WO2002042434A1

WO2002042434A1 - Cells to be used in producing virus vector, process for producing the same and process for producing virus vector with the use of the cells

Info

Publication number: WO2002042434A1
Application number: PCT/JP2001/010213
Authority: WO
Inventors: Takashi Shimada
Original assignee: Hisamitsu Pharmaceutical Co Inc
Current assignee: Hisamitsu Pharmaceutical Co Inc
Priority date: 2000-11-22
Filing date: 2001-11-22
Publication date: 2002-05-30
Anticipated expiration: 2003-05-22
Also published as: AU2002221033A1; EP1336652A1; JP2002153278A; US20040043490A1; EP1336652A4

Description

明細 i ウィルスベクターの製造に用いられる細胞、その製法およびその細胞を用いたウィルスぺク夕一の製造方法技術分野

本発明は、ウィルスベクター、とくに高力価ウィルスベクターの製造に用いられる細胞、その製法およびその細胞を用いたウィルスベクタ一、とくに高カ価ゥィルスべクタ一の製造方法に関する。

背景技術

近年、ヒトを含む動物に対し、遺伝子を導入する方法としてウィルスベクターを用いる方法が広く知られており、用いられるウィルスベクタ一としては、レト口 _sウィルス、レンチウィルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウィルスなどを利用したウィルスベクターが知られている。

アデノ随伴ウィルス（ A A V ： Adeno-Associated Virus) ベクターは、ゲノム D N Aを宿主染色体 D N Aへ組み込むことができるが、野生型 A A V自体は非病原 '性で fcる (N. IViuzyczka, Current Topics in icrobiolosv and Immunol oev， 158, 97， 1992) o A A Vベクタ一は、造血幹細胞等の非分裂細胞へも遺伝子導入ができることや、ヒトの第 1 9染色体に選択的に遺伝子導入することができる等の特徴がある（M. Su adogo and R. G.Roder, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82, 4394, 1985)。また、 A A V粒子は物理的に安定であるため、ショ糖密度勾配超遠心法や硫酸セルロースァフィ二ティ一クロマトグラフィー等による濃縮により遺伝子導入効率の高いベクタ一を調製することが可能である（K. Tamayose, et al., Hum. Gene Ther" 7, 507-513, 1996)。

A A Vは、自己複製能の欠損したウィルス（ Dependentvirus属）であり、増殖には、アデノウイルス（A d ： Adenovirus) などのヘルパーウィルスの存在が必要である。これまで、 A A Vベクタ一を用いる場合、ヘルパープラスミドとべク夕一プラスミドとのコトランスフエクシヨンに加え、ヘルパーウィルスであるァデノウィルスの感染を同時におこなうことによつて調製されていた（R. M. Kotin, Hum. Gene Ther. 5， 793, 1994)。しかし、リン酸カルシウム法に代表されるトランスフヱクシヨン法は、（ 1 ) プラスミドの細胞への遺伝子導入効率に限界があり、臨床の場で必要とされる高い力価のウィルスベクタ一を得ることは困難である、 ( 2 ) いくつかの口ヅトに分けてトランスフエクシヨンをおこなった場合に、各ロット間の遺伝子導入効率に差が生じ、一定の力価のウィルスベクターを安定的に供給することができない、（3 ) トランスフエクシヨンの操作が繁雑であるために、一度に大量のベクタ一を調製するのは困難である、（4 ) 大量の AAVベクタ一を調製するためには大量のトランスフエクシヨン用プラスミドを調製する必要がある、等の問題点が存在する。

このような問題点を解決する手段として、ヘルパープラスミドを、ウイルスべク夕一産生細胞のゲノム D N Aに組み込んだパッケージング細胞が考えられている。この細胞株は、プラスミド由来の D NAがゲノム: D NAに安定的に組み込ま. れているため細胞分裂の際にも娘細胞に受け継がれることから、任意の規模で培養することにより、必要に応じた量の組換えウィルスを安定的に得ることができる。一般的に、これらのパッケージング細胞株の樹立は、ネオマイシン耐性遺伝子や、ハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子を保持したヘルパーブラスミドを、ウィルスぺクタ一を産生させるための細胞にトランスフエクシヨンすることにより行われ、その細胞を抗生物質の含有する培地で長期間培養することにより、ゲノム D N Aにプラスミド由来の遺伝子が組み込まれたパッケージング細胞が得られる。 AAVベクタ一の調製には、アデノウイルスの E 1 A、 E 1 B 遺伝子を恒常的に発現している 2 9 3細胞が用いられている。 2 9 3細胞は、ヒト胎児腎細胞がアデノウイルス 5型（A d 5 ) の E 1遺伝子（E 1 Aおよび E 1 B遺伝子）により形質転換して樹立された細胞株である。

アデノウィルスの E 1 A蛋白質は、 AAVの p 5プロモ一夕一からの転写を誘導し、 AAVの R E P蛋白質を発現させる。 R E P蛋白質は、 AAVゲノムがヒトの第 1 9染色体に選択的に遺伝子導入される際に必要な蛋白質であると同時に、細胞の蛋白質合成系を、 AAV粒子を作らせる方向に向かわせると考えられている。しかしながら、 R E P蛋白質は細胞毒性を有し、細胞の増殖を抑制する性質を有する。さらにまた、アデノウイルスの E 1 Bと E 4は mR NAの蓄積、 E 2 Aと V Aは mR N Aのスブライシングと翻訳に必要であると考えられている (N. Muzyczka, Current Tonics in Microbiology and Immunology, 158， 97, 199^₀ アデノウイルス 5型の E 1遺伝子を恒常的に発現している 2 9 3細胞では、ァデノウィルスの混入がなくても AAVの p 5プロモー夕一が活性化され、 R E P 蛋白質が発現する。この R E P蛋白質を恒常的に発現させると細胞の増殖阻害が起こるため細胞が死滅する。このような理由から 2 9 3細胞での AAVベクタ一のパヅケ一ジング細胞の製造は困難であった。さらに、 R E P蛋白質は、ヘルパ —ウィルスであるアデノウィルスの増殖を抑制する作用があり、 r e p遺伝子が恒常的に発現した細胞の中では、アデノウィルスの増殖が抑制されてしまう。 r e p遺伝子産物（すなわち、 R E P蛋白質）の細胞への毒性、およびヘルパーウィルスのアデノウィルスの増殖抑制を回避するために、様々な方法が検討されている。 A A Vベクタ一に組み込まれるベクタ一プラスミド由来の遺伝子配列のみを導入して樹立したパッケージング細胞に対して、 r e pおよび/または c a P遺伝子をコードする遺伝子を公知の方法により導入し、 AAVベクタ一を調製する方法も考えられている。こので e pおよび Zまたは c a p遺伝子をコードする遺伝子配列の細胞への導入法には、大きく分けて、組換えウィルスを用いる方法と用いない方法があるが、アデノウイルスを用いる方法では遺伝子導入効率が高く、力価がより高い AAVベクタ一を産生するのに好ましい。

パッケージング細胞に 2 9 3細胞を使用した場合には、この細胞にすでにアデノウィルスの E 1遺伝子が保持されているため、 A A Vベクタ一を製造する際、野生型アデノウイルスではなく、 E 1欠損型アデノウイルスを感染させるだけでも、 AAVベクタ一を製造することができる。そこでこの E 1欠損領域に AAV の r e pおよび Zまたは c a p遺伝子をコードする遺伝子配列を組み込んだァデノウィルスによって R E Pおよび/または C A P蛋白を供給する方法が考えられた。しかしながら、公知の C O S— T P C法（鐘ケ江ら、実験医学 Vol. 12, No. 3， 1994, S. Miyake. Et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93, 1320, 1996、特閧平 8— 8 4 5 8 9号、特閧平 7— 2 9 8 8 7 7号）によりアデノウイルスを調製しようとすると、 2 9 3細胞において R E P蛋白質の発現が起こるため、： r e p遺伝子をゲノム配列内に保持したアデノウィルスを得ることができない。特開平 1 0— 3 3 1 7 5号では、 C r e/ 1 o x P発現制御システムを用いて r e p遺伝子の発現を制御することによって、 2 9 3細胞における組換え AAV ベクタ一を製造する方法が開示されている。しかしながら、この方法を用いても、 C r e / 1 o x P発現制御システムでの r e ρ遺伝子の発現制御は完全ではない。また、 AA Vベクタ一を製造する場合に、 C r eを供給して Ι ο χ Ρを切り出す必要があり、操作が煩雑で、さらに C r eの供給についても非常に調整が難しく発現制御が不安定となるなどの問題点があつた。

このように、従来の方法では、操作が煩雑であること、プラスミドではすベての細胞に一様に遺伝子導入できないこと、プラスミド DNAが残留すること、コストが高いことなどの理由から、所望の AAVベクターを効率よく製造する方法が望まれていた。

発明の開示

したがって、本発明の目的は、煩雑な操作を必要とせず、ウィルスベクターを効率よく製造するための新規細胞系を樹立し、該細胞系を用いた高力価ウィルスベクターの製造方法を提供することにある。

本発明者は、前記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ウィルスベクターの製造に用いる新規細胞系を樹立し、該細胞系を用いた高力価ウィルスベクターの製造方法を見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、ウィルスベクタ一の製造に用いられる細胞であって、細胞毒性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が発現するセンス R N Aの全配列または一部配列に対するアンチセンス： R N Aを発現するアンチセンス遺伝子が

1又は 2以上導入された、前記細胞に関する。

また本発明は、細胞毒性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が、ウィルスベクター由来の遺伝子である、前記細胞に関する。

さらに本発明は、ウィルスベクタ一由来の遺伝子が、アデノ随伴ウィルスべク夕一由来の遺伝子である、前記細胞に関する。

また本発明は、アデノ随伴ウィルスベクタ一由来の遺伝子が、 r e p遺伝子である、前記細胞に関する。

さらに本発明は、アンチセンス遺伝子が、配列番号 1で示される配列およびノまたは該配列の一部が欠失、置換若しくは付加された配列に対するアンチセンス

R N Aを発現するアンチセンス遺伝子である、前記細胞に関する。

また本発明は、細胞が、受託番号が F E RM B P— 7 3 7 7の細胞である、前記細胞に関する。

さらに本発明は、細胞毒性を有するポリペプチドが、ヘルパーウィルスの増殖を阻害するポリペプチドである、前記細胞に関する。

また本発明は、ヘルパーウィルスが、アデノウイルスである、前記細胞に関する。

さらに本発明は、ウィルスベクタ一の製造に用いられる細胞を製造する方法であって、細胞毒性を有するポリべプチドをコードする遺伝子が発現するセンス R N Aの全配列または一部配列に対するアンチセンス R N Aを発現するアンチセンス遺伝子を 1又は 2以上導入することを特徴とする、前記方法に関する。

また本発明は、細胞毒性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が、ウィルスぺク夕一由来の遺伝子である、前記方法に関する。

さらに本発明は、ウィルスベクター由来の遺伝子が、アデノ随伴ウィルスべク夕一由来の遺伝子である、前記方法に関する。

また本発明は、アデノ随伴ウィルスベクタ一由来の遺伝子が、 r e p遺伝子である、前記方法に関する。

さらに本発明は、アンチセンス遺伝子が、配列番号 1で示される配列およびノまたは該配列の一部が欠失、置換若しくは付加された配列に対するアンチセンス R N Aを発現するアンチセンス遺伝子である、前記方法に関する。

また本発明は、細胞が、受託番号が F E RM B P— 7 3 7 7の細胞である、前記方法に関する。

さらに本発明は、細胞毒性を有するポリペプチドが、ヘルパーウィルスの増殖を阻害するポリペプチドである、前記方法に関する。

また本発明は、ヘルパーウィルスが、アデノウイルスである、前記方法に関する ο

さらに本発明は、前記細胞を用いてウィルスベクターを製造する方法であって、ウィルスベクター由来の遺伝子を発現するへルパ一ウィルスを得る工程、およびアンチセンス遺伝子が導入されていない細胞に、ウィルスベクター由来の遺伝子を発現するへルパ一ウィルスとウィルスベクタ一プラスミドをトランスフエクシヨンする工程

を含むことを特徴とする、前記方法に関する。

本発明によれば、目的のウィルスベクターを製造するために、細胞毒性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が、ウィルスベクタ一の製造に用いられる細胞に導入され、細胞内で発現する可能性がある場合でも、細胞内ではアンチセンス遺伝子が恒常的に発現しており、' ^¾細胞毒性を有するポリぺプチドをコ一ドする遺伝子の発現を抑えることができる。

すなわち、本発明の細胞自体が、細胞毒性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現を抑えるので、従来の C r e 1 o x P発現制御システムを利用した場合のように、細胞毒性を有するポリぺプチドをコードする遺伝子に特別な配列を挿入しておく必要もなく、また、遺伝子の発現制御をするために、特別な酵素を細胞内に与える必要もなくなるので、簡便な操作で効率的に目的のウィルスベクターを製造することができる。

なお、受託番号が F E RM B P— 7 3 7 7の細胞は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センタ一（〒 3 0 5— 8 5 6 6日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号）に 2 0 0 0年 1 1月 2 1日付で寄託された細胞である。

図面の簡単な説明

図 1は、本発明の r e pアンチセンスを発現する細胞を確認したノーザンハイブリダィゼ一シヨンの結果を示す写真である。

図 2は、本発明の A dZA A V溶液を用いて調製した組換え A A Vベクタ一溶液と、従来のプラスミドを用いて調製した組換え AAVベクタ一溶液との遺伝子導入効率を比較したグラフである。

図 3は、プラスミド pCAGS/LNの構成を示す概略図である。

図 4は、プラスミド pCAGS-r/anti-p5+pl9/LNの構成を示す概略図である。図 5は、プラスミド pAAV/Adの構成を示す概略図である。

図 6は、コスミド pAdexlwの構成を示す概略図である。

図 7は、コスミド pAdexlw/AAVの構成を示す概略図である。図 8は、 pAdexlw/AAVを E c o T 2 2 I処理した C O S— T P Cを示す概略図である。

図 9は、組換え A A Vベクタ一べク夕一プラスミド pCAGSETN/sub の構成を示す概略図である。

図 1 0は、本発明の r e pアンチセンスを発現する細胞に導入した P C R増幅産物（P 5— 1 9 /P C R ) の塩基配列である。

発明を実施するための形態

本明細書でいう「ウィルスベクタ一」とは、自然界に存在するウィルスを組換え DNA技術により改変したもので、任意の遺伝子をウィルスのゲノムに挿入したものをさす。ウィルスベクターは、ウィルスゲノムが DNAである DNAウイルスべクタ一と、ウィルスゲノムが RNAである RNAウィルスベクタ一に大別できる。ウィルスベクタ一は、ウィルスがもともと持つ遺伝子導入活性をを利用して、任意の遺伝子を標的細胞に導入して発現させる機能を有している。このようなウィルスベクターとしては、アデノ随伴ウィルス (AAV) ベクター、アデノウィルスベクタ一、マウス白血病ウィルス（MoMLV) ベクタ一、ヒト免疫不全ウィルス (H I V) ベクター、サル免疫不全ウィルス (S I V) ベクター、センダイウィルスベクター、ヘルぺスウィルスベクターなどがあげられる。また、ウィルスベクタ一の構成蛋白質群のうち 1つ以上を、異種ウィルスの構成蛋白質に置換する、もしくは、遺伝子情報を構成する核酸配列のうち 1部を異種ウィルスの核酸配列に置換する、シユードタイプ型のウィルスベクターも本発明に使用できる。

また、高力価ウィルスベクターとは、力価の高いウィルスベクタ一のことをいい、遺伝子導入効率が高いウィルスベクターのことをいう。ウィルスベクタ一の力価は、通常、 CFU (colony forming units) で表される。例えば、ウィルスゲノムにネオマイシン耐性遺伝子を挿入、もしくは置換したウィルスぺク夕一を任意の細胞に遺伝子導入して、ネオマイシン含有培地で生育した細胞のコロニー数を数えるという方法で評価される。

本明細書でいう「ヘルパーウィルス」とは、単独では複製し得ないウィルスべクタ一の複製を誘導するために必要とされるウィルスをいう。例えば、 AA Vでは、自己複製能の欠損したウィルスであり、それ自身の複製にはアデノウイルスあるいはヘルぺスウィルスのいずれかが必要である。このようなアデノウィルスあるいはヘルぺスウィルスが、 A A Vのヘルパーウィルスである。

本明細書でいう「ヘルパープラスミド」とは、例えば、野生型 A A Vのゲノムの 5 '末端側の I T Rおよび 3 '末端側の I T R配列の間の構造遺伝子を切り出し、それ自身はパッケージングされず、 A A Vベクタ一の産生に必要な蛋白質を発現することを可能とする遺伝子配列を保持するようなプラスミドのことである。へルパープラスミドは、公知の方法により構築することができる。ここで、野生型八¥の1丁11 (inverted terminal repeat) とは、 A A Vのゲノム D N Aの両末端に存在する 1 4 5塩基の配列であって、 T型のヘアピン構造を持ち、ウィルスの複製、パッケージング、染色体への組み込み等に必須である（R. Samulski et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 2077, 1982)。このへルパープラスミドにはプロモ —夕一配列がなく、 A A V由来のプロモーターからのみ AA V遺伝子は発現される。 AA Vベクタ一の製造に用いるヘルパープラスミドは、パッケージング細胞を 2 9 3細胞とすることにより、 p 5からの転写ができる。ここでいう p 5とは、 AAVのプロモ一夕一であって、通常、 r e p遺伝子の上流に存在する。

本明細書でいう「ベクタープラスミド」とは、導入する目的の外来遺伝子（導入用遺伝子）を有するプラスミドで、例えば、 p s u b 2 0 1に代表される野生型 A A Vの全ゲノム配列をコ一ドするプラスミドのゲノムの 5 '末端側の I T R と 3 '末端側の I T R配列間の野生型 A A Vゲノム配列が、少なくとも 1つの遺伝子マーカ一および/または導入用遺伝子で置換されている A A Vベクタ一ブラスミドをいう。導入用遺伝子は、少なくとも 1つのプロモー夕一とポリ Aシグナルを含み、プロモーターとしては、アデノウイルス（A d )、サイトメガロウイルス（CMV)、ヒト免疫不全ウィルス（H I V)、アデノ随伴ウィルス（AAV)、シミアンウィルス 4 0 (SV40)、ラウス肉腫ウィルス（RSV)、単純ヘルぺスゥィルス（HSV)、マウス白血病ウィルス（MoMLV)、シンビスウィルス（Sindbis virus) s センダイウィルス（SeV)、 A型肝炎ウィルス（HAV：)、 B型肝炎ウィルス（HBV)、 C型肝炎ウィルス（HCV)、ヒトパピローマウィルス（HPV)、ゥシパピローマウィルス（BPV)、ヒト T細胞白血病ウィルス（HTLV)、水疱性口内炎ウィルス（VSV)、インフルエンザウイルス（Influenza virus)、日本脳炎ウィルス（Japanese encephalitis viru 、 JCウィルス（ JC viru^ パルボウイルス B19

(Parvovirus B19)、ポリオウイルス（Poliovirus) 等のウィルス由来のプロモー夕 ―、 SR - (シグナル認識粒状レセプ夕一のアルファサブュニヅト）、ミエリン塩基性蛋白質（MBP)、グリア特異的グリア線維性酸性蛋白質（GFAP)、 β—ァクチン、伸長因子—ひ (EF 1—ひ）、グリセルアルデヒド一 3—リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH)、多剤耐性遺伝子（Mdrl)、アルブミンアルファフエトプロティン（AFP)、熱ショック蛋白質（HSP)、低酸素誘導蛋白質（H I P) 等の哺乳類由来のプロモ一夕一、もしくは、 CMV初期ェンハンサ一ノトリ/?ァクチンプロモ一夕一//?グロビンポリ Aからなるキメラプロモ一夕一（CAG)、 CMV 初期ェンハンサ一 /アルファースケルトンァクチンプロモ一夕一からなるキメラプロモーター等のキメラ型プロモーター等を含む。また、遺伝子とそれらを発現させるレトロウィルス由来のプロモーターである LTR を、 LTRの U3領域を例えば、 CAG、 CMV、 RSV、単純へルぺスゥィルス—チミジンキナーゼ（HSV一 TK：)、 SV 4 0、 SR—ひ、 MBP、 ?—ァクチン、 EF1 —ひ等のプロモ一夕一に置換した、キメラ型 LTR等が挙げられるが、遺伝子の発現効率が高く、プロモー夕一に宿主、臓器特異性がないため、各種実験動物やヒトの様々な臓器で、遺伝子を高発現できる等の理由から CAG プロモー夕一が好ましい。ネオマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子を選択のために組み込むこともできる。

本明細書でいう「パッケージング細胞」とは、感染性を有するウィルス粒子を産生するために、必要な蛋白質をコードする遺伝子を染色体に組み込むなどしてあらかじめ導入した細胞のことであるが、パッケージング細胞で産生されるゥィルス粒子はウィルスゲノムを保持しない。パッケージング細胞に、任意の遺伝子を揷入、もしくは置換したウィルスゲノムを供給することによって、このウィルスゲノムはウィルス粒子に取り込まれ、ウィルスベクタ一が産生されるというものである。パッケージング細胞に用いられる細胞には、 2 9 3細胞、 H e L a細胞、 COS細胞、 3 T 3細胞などが挙げられる。 AAVベクター作製に際してはへルパーウィルスが必要であるので、ヘルパーウィルスであるアデノウィルスが感染しゃすい 2 9 3細胞が好ましい。本明細書でいう「細胞毒性を有するポリペプチド」とは、ウィルスベクタ一を製造するための細胞内で産生された場合、細胞毒性によって該細胞が正常な状態を保てなくなる原因となる蛋白質を含むポリペプチドをいう。例えば、 r e p遺伝子にコードされる R E P蛋白質、 H I Vの env遺伝子にコードされるウィルス皮膜蛋白質（ENV)、 VSVの G遺伝子にコードされるウィルス皮膜蛋白質（ VSV 一 G) などがあげられる。

本明細書でいう「r e p遺伝子」とは、 A A V由来の遺伝子であって、 AAV の複製に関与する R E P蛋白質をコードしている遺伝子である。 r e p遺伝子は、ウィルス p 5プロモ一夕一から転写、翻訳される Large Rep (Rep78、 Rep68) と 1 9プロモー夕一から転写、翻訳される Small Rep ( Rep52, Rep40) の 4つの蛋白質をコードしている。 Large Repと Small Repはスプライシングによってサィズが変わる。 r e p遺伝子にコードされる R E P蛋白質は、 AAV複製に関与するが、一方でアデノウイルスの複製は阻害し、細胞毒性を有する。 r e p遺伝子の塩基配列については配列番号 5および配列番号 6で示しているが、この配列だけに限定されるものではない。実質的に同等の機能および性質を有していれば、配列の一部が欠失、置換または付加されていても、本明細書でいう r e p遺伝子に ι3まれる。

本発明の細胞に導入されるアンチセンス遺伝子は、 1又は 2以上のアンチセンス遺伝子であってよい。アンチセンス遺伝子が 2以上細胞に導入される場合、ァンチセンス遺伝子は、同種のアンチセンス遺伝子が複数コピー導入されていてもよく、また、異種のアンチセンス遺伝子、すなわち、異種のポリペプチドをコ一ドする複数の遺伝子に対する複数のアンチセンス遺伝子が導入されていてもよい。さらに、細胞毒性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現を抑える性質を有する限り、アンチセンス遺伝子の塩基配列が一部が欠失、置換若しくは付加された配列であってもよい。

以下、本発明を実施例を示しながら、さらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。

[実施例:！

害施例 1 プラスミド pCAGS-r/anti-p5+_P19/LNの構築 r e p遺伝子の p 5プロモー夕一の転写開始点を含むように、 B g 1 I Iサイトをデザインしたプライマ一（repS； 5，： -GAAGATCTTCCATT TTGAAGCGGGAGGTTTGAACG-3⁵ ； (配列番号 2 )；下線は B g 1 I Iサイトを示す）と、 p 19プロモー夕一の転写開始点から約 200 bp 下流に、 Bgl I Iサイトをデザインしたプライマ一（repA ; 5⁵ ； -GA AGATCTGAATTCGCCGCATTGAAGGAGATGTATGAG

G— 3，；（配列番号 3)；下線は Bgl I Iサイトを示す）を設計した。

A A Vの全構造遺伝子を保持するプラスミド pAAV/Ad (Samulski, R. J. et al., J. Virol., 63, 3822 - 3828, 1989；図 5 ; Samulski氏より入手）を鎵型にして、； r θ Ρ遺伝子のコーディング領域の一部を PCR (ポリメラ一ゼ連鎖反応）により増幅した。 PCR条件は、 94°Cで 5分反応後、 94°C30秒、 61°C30秒、 7 2°C1分を 30サイクルし、再度 72 °Cで反応を行った。 PCR反応物を、常法にしたがい、 2%ァガロースゲル、 1 X TAEバッファ一を用いて電気泳動を行い、終濃度 S^gZmlのェチジゥムブロマイドにより染色し、紫外線照射により観察したところ、約 0. 8 kbの増幅産物が得られたことが確認された。

この約 0. 8 kbの増幅産物をゲルから回収し、 Bgl I I消化した。一方で、 pCAGS/LN (図 3) を BamH I消化後、末端を BAP処理により脱リン酸化し、前述の Bgl I I消化した増幅産物をサブクローニングした。サブクローニングで得られたクローンの塩基配列の解析を行い、 C AGプロモ一夕一から r e p遺伝子のアンチセンスが転写される方向に断片が組み込まれたクローンを選択した ( pCAGS-r/anti-p5+_P19/LN；図 4 )。

なお、増幅産物の塩基配列は図 10に示す。

ここで、 C AGプロモーターとは、 CMV初期ェンハンサ一 /トリ^アクチンプロモ一夕一/ 5グロビンポリ Aからなるキメラプロモ一夕一である。

また、図中の ampは、選択マ一カーとして使用できるアンピシリン耐性遺伝子を示す。

CMV - I Eェンハンサ一は、サイトメガロウィルス（CMV) 由来の初期プロモ—夕一のェンハンサ—配列を示す。

SV40 oriは、シミアンウィルス 40 (SV40) 由来で、 SV40 Large T抗原により複製される複製起点を示す。

ゥサギ ?一グロビン poIyAは、ゥサギ ?一グロビン遺伝子由来のポリ Aシグナルを示す。

実施例 2 プラスミド pAdexlw/AAVの構築

pAAV/Ad (図 5) から、八八¥の 6 遺伝子ぉょび0 & 遺伝子を含む約 4. 3kbの Xb a l断片を回収した。次にこの Xba l断片をコスミド pAdexlw (Miyake, S. et al Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 93， 1320-1324, 1996.；図 6 ；斉藤氏より入手）の Swa l部位にサブクローニングし、コスミド pAdexlw/AAV (図 7) を構築した。なお、遺伝子断片の回収およびサブクローニングは実施例 1と同様にして行った。

また、図中のアデノウイルス I TR (Ad I TR) は、アデノウイルス 5型由来の I T R (Inverted Terminal Repeat) を示す。

repは、 AAV 2型由来の rep遺伝子を示す。

capは、 AAV 2型由来の cap遺伝子を示す。

COSは、えファージ由来のパヅケージング認識配列を示す。

pBR322 oriは、 pBR322由来の大腸菌内でのプラスミド複製起点を示す。

実施例 3 r e pアンチセンス発現細胞株の樹立

r epアンチセンス発現細胞株を樹立するために 293細胞を用いた。 293 細胞を 10%牛胎児血清（Gibco社製）および抗生物質を補充したダルベッコ改良イーグル培地（DMEM； Gibco社製）中に維持した。この細胞を 10 cmのディヅシュで約 70 %コンフルェントの状態に培養して、構築したプラスミド pCAGS/ anti-p5+pl9/LN (図 4)を公知のリン酸カルシウム法（ M. Kringler, Gene Transfer and Expression Protocol., A Labolatory Manua, Oxford University Press, 1990) によりトランスフエクシヨンした。トランスフエクシヨンした 293細胞を C 0₂ィンキュベー夕一内（培養条件；細胞は 10 %ゥシ胎仔血清（FBS、 Gibco 社製）を含むダルべヅコ改変イーグル培地（DMEM、 Gibco社製）を用いて 5% 酸素濃度、 37°C条件下で培養した）で 4時間インキュベーションした後、新鮮な培養液に置換してさらに 2日間ィンキュベーションした。

次にトランスフエクタントのみを選択するために、リン酸バッファ一（PBS (一）、 Gibco社製）で細胞を 2度洗浄後、トリプシン— E D T A混液により細胞を培養皿から剥がし、新しい 10 cmの培養皿に再播種した。細胞が培養皿に接着したのを確認後、ネオマイシンの類縁物質である G418 (Gibco社製）を培養液中に最終濃度 1000 g/mlになるように添加した。 C0₂インキュベー夕一内で 10日間インキュベーションを続けた後、生き残った細胞集団（コロニー）を 1つずつ分離し、新鮮な培養液中でさらにィンキュベ一シヨンを続け、ネオマイシン耐性細胞株（r epアンチセンス発現細胞）を得た。

実施例 r epアンチセンス発現量の確認

実施例 3で得られた r e pアンチセンス発現細胞から AGP C (Acid- Guanidium-Phenol-Chroloform) 法により全 RNAを抽出して使用した。調製したトータル RNA ( 1 5 ju g) を 1 %ホルムアルデヒド—ァガ口一スゲルで電気泳動し、ニトロセルロースフィル夕一（Hy b 0 ndN⁺：アマシャム社製）に固定化した。 pAAV/Ad (図 5) を Xb a Iおよび S a c Iで消化し、約 630 b Pの r e p遺伝子の P 5プロモ一夕一領域に特異的な D N A断片（配列番号 4) を回収した。

この断片を³² Pでラベルしたプロ一プを用いてノーザンハイブリダィゼーション（42°C、 12時間）を行った。メンプレンを 5 XSSC、 50%ホルムアミド、 I Xデンハールト水溶液、 0. 2%SDS、 10%硫酸デキストラン、熱変性させた 200 /g/mlのサケ精巣 DNAを含むバッファ一中に入れ、ラジオアイソト一プでラベルしたプロ一ブ DNAを加え 65°Cでハイブリダィズした。その後フィル夕一を 55°Cの 2 X S S C/0.5 %SD Sバッファ一中で洗浄し、さらに 55°Cの 0. 1 XSS CZ0. 5 %SDSバッファ一中でもう一度洗浄した。 X線フィルム上でォ一トラジオグラフィーにかけて、ネオマイシン耐性細胞株における r epアンチセンスの発現を碑認した（図 1)。特にクローン L 9/ 293 (以下、 L 9/293細胞と称する）は、高い r e pアンチセンスの発現を示した。

なお、 L 9/2 93細胞は r ep遺伝子のアンチセンス（配列番号 1 ) を恒常的に発現する細胞株であって、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に 2000年 1 1月 2 1日付で寄託され、寄託番号 FERM BP— 7377として受託された。

実施例 5 rep— cap発現アデノウイルスの作製

本実験で用いられる組換えアデノウイルスベクタ一は C 0 S— T P C法 (Miyake, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA.,93, 1320, 1996) に従って作製した。構築したコスミド pAdexlw/AAVをと EcoT22 I処理した C OS- TP C (図 8) を 5〃gとを、リン酸カルシウム法にて実施例 4で樹立した r e pアンチセンス発現細胞の L 9/293細胞（図 1) にトランスフエクシヨンした。 37。C、 5%C0₂条件下で 12時間培養した後、細胞を 96穴プレートに播種し、さらに 10〜15日間培養を続けた。細胞が死滅したゥエルから死滅細胞ごと培養液を回収し、凍結融解を 6回繰り返した後、 5， 000 rpm、 5分間遠心分離した。上清を 1次ウィルス液として一 80°Cにて保存した。 1次ウイルス液を L 9/293細胞および H e La細胞にそれそれ感染させた。感染 3日後に H e L a細胞では変性が認められず、 L 9/293細胞が完全に死滅した 1 次ウィルス液について、クローンの L 9/293細胞から死滅細胞ごと培養液を回収した。回収した培養液は、凍結融解を 6回行った後、 5, 000 rpm、 5 分間遠心分離した。上清を 2次ウィルス液として— 80°Cにて保存した。

2次ウィルス液を調製した際の細胞を回収し、 1 XTEN緩衝液（TEN : 5 OmM T r i s -HC 1 (pH 8. 0)、 10 mM EDTA、 100 mM NaC 1) 中に懸濁しホモジナイズした。ホモジナイズした懸濁液に SDS ( 1 0 ) を終濃度 0. 1 %、 Proteinase K (MERCK社製、 2 Omg/m 1 ) を 0. lmgZmlとなるように加え、緩やかに転倒混和し、 50°Cで 1時間インキュペートした。フヱノール ·クロ口ホルム抽出を 2回行い、回収した上清からさらにクロ口ホルム抽出を 2回行い上清を回収した。ェ夕ノ一ル沈澱により回収した DNAに適量の TE緩衝液（ 1 OmM Tr i s-HCl (pH 8. 0)、 1 m M EDTA) を加え、 DNAを溶解した。この DNAを E c o R I消化した後に、ァガロースゲル電気泳動を行い、アデノウイルスゲノムおよび、挿入遺伝子の有無を確認した。

この操作で選択したクローンの 2次ウィルス液から、 L 9/293細胞に感染させ、細胞が死滅したものについて、死滅細胞ごと培養液を回収し、凍結融解を 6回繰り返した後、 3, 000 rpm、 10分間遠心分離した。上清を 3次ウイルス液として一 80°Cにて保存した。同様の操作でスケールアップを行い、最終的に 4次ウィルス液（以下、 Ad/AAV溶液と称す）を調製し、 — 80°Cにて保存した。

実施例 6 Ad/A A V溶液を利用した組換え A A Vベクターの調製

Ad/AAV溶液を用いて、 AAVベクタ一の調製を行った。

293細胞を 10 cmシャーレで、 10mlの D MEM ( 10%F C S) を用いて 70%コンフルェントの状態になるまで培養した。

実施例 5で調製した Ad/AAV溶液 60〃1を加ぇたDMEM(2%FCS) lmlを、培地を除いたシャーレに加えて、 1時間インキュベートした。 DME M ( 10%FCS) を 8ml加えた後、 AAV由来の I TRの間に C AGプロモ一ターで誘導される EGFP (ォワンクラゲ由来の緑色蛍光蛋白質で、紫外線照射下で緑色蛍光を発するという性質を有する）遺伝子と、 TKプロモーター（単純へルぺスウィルスのチミジンキナーゼ遺伝子由来のプロモ一夕一）で誘導されるネオマイシン耐性遺伝子を含む組換え AAVベクターベクタ一プラスミド pCAGSETN/sub (図 9 ) 10〃 gをリン酸カルシウム法により 293細胞に小ランスフエクシヨンした。 6時間後に培地を除去し、 DMEM (10%FCS) を 6 ml加えて、 2日間培養した。

細胞を培養液ごとかき集め、凍結融解を繰り返して細胞を破壊した後、 3, 0 00 r pm、 10分間遠心分離し、上清を回収した。 56°Cで 45分間加熱して、アデノウイルスを不活化した後、 3, 000 rpm、 10分間遠心分離し、上清 (組換え AAVベクタ一溶液）を回収した。

実施例 7 A A Vベクタ一の力価測定

実施例 6で得られた組換え A A Vベクタ一の力価を、以下に示す He La細胞を用いたバイオアツセィ法により検定した。

1 X 10⁵個の He La細胞を 6ゥエルの培養皿に播種し、一晩 CO ₂インキュベ一夕一内に放置した。細胞を PBS (—）で 2度洗浄後、 lmlの組換え AA Vベクター溶液を添加した。 4時間 C0₂インキュベーター内に放置した後、 1 0%FCSを含む3mlのDMEMを添加し、 2日間 C 0₂インキュベータ一内でインキュベーションした。 PBS (—）で洗浄後トリプシン一 EDTA混液で細胞を培養皿から剥がし、新しい 10 cmの培養皿に再播種した。細胞が培養皿に接着したのを確認後、ネオマイシンの類縁物質である G 418 (Gibco社製）を培養液中に最終濃度 1000 /g/mlになるように添加した。 C0₂インキュぺ一夕—内で 10日間ィンキュベ一ションを続けた後、生き残った細胞集団（コロニー）をクリスタルバイオレットによって染色し、染色されたコロニーをカウントした（図 2)。対照として、未処置の HeLa細胞を G418処理した際のコロニ一数を示す。その結果、 repアンチセンス発現細胞株を用いることによつて、 AAVベクタ一を作製することが可能であることが明らかとなった。

以上の結果から、

(1) 細胞毒性を有する rep遺伝子をアデノウイルス（ヘルパーウィルス）ゲノムに揷入する工程、

(2) 前記ヘルパーウィルスを大量増殖させる工程、

(3) 前記ヘルパーウィルスを用いて AAVべク夕一を作製する工程、を含む AAVベクタ一の製造方法において、（2) の工程で、本発明のアンチセンス遺伝子を導入した細胞を用いることで、煩雑な操作をする必要がなく細胞毒性を有する Rep蛋白質の産生を抑制することで、細胞の死滅を防ぎ、ヘルパーウィルスを製造することができることが示された。

産業上の利用可能性

本発明の、細胞毒性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が発現するセンス RN Aの全配列または一部配列に対するアンチセンス RN Aを発現するアンチセンス遺伝子を導入した細胞を用いることによって、高力価ウィルスベクタ一溶液を得ることができる。

Claims

請求の範囲

1. ウィルスベクタ一の製造に用いられる細胞であって、細胞毒性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が発現するセンス R N Aの全配列または一部配列に対するアンチセンス RN Aを発現するアンチセンス遺伝子が 1又は 2以上導入された、前記細胞。

2. 細胞毒性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が、ウィルスベクタ一由来の遺伝子である、請求項 1に記載の細胞。

3. ウィルスベクタ一由来の遺伝子が、アデノ随伴ウィルスベクター由来の遺伝子である、請求項 2に記載の細胞。

4. アデノ随伴ウィルスベクタ一由来の遺伝子が、 rep遺伝子である、請求項 3に記載の細胞。

5. アンチセンス遺伝子が、配列番号 1で示される配列および/または該配列の一部が欠失、置換若しくは付加された配列に対するアンチセンス RNAを発現するアンチセンス遺伝子である、請求項 1に記載の細胞。

6. 細胞が、受託番号が F E RM BP-7377の細胞である、請求項 5に記載の細胞。

7. 細胞毒性を有するポリペプチドが、ヘルパーウィルスの増殖を阻害するポリペプチドである、請求項 1に記載の細胞。

8. ヘルパーウィルスが、アデノウイルスである、請求項 7記載の細胞。

9. ウィルスベクタ一の製造に用いられる細胞を製造する方法であって、細胞毒性を有するポリぺプチドをコードする遺伝子が発現するセンス RN Aの全配列または一部配列に対するアンチセンス RN Aを発現するアンチセンス遺伝子を 1又は 2以上導入することを特徴とする、前記方法。

10. 細胞毒性を有するポリペプチドをコードする遺伝子が、ウィルスベクター由来の遺伝子である、請求項 9に記載の方法。

11. ウィルスベクタ一由来の遺伝子が、アデノ随伴ウィルスベクタ一由来の遺伝子である、請求項 10に記載の方法。

12. アデノ随伴ウィルスベクタ一由来の遺伝子が、 rep遺伝子である、請求項 11に記載の方法。

13. アンチセンス遺伝子が、配列番号 1で示される配列および/または該配列の一部が欠失、置換若しくは付加された配列に対するアンチセンス RNAを発現するアンチセンス遺伝子である、請求項 9に記載の方法。

14. 細胞が、受託番号が FERM BP— 7377の細胞である、請求項 13 に記載の方法。

15. 細胞毒性を有するポリペプチドが、ヘルパーウィルスの増殖を阻害するポリペプチドである、請求項 9に記載の方法。

16. ヘルパーウィルスが、アデノウイルスである、請求項 15記載の方法。

17. 請求項 1〜8のいずれかに記載の細胞を用いてウィルスべク夕一を製造する方法であって、

ウィルスベクター由来の遺伝子を発現するヘルパーウィルスを得る工程、および

アンチセンス遺伝子が導入されていない細胞に、ウィルスベクタ一由来の遺伝子を発現するヘルパーウィルスとウィルスベクタープラスミドをトランスフエクシヨンする工程

を含むことを特徴とする、前記方法。