WO2002055711A2 - Verfahren zur fermentativen herstellung von pantothensäure - Google Patents

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1096—Transferases (2.) transferring nitrogenous groups (2.6)

Definitions

  • the invention relates to microorganisms of the genus Corynebacterium which are replicable and optionally recombinant DNA. It also relates to a process for the fermentative production of pantothenic acid.
  • Pantothenic acid is a commercially important vitamin that is used in cosmetics, medicine, human nutrition and animal nutrition. There is therefore a general interest in providing improved processes for the production of pantothenic acid.
  • Pantothenic acid can be produced by chemical synthesis or biotechnologically by fermentation of suitable microorganisms in suitable nutrient solutions.
  • the advantage of biotechnological production by microorganisms lies in the formation of the correct stereoisomeric form, namely the D-form of pantothenic acid, which is free of L-pantothenic acid.
  • B. ⁇ scherichia coli Corynebacterium erythrogenes, Brevibacterium ammoniagenes and also yeasts, such as. B. Debaromyces castellii can, as shown in EPA 0 493 060, produce D-pantothenic acid in a nutrient solution containing glucose, D-pantoic acid and ⁇ -alanine.
  • EP 0 493 060 further shows that in Escherichia coli Amplification of pantothenic acid biosynthesis genes using the plasmids pFV3 and pFV5 improves the formation of D-pantothenic acid.
  • EP 0 590 857 describes strains of Escherichia coli which are resistant to various antimetabolites such as e.g. As salicylic acid, ⁇ -ketobutyric acid, ß-hydroxyaspartic acid, etc. wear and produce D-pantoic acid and D-pantothenic acid in a nutrient solution containing glucose and ⁇ -alanine.
  • EPA 0 590 857 furthermore shows that the production of D-pantoic acid and D-pantothenic acid can be improved by amplification of the pantothenic acid biosynthesis genes which are contained on the plasmid pFV31.
  • WO 97/10340 also shows that pantothenic acid-producing mutants of Escherichia coli can further increase pantothenic acid production by increasing the activity of the enzyme acetohydroxy acid synthase II, an enzyme of valine biosynthesis.
  • the object is achieved according to the invention by the recombining DNA sequences as set out in the claims.
  • the object is further achieved by the use of the improved, pantothenic acid-producing microorganisms produced according to claim 6 and the use of the plasmid vector produced according to claim 7.
  • the invention further relates to a process for the fermentative production of pantothenic acid using microorganisms which, in particular, already produce pantothenic acid and in which the brnA gene coding for the transaminase has been deleted or its expression is weakened or is not expressed at all.
  • D-pantothenic acid or pantothenic acid or pantothenate are mentioned in the following text, not only the free acid but also the salts of D-pantothenic acid, such as, for. B. the calcium, sodium, ammonium or potassium salt.
  • D-pantothenic acid or pantothenic acid or pantothenate are mentioned in the following text, not only the free acid but also the salts of D-pantothenic acid, such as, for. B. the calcium, sodium, ammonium or potassium salt.
  • the production of L-isoleucine, L-valine and L-leucine catalyzed by this enzyme is either weakened or completely blocked.
  • the preliminary stages required for pantothenic acid formation can only be implemented in the direction of pantothenic acid.
  • pantothenate formation is brought about: ilvBN genes which code for the enzyme acetohydroxy acid synthase, ilvC gene which codes for the enzyme isomeroreductase, ilvD gene which encodes the enzyme dihydroxy acid dehydratase, and enhancement or overexpression of the gene panB, which codes for the enzyme ketopantoate hydroxymethyltransferase and the gene panC, which codes for the enzyme pantothenate ligase, and the gene panD, which codes for the enzyme aspartate decarboxylase.
  • amplification in this context describes the increase in the intracellular activity of one or more enzymes in a microorganism which are encoded by the corresponding DNA, for example by B. increases the copy number of the gene (s), uses a strong promoter or uses a gene which codes for a corresponding enzyme with a high activity and, if appropriate, combines these measures.
  • the term “less expressed” includes the weakening of the synthesis of the transaminase or the complete deletion of the transaminase brnA gene or the reduction or elimination of the intracellular activity of the transaminase. This can be done, for example, by using a weak promoter or using a gene or allei that codes for a corresponding enzyme with a low activity, or by inactivating the corresponding enzyme (protein) and, if appropriate, combining these measures.
  • the nucleotide sequences according to the invention comprise, optionally recombinant DNA which can be replicated in microorganisms of the genus Corynbacterium and which either do not contain a nucleotide sequence coding for a transaminase or contain a nucleotide sequence coding for a transaminase, which are not expressed or are expressed to a lesser extent than naturally occurring nucleotide sequences.
  • the term “natural” is intended to include nucleotide sequences that can be isolated from genetically unmodified microorganisms, the wild-type strains.
  • the nucleotide sequences should include sequences which i) a sequence shown in Seq. -ID # 1 encoding brnA, or ii) comprises a sequence corresponding to sequence (i) within the range of degeneracy of the genetic code, or iii) comprises a sequence matching one to the sequence
  • function-neutral meaning mutations means the exchange of chemically similar amino acids, such as. B. Glycine by alanine or serine by threonine.
  • nucleotide sequences coding for a transaminase can be removed or their expression reduced. These methods can be used, for example, to delete the brnA gene coding for the transaminase in the chromosome. Suitable methods for this are described in Shufer et al. (Gene (1994) 145: 69-73) or Link et al. (Journal of Bacteriology (1998) 179: 6228-6237). Only parts of the gene can also be deleted or mutated fragments of the transaminase gene can also be exchanged.
  • mutagenesis methods include undirected processes that use chemical reagents such as Use N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine or UV radiation for mutagenesis, followed by a search for the desired microorganisms for the need for L-valine, L-leucine and L-isoleucine.
  • the expression of the transaminase (brnA) gene can also be reduced.
  • the promoter and regulatory region located upstream of the structural gene can be mutated.
  • Expression cassettes which are installed upstream of the structural gene act in the same way.
  • adjustable promoters it is also possible to express in the course of the fermentation to reduce d-pantothenate formation.
  • regulation of translation is also possible, for example, by reducing the stability of the m-RNA.
  • genes can be used which code for the corresponding enzyme with low activity.
  • a reduced expression of the transaminase gene can also be achieved by changing the media composition and culture management. The expert can find instructions, inter alia, from Martin et al.
  • the microorganisms which are the subject of the present invention can produce pantothenic acid from glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, starch, cellulose or from glycerol and ethanol.
  • Gram-negative bacteria such as B. Escherichia coli, or gram-positive bacteria, e.g. B. the genus Bacillus or coryneform bacteria of the genera Corynebacterium or Arthrobacter.
  • the species Cory- To name nebacterium glutamicum which is known in the art for its ability to form low molecular weight metabolites such as D-pantothenic acid or amino acids.
  • This type includes wild-type strains such as B. Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Brevibacterium flavum ATCC14067, Corynebacterium melassecola ATCC17965 and others.
  • a gene bank is first created.
  • the creation of gene banks is recorded in well-known textbooks and manuals. Examples include the textbook by Winnacker: genes and clones, an introduction to genetic engineering (Verlag Chemie, Weinheim, Germany, 1990) or the manual by Sambrook et al. : Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
  • a well-known gene bank is that of the E. coli K-12 strain W3110, which was described by Kohara et al. (Cell 50, 495-508 (1987)), which was designed in ⁇ vectors. Bathe et al.
  • C. glutamicum 13032 which can be generated using the cosmid vector SuperCos I (Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84: 2160 -2164) in E. coli K-12 NM554 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16: 1563-1575).
  • Particularly suitable hosts are C. glutamicum strains which are defective in terms of restriction and recombination. An example of this is the strain R127, which was developed by Liebl et al. (FEMS Microbiol. Lett. 65: 269-304).
  • the gene bank is then incorporated into an indicator stock by transformation (Hanahan, Journal of Molecular Biology 166, 557-580, 1983) or electroporation (Tauch et.al., 1994, FEMS Microbiological Letters, 123: 343-347).
  • the indicator strain is distinguished by the fact that it has a mutation in the gene of interest which has a detectable phenotype, e.g. B. causes auxotrophy.
  • the indicator strains or mutants are available from published sources or strain collections or may have to be produced by the user. An example of this is the C. glutamicum mutant R127 / 12 isolated in the context of the present invention, which is defective in the brnA gene coding for the transaminase.
  • the plasmid After successful transformation of the indicator base, e.g. of the brnA mutant with a recombinant plasmid, the plasmid compensates for the property of the indicator strain, e.g. the need for the branched chain amino acids L-isoleucine, L-valine, L-leucine.
  • the plasmid complements the genetic functional defect of the indicator strain.
  • the gene or DNA fragment isolated in this way can be determined by determining the sequence, as described, for example, by Sanger et al. (Proceedings of the National of Sciences of the United States of America USA, 74: 5463-5467, 1977). Subsequently, the degree of identity can be known Genes contained in databases such as GenBank (Benson et el., 1998, Nuleic Acids Research, 26: 1- 7), using published methods (Altschul et al., 1990, Journal of Molecular Biology 215: 403-410 ) to be analyzed.
  • the new DNA sequence coding for the brnA gene from C. glutamicum was obtained, which is identified as SEQ-ID-NO. 1 is part of the present invention. Furthermore, the amino acid sequence of the transaminase was derived from the present DNA sequence using the methods described above. In SEQ ID NO. 2 shows the resulting amino acid sequence of the brnA gene product.
  • the microorganisms produced according to the invention can be cultured continuously or discontinuously in the batch process (batch cultivation) or in the fed batch (feed process) or repeated fed batch process (repetitive feed process) for the purpose of pantothenic acid production.
  • batch cultivation batch cultivation
  • feed process fed batch
  • repetitive feed process repetitive feed process
  • a summary of known cultivation methods can be found in the textbook by Chmiel (bioprocess technology 1st introduction to bioprocess engineering (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) or in the textbook by Storhas (bioreactors and peripheral devices (Vieweg Verlag, Braunschweig / Wiesbaden, (1994)) described.
  • the culture medium to be used must meet the requirements of the respective microorganisms in a suitable manner. Descriptions of cultural media differ their microorganisms are contained in the manual "Manual of Methods for General Bacteriology" of the American Society for Bacteriology (Washington DC, USA, 1981).
  • sugar and carbohydrates such as glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, starch and cellulose
  • oils and fats such as.
  • fatty acids such as.
  • alcohols such as. B. glycerol and ethanol and organic acids, such as. B.
  • acetic acid can be used. These substances can be used individually or as a mixture.
  • Organic nitrogen-containing compounds such as peptones, yeast extract, meat extract, malt extract, corn steep liquor, soybean meal and urea or inorganic compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate can be used as the nitrogen source.
  • the nitrogen sources can be used individually or as a mixture.
  • Potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing salts can be used as the source of phosphorus.
  • the culture medium must also contain salts of metals, such as magnesium sulfate or iron sulfate, which are necessary for growth.
  • the culture medium can also precursors of pantothenic acid such.
  • B. ß-alanine or L-valine can be added.
  • the feedstocks mentioned can be used for culture in Form of a one-time approach added or added in a suitable manner during the cultivation.
  • Basic compounds such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or acidic compounds such as phosphoric acid or sulfuric acid are used in a suitable manner to control the pH of the culture.
  • Antifoam agents such as e.g. Fatty acid polyglycol esters can be used.
  • suitable selectively acting substances e.g. Antibiotics.
  • oxygen or gas mixtures containing oxygen e.g. Air, entered into the culture.
  • the temperature of the culture is usually 20 ° C to 50 ° C, and preferably 25 ° C to 45 ° C.
  • the culture is continued until a maximum of pantothenic acid has formed. This goal is usually achieved within 10 to 160 hours.
  • pantothenic acid formed can be determined using known methods (Velisek; Chromatographie Science 60, 515-560 (1992)).
  • the Lactobacillus plantarum ATCC8014 strain is commonly used for the microbiological determination of pantothenic acid (US Pharmacopeia 1980; AOAC International 1980).
  • other test organisms such as Pediococcus acidilactici NCIB6990 are also used for see determination of pantothenate concentrations used (Sollberg and Hegna; Methods in Enzymology 62, 201-204 (1979)).
  • Fig. 1 plasmid vector pJClbrnA
  • Fig. 2 plasmid vector pK19mobsac ⁇ brnA
  • aminopep coding region of the aminopeptidase gene
  • Apol interface of the restriction enzyme Apol
  • Bglll interface of the restriction enzyme Bglll brnA: coding region of the transaminase gene, for example: base pairs
  • Bsu36I cleavage site of the restriction enzyme Bsu36I dbrnA: deleted brnA gene
  • Dralll interface of the restriction enzyme Dralll
  • Kan coding region of the kanamycin resistance gene
  • OriV Origin of vegetative replication oxred " : coding region of the oxidoreductase gene
  • SacB coding region of the sucrose resistance gene
  • Sall Interface of the restriction enzyme Sall
  • SexAI Interface of the restriction enzyme SexAI
  • Tthllll interface of the restriction enzyme Tthllll
  • the clones were cultivated in 60 ml of LB medium and centrifuged off in the exponential growth phase.
  • the cell pellet was washed once with 0.05 M potassium phosphate buffer and resuspended in the same buffer.
  • the cells were disrupted by means of an ultrasound treatment for 10 minutes (Branson-Sonifier W-250, Branson Sonic Power Co, Danbury, USA).
  • the cell debris was then removed by centrifugation at 13000 rpm and 4 ° C. for 30 minutes and the supernatant was used as a crude extract in the enzyme test.
  • the reaction mixture of the enzyme test contained 0.2 ml of 0.25 M Tris / HCl, pH 8, 0.05 ml of crude extract, and 0.1 ml of 2.5 mM pyridoxal phosphate, 0.1 ml of 40 mM ketoisocroate and 0.1 ml 0.5 M Na glutamate.
  • the test batches were incubated at 30 ° C., after 10, 20 and 30 minutes 200 ⁇ l samples were taken and their leucine concentration was determined by means of HPLC analysis (Hara et al., 1985, Analytica Chimica Acta 172: 167-173). As Table 1 shows, the strain R127 / 12 has no transaminase activity.
  • the vector pJCl was linearized with BamHI and dephosphorylated. Five ng of these were ligated with 20 ng of the said fraction of the chromosomal DNA and the mutant R127 / 12 was thus transformed by electroporation (Haynes and Britz, FEMS Microbiology Letters 61 (1989) 329-334). The transformants were tested for the ability to grow on CGXII agar plates without adding the branched chain amino acids. After replica plating and two days incubation at 30 ° C, 8 clones of over 5000 transformants tested grew on minimal medium plates. Plasmid preparations were made from these clones, as described by Schwarzer et al.
  • the nucleic acid sequence of the 1.5 kb Bgll / Nael fragment was determined by the dideoxy chain termination method by Sanger et al. (Proceedings of the National of Sciences of the United States of America USA (1977) 74: 5463-5467).
  • the auto-read sequencing kit was used (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden).
  • the gel electrophoretic analysis was carried out with the automatic laser fluorescence sequencer (A.L.F.) from Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, Sweden).
  • the nucleotide sequence obtained was analyzed with the program package HUSAR (Release 4.0, EMBL, Cambridge, GB).
  • the nucleotide sequence with the flanking regions Bgll / Nael is shown as SEQ ID no. 1 reproduced.
  • the analysis revealed an open reading frame of 1573 base pairs, which was identified as the brnA gene and which codes for a polypeptide of 367 amino acids, which is identified as SEQ-ID-NO. 2 is reproduced.
  • the plasmid pJCl was digested with the restriction enzymes Bgll and Nael according to the instructions of the manufacturer of the restriction enzyme (Röche, Boehringer Mannheim). Then the 1.5 kb Bgll / Nael fragment isolated by means of ion exchange columns (Quiagen, Hilden). The overhanging Bgll section of the isolated fragment was filled in with Klenow polymerase.
  • the vector pJCl (Cremer et al., Mol. Gen. Genet (1990) 220: 478-480) was Pstl cut, also treated with Klenow polymerase, and then fragment and vector ligated. The E.
  • coli strain DH5 ⁇ mcr (Grant et al., Proceedings of the National of Sciences of the United States of America USA, 87 (1990) 4645-4649) was transformed with the ligation approach (Hanahan, Journal of Molecular Biology 166 (1983) 557-580). Plasmid preparations (Sambrook et al., Molecular cloning. A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press) of clones identified a clone which contained the recombinant plasmid pJClbrnA. With this plasmid, Corynebacterium glutamicum R127 was transformed by means of electroporation as in Haynes et al. (1989, FEMS Microbiol. Lett.
  • the transaminase activity coded by brnA was then determined from Corynebacterium glutamicum R127 pJCl and Corynebacterium glutamicum R127 pJClbrnA.
  • the clones were cultivated in 60 ml of LB medium and centrifuged off in the exponential growth phase. The cell pellet was washed once with 0.05 M potassium phosphate buffer and resuspended in the same buffer. The cells were disrupted by means of an ultrasound treatment for 10 minutes (Branson-Sonifier W-250, Branson Sonic Power Co, Danbury, USA). The cell debris was then removed by centrifugation at 13000 rpm and 4 ° C.
  • the reaction batch of the enzyme test contained 0.2 ml of 0.25 M Tris / HCl, pH 8, 0.05 ml of crude extract, and 0.1 ml of 2.5 mM pyridoxal phosphate, 0.1 ml of 40 mM ketoisocaproate and 0.1 ml of 0.5 M Na-glutamate.
  • the test batches were incubated at 30 ° C., after 10, 20 and 30 minutes 200 ⁇ l samples were taken and their leucine concentration was determined by means of HPLC analysis (Hara et al. 1985, Analytica Chimica Acta 172: 167-173).
  • Table 2 shows, the strain Corynebacterium glutamicum R127 pJClbrnA has an increased transaminase activity compared to the control strain.
  • the incomplete gene was then isolated from the vector as an Xhol / Sall fragment and ligated into the vector pK19mobsacB linearized with Xhol / Sall (Schäfer 1994, Gene 145: 69-73).
  • the inactivation vector pK19mobsacB ⁇ brnA obtained was introduced into the E. coli strain S 17-1 by transformation (Hanahan 1983, Journal of Molecular Biology 166: 557-580) and transferred by conjugation to Corynebacterium glutamicum 13032 (Schäfer et al. 1990, Journal of Bacteriology 172: 1663-1666). Kanamycin-resistant clones of Corynebacterium glutamicum were obtained in which the inactivation vector was integrated in the genome.
  • kanamycin-resistant clones were placed on sucrose-containing LB medium ((Sambrook et al., Molecular cloning. A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press)) with 15 g / 1 agar, 2% glucose / 10% sucrose) and colonies obtained which have lost the vector again due to a second recombination event (Jäger et al. 1992, Journal of Bacteriology 174: 5462-5465).
  • the vector pECM3ilvBNCD (Sahm and Eggeling, Applied and Environmental Microbiology 65 (1999) 1973-1979), which carries a chloramphenicol resistance gene, was used to express the genes of acetohydroxy acid synthase (ilvBN) and isomeroreductase (ilvC).
  • Corynebacterium glutamicum 13032 ⁇ brnA was transformed with p ⁇ CM3ilvBNCD as in Schfer et al. , (Gene (1994) 145: 69-73).
  • the strains listed in Table 4 were precultivated in 60 ml of Brain Heart Infusion medium (Difco Laboratories, Detroit, USA) for 14 h at 30 ° C. The cells were then washed once with 0.9% NaCl solution (w / v) and inoculated with this suspension in each case 60 ml of CgXII medium, that the OD 6 oo was 0.5.
  • the medium was identical to that in Keilhauer et al. , (Journal of Bacteriology (1993) 175: 5595-5603).
  • the medium additionally contained 2 mM L-valine, L-isoleucine and L-leucine. The medium is shown in Table 3.
  • the medium was additionally treated with 1 mM isopropylthio- ⁇ -D- after 5 hours. galactoside added. After 48 hours of cultivation, samples were taken, the cells were centrifuged and the supernatant was sterile filtered. The pantothenate concentration of the supernatant was determined as described by Sahm and Eggeling (Applied and Environmental Microbiology 65 (1999), 1973-1979). The results are shown in Table 4.

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Abstract

Die Erfindung betrifft in Mikroorganismen der Gattung Corynebacterium replizierbare, gegebenenfalls rekombinante DNA. Sie betrifft weiterin ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Pantothensäure. Erfindungsgemäss wird durch eine Abschwächung oder Ausschaltung der Transaminase eine erhöhte Pantothensäurebildung möglich. Dies kann durch Deletion oder eine geringere Expression der für Transaminase codierenden Gensequenzen erreicht werden. Beispielsweise konnte durch Deleton oder Reduzierung der Expression des neuisolierten D-Pantothenatbiosynthesegens brnA aus Corynebacterium glutamicum in verbesserter Weise Panthotenat produziert werden. Mit Hilfe der erfindungsgemässen Nukleotidsequenz und dem Verfahren wird es möglish, durch Reduzierung der Transaminaseaktivität, eine verstärkte Pantothensäureproduktion zu erreichen.

Description

B e s c h r e i b u n g
Verfahren zur fermentativen Herstellung von Pantothensaure
Die Erfindung betrifft in Mikroorganismen der Gattung Corynebacterium replizierbare, gegebenenfalls rekombinante DNA. Sie betrifft weiterhin ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Pantothensaure.
Die Pantothensaure stellt ein kommerziell bedeutendes Vitamin dar, das in der Kosmetik, der Medizin, der Humanernährung und in der Tierernährung Anwendung findet . Es besteht daher ein allgemeines Interesse daran, verbesserte Verfahren zur Herstellung von Pantothensaure bereitzustellen.
Pantothensaure kann durch chemische Synthese oder biotechnologisch durch Fermentation geeigneter Mikroorganismen in geeigneten Nährlösungen hergestellt werden. Der Vorteil der biotechnologischen Herstellung durch Mikroorganismen liegt in der Bildung der korrekten stereoisomeren Form, nämlich der D-Form von Pantothensaure, die frei von L-Pantothensaure ist.
Verschiedene Arten von Bakterien, wie z. B. Ξscherichia coli, Corynebacterium erythrogenes, Brevibacterium ammoniagenes und auch Hefen, wie z. B. Debaromyces castellii können wie in EPA 0 493 060 gezeigt, in einer Nährlösung, die Glucose, D -Pantoinsäure und ß-Alanin enthält, D-Pantothensäure produzieren. EP 0 493 060 zeigt weiterhin, daß bei Escherichia coli durch Amplifikation von Pantothensaure-Biosynthesegenen mittels der Plasmide pFV3 und pFV5 die Bildung von D-Pantothensäure verbessert wird.
EP 0 590 857 beschreibt Stämme von Escherichia coli, die Resistenzen gegen verschiedene Antimetabolite, wie z. B. Salizylsäure, α-Ketobuttersäure, ß-Hydroxyaspara- ginsäure etc. tragen und in einer Nährlösung, die Glucose und ß-Alanin enthält, D-Pantoinsäure und D-Pantothensäure produzieren. In EPA 0 590 857 wird weiterhin gezeigt, daß durch Amplifikation der Pantothensaure- Biosynthesegene, die auf dem Plasmid pFV31 enthalten sind, die Produktion von D-Pantoinsäure und D-Pantothensäure verbessert werden kann.
In WO 97/10340 wird darüber hinaus gezeigt, daß in Pantothensaure bildenden Mutanten von Escherichia coli durch Erhöhung der Aktivität des Enzyms Acetohydroxy- säure-Synthase II, einem Enzym der Valin Biosynthese, die Pantothensaureproduktion weiter gesteigert werden kann.
Durch stoffwechselbedingte Nebenreaktionen werden neben der Pantothensaure noch andere Aminosäuren, wie z. B. Isoleucin, Valin und Leucin gebildet. Um eine hohe Produktausbeute an Pantothensaure zu erzielen, muß die Bildung dieser Stoffwechselprodukte unterdrückt oder reduziert werden.
Es ist daher Aufgabe der Erfindung, eine DNA bzw. einen Plasmidvektor bereitzustellen, mit der bzw. dem eine gesteigerte Pantothensäurebildung erreicht werden kann. Weiterhin ist es Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zu schaffen, mit dem eine hohe Pantothensaureproduktion mit Mikroorganismen möglich wird. Eine weitere Aufgabe der Erfindung liegt in der Bereitstellung von Mikroorganismen, mit denen eine erhöhte Pantothensaureproduktion möglich ist.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch die re- kombinanten DNA-Sequenzen, wie sie in den Ansprüchen niedergelegt sind. Die Aufgabe wird weiterhin gelöst durch die Verwendung der gemäß Anspruch 6 hergestellten, verbesserten, Pantothensaure erzeugenden Mikroorganismen sowie die Verwendung des gemäß Anspruch 7 hergestellten Plasmidvektors . Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Pantothensaure unter Verwendung von Mikroorganismen, die insbesondere bereits Pantothensaure produzieren und in denen das für die Transaminase codierende brnA-Gen deletiert wurde oder in seiner Expression abgeschwächt wird oder gar nicht exprimiert wird.
Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindungen sind in den Unteransprüchen angegeben.
Wenn im folgenden Text D-Pantothensäure oder Pantothensaure oder Pantothenat erwähnt werden, sind damit nicht nur die freie Säure sondern auch die Salze der D-Pantothensäure, wie z. B. das Calcium-, Natrium-, Ammoniumoder Kaliumsalz gemeint. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und der DNA sowie den Mikroorganismen ist es nunmehr möglich, gegenüber herkömmlichen Verfahren eine erhöhte Konzentration an Pantothensaure zu produzieren. Die Erfinder fanden heraus, daß nach Deletion oder Reduzierung der Expression des neu isolierten D-Pantothenatbiosynthesegens brnA aus Corynebacterium glutamicum, das für das Enzym Transaminase codiert, in verbesserter Weise D-Pantothenat produziert werden kann, da stoffwechselbedingte Nebenreaktionen abgeschwächt oder komplett ausgeschaltet werden. Durch die Reduktion der Transaminase Aktivität wird die durch dieses Enzym katalysierte Produktion von L-Isoleucin, L-Valin und L-Leucin entweder abgeschwächt oder völlig blockiert. So können die für die Pantothensäurebildung benötigten Vorstufen nur noch in Richtung der Pantothensaure umgesetzt werden. Die Erfinder haben weiter festgestellt, daß in Kombination mit einer Verstärkung bzw. Überexpression folgender Gene eine verstärkte Pantothenatbildung bewirkt wird: ilvBN-Gene, die für das Enzym Acetohydroxysäuresynthase codieren, ilvC-Gen, das für das Enzym Isomeroreduktase codiert, ilvD-Gen, das für das Enzym Dihydroxysäuredehydratase codiert, sowie Verstärkung bzw. Überexpression des Gens panB, das für das Enzym Ketopantoathydroxymethyltrans- ferase codiert und des Gens panC, das für das Enzym Pantothenatligase codiert sowie des Gens panD, welches für das Enzym Aspartatdecarboxylase codiert. Durch Aktivierung eines, mehrerer oder aller dieser Enzyme werden auch verstärkt die für die Pantothensäurebildung benötigten Vorstufen gebildet . Der Begriff Verstärkung beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA codiert werden, indem man z. B. die Kopienzahl des Gens/der Gene erhöht, einen starken Promotor verwendet oder ein Gen verwendet , das für ein entsprechendes Enzym mit einer hohen Aktivität codiert und gegebenenf lls diese Maßnahmen kombiniert.
Der Begriff "geringer exprimiert" beinhaltet die Ab- schwächung der Synthese der Transaminase bzw. die vollständige Deletion des Transaminase brnA-Gens oder die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität der Transaminase. Dies kann beispielsweise durch Verwendung eines schwachen Promotors oder Verwendung eines Gens bzw. Alleis, das für ein entsprechendes Enzym mit einer niedrigen Aktivität kodiert, bzw. durch Inaktivierung des entsprechenden Enzyms (Protein) und gegebenenfalls Kombination dieser Maßnahmen erfolgen.
Die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen umfassen in Mikroorganismen der Gattung Corynbacterium replizierbare, gegebenenfalls rekombinante DNA, die entweder keine für eine Transaminase codierende Nukleotidsequenz enthalten oder eine für eine Transaminase codierende Nukleotidsequen enthalten, die nicht oder gegenüber natürlich vorkommenden Nukleotidsequenzen geringer exprimiert werden. Der Begriff "natürlich" soll dabei solche Nukleotidsequenzen umfassen, die aus genetisch nicht veränderten Mikroorganismen, den Wildtypstammen, isoliert werden können. Weiterhin sollen die Nukleotidsequenzen Sequenzen umfassen, die i) eine Sequenz, dargestellt in Seq. -ID-Nr .1, die für brnA codiert, umfaßt oder ii) eine Sequenz umfaßt, die der Sequenz (i) innerhalb des Bereichs der Degeneration des genetischen Codes entspricht oder iii) eine Sequenz umfaßt, die mit einer zur Sequenz
(i) oder (ii) komplemetären Sequenz hybridisiert, und gegebenenfalls iiii) funktionsneutrale Sinnmutationen in (i) umfaßt.
Dabei bedeutet der Begriff funktionsneutrale Sinnmutationen den Austausch chemisch ähnlicher Aminosäuren, wie z. B. Glycin durch Alanin oder Serin durch Threo- nin.
Mit Hilfe gerichteter rekombinanter DNA-Techiken können für eine Transaminase codierende Nukleotidsequenzen entfernt oder in ihrer Expression reduziert werden. Mit Hilfe dieser Methoden kann zum Beispiel das für die Transaminase codierende brnA-Gen im Chromosom deletiert werden. Geeignete Methoden dazu sind bei Schäfer et al . (Gene (1994) 145: 69-73) oder auch Link et al . (Journal of Bacteriology (1998) 179: 6228-6237) beschrieben. Auch können nur Teile des Gens deletiert werden o- der auch mutierte Fragmente des Transaminase-Gens ausgetauscht werden. Durch Deletion oder Austausch wird so ein Verlust oder eine Reduktion der Transa- minaseaktivität erreicht (Möckel et al . , (1994) Molecular Microbiology 13: 833-842; Morbach et al . , (1996) Applied Microbiology and Biotechnology 45: 612-620) . Ein Beispiel für eine derartige Mutante ist der erfindungsgemäße C. glutamicum Stamm 13032ΔbrnA, der eine Deletion im brnA-Gen trägt.
Eine weitere Möglichkeit, die Aktivität der Transaminase abzuschwächen oder auszuschalten, sind Muta- geneseverfahren. Hierzu gehören ungerichtete Verfahren, die chemische Reagenzien, wie z.B. N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin oder auch UV- Bestrahlung zur Mutagenese benutzen, mit anschließender Suche der gewünschten Mikroorganismen auf Bedürftigkeit für L-Valin, L-Leucin und L-Isoleucin. Verfahren zur Mutationsauslösung und Mutantensuche sind allgemein bekannt und können unter anderem bei Miller (A Short Course in Bacterial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for E- scherichia coli and Related Bacteria (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992)) oder im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981) nachgelesen werden.
Darüber hinaus kann auch die Expression des Transaminase (brnA) -Gens reduziert werden. So kann die Promoter- und Regulationsregion, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch regulierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Expression im Verlaufe der fermenta- tiven D-Pantothenatbildung zu reduzieren. Daneben ist aber auch eine Regulation der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der m-RNA reduziert wird. Desweiteren können Gene verwendet werden, die für das entsprechende Enzym mit geringer Aktivität codieren. Alternativ kann weiterhin eine reduzierte Expression des Transaminase-Gens durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden. Anleitungen findet der Fachmann unter anderem bei Martin et al .
(Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), bei Guerrero et al . (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya und Morinaga
(Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), bei Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), in der Europäischen Patentschrift EPS 0 472 869, im US Patent 4,601,893, bei Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991), bei Reinscheid et al . (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), bei LaBarre et al . (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)) und in der Patentanmeldung WO 96/15246.
Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können Pantothensaure aus Glu- cose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es kann sich um Gram-negative Bakterien, wie z. B. Escherichia coli, oder Grampositive Bakterien, z. B. der Gattung Bacillus oder um coryneforme Bakterien der Gattungen Corynebacterium oder Arthrobacter handeln. Bei der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die Art Cory- nebacterium glutamicum zu nennen, die in der Fachwelt für ihre Fähigkeit bekannt ist, niedermolekulare Metabolite wie D-Pantothensäure oder Aminosäuren zu bilden. Zu dieser Art gehören Wildtypstämme, wie z. B. Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Brevibacterium flavum ATCC14067, Corynebacterium melassecola ATCC17965 und andere.
Zur Isolierung des Gens brnA von C. glutamicum oder anderer Gene wird zunächst eine Genbank angelegt. Das Anlegen von Genbanken ist in allgemein bekannten Lehrbüchern und Handbüchern niedergeschrieben. Als Beispiel seien das Lehrbuch von Winnacker: Gene und Klone, Eine Einführung in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Deutschland, 1990) oder das Handbuch von Sambrook et al . : Molecular Clo- ning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) genannt. Eine bekannte Genbank ist die des E. coli K-12 Stammes W3110, die von Ko- hara et al . (Cell 50, 495 - 508 (1987)), die in λ- Vektoren angelegt wurde. Bathe et al . (Molecular and General Genetics, 252:255-265, 1996) beschreiben eine Genbank von C. glutamicum 13032, die mit Hilfe des Cosmidvektors SuperCos I (Wahl et al . , 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84:2160-2164) im E. coli K-12 NM554 (Raleigh et al . , 1988, Nucleic Acids Research 16:1563-1575) angelegt wurde. Als Wirte eignen sich besonders solche C. glutamicum Stämme, die restrik- tions- und rekombinationsdefekt sind. Ein Beispiel hierfür ist der Stamm R127, der von Liebl et al . (FEMS Microbiol. Lett . 65: 269-304) beschrieben wurde .
Die Genbank wird anschließend in einen Indikatorstamm durch Transformation (Hanahan, Journal of Molecular Biology 166, 557-580, 1983) oder Elektro- poration (Tauch et.al., 1994, FEMS Microbiological Letters, 123:343-347) eingebaut. Der Indikatorstamm zeichnet sich dadurch aus, daß er eine Mutation in dem interessierenden Gen besitzt, die einen detek- tierbaren Phänotyp, z. B. eine Auxotrophie hervorruft. Die Indikatorstämme bzw. Mutanten sind aus publizierten Quellen oder Stammsammlungen erhältlich oder müssen gegebenenfalls selbst hergestellt werden. Ein Beispiel hierfür ist die im Rahmen der vorliegenden Erfindung isolierte C. glutamicum Mut- ante R127/12, die in dem für die Transaminase codierendem brnA-Gen defekt ist. Nach erfolgreicher Transformation des Indikatorstammes, wie z.B. der brnA-Mutante mit einem rekombinanten Plasmid, kompensiert das Plasmid die Eigenschaft des Indikatorstammes, wie z.B. die Bedürftigkeit für die ver- zweigtkettigen Aminosäuren L-Isoleucin, L-Valin, L-Leucin. Das Plasmid komplementiert den genetischen Funktionsdefekt des Indikatorstammes.
Das dergestalt isolierte Gen bzw. DNA-Fragment kann durch Bestimmung der Sequenz, wie z.B. bei Sanger et al . (Proceedings of the National of Sciences of the United States of America USA, 74:5463-5467, 1977) beschrieben und charakterisiert werden. Anschließend kann der Grad an Identität zu bekannten Genen, die in Datenbanken wie z.B. der GenBank (Benson et el . , 1998, Nuleic Acids Research, 26:1- 7) enthalten sind, mit publizierten Methoden (Altschul et al . , 1990, Journal of Molecular Biology 215:403-410) analysiert werden.
Auf diese Weise wurde die neue für das Gen brnA codierende DNA-Sequenz von C. glutamicum erhalten, die als SEQ-ID-NR. 1 Bestandteil der vorliegenden Erfindung ist. Weiterhin wurden aus der vorliegenden DNA-Sequenz mit den oben beschriebenen Methoden die Aminosäuresequenz der Transaminase abgeleitet . In SEQ-ID-NR. 2 ist die sich ergebende Aminosäure- sequenz des brnA-Genproduktes dargestellt.
Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch- Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Pantothensaureproduktion kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/ Wiesbaden, (1994)) beschrieben.
Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Mikroorganismen genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschie- dener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981) enthalten. Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate, wie z.B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette, wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren, wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Li- nolsäure, Alkohole, wie z. B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren, wie z. B. Essigsäure, verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als Stickstoffquelle können organische stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoni- umcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als Phosphorquelle können Kalium- dihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat o- der die entsprechenden natriumhaltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muß weiterhin Salze von Metallen enthalten, wie z.B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies Vorstufen der Pantothensaure, wie z. B. ß-Alanin oder L-Valin, zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.
Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaum- mittel, wie z.B. Fettsäurepolyglykolester, eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe, z.B. Antibiotika, hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten werden Sauerstoff oder sauerstoffhaltige Gasmischungen, wie z.B. Luft, in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20 °C bis 50 °C und vorzugsweise bei 25 °C bis 45 °C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum an Pantothensaure gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 bis 160 Stunden erreicht .
Die Konzentration an gebildeter Pantothens ure kann mit bekannten Verfahren (Velisek; Chromatographie Science 60, 515-560 (1992)) bestimmt werden. Zur mikrobiologischen Bestimmung von Pantothensaure wird gebräuchlicherweise der Stamm Lactobacillus plantarum ATCC8014 eingesetzt (U.S. Pharmacopeia 1980; AOAC International 1980) . Darüber hinaus werden auch andere Testorganismen, wie z.B. Pediococcus acidilactici NCIB6990 zur ikrobiologi- sehen Bestimmung von Pantothenatkonzentrationen eingesetzt (Sollberg and Hegna; Methods in Enzymo- logy 62, 201-204 (1979)).
Folgende Mikroorganismen wurden am 22.12.2000 bei der Deutschen Sammlung für Mikrorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) gemäß Budapester Vertrag hinterlegt :
Corynebacterium glutamicum 13032ΔbrnA als DSM 13971 Corynebacterium glutamicum R127/12 als DSM 13970
Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unteransprüchen angegeben.
Die Zeichnungen zeigen eine beispielhafte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens :
Es zeigt :
Fig. 1: Plasmidvektor pJClbrnA
Fig. 2: Plasmidvektor pK19mobsacΔbrnA
Bei den Angaben der Basenpaarzahlen handelt es sich um ca. -Werte, die im Rahmen der Reproduzierbarkeit erhalten werden. Die in den Figuren verwendeten Abkürzungen haben folgende Bedeutung :
aminopep: Kodierbereich des Aminopeptidasegens
ApaLI : Schnittstelle des Restriktionsenzyms ApaLI
Apol : Schnittstelle des Restriktionsenzyms Apol
Asp7181: Schnittstelle des Restriktionsenzyms Asp7181 Aval: Schnittstelle des Restriktionsenzyms Aval
Ball : Schnittstelle des Restriktionsenzyms Ball
BamHI : Schnittstelle des Restriktionsenzyms BamHI
Bell : Schnittstelle des Restriktionsenzyms Bell
Bgll: Schnittstelle des Restriktionsenzyms Bgll
Bglll: Schnittstelle des Restriktionsenzyms Bglll brnA: Kodierbereich des Transaminasegens bsp : Basenpaare
BspH:I Schnittstelle des Restriktionsenzyms BspHI
BsrDi : Schnittstelle des Restriktionsenzyms BsrDi
BsrGI : Schnittstelle des Restriktionsenzyms BsrGI
Bsu36I: Schnittstelle des Restriktionsenzyms Bsu36I dbrnA: Deletiertes brnA Gen
Dralll: Schnittstelle des Restriktionsenzyms Dralll
Dsal : Schnittstelle des Restriktionsenzyms Dsal
Eco47III: Schnittstelle des Restriktionsenzyms Eco47III
EcoRI : Schnittstelle des Restriktionsenzyms EcoRI
Hindlll: Schnittstelle des Restriktionsenzyms Hindlll
Kan: Kodierbereich des Kanamycinresistenzgens
Kpnl : Schnittstelle des Restriktionsenzyms Kpnl
Nael : Schnittstelle des Restriktionsenzyms Nael
Ncol : Schnittstelle des Restriktionsenzyms Ncol
Nhel : Schnittstelle des Restriktionsenzyms Nhel
OriT: Origin of transfer
OriV: Origin der vegetativen Replikation oxred" : Kodierbereich des Oxidoreduktasegens
PstI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms PstI
Pvul: Schnittstelle des Restriktionsenzyms Pvul
Rsrll: Schnittstelle des Restriktionsenzyms Rsrll
SacB: Kodierbereich des Sucroseresistenzgens
Sall: Schnittstelle des Restriktionsenzyms Sall
SexAI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms SexAI
SgrAI : Schnittstelle des Restriktionsenzyms SgrAI
Smal : Schnittstelle des Restriktionsenzyms Smal
SphI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms SphI
Sse8387I : Schnittstelle des Restriktionsenzyms Sse8387I
Tthllll: Schnittstelle des Restriktionsenzyms Tthllll
Xbal: Schnittstelle des Restriktionsenzyms Xbal
Xhol: Schnittstelle des Restriktionsenzyms Xhol
Xmal : Schnittstelle des Restriktionsenzyms Xmal
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert .
Beispiel 1
Klonierung, Sequenzierung und Expression des für die Transaminase codierenden brnA-Gens aus Corynebacterium glutamicum
1. Isolierung einer brnA Mutante von Corynebacterium glutamicum
Der Stamm Corynebacterium glutamicum R127 (Haynes 1989, FEMS Microbiology Letters 61: 329-334) wurde mit N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin mutagenisiert
(Sambrook et al . , Molecular cloning. A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press) . Dazu wurden 5 ml einer über Nacht angezogenen Corynebacterium glutamicum Kultur mit 250 μl N-methyl-N- nitro-N-nitrosoguanidin (5 mg /ml Dimethylformamid) versetzt und 30 Minuten bei 30 °C und 200 Upm inkubiert
(Adelberg 1958, Journal of Bacteriology 76: 326). Die Zellen wurden anschließend zweimal mit steriler NaCl- Lösung ( 0 , 9 %) gewaschen. Durch Replikaplattierung auf Minimalmediumplatten CGXII mit 15 g/1 Agar (Keilhauer et al Journal of Bacteriology 175: 5595-5603), wurden Mutanten isoliert, die bei Zugabe von L-Valin, L-Isoleucin und L-Leucin (je 0,1 g/1) wuchsen, aber nicht bei Zugabe von Keto-Valin, Keto-Isoleucin und Keto- Leucin (je 0,1 g/1). Die Enzymaktivität der Transaminase wurde im Rohextrakt dieser Mutanten bestimmt . Dazu wurden die Klone in 60 ml LB-Mediu kultiviert und in der exponentiellen Wachstumsphase abzentrifugiert . Das Zellpellet wurde einmal mit 0,05 M Kaliumphosphatpuffer gewaschen und im selben Puffer resuspendiert. Der Zellaufschluß erfolgte mittels 10 minütiger Ultraschallbehandlung (Branson- Sonifier W-250, Branson Sonic Power Co, Danbury, USA). Anschließend wurden die Zelltrümmer durch eine 30 minü- tige Zentrifugation bei 13000 rpm und 4 °C abgetrennt und der Überstand als Rohextrakt in den Enzymtest eingesetzt. Der Reaktionsansatz des Enzymtests enthielt 0,2 ml 0,25 M Tris/HCl, pH 8 , 0,05 ml Rohextrakt, und 0,1 ml 2,5 mM Pyridoxalphosphat , 0,1 ml 40 mM Ketoiso- caproat und 0,1 ml 0,5 M Na-Glutamat . Die Testansätze wurden bei 30 °C inkubiert, nach 10, 20 und 30 Minuten wurden je 200 μl Proben genommen und deren Leucinkon- zentration mittels HPLC-Analytik bestimmt (Hara et al . , 1985, Analytica Chimica Acta 172: 167-173). Wie Tabelle 1 zeigt, weist der Stamm R127/12 keine Transaminase Aktivität auf.
Tabelle 1 :
Spezifische Aktivität (μmol/min und mg Protein) der
Transaminase in Corynebacterium glutamicum Stämmen
Figure imgf000020_0001
2. Klonierung des brnA-Gens von Corynebacterium glutamicum
Chromosomale DNA aus Corynebacterium glutamicum 13032 wurde wie bei Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9
(1990) 84-87) beschrieben isoliert. Diese wurde mit dem Restriktionsenzym Sau3A (Boehringer Mannheim) gespalten und durch Saccharose-Dichte-Gradienten-Zentrifugation
(Sambrook et al . , Molecular cloning. A laboratory man- ual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press) aufgetrennt. Die Fraktion mit dem Fragmentgrößenbereich von etwa 6-10 kb wurde zur Ligation mit dem Vektor pJCl
(Cremer et al . , Molecular and General Genetics 220
(1990) 478-480) eingesetzt. Der Vektor pJCl wurde hierzu mit BamHI linearisiert und dephosphoryliert . Fünf ng davon wurden mit 20 ng der genannten Fraktion der chro- mosomalen DNA ligiert und damit die Mutante R127/12 durch Elektroporation (Haynes und Britz, FEMS Microbiology Letters 61 (1989) 329-334) transformiert. Die Transformanten wurden auf die Fähigkeit getestet auf CGXII Agarplatten ohne Zugabe der verzweigtkettigen Aminosäuren wachsen zu können. Von über 5000 getesteten Transformanden wuchsen nach Replicaplattierung und zweitägiger Inkubation bei 30 °C 8 Klone auf Minimalmediumplatten. Von diesen Klonen wurden Plasmidpräparati- onen, wie bei Schwarzer et al . (Bio/Technology (1990) 9: 84-87) beschrieben, durchgeführt. Restriktionsanalysen der Plasmid-DNA ergaben, daß in allen 8 Klonen dasselbe Plasmid, im folgenden pJClbrnA genannt, enthalten war. Das Plasmid trägt ein Insert von 6,1 kb und wurde durch Retransformation auf seine Fähigkeit, die brnA- Mutante R127/12 zu komplementieren, getestet. Durch Subklonierung wurde der für die Komplementation der Mutante R127/12 verantwortliche Bereich auf ein 1,5 kb Bgll/Nael- Fragment eingegrenzt.
3. Sequenzierung des brnA-Gens
Die Nukleinsäuresequenz des 1,5 kb Bgll/Nael-Fragments wurde nach der Dideoxy-Kettenabbruchmethode von Sanger et al . durchgeführt (Proceedings of the National of Sciences of the United States of America USA (1977) 74: 5463-5467) . Dabei wurde der Auto-Read Sequencing kit verwendet (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) . Die gelelektrophoretische Analyse erfolgte mit dem automatischen Laser-Fluoreszenz Sequenziergerät (A.L.F.) von Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, Schweden) . Die erhaltene Nukleotidsequenz wurde mit dem Programmpaket HUSAR (Release 4.0, EMBL, Cambridge, GB) analysiert. Die Nukleotidsequenz mit den flankierenden Bereichen Bgll/Nael ist als SEQ-ID-Nr. 1 wiedergegeben. Die Analyse ergab ein offenes Leseraster von 1573 Basenpaaren, das als brnA-Gen identifiziert wurde und für ein Polypeptid von 367 Aminosäuren codiert, das als SEQ-ID-NR. 2 wiedergegeben ist.
4. Expression des brnA-Gens
Das Plasmid pJCl wurde mit den Restriktionsenzymen Bgll und Nael entsprechend den Angaben des Herstellers des Restriktionsenzyms verdaut (Röche, Boehringer Mannheim) . Anschließend wurde das 1,5 kb Bgll/Nael-Fragment mittels Ionenaustauschersäulchen isoliert (Quiagen, Hilden) . Der überhängende Bgll Schnitt des isolierten Fragmentes wurde mit Klenow Polymerase aufgefüllt. Der Vektor pJCl (Cremer et al . , Mol. Gen. Genet (1990) 220:478-480) wurde Pstl-geschnitten, ebenfalls mit Klenow Polymerase behandelt, und anschließend Fragment und Vektor ligiert. Mit dem Ligationsansatz wurde der E. coli Stamm DH5αmcr (Grant et al . , Proceedings of the National of Sciences of the United States of America USA, 87 (1990) 4645-4649) transformiert (Hanahan, Journal of Molecular Biology 166 (1983) 557-580) . Durch Plasmidpräparationen (Sambrook et al . , Molecular clon- ing. A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press) von Klonen wurde ein Klon identifiziert, der das rekombinante Plasmid pJClbrnA enthielt . Mit diesem Plasmid wurde Corynebacterium glutamicum R127 mittels Elektroporation transformiert wie bei Haynes et al . (1989, FEMS Microbiol . Lett . 61: 329- 334) beschrieben. Von Corynebacterium glutamicum R127 pJCl und Corynebacterium glutamicum R127 pJClbrnA wurde anschließend die durch brnA codierte Transaminase- Aktivität bestimmt. Dazu wurden die Klone in 60 ml LB- Medium kultiviert und in der exponentiellen Wachstumsphase abzentrifugiert . Das Zellpellet wurde einmal mit 0,05 M Kaliumphosphatpuffer gewaschen und im selben Puffer resuspensiert . Der Zellaufschluß erfolgte mittels 10 minütiger Ultraschallbehandlung (Branson- Sonifier W-250, Branson Sonic Power Co, Danbury, USA). Anschließend wurden die Zelltrümmer durch eine 30 minü- tige Zentrifugation bei 13000 rpm und 4 °C abgetrennt und der Überstand als Rohextrakt in den Enzymtest eingesetzt. Der Reaktionsansatz des Enzymtests enthielt 0,2 ml 0,25 M Tris/HCl, pH 8 , 0,05 ml Rohextrakt, und 0,1 ml 2,5 mM Pyridoxalphosphat , 0,1 ml 40 mM Ketoiso- caproat und 0,1 ml 0,5 M Na-Glutamat. Die Testansätze wurden bei 30 °C inkubiert, nach 10, 20 und 30 Minuten wurden je 200 μl Proben genommen und deren Leucinkon- zentration mittels HPLC-Analytik bestimmt (Hara et al . 1985, Analytica Chimica Acta 172: 167-173) . Wie Tabelle 2 zeigt, weist der Stamm Corynebacterium glutamicum R127 pJClbrnA eine gesteigerte Transaminase-Aktivität gegenüber dem Kontrollstamm auf.
Tabelle 2 :
Spezifische Aktivität (μmol/min und mg Protein) der
Transaminase in Corynebacterium glutamicum R127
Figure imgf000024_0001
Beispiel 2
Konstruktion einer brnA Deletionsmutante von Corynebacterium glutamicum
Die interne Deletion des brnA-Gens von Corynebacterium glutamicum 13032 wurde mit dem bei Schäfer et al . (Gene 145: 69-73 (1994)) beschriebenen System zum Genaustausch durchgeführt. Zur Konstruktion des Inaktivie- rungsvektors pK19mobsacBΔbrnA wurde zunächst das 1 , 5 kb Bgll/Nael-Fragment in die Smal Schnittstelle des Vektors pUC18 kloniert . Aus dem resultierenden Vektor pUClδbrnA wurde ein internes 770 bp Dralll -Fragment entfernt. Hierzu wurde der Vektor mit Dralll geschnitten und, nach Abtrennung des brnA internen Dralll - Fragmentes, mittels Agarosegelelektrophorese religiert . Anschließend wurde aus dem Vektor das unvollständige Gen als Xhol/Sall-Fragment isoliert und in den mit Xhol/Sall linearisierten Vektor pK19mobsacB (Schäfer 1994, Gene 145: 69-73) ligiert. Der erhaltene Inakti- vierungsvektor pK19mobsacBΔbrnA wurde durch Transformation in den E. coli Stamm S 17-1 eingebracht (Hanahan 1983, Journal of Molecular Biology 166: 557-580) und per Konjugation nach Corynebacterium glutamicum 13032 transferiert (Schäfer et al . 1990, Journal of Bacteriology 172: 1663-1666). Es wurden Kanamycin-resistente Klone von Corynebacterium glutamicum erhalten, bei denen der Inaktivierungsvektor im Genom integriert vorlag. Um auf die Excision des Vektors zu selektionieren, wurden Kanamycin-resistente Klone auf Saccharose- haltigem LB-Medium ( (Sambrook et al . , Molecular clo- ning. A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press) ) mit 15 g/1 Agar, 2% Glucose/ 10% Saccharose) ausplattiert und Kolonien erhalten, welche den Vektor durch ein zweites Rekombinationsereignis wieder verloren haben (Jäger et al . 1992, Journal of Bacteriology 174: 5462-5465) . Durch Überimpfen auf Minimalmediumplatten (Medium CGXII mit 15 g/1 Agar (Keil- hauer et al . , Journal of Bacteriology 175 (1993) 5595- 5603) ) mit und ohne 2 mM L-Isoleucin, 2 mM L-Valin, 2 mM L-Leucin, bzw. mit und ohne 50 μg/ml Kanamycin wurden 36 Klone isoliert, welche durch die Excision des Vektors Kanamycin sensitiv und Isoleucin-Leucin-Valin auxotroph waren und bei denen nun das unvollständige brnA-Gen (ΔbrnA-Allel) im Genom vorlag. Der Stamm wurde als Corynebacterium glutamicum 13032ΔbrnA bezeichnet und weiter verwendet .
Beispiel 3
Expression der Gene ilvD, ilvBN, ilvC und panBC in Corynebacterium glutamicum
Zur Expression der Gene der Acetohydroxysäuresynthase (ilvBN) und der Isomeroreduktase (ilvC) wurde der Vektor pECM3ilvBNCD benutzt (Sahm und Eggeling, Applied and Environmental Microbiology 65 (1999) 1973-1979) welcher ein Chloramphenicolresistenzgen trägt. Corynebacterium glutamicum 13032ΔbrnA wurde mit pΞCM3ilvBNCD transformiert wie bei Schäfer et al . , (Gene (1994) 145: 69-73) beschrieben. Der resultierende Stamm Corynebacterium glutamicum 13032ΔbrnA pECM3ilvBNCD wurde mit dem bei Sahm und Eggeling beschriebenen Vektor pEKEx2panBC transformiert (Applied and Environmental Microbiology 65 (1999) , 1973-1979) .
Beispiel 4
Produktion von D-Pantothenat mit verschiedenen C. glutamicum Stämmen
Zur Untersuchung ihrer Pantothenatbildung wurden die in Tabelle 4 angegebenen Stämme in 60 ml Brain Heart Infusion-Medium (Difco Laboratories, Detroit, USA) für 14 h bei 30 °C vorkultiviert. Anschließend wurden die Zellen einmal mit 0,9% NaCl-Lösung (w/v) gewaschen und mit dieser Suspension je 60 ml CgXII-Medium so angeimpft, daß die OD6oo 0,5 betrug. Das Medium war identisch mit dem bei Keilhauer et al . , (Journal of Bacteriology (1993) 175: 5595-5603) beschriebenen Medium. Für die Kultivierung der ΔbrnA Stämme enthielt das Medium aber zusätzlich 2 mM L-Valin, L-Isoleucin und L-Leucin. Das Medium ist in Tabelle 3 dargestellt.
Tabelle 3 :
Zusammensetzung des Mediums CGXII
Figure imgf000027_0001
Bei der Kultivierung der Stämme wurde das Medium nach 5 Stunden zusätzlich mit 1 mM Isopropylthio-ß-D- galactosid versetzt. Nach 48 stündiger Kultivierung wurden Proben genommen, die Zellen abzentrifugiert und der Überstand sterilfiltriert. Die Pantothenatkon- zentration des Überstands wurde wie bei Sahm und Eggeling beschrieben (Applied and Environmental Microbiology 65 (1999), 1973-1979) bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt.
Tabelle 4 :
D-Pantothenatbildung in verschiedenen C. glutamicum
Stämmen
Figure imgf000028_0001

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
In Mikroorganismen der Gattung Corynebacterium replizierbare, gegebenenfalls rekombinante DNA, die
a) keine für eine Transaminase codierende Nucleo- tidsequenz enthält oder b) eine für eine Transaminase codierende Nucleo- tidsequenz enthält, die nicht oder gegenüber natürlich vorkommenden Nukleotidsequenzen geringer expri iert wird.
Replizierbare DNA gemäß Anspruch 1, deren Nucleo- tidsequenz a) keine für das brnA-Gen (Transaminase) codierende Nukleotidsequenz enthält oder b) eine für das brnA-Gen (Transaminase) codierende Nukleotidsequenz enthält, die nicht oder gegenüber natürlich vorkommenden Nukleotidsequenzen geringer exprimiert wird.
Replizierbare DNA nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß diese im Fall b) i) eine Sequenz, dargestellt in Seq.-ID-Nr. 1, die für brnA codiert, umfaßt oder ii) eine Sequenz umfaßt, die der Sequenz (i) innerhalb des Bereichs der Degeneration des genetischen Codes entspricht; oder iii) eine Sequenz umfaßt, die mit einer zur Sequenz (i) oder (ii) komplemetären Sequenz hybridisiert, und gegebenenfalls iiii) funktionsneutrale Sinnmutationen in (i) umfaßt.
4. Replizierbare DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß zur Erzielung der geringeren Expression die Promotor- und Regulationsregion, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, mutiert ist.
5. Replizierbare DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß zur Erzielung der geringeren Expression, die Expression des brnA-Gens in den Mikroorganismen durch Verkürzung der Lebensdauer der entsprechenden m-RNA und/oder der Beschleunigung des Abbaus des zugehörigen Enzymproteins beschleunigt ist.
6 . Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet , daß sie eine Nukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 enthalten.
7. Plasmidvektor pK19mobsacBΔbrnA, gekennzeichnet durch die in Figur 2 wiedergegebene Restriktionskarte, hinterlegt als Corynebacterium glutamicum 13032ΔbrnA unter der Bezeichnung DSM 13971.
8. Verfahren zur fermentativen Herstellung von Pantothensaure, dadurch gekennzeichnet, daß für die Transaminase codierende Nukleotidsequenzen in Mikroorganismen deletiert werden oder gegenüber natürlich vorkommenden Sequenzen nicht oder geringer exprimiert werden und diese Mikroorganismen zur Fermentation eingesetzt werden.
9. Verf hren nach Anspruch 8 , dadurch gekennzeichnet, daß die für das brnA-Gen codierende Nukleotidsequenz in Mikroorganismen deletiert wird oder gegenüber natürlich vorkommenden Sequenzen geringer exprimiert wird und diese Mikroorganismen zur Fermentation einsetzt werden.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß zur Erzielung der geringeren Expression, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindende Promotor- und Regulationsregion mutiert wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß zur Erzielung der geringeren Expression die Expression des brnA-Gens in den Mikroorganismen durch eine Verkürzung der Lebensdauer der entsprechenden m-RNA durchgeführt wird und/oder der Abbau des zugehörigen Enzymproteins beschleunigt wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß man die DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 5, in Mikroorganismen repliziert und (über) exprimiert , die eine oder mehrere Metabolit- und/oder Antimeta- bolit-Resistenzmutationen aufweisen.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Plasmidvektor pJClbrnA, gekennzeichnet durch die in Figur 1 wiedergegebene Restriktions- karte, in Mikroorganismen mit einer inaktivierten Transaminase eingesetzt wird.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Corynebacterium glutamicum R127/12, hinterlegt unter der Bezeichnung DSM 13970, eingesetzt wird.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Komponente aus der Gruppe der Gene ilvBN, ilvC, ilvD, panB, panC und panD in Mikroorganismen gegenüber den in Wildstämmen vorkommenden entsprechenden Genen verstärkt werden, und diese Mikroorganismen zur Fermentation eingesetzt werden.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Erzielung der Verstärkung die Kopienzahl der Gene bzw. Nukleotidsequenzen durch Trans- formation von Mikroorganismen mit diesen Gene bzw. Nukleotidsequenzen tragenden Plasmidvektoren oder durch chromosomale Amplifikation erhöht.
17. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Erzielung der Verstärkung die sich stromaufwärts des Strukturgens befindende Promotor- und Regulationsregion mutiert.
18. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Erzielung der Verstärkung stromaufwärts der Strukturgene Expressionskassetten einbaut.
19. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man die Expression mindestens einer Komponente aus der Gruppe der Gene ilvBN, ilvC, ilvD, panB, panC und panD in den Mikroorganismen durch Verlängerung der Lebensdauer der entsprechenden m-RNA und/oder Verhinderung des Abbaus der zugehörigen Enzymproteine verbessert .
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mikroorganismen zur Verringerung der Expression des brnA-Gens bzw. zur Erzielung der Überexpression mindestens einer Komponente aus der Gruppe der Gene ilvBN, ilvC, ilvD, panB, panC und panD in geänderten Kulturmedien fermentiert und/oder die Fermentationsführung ändert .
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen einsetzt, in denen die Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet sind, die die Pantothenat- (Pantothensaure) -bildung verringern.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß man mit verschiedenen kompatiblen, mindestens eine Komonente aus der Gruppe der Gene ilvBN, ilvC, ilvD, panB, panC, und panD enthaltenden und das Gen brnA nicht enthaltenden Plasmidvektoren transformierte Mikroorganismen einsetzt.
23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen einsetzt, die mit einem Plasmidvektor pK19mobsacBΔbrnA transformiert sind.
24. Verfahren zur Herstellung von Pantothensaure, dadurch gekennzeichnet, daß man folgende Schritte durchführt :
a) Fermentation von Mikroorganismen gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, in denen das brnA-Gen deletiert oder geringer exprimiert wird und gegebenenfalls mindestens eine Komponente aus der Gruppe der Gene ilvBN, ilvC, ilvD, panB, panC und panD verstärkt wird, b) Anreicherung der Pantothensaure im Medium oder in den Zellen der Mikroorganismen, und
c) Isolieren der Pantothens ure.
25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die uberexprimierten Gene aus Mikroorganismen der Gattungen Corynebacterium oder Escherichia stammen.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe a) als Vorstufe ß-Alanin oder L-Valin zusetzt.
27. Verfahren gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen der Gattungen Escherichia oder Corynebacterium einsetzt.
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