JPH08504102A - 組換えウイルスベクター系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、図に示される組換えＤＮＡ断片を複製し、アテノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質から構成されるウイルス粒子へキャプシド化するための系に関する。本発明は、遺伝病患者の治療に使用することができる組換えウイルス株を得るための手段を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 組換えウイルスベクター系 １．序論 本発明は、組換えＤＮＡ断片を複製し、アデノウイルス随伴ウイルス（adenov irus associated virus ：ＡＡＶ）キャプシドタンパク質から構成されるウイル ス粒子へキャプシド化（encapsidation）するための系に関する。本発明は、遺 伝病に苦しんでいる患者の治療に用いられる組換えウイルス株を得るための手段 を提供する。 ２．発明の背景 最もよく研究されている遺伝子治療のモデルは、病気の表現型を修正するため に新しい遺伝情報を発現する組換え病原ウイルスを用いる遺伝子導入を伴うもの である。最近まで、最も広く研究されてきた遺伝子治療用のウイルスベクターは レトロウイルスであった（Miller，A.D.，1990，Human Gene Ther．1：5-14）。 レトロウイルスの使用は、例えば、挿入突然変異誘発をもたらすことがある宿主 ゲノムへのレトロウイルスの無作為組込み、あるいはレトロウイルスＬＴＲ（lo ng terminal repeat）と関連したプロモーター活性によるがん原遺伝子発現の偶 然の活性化といった数多くの問題点を抱えている。ヒト以外の霊長類動物におい てレトロウイルスベクターを使用した最近の研究からは、Ｔ細胞リンパ腫が発生 することが証明されている。近頃では、遺伝子治療の分 野における研究努力はこれら特定の性質を欠いているウイルスベクターの開発に 集中している。 ＡＡＶは宿主細胞に感染する際に２つの経路をとることができる。ヘルパーウ イルスが存在すると、ＡＡＶは溶菌サイクルに入り、そこでウイルスゲノムが転 写、複製されて、新たに形成されたウイルス粒子へキャプシド化される。ヘルパ ーウイルス機能が存在しないと、ＡＡＶゲノムはＡＡＶ両末端と宿主細胞配列間 の組換えにより宿主細胞ゲノムの特定領域へプロウイルスとして組込まれる 〔C heung，A.ら，1980，J．Virol．33：739-748；Berns，K.I．ら，1982，Virus Pe rsistence，Mahey，B.W.J.ら編集（Cambridge Univ．Press，Cambridge），pp． 249-265〕。 プロウイルスの組込み部位の特性付けおよびフランキング細胞配列の分析は、 ヒト染色体１９の長腕へのＡＡＶウイルスＤＮＡの特定の標的指向性（targetin g）を示す（Kotin，R.M．ら，1990，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87：2211-221 5；Samulski，R.J．ら，1991，EMBO J．10：3941-3950）。ＡＡＶのこの特性は 、ウイルスベクターＤＮＡが宿主遺伝子のコード領域に無作為に組込まれること から生じる挿入突然変異誘発の可能性を低くする。さらに、レトロウイルスのＬ ＴＲ配列とは対照的に、ＡＡＶのＩＴＲ（inverted terminal repeat：逆方向末 端反復）配列は転写調節要素を欠き、がん原遺伝子の挿入活性化の危険性を減ら すようである。 ＡＡＶゲノムはＲｅｐ（複製）およびＣａｐ（キャプシド）タンパク質をコー ドする主要なオープン・リーディング・フレームを含む４６８０ヌクレオチドの 直鎖状一本鎖ＤＮＡ分子から構成 される。パリンドローム配列（ＤＮＡ複製の開始に際してプライマーとして機能 するヘアピン構造を形成するために折り畳むことができる）を含む２つの１４５ ヌクレオチドの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列がＡＡＶコード領域に隣接してい る（図１）。さらに、実験的観察から、ウイルスの組込み、宿主ゲノムからの救 済、および成熟ウイルス粒子へのウイルス核酸のキャプシド化にとってはＩＴＲ 配列が必要とされることが示された（Muzyczka，N．1992，Current Topics in M icrobiology ＆ Immunology．158，97-129）。 ＡＡＶを用いる近頃の実験は、原核生物ベクターにクローン化されたＡＡＶ配 列が感染性であるという発見によって容易になっている（Samulskiら，1982，Pr oc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.79：2077-2081）。無傷のＡＡＶゲノムを含むプラ スミドをヘルパーウイルスの存在下で細胞にトランスフェクトすると、ＡＡＶは プラスミドベクターから救済され、溶菌経路に入って成熟ウイルス粒子の生産を もたらす。ヘルパーウイルスの不在下では、組換えＡＡＶベクターは宿主細胞の ゲノムに組込まれ、その後細胞がヘルパーウイルスに感染するまでプロウイルス としてそのままの状態で存在する。 ３．発明の概要 本発明は、in vitroで合成することができかつ発現ベクターおよび／または遺 伝子治療に有用なベクターを遺伝子工学的に作製するために使用することができ る、ＡＡＶ ＩＴＲ配列を含む新規な１６５塩基対のＤＮＡ断片のin vitro合成 に関する。この１ ６５ｂｐＤＮＡ配列（本明細書中では二重Ｄ ＩＴＲ配列と呼ぶことにする）は 野生型のＡＡＶには存在することが見いだされていない新規な形状をしている。 本発明は、二重Ｄ ＩＴＲ配列が、シス（cis）において、環状二本鎖ＤＮＡ 分子を直鎖状複製分子（共有結合で閉鎖された末端を有する）に変換するための 、またはＡＡＶウイルス粒子内にキャプシド化するための、あるいは宿主ゲノム へ組込むための、十分な情報を提供できる点に部分的に基づいている。本発明は 、組換えＤＮＡ分子を複製して成熟ウイルス粒子にパッケージするためのin viv o 系を提供する。得られる組換えウイルス株は任意の細胞または組織へ遺伝情報 を導入するための便利で効率のよい手段を提供する。この系は、障害されている 遺伝子の正常な対応遺伝子の発現を介して所定の遺伝子異常を修正することを意 図している遺伝子治療に応用することができる。 本発明はまた、トランスフェクションに先立って、組換えウイルスベクターお よび／または遺伝子治療に有用なベクターを細菌のγδリゾルベースでin vitro 処理することに関する。組換えベクターへのリゾルベース認識配列の遺伝子工学 的操作は、通常は複製およびキャプシド化される直鎖状のＤＮＡ分子の一部とし て含まれる細菌のプラスミド配列を取り除くという選択肢をもたらす。複製およ びキャプシド化の前に、これらの細菌配列を取り除くことにより、発現ベクター に対象の外来ＤＮＡ配列を挿入するための最大量のスペースを作りだすことが可 能となる。 本発明は、ＡＡＶの二重Ｄ ＩＴＲ断片がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で 増幅されてプラスミドベクターに挿入される実施 例により説明される。成熟ウイルス粒子にキャプシド化された組換えＤＮＡを含 むウイルス株は、ヘルパー機能を発現している宿主細胞への発現ベクターのトラ ンスフェクションにより得ることができる。 ４．図面の簡単な説明 図１． ＡＡＶの救済および複製メカニズム。（Ａ）逆方向末端反復（ＩＴＲ ）はＡ，Ａ’，Ｂ，Ｂ’，Ｃ，Ｃ’配列の塩基対合により折り畳まれてＴ字状構 造を形成することができる。（Ｂ） ＩＴＲ部位での感染性プラスミドの切除は ２本の直鎖状ＤＮＡ断片、つまりＡＡＶとプラスミドベクター、を生成する。（ Ｃ）プラスミドの環状体から共有結合閉鎖末端を有する線状体への救済後の二重 Ｄプラスミドから生成される想定断片。 図２． 環状ＤＤ−ＩＴＲプラスミドからの救済中間体。 図３． 二重Ｄ ＩＴＲを含むプラスミドの複製検定。ヘルパープラスミドｐ ＡＡＶ／Ａｄの同時トランスフェクションを行ってまたは行わずに、プラスミド ｐＤＤ−２をＡｄ５感染２９３細胞にトランスフェクトした。感染の４８時間後 に低分子量ＤＮＡを抽出し、ＤｐｎＩ消化を行ってまたは行わずに、１％アガロ ースゲルで分離した。（Ａ）ゲルのエチジウムブロミド染色。（Ｂ）³²Ｐ標識プ ラスミドｐＧＥＭ ３Ｚプローブによるサザンブロット。 図４． ｐＤＤ−２とｐｓｕｂ２０１およびｐＳＭ６２０との複製の比較。プ ラスミドｐＤＤ−２を等量のｐＡＡＶ／Ａｄ（レーン１）、ｐｓｕｂ２０１（レ ーン２）またはｐＳＭ６２０（レー ン３）とともにＡｄ５感染２９３細胞に同時トランスフェクトした。低分子量Ｄ ＮＡを抽出し、ＤｐｎＩで消化し、１％アガロースゲルで分析した。（Ａ）エチ ジウムブロミド染色。（Ｂ） ＩＴＲオリゴヌクレオチドプローブによるサザン ブロット。 図５． 大きさが異なる二重Ｄプラスミドの複製検定。ｐＤＤ−２またはｐＤ Ｄ−ｎｅｏをヘルパーｐＡＡＶ／ＡｄとともにＡｄ５感染２９３細胞に同時トラ ンスフェクトした。低分子量ＤＮＡを抽出し、ＤｐｎＩで消化し、１％アガロー スゲルで分析した。（Ａ）エチジウムブロミド染色。（Ｂ）³²Ｐ標識プラスミド ｐＧＥＭ ３Ｚプローブによるサザンブロット。 図６． ｐＤＤ−２の救済および複製の制限分析。プラスミドｐＤＤ−２をＡ ｄ５感染または非感染２９３細胞に、ヘルパープラスミドｐＡＡＶ／Ａｄの同時 トランスフェクションを行ってまたは行わずに、トランスフェクトした。低分子 量ＤＮＡをＳｓｐＩまたはＳｃａＩのいずれかで消化し、１％アガロースゲルで 分離した。³²Ｐ標識ＩＴＲプローブを用いてサザンブロットを行った。 図７． ＰＣＲにより増幅しかつＥｃｏＲＩで切断したｄｄ−ＩＴＲのプラス ミドｐＧＥＭ−３ＺのＥｃｏＲＩ部位へのクローニング。 図８． リゾルベース配列を含む親プラスミドのin vitro複製。 図９． 二重Ｄ ＩＴＲ配列（配列番号１）。 図10． 細菌のγδリゾルベース認識配列（配列番号２）。 ５．発明の詳細な説明 本発明は、本明細書中で二重Ｄ ＩＴＲ配列と呼ばれる、新規な修飾ＡＡＶ ＩＴＲヌクレオチド配列のin vitro構築に関する。本発明は、ＰＣＲ技法を用い る二重Ｄ ＩＴＲ ＤＮＡ断片の合成、ならびにこの断片が、シスにおいて、組 換えＤＮＡ断片の複製および成熟ＡＡＶウイルス粒子へのそのキャプシド化、ま たは宿主ゲノムへの組換えＤＮＡの特異的組込みのための十分な情報を提供する という証明に基づいている。本発明はさらに、真核生物ベクター中での二重Ｄ ＩＴＲ ＤＮＡ配列の使用、ならびに遺伝子代償療法におけるこれらのベクター の使用に関する。 二重Ｄ ＩＴＲ配列は遺伝子工学的に操作して、対象の異種遺伝子を導入およ び／または発現させるように設計されたベクターとすることができる。遺伝子治 療に用いる場合、対象の異種遺伝子は、所定の遺伝病に関係した欠損または変異 遺伝子の正常もしくは野生型でありうる。組換えベクターは、対象の遺伝子のコ ード領域および二重Ｄ ＩＴＲ配列を含むことに加えて、プロモーター／エンハ ンサー要素のような他の必要な調節要素、さらに翻訳およびポリアデニレーショ ンシグナルを含むことができる。プロモーターおよびエンハンサー領域の選択は 対象の遺伝子の希望するレベルおよび組織特異的発現に密接に関係してくるだろ う。 ヘルパーウイルス機能を提供しかつトランス（trans）においてＲＥＰおよび ＣＡＰタンパク質を供給する宿主細胞系への組換えベクターのトランスフェクシ ョンは、組換えウイルス株を得ることを可能とする（Muzyczka，N.，1992，Curr ent Topics inMicrobiology and Immunology 158：97-129）。その後、得られた ウイルス株は、標的とされた所定の細胞または組織へ新しい遺伝 情報を運搬および導入するための非常に効率のよい手段として使用することがで きる。 5.1.AAV ウイルス配列 AAV ゲノムは、REP（複製）タンパク質およびCAP（キャプシド）タンパク質を コードする２つのオープン・リーディング・フレームを含む4680のヌクレオチド からなる。145 bp逆方向末端反復配列（ITR）がゲノムの両末端に位置され、そ れらは互いに塩基対合することができるだけでなく、一本鎖の場合にはＡ、A'、 Ｂ、B'、Ｃ、C'配列の塩基対合成によりそれら自体で個々に折り畳まれてDNA 複 製のためのＴ字形構造を形成できる点で特異である（図1A）。 無傷AAV ゲノムを含むプラスミドがアデノウイルス感染細胞にトランスフェク トされる場合、AAV はプラスミドベクターから救済または複製されてウイルス溶 菌サイクルに入り、成熟ウイルス粒子の生産をもたらすことができる。加えて、 AAV コード領域が欠失され、異種DNA 配列により置換される場合、組換えAAV が 依然としてウイルス溶菌サイクルを完結でき、但し、ITR が無傷であり、かつ REP タンパク質およびCAP タンパク質、または機能性均等物がトランスで供給さ れることを条件とする。しかしながら、２つのITR 配列のうちの１つが欠失され る場合、ウイルスDNA の複製が観察されず、これは両方のITR がAAV 生存に必要 とされることを示す。 本発明は、ITR 配列中に存在する下記の20塩基対のＤ配列（AGGAACCCCTAGTGAT GGAG）（配列番号５）がウイルス複製に必要とされたという発見に一部基いてい る。これは、Ｄ配列を欠失したウイルス変異体がそれらのDNA を複製できないこ とにより最初に実証された。更に、末端分割部位変異体の複製中に、自然欠失が ITR のＡ配列に対してのみ起こり、Ｄ末端に対しては起こらないことがわかり、 これはＤ配列を保持するための選択プロセスを示唆した。 Ｄ配列の機能を更に解明するために、付加的な20 bp D'配列と共に単一の145 bp ITR配列を含む新規な修飾末端反復構造を構築した（図９） （配列番号１） （下記の第6.13節を参照のこと）。得られる165 bp配列は自然界に存在するウ イルス中で同定されていない。鋳型としてのAAV DNA およびAAV ITR 配列のＤ配 列＋５'末端の６bpのEcoRI 認識部位から誘導された単一プライマーを使用して 、ポリメラーゼ連鎖反応が行われ、これはＤ配列またはD'配列並びにEcoRI 部位 がITR の両側に配置されたDNA 断片をもたらした。PCR 生成DNA 断片がEcoRI に より開裂されて付着末端を生じ、続いてpGEM3ZのEcoRI 部位にクローン化された （図７）。二重D ITR 構造を含む組換えプラスミドが細胞にトランスフェクトさ れて、二重D ITR が組換えDNA の複製、キャプシド化、組込みおよび救済に機能 し得るか否かを測定した。これらの実験からの結果は、新規な二重D ITR 構造が 溶菌性または潜在性AAV ウイルス感染中に２つの野生型ITR の通常必要とされる 機能を行うのに充分であることを示す（下記の第6.2.3.節および第6.2.4.節を参 照のこと）。 5.2.AAV ウイルス配列および異種結合配列を含む組換えベクターの構築 本発明の二重D ITR 配列（配列番号１）は組換えDNA の複製および成熟ウイル ス粒子へのキャプシド化を誘導するのに必要とさ れる必要な情報を与える。二重D ITR ヌクレオチド配列を含むDNA 断片は、当技 術分野で普通使用される幾つかの方法により得られる。本明細書に記載された特 定の実施態様では、鋳型としてのAAV DNA およびAAV ITR のＤ配列から誘導され たプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応（PCR）が二重D ITR DNA 断片を 得るのに使用された。このアプローチの合理性は天然ITR 配列の予想二次構造に 基いている。PCR 反応の第一ラウンドにおいて、AAVウイルスITR はヘアピン構 造を形成し、そして伸長プロセスを自己開始して基部にＤおよびD'を含む長いＴ 形ヘアピン構造を生じる。変性後に、このDNA は単一プライムドPCR 反応の鋳型 として利用できる。二重D ITR DNA 断片を単離するための別法として、DNA 配列 を化学的に合成することが挙げられるが、これに限定されない。 本発明に従って使用し得る改変ヌクレオチド配列は、それらがシスにおいて組 換えDNA の複製、キャプシド化、組込みおよび救済のための情報を与えるそれら の能力を保持する点で機能上均等である二重D ITR 配列の誘導体および類似体を 含む。特に、二重D ITR 誘導体はヌクレオチド配列の付加、置換または欠失を含 んでいてもよいが、依然として生物学的機能を保持する。 通常の組換えDNA 方法が真核生物発現ベクターへの新規な二重D ITR 配列の挿 入に使用し得る。これらとして、in vitro組換えDNA 技術、合成技術およびin v ivo 組換え／遺伝子組換えが挙げられる。例えば、二重D ITR DNA 配列は、適当 な制限エンドヌクレアーゼ認識部位を増幅DNA 断片のそれぞれの末端に付加する オリゴヌクレオチドプライマーを使用してPCR 反応で増幅し得る（ 第6.1.3 節を参照のこと）。また、所望される制限部位は制限エンドヌクレアー ゼ認識配列をコードする特別に化学合成されたオリゴヌクレオチドを含むヌクレ オチド配列（リンカー）を、相補付着末端を有する発現ベクターへ増幅二重D 断 片の末端でつなぐことにより生成し得る。 種々の宿主組換えベクター系が当業者により同等に良好に使用し得る。組換え ベクターはE.coliにおける複製に必要な細菌プラスミド配列を含むことができ、 またはシス作用性二重D ITR 配列が対象の遺伝子に直接連結され得る。加えて、 プラスミドは適当な転写／翻訳調節配列とポリアデニレーションシグナルの間に 挿入された対象の異種遺伝子をコードするDNA 配列を含むであろう。種々のプロ モーター／エンハンサー要素が、所望されるレベルおよび組織特異的発現に応じ て使用し得る。組換えＤＮＡ技術または合成技術により生成されたプロモーター は、対象の挿入遺伝子の転写を与えるのに使用し得る。また、特定の開始シグナ ルが挿入タンパク質コード配列の効率のよい翻訳に必要とされる。これらの配列 はATG 開始コドンおよび隣接配列を含む。さらに、ポリアデニレーションシグナ ルが転写mRNAの安定性を増大するために含まれていてもよい。 AAV ウイルスベクター系の１つの潜在的な欠点は、５Kbより大きいDNA 断片が 成熟ウイルス粒子にパッケージされ得ないことにより課せられたサイズ制限であ る。所定の発現ベクターにおいて、2-3 KbのDNA 配列はE.coli中のプラスミドの 増殖に必要とされる細菌プラスミド配列に由来する。これらのDNA 配列は複製起 点（ori）配列並びにアンピシリンおよびテトラサイクリンの如き抗 生物質に対する耐性を与える遺伝子を含む。実際に、これは対象の異種遺伝子の 挿入のための２Kbのスペースのみを残す。 本発明の下記の特定の非限定的実施態様はこのサイズ制限問題に取り組んでい る。対象となる配列のクローニングに利用可能なスペースの量を増大するために 、細菌組換え系（γδ）は、細菌プラスミドDNA 配列の大半がin vitroで所定の 組換えプラスミド構築物から組換えられ、それにより外来遺伝子の挿入のための スペースの最大量を可能にするような様式でプラスミドを分割するのに使用し得 る。γδリゾルベース配列は、外来遺伝子の挿入に利用可能なスペースを増大す るための一般的な方法として、AAV系に限定されない種々のウイルスベクター系 中で使用し得る。 親の二重Ｄ発現ベクタープラスミドは、二重D ITR 配列の他に、γδリゾルベ ース酵素でin vitroで分割される場合に組換えを促進するように正しい方向で２ コピーのγδ分割部位（図10）（配列番号２）（120 塩基対）を含むように遺伝 子工学的に操作し得る。γδリゾルベースの存在下で、組換えプラスミドは２つ の環状DNA 分子に変換されるはずである（図８）。１つのプラスミド分子は１コ ピーのγδ分割部位と共に一次細菌プラスミド配列を含むだろう。その他の分割 プラスミド分子は二重D ITR シス作用性配列、１コピーのγδ分割部位および対 象の遺伝子のコード領域を含むと予想されるであろう。ヘルパーウイルス並びに ウイルスREP タンパク質およびCAP タンパク質の存在下で直線状複製分子に変換 されるのはこのプラスミド分子であり、次にその直線状複製分子が成熟ウイルス 粒子にキャプシド化されるであろう。 現在、環状プラスミド分子を複製直線状 DNA 断片に変換する のに必要とされるCAP タンパク質およびREP タンパク質を供給するにあたって、 第２のプラスミドが必要とされる。本発明の更に特定の実施態様では、γδ分割 部位を含むプラスミドが必要とされるウイルスREP 機能およびCAP 機能のための コード領域を含むように操作し得る。通常、REP コード配列およびCAP コード配 列は発現ベクターから排除されるであろう。何となれば、それらは挿入物のサイ ズを更に制限するからである。in vitro組換え系を使用して、これらのコード配 列をプラスミド構築物中に含有させてもよい。何となれば、それらはリゾルベー ス酵素による２つのγδ分割部位での分割中に組換えられるからである（図８） 。生産物は２種の連鎖状DNA 分子である。 in vitro γδ反応は線形反応であるので、分割分子の量は親プラスミド対分 割環状体の所望の比を生じるようにin vitro分割反応において調節し得る。次に プラスミドの混合物を宿主細胞にトランスフェクトすることができる。これは生 産的複製にトランスで必要とされるAAV REP 遺伝子およびCAP 遺伝子を含む１つ の環状分子を導入し、そして他の環状分子が二重D ITR 配列および対象の遺伝子 を含む。二重Ｄ環状分子は直線状DNA 分子に複製され、続いてこれがREP/CAP 環 状プラスミド上に導入されたトランス因子によりウイルス粒子にキャプシド化さ れ得る。 本発明は、第一に、（ｉ）対象の遺伝子を含む組換えウイルスベクター配列、 （ii）ヘルパー機能を与えるウイルス遺伝子、および（iii）ウイルスベクター 配列に隣接する２つのγδリゾルベース認識配列（配列番号２）を含むプラスミ ドを増殖し、そして第二に、リゾルベース酵素を使用して対象の遺伝子を含む組 換えウイ ルスベクター配列を残りのプラスミド配列から分離するための、上記のγδリゾ ルベース系の同様の使用を更に提供する。これらの方法によれば、ベクター機能 およびヘルパー機能が誘導されるウイルスは、AAV 、レトロウイルス、アデノウ イルス、またはヘルペスウイルスを含むが、これらに限定されない任意の好適な ウイルスであり得る。特に好ましい実施態様において、プラスミドのウイルスベ クター部分は二重D ITR 配列を含み、または両方のAAV ITR を含む。一般に、ウ イルスベクター部分は、対象の遺伝子のキャプシド化および転写に必要な配列を 含む。 5.3.組換えウイルス株の生産 本発明は、ヘルパーウイルス、AAV REP タンパク質およびCAPタンパク質をコ ードする組換えDNA 、並びに対象のDNA 配列および165 塩基対の二重D ITR 配列 を含む組換え核酸を含む真核細胞を培養することを特徴とする組換えDNA 分子を 複製し、AAV 粒子にキャプシド化する方法に関する。 組換えウイルス株を作出するために、二重D ITR 組換え発現ベクタープラスミ ドを、ヘルパーウイルス機能を与え、そしてAAVREP タンパク質およびCAP タン パク質をトランスで供給できる宿主細胞系にトランスフェクトする。REP タンパ ク質およびCAP タンパク質は直線状組換えDNA の複製および成熟ウイルス粒子へ のキャプシド化に必要とされる。 REP タンパク質およびCAP タンパク質は、該タンパク質のそれぞれをコードで きる組換えプラスミドによる宿主細胞系のトランスフェクションによりトランス で供給される。DNA トランスフェ クションは、当業者に公知の方法を使用して行い得る。これらとして、リポフェ クション、エレクトロポレーションまたはリン酸カルシウム沈殿によるDNA トラ ンスフェクションが挙げられる［Ausubel ら，1989，Current Protocols for Mo lecular Biology］。プラスミドは、REP タンパク質およびCAP タンパク質を一 時的にまたは安定に発現させる目的で宿主細胞系にトランスフェクトされる。第 6.1.節に記載された特定の実施態様において、AAVコード領域を含むプラスミドp AAV/AD がREP タンパク質およびCAP タンパク質を発現させる目的で宿主細胞に トランスフェクトされた。 別の実施態様において、二重D ITR 発現ベクターはREP タンパク質およびCAP タンパク質を直接発現するように操作し得る。この場合、プラスミドベクター中 にγδリゾルベース配列を入れることがまた重要となり、その結果、REP コード 領域およびCAP コード領域は、外来DNA の挿入に関してサイズ制限が課せられな いようにin vitroリゾルベース反応中に組換えられる。 ウイルスREP タンパク質およびCAP タンパク質を発現することの他に、宿主細 胞系はヘルパーウイルス機能を与えることができなければならない。アデノウイ ルスおよび単純ヘルペスウイルスの両方が、二重D ITR 配列を含むDNA 断片の複 製のためのヘルパーウイルスとして利用し得る。これらの２種のウイルスまたは AAV のヘルパーウイルスとして作用するウイルスのいずれかによる感染を許容す る宿主細胞はどれも、本発明の実施に使用し得る。感染多重度（MOI）および感 染時間の期間は、使用されるウイルスの型および使用される細胞系に依存するで あろう。 本明細書に記載された特定の実施態様では、組換え二重D ITR発現ベクターで 既にトランスフェクトされた293 細胞が10のMOIでAd5 により感染された。48時 間後に、細胞は凍結および解凍を３回行い、そして56℃で１時間インキュベート してアデノウイルスを不活化した。得られる細胞溶解産物は、選択された細胞ま たは組織を感染するのに使用し得る組換えウイルス粒子を含む。 5.4.組換えベクターの使用 患者が苦しんでいる多数のヒト遺伝子疾患があり、これらは鎌状赤血球貧血症 、サラセミア、レッシュ−ナイハン症および膵嚢胞性繊維炎の如き疾患を含む。 現在の治療はこれらの疾患と関連する徴候を殆ど軽減せず、そして遺伝子疾患の 治療のための新規な方法を開発する努力が現在なされている。 分子技術における最近の進歩は、所定の欠損遺伝子の正常な対応遺伝子を単離 することを可能にし、これが“遺伝子治療”の概念、および遺伝子疾患にかかっ ている患者の治療の実施可能な手段としての遺伝子治療の容認をもたらした。最 近まで、レトロウイルスが遺伝子治療における使用につき最も広く研究されたウ イルスベクターであった。残念なことに、幾つかの難点がレトロウイルスの使用 と関連し、これらは宿主染色体へのレトロウイルスDNA のランダム組込みを含み 、挿入突然変異誘発またはがん原遺伝子発現の活性化をもたらす。 AAV ベクターは遺伝子治療で使用するためのレトロウイルス系の実施可能な代 替物を提供する。宿主染色体へのAAV の非ランダムな組込みおよびITR 構造と関 連する転写活性の欠如は、AAV が 遺伝子疾患の治療に特に有益であり得ることを示す。 本明細書に記載された対象の遺伝子を含む、二重D ITR 発現ベクターは、遺伝 子疾患の治療に有益であり得る。対象となる遺伝子はあらゆる突然変異遺伝子ま たは欠損遺伝子の野生型対応物であり、その発現がその天然プロモーターにより 調節されるように（例えば、発現が正常に調節されるように）または異種プロモ ーターにより調節されるように二重D ITR 組換えベクターに挿入し得る。組換え ウイルス株は、最初に両末端が共有結合で閉鎖された直線状DNA 分子への環状二 本鎖分子の変換を可能にする好適な宿主細胞系へ二重D ITR プラスミドをトラン スフェクトすることにより発生し得る。次にこれは組換えDNA の複製および成熟 ウイルス粒子へのキャプシド化を可能にする。次に得られたウイルス株は遺伝子 欠損により冒された組織または細胞を感染するのに使用し得る。 6.実施例：新規な165 塩基対の末端反復配列はアデノ随伴ウイルスの生活環に 必要とされる唯一のシス要素である 下記の文節は二重D ITR 配列の合成および機能特性付けを記載する。 6.1.材料および方法 6.1.1.DNA トランスフェクション ヒト細胞系293 を、10％のFCS（ウシ胎児血清、ハイクローン（HyClone）を含 むDMEM （ダルベッコ改良イーグル培地、ギブコ（GIBCO））中に維持した。プラ スミドDNA のトランスフェクション を、製造業者により記載されたリポフェクション（BRL）方法により行った。簡 単に言えば、６cmの皿中の細胞をDMEMで２回洗浄し、１時間にわたってOpti-MEM （ギブコ）１ml中で10 moi（感染多重度）でアデノウイルス５で感染した。次に プラスミドDNA ５μg を室温で10分間にわたってリポフェクチン（BRL）50 μl とともにインキュベートし、Opti-MEM ２mlと混合し、アデノウイルス感染細胞 に添加した。12時間のインキュベーション後に、細胞に４％のFCS を含むDMEM３ mlを供給し、更に36時間インキュベートした。 6.1.2.サザンハイブリダイゼーション トランスフェクトした細胞からの低分子量DNA をHirt（Hirt，B.1967，J.Mol. Biol．26：365-369）により記載されたようにして抽出した。DNA を制限酵素（ ニューイングランド・バイオラブ（New England BioLab））により消化し、アガ ロースゲルで分離し、次にジーンスクリーン＋ナイロン膜（デュポン（Du Pont ））に移した。³²P 標識プラスミドDNA によるハイブリダイゼーションを製造業 者により推奨されたようにして行った。N.Muzyczkaにより親切に提供されたITR のＡ領域から誘導されたｒ-³²P-ATP 末端標識ITR オリゴヌクレオチドプローブA -1（5'TTGGCCACTCCCTCTCTGCG3'）（配列番号４）によるハイブリダイゼーション を以下のようにして行った。その膜を、5X SSC、10Xデンハート溶液、10％硫酸 デキストランおよび５％SDS を含む溶液10ml中で60℃で少なくとも１時間にわた ってプレハイブリダイズさせた。³²P 末端標識オリゴープローブ25ngおよびH₂O 0.5 ml 中の熱変性サケ精子DNA 200 μg を添加した。ハイブリダイゼーションを60℃で 一夜続けた。その膜を3X SSCおよび５％SDS 中で60℃で30分間にわたって２回洗 浄し、そして0.2X SSC 中で室温で10分間にわたって１回洗浄した。 6.1.3.PCR およびITR プラスミドの構築 AAV およびAd5 感染細胞からの低分子量DNA をAAV のＤ配列から誘導された単 一プライマーによるPCR 反応の鋳型として使用した。PCR を、20mMのトリス-HCI （pH8.8）、1.5mMのMgCl、50mMのKCI 、2.5 ％のホルムアミド、100 μモルのdA TP、dCTPおよびdTTP、75μモルの７-デアゾ-dGTP 、25μモルのdGTP、1.5UのAmp liTag（パーキン・エルマー・シータス（Perkin Elmer Cetus））、１ngのAAV D NA および100pモルのプライマーTR-1（5'-GGAATTCAGGAACCCCTAGTGATGG-3'）（配 列番号３）を含む反応溶液50μl中で94℃で１分間、45℃で30秒間そして72℃で １分間で35サイクルにわたって行った。PCR 産物をアガロースゲル電気泳動によ り精製し、EcoRI で切断し、そしてEcoRI で切断され、かつ脱リン酸化されたpG EM3Zプラスミド（プロメガ（Promega））と連結した。連結したプラスミドをE.c oli Sure 株（ストラタゲン（Stratagene））に形質転換した。pDD と称される 陽性クローンを二重Ｄ末端反復配列の存在につきスクリーニングし、そしてdGTP に代えて用いた7-デアゾ-dGTP によるジデオキシ配列決定法により確認した（Sa nger，F．ら，1977，Proc.Natl.Acad．Sci．USA 74：5463-5467）。続いて、neo 遺伝子をpDD-2 のSalI部位にクローン化してプラスミドpDD-neo を得た。 6.1.4.neo-耐性細胞系のクローニング Ad5 感染293 細胞をpDD-neo およびpAAV/Ad ［Samulskiら，1989．J.Virol．6 3：3822-3828］で48時間にわたって同時トランスフェクトした。細胞を３回凍結 、解凍し、次に56℃で１時間インキュベートしてAd5 ウイルスを不活化した。DD -neo組換えAAVウイルスを含む細胞溶解産物を使用してヒト細胞系デトロイト６ に感染させた。細胞を24時間接種し、次に400 μg/mlのG418で選択してneo-耐性 クローンを得た。種々のクローンを10のMOI で野生型AAV およびAd5 で重感染し て潜在性neo-AAV を救済した。 6.2.結果 6.2.1.二重Ｄ配列を含むITR の構築 ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用して他の末端に付加されたD'配列を含む 逆方向末端反復配列を構築した。その合理性はITRのＴ形構造に基いている。PCR 反応の第一ラウンドにおいて、AAV ウイルスIRT は伸長を自己開始して基部に ＤおよびD'を含む長いＴ形ヘアピン構造を生じるであろう。変性後に、このDNA は単一プライムドPCR の鋳型として利用できる。 ITR 領域中の高GC含量および強いパリンドローム構造のために、幾つかの戦略 、例えば、7-デアゾ-dGTP 、2.5 ％のホルムアミド、および高濃度のプライマー を使用してPCR 問題に取り組んで、充分な所望のPCR 産物を得た。クローニング の便宜のために、EcoRI認識部位をプライマーの5'側に結合し、その結果、PCR 産物をEcoRI により切断し、pGEM 3Z のポリリンカーに容易にクローン化で きた。細菌宿主中のITR の不安定性のために、組換えプラスミドを、ITR がかな り安定であるE.coli Sure 株（ストラタゲン）に形質転換した。上記の戦略を使 用することにより、本発明者らは多数の陽性クローンを得た。幾つかのクローン を制限消化および配列決定により特性付けした。pGEM 3Z のEcoRI 部位に D'ABB 'CC'A'Dの挿入物を有するクローンの１つが図２に示される。このプラスミドをp DD-2 と称し、下記のトランスフェクション実験に使用した。 6.2.2.pDD-2複製はREP に依存性である 複製の能力を分析するために、ヘルパープラスミドpAAV/Ad（これは機能性REP 遺伝子およびCAP 遺伝子を含むがITR を含まず、その結果、それは複製できな い）の同時トランスフェクションにより、またはそれによらずにプラスミドpDD- 2 をAd5 感染293 細胞にトランスフェクトした。機能性起点の欠如のために、こ の分子はREP タンパク質およびCAP タンパク質をトランスで供給し得るにすぎな い。48時間のトランスフェクション後に、プラスミドDNA を抽出し、DpnI消化を 行って、または行わないで１％のアガロースで分離した。DpnIはインプットされ たメチル化プラスミドDNA のみを消化し、一方、複製（脱メチル化）DNA を無傷 で残す。結果は、ヘルパープラスミドの不在下で、pDD-2 プラスミドは複製せず 、それ故、そのDNA が完全にDpnI感受性であることを実証した（図３、レーン１ および２）。しかしながら、ヘルパープラスミドの存在下で、pDD-2 はDpnI消化 に対する耐性および単量体分子および二量体分子（すなわち、典型的なAAV 複製 パターン ）の 在により証明されるように非常に効率よく複製した（図３、レーン３およ び４）。pDD-2 複製は２つの因子、すなわちシスのDD-ITRおよびトランスのREP 遺伝子産物に依存性である。何となれば、クローニングベクターpGEM-3Z は同じ 条件下で複製せず、またCAP 遺伝子を含まないでREP 遺伝子のみを含むプラスミ ドがpDD-2 にヘルパー機能をトランスで供給し得るからである（データは示され ていない）。１つの修飾ITR を含むpDD-2 の複製は非常に効率的であったので、 pDD-2 と２種のその他の感染性AAVプラスミド、psub201 ［Sam-ulski ら，1987 ．J.Virol，61：3096-3101］およびpSM620［Sam-ulski ら，1982，Proc.Natl．A cad.Sci．U.S.A．79：2077-2081］ （これは２つのITR ならびに野生型REP 遺伝 子およびCAP 遺伝子を有する）の比較を行った。pDD-2を、等量のpAAV/Ad ヘル パー（ITRを含まない）、psub201 またはpSM620と共にAd5 感染細胞に同時トタ ンスフェクトした。プラスミドDNA をトランスフェクションの２日後に抽出し、 DpnIで消化し、１％のアガロースゲルで分離した。ITR を含む全ての複製DNA を 検出できるようにITR のＡ配列からのオリゴヌクレオチドプローブを用いてサザ ンブロットを行った。図４に示されるように、AAV コード遺伝子を含む全ての３ 種のプラスミドはpDD-2 複製を同等に良好に補足することができる。しかしなが ら、psub201それ自体は極めて低いレベルで複製したが、それはpDD-2 複製を効 率よく補足することができる。pSM201はpDD-2 と同様のレベルで複製した。 pDD-2 複製の有効性が特別なDD-ITRによるものであったか、または更に小さい サイズのプラスミド（2.9 kb）によるものであった かを調べるために、1.2 kbのneo 遺伝子断片をpDD-2 のポリリンカーでSalI部位 に挿入した。新規なプラスミドpDD-neo はサイズが4.1kbであり、野生型AAV の サイズ（4.68 kb）に近似する。このプラスミドは環状二本鎖から直線状分子に 変換し、親pDD-2 と同様に有効に複製した（図５）。DD-ITRプラスミドを7.5 kb までのサイズで構築した。これらの分子もまた効率よく複製する（データは示さ れていない）。上記の結果は、DD-ITRがRep 依存性複製のための優れた基質であ ることを示唆する。 6.2.3.複製および救済はAAV 機構によるものである AAV 逆方向末端反復配列はウイルス複製起点であることが証明された。in vi tro で、これらの配列はREP タンパク質、部位およびストランド特異的ニッカー ゼおよびヘリカーゼにより基質として認識される。また、ITR はAAV 救済の基質 として考えられていた［Muzyczka，N．1992，Current Topics in Microbiology &Immunology．158，97-129］。二重Ｄプラスミドは１つの特異なITR を含み、そ して本発明者らはこの配列がＲＥＰタンパク質の存在下でのみ複製することを実 証したので、救済および複製が同様のAAV 救済および複製機構によるものである と予想することは魅力的である（図１、ＡおよびＢ）。 上記の仮説を試験するために、pDD-2 DNA をヘルパープラスミドを用いて、ま たは用いないでAd5 感染293 細胞にトランスフェクトし、または非感染293 細胞 にトランスフェクトした。続いて、プラスミドDNA をそれぞれ２種の単一切断 酵素ScpIおよびScaIにより制限分析にかけた（地図については、図２を参照のこ と） 。ITR を含む断片のみが検出されるようにITR オリゴヌクレオチドを用いてＤＮ Ａを釣り上げた。。結果を図６に示す。SspIまたはScaI消化後に、直線状全長プ ラスミドバンドが全てのレーン（Ｐ〜６）で観察できた。このバンドは分割され なかったインプット環状プラスミドに由来した。レーン１および４（Ad5 ＋ヘル パープラスミド）では、予想分子量を有する４つの付加的なバンドも見られた。 それらのうちの２つは消化二量体分子の内部の頭−頭結合断片および尾−尾結合 断片から生じた。その他の２つのバンドは消化された単量体および二量体外部断 片により誘導され、おそらくpDD-2 が特異な二重D ITR 部位で分割され、AAV 複 製機構により複製されることを示唆する。Ad5 感染細胞（レーン２および５）お よび非感染細胞（レーン３および６）では、分割単量体からの２つの不明瞭なバ ンドが目視できたことが注目に値し、これは或る細胞機構がその他のAAV 配列ま たはAAV 遺伝子産物の不在下で二重D ITR 部位で救済プロセスを開始できること を示唆する。このような救済されたDNA はRep タンパク質の不在下で複製できな かったが（図３、レーン２を参照のこと）、これは二重Ｄ基質が２つの野生型IT R を含む通常のAAV プラスミドでは見られないAAV 認識の第一段階に関与する特 別な特徴を与え得ることを示唆する。 6.2.4.１つのシスのDD-ITRはAAV 生存にとって充分である 単一の修飾DD-ITRを含むプラスミドは野生型AAV と同様に効率よく複製できた ので、それ故下記の質問が問われた。すなわち、この複製DNA はウイルス粒子に キャプシド化され得るのか？そうである場合、これらのウイルス粒子は細胞を感 染し、そして細胞 DNA への組込みにより潜在性感染を樹立することができるのか？ 最後に、これらの潜在性配列は続いて染色体から離れて救済され、そして野生型 AAV およびアデノウイルスによる重感染後に生産的経路に再度入ることができる のか？ 上記の質問に答えようと努めて、プラスミドpDD-neo を使用して第6.1.4.節に 記載されたようにしてDD-neoウイルス調製物をつくった。次に組換えウイルス粒 子を含む細胞溶解産物を使用してヒトデトロイト６細胞を感染した。感染２週間 後に細胞をG418に対して選択した。幾つかのneo 耐性クローンを分離し、これは 組換えウイルスがつくられ、そして形質導入が行われたことを示す。DD-neo^r細 胞系を野生型AAV-2 およびAd5 で重感染し、導入のDNA の救済および複製につき 分析した。次にウイルスDNA を抽出し、neo 遺伝子断片で釣り上げた。DD-neoウ イルスDNA を救済したpDD-neo^r細胞系の例は単量体および二量体として複製した （データは示されていない）。これらの結果は、165 bpの単一DD-ITRがAAV 生活 環の全段階を実現するのに必要とされる唯一のシス配列であることを実証した。 こうして、プラスミドからの救済、DNA の複製、ウイルスのキャプシド化、細胞 への感染、染色体への組込みそして再度の救済の如きプロセスは全てこの特異な 二重Ｄ逆方向末端反復配列により媒介された。 本発明は本明細書に開示された実施態様により範囲を限定されるべきではなく 、これらは本発明の単なる側面の説明として意図され、そして機能上均等である あらゆるクローン、DNA またはアミノ酸配列が本発明の範囲内にある。実際に、 本明細書に示され、記載されたものに加えて、本発明の種々の改良が以上の説明 お よび添付図面から当業者に明らかになるであろう。このような改良は請求の範囲 内に入ることが意図されている。 また、ヌクレオチドおよびペプチドにつき示された全ての塩基対並びにアミノ 酸残基の数およびサイズはおよそのものであり、説明の目的で使用されることが 理解されるべきである。 種々の刊行物が本明細書に引用され、これらは参考として本明細書にそのまま 組み込まれる。 配列表 配列番号：１ 配列の長さ：165 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：不明 配列の種類：DNA （genomic） 配列 配列番号：２ 配列の長さ：120 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：不明 配列の種類：DNA （genomic） 配列 配列番号：３ 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：不明 配列の種類：DNA （genomic） 配列 配列番号：４ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：不明 配列の種類：DNA （genomic） 配列 配列番号：５ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：不明 配列の種類：DNA （genomic） 配列

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:92）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．図９（配列番号１）に示した１６５塩基対の逆方向末端反復配列を含む、精 製および単離された核酸分子。 ２．対象のタンパク質をコードするＤＮＡヌクレオチド配列および図９（配列番 号１）に示した１６５塩基対の逆方向末端反復配列を含む組換えＤＮＡベクター 。 ３．ＡＡＶのＲＥＰおよびＣＡＰタンパク質をコードするＤＮＡヌクレオチド配 列をさらに含む、請求項２に記載の組換えＤＮＡベクター。 ４．図１０（配列番号２）に示した細菌のγδリゾルベースにより認識されるＤ ＮＡヌクレオチド配列をさらに含む、請求項２に記載の組換えＤＮＡベクター。 ５．図１０（配列番号２）に示した細菌のγδリゾルベースにより認識されるＤ ＮＡヌクレオチド配列をさらに含む、請求項３に記載の組換えＤＮＡベクター。 ６．組換えＤＮＡ分子を複製し、ＡＡＶ粒子へキャプシド化する方法であって、 ヘルパーウイルス、ＡＡＶのＲＥＰおよびＣＡＰタンパク質をコードする組換え 核酸、および対象のＤＮＡ配列と図９（配列番号１）に示した１６５塩基対の逆 方向末端反復配列を含む組換え核酸を含有す真核細胞を培養することにより、１ ６５塩基対の逆方向末端反復配列および対象のＤＮＡ配列を含む該核酸を複製し 、ＡＡＶ粒子へ集合させることからなる方法。 ７．ヘルパーウイルスがアデノウイルスである、請求項６に記載の方法。 ８．ヘルパーウイルスが単純ヘルペスウイルスである、請求項６に記載の方法。 ９．ＡＡＶのＲＥＰおよびＣＡＰタンパク質をコードする組換え核酸が、 （ａ）ＡＡＶのＲＥＰおよびＣＡＰ ＲＮＡの発現を制御するプロモーター 、 （ｂ）ＲＥＰおよびＣＡＰ ｍＲＮＡのための転写開始シグナル、 （ｃ）ＲＥＰおよびＣＡＰタンパク質をコードするＤＮＡ配列、 および （ｄ）転写終止シグナル、 を含むプラスミドベクターである、請求項６に記載の方法。 10．対象のＤＮＡ配列および１６５塩基対の逆方向末端反復配列を含む組換え核 酸が、 （ａ）プロモーター、 （ｂ）該プロモーターの制御下で転写される対象のＤＮＡ配列、 および （ｃ）図９（配列番号１）に示した１６５塩基対の逆方向末端反復配列、 を含むプラスミドベクターである、請求項６に記載の方法。 11．組換えＤＮＡ分子を複製し、ウイルス粒子へキャプシド化する方法であって 、 （ａ） （ｉ）対象の遺伝子を含む組換えウイルスベクター、 （ii）ヘルパー機能をもたらすウイルス遺伝子、および（iii）該ウイルスベ クター配列の隣に位置する２つの図１０（配列番号 ２）に示した細菌γδリゾルベース認識配列、を含む組換え核酸を増殖し、 （ｂ）増殖した核酸を細菌γδリゾルベースで処理し、そして （ｃ）ヘルパーウイルスおよび該リゾルベース処理組換え核酸 を含む真核細胞を培養することにより、該分割した組換えＤＮＡを複製し、ウイ ルス粒子へキャプシド化する、 ことからなる方法。 12．組換えＤＮＡ分子を複製し、ＡＡＶ粒子へキャプシド化する方法であって、 （ａ）図９（配列番号１）に示した１６５塩基対の逆方向末端反復配列およ び図１０（配列番号２）に示した細菌γδリゾルベース認識配列を含む組換え核 酸を、細菌のγδリゾルベース酵素で処理し、そして （ｂ）ヘルパーウイルスおよび該リゾルベース処理組換え核酸を含む真核細 胞を培養することにより、該分割した組換えＤＮＡを複製し、ＡＡＶ粒子へキャ プシド化する、 ことからなる方法。 13．ヘルパーウイルスがアデノウイルスである、請求項１２に記載の方法。 14．ヘルパーウイルスが単純ヘルペスウイルスである、請求項１２に記載の方法 。 15．細菌γδリゾルベース認識配列を含む組換え核酸が、 （ａ）細菌γδリゾルベース認識配列、 （ｂ）プロモーター、 （ｃ）該プロモーターの制御下で転写される対象のＤＮＡ配列、 および （ｄ）図９（配列番号１）に示した１６５塩基対の逆方向末端反復配列、 を含むプラスミドベクターである、請求項１２に記載の方法。 16．細菌γδリゾルベース認識配列を含む組換え核酸が、 （ａ）細菌γδリゾルベース認識配列、 （ｂ）プロモーター、 （ｃ）該プロモーターの制御下で転写される対象のＤＮＡ配列、 （ｄ）図９（配列番号１）に示した１６５塩基対の逆方向末端反復配列、お よび （ｅ）ＡＡＶのＲＥＰおよびＣＡＰタンパク質をコードするＤＮＡヌクレオ チド配列、 を含むプラスミドベクターである、請求項１２に記載の方法。