EP0により血清 EP0レベルは 1週間後にピークとなり、その後徐々に減少した（デ一夕示さず）。一方、へマトクリット値は導入後より上昇し、 4週間後にピ一クとなりその後ほぼ一定値を保った。その後は、初めのピーク値に対して有意ではないものの、 16週間後に再び上昇し 24週間後もこのレべルを維持した（図 3 ) 。

これに対して、 hSEP0R2-IgGlFcキメラ蛋白質発現プラスミド導入群では、 4 週間後から 24週間後にわたって、 EP0導入群に比べ有意にへマトクリット値を低下させた（図 3 ) 。 IgGlFcや可溶性ヒト EP0受容体を導入した群では、 EP0単独導入群と比べてへマトクリツト値を下げる傾向は見られるものの、両者の差は有意ではなかった。' hSEP0R2-IgGlFcキメラ蛋白質の作用は、 IgGlFc導入群と比較しても有意であり、可溶性ヒト EP0受容体導入群に比べても、 4週〜 12週間後にわたつて有意に強い効果を示した（図 3 ) 。

網状赤血球数は、ラット EP0導入 1週間後にピークを示し、その後急速に低下する。 IgGlFcや EP0受容体導入によって、 EP0遺伝子単独導入群と比べて網状赤血球数のレベルに変化は見られない。しかし hSEP0R2- IgGlFcキメラ蛋白質の導入により、 4週間後から 24週間後にわたって網状赤血球数は有意な減少を示す。その作用は IgGlFc及び EP0受容体導入群と比べても有意に強かった（図 4 ) 。以上の結果より、 EP0受容体を単独で発現するのに比べ、ラット IgGlFcとのキメラ受容体 (hSEP0R2- IgGlFc)の形で導入した方が、上昇した血中の EP0レベルをより強く低下させる作用があることが確認された。

なお実施例 2 (図 2 ) では EP0受容体の導入で、上昇したへマトクリヅトを有意に低下したのに対して、実施例 4 (図 3 ) では同じ傾向が見られたものの有意な差ではなかった。この EP0受容体の効果の違いは、導入したラヅト Epo(pCAGG S - EPO)の量の違いに起因するものと思われた。 pCAGGS- EP0の導入量が、実施例 2 (図 2 ) の 200〃gに対して、実施例 4 (図 3 ) では 400〃gとなっている。つまり実施例 4におけるラヅトの方がより多くの EP0を発現しているために、同量の EP0受容体では十分に中和できなかつた可能性が考えられる。産業上の利用の可能性

本発明は、従来の遺伝子治療法では考慮されていなかった導入遺伝子の発現産物の生体内での活性の制御方法を実現する。生体に人為的に導入した遺伝子の発現レベルが、生理的な濃度を越えて恒常的に発現されれば、生体に対して副作用を示す恐れがある。たとえば EP0の場合には、多血症といった副作用を生じる。本発明では、干渉物質の投与により、過剰発現に起因する副作用を軽減することができる。実施例では可溶性受容体の遺伝子の導入することによる干渉物質の投与例を示した。この他にも受容体のみならず、中和抗体や、それをコードする遺伝子の導入によっても受容体の同様の効果を得ることができる。

この目的のためにリコンビナントの可溶性受容体蛋白や、抗体蛋白を投与する方法では、抑制作用を得るのに大量の精製蛋白と繰り返し投与を必要とし、そのコストや、通院等の患者の物理的負担も大きくなる。発明者が示した遺伝子導入による方法は、患者自身の組織の細胞で蛋白が作られることから、糖鎖修飾等の点からも抗原性は少なく、効果の持続や、安全性にも優れていると考えられる。また、皮膚に遺伝子導入した場合は、皮膚移植により遺伝子導入の switchの on /off を簡便に行うことも可能となる。

Claims

請求の範囲生体に導入された遺伝子の発現産物の活性に干渉する蛋白質を共存させることによって、当該発現産物の活性を制御する方法。

発現産物の活性に干渉する蛋白質をコードする遺伝子を同じ生体内で発現させることによって共存させる請求項 1に記載の方法。

発現産物の活性に干渉する蛋白質をコ一ドする遺伝子が、ネーキッド DNA からなる発現べク夕一によって生体に導入される請求項 2に記載の方法。発現べクタ一が、エレクト口ポレーシヨン法により生体に導入される請求項 3に記載の方法。

発現産物の活性に干渉する蛋白質が、この発現産物の受容体、この発現産物の活性中和抗体、およびそれらの活性部位を含む蛋白質からなる群から選択される蛋白質である請求項 1に記載の方法。

発現産物の活性に干渉する蛋白質をコードする遺伝子が、誘導型のプロモ一夕一の制御下で発現するものである請求項 2に記載の方法。

請求項 1に記載の方法によって、遺伝子治療において導入された遺伝子発現産物の活性を IJ御する方法。

導入された遺伝子が、血液蛋白質、サイトカイン、およびホルモンから選択されるいずれかの群に属する蛋白質の遺伝子である請求項 7に記載の方法。

血液蛋白質、サイト力イン、およびホルモンから選択されるいずれかの群に属する蛋白質が、下記の群より選択されたいずれかの蛋白質である請求項 8に記載の方法。

エリスロポエチン、顆粒球—コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージ—コロニー刺激因子、

ステムセルファクタ一、スロンボポェチン、腫瘍壊死因子 o\

トランスフォーミング成長因子^、 C D 4、

C D 4 5、骨形成因子、

ィン夕ーフエロン一ひ、ィン夕一フエロン一ァ、ィン夕ーロイキン一 1、ィン夕一ロイキン一 2、ィン夕一ロイキン一 6、ィン夕一ロイキン一 1 1、ィン夕ーロイキン一 1 2、表皮細胞成長因子、

酸性線維芽細胞成長因子、塩基性線維芽細胞成長因子、線維芽細胞成長因子一 I：血小板由来成長因子、血管内皮成長因子、神経成長因子、

脳由来神経栄養因子、インシュリン様成長因子— I、インシュリン様成長因子— I I、ヒト成長ホルモン、

パラサイロイドホルモン、血管新生阻害因子、

色素.上皮由来因子、および肝細胞成長因子

蛋白質が、エリスロポエチンである請求項 9に記載の方法。

発現産物の活性に干渉する蛋白質が、可溶ィ匕したエリスロポエチン受容体である請求項 1 0に記載の方法。

発現物質の活性に干渉する蛋白質が、他の蛋白質との融合蛋白質である請求項 1に記載の方法。

生体に導入された遺伝子の発現産物の活性に干渉する蛋白質を同じ生体内において発現することができる、当該発現産物の活性を制御するための発現べクタ一。

発現産物の活性に干渉する蛋白質が、他の蛋白質との融合蛋白質である請求項 1 3に記載の発現ベクター。

請求項 1 3に記載の発現べクタ一を有効成分として含む、生体に導入された遺伝子の発現産物の活性を制御するための組成物。

1 6 . 生体に導入された遺伝子の発現産物の活性に干渉する蛋白質を同じ生体内において発現することができる発現ベクターの、生体に導入された遺伝子の発現産物の活性を制御するための組成物の製造における使用。

1 7 . 発現産物の活性に干渉する蛋白質が、他の蛋白質との融合蛋白質である、請求項 1 6に記載の発現ベクターの使用。