WO2003016903A2 - Vorrichtung und verfahren zum nachweis eines analyten - Google Patents

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Definitions

  • the invention relates to a method for the detection of at least one analyte from a sample by an immunochemical reaction with a device consisting of several zones. Furthermore, the invention relates to a device for the detection of at least one analyte from one or more capillary-capable materials, on which at least one starting zone and an adjacent zone consisting of one or more fields in which or at least one immobilized reagent is arranged. The invention further relates to a reagent for performing the method according to one of claims 1 to 17 and an analysis kit according to claim 57. The invention also relates to the use of the device, the reagent and the analysis kit according to claims 58 to 60.
  • DE 19622503 AI describes a method for the detection of analytes on surfaces which have come into contact with body fluids.
  • This document describes a test strip made of one or more capillary-active sheet-like materials capable of chromatography in fluid contact with one another with an eluent application zone at one end and a target zone at the other end.
  • the capture reagent can either bind the analyte, a specific analyte binding partner or a labeled binding partner.
  • the binding partner can specifically bind either the analyte or the specific analyte binding partner or the capture reagent, the binding of the labeled binding partner leading to a detectable signal in the capture zone or in the target zone. This signal indicates the presence of the analyte.
  • a wiping element is separated from the test strip surface and a pressing device which eliminates contact between the wiping element and the test strip surface between the eluent application zone and the conjugate zone. With the wiping element, body fluids are absorbed from a body region. Direct markings, such as metal markings, in particular the gold marking, are preferred as markings for detection, because the test result can be read directly from the eye.
  • Antibodies and antibody fragments can be considered as binding partners for the analyte. With this method, absolute amounts of up to 10 ng analyte, in particular drugs on surfaces, can be detected.
  • a disadvantage of this disclosure is that low concentrations of analytes cannot be detected.
  • US Pat. No. 6,248,598 B1 describes a method which, on the one hand, for the production of saliva and, on the other hand, for the detection of at least one analyte therein without any additional external
  • the US B1 describes a method for the detection of an analyte with a device which fluidly connects a first part with absorbent material, which absorbs saliva in the mouth, to a second part and then enables a visual detection of analytes. light.
  • a ligand that specifically binds an analyte, an indicator consisting of an analyte with a visually detectable label, an area on which the presence or absence of the analyte is indicated and possibly a control area.
  • a holder in which a window for visual detection is located is described.
  • One end of the device is for 10 to
  • WO 00/208 62 AI describes a method and an apparatus for the in vitro detection of many different analytes, from serum, plasma, blood, saliva or urine of human or animal origin.
  • the detection system consists of a plastic device with an absorbent pad with an affinity membrane.
  • the device has specific regions on the membrane in which antigens are immobilized.
  • Each device has a quality control substance to check that the device is working properly.
  • the control material is usually human IgG.
  • antigen detection the control material is a specific antigen. Any area can be used as a control area in a multi-analyte detection system.
  • the device consists of a microporous membrane with a first and a second surface, a liquid flowing from one side to the other.
  • Membrane has a multiplicity of readable regions which are arranged spaced apart from one another over the entire membrane, an antigen, antibody or hapten being immobilized on each region. Furthermore, the device has a cover for the first side of the membrane with a recess for receiving liquids, whereby a region of the membrane is visible. Finally, the device consists of an absorbent
  • the object of the invention is therefore possibilities for the detection of low concentrations to provide different analytes. It is also a sub-object of the invention to increase the specificity for the detection of drugs and drug substitutes.
  • the object of the invention is achieved by the method according to the features in the characterizing part of claim 1.
  • the advantage of this method is that very low concentrations of an analyte are sufficient to be able to be detected using the method according to the invention.
  • This method therefore offers a highly sensitive method to detect analytes from a sample. Simple detection methods for the determination of analytes allow them to be carried out outside of laboratories, e.g. on the street, in police stations, in prisons, in factories or other workplaces, at home, practically anywhere. This detection method eliminates the need for costly laboratory analysis and thus enables cost savings.
  • Free biotin binding sites are then saturated with a biotin-labeled enzyme, eg alkaline phosphatase.
  • a biotin-labeled enzyme eg alkaline phosphatase.
  • the addition of chromogenic substrates causes a color mixture to precipitate, which enables the binding to be detected.
  • the biotin-binding proteins contain four biotin binding sites and the enzymes used also carry several biotin groups, complexes with many protein-enzyme-biotin molecules can form, which significantly increases the sensitivity of detection.
  • Alkaline phosphatase is used as a marker enzyme, since a sensitive, histochemical color reagent and signal amplifier system develops in conjunction with suitable substrates.
  • the enzyme ß-galactosidase cleaves natural and artificial ß-D-galactosides into galactose and the corresponding residues (mostly alcohol compounds).
  • unphysiological Substrates for the enzyme such as ONPG or X-gal, produce colored reaction products after hydrolysis and oxidation and thus allow visual and spectrophotometric detection.
  • an embodiment according to claim 4 is advantageous, wherein by separating the analyte in the many zones, a reaction with a dye component or its precursor as well as with a conjugated antibody can take place and these can then be detected in an analysis field.
  • Another advantage is that, regardless of the presence of an analyte in the sample, a marking in the zone of the control field can be detected in order to control the functionality of the analysis method.
  • a further advantage is the temporary immobilization of the reagents in the dye field and in the conjugate field, because this eliminates the need to add these reagents during the analysis, thus simplifying the process and preventing confusion of the reagents.
  • the arrangement of running fields enables the analytes to be freed from particulate contaminants during the passage of the capillary-capable material.
  • An embodiment according to claim 5 proves to be advantageous, according to which a multiplicity of analytes can be detected by this method. It has also proven to be advantageous that such a large number of analytes can be detected using the same method without having to adapt the method. Another advantage is that, due to the diversity of this method, no special training of the personnel to be carried out is required for the various analytes, and thus a large number of analytes can be evaluated by only one person. It has also proven to be advantageous that several analytes can be evaluated simultaneously using one method and on one device.
  • a further development of the method according to claim 10 is also advantageous, according to which the risk of contamination for the personnel who carries out the analysis can be minimized by the rapid detection of antibodies against infections. On the one hand, it can be decided by the detection of a viral infection that special caution should prevail for the further examination measures. On the other hand, due to the rapid analysis results, intensive treatment of supposedly infected people or even their quarantine can be dispensed with.
  • the method enables the detection of different hormones, e.g. of HCG, which is only detectable during pregnancy. This method also makes it easy to quickly prove pregnancy.
  • a further development of the method according to claim 12 has also proven to be advantageous, according to which, in the event of a conspicuous medical history, a first statement about the presence of tumor markers can be made quickly, and thus the time period until the result of the finding and thus the uncertainty for the patient is minimized.
  • the embodiment of the method according to claim 13 proves to be advantageous, wherein the correct treatment of the intoxication can be started immediately by detecting the toxin and, for example, the appropriate antidote can be administered immediately.
  • a further development according to claims 14, 15 and 16 is advantageous, according to which the analyte comes from a sample of any origin and can be used for the method.
  • a particular advantage of this method is that, despite the variety of samples, regardless of their origin, a reliable, reproducible result is always achieved. It has proven to be particularly advantageous that the method has a high tolerance limit for contamination and that the samples therefore do not have to be cleaned before the analysis.
  • the object of the invention is independently achieved by a device according to the features in the characterizing part of claim 18.
  • This device provides a very sensitive possibility for the detection of at least one analyte.
  • the simple structure of the device enables it to be operated and evaluated by chemically and medically untrained personnel, and the analyte can thus be detected independently of a specific location.
  • a further development according to claim 19 proves to be advantageous because it can prevent non-specific bindings and therefore only specific bindings can take place and can also be detected. It is also advantageous that during the detection no signals which result from unspecific binding influence the readability of the device.
  • the sensitivity of the device for detecting the analyte is increased.
  • the dye components and their precursors act as part of an amplifier system.
  • the attachment of a dye field enables only the analyte to be applied to the device and not the dye components to be added to the reagent first. This again simplifies the handling of the device.
  • Embodiments of the device according to one of claims 23 and 24 are also advantageous, the dye component or its precursors serving as an enhancer system and the sensitivity of the analysis thus being increased.
  • X-gal has the advantage over ONPG that the blue oxidigo dye formed as a reaction product after hydrolysis and oxidation is sparingly soluble and therefore does not diffuse.
  • Embodiments according to claims 25 and 26 also prove to be advantageous, according to which the addition of these substances results in better solubility of the dye components and their precursors and thus in turn improves the sensitivity of the analysis.
  • the refinements according to claim 30 also prove to be advantageous, the same analyte being arranged in the analysis field or a specific binding partner for the analyte to be detected and thus cross-reactions and false positive results can be excluded by unspecific binding.
  • An embodiment according to claim 31 is also advantageous in that a variety of analytes can be detected and the device can not only be used for the detection of a single analyte and production costs for the different designs of the devices can thereby be minimized. It also proves advantageous that the same method can be used for the detection of all analytes.
  • an embodiment according to claim 32 proves to be advantageous, according to which only a small amount of the analyte has to be applied to the device and thereby the costs for the material expenditure of the device are minimized.
  • the analyte can already be bound in the reagent and is detected in the analysis method by a specific binding partner for the binding partner of the analyte. This enables indirect detection of the analyte.
  • components of the dye system or their precursors can already be added to the reagent and, for example, this can shorten the running distance of the analyte on the device and thus minimize the size of the device overall.
  • the object of the invention is also achieved independently by an analysis kit according to the features in the characterizing part of claim 57.
  • the advantage of this is that all the necessary devices and reagents for carrying out the analysis are made available.
  • Another advantage is that the simple way of storing the analysis kit at room temperature makes it possible to store it regardless of the location.
  • the object of the invention is also achieved independently by using the device according to the features in the characterizing part of claim 58. It has been shown to be advantageous that the device provides a reliable means for analyzing at least one analyte in a sample.
  • the object of the invention is also achieved independently by the use of the reagent according to the features in the characterizing part of claim 59. It has proven to be advantageous that the use of the reagent provides an inexpensive means with enhancement potential.
  • the object of the invention is also achieved independently by using the analysis kit in accordance with the features in the characterizing part of claim 60. It proves to be advantageous that the analysis kit enables rapid and uncomplicated determination of the analyte regardless of the location.
  • Figure 1 shows a square device from the start zone and analysis field.
  • Figure 2 shows a square device from the start zone, zone and target zone.
  • 3 shows a quadrangular device consisting of the start zone, zone and target zone
  • 5 shows a round device comprising the start zone, zone and target zone
  • FIG. 6 shows a star-shaped device consisting of a starting zone and an analysis field
  • FIG. 7 shows a star-shaped device comprising the start zone, zone and target zone
  • FIG. 8 shows a hexagonal device consisting of a start zone and an analysis field
  • Fig. 9 shows a hexagonal device from the start zone, zone and target zone.
  • Fig. 1 shows a side view of a device 1 on a carrier material 2, wherein the at least one capillary material 3 by means of a connecting layer 4, such as. B. one Double adhesive film, is connected to the carrier material 2. It is also possible to apply the capillary-capable material to a one-sided adhesive carrier material (laminating). A starting zone 5 and a further zone 6, which is formed from at least one capillary-capable material 3, are arranged on the device 1.
  • FIG. 2 shows a further embodiment of the device 1, it being noted at this point that the invention is not restricted to the specially shown embodiment variants of the device, but rather that various combinations of the individual embodiment variants with one another are possible and this variation possibility is due to this the teaching of technical action through objective invention lies in the ability of the specialist working in this technical field.
  • the scope of protection also includes all conceivable design variants which are possible by combining individual details of the design variant illustrated and described.
  • FIG. 2 shows a side view of a device 1 on a carrier material 2, the
  • Carrier material 2 is connected to at least one capillary-capable material 3 via a connecting layer 4.
  • a starting zone 5, a zone 6 and a target zone 7 are arranged on the capillary-capable material 3.
  • Zone 6 consists of several fields, e.g. a conjugate field 8 with specific binding partners to which at least one substance is conjugated, at least one running field 9, an analysis field 10 and / or control field 11 and a dye id 12.
  • FIG. 3 shows a square device 1, with several analysis fields 10 being arranged in zone 6. A different analyte 13 can be bound to each of these analysis fields 10 and thus the device 1 for the detection of several different analytes
  • start zone 5 can also be arranged centrally on the device 1, the analysis fields 10 being able to be located on all sides of the start zone 5.
  • a plurality of target zones 7 can also be arranged on the device 1.
  • FIG. 4 shows a round embodiment of the device 1 as described in FIG. 1. Adjacent to the starting zone 5 there is another zone 6 in which the detection of the at least one analyte 13 takes place.
  • Fig. 5 shows a round embodiment of the device 1, being adjacent to the Starting zone 5 are a conjugate field 8, a dye id 12, several running fields 9, at least one analysis field 10 and / or a control field 11 and a target zone 7.
  • FIG. 6 and 7 show star-shaped designs of the device 1, the device 1 in FIG. 6 being formed only by a start zone 5 and an adjacent zone 6 and in FIG. 7 comprising a start zone 5, a target zone 7 and a zone 6 from a conjugate field 8, a dye id 12, several running fields 9, at least one analysis field 10 and / or a control field 11 are shown.
  • the different zones 6 are arranged in a circle on the device 1.
  • FIG. 8 and 9 show octagonal embodiments of the device 1, the device 1 in FIG. 8 being formed only by a start zone 5 and an adjacent zone 6 and in FIG. 9 comprising a start zone 5, a target zone 7 and a zone 6 from a conjugate field 8, a dye id 12, several running fields 9, at least one analysis field 10 and / or a control field 11 are shown.
  • the different zones 6 or fields can have different forms, e.g. linear, circular, triangular, quadrangular, hexagonal, pentagonal, heptagonal, octagonal, trapezoidal, rhomboid, etc., can be arranged on the device 1.
  • the capillary-capable material which constitutes a filter, consists of cellulose and / or its derivatives, of organic polymers and their derivatives, in particular of materials that adsorb little protein on their surface, such as e.g. Glass fiber, ceramic, polytetrafluoroethylene (PTFE), nylon, polyvinylidene fluoride (PVDF), materials based on silicon, materials of biological origin, acetates or from mixtures or modifications thereof
  • the filters are of a pore size selected from a range with an upper limit of 50 ⁇ m, preferably 40 ⁇ m, in particular 35 ⁇ m and a lower limit of 0.20 ⁇ m, preferably 5 ⁇ m and in particular 10 ⁇ m. Filters with a pore size have also been selected particularly advantageously from a range with an upper limit of 30 ⁇ m, preferably 25 ⁇ m, in particular 20 ⁇ m and a lower limit of 12 ⁇ m, preferably 15 ⁇ m, in particular 17 ⁇ m. Pre-filters with an undefined pore size can also be used.
  • the capillary-capable material can be formed by a filter with an arbitrarily defined pore size.
  • the capillary-capable material 3 of the device 1 has a thickness selected from an area with a lower limit of 0.05 mm, preferably 0.08 mm, in particular 0.15 mm and an upper limit of 2 mm, preferably 1.5 mm. in particular 1 mm.
  • a thickness has been selected from a range with a lower limit of 0.1 mm, preferably 0.15 mm, in particular 0.2 mm and an upper limit of 0.9 mm, preferably 0.8 mm, in particular 0, 5 mm.
  • the thickness of the capillary material 3 can vary in the different zones 6 or the different fields; ie that the device 1 does not have to have a uniform thickness over its entire extent.
  • the different zones 6 of the device 1 can consist of the same capillary material 3 or of different capillary materials 3. As shown in FIG. 2, the device 1 in the start and target zone 7 can be made of a different material than in the zone 6 consisting of fields. The thickness and the pore size of the capillary material 3 can also be different in the different zones 6.
  • the capillary material is treated with solutions containing proteins such as BSA, milk powder, casein, gelatin, fat-free milk powder, calf serum, etc. and / or with commercial blocking reagents, e.g. Blotto or Superblock (from Pierce) in a concentration of 0.1-10 mg / ml and / or detergents, e.g. Tween, Triton, Nonidet P-40, Chaps, etc. in a concentration of 0.005 to
  • a predeterminable amount of the at least one analyte 13 is selected in a concentration from a range with a lower limit of 0.5 ng / ml, in particular 1 ng / ml, preferably 2 ng / ml, and an upper limit of 5 mg / ml, in particular
  • the at least one analyte 13 can be detected both directly and indirectly, for example by the analyte 13 itself, a specific analyte binding partner or a labeled binding partner. Indirect detection is carried out by binding analyte 13 to a first specific binding partner, eg primary antibody. In the analysis field either this or the analyte (at another location) is then recognized and bound by a second specific binding partner, for example secondary antibody, which is immobilized in the analysis field 10.
  • a first specific binding partner eg primary antibody
  • a second specific binding partner for example secondary antibody
  • the presence of the analyte in the analysis field 10 is finally linked to a further specific binding partner, which is conjugated to a substance, which either binds the analyte itself (at another location) or the analyte to the first specific binding partner or recognizes the second specific binding partner.
  • At least one analyte 13 is immobilized in the analysis field 10.
  • an analyte-specific binding partner can also be immobilized in analysis field 10.
  • the specific binding partner which is conjugated with a substance must be specific for the analyte and bind it to another location.
  • a large number of different analytes 13 can be detected.
  • the at least one analyte 13 can be selected from a group comprising drugs or drug substitutes including cannabis products, e.g. Marijuana, hashish and / or cannabinol, cocaine, e.g. Benzoylecgonine, crack and / or crystal, opiates, such as e.g. Morphine,
  • MDA dimethoxybromamphetamine
  • methamphetamines such as e.g. ecstasy, MDMA
  • phencyclidine angel dust
  • ⁇ -hydroxybutyric acid liquid ec
  • Doping agents from a group comprising anabolics such as testosterone and its derivatives, somatotropin, ephedrine derivatives, analeptics, such as strychnine, amphetamine derivatives, analgesics, antitussives, agents for increasing the oxygen transport capacity and the oxygen availability for the skeletal muscles, such as eg erythropoietin and / or diuretics, drugs, analgesics or psychopharmaceuticals from a group comprising, neuroleptics such as phenothiazine, butyrophenones and / or thioxanthenes, antidepressants such as MAO (monoamine oxidase) inhibitors, imipramine, desipramine, amitriptyline, etc., tranquilizers, such as.
  • anabolics such as testosterone and its derivatives, somatotropin, ephedrine derivatives, analeptics, such as strychnine, amphetamine derivatives, an
  • B. benzodiazepines diazepam
  • barbiturates and or psychoanaleptics
  • stimulants such as phenylethylamine, antiepileptics and / or hypnotics
  • antibodies formed as a reaction to viral, viroid, bacterial, mycotic, parasitic or prion-based infections and / or formed as a result of immunizations (vaccination in humans or animals or polyclonal antibody production in animals) and / or formed as a result of autoimmune diseases or allergic reactions
  • hormones such as, for example, HCG (human chorion gonadotropin), proteins as tumor markers from a group comprising squamous cell carcinoma antigen (SCC), thyroglobin (Tg), steroid hormone receptors, prostate-specific antigen (PSA), neuron-specific enolase (NSE), carcinoembryonic antigen (CEA), alpha-fetoprotein (AFP), CYFRA 21-1, CA 125, 19-9,
  • allergens such as. e.g. pollen, dust mite droppings, histamine, etc.
  • the detection of prions from the nervous system of various mammals as well as from feed or food is of increasing importance in order to prevent the spread of Creutzfeldt-Jakob disease.
  • Markers or species-specific proteins which are used in genetic engineering to identify genetically modified foods, seeds, etc. can also be detected as analyte 13.
  • Various antibody (sub) types can also be detected.
  • concentration of the at least one analyte 13 in the dilution series decreases with a factor selected from a range with a lower limit of 1, in particular 2, preferably 3 and an upper limit of 100, in particular 10, preferably with a factor 5.
  • the analyte 13 can be obtained from a sample of biological origin, such as body fluids from humans and animals, e.g. Blood, plasma, serum, urine, saliva, sweat, sperm, etc. and / or of vegetable origin, e.g. Leaf, fruit, seeds, etc. and / or microbiological
  • the analyte 13 can also be detected from the soil or from water.
  • the analyte 13 has to be concentrated, e.g. by sucking in larger air volumes by means of a pump, it being possible for the analyte 13 to be enriched directly on the material of the starting zone 5.
  • One or more dye components or their precursors are temporarily immobilized in the dye id 12.
  • the dye components do not necessarily have to be located in a zone 6, but can also be divided into several zones 6, such as, for example, the start zone 5, the dye id 12, the conjugate field 8 and the running field 9.
  • the dye components are in undissolved form in front.
  • the dye components or their precursors used are: tyramine and its derivatives, X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-D-galactoside), S-gal (3,4 cyclohexenoesculetin-ß-D- Galactopyranoside), ONPG (o-nitrophenyl-ß-D-galactopyranoside), CPRG (chlorophenol red-ß-D-galactopyranoside), bluogal (5-bromo-3-indolyl-ß-D-galactoside), MUGal (4-methylumbelüferyl -beta-D-galacto- pyranoside), NBT (nitroblue tetrazolium chloride), BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate), PNPP (p-nitrophenyl phosphate), OPD (o-phenylenediamine), ABTS (2,2'-azin
  • conjugate field 8 there are in particular specific binding partners such as e.g. Antibodies against analyte 13, which are combined with a catalyst, e.g. an organic or inorganic catalyst or enzymes or proteins, e.g. ⁇ -galactosidase, peroxidase, alkaline phosphatase, streptavidin / avidin, protein A or similar molecules capable of high-affinity specific bonds, etc., are conjugated.
  • a catalyst e.g. an organic or inorganic catalyst or enzymes or proteins, e.g. ⁇ -galactosidase, peroxidase, alkaline phosphatase, streptavidin / avidin, protein A or similar molecules capable of high-affinity specific bonds, etc.
  • a catalyst e.g. an organic or inorganic catalyst or enzymes or proteins, e.g. ⁇ -galactosidase, peroxidase, alkaline phosphatase, streptavidin /
  • the concentration of the specific binding partner to which the substance is conjugated is selected from a range with a lower limit of 0.5 ng / ml, in particular 1 ng / ml, preferably 2 ng / ml, and an upper limit of 5 mg / ml, in particular 2 mg / ml, preferably 1 mg / ml. Concentrations have also been selected particularly advantageously from a range with a lower limit of 0.1 mg / ml, preferably 0.2 mg / ml, in particular 0.3 mg / ml, and an upper limit of 2 mg / ml, preferably 1 mg / ml, especially 0.5 mg / ml.
  • an immobilized specific binding partner for example a Antibodies for at least one substance, such as, for example, ⁇ -galactosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, streptavidin / avidin, protein A or similar molecules capable of high-affinity specific bonds, etc., in a concentration selected from a range with a lower limit of 0.5 ng / ml, in particular 1 ng / ml, preferably 2 ng / ml, and an upper limit of 5 mg / ml, in particular 3 mg / ml, preferably 1 mg / ml.
  • a concentration selected from a range with a lower limit of 0.5 ng / ml, in particular 1 ng / ml, preferably 2 ng / ml, and an upper limit of 5 mg / ml, in particular 3 mg / ml, preferably 1 mg / ml.
  • a small amount of a sample with an absorbent material such as e.g. collected a cotton swab.
  • the analyte 13 adhering to the absorbent material is taken up in a reagent, in particular an organic reagent.
  • a reagent in particular an organic reagent.
  • Three to seven drops of this reagent provided with analyte 13 are applied to the device 1.
  • the reagent with the analyte 13 migrates in the capillary-capable material 3 of the device 1 at a speed of 1 to 12 cm / minute from the starting zone 5, for example through the zone 6 consisting of at least one conjugate field 8, dye id 12,
  • the first marking resulting from the binding of the analyte-specific and / or substance-conjugated analyte-specific binding partner in the analysis field 10 results and the second label results from the binding of the immobilized binding partner specifically for the substance, such as ⁇ -galactosidase in reaction with a dye component or its precursor.
  • the analyte-specific binding partner in analysis field 10 and the analyte-specific binding partner to which at least one substance is conjugated reacts with the passing dye component or its precursors in such a way that the dye or dye complex formed is either insoluble or poorly soluble on Analysis field 10 remains and / or can be detected by antibodies against the dye complex formed.
  • the specific binding partner, to which at least one substance is conjugated can carry several binding sites for dyes or dye complex molecules that produce a clearly visible label.
  • analyte 13 If a sufficient amount of the analyte 13 is present, it binds to the analyte-specific binding partners which are conjugated with a substance, and these binding partners can therefore no longer bind to the immobilized analyte 13 in the analysis field 10 and run into the target zone 7 without formation of a visible marking of the device 1.
  • the substance thus bound also react the passing dye components or their precursors in such a way that the dye formed remains complex insoluble or poorly soluble in place and / or by an antibody against the dye complex formed, which is immobilized in the control field 11, with the
  • the detection of an analyte 13 with the enzyme ß-galactosidase as an enhancer system is carried out by the cleavage of natural or artificial ß-D-galactosides in galactose and the corresponding residual compounds.
  • Unphysiological substrates for the enzyme such as ONPG or X-gal, give colored reaction products after hydrolysis and oxidation and allow visual and spectrophotometric detection.
  • streptavidin and avidin proteins with multiple Binding sites for biotin are used.
  • a specific binding partner can be labeled with biotin.
  • Proteins such as streptavidin and avidin bind to one of their four binding sites in a highly specific manner to ' biotin. Free biotin binding sites are then saturated with biofin-labeled enzyme, eg alkaline phosphatase. Due to the addition of chromogenic substrates, a color mixture precipitates, so that the binding can be demonstrated.
  • biofin-labeled enzyme eg alkaline phosphatase. Due to the addition of chromogenic substrates, a color mixture precipitates, so that the binding can be demonstrated.
  • biotin-binding proteins contain four biotin binding sites and the enzymes used can also carry several biotin groups, complexes can form with many protein-enzyme-biotin molecules, which significantly increases the sensitivity of detection.
  • Alkaline phosphatase is used as a marker enzyme, since a sensitive, histochemical one is found in connection with suitable substrates
  • Color reagent and signal amplifier system can be developed.
  • BCEP is usually used together with nitro blue tetrazolium (NBT) as a color enhancer.
  • the enzyme peroxidase (HRP) with derivatized tyramine can be used as a further alternative amplification system (Super-CARD, Catalytic deposition of derivatized tyramine, Bhattacharya, R., Bhattacharya, D., and Dhar, TK (1999) Journal of Immunological Method 227, 31-39).
  • HRP enzyme peroxidase
  • the specific binding partner is coupled to the enzyme peroxidase (HRP) and catalyzes the covalent binding of the derivatized tyramine to the analysis field (specifically to specially modified proteins for this purpose) using H2O2 (which is present in the reagent or is formed directly by a chemical reaction).
  • p-OH-PPA-casein p-OH-PPA-gelatin or p-OH-PPA-BSA
  • p-OH-PPA 3- (p-hydroxyphenyl) propionic acid) which are immobilized on the analysis field).
  • a dye gold particles (NanoGold) or a catalyst is considered.
  • a histochemical color reagent gives a signal that is amplified many times over.
  • the reagent used to take up the sample consists of monohydric alcohol with 1 to 5 carbon atoms, ketones with 3 to 8 carbon atoms, polyhydric alcohols, especially ethylene glycol and polyethylene glycol.
  • concentrations of these chemical compounds are from a range with a lower limit of 0.1%, in particular 5%, preferably 10%, and an upper limit of 40%, in particular 30%, preferably 20% selected.
  • the reagent can additionally be a detergent, in particular (octylphenoxyl) polyethoxyethanol, alkylphenol polyglycol ether, Tween 20, sodium deoxycholate, Nonidet P-40 (Igepal CA-630), Triton X-100, cholic acid, deoxycholic acid and / or Zwittergent® in a concentration selected from a range with a lower limit of 0.001%, in particular 0.005%, preferably 0.01%, and an upper limit of 1%, in particular 0.5%, preferably 0.2%, as a solubilizer.
  • a detergent in particular (octylphenoxyl) polyethoxyethanol, alkylphenol polyglycol ether, Tween 20, sodium deoxycholate, Nonidet P-40 (Igepal CA-630), Triton X-100, cholic acid, deoxycholic acid and / or Zwittergent® in a concentration selected from a range with a lower limit of 0.001%, in particular 0.00
  • a buffer can also be added to the reagent, which keeps the reagent constant in a pH range.
  • Buffer solutions such as e.g. Citrate buffer, acetate buffer, maleate buffer, phosphate buffer, collidine buffer, triethanolamine-HCl-EDTA buffer, tris buffer, ammediol buffer, glycine buffer, diethanolamine buffer or tris-boric acid-EDTA buffer, or buffer according to Good, N.E. et al. (1966) Biochemistry 5, 467.
  • the concentration of the buffer solutions is in one percent by weight
  • the buffer solution has a pH value selected from a range with a lower limit of 5.5, in particular 6.0, preferably 6.5, and an upper limit of 9.5, in particular 9.0, preferably 8.5. Buffer solutions with a pH
  • At least one dye component or its precursor can be added to the reagent, the dye components being selected from a group comprising tyramine and its derivatives, X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ⁇ -D- Galactoside), S-Gal (3,4 cyclohexenoesculetin-ß-D-galactopyranoside), ONPG (o-nitrophenyl-ß-D-galactopyranoside), CPRG (chlorophenol red-ß-D-galactopyranoside), Bluogal (5- Bromine-3-indolyl- ⁇ -D-galactoside), MUGal (4-methylumbelliferyl- ⁇ -D-galactopyranoside), NBT (Nitroblue Tetrazolium chloride), BCE?
  • X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ⁇ -D- Galactoside)
  • S-Gal (3,4
  • LuciGLOTM LuciGLOTM, DuoLuXTM, Lumigen PS-3, chemiluminescent HRP (horseradishperoxidase) substrate, 2 Component System from BioFXTM, and / or Lumi-Gal 530 and / or fluorescent dyes, e.g. 3-carboxyumbelliferyl- ⁇ -D-galactopyranoside (CUG) and / or MUP (4-methylumbelliferyl phosphate).
  • concentration of the dye components is selected from a range with a lower limit of 1 ⁇ M, in particular 10 ⁇ M, preferably 50 ⁇ M, and an upper limit of 300 mM, in particular 150 mM, preferably 100 mM.
  • the dye components and / or their precursors are dissolved in the reagent and are dissolved there by adding the components of the reagent, BSA, maltodextrin, milk powder, calf serum, casein and / or gelatin, or are transported via the device 1 by the capillary action ,
  • sodium salts, potassium salts, phosphate salts, magnesium and / or manganese salts, BSA, maltodextrin (maltrin) or milk powder in a concentration from a range with a lower limit of 0.001%, in particular
  • 0.1%, preferably 1%, and an upper limit of 30%, in particular 20%, preferably 10%, can be added.
  • a preservative in particular sodium azide, sodium benzoate, sorbic acid, pentachlorophenol, sorbate and / or preservative based on mercury, can be added to the reagent in a concentration from a range with a lower limit of 0.01%, in particular 0.05%, preferably 0.1%, and an upper limit of 5%, in particular 3%, preferably 1%, in order to extend the shelf life of the reagent.
  • the dye components and / or their precursors are in the reagent or partially in the reagent or are completely or partially in the dye id 12 or completely or partially in the starting zone 5 of the device 1 in undissolved form.
  • the analysis kit comprises a device 1 for detecting at least one analyte 13, the reagent an absorbent substance, such as a cotton swab or the like.
  • the analysis kit also contain other aids, such as gloves, stopwatch, pipettes, etc.
  • the start 5 and finish zone 7 are made of cellulose absorbent paper (Pall Corporation, type 165 for the start zone 5 (BSP165PK) and type 197 for the target zone 7 (BSP197PK)).
  • the format of start 5 and finish zone 7 is 25 x 80 mm.
  • the filter paper is used without further impregnation to produce the device 1.
  • the dye id 12 is made from glass fiber microfilter type GF / D (Whatman).
  • the format of the dye field 12 is 5 x 80 mm and is evenly charged with 80 ⁇ l of the dye solution. This is followed by drying at 20 ° C in the absence of light.
  • the dye solution consists of: X-Gal (100 mM), NBT (50 mM), Phenazine Methosulfate (1 mM), BSA (4%), Maltrin (1) in PBS (5 mM KH 2 PO 4 , 15 mM Na 2 HPO 4 , 120 mM NaCl, 2.3 mM KC1, 2 mM MgCl 2 , 0.05% NaN 3 , 5% ethanol, 0.1% Triton X-100).
  • the starting reagents are manufactured by SIGMA-Aldrich.
  • the conjugate field 8 consists of blocked Accuwick® membrane (Pall. AW 14-20-10).
  • the membrane is blocked with 1% BSA in PBS solution for 1 hour at room temperature, then drying at 20 ° C.
  • the format is again 5 x 80 mm. 80 ⁇ l of the antibody solution are pipetted on evenly and then drying is carried out at 20 ° C.
  • the antibody solution consists of: primary monoclonal antibodies (host mouse) against benzodiazepines (25 nM), (Fitzgerald, cat.
  • the strips are placed in a 1% BSA-containing PBS solution (5 mM KH 2 PO 4 , 15 mM Na 2 HPO 4 , 120 mM NaCl, 2.3 mM KC1, 2 mM MgCl 2 , 0.05 % NaN 3 , 0.1% Titron X-100) incubated for 30 minutes at room temperature with stirring.
  • a 1% BSA-containing PBS solution 5 mM KH 2 PO 4 , 15 mM Na 2 HPO 4 , 120 mM NaCl, 2.3 mM KC1, 2 mM MgCl 2 , 0.05 % NaN 3 , 0.1% Titron X-100
  • a BS A-benzodiazepine conjugate (from Fitzgerald) is immobilized in the test field before binding sites are blocked.
  • the cellulose acetate filter (AcetatePlus) is incubated in 100 mM sodium periodate (SIGMA-Aldrich) for 20 min, then washed with H2O and with a 0.5 ⁇ M BSA-benzodiazepine solution in 0.1 M borate buffer (pH 9.0 ) incubated for 10 minutes. Then 4 mg sodium cyanoborohydride (SIGMA-Aldrich) are added per ml and incubated for 2 h at room temperature. Unbound BSA benzodiazepine is washed away using H2O.
  • control field 11 a specific polyclonal antibody against the enzyme ⁇ -galactosidase (Fitzgerald, host: Rabbit) is immobilized before the binding sites are blocked. 0.25 ⁇ M specific polyclonal antibody is immobilized using the same method as in the test field.
  • the reagent used, in which the sample is taken up consists of PBS (5 mM
  • the starting zone 5, the fields of zone 6 and the target zone 7 are cut according to the specifications described and by means of double-sided adhesive film (from Tesa AG)
  • Carrier films Xeroperm (Rank Xerox Limited) attached. Of these, strips of 4 mm are cut with a roll cutter. The strips are stored at room temperature in the absence of light and moisture.
  • the start 5 and finish zone 7 are made of cellulose absorbent paper (Pall Corporation, type 165 for the application cushion (BSP165PK) and type 197 for the absorption cushion (BSP197PK)) manufactured. Strips of 25 x 80 mm are cut to size, which are used to produce the device 1 without further impregnation or pretreatment.
  • BSP165PK type 165 for the application cushion
  • BSP197PK type 197 for the absorption cushion
  • Dye 12 is made from 'Glass Fiber Media' (Pall, A / D Glass). Strips in the format of 5 x 80 mm are cut and evenly charged with 80 ⁇ l of the dye solution. The drying is then carried out at 20 ° C in the absence of light.
  • the dye solution consists of: X-Gal (100 mM), NBT (50 mM), phenazine methosulfate (1 mM), BSA (4%), maltrine (1%) in PBS (5 mM KH 2 PO 4 , 15 mM Na 2 HPO 4 , 120 mM NaCl, 2.3 mM KC1, 2 mM MgCl 2 , 0.05% NaN 3 , 5% ethanol, 0.1% Triton X-100) (all solutions are from SIGMA -Aldrich).
  • the running field 9, analysis field 10 and control field 11 consist of a 5 ⁇ m Immunodyne® ABC membrane in the format 20 x 80 mm (Pall., BC500H5R).
  • a 0.5 ⁇ M testosterone-3-CMO-BSA solution (from Fitzgerald, 80-IT49) is placed on the device 1 at the location of the analysis field 10 and a 0.25 ⁇ M biotin-BSA at the location of the control field 11 solution
  • Biotinylated anti-mouse IgG antibodies (host: Pferd, Vector Laboratories: BA-2080) and 100 nM of an avidin-beta-galactosidase conjugate (SIGMA-Aldrich) applied directly to the blocked Immunodyne® ABC membrane between start zone 5 and analysis field 10.
  • SIGMA-Aldrich an avidin-beta-galactosidase conjugate
  • the reagent used, in which the sample is taken up consists of PBS (5 mM
  • Carrier material (film Xeroperm type 003R96094 from Rank Xerox Limited) attached. Of these, strips of 4 mm are cut with a roll cutter. The strips are stored at room temperature in the absence of light and moisture.
  • FIGS. 1 to 9 For the sake of order, it should finally be pointed out that, for a better understanding of the structure of FIGS. 1 to 9, these or their components have been partially shown to scale and / or enlarged and / or reduced.
  • FIGS. 1 to 9 can form the subject of independent solutions according to the invention.
  • the relevant tasks and solutions according to the invention can be found in the detailed descriptions of these figures.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren zum Nachweis zumindest eines Analyten aus einer Probe durch eine immunochemische Reaktion mit einer Vorrichtung bestehend aus mehreren Zonen. Der zumindest eine Analyt wird in einem Reagens, insbesondere einem organischen Reagens, auf eine Startzone aufgebracht und läuft durch Kapillarkräfte in zumindest eine weitere Zone mit einem oder mehreren Feldern, wobei in einem Feld zumindest ein spezifischer Bindungspartner, an welchen zumindest eine Substanz Konjugiert ist, temporär immobilisiert ist.

Description

Vorrichtung und Verfahren zum Nachweis eines Analyten
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis zumindest eines Analyten aus einer Probe durch eine immunochemische Reaktion mit einer Vorrichtung bestehend aus mehreren Zonen. Weiters betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zum Nachweis zumindest eines Analyten aus einem oder mehreren kapillarfähiges Materialien, auf denen zumindest eine Startzone und eine angrenzende Zone bestehend aus einem oder mehreren Feldern in dem oder denen zumindest ein immobilisiertes Reagens angeordnet ist. Des weiteren betrifft die Erfindung ein Reagens zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 17 und einen Analysekit nach Anspruch 57. Die Erfindung betrifft ebenso die Verwendung der Vorrichtung, des Reagens sowie des Analysekits entsprechend den Ansprüchen 58 bis 60.
Durch den zusehends größer werdenden Mißbrauch von Arzneimitteln und Drogen besteht immer mehr die Notwendigkeit diese im Menschen nachzuweisen um eine Beeinträchtigung z.B. seiner Reaktionsfähigkeit während der Arbeitszeit oder im Straßenverkehr ausschließen zu können. Die Bestimmung und Quantifizierung von Analyten, insbesondere von illegalen Substanzen, in biologischen Proben, wie z.B. Blut und Urin, ist eine nützliche analytische Methode um den Mißbrauch von Drogen zu verifizieren. Zur Zeit ist es üblich, Drogen bzw. Drogenderivate im Blut, Serum, Plasma bzw. im Urin nachzuweisen. Durch die aufwendige Probengewinnung, wie z.B. von Blut, welches nur von medizinischem Fachpersonal gewonnen werden darf, ist der Nachweis nur in Speziallabors möglich und somit mit einem großen Aufwand verbunden. Durch die aufwendigen Analyseverfahren kommt es auch häufig zu großen Zeitverzögerungen bis ein endgültiges Ergebnis vorliegt.
Der Nachweis von illegalen Substanzen aus dem Urin bietet eine Alternative. Allerdings korrespondieren die nachgewiesenen Mengen von Drogen bzw. Drogenersatzstoffen aus positiven Urintests nicht eindeutig mit jenen Konzentration, welche im Blut nachgewiesen werden, da diese Stoffe teilweise noch Tage nach deren Konsum im Urin nachweisbar sind, aber nicht mehr im Blut vorhanden sind und daher zum Zeitpunkt der Urinabgabe keine drogenspezifi- sehen Beeinträchtigung des Probanden mehr vorliegt.
Zur Bestimmung des gegenwärtigen Zustande einer Person sind also nur Analysen, welche die Drogenkonzentrationen aus dem Blut bestimmen zweckdienlich. Allerdings korreliert die Konzentration von illegalen Substanzen im Blut sehr gut mit jener des Speichels. Zum Nach- weis von Drogen bzw. Drogenersatzstoffen aus dem Speichel müssen allerdings sehr sensitive Tests verwendet werden, weil im Speichel teilweise nur geringere Konzentrationen dieser Stoffe als im Blut vorhanden sind. Zielführend ist es daher eine Analyse anzuführen, welche den Nachweis von illegalen Substanzen aus dem Speichel ermöglicht.
In der DE 19622503 AI wird ein Verfahren zum Nachweis von Analyten auf Oberflächen, die mit Körperflüssigkeiten in Berührung gekommen sind, beschrieben. In diesem Dokument wird ein Teststreifen aus einem oder mehreren kapillaraktiven chromatographiefähigen flä- chenförmigen Materialien in Fluidkontakt zueinander mit einer Elutionsmittelaufgabezone an einem Ende und einer Zielzone am anderen Ende beschrieben. Zwischen der Elutionsmittel- aufgabezone und der Zielzone befindet sich eine Abfangzone, in der ein Abfangreagens immobilisiert ist. Das Abfangreagens kann entweder den Analyten, einen spezifischen Analyt- bindungspartner oder einen markierten Bindungspartner binden. Zwischen der Elutionsmittelaufgabezone und der Abfangzone befindet sich noch eine Konjugatzone, die einen wanderungsfähigen markierten Bindungspartner enthält. Der Bindungspartner kann entweder den Analyten oder den spezifischen Analytbindungspartner oder das Abfangreagens spezifisch binden, wobei die Bindung des markierten Bindungspartners zu einem detekierbaren Signal in der Abfangzone oder in der Zielzone führt. Dieses Signal zeigt die Anwesenheit des Analyten an. Weiters wird ein Wischelement separat zur Teststreifenoberfläche und eine Andrückvorrichtung, die einen Kontakt zwischen dem Wischelement mit der Teststreifenoberfläche zwi- sehen Elutionsmittelauftragszone und Konjugatzone eliminiert. Mit dem Wischelement werden Körperflüssigkeiten von einer Körperregion aufgenommen. Als Markierungen zur Detek- tion kommen bevorzugt Direktmarkierungen, wie Metallmarkierungen, insbesondere die Goldmarkierung in Frage, weil direkt mit dem Auge das Testergebnis abgelesen werden kann. Als Bindungspartner für den Analyten kommen Antikörper und Antikörperfragmente in Be- tracht. Mit diesem Verfahren können Absolutmengen von bis zu 10 ng Analyt, insbesondere Drogen auf Oberflächen, nachgewiesen werden. Nachteilig an dieser Offenbarung ist, daß geringe Konzentrationen von Analyten nicht nachgewiesen werden können.
In der US 6 248 598 Bl wird eine Methode, welche einerseits zur Gewinnung von Speichel und andererseits zur Detektion von mindestens einem Analyten darin ohne zusätzlich externe
Reagenzien zufügen zu müssen, beschrieben. Durch die Bestimmung von Drogen aus dem Speichel kann auch ein kurzfristiger Konsum dieser nachgewiesen werden. Die US Bl beschreibt eine Methode zur Detektion eines Analyten mit einer Vorrichtung die einen ersten Teil mit absorbierendem Material, der Speichel im Mund absorbiert, mit einem zweiten Teil in fluide Verbindung bringt und anschließend eine visuelle Detektion von Analyten ermög- licht. Auf diesem zweiten Teil ist ein Ligand der spezifisch einen Analyten bindet, ein Indikator, der aus einem Analyten mit einer visuell detektierbaren Markierung besteht, ein Bereich auf dem die Gegenwart oder Abwesenheit des Analyten angezeigt wird und eventuell ein Kontrollbereich angeordnet. Weiters ist eine Halterung, in welcher sich ein Fenster zur visuellen Detektion befindet, beschrieben. Das eine Ende der Vorrichtung wird für 10 bis
120 sec. in den Mund zur Anreicherung von Speichel gegeben, wieder entfernt und innerhalb von 1 bis 60 min. nach der Speichelgewinnung kann die Gegenwart bzw. Abwesenheit des Analyten visuell angezeigt werden.
Die WO 00/208 62 AI beschreibt ein Verfahren und einen Apparat zur in vitro Detektion von vielen verschiedenen Analyten, aus Serum, Plasma, Blut, Speichel oder Urin menschlichen oder tierischen Ursprungs. Das Detektionssystem besteht aus einer Plastikvorrichtung mit einem absorbierenden Kissen mit einer Affinitätsmembran. Die Vorrichtung hat spezifische Regionen auf der Membran, in welcher Antigene immobilisiert sind. Jede Vorrichtung besitzt eine Kontrollsubstanz zur Qualitätskontrolle, um zu überprüfen, ob die Vorrichtung korrekt funktioniert. Im Falle der Antikörperdetektion ist das Kontrollmaterial normalerweise humanes IgG. Im Falle von Antigendetektionen ist das Kontrollmaterial ein spezifisches Antigen. In einem Multianalytdetektionssystem kann jeder beliebige Bereiche als Kontrollbereich verwendet werden. Die Vorrichtung besteht aus einer mikroporösen Membran mit einer ersten und einer zweiten Oberfläche, wobei eine Flüssigkeit von einer Seite zur anderen fließt. Die
Membran weist eine Vielzahl von lesbaren Bereichen, die voneinander beabstandet über die gesamte Membran angeordnet sind, wobei auf jeden Bereich ein Antigen, Antikörper oder Hapten immobilisiert ist, auf. Weiters hat die Vorrichtung eine Abdeckung für die erste Seite der Membran mit einer Vertiefung für die Aufnahme von Flüssigkeiten, wodurch ein Bereich der Membran sichtbar wird. Zuletzt besteht die Vorrichtung noch aus einem absorbierenden
Material, welches in Kontakt mit der zweiten Seite der Membran steht, für die Aufnahme der Flüssigkeit, welche durch die Membran diffundiert ist. Weiters wird auch eine Methode zur Detektion mit dieser Vorrichtung beschrieben.
Nachteilig an diesen Verfahren und diesen Vorrichtungen ist, daß die Nachweisgrenzen von
10 ng für die jeweilige Droge bzw. für den Drogenersatzstoff nicht unterschritten werden kann. Besonders nachteilig dabei erweist sich, daß sich gerade im Speichel, welcher sehr leicht gewinnbar ist, oft nur geringe Konzentrationen von illegalen Substanzen befinden.
Aufgabe der Erfindung ist es daher Möglichkeiten zum Nachweis von geringen Konzentratio- nen von verschiedenen Analyten zur Verfügung zu stellen. Es ist weiters eine Teilaufgabe der Erfindung die Spezifität zum Nachweis von Drogen sowie Drogenersatzstoffen zu steigern.
Die Aufgabe der Erfindung wird durch das Verfahren entsprechend den Merkmalen im Kenn- zeichenteil des Anspruches 1 gelöst. Der Vorteil dieses Verfahrens liegt darin, daß bereits sehr niedrige Konzentrationen eines Analyten ausreichen, um mit dem erfindungsgemäßen Verfahren nachgewiesen werden zu können. Dieses Verfahren bietet somit eine höchst sensitive Methode, um Analyten aus einer Probe nachzuweisen. Einfache Nachweisverfahren zur Bestimmung von Analyten erlauben es, diese außerhalb von Labors durchführen zu können, wie z.B. auf der Straße, in Polizeistationen, in Gefängnissen, in Fabriken oder anderen Arbeitsplätzen, zu Hause, praktisch an jedem Ort. Dieses Nachweisverfahren eliminiert die Notwendigkeit von kostenintensiven Laboranalysen und ermöglicht somit eine Kostenersparnis.
Vorteilhaft erweist sich weiters nach Anspruch 2, daß durch die Substanz, welche an den spe- zifischen Bindungspartner gebunden ist, die Sensitivität dieses Nachweisverfahrens durch die zusätzliche chemische Reaktion, welche durch die Substanz verursacht wird, erheblich erhöht werden kann.
Weiters erweist sich eine Weiterbildung des Verfahrens nach Anspruch 3 als vorteilhaft, weil unphysiologische Substrate beispielsweise für Enzyme, wie z. B. ß-Galactosidase, Horsera- dishperoxidase, etc. nach der chemischen Reaktion farbige Reaktionsprodukte ergeben und erlauben somit eine visuelle und auch spektrophotometrische Detektion. Bei den Proteinen Streptavidin, Avidin bzw. Protein A erweisen sich die multiplen Bindungsstellen für Biotin bzw. Fc Teile von Antikörpern als vorteilhaft. Beispielsweise kann ein Antikörper mit Biotin markiert sein. Proteine wie Streptavidin und Avidin binden mit einer ihrer vier Bindungsstellen hochspezifisch an Biotin. Freie Biotin-Bindungsstellen werden dann mit einem biotinmar- kiertem Enzym z.B. alkalische Phosphatase, abgesättigt. Durch die Zugabe von chromogenen Substraten fällt ein Farbgemisch aus, wodurch die Bindung nachgewiesen werden kann. Da die biotinbindenden Proteine vier Biotin-Bindestellen enthalten und die verwendeten Enzyme ebenfalls mehrere Biotin-Gruppen tragen, können sich Komplexe mit vielen Protein-Enzym- Biotin-Molekülen ausbilden, wodurch die Nachweisempfindlich eit wesentlich erhöht wird. Alkalische Phosphatase wird als Markerenzym eingesetzt, da sich in Verbindung mit geeigneten Substraten ein empfindliches, histochemisches Farbreagens und Signalverstärkersystem entwickelt. Das Enzym ß-Galactosidase spaltet natürliche wie künstliche ß-D-Galactoside in Galactose und die entsprechenden Reste (meist Alkohol-Verbindungen). Unphysiologische Substrate für das Enzym, wie ONPG oder X-gal ergeben nach der Hydrolyse und Oxidation farbige Reaktionsprodukte und erlauben somit eine visuelle und auch spektrophotometrische Detektion.
Vorteilhaft ist weiters eine Ausgestaltung nach Anspruch 4, wobei durch die Auftrennung des Analyten in den vielen Zonen sowohl eine Reaktion mit einer Farbstoffkomponente bzw. deren Vorstufe als auch mit einem konjugierten Antikörper erfolgen kann und diese dann in einem Analysefeld detektiert werden können. Von Vorteil ist weiters, wonach unabhängig vom Vorhandensein eines Analyten in der Probe eine Markierung in der Zone des Kontroll- feldes detektierbar wird, um die Funktionsfähigkeit des Analyseverfahrens zu kontrollieren.
Weiters erweist sich als vorteilhaft, daß durch die Anordnung mehrerer Analysefelder gleichzeitig verschiedene Analyten nachgewiesen werden können. Einen weiteren Vorteil stellt die temporäre Immobilisierung der Reagenzien im Farbstofffeld und im Konjugatfeld dar, weil sich dadurch die Zugabe dieser Reagenzien während der Analyse erübrigt und somit das Ver- fahren vereinfacht wird und eine Verwechslung der Reagenzien ausgeschlossen werden kann.
Durch die Anordnung von Lauffeldern wird ermöglicht, daß die Analyten während der Passage des kapillarfähigen Materials von partikulären Verunreinigungen befreit werden.
Dabei erweist sich eine Ausgestaltung nach Anspruch 5 vorteilhaft, wonach durch dieses Ver- fahren eine Vielzahl von Analyten nachgewiesen werden kann. Als vorteilhaft erweist sich weiters, daß mit dem gleichen Verfahren eine so große Anzahl von Analyten nachgewiesen werden kann ohne das Verfahren anpassen zu müssen. Weiters ist von Vorteil, daß durch die Vielfältigkeit dieses Verfahrens keine spezielle Einschulung des durchzuführenden Personals für die verschiedenen Analyten erforderlich ist und somit eine Vielzahl von Analyten von nur einer Person ausgewertet werden kann. Als Vorteilhaft erweist sich weiters, daß mehrere Analyten mittels eines Verfahrens und auf einer Vorrichtung gleichzeitig ausgewertet werden können.
Von Vorteil sind die Weiterbildungen nach den Ansprüchen 6, 7, 8 und 9, wonach insbeson- dere Analyten, welche das physiologische Gleichgewicht des Menschen beeinflussen, nachgewiesen werden können. Als vorteilhaft dabei erweist sich, daß das Verfahren eine einfache Handhabung gewährleistet und somit von jedermann durchgeführt werden kann. Durch dieses multipel anwendbare Verfahren wird eine Kostenminimierung für die Analyse der unterschiedlichsten Analyten erzielt. Die Analyten können direkt vor Ort bestimmt werden und müssen nicht erst in ein Speziallabor transportiert werden. Durch das rasche Testergebnis kann des weiteren frühzeitig entschieden werden, ob eine Beeinträchtigung des Individuums durch den Analyten vorliegt und somit weitere gefährliche Situationen vermieden werden können. Ein rasches Testergebnis verhindert des weiteren auch die Möglichkeit der Manipulation von biologischen Proben wie beispielsweise durch die Einnahme von Doping-Mas- kierern, wie z.B. Probeneeid den Nachweis von Steroid-Hormonen verhindert. Durch das sofortige Vorliegen eines Ergebnisse vor Ort wird die Argumentation für den Probanden viel schwieriger. Es könnte dadurch verhindert werden, daß z.B. Sportler eine olympische Medaille bekommen, obwohl sie ihnen nicht zusteht, aber man allerdings bis zu einigen Tagen nach der Siegerehrung warten muß, bis ein endgültiges Ergebnis der Dopingkontrolle mit herkömmlichen Tests vorliegt.
Sowohl Drogen als auch Psychopharmaka beeinträchtigen einerseits die Reaktionsfähigkeit der Probanden am Arbeitsplatz und andererseits deren Verkehrstüchtigkeit im Straßenverkehr. Durch das Vorliegen eines raschen Testergebnisses mittels dieses Verfahrens kann die un- mittelbare Gefahr von solchen Situationen sofort erkannt werden.
Vorteilhaft ist weiters eine Weiterbildung des Verfahrens nach Anspruch 10, wonach durch den raschen Nachweis von Antikörpern gegen Infektionen das Risiko für Kontaminationen für das Personal, welche die Analyse durchführt, minimiert werden kann. Einerseits kann durch den Nachweis einer viralen Infektion entschieden werden, daß für die weiteren Untersuchungsmaßnahmen besondere Vorsicht vorherrschen soll. Andererseits kann durch das Vorliegen von raschen Analyseergebnissen auf eine intensive Behandlung vermeintlich infizierter Personen oder gar deren Quarantäne verzichtet werden.
Gemäß Anspruch 11 ermöglicht das Verfahren einen Nachweis von verschiedenen Hormonen, wie z.B. von HCG, welches nur während der Schwangerschaft nachweisbar ist. Somit wird durch dieses Verfahren auch eine einfache Möglichkeit zum raschen Nachweis einer Schwangerschaft möglich.
Vorteilhaft erweist sich auch eine Weiterbildung des Verfahrens nach Anspruch 12, wonach bei auffälliger Anamnese bereits rasch eine erste Aussage über das Vorhandensein von Tumormarkern getroffen werden kann, und somit die Zeitspanne, bis zum Ergebnis des Befundes und somit die Ungewißheit für den Patienten minimiert wird.
Weiters erweist sich die Ausgestaltung des Verfahrens nach Anspruch 13 von Vorteil, wobei durch den Nachweis des Toxins sofort mit der richtigen Behandlung der Intoxikation begonnen werden kann und beispielsweise sofort das passende Antidot verabreicht werden kann.
Von Vorteil ist eine Weiterbildung nach Anspruch 14, 15 und 16, wonach der Analyt aus ei- ner Probe beliebigen Ursprungs stammen und für das Verfahren eingesetzt werden kann. Besonders von Vorteil ist bei diesem Verfahren, daß trotz der Vielfalt der Proben unabhängig von ihrem Ursprung immer ein sicheres, reproduzierbares Ergebnis erzielt wird. Besonders vorteilhaft erweist sich dabei, daß das Verfahren eine hohe Toleranzgrenze gegenüber Kontaminationen aufweist und die Proben daher vor der Analyse nicht aufgereinigt werden müs- sen.
Von Vorteil zeigt sich auch die Weiterbildung des Verfahrens nach Anspruch 17, wonach bereits sehr geringe Mengen eines Analyten nachgewiesen werden können. Die hohe Sensiti- vität des Verfahrens ermöglicht somit die Detektion von Analyten im Pikogrammbereich.
Die Aufgabe der Erfindung wird eigenständig auch durch eine Vorrichtung entsprechend den Merkmalen im Kennzeichenteil des Anspruches 18 gelöst. Vorteilhaft daran ist einerseits, daß mittels dieser Vorrichtung eine sehr sensitive Möglichkeit zum Nachweis zumindest eines Analyten zur Verfügung steht. Andererseits ist von Vorteil, daß durch den einfachen Aufbau der Vorrichtung, diese sowohl von chemisch als auch medizinisch ungeschultem Personal bedient und ausgewertet werden kann und somit der Nachweis des Analyten unabhängig von einem bestimmten Ort durchgeführt werden kann.
Eine Weiterbildung nach Anspruch 19 erweist sich als vorteilhaft, weil dadurch unspezifische Bindungen verhindert werden können und somit nur spezifische Bindungen stattfinden können und auch detektiert werden können. Weiters ist von Vorteil, daß während der Detektion keine Signale, welche aus unspezifischen Bindungen resultieren, die Ablesbarkeit der Vorrichtung beeinflussen.
Gemäß der Ausgestaltung nach Anspruch 20 wird die Sensitivität der Vorrichtung zum Nachweis des Analyten erhöht. Die Farbstoffkomponenten und deren Vorstufen wirken als Teil eines Verstärkersystems. Weiters erweist sich als vorteilhaft, daß durch das Anbringen eines Farbstofffeldes ermöglicht wird, daß nur der Analyt auf die Vorrichtung aufgebracht werden muß und nicht erst die Farbstoffkomponenten dem Reagens zugefügt werden müssen. Somit wird die Handhabung der Vorrichtung wiederum vereinfacht. Weiters erweist sich nach Anspruch 21 von Vorteil, daß durch die Anordnung eines Kontrollfeldes eine Kontrolle des gesamten Nachweisverfahrens durchführbar ist. Unabhängig von der Gegenwart eines Analyten in der Probe wird ein Signal detektiert und somit eine Funktionskontrolle für die Analyse ermöglicht. Vorteilhaft ist weiters, daß in der Analysezone nicht nur der Analyt selbst, sondern auch ein spezifischer Bindungspartner für diesen immobilisiert werden kann und somit eine große Anzahl von Bindungspartnern für die Bindung des Analyten aus der Probe zur Verfügung stehen. Vorteilhaft erweist sich auch, daß eine große Anzahl von verschiedenen Analyten mit einer Vorrichtung analysiert werden kann. Durch die Anordnung eines Konjugat- und Farbstofffeldes erübrigt sich das Beimengen der Stoffe, welche an diesen Feldern temporär immobilisiert sind und somit die Fehleranfälligkeit des Tests minimiert wird. Weiters erweist sich von Vorteil, daß sich sowohl in der Kontrollzone als auch in der Analysezone entweder der spezifische Bindungspartner, an welche die gleiche Substanz konjugiert ist oder die gleiche Substanz selbst, welche die gleiche Reaktion mit dem Farbstoff bzw. den Farbstoffvorstufen erzeugt, befinden. Dadurch wird eine genaue Kontrolle der Funktionsfähigkeit der Vorrichtung ermöglicht.
Gemäß der Weiterbildung der Vorrichtung nach Anspruch 22 ist von Vorteil, daß spezifische Bindungsstellen des zumindest einen Analyten nicht durch unspezifische Reaktionen der Farbstoffkomponenten bzw. deren Vorstufen bereits im Vorfeld der Analyse blockiert werden und somit zu einem falsch negativen Ergebnis führen würden.
Vorteilhaft sind auch Ausbildungen der Vorrichtung nach einem der Ansprüche 23 und 24, wobei die Farbstoffkomponente bzw. deren Vorstufen als Verstärkersystem dienen und die Sensitivität der Analyse somit gesteigert wird. X-gal hat gegenüber ONPG den Vorteil, daß der nach der Hydrolyse und Oxidation als Reaktionsprodukt entstehende, blaue Ixidigofarb- stoff schwer löslich ist und somit nicht diffundiert.
Von Vorteil erweisen sich auch Ausgestaltungen nach den Ansprüchen 25 und 26, wonach durch die Zugabe dieser Stoffe, eine bessere Löslichkeit der Farbstoffkomponenten und deren Vorstufen erzielt und somit wiederum die Sensitivität der Analyse verbessert wird.
Die Weiterbildung nach Anspruch 27 erweist sich als vorteilhaft, wonach eine Kontrolle der Analyse ermöglicht wird, weil in jedem Fall eine Bindung der Substanzen an die im Kontrollfeld vorhandenen spezifischen Bindungspartner stattfindet und somit die Funktionalität der Analyse auf jeder Vorrichtung oder auf einer eigenen Vorrichtung kontrolliert werden kann. Von Vorteil ist auch eine Ausgestaltung nach Anspruch 28 wobei bereits geringe Mengen an spezifischen Bindungspartnern für die Substanzen ausreichen um ein detektierbares Signal zu erhalten und somit die Herstellungskosten der Vorrichtung sehr niedrig gehalten werden können.
Gemäß der Ausgestaltung nach Anspruch 29 erweist sich von Vorteil, daß während der Analyse im Analysefeld in jedem Fall genügend Substanz konjugierte spezifische Bindungspartner vorhanden sind, weil das Kontrollfeld nachgeordnet angebracht ist und daher nicht bereits zu viele substanzspezifische Bindungspartner im Kontrollfeld abgefangen werden können und dadurch für das Analysefeld nicht mehr genügend spezifische Bindungspartner, welche an eine Substanz konjugiert sind, zur Verfügung stehen würden.
Vorteilhaft erweisen sich auch die Weiterbildungen nach Anspruch 30, wobei im Analysefeld der gleiche Analyt angeordnet ist bzw. ein spezifischer Bindungspartner für den nachzuwei- senden Analyten und somit Kreuzreaktionen und falsch positive Ergebnisse durch unspezifische Bindungen ausgeschlossen werden können.
Von Vorteil ist auch eine Ausgestaltung nach Anspruch 31, daß eine Vielfalt von Analyten nachgewiesen werden kann und die Vorrichtung nicht nur für den Nachweis eines einzigen Analyten verwendet werden kann und dadurch Produktionskosten für die unterschiedlichen Ausgestaltungen der Vorrichtungen minimiert werden können. Von Vorteil erweist sich weiters, daß das gleiche Verfahren für den Nachweis aller Analyten angewendet werden kann.
Weiters erweist sich eine Ausgestaltung nach Anspruch 32 von Vorteil, wonach nur eine ge- ringe Menge des Analyten auf die Vorrichtung aufgebracht werden muß und dadurch die Kosten für den Materialaufwand der Vorrichtung minimiert werden.
Von Vorteil sind auch die Weiterbildungen der Vorrichtung nach den Ansprüchen 33 und 34, womit die Intensität der durch die Auswertung entstandenen Signale in diversen Abstufungen vorliegt, da eine zu hohe Konzentration eine Überlagerung der Signale verursachen würde, wodurch die Klarheit der Analyseergebnisse gefährdet ist. Damit kann die Vorrichtung unabhängig von der zu erwartenden Konzentration des Analyten universell angewandt werden. Weiters ist von Vorteil, daß die unterschiedlichen Konzentrationen der Analyten eine Quantifizierung ermöglichen. Die Aufgabe der Erfindung wird eigenständig auch durch ein Reagens entsprechend den Merkmalen in Kennzeichenteil des Anspruches 35 gelöst. Es erweist sich von Vorteil, daß für die Herstellung des Reagens einfache chemische Verbindungen verwendet werden können, die in der Herstellung und Beschaffung sehr niedrige Kosten verursachen und somit in der Folge eine kosteneffiziente Herstellung des Reagens ermöglichen. Vorteilhaft daran ist auch, daß eine Intensivierung des Signals hervorgerufen werden kann und somit die Sensibilität des Verfahrens und auch der Vorrichtung steigt.
Gemäß der Weiterbildung des Reagens nach Anspruch 36 erweist sich von Vorteil, daß der Analyt bereits im Reagens gebunden werden kann und im Analyseverfahren durch einen spezifischen Bindungspartner für den Bindungspartner des Analyten nachgewiesen wird. Es besteht dadurch eine Möglichkeit einen indirekten Nachweis des Analyten zu ermöglichen.
Gemäß den Weiterbildungen des Reagens nach den Ansprüchen 37 bis 39 können dem Rea- gens bereits Komponenten des Farbstoff Systems oder deren Vorstufen beigemengt sein und dadurch kann man beispielsweise die Laufstrecke des Analyten auf der Vorrichtung verkürzen und somit die Größe der Vorrichtung insgesamt minimieren.
Von Vorteil erweisen sich weiters die Weiterbildungen nach den Ansprüchen 40 und 41, wo- nach durch die Zugabe dieser Komponenten eine raschere Löslichkeit der Farbstoff komponenten in dem Reagens erreicht wird und/oder die Adsorption der Farbstoff komponenten am kapillarfähigen Material der Vorrichtung vermindert wird.
Von Vorteil zeigen sich auch die Weiterbildungen nach den Ansprüchen 42 bis 47, wonach für die Herstellung des Reagens Standardprodukte aus der chemischen Industrie verwendet werden können, und somit die Herstellungskosten für das Reagens niedrig gehalten werden.
Weiters erweisen sich die Weiterbildungen nach den Ansprüchen 48 bis 50 von Vorteil, wonach während der gesamten Analyse konstante Bedingungen im Reagens und somit ein repro- duzierbares Ergebnis gewährleistet wird. Außerdem wird durch die Aufrechterhaltung von konstanten Bedingungen die Funktionalität der Vorrichtung verbessert. Von Vorteil dabei erweist sich insbesondere, daß durch den Zusatz einer Mischung der genannten Puffer es gelingt, das Reagens über einen größeren pH-Wert abzupuffern und die Nachweisreaktion des Analyten nicht gestört ist und somit auch bei Untersuchungen von verunreinigten Proben ein reproduzierbares Analyseergebnis zur Verfügung steht. Gemäß den Ausbildungen nach einem der Ansprüche 51 und 52 erweist sich von Vorteil, daß für die Auflösung von Substanzen mit komplizierten Molekülstrukturen und auch großen Molekülen ein Detergens eine Verbesserung der Löslichkeit herbeiführt.
Weiters erweisen sich die Ausgestaltungen nach den Ansprüchen 53 und 54 als vorteilhaft, wonach durch das Zufügen dieser Substanzen sowohl die Osmolarität des Reagens als auch die Löslichkeit erhöht werden.
Von Vorteil sind auch Weiterbildungen nach den Ansprüchen 55 und 56, wonach die Halt- barkeit des Reagens verlängert wird.
Die Aufgabe der Erfindung wird eigenständig auch durch einen Analysekit entsprechend den Merkmalen im Kennzeichenteil des Anspruches 57 gelöst. Vorteilhaft daran ist, daß alle notwendigen Vorrichtungen und Reagenzien zur Durchführung der Analyse zur Verfügung ge- stellt werden. Von Vorteil ist weiters, daß durch die einfache Aufbewahrungsart des Analysekits bei Raumtemperatur eine Lagerung unabhängig vom Ort möglich ist.
Die Aufgabe der Erfindung wird eigenständig auch durch die Verwendung der Vorrichtung entsprechend den Merkmalen im Kennzeichenteil des Anspruches 58 gelöst. Von Vorteil er- weist sich, daß durch die Verwendung der Vorrichtung ein probates Mittel zur Analyse zumindest eines Analyten in einer Probe zur Verfügung steht.
Die Aufgabe der Erfindung wird eigenständig auch durch die Verwendung des Reagens entsprechend den Merkmalen im Kennzeichenteil des Anspruches 59 gelöst. Vorteilhaft erweist sich, daß durch die Verwendung des Reagens ein kostengünstiges und mit Verstärkungspotential ausgestattetes Mittel zur Verfügung steht.
Die Aufgabe der Erfindung wird auch eigenständig durch die Verwendung des Analysekits entsprechend den Merkmalen im Kennzeichenteil des Anspruches 60 gelöst. Von Vorteil da- bei erweist sich, daß durch die Verwendung des Analysekits eine rasche und unkomplizierte Analytbestimmung unabhängig vom Ort ermöglicht wird.
Zum besseren Verständnis der Erfindung wird diese anhand der nachfolgenden Figuren näher erläutert, wobei diese in schematisch vereinfachter Darstellung eine Vorrichtung zum Nach- weis zumindest eines Analyten zeigt. Die Erfindung wird im nachfolgenden anhand der in der Zeichnung dargestellten Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Es zeigen:
Fig. 1 eine viereckige Vorrichtung aus Startzone und Analysefeld;
Fig. 2 eine viereckige Vorrichtung aus Startzone, Zone und Zielzone;
Fig. 3 eine viereckige Vorrichtung aus Startzone, Zone und Zielzone;
Fig. 4 eine runde Vorrichtung aus Startzone und Analysefeld;
Fig. 5 eine runde Vorrichtung aus Startzone, Zone und Zielzone;
Fig. 6 eine sternförmige Vorrichtung aus Startzone und Analysefeld;
Fig. 7 eine sternförmige Vorrichtung aus Startzone, Zone und Zielzone;
Fig. 8 eine sechseckige Vorrichtung aus Startzone und Analysefeld;
Fig. 9 eine sechseckige Vorrichtung aus Startzone, Zone und Zielzone.
Einführend sei festgehalten, daß in den unterschiedlich beschriebenen Ausführungsformen gleiche Teile mit gleichen Bezugszeichen bzw. gleichen Bauteilbezeichnungen versehen wer- den, wobei die in der gesamten Beschreibung enthaltenen Offenbarungen sinngemäß auf gleiche Teile mit gleichen Bezugszeichen bzw. gleichen Bauteilbezeichnungen übertragen werden können. Auch sind die in der Beschreibung gewählten Lageangaben, wie z.B. oben, unten, seitlich usw. auf die unmittelbar beschriebene sowie dargestellte Figur bezogen und sind bei einer Lageänderung sinngemäß auf die neue Lage zu übertragen. Weiters können auch Einzelmerkmale oder Merkmalskombinationen aus den gezeigten und beschriebenen unterschiedlichen Ausfuhrungsbeispielen für sich eigenständige, erfinderische oder erfindungsgemäße Lösungen darstellen.
Die Fig. 1 zeigt eine Seitenansicht einer Vorrichtung 1 auf einem Trägermaterial 2, wobei das zumindest eine kapillarfähige Material 3 mittels einer Verbindungsschicht 4, wie z. B. einem Doppelklebefilm, mit dem Trägermaterial 2 verbunden ist. Ein Aufbringen des kapillarfähigen Materials auf ein einseitig klebendes Trägermaterial (laminieren) ist auch möglich. Auf der Vorrichtung 1 sind eine Startzone 5 und eine weitere Zone 6, die aus zumindest einem kapillarfähigen Material 3 gebildet ist, angeordnet.
Die Fig. 2 zeigt eine weitere Ausführungsform der Vorrichtung 1, wobei bereits an dieser Stelle bemerkt sei, daß die Erfindung nicht auf die speziell dargestellten Ausführungsvarian- ten derselben eingeschränkt ist, sondern vielmehr auch diverse Kombinationen der einzelnen Ausführungsvarianten untereinander möglich sind und diese Variationsmöglichkeit aufgrund der Lehre zum technischen Handeln durch gegenständliche Erfindung im Können des auf dem diesen techmschen Gebiet tätigen Fachmannes liegt. Es sind also auch sämtliche denkbaren Ausführungsvarianten, die durch Kombinationen einzelner Details der dargestellten und beschriebenen Ausführungsvariante möglich sind, vom Schutzumfang mitumfaßt.
Die Fig. 2 zeigt eine Seitenansicht einer Vorrichtung 1 auf einem Trägermaterial 2, wobei das
Trägermaterial 2 über eine Verbindungsschicht 4 mit zumindest einem kapillarfähigen Material 3 verbunden ist. Auf dem kapillarfähigen Material 3 sind eine Startzone 5, eine Zone 6 und eine Zielzone 7 angeordnet. Die Zone 6 besteht aus mehreren Feldern, wie z.B. einem Konjugatfeld 8 mit spezifischen Bindungspartnern, an welche zumindest eine Substanz kon- jugiert ist, zumindest einem Lauffeld 9, einem Analyse- 10 und/oder Kontrollfeld 11 und einem Farbstoffeid 12.
Die Fig. 3 zeigt eine viereckige Vorrichtung 1, wobei in der Zone 6 mehrere Analysefelder 10 angeordnet sind. Auf jedem dieser Analysefelder 10 kann ein unterschiedlicher Analyt 13 ge- bunden sein und die Vorrichtung 1 somit für den Nachweis mehrerer verschiedener Analyten
13 verwendet werden. In einer alternativen nicht dargestellten Ausführungsvariante kann die Startzone 5 auch zentral an der Vorrichtung 1 angeordnet sein, wobei sich die Analysefelder 10 auf allen Seiten der Startzone 5 befinden können. Es können auch mehrere Zielzonen 7 an der Vorrichtung 1 angeordnet sein.
Die Fig. 4 zeigt eine runde Ausfuhrungsform der Vorrichtung 1 wie sie in Fig. 1 beschrieben ist. Angrenzend an die Startzone 5 befindet sich eine weitere Zone 6, in welcher der Nachweis des zumindest einen Analyten 13 stattfindet.
Die Fig. 5 zeigt eine runde Ausführangsform der Vorrichtung 1, wobei sich angrenzend an die Startzone 5 ein Konjugatfeld 8, ein Farbstoffeid 12, mehrere Lauffelder 9, zumindest ein Analysefeld 10 und/oder ein Kontrollfeld 11 und eine Zielzone 7 befinden.
Die Fig. 6 und 7 zeigen sternförmige Ausführungen der Vorrichtung 1, wobei in Fig. 6 die Vorrichtung 1 nur von einer Startzone 5 und einer angrenzenden Zone 6 gebildet wird und in Fig. 7 eine Startzone 5, eine Zielzone 7 und eine Zone 6 bestehend aus einem Konjugatfeld 8, einem Farbstoffeid 12, mehreren Lauffeldern 9, zumindest einem Analysefeld 10 und/oder einem Kontrollfeld 11 dargestellt sind. Die verschiedenen Zonen 6 sind kreisförmig auf der Vorrichtung 1 angeordnet.
Die Fig. 8 und 9 zeigen oktogonale Ausführungsformen der Vorrichtung 1, wobei in Fig. 8 die Vorrichtung 1 nur von einer Startzone 5 und einer angrenzenden Zone 6 gebildet wird und in Fig. 9 eine Startzone 5, eine Zielzone 7 und eine Zone 6 bestehend aus einem Konjugatfeld 8, einem Farbstoffeid 12, mehreren Lauffeldern 9, zumindest einem Analysefeld 10 und/oder einem Kontrollfeld 11 dargestellt sind.
Die verschiedenen Zonen 6 bzw. Felder können in unterschiedlichen Formen, wie z.B. linear, kreisförmig, dreieckig, viereckig, hexagonal, pentagonal, heptagonal, oktogonal, trapezoid, rhomboid, etc., auf der Vorrichtung 1 angeordnet sein.
Das kapillarfähige Material, welches einen Filter darstellt, besteht aus Zellulose und/oder deren Derivaten, aus organischen Polymeren und ihren Derivaten, insbesondere aus Materialien, die wenig Proteine an ihrer Oberfläche adsorbieren, wie z.B. Glasfaser, Keramik, Polytetra- fluorethylen (PTFE), Nylon, Polyvinylidenfluorid (PVDF), Materialien auf Silizium-Basis, Materialien biologischen Ursprungs, Acetate oder aus Gemischen oder Modifikationen dieser
Materialien. Die Filter sind mit einer Porengröße, ausgewählt aus einem Bereich mit einer oberen Grenze von 50 μm, vorzugsweise 40 μm, insbesondere 35 μm und einer unteren Grenze von 0,20 μm, vorzugsweise 5 μm und insbesondere 10 μm. Besonders vorteilhaft haben sich auch Filter mit einer Porengröße ausgewählt aus einem Bereich mit einer oberen Grenze von 30 μm, vorzugsweise 25 μm, insbesondere 20 μm und einer unteren Grenze von 12 μm, vorzugsweise 15 μm, insbesondere 17 μm. Es können auch Vorfilter mit einer Undefinierten Porengröße verwendet werden. Insbesondere im Bereich der Startzone 5 und im Bereich der Lauffelder 9 bzw. im Bereich der Zielzone 7 kann das kapillarfähige Material von einem Filter mit beliebig definierter Porengröße ausgebildet sein. Das kapillarfähige Material 3 der Vorrichtung 1 weist eine Dicke, ausgewählt aus einem Bereich mit einer unteren Grenze von 0,05 mm, vorzugsweise 0,08 mm, insbesondere 0,15 mm und einer oberen Grenze von 2 mm, vorzugsweise 1,5 mm, insbesondere 1 mm, auf. Besonders hat sich eine Dicke, ausgewählt aus einem Bereich mit einer unteren Grenze von 0,1 mm, vorzugsweise 0,15 mm, insbesondere 0,2 mm und einer oberen Grenze von 0,9 mm, vorzugsweise 0,8 mm, insbesondere 0,5 mm, erwiesen. Die Dicke des kapillarfähigen Materials 3 kann in den unterschiedlichen Zonen 6 bzw. den verschiedenen Feldern variieren; d. h. daß die Vorrichtung 1 keine einheitliche Dicke über ihre gesamte Ausdehnung aufweisen muß.
Die verschiedenen Zonen 6 der Vorrichtung 1 können aus dem selben kapillarfähigen Material 3 oder aus unterschiedlichen kapillarfähigen Materialien 3 bestehen. Wie in Fig. 2 gezeigt wird, kann die Vorrichtung 1 in der Start- und Zielzone 7 aus einem anderen Material als in der Zone 6 bestehend aus Feldern ausgebildet sein. Auch die Dicke und die Porengröße des kapillarfähigen Materials 3 kann in den verschiedenen Zonen 6 unterschiedlich sein.
Zur Absättigung der freien unspezifischen Bindungsstellen wird das kapillarfähige Material mit Lösungen beinhaltend Proteine wie BSA, Milchpulver, Casein, Gelatine, fettfreies Milchpulver, Kälberserum, etc. und/oder mit kommerziellen Blockungsreagenzien, wie z.B. Blotto oder Superblock (Fa. Pierce) in einer Konzentration von 0,1 - 10 mg/ml und/oder Detergen- zien, wie z.B. Tween, Triton, Nonidet P-40, Chaps, etc. in einer Konzentration von 0,005 bis
5 Gew.- % blockiert.
Im Analysefeld 10 ist eine vorbestimmbare Menge des zumindest einen Analyten 13 in einer Konzentration ausgewählt aus einem Bereich mit einer unteren Grenze von 0,5 ng/ml, insbe- sondere 1 ng/ml, vorzugsweise 2 ng/ml, und einer oberen Grenze von 5 mg/ml, insbesondere
3 mg/ml, vorzugsweise 1 mg/ml, immobilisiert. Der zumindest eine Analyt 13 kann sowohl direkt als auch indirekt nachgewiesen werden, wie z.B. durch den Analyt 13 selbst, einen spezifischen Analytbindungspartner oder einen markierten Bindungspartner. Der indirekte Nachweis erfolgt durch die Bindung des Analyten 13 an einen ersten spezifischen Bindungspartner, z.B. primärer Antikörper. Im Analysefeld wird dann entweder dieser oder der Analyt (an einer anderen Stelle) durch einen zweiten spezifischen Bindungspartner, z.B. sekundärer Antikörper, welcher im Analysefeld 10 immobilisiert ist, erkannt und gebunden. Das Vorhandensein des Analyten im Analysefeld 10 wird schließlich mit einem weiteren spezifischen Bindungspartner, welcher mit einer Substanz konjugiert ist, der entweder den Analyten selbst (an einer anderen Stelle) bzw. den Analyten gebunden an den ersten spezifischen Bindungspartner oder den zweiten spezifischen Bindungspartner erkennt, nachgewiesen.
Im Analysefeld 10 ist zumindest ein Analyt 13 immobilisiert. Alternativ zum Analyten 13 kann auch ein analytspezifischer Bindungspartner im Analysefeld 10 immobilisiert sein. In diesem Fall muß für die Detektion des Analyten 13 der spezifische Bindungspartner, welcher mit einer Substanz konjugiert ist, spezifisch für den Analyten sein und diesen an einer anderen Stelle binden. Es kann eine Vielzahl von verschiedenen Analyten 13 nachgewiesen werden. Der zumindest eine Analyt 13 kann aus einer Gruppe umfassend Drogen bzw. Drogenersatzstoffe umfassend Cannabisprodukte, wie z.B. Marihuana, Haschisch und/oder Cannabinol, Kokain, wie z.B. Benzoylecgonine, Crack und/oder Crystal, Opiate, wie z.B. Morphium,
Acetylmorphin, Heroin, Codein, Propoxyphene und/oder Fentanyl, Nikotin, Kotinin, d- Lysergsäurediethylamid (LSD), Psilocybin und Psilocin, Mescalin und Peyote, Methadon oder Methadonmetabolite, oder eine Designerdroge, wie z.B. Amphetamine (MDA, Dime- thoxybromamphetamin, etc.), Methamphetamine (wie z.B. Ecstasy, MDMA) , Phencyclidin (Engelsstaub), γ-Hydroxybuttersäure (Liquid Ecstasy), Antiepileptika, wie z.B. Phenytoin,
Dopingmittel aus einer Gruppe umfassend Anabolika, wie z.B. Testosteron und seine Derivate, Somatotropin, Ephedrin-Derivate, Analeptika, wie z.B. Strychnin, Amphetamin-Deri- vate, Analgetika, Antitussiva, Mittel zur Steigerung der Sauerstofftransportkapazität und der Sauerstoff Verfügbarkeit für die Skelettmuskulatur, wie z.B. Erythropoietin und/oder Diure- tika, Arzneimittel, Analgetika oder Psychopharmaka aus einer Gruppe umfassend, Neurolep- tika, wie z.B. Phenothiazin, Butyrophenone und/oder Thioxanthene, Antidepressiva, wie z.B. MAO (Monoaminoxidase)-Hemmer, Imipramin, Desipramin, Amitryptilin, etc., Tranquilizer, wie z. B. Benzodiazepine (Diazepam), Barbiturate und oder Psychoanaleptika, Stimulantien, wie z.B. Phenylethylamin, Antiepileptika und/oder Hypnotika, Antikörper, gebildet als Reak- tion auf virale, viroide, bakterielle, mykotische, parasitäre bzw. auf Prionen basierende Infektionen und/oder gebildet infolge von Immunisierungen (Impfung beim Menschen oder Tier bzw. polyklonale Antikörperherstellung bei Tieren) und/oder gebildet infolge von Autoimmunkrankheiten oder allergischen Reaktionen, Hormone, wie z.B. HCG (human chorion Go- nadotropin), Proteine als Tumormarker aus einer Gruppe umfassend squamous cell carcinoma antigen (SCC), Thyreoglobin (Tg), Steroidhormonrezeptoren, Prostata-spezifisches Antigen (PSA), Neuronen-spezifische Enolase (NSE), Carcinoembryonales Antigen (CEA), Alpha- Fetoprotein (AFP), CYFRA 21-1, CA 125, 19-9, 72-4, 15-3 und/oder humanes Calcitonin (hCT), MCA (Mucine-like cancer associated antigen), Toxine aus einer Gruppe umfassend Botulinumtoxin, Toxine aus Tieren, Pflanzen, wie: Pilzen, Bakterien, Algen, Pflanzen und ihren Bestandteilen, Lebensmitteln und/oder Toxine künstlichen Ursprungs, z.B. Kampfgifte, und/oder Schwermetalle, Herbizide, Fungizide, Pestizide, Bakterizide, Antibiotika, Konservierungsmittel, etc., ausgewählt sein. Des weiteren können auch Allergene wie. z.B. Pollen, Hausstaubmilbenkot, Histamin, etc. nachgewiesen werden. Von immer größer werdender Bedeutung ist auch der Nachweis von Prionen aus dem Nervensystem verschiedener Säugetiere als auch aus Futtermitteln oder Nahrungsmitteln um eine Ausbreitung der Creutzfeldt- Jakob- Krankheit zu verhindern. Als Analyt 13 können auch Marker oder speziesspezifische Proteine, welche in der Gentechnologie verwendet werden um gentechnologisch veränderte Lebensmittel, Saatgut, etc. zu identifizieren, nachgewiesen werden. Es können des weiteren auch verschiedene Antikörper(sub)typen nachgewiesen werden.
Durch die Immobilisierung des zumindest einen Analyten 13 in unterschiedlichen Konzentrationen in den Analysefeldern 10 kann eine semiquantitative Bestimmung des Analyten 13 durchgeführt werden. Die Konzentration des zumindest einen Analyten 13 in der Verdünnungsreihe nimmt mit einem Faktor, ausgewählt aus einem Bereich mit einer unteren Grenze von 1, insbesondere 2, vorzugsweise 3 und einer oberen Grenze von 100, insbesondere 10, vorzugsweise mit einem Faktor 5 ab.
Der Analyt 13 kann aus einer Probe biologischen Ursprungs, wie Körperflüssigkeiten aus Mensch und Tier, wie z.B. Blut, Plasma, Serum, Urin, Speichel, Schweiß, Sperma, etc. und/ oder pflanzlichen Ursprungs, wie z.B. Blatt, Frucht, Samen, etc. und/oder mikrobiologischen
Ursprungs stammen. Der Analyt 13 kann auch aus dem Boden bzw. aus Wasser nachgewiesen werden. Um eine Analyse von Stoffen aus der Luft durchzuführen bedarf es einer Ankonzen- trierung des Analyten 13, z.B. durch Ansaugen größerer Luftvolumina mittels einer Pumpe, wobei die Anreicherung des Analyten 13 direkt auf dem Material der Startzone 5 erfolgen kann.
Im Farbstoffeid 12 sind eine oder mehrere Farbstoffkomponenten oder deren Vorstufen temporär irnmobilisiert. Die Farbstoffkomponenten müssen sich allerdings nicht notwendigerweise in einer Zone 6 befinden, sondern können auch auf mehrere Zonen 6 aufgeteilt sein, wie z.B. auf die Startzone 5, auf das Farbstoffeid 12, auf das Konjugatfeld 8 und das Lauffeld 9. Die Farbstoffkomponenten liegen in ungelöster Form vor. Die verwendeten Farbstoffkomponenten bzw. deren Vorstufen sind: Tyramin und dessen Derivate, X-Gal (5-Brom-4-Chlor-3- Indolyl-ß-D-Galactosid), S-Gal (3,4 Cyclohexenoesculetin-ß-D-Galactopyranosid), ONPG (o-Nitrophenyl-ß-D-Galactopyranosid), CPRG (Chlorophenol red-ß-D-Galactopyranosid), Bluogal (5-Brom-3-Indolyl-ß-D-Galactosid), MUGal (4-Methylumbelüferyl-ß-D-Galacto- pyranosid), NBT (Nitroblue Tetrazolium Chlorid), BCIP (5-Brom-4-Chlor-3-Indolylphos- phat), PNPP (p-Nitrophenyl Phosphat), OPD (o-Phenylenediamine), ABTS (2,2'-Azino-di-(3- ethylbenz-thiazoline Sulfonic Acid), DAB (3,3-Diaminobenzidine), TMB (3,3'5,5'~ Tetra- methylbenzidine), Phenazinmethosulfat, Kaliumferrocyanid, Kaliumferricyanid, Ferne Am- moniumeitrat, VectorBlackTM, Chemilumineszenzfarbstoffe, wie z.B. Galacton-Star Substrat, Lumi-PhosTM plus, LuciGLOTM, DuoLuXTM, Lumigen PS-3, Chemiluminescent HRP (horseradishperoxidase) Substrat, 2 Component System from BioFXTM, und/oder Lu- mi-Gal 530 und/oder Fluoureszenfarbstoffe, z.B. 3-Carboxyumbelliferyl-ß-D-Galactopyra- nosid (CUG) und/oder MUP (4-Methylumbelliferyl-Phosphat). Die Konzentration der Farb- Stoffkomponenten und deren Vorstufen ist, jeweils in Gew-%, aus einem Bereich mit einer unteren Grenze von 0,01 %, insbesondere 0,1 %, vorzugsweise 1 %, und einer oberen Grenze von 20 %, insbesondere 10 %, vorzugsweise 4 %, ausgewählt.
Im Feld mit den Farbstoffkomponenten können auch andere Substanzen, wie z.B. BSA, Maltrin, Milchpulver, Casein, Gelatine, in den Konzentrationen ausgewählt aus einem Bereich mit einer unteren Grenze von 0,1 %, insbesondere 1 %, vorzugsweise 5 %, und einer oberen Grenze von 50 %, insbesondere 30 %, vorzugsweise 10 %, zugefügt werden, um die Adsorption der Farbstoffkomponenten an die Vorrichtung 1 zu vermindern, bzw. die Löslichkeit der Farbstoffe zu erhöhen.
Im Konjugatfeld 8 kommen insbesondere spezifische Bindungspartner wie z.B. Antikörper gegen Analyten 13, die mit einem Katalysator, wie z.B. einem organischen oder anorganischen Katalysator oder Enzymen oder Proteinen, wie z.B. ß-Galactosidase, Peroxidase, alkalische Phosphatase, Streptavidin/ Avidin, Protein A oder ähnliche zu hochaffinen spezifischen Bindungen befähigte Moleküle etc., konjugiert sind, vor. Alternativ können auch mehrere unterschiedliche Substanzen gleichzeitig oder in einer vordefinierten Reihenfolge an einen spezifischen Bindungspartner konjugiert sein. Die Konzentration der spezifischen Bindungspartner, an welche die Substanz konjugiert ist, beträgt, ausgewählt aus einem Bereich mit einer unteren Grenze von 0,5 ng/ml, insbesondere 1 ng/ml, vorzugsweise 2 ng/ml, und einer oberen Grenze von 5 mg/ml, insbesondere 2 mg/ml, vorzugsweise 1 mg/ml. Besonders vorteilhaft haben sich auch Konzentrationen ausgewählt aus einem Bereich mit einer unteren Grenze von 0,1 mg/ml, vorzugsweise 0,2 mg/ml, insbesondere 0,3 mg/ml, und einer oberen Grenze von 2 mg/ml, vorzugsweise 1 mg/ml, insbesondere 0,5 mg/ml, erwiesen.
Im Kontrollfeld 11 befindet sich ein immobilisierter spezifischer Bindungspartner, z.B. ein Antikörper für zumindest eine Substanz, wie z.B. ß-Galactosidase, alkalische Phosphatase, Peroxidase, Streptavidin/ Avidin, Protein A oder ähnliche zu hochaffinen spezifischen Bindungen befähigte Moleküle etc., in einer Konzentration ausgewählt aus einem Bereich mit einer unteren Grenze von 0,5 ng/ml, insbesondere 1 ng/ml, vorzugsweise 2 ng/ml, und einer oberen Grenze von 5 mg/ml, insbesondere 3 mg/ml, vorzugsweise 1 mg/ml.
In der Zielzone 7 und den Lauffeldern 9 ist es nicht notwendig eine Substanz oder einen Analyten 13 zu immobilisieren.
Es können in einem Feld auch mehrere Analyten oder Kombinationen aus z. B. spezifischen Bindungspartnern, Substanzen und/oder Farbstoff komponenten oder deren Vorstufen vorliegen.
Zur Durchführung des Verfahrens wird eine kleine Menge einer Probe mit einem saugfälligen Material, wie z.B. einem Wattestäbchen gesammelt. Der an dem saugfähigen Material haftende Analyt 13 wird in einem Reagens, insbesondere organischen Reagens, aufgenommen. Drei bis sieben Tropfen dieses mit Analyten 13 versehenen Reagens werden auf die Vorrichtung 1 aufgebracht. Das Reagens mit dem Analyten 13 wandert in dem kapillarfähigen Material 3 der Vorrichtung 1 mit einer Geschwindigkeit von 1 bis 12 cm/Minute von der Startzone 5 bei- spielsweise durch die Zone 6 bestehend aus zumindest einem Konjugatfeld 8, Farbstoffeid 12,
Lauffeld 9, Analyse- 10 und Kontrollfeld 11 und zuletzt in die Zielzone 7. Falls im Reagens mit der Probe eine ausreichende Menge des Analyten 13 vorhanden ist und alle Bindungsstellen der spezifischen Bindungspartner abgesättigt sind, können diese somit nicht mehr an die immobilisierten Analyten 13 im Analysefeldes 10 binden. Eine detektierbare Menge des Ana- lyten 13 ergibt auf der Vorrichtung 1 nur eine Markierung im Kontrollfeld 11, weil die Bindungspartner bereits abgesättigt sind und nicht mit den immobilisierten Analyten 13 an der Vorrichtung 1 reagieren. Im Falle, daß in der Probe kein Analyt 13 bzw. eine unzureichende Menge zur Detektion des Analyten 13 vorhanden ist, ergeben sich auf der Vorrichtung 1 zwei Markierungen, wobei sich die erste Markierung aus der Bindung des analytspezifischen und/ oder substanzkonjugierten analytspezifischen Bindungspartner im Analysefeld 10 ergibt und die zweite Markierung resultiert aus der Bindung der immobilisierten Bindungspartner spezifisch für die Substanz, wie z.B. ß-Galactosidase in Reaktion mit einer Farbstoffkomponente oder deren Vorstufe.
Im Falle des Fehlens des zu bestimmenden Analyten 13 in der Probe bindet der analytspezifi- sche Bindungspartner im Analysefeld 10 und der analytspezifische Bindungspartner, an welchen zumindest eine Substanz konjugiert ist, wie z.B. ß-Galactosidase, reagiert mit der vorbeilaufenden Farbstoffkomponente bzw. deren Vorstufen in der Weise, daß der gebildete Farbstoff bzw. Farbstoffkomplex entweder unlöslich oder schwer löslich am Analysefeld 10 verbleibt und/oder durch Antikörper gegen den gebildeten Farbstoffkomplex, detektiert werden kann. Der spezifische Bindungspartner, an welchen zumindest eine Substanz konjugiert ist, kann mehrere Bindungsstellen für Farbstoffe bzw. Farbstoffkomplexmoleküle, die eine gut sichtbare Markierung erzeugen, tragen.
Ist eine ausreichende Menge des Analyten 13 vorhanden, bindet diese an die analytspezifischen Bindungspartner, welche mit einer Substanz konjugiert sind, und diese Bindungspartner können daher nicht mehr an den immobilisierten Analyten 13 im Analysefeld 10 binden und laufen ohne Ausbildung einer sichtbaren Markierung in die Zielzone 7 der Vorrichtung 1. Unabhängig vom Vorhandensein des nachzuweisenden Analyten 13 in der Probe, binden ent- weder die analytspezifischen Bindungspartner, welche mit einer Substanz konjugiert sind, oder die Substanz selbst, an das Kontrollfeld 11 an entsprechend substanzspezifische Bindungspartner, wobei die somit gebundene Substanz mit dem vorbeilaufenden Farbstoffkomponenten bzw. deren Vorstufen in der Weise reagieren, daß der gebildete Farbstoff komplex unlöslich oder schwer löslich am Ort verbleibt und/oder durch einen Antikörper gegen den gebildeten Farbstoffkomplex, welche immobilisert im Kontrollfeld 11 angebracht ist, mit der
Fortdauer des Tests in großer Anzahl gebunden werden und dort eine gut sichtbare Markierung ausbilden, nachgewiesen werden können.
Im Kontrollfeld 11 befindet sich ein immobilisierter Antikörper gegen die Substanz, wie z.B. ß-Galactosidase. Wie bereits erwähnt findet die Reaktion im Kontrollfeld 11 in jedem Fall statt, unabhängig davon, ob im Laufmittel eine ausreichende Menge des Analyten 13 vorhanden war.
Der Nachweis eines Analyten 13 mit dem Enzym ß-Galactosidase als Verstärkersystem er- folgt durch die Spaltung von natürhchen oder künstlichen ß-D-Galactosiden in Galactose und die entsprechenden Rest- Verbindungen. Unphysiologische Substrate für das Enzym, wie ONPG oder X-gal ergeben nach der Hydrolyse und Oxidation farbige Reaktionsprodukte und erlauben eine visuelle und auch spektrophotometrische Detektion.
Als alternatives Verstärkungssystem können Streptavidin und Avidin, Proteine mit multiplen Bindungsstellen für Biotin eingesetzt werden. Beispielsweise kann ein spezifischer Bindungspartner mit Biotin markiert werden. Proteine wie Streptavidin und Avidin binden mit einer ihrer vier Bindungsstellen hochspezifisch an' Biotin. Freie Biotin-Bindungsstellen werden dann mit biofinmarkiertem Enzym, z.B. alkalische Phosphatase, abgesättigt. Durch die Zu- gäbe von chromogenen Substraten fällt ein Farbgemisch aus, wodurch die Bindung nachgewiesen werden kann. Da die biotinbindenden Proteine vier Biotin-Bindestellen enthalten und die verwendeten Enzyme ebenfalls mehrere Biotin-Gruppen tragen können, können sich Komplexe mit vielen Protein-Enzym-Biotin-Molekülen ausbilden, wodurch die Nachweisempfindlichkeit wesentlich erhöht wird. Alkalische Phosphatase wird als Markerenzym ein- gesetzt, da sich in Verbindung mit geeigneten Substraten ein empfindliches, histochemisches
Farbreagens und Signalverstärkersystem entwickeln läßt. Substrate wie z.B. p-Nitrophenyl- phosphat ergeben nach der hydrolytischen Spaltung durch das Enzym farbige, photometrisch leicht meßbare Reaktionsprodukte, oder, wie im Falle des 5-Brom-4-Chlor-3-Indolylphosphat (BCIP=X-Phosphat), einen tiefblau gefärbten unlöslichen, leicht erkennbaren Niederschlag von Indigo. BCEP wird in der Regel zusammen mit Nitroblau-Tetrazolium (NBT) als Farbverstärker verwendet.
Als weiteres alternatives Verstärkungssystem kann das Enzym Peroxidase (HRP) mit deriva- tisiertem Tyramin verwendet werden (Super-CARD, Catalytic deposition of derivatized tyra- mine, Bhattacharya, R., Bhattacharya, D., and Dhar, T. K. (1999) Journal of Immunological Methode 227, 31-39). Dabei ist z.B. der spezifische Bindungspartner mit dem Enzym Peroxidase (HRP) gekoppelt und katalysiert mit Hilfe von H2O2 (welches im Reagens vorhanden oder durch eine chemische Reaktion direkt gebildet wird) die kovalente Bindung des derivati- sierten Tyramin an das Analysefeld (konkret an dafür spezielle modifizierte Proteine (p-OH- PPA-Casein, p-OH-PPA-Gelatin oder p-OH-PPA-BSA; p-OH-PPA=3-(p-Hydroxyphenyl)- propionsäure) die auf dem Analysefeld immobilisiert sind). Als Molekül welches an Tyramin gekoppelt ist, wird entweder direkt ein Farbstoff, Goldpartikel (NanoGold) oder ein Katalysator in Frage. In letzterem Fall z.B. Peroxidase (HRP), ergibt sich somit mittels eines histo- chemischen Farbreagens ein vielfach verstärktes Signal.
Das Reagens, das zur Aufnahme der Probe dient, besteht aus einwertigem Alkohol mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, Ketonen mit 3 bis 8 Kohlenstoffatomen, mehrwertigen Alkoholen, insbesondere Ethylenglycol und Polyethylenglycol. Die Konzentrationen dieser chemischen Verbindungen sind aus einem Bereich mit einer unteren Grenze von 0,1 %, insbesondere 5 %, vorzugsweise 10 %, und einer oberen Grenze von 40 %, insbesondere 30 %, vorzugsweise 20 %, ausgewählt.
Dem Reagens kann zusätzlich noch ein Detergens, insbesondere (Octylphenoxyl)-polyethoxy- ethanol, Alkylphenolpolyglycolether, Tween 20, Natriumdeoxycholat, Nonidet P-40 (Igepal CA-630), Triton X-100, Cholic acid, Deoxycholic acid und/oder Zwittergent® in einer Konzentration ausgewählt aus einem Bereich mit einer unteren Grenze von 0,001 %, insbesondere 0,005 %, vorzugsweise 0,01 %, und einer oberen Grenze von 1 %, insbesondere 0,5 %, vorzugsweise 0,2 % als Lösungsvermittler zugesetzt werden.
Dem Reagens kann zusätzlich ein Puffer zugesetzt werden, welcher das Reagens in einem pH-Wertbereich konstant hält. Bevorzugt werden hierbei dem Reagens Pufferlösungen, wie z.B. Citratpuffer, Acetatpuffer, Maleatpuffer, Phosphatpuffer, Collidinpuffer, Triethanolamin- HCl-EDTA-Puffer, Trispuffer, Ammediolpuffer, Glycinpuffer, Diethanolaminpuffer oder Tris-Borsäure-EDTA-Puffer, oder Puffer nach Good, N. E. et al. (1966) Biochemistry 5, 467, zugesetzt. Die Konzentration der Pufferlösungen ist jeweils in Gewichtsprozent aus einem
Bereich mit einer unteren Grenze von 0,1 %, vorzugsweise 1 % und insbesondere 2 % hat und mit einer oberen Grenze von 20 %, vorzugsweise 15 %, insbesondere 10 %, ausgewählt. Die Pufferlösung hat einen pH-Wert ausgewählt aus einem Bereich mit einer unteren Grenze von 5,5, insbesondere 6,0, vorzugsweise 6,5, und einer oberen Grenze von 9,5, insbesondere 9,0, vorzugsweise 8,5. Als besonders vorteilhaft haben sich Pufferlösungen mit einem pH-
Wert mit einer unteren Grenze von 6,8, vorzugsweise 7,0, insbesondere 7,2 und einer oberen Grenze von 8,0, vorzugsweise 7,8, insbesondere 7,6 erwiesen.
Durch den Zusatz einer Mischung der genannten Puffer gelingt es, das Reagens über einen größeren pH- Wertbereich abzupuffern und somit auch bei Untersuchungen von verunreinigten Proben ein korrektes Analyseergebnis sicherzustellen. Auch Verunreinigungen durch das vorhandene Puffersystem werden mit Sicherheit soweit abgepuffert, daß sie die Analysereaktion des zumindest einen Analyten 13 nicht stören.
Dem Reagens kann des weiteren zumindest eine Farbstoffkomponente bzw. deren Vorstufe zugesetzt werden, wobei die Farbstoffkomponenten aus einer Gruppe ausgewählt sind, umfassend Tyramin und dessen Derivate, X-Gal (5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-ß-D-Galactosid), S-Gal (3,4 Cyclohexenoesculetin-ß-D-Galactopyranosid), ONPG (o-Nitrophenyl-ß-D-Galacto- pyranosid), CPRG (Chlorophenol red-ß-D-Galactopyranosid), Bluogal (5-Brom-3-Indolyl-ß- D-Galactosid), MUGal (4-Methylumbelliferyl-ß-D-Galactopyranosid), NBT (Nitroblue Tetrazolium Chlorid), BCE? (5-Brom-4-Chlor-3-Indolylphosphat), PNPP (p-Nitrophenyl Phosphat), OPD (o-Phenylenediamine), ABTS (2,2'-Azino-di-(3-ethylbenz-thiazoline Sul- fonic Acid), DAß (3,3-Diaminobenzidine), TMB (3,3'5,5'- Tetramethylbenzidine), Phena- zinmethosulfat, Kaliumferrocyanid, Kaliumferricyanid, Ferric Ammoniumeitrat, Vector- BlackTM, Chemilumineszenzfarbstoffe, wie z.B. Galacton-Star Substrat, Lumi-PhosTM plus,
LuciGLOTM , DuoLuXTM, Lumigen PS-3, chemiluminescent HRP (horseradishperoxidase) Substrat, 2 Component System from BioFXTM, und/oder Lumi-Gal 530 und/oder Fluoures- zenfarbstoffe, z.B. 3-Carboxyumbelliferyl-ß-D-Galactopyranosid (CUG) und/oder MUP (4- Methylumbelliferyl-Phosphat). Die Konzentration der Farbstoffkomponenten ist aus einem Bereich mit einer unteren Grenze von 1 μM, insbesondere 10 μM, vorzugsweise 50 μM, und einer oberen Grenze von 300 mM, insbesondere 150 mM, vorzugsweise 100 mM, ausgewählt.
Die Farbstoffkomponenten und/oder deren Vorstufen werden im Reagens gelöst und werden dort durch die Zugabe der Komponenten des Reagens, BSA, Maltodextrin, Milchpulver, Käl- berserum, Casein und/oder Gelatine zeitlich verzögert gelöst bzw. über die Vorrichtung 1 durch die Kapillarwirkung transportiert.
Um die Osmolarität des Reagens zu erhöhen, können Natriumsalze, Kaliumsalze, Phosphatsalze, Magnesium- und/oder Mangansalze, BSA, Maltodextrin (Maltrin) oder Milchpulver in einer Konzentration aus einem Bereich mit einer unteren Grenze von 0,001 %, insbesondere
0,1 %, vorzugsweise 1 %, und einer oberen Grenze von 30 %, insbesondere 20 %, vorzugsweise 10 %, zugesetzt werden.
Weiters kann dem Reagens ein Konservierungsmittel, insbesondere Natriumazid, Natrium- benzoat, Sorbinsäure, Pentachlorophenol, Sorbat und/oder Konservierungsmittel auf Quecksilber-Basis, in einer Konzentration aus einem Bereich mit einer unteren Grenze von 0,01 %, insbesondere 0,05 %, vorzugsweise 0,1 %, und einer oberen Grenze von 5 %, insbesondere 3 %, vorzugsweise 1 %, zugesetzt werden, um die Haltbarkeit des Reagens zu verlängern. Die Farbstoffkomponenten und/oder deren Vorstoffen befinden sich im Reagens oder teilweise im Reagens oder befinden sich komplett oder teilweise im Farbstoffeid 12 oder komplett oder teilweise in Startzone 5 der Vorrichtung 1 in ungelöster Form.
Der erfindungsgemäße Analysekit umfaßt eine Vorrichtung 1 zum Nachweis zumindest eines Analyten 13, das Reagens einen saugfähigen Stoff, wie z.B. ein Wattestäbchen oder ähnli- ches. Um die Durchführung des Analyseverfahrens weiter zu vereinfachen, kann der Analyse- kit auch weitere Hilfsmittel, wie z.B. Handschuhe, Stoppuhr, Pipetten, etc., enthalten.
Die zwei folgenden Ausführungsbeispiele zeigen mögliche Durchführungsmöglichkeiten des Verfahrens, wobei an dieser Stelle bemerkt sei, daß die Erfindung nicht auf die speziell ange- führten Ausführungsbeispiele beschränkt ist, sondern vielmehr sämtliche denkbare Ausführungsbeispiele die durch Kombinationen einzelner Details der beschriebenen Möglichkeiten vom Schutzumfang mitumfaßt sind
Ausführungsbeispiel 1:
Vorrichtung 1 zur Bestimmung von Benzodiazepinen im Speichel
Die Start- 5 und Zielzone 7 ist aus aus Cellulose Absorbent Paper (Pall Corporation, Type 165 für die Startzone 5 (BSP165PK) und Typ 197 für die Zielzone 7 (BSP197PK)) hergestellt. Das Format der Start- 5 und Zielzone 7 beträgt 25 x 80 mm. Das Filterpapier wird ohne weitere Imprägnierung zur Herstellung der Vorrichtung 1 verwendet.
Das Farbstoffeid 12 wird aus Glasfaser-Mikrofilter Sorte GF/D (Whatman) hergestellt. Das Format des Farbstofffeldes 12 beträgt 5 x 80 mm und wird mit 80 μl der Farbstofflösung gleichmäßig beschickt. Anschließend erfolgt eine Trocknung unter Lichtausschluß bei 20 °C.
Die Farbstofflösung besteht aus: X-Gal (100 mM), NBT (50 mM), Phenazine Methosulfate (1 mM), BSA (4 %), Maltrin (1 ) in PBS (5 mM KH2PO4, 15 mM Na2HPO4, 120 mM NaCl, 2,3 mM KC1, 2 mM MgCl2, 0,05 % NaN3, 5 % Ethanol, 0,1 % Triton X-100). Die Ausgangsreagenzien werden von der Fa. SIGMA-Aldrich hergestellt.
Das Konjugatfeld 8 besteht aus geblockter Accuwick® Membran (Fa. Pall, AW 14-20-10). Das Blocken der Membran erfolgt mit 1 % BSA in PBS Lösung für 1 Stunde bei Raumtemperatur, anschließend Trocknung bei 20°C. Das Format beträgt wiederum 5 x 80 mm. Es werden 80 μl der Antikörperlösung gleichmäßig aufpipettiert und anschließend erfolgt die Trocknung bei 20 °C. Die Antikörperlösung besteht aus: primäre monoklonale Antikörper (Host Maus) gegen Benzodiazepine (25 nM), (Fitzgerald, Kat.Nr.: 10-B12) sekundäre, mit Beta-Glacto- sidase konjugierte Antikörper anti Maus (25nM) (Fa. Fisher Scientifϊc) ß-Galactosidase (25 nM), (Röche Applied Science), BSA (4 %), Maltrin (1 %) in PBS (5 mM KH2PO4, 15 mM Na2HPO4, 120 mM NaCl, 2,3 mM KCL, 2 mM MgCl2, 0,05 % NaN3, 0,1 % Triton X-100). Für die Herstellung der Lauffelder 9 werden Streifen aus Zellulose-Acetatfilter (Fa. Osmonics Inc.) im Format 20 x 80 mm verwendet. Zur Blockierung von Bindungsstellen werden die Streifen in einer 1 % BSA-hältigen PBS-Lösung (5 mM KH2PO4, 15 mM Na2HPO4, 120 mM NaCl, 2,3 mM KC1, 2 mM MgCl2, 0,05 % NaN3, 0,1 %Titron X-100) 30 Minuten bei Raum- temperatur unter Rühren inkubiert.
Im Testfeld wird ein BS A-Benzodiazepinkonjugat (Fa. Fitzgerald) noch vor Blockung von Bindungsstellen immobilisiert. Dazu wird der Zellulose-Acetatfilter (AcetatePlus) in 100 mM Natriumperjodat (SIGMA-Aldrich) für 20 min inkubiert, anschließend mit H2O gewaschen und mit einer 0,5 μM BSA-Benzodiazepin-Lösung in 0,1 M Boratpuffer (pH 9,0) für 10 Minuten inkubiert. Anschließend werden 4 mg Natrium Cyanoborohydride (SIGMA-Aldrich) pro ml zugegeben und 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nichtgebundenes BSA-Benzodia- zepin wird mittels H2O weggewaschen.
Im Kontrollfeld 11 wird ein spezifischer polyklonaler Antikörper gegen das Enzym ß-Galactosidase (Fitzgerald, Host: Rabbit) noch vor Blockung der Bindungsstellen immobilisiert. Die Immobilisierung von 0,25 μM spezifischem polyklonalem Antikörper erfolgt nach der gleichen Methode wie im Testfeld.
Das verwendete Reagens, in welchem die Probe aufgenommen wird, besteht aus PBS (5 mM
KH2PO4, 15 mM Na2HPO4, 120 mM NaCl, 2,3 mM KC1, 2 mM MgCl2, 0,1 % BSA, 0,1 % Maltrin, 0,05 % NaN3, 5 % Ethanol, 0,05 % Triton X-100) mit einem pH-Wert von 7,1.
Die Startzone 5, die Felder der Zone 6 und die Zielzone 7 werden nach den beschriebenen Spezifikationen zugeschnitten und mittels doppelseitigen Klebefilms (Fa. Tesa AG) auf
Trägerfolien Xeroperm (Rank Xerox Limited) befestigt. Davon werden mit einem Rollenschneidegerät Streifen von 4 mm geschnitten. Die Lagerung der Streifen erfolgt bei Raumtemperatur unter Ausschluß von Licht und Feuchtigkeit.
Ausführungsbeispiel 2
Vorrichtung 1 zur Bestimmung von Testosteron im Speichel
Die Start- 5 und Zielzone 7 werden aus Cellulose Absorbent Paper (Pall Corporation, Type 165 für das Auftragekissen (BSP165PK) und Typ 197 für das Aufnahmekissen (BSP197PK)) hergestellt. Es werden Streifen von 25 x 80 mm zugeschnitten, die ohne weitere Imprägnierung oder Vorbehandlung zur Herstellung der Vorrichtung 1 verwendet werden.
Das Farbstoffeid 12 wird aus ,Glass Fiber Media' (Pall, A/D Glass) hergestellt. Es werden Streifen im Format von 5 x 80 mm zugeschnitten und mit 80 μl der Farbstofflösung gleichmäßig beschickt. Anschließend erfolgt die Trocknung unter Lichtausschluß bei 20°C. Die Farbstofflösung besteht aus: X-Gal (100 mM), NBT (50 mM), Phenazine Methosulfate (1 mM), BSA (4%), Maltrin (1%) in PBS (5 mM KH2PO4, 15 mM Na2HPO4, 120 mM NaCl, 2,3 mM KC1, 2 mM MgCl2, 0,05% NaN3, 5% Ethanol, 0,1% Triton X-100) (alle Lösungen stam- men von der Fa. SIGMA-Aldrich).
Das Lauffeld 9, Analysefeld 10 und Kontrollfeld 11 bestehen aus einer 5 μm Immunodyne® ABC Membran im Format 20 x 80 mm (Fa. Pall, BC500H5R). Auf die Vorrichtung 1 wird an der Stelle des Analysefeldes 10 eine 0,5 μM Testosterone-3-CMO-BSA Lösung (Fa. Fitz- gerald, 80-IT49) und an der Stelle des Kontrollfeldes 11 eine 0,25 μM Biotin-BSA Lösung
(SIGMA-Aldrich) aufgetragen. Danach werden die restlichen Bindungsstellen auf der Membran für 2 Stunden bei Raumtemperatur mit einer 1% BSA in PBS Lösung geblockt.
An die Stelle des Konjugatfeldes 8 auf der Vorrichtung 1 werden 10 nM des primären spezifi- sehen monoklonalen Antikörpers gegen Testosteron (Host: Maus, Fitzgerald: 10-T07), 25 nM
Biotinylated Anti-Mouse IgG Antikörper (Host: Pferd, Vector Laboratories:BA-2080) und 100 nM eines Avidin-Beta-Galactosidase Konjugates (SIGMA-Aldrich) direkt auf die geblockte Immunodyne® ABC Membran zwischen Startzone 5 und Analysefeld 10 aufgebracht.
Das verwendete Reagens, in welchem die Probe aufgenommen wird, besteht aus PBS (5 mM
KH2PO4, 15 mM Na2HPO4, 120 mM NaCl, 2,3 mM KC1, 2 mM MgCl2, 0,1% BSA, 0,1% Maltrin, 0,05% NaN3, 5% Ethanol, 0,05% Triton X-100) mit einem pH-Wert von 7,1.
Die Kissen und die bestückte Immunodyne® ABC Membran werden nach den beschriebenen Spezifikationen zugeschnitten und mittels doppelseitigen Klebefilms ( Fa. Tesa AG) auf dem
Trägermaterial (Folie Xeroperm Typ 003R96094 der Fa. Rank Xerox Limited) befestigt. Davon werden mit einem Rollenschneidegerät Streifen von 4 mm geschnitten. Die Lagerung der Streifen erfolgt bei Raumtemperatur unter Ausschluß von Licht und Feuchtigkeit.
Abschließend sei auch noch erwähnt, daß insbesondere die Antikörper, welche in der Anti- körperlösung vorliegen, jeweils auf den nachzuweisenden Analyten angepaßt sind.
Der Ordnung halber sei abschließend darauf hingewiesen, daß zum besseren Verständnis des Aufbaus der Fig. 1 bis 9 diese bzw. deren Bestandteile teilweise unmaßstäblich und/oder ver- größert und/oder verkleinert dargestellt wurden.
Die den eigenständigen erfinderischen Lösungen zugrundeliegende Aufgabe kann der Beschreibung entnommen werden.
Vor allem können die einzelnen in den Fig. 1 bis 9 gezeigten Ausführungen den Gegenstand von eigenständigen, erfindungsgemäßen Lösungen bilden. Die diesbezüglichen, erfindungsgemäßen Aufgaben und Lösungen sind den Detailbeschreibungen dieser Figuren zu entnehmen.
Bezu gsz eich enaufs eilun
Vorrichtung Trägermaterial kapillarfähiges Material Verbindungsschicht Startzone Zone Zielzone Konjugatfeld Lauffeld Analysefeld Kontrollfeld Farbstoffeid Analyt Bindungspartner

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Verfahren zum Nachweis zumindest eines Analyten aus einer Probe durch eine immunochemische Reaktion mit einer Vorrichtung bestehend aus mehreren Zonen, dadurch gekennzeichnet, daß der zumindest eine Analyt in einem Reagens, insbesondere einem organischen Reagens, auf eine Startzone aufgebracht wird und durch Kapillarkräfte in zumindest eine weitere Zone mit einem oder mehreren Feldern läuft, wobei in einem Feld zumindest ein spezifischer Bindungspartner, an welchen zumindest eine Substanz konjugiert ist, temporär immobilisiert ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der zumindest eine Analyt durch eine chemische oder physikalische Reaktion der zumindest einen Substanz oder durch eine chemische Reaktion katalysiert durch die Substanz, welche an den spezifischen Bindungspartner, wie z. B. einen Antikörper, konjugiert ist, nachweisbar wird.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die zumindest eine Substanz aus einer Gruppe umfassend alkalische Phosphatase, Peroxidase, z.B. vom Meerrettich, ß-Galactosidase, Streptavidin Avidin, Protein A oder zu hochaffinen spezifischen Bindungen befähigte Moleküle und/oder einem katalytisch wirkenden Stoff, ausge- wählt wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der zumindest eine Analyt durch eine Zone bestehend aus zumindest einem Feld ausgewählt aus einer Gruppe umfassend Analysefelder, Kontrollfelder, Lauffelder, Farbstofffelder und/oder Konjugatfelder, läuft.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der zumindest eine Analyt aus einer Gruppe umfassend Wirkstoffe, Hormone, Proteine, Pep- tide, Allergene, Antigene, Antikörper, Neurotransmitter, Nukleinsäuren, Kohlenhydrate und/ oder Lipide nachgewiesen wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß Wirkstoffe aus einer Gruppe umfassend Drogen, Drogenersatzstoffe, leistungssteigernde Substanzen wie Dopingmittel, Arzneimittel, Toxine oder deren Metaboliten, nachgewiesen werden.
7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß Drogen bzw. Drogenersatzstoffe aus einer Gruppe umfassend Cannabisprodukte, wie z.B. Marihuana, Haschisch und/oder Cannabinol, Kokain, wie z.B. Benzoylecgonine, Crack und/oder Crystal, Opiate, wie z.B. Morphium, Acetylmorphin, Heroin, Codein, Propoxyphene und/oder Fentanyl, Nikotin, Kotinin, d-Lysergsäurediethylamid (LSD), Psilocybin und Psilocin, Mescalin und Peyote, Methadon oder Methadonmetabolite, oder eine Designerdroge, wie z.B. Amphetamine (MDA, Dimethoxybromamphetamin), Methamphetamine (Ecstasy, MDMA), Phencyclidin (Engelsstaub), γ-Hydroxybuttersäure (Liquid Ecstasy), Antiepileptika, wie z.B. Phenytoin, ausgewählt werden.
8. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß Dopingmittel aus einer Gruppe umfassend Anabolika, wie z.B. Testosteron und seine Derivate, Somatotropin, Ephe- drin-Derivate, Analeptika, wie z.B. Strychnin, Amphetamin-Derivate, Analgetika, Antitussi- va, Mittel zur Steigerung der Sauerstofftransportkapazität und der Sauerstoff Verfügbarkeit für die Skelettmuskulatur, wie z.B. Erythropoietin und/oder Diuretika, ausgewählt werden.
9. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Arzneimittel Analgetika oder Psychopharmaka aus einer Gruppe umfassend, Neuroleptika, wie z.B. Phenothiazin, Butyrophenone und/oder Thioxanthene, Antidepressiva, wie z.B. MAO (Monoaminoxidase)- Hemmer, Imipramin, Desipramin, Amitryptilin, etc., Tranquilizer, wie z. B. Benzodiazepine
(Diazepam), Barbiturate und/oder Psychoanaleptika, Stimulantien, wie z.B. Phenylethylamin, Antiepileptika und/oder Hypnotika, ausgewählt werden.
10. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß Antikörper, gebildet als Reaktion auf virale, viroide, bakterielle, mykotische, parasitäre bzw. auf Prionen basierende
Infektionen und/oder gebildet infolge von Immunisierungen (Impfung beim Menschen oder Tier bzw. polyklonale Antikörperherstellung bei Tieren) und/oder gebildet infolge von Autoimmunkrankheiten oder allergischen Reaktionen nachgewiesen werden.
11. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß Hormone, wie z.B. HCG
(human chorion Gonadotropin), nachgewiesen werden.
12. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Proteine Tumormarker aus einer Gruppe umfassend squamous cell carcinoma antigen (SCC), Thyreoglobin (Tg), Steroidhormonrezeptoren, Prostata-spezifisches Antigen (PSA), Neuronen-spezifische Enola- se (NSE), Carcinoembryonales Antigen (CEA), Alpha-Fetoprotein (AFP), CYFRA 21-1, CA 125, 19-9, 72-4, 15-3, MCA (Mucine-like cancer associated antigen) und/oder humanes Cal- citonin (hCT), nachgewiesen werden.
13. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß Intoxikationen verursacht durch Toxine aus einer Gruppe umfassend Botulinumtoxin, Toxine aus Pilzen, Bakterien, Algen, Pflanzen und ihren Bestandteilen, Lebensmitteln und/oder Toxine künstlichen Ursprungs, z.B. Kampfgifte, und/oder Schwermetalle nachgewiesen werden.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der zumindest eine Analyt aus einer biologischen Probe menschlichen, tierischen oder pflanzlichen Ursprungs, wie z.B. Blut, Plasma, Serum, Urin, Speichel, Schweiß, Sperma und/oder Blätter, nachgewiesen wird.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der zumindest eine Analyt von einer Oberfläche eines Gegenstandes oder eines menschlichen, tierischen oder pflanzlichen Körpers nachgewiesen wird.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der zumindest eine Analyt aus dem Boden, aus Wasser oder der Luft nachgewiesen wird.
17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine Konzentration des zumindest einen Analyten in der Probe ausgewählt aus einem Bereich mit einer unteren Grenze von 0,01 ng/ml, vorzugsweise 0,1 ng/ml, insbesondere 0,2 ng/ml und einer oberen Grenze von 1000 ng/ml, vorzugsweise 200 ng/ml, insbesondere 100 ng/ml nachgewiesen wird.
18. Vorrichtung zum Nachweis zumindest eines Analyten, insbesondere zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 17, mit einem oder mehreren kapillarfä- higen Materialien, auf denen zumindest eine Startzone und eine angrenzende Zone bestehend aus einem oder mehreren Feldern in dem oder denen zumindest ein immobilisiertes Reagens angeordnet ist, dadurch gekennzeichnet, daß auf dem oder den kapillarfähigen Materialien (3) zumindest ein analytspezifischer Bindungspartner (14), an welchen zumindest eine Substanz konjugiert ist, temporär immobilisiert ist.
19. Vorrichtung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß freie unspezifische Bindungsstellen auf dem einen oder mehreren kapillarfähigen Materialien (3) durch Reagenzien ausgewählt aus einer Gruppe umfassend Proteine, wie z. B. BSA, Milchpulver, Casein, Gelatine, fettfreies Milchpulver, Kälberserum, kommerzielle Blockungsreagenzien wie Blotto oder Superblock (Fa. Pierce), und/oder Detergenzien, wie z.B. Tween-20, Triton X-100, No- nidet P-40 und/oder Chaps, blockiert sind.
20. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz aus einer Gruppe umfassend alkalische Phosphatase, Peroxidase z.B. vom Meerret- tich, ß-Galactosidase, Streptavidin/Avidin, Protein A oder zu hochaffinen spezifischen Bindungen befähigte Moleküle und/oder einem katalytisch wirkenden Stoff, ausgewählt ist.
21. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Zone (6) aus zumindest einem Feld ausgewählt aus einer Gruppe umfassend Analysefelder (10), Kontrollfelder (11), Lauffelder (9), Farbstofffelder (12) und/oder Konjugatfelder (8), besteht.
22. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß sich zumindest ein Feld mit Farbstoffkomponenten bzw. deren Vorstufen zwischen der Startzone und dem zumindest einen Analyse- und /oder Kontrollfeld (10, 11) befindet.
23. Vorrichtung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Farbstoffkomponenten bzw. deren Vorstufen aus einer Gruppe, umfassend Tyramin und dessen Derivate, X-Gal (5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-ß-D-Galactosid), S-Gal (3,4 Cyclohexenoesculetin-ß-D- Galactopyranosid), ONPG (o-Nitrophenyl-ß-D-Galactopyranosid), CPRG (Chlorophenol red- ß-D-Galactopyranosid), Bluogal (5-Brom-3-Indolyl-ß-D-Galactosid), MUGal (4-Methylum- belliferyl-ß-D-Galactopyranosid), NBT (Nitroblue Tetrazolium Chlorid), BGB? (5-Brom-4- Chlor-3-Indolylphosphat), PNPP (p-Nitrophenyl Phosphat), OPD (o-Phenylenediamine), ABTS (2,2'-Azino-di-(3-ethylbenz-thiazoline Sulfonic Acid), DAB (3,3-Diaminobenzidine), TMB (3,3 5'- Tetramethylbenzidine), Phenazinmethosulfat, Kaliumferrocyanid, Kalium- ferricyanid, Ferne Ammoniumeitrat, VectorBlack™, Chemilumineszenzfarbstoffe, wie z.B. Galacton-Star Substrat, Lumi-Phos™ plus, LuciGLO™ , DuoLuX™, Lumigen PS-3, chemi- luminescent HRP (horseradishperoxidase) Substrat, 2 Component System from BioFX™, und/oder Lumi-Gal 530 und/oder Fluoureszenfarbstoffe, z.B. 3-Carboxyumbelliferyl-ß-D- Galactopyranosid (CUG) und/oder MUP (4-Methylumbelliferyl-Phosphat), ausgewählt sind.
24. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der Farbstoffkomponenten und deren Vorstufen, jeweils in Gew-%, aus einem Bereich mit einer unteren Grenze von 0,1 %, insbesondere 1 %, vorzugsweise 2 %, und einer oberen Grenze von 20 %, insbesondere 10 %, vorzugsweise 4 %, ausgewählt ist.
25. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 22 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß auf dem zumindest einen Farbstoffeid (12) Stoffe, ausgewählt aus einer Gruppe umfassend, Bo- vines Serum Albumin (BSA), Casein, Gelatine, Maltodextrin (Maltrin), Milchpulver und/oder das Reagens und/oder Bestandteile des Reagens nach einem der Ansprüche 35 bis 56 vorhan- den sind.
26. Vorrichtung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der Stoffe, jeweils in Gew-%, aus einem Bereich mit einer unteren Grenze von 0,1 %, insbesondere 1 %, vorzugsweise 5 %, und einer oberen Grenze von 50 %, insbesondere 30 %, vor- zugsweise 10 %, ausgewählt ist.
27. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß im Kontrollfeld (11) zumindest ein spezifischer Bindungspartner (14) für die zumindest eine Substanz immobilisiert ist.
28. Vorrichtung nach Ansprach 27, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des substanzspezifischen Bindungspartners aus einem Bereich mit einer unteren Grenze von 0,5 ng/ml, insbesondere 1 ng/ml, vorzugsweise 2 ng/ml, und einer oberen Grenze von 5 mg/ml, insbesondere 3 mg/ml, vorzugsweise 1 mg/ml, ausgewählt ist.
29. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß das Kontrollfeld distal vom Analysefeld in bezug auf die Startzone angeordnet ist.
30. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß im Analysefeld (10) eine vorbestimmbare Menge des zumindest einen Analyten (13) immobilisiert ist.
31. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 30, dadurch gekennzeichnet, daß der zumindest eine Analyt (13) aus einer Gruppe nach einem der Ansprüche 5 bis 13 ausgewählt ist.
32. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 30 oder 31 , dadurch gekennzeichnet, daß die Menge des zumindest einen Analyten (13) aus einem Bereich mit einer unteren Grenze von 0,5 ng/ml, insbesondere 1 ng/ml, vorzugsweise 2 ng/ml, und einer oberen Grenze von 5 mg/ml, insbesondere 3 mg/ml, vorzugsweise 1 mg/ml, ausgewählt ist.
33. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 30 bis 32, dadurch gekennzeichnet, daß der zumindest eine Analyt (13) in einer Verdünnungsreihe mit unterschiedlichen Konzentrationen vorliegt, wobei jeweils eine Konzentration der Verdünnungsreihe in einem vorbestimmbaren Analysefeld (10) vorliegt.
34. Vorrichtung nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des zumindest einen Analyten (13) in der Verdünnungsreihe mit einem Faktor, ausgewählt aus einem Bereich mit einer unteren Grenze von 1, insbesondere 2, und einer oberen Grenze von 100, insbesondere 10, vorzugsweise mit einem Faktor 5 abnimmt.
35. Reagens zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagens aus zumindest einem Alkohol und/oder Keton und/ oder zumindest einer Pufferlösung und/oder zumindest einem Detergens und/oder zumindest einem Konservierungsmittel besteht.
36. Reagens nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagens mit zumindest einem analytspezifischen Bindungspartner (14) hergestellt ist.
37. Reagens nach einem der Ansprüche 35 oder 36, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagens mit einer oder mehreren Farbstoffkomponenten oder deren Vorstufen hergestellt ist.
38. Reagens nach Ansprach 37, dadurch gekennzeichnet, daß die eine oder mehreren Farbstoffkomponenten bzw. deren Vorstufen aus einer Gruppe, umfassend Tyramin und dessen Derivate, X-Gal (5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-ß-D-Galactosid), S-Gal (3,4 Cyclohexenoe- sculetin-ß-D-Galactopyranosid), ONPG (o-Nitrophenyl-ß-D-Galactopyranosid), CPRG (Chlorophenol red-ß-D-Galactopyranosid), Bluogal (5-Brom-3-Indolyl-ß-D-Galactosid), MUGal (4-Methylumbelliferyl-ß-D-Galactopyranosid), NBT (Nitroblue Tetrazolium Chlorid), BCIP (5-Brom-4-Chlor-3-Indolylphosphat), PNPP (p-Nitrophenyl Phosphat), OPD (o- Phenylenediamine), ABTS (2,2'-Azino-di-(3-ethylbenz-thiazoüne Sulfonic Acid), DAB (3,3- Diaminobenzidme), TMB (3,3 '5,5'- Tetramethylbenzidine), Phenazinmethosulfat, Kaliumfer- rocyanid, Kaliumferricyanid, Ferne Ammoniumeitrat, VectorBlack™, Chemilumineszenzfarbstoffe, wie z.B. Galacton-Star Substrat, Lumi-Phos™ plus, LuciGLO™ , DuoLuX™, Lumigen PS-3, chemiluminescent HRP (horseradishperoxidase) Substrat, 2 Component System from BioFX™, und/oder Lumi-Gal 530 und/oder Fluoureszenfarbstoffe, z.B. 3-Car- boxyumbelliferyl-ß-D-Galactopyranosid (CUG) und/oder MUP (4-Methylumbelliferyl- Phosphat), ausgewählt sind.
39. Reagens nach einem der Ansprüche 37 oder 38, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der Farbstoff komponenten, jeweils in Gew.-%, aus einem Bereich mit einer unteren Grenze von 0,01 %, insbesondere 0,1 %, vorzugsweise 1 %, und einer oberen Grenze von 20 %, insbesondere 10 %, vorzugsweise 4 %, ausgewählt ist.
40. Reagens nach einem der Ansprüche 35 bis 39, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest ein Stoff ausgewählt aus einer Gruppe umfassend, Bovines Serum Albumin (BSA), Casein, Gelatine, Kälberserum, Maltodextrin (Maltrin), Milchpulver und/oder kommerzielle
Blockungsreagenzien, wie z.B. Blotto oder Superblock, enthalten ist.
41. Reagens nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der Substanzen, jeweils in Gew-%, aus einem Bereich mit einer unteren Grenze von 0,1%, insbeson- dere 1 %, vorzugsweise 5 %, und einer oberen Grenze von 30 %, insbesondere 20 %, vorzugsweise 10 %, ausgewählt ist.
42. Reagens nach einem der Ansprüche 35 bis 41, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagens aus einwertigen Alkoholen, ausgewählt aus einer Gruppe umfassend Methanol, Ethanol, Propanol, Butanol und/oder Pentanol, herstellbar ist.
43. Reagens nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der einwertigen Alkohole, jeweils in Gew-%, aus einem Bereich mit einer unteren Grenze von 0,5 %, insbesondere 5 %, vorzugsweise 10 %, und einer oberen Grenze von 40 %, insbeson- dere 30 %, vorzugsweise 20 %, ausgewählt ist.
44. Reagens nach einem der Ansprüche 35 bis 43, dadurch gekennzeichnet, daß mehrwertige Alkohole, wie z.B. Ethylenglykol, Polyethylenglykol und/oder Glycerin zugefügt sind.
45. Reagens nach Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der mehrwertigen Alkohole, jeweils in Gew-%, aus einem Bereich mit einer unteren Grenze von 0,1 %, insbesondere 2 %, vorzugsweise 5 %, und einer oberen Grenze von 20 %, insbesondere 15 %, vorzugsweise 10 %, ausgewählt ist.
46. Reagens nach einem der Ansprüche 35 bis 45, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagens aus Ketonen mit 3 bis 8 Kohlenstoffatomen, wie z.B. Propanon, Butanon, Pentanon, Hexanon, Heptanon und/oder Octanon, herstellbar ist.
47. Reagens nach Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der Ke- tone, jeweils in Gew-%, aus einem Bereich mit einer unteren Grenze von 0,1 % , insbesondere 2 %, vorzugsweise 5 %, und einer oberen Grenze von 20 %, insbesondere 15 %, vorzugsweise 10 %, ausgewählt ist.
48. Reagens nach einem der Ansprüche 35 bis 47, dadurch gekennzeichnet, daß als weiterer Bestandteil zumindest eine Pufferlösung, ausgewählt aus einer Gruppe umfassend Citrat- puffer, Acetatpuffer, Maleatpuffer, Phosphatpuffer, Collidinpuffer, Triethanolamin-HCl- EDTA-Puffer, Trispuffer, Ammediolpuffer, Glycinpuffer, Diethanolaminpuffer oder Tris- Borsäure-EDTA-Puffer oder Puffer nach Good, N. E. et al. (1966) Biochemistry 5, 467 ent- halten ist.
49. Reagens nach Ansprach 48, dadurch gekennzeichnet, daß der pH- Wert der Pufferlösung ausgewählt aus einem Bereich mit einer unteren Grenze von 5,5, vorzugsweise 6,0 und insbesondere 6,5 hat und mit einer oberen Grenze von 9,5, vorzugsweise 9,0, insbesondere 8,5, beträgt.
50. Reagens nach Ansprach 48 bis 49, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der zumindest einen Pufferlösung, jeweils in Gew-%, aus einem Bereich mit einer unteren Grenze von 0,1 %, insbesondere 1 %, vorzugsweise 2 %, und einer oberen Grenze von 20 %, insbesondere 15 %, vorzugsweise 10 %, ausgewählt ist.
51. Reagens nach einem der Ansprüche 35 bis 50, dadurch gekennzeichnet, daß als Detergens zumindest ein Vertreter ausgewählt aus einer Gruppe umfassend (Octylphenoxyl)- polyethoxyethanol, Alkylphenolpolyglycolether, Tween 20, Natriumdeoxycholat, Nonidet P- 40 (Igepal CA-630), Triton X-100, Cholic acid, Deoxycholic acid und/oder Zwittergent® zugefügt ist.
52. Reagens nach Anspruch 51, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des zumindest einen Detergens, jeweils in Gew-%, aus einem Bereich mit einer unteren Grenze von 0,001 %, insbesondere 0,005 %, vorzugsweise 0,01 %, und einer oberen Grenze von 1 %, insbesondere 0,5 %, vorzugsweise 0,2 %, ausgewählt ist.
53. Reagens nach einem der Ansprüche 35 bis 52, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest ein Stoff ausgewählt aus einer Gruppe umfassend Natriumsalze, Kaliumsalze, Phos- phatsalze, Magnesium- und/oder Mangansalze, Bovines Serum Albumin (BSA), Casein, Gelatine, Maltodextrin, Kälberserum und/oder Milchpulver, zugesetzt sind.
54. Reagens nach Ansprach 53, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der Stoffe, jeweils in Gew-%, aus einem Bereich mit einer unteren Grenze von 0,001 %, insbe- sondere 0,1 %, vorzugsweise 1 %, und einer oberen Grenze von 30 %, insbesondere 20 %, vorzugsweise 10 %, ausgewählt ist.
55. Reagens nach einem der Ansprüche 35 bis 54, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest ein Konservierungsmittel, ausgewählt aus einer Gruppe umfassend Natriumazid, Natri- umbenzoat, Sorbinsäure, Pentachlorophenol, Sorbat und/oder Konservierungsmittel auf Quecksilber-Basis, zugesetzt ist.
56. Reagens nach Anspruch 55, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des Konservierungsmittels, jeweils in Gew-%, aus einem Bereich mit einer unteren Grenze von 0,01 %, insbesondere 0,05 %, vorzugsweise 0,1 %, und einer oberen Grenze von 5 %, insbesondere 3 %, vorzugsweise 1 %, ausgewählt ist.
57. Analysekit umfassend zumindest ein saugfähiges Material, ein Reagens zur Aufnahme zumindest eines Analyten (13) und eine Vorrichtung (1) aus kapillarfähigem Material, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagens nach einem der Ansprüche 35 bis 56 und die Vorrichtung (1) nach einem der Ansprüche 18 bis 34 ausgebildet ist.
58. Verwendung der Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 34 für den Nachweis zumindest eines Analyten.
59. Verwendung des Reagens nach einem der Ansprüche 35 bis 56 für den Nachweis zumindest eines Analyten.
60. Verwendung des Analysekits nach Ansprach 57 für den Nachweis zumindest eines Analyten.
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