WO2003020755A1 - Gene env mute, glycoproteine env mutee et utilisations - Google Patents

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WO2003020755A1
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glycoprotein
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Frédéric Bedin
Frédéric REYNARD
Bernard Verrier
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Biomerieux SA
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    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • Acquired Immunodeficiency Syndrome is a viral disease of major importance in America, Europe, Africa and Asia. Infected individuals have severe immunosuppression and the disease can still be fatal although progress has been made with triple therapy. Transmission of the disease most often occurs through sexual contact and the use of intravenous drugs. The disease is transmissible from mother to child.
  • One of the causative agents of this disease is the HIV-1 retrovirus.
  • the HIV-1 genome has been fully characterized by ain-Hobson et al., 1985 (22); Ratner et al., 1985 (23); Muesing et al., 1985 (24); Sanchez-Pescador et al., 1985
  • HIV-1 are the gag, pol and env genes.
  • the env gene sequence encodes the Env protein which is synthesized in the form of a glycosylated precursor, gpl ⁇ O, which is cleaved by a cellular endoprotease into two subunits, the surface protein gpl20 and the transmembrane protein gp41. These two subunits remain linked noncovalently and the native glycoprotein anchored to the cytoplasmic membrane or to the viral envelope is very probably a trimer or possibly a tetramer of the gpl20 / gp41 complex, stabilized by interactions at the level of the extracellular domains of the gp41 subunits
  • primary isolates are generally much more resistant than laboratory strains to neutralization by antibodies and soluble forms of CD4. Indeed, epitopes such as the site of binding to the CD4 receptor and the V3 loop are not very accessible on the Env proteins of the primary isolates, while they are exposed on the surface of viruses adapted to culture. Consequently, the antibodies specific for these antigenic determinants effectively neutralize the adapted strains but not the primary isolates (1).
  • the resistance of primary isolates to neutralization is independent of the differential use of coreceptors between the adapted and primary strains. The few primary isolates that use only CXCR4 as a co-receptor are as difficult to neutralize as those using CCR5.
  • CTL cytotoxic CD8 + T lymphocytes
  • Envelope glycoproteins from primary isolates should be used, not TCLA laboratory strains. Make sure to present this protein to the immune system in its native oligomeric conformation.
  • New broad-spectrum neutralization epitopes must be identified due to the extraordinary adaptability of primary viruses to mutate to resist neutralization by an antibody. Indeed, in the humanized SCID mouse model, a therapeutic attempt consisting in the administration of a mixture of the three antibodies IgGlbl2, 2G12 and 2F5 selected, within a week, a viral subpopulation resistant to neutralization by each of the three antibodies (Poignard P. et al., 1999 (5)).
  • the HIV-1 envelope protein is highly glycosylated (50% of the total mass).
  • the sugars present on its surface provide, among other things, protection against the neutralizing response (Reitter J.N. et al., 1998 (6)).
  • Numerous studies have shown the role played by these residues in infectivity or protection. However, these studies, far from being systematic, have always taken into account glycosylation sites either independently of each other or on specific structural elements such as variable loops VI, V2, V3 or the N-terminal and C- ends protein terminal (6-8).
  • the inventors first put forward and verified the hypothesis that at the level of the sorting of hetero-dimers present on the surface of infected cells or of the virus, the most conserved potential glycosylation sites are grouped so as to protect important conformational elements for the virus.
  • Table 1 Alignment of the potential glycosylation sites on 13 sequences of primary isolates (PI) from patients with primary infection and 5 sequences of TCLA strain (deleted from the V1 / V2 loops)
  • IP IP
  • TCLA strain TC
  • CCR5 R5
  • CXCR4 X4
  • double tropism
  • NB the amino acid numbering is given in relation to the complete sequence.
  • the inventors then selected the most highly conserved glycosylation sites and positioned these conserved sites on the 3D structure of gpl20 (#PDB database: 1G9M) using PDB-Vie software (Glaxo-Welcorne).
  • Each sequence was analyzed independently. This analysis showed that the conserved sites had a layout comparable to the surface of the molecule, regardless of the sequence of the primary isolates.
  • groups or “glycosylation clusters” which correspond to groupings of the sites conserved on the surface of gpl20 from one primary isolate to another. These groups being defined, a list of deglycosylation mutants which takes these results into account has been established.
  • One of the glycosylation groups corresponds to a region located near the GPGS motif of the V3 loop (group gl4).
  • Another group (g112 / gl22) partially overlaps the glycosylation sites which define the neutralizing epitope 2G12 (Trkolla A. et al., 1996 (14)).
  • a third group is juxtaposed to a cavity in which are housed amino acids involved in the binding to co-receptors (group 1112).
  • a fourth group is located at the level of 4 anti-parallel beta sheets located at the junction of the two main areas of the gpl20 (Bridging sheet).
  • a fifth group is present on the “silent” side of gpl20 (group 113).
  • the controls consist either of the completely deglycosylated envelope gene for VI (6) or of a total deletion of the V1V2 loops.
  • two additional mutants gl23 and gll23 were defined which correspond to deglycosylations, not within the same cluster, but in each different “cluster” (one mutation per “cluster”).
  • At least one mutation was carried out on the selected sequences obtained from patient 133 (PHI133, accession number AF041126). Each mutation consists in replacing the asparagine of the potential glycosylation site (NXS / T) by a glutamine and this with the help of a mutagenesis kit directed according to the manufacturer's instructions (Quickchange Site-directed Mutagenesis Kit, Stratagene ). Each mutant was cloned into the expression vector pCI (Promega) and completely sequenced in order to verify the integrity of the sequence after mutagenesis. The purification of the mutant plasmids was carried out using the Nucleobond PC500 kit (Macherey-Nagel). Figure 1 shows the definition of clusters and the proximity of each site on the crystallized gpl20 molecule.
  • Table 2 summarizes the nature and positioning of each mutation for a specific mutant.
  • the reference amino acid sequences are the sequence of the Env protein of the deleted non-mutated HIV-1 133 isolate and the sequence of the Env protein of the complete non-mutated HIV-1 133 isolate. The amino acid correspondences are given in Table 2.
  • the amino acid sequence of the Env protein of the complete non-mutated isolate HIV-1 133 is identified in SEQ ID NO: 11 and the corresponding nucleotide sequence of the env gene of l the non-mutated (complete) HIV-1 133 isolate is identified in SEQ ID NO: 1.
  • sequences SEQ ID Nos 2 to 10 and SEQ ID Nos 12 to 20 which are listed below correspond respectively to the sequences of the env genes complete and truncated mutants of the HIV-1 133 isolate and to the sequences of the complete and truncated mutated Env proteins of the HIV-1 isolate 133.
  • the sequence of gpl60 is given with reference to SEQ ID NO: 11.
  • the sequence of gpl20 begins at amino acid 1 and ends at amino acid 498 with reference to SEQ ID NO: 11.
  • sequence of gpl40 (which corresponds to gpl20 plus the extracellular domains of gp41) begins at l amino acid 1 and ends at amino acid 669 with reference to the sequence SEQ ID NO: 11.
  • Table 2 characteristics of the different mutants of the 133 envelope sequence.
  • the position of the conserved glycosylation sites can vary from 1 to 8 amino acids and the invention encompasses these positioning variations.
  • Table 3 presents some examples of variation of the glycosylation sites and summarizes all the potential glycosylation sites in the env genes of the primary isolates 133, 146, 153, 159, 160, 374 and 384. The positions in amino acids are indicated for deleted sequences according to Kwong et al. 1998. Each row of the table corresponds to a potential site, the correspondence between the different positions was determined by an alignment of the deleted sequences. The glycosylation sites conserved in all the sequences are underlined.
  • the inventors then studied the antigenic and functional characteristics of each of these mutants and selected the mutants which have the best characteristics for preventive vaccination.
  • the mutants gl2, g112 and gl4 were selected. The results are presented in the examples and figures which follow.
  • sequence SEQ ID NO: 2 represents the nucleotide sequence of the gl2 mutant (env gene).
  • sequence SEQ ID NO: - 3 represents the nucleotide sequence of the truncated gl2 mutant which codes for gpl20.
  • sequence SEQ ID NO: 4 represents the nucleotide sequence of the gl2 mutant. truncated which codes for gpl40.
  • sequence SEQ ID NO: 5 represents the nucleotide sequence of the g112 mutant (env gene).
  • sequence SEQ ID NO: 6 represents the nucleotide sequence of the truncated g112 mutant which codes for gpl20.
  • sequence SEQ ID NO: 7 represents the nucleotide sequence of the truncated g112 mutant which codes for gpl40.
  • sequence SEQ ID NO: 8 represents the nucleotide sequence of the gl4 mutant (env gene).
  • sequence SEQ ID NO: 9 represents the nucleotide sequence of the truncated gl4 mutant which codes for gpl20.
  • sequence SEQ ID NO: 10 represents the nucleotide sequence of the truncated gl4 mutant which codes for gpl40.
  • sequence SEQ ID NO: 12 represents the amino acid sequence of the gl2 mutant (Env protein).
  • sequence SEQ ID NO: 13 represents the amino acid sequence of the g220 of the gl2 mutant.
  • sequence SEQ ID NO: 14 represents the amino acid sequence of the g240 of the gl2 mutant.
  • sequence SEQ ID NO: 15 represents the amino acid sequence of the g112 mutant (Env protein).
  • sequence SEQ ID NO: 16 represents the amino acid sequence of the gp120 of the g112 mutant.
  • sequence SEQ ID NO: 17 represents the amino acid sequence of the gp140 of the g112 mutant.
  • sequence SEQ ID NO: 18 represents the amino acid sequence of the gl4 mutant (Env protein).
  • sequence SEQ ID NO: 19 represents the amino acid sequence of the gpl20 of the gl mutant.
  • the sequence SEQ ID NO: 20 represents the amino acid sequence of the g440 of the gl4 mutant.
  • the gpl20 and gpl40 sequences are obtained either by truncation of the gene, or by insertion of a stop codon and / or a reading frame shift without deletion of the gene.
  • the gpl20 and gpl40 forms are soluble, therefore easier to purify and administer than the complete Env protein.
  • the subject of the present invention is a mutated env gene coding for a mutated envelope glycoprotein of the HIV-1 virus, said gene having, relative to the env gene, a primary isolate of primary infection, known as a reference, at least two mutations at the conserved glycosylation sites from one primary isolate to another, each mutation consisting in the replacement of an AAC or AAT codon which codes for an asparagine by a CAG or CAA codon which codes for a glutamine, both mutations at least being chosen from the following:
  • the gene consists of a sequence chosen from the sequences identified in SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 23 or their complementary sequences.
  • the gene comprises at least three mutations, namely at least two mutations in the part coding for the region C3 and at least one mutation in the part coding for the region V3: preferably, these mutations are carried out at the level of the codons 976-978, 991-993 and 880-882, the position of at least any one of said codons possibly varying from three to twenty-four nucleotides;
  • the sequence of the gene thus mutated consists of a sequence chosen from the sequences identified in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 or their complementary
  • At least one mutation is carried out at the level of codon 805-807 of the part coding for the region C2, the position of at least any one of said codons can vary from three to twenty-four nucleotides .
  • At least one mutation is carried out at the level of codon 880-882 of the part coding for the V3 region, the position of at least one any of said codons can vary from three to twenty-four nucleotides.
  • sequence of the mutated gene can also consist of a sequence chosen from the sequences identified in SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 or their complementary sequences.
  • the invention also relates to a mutated Env glycoprotein of the HIV-1 virus, which glycoprotein present, relative to a native Env protein of a primary isolate of primary infection, known as a reference, at least two mutations at the conserved glycosylation sites. of said reference protein, from one primary isolate to another, each mutation consisting in the replacement of an asparagine by a glutamine, the two mutations at least being chosen from the following:
  • the preferential mutations according to the invention are as follows.
  • the glycoprotein consists of a sequence chosen from the sequences identified in SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 23.
  • the glycoprotein comprises at least three mutations, preferably at least two mutations in the region C3 and at least one mutation in the region V3:
  • a mutated Env glycoprotein of the invention consists of a sequence chosen from the sequences identified in SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14; or at least one mutation is carried out at amino acid 326 or 331, at least one mutation is carried out at amino acid 347 or 354 and at least one mutation is carried out at amino acid 294, ; advantageously, the mutations are carried out at amino acids 326, 331, 294, 347 and 354; better still, a mutated Env glycoprotein of the invention consists of a sequence chosen from the sequences identified in SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17, it being understood that the position of said glycosylation sites conserved d '' a primary isolate of primary infection to another which can vary from one to eight amino acids. According to the mutations (c '), at least one mutation is carried out at amino acid 269 of the C2 region
  • At least one mutation is made at amino acid 294 of the V3 region.
  • a mutated Env glycoprotein of the invention may consist of a sequence chosen from the sequences identified in SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20.
  • the subject of the invention is also a pharmaceutical composition comprising:
  • mutated gene coding for a mutated envelope glycoprotein gpl20 of the HIV-1 virus, said mutated gene being chosen from any one of the genes described above and being placed under the control of regulatory sequences allowing its expression in a host cell, a pharmaceutically acceptable vehicle, and optionally an additional agent which facilitates the penetration of said mutated gene into said cell and / or which makes it possible to target said cell, or
  • targeting agent is meant a chemical or biological molecule which makes it possible to target said host cell in vivo. It can, inter alia, be a specific ligand, an anti-ligand naturally present at the level of the host cell or of the cellular compartment to be targeted, in particular present on the surface of said host cell, and it is possible to cite by way of example the antibodies as ligands and the antigens as anti-ligands.
  • an antibody is coupled to the active principle and is specific for a host cell surface antigen, it will act as a targeting agent for said host cell through the specific formation of an antibody / antigen complex.
  • agent which facilitates the penetration of said mutated gene into a host cell is meant, inter alia, agents such as bupivacaine and cardiotoxin.
  • pharmaceutically acceptable vehicle means, inter alia, liposomes, virosomes, nanoparticles, microparticles (example: gold beads), iscoms.
  • MVA Modified Vaccinia Ankara
  • alphaviruses SFV (Semliki Forest Virus)
  • adenoviruses adeno-Associated Virus
  • compositions defined above are particularly advantageous DNA vaccine compositions, in particular compared to the “conventional” vaccine compositions based on recombinant protein.
  • the vaccine use of recombinant proteins is a heavy system and expensive, in particular because it requires very important steps in the purification of the recombinant antigens.
  • one of the difficulties encountered is to obtain a persistence of the vaccine long enough to maintain a good immune memory.
  • the DNA vaccination method the advantages of which are inherent in the intrinsic properties of DNA, is simple and inexpensive and is carried out simply by intramuscular or intradermal injection.
  • the viral antigen is expressed in mammalian cells in its native conformation
  • DNA vaccines can easily be combined due to their physicochemical homogeneity.
  • the invention is not limited to a DNA vaccine composition as defined above and also relates to a pharmaceutical composition comprising:
  • mutated envelope glycoprotein gpl20 of the HIV-1 virus said mutated glycoprotein being chosen from any one of the glycoproteins described above,
  • Such a prepared vaccine composition is injectable, that is to say in liquid solution or in suspension.
  • the preparation can also be emulsified.
  • the antigenic molecule i.e. mutated glycoprotein
  • excipients which are pharmaceutically acceptable and compatible with the active ingredient or principle. Examples of favorable excipients are water, saline, dextrose, glycerol, ethanol or the like and combinations thereof.
  • the vaccine may contain minor amounts of auxiliary substances such as wetting or emulsifying agents, pH buffering agents or adjuvants such as aluminum hydroxide, dipeptide muramyl or their variations, cationic polymers, nanoparticles cationic polymers or their variants (poly lactic acid, poly lactic acid - coglycoside).
  • auxiliary substances such as wetting or emulsifying agents, pH buffering agents or adjuvants such as aluminum hydroxide, dipeptide muramyl or their variations, cationic polymers, nanoparticles cationic polymers or their variants (poly lactic acid, poly lactic acid - coglycoside).
  • the vaccine is administered conventionally by injection, for example intramuscularly.
  • pharmaceutically acceptable vehicle means the supports and vehicles which can be administered to humans or to an animal, as described for example in Remington's Pharmaceutical Sciences 16 th ed., Mac Publishing Co.
  • the pharmaceutically acceptable vehicle is preferably isotonic, hypotonic or has low hypertonicity and has a relatively low ionic strength.
  • the definitions of pharmaceutically acceptable excipients and adjuvants are also given in Remington's Pharmaceutical Sciences supra.
  • the present invention also relates to a method for inducing an improved humoral and / or cellular response against the HIV-1 virus in a mammalian animal, according to which: a quantity of mammalian animal is administered by intramuscular or intradermal injection, sufficient to be effective, a DNA vaccine composition, comprising at least the mutated gene which codes for a mutated protein of the invention as defined above, or - A mammalian animal is administered by intramuscular or intradermal injection a quantity, sufficient to be effective, of a vaccine composition comprising at least the mutated protein of the invention as defined above.
  • the concentration of nucleic acid in the composition used for administration in vivo is approximately 100 ⁇ g / ml to 10 mg / ml, preferably 1 mg / ml.
  • the amount of protein administered depends on the addition or not of an adjuvant, but will generally be between 10 and 50 ⁇ g / ml of protein.
  • the vaccine is administered at a determined dose in one or more injection (s) intramuscularly or intradermally, followed by booster (s), if necessary.
  • the immunizing effect of the vaccine is followed by an assay of anti-HIV-1 antibodies in the individual or animal vaccinated.
  • nucleic acid (s) or protein (s) of interest or their fragment (s), alone or in combination, is used for prophylaxis and / or therapy.
  • a nucleic acid (s) or their fragments or a protein (s) or their fragments are administered, their characteristic is not to exhibit the virulence of HIV-1 but to have the property of inducing a response immune, humoral and / or cellular, in the individual or animal to which they are administered.
  • protein (s) these can be obtained by synthetic techniques or genetic recombination or by modification of natural protein (s) by chemical or physical treatments.
  • the protein (s) or their fragments, candidate (s) for the formulation of a vaccine are identified and analyzed in a functional test to ensure that they have lost their toxicity and for verify their immunogenicity (i) by carrying out an in vitro test for proliferation of CD44 T lymphocytes- specific for the administered antigen (T cell assay) or an in vitro test for cytotoxicity of CD84 lymphocytes- specific for the administered antigen and , (ii) by measuring, among other things, the level of circulating antibodies directed against the natural protein and their capacity to neutralize primary isolates. These modified forms are used to immunize men by standardized procedures with appropriate adjuvants.
  • the invention also relates to:
  • antibody polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, transmembrane antibodies and humanized antibodies or fragments of said antibodies.
  • the production of polyclonal and monoclonal antibodies is part of the general knowledge of those skilled in the art.
  • Bolelli GF Production of high-titer antibody to bile acids, Journal of Steroid Biochemistry, Vol. 13, pp. 449-454 (1980) for the production of polyclonal antibodies.
  • the immunogen can be coupled to Lymphet Keyhole hemocyanin (peptide KLH) as a carrier for immunization or to serum albumin (peptide SA).
  • the animals are injected with immunogen using complete Freund's adjuvant.
  • the sera and hybridoma culture supernatants from immunized animals are analyzed for their specificity and their selectivity using standard techniques, such as for example ELISA or Western Blot tests.
  • the hybridomas producing the most specific and sensitive antibodies are selected.
  • Monoclonal antibodies can also be produced in vitro by cell culture of the hybridomas produced or by recovery of ascites fluid, after intraperitoneal injection of the hybridomas in mice.
  • the antibodies are then purified.
  • the purification methods used are essentially filtration on an ion exchange gel and exclusion chromatography or affinity chromatography (protein A or G). A sufficient number of antibodies are screened in functional tests to identify the best performing antibodies.
  • the in vitro production of antibodies, antibody fragments or antibody derivatives, such as chimeric antibodies produced by genetic engineering is well known to those skilled in the art.
  • transmembrane antibody an antibody whose at least the functional region capable of recognizing and binding to its specific antigen is expressed on the surface of the target cells to allow said recognition and fixation. More particularly, the antibodies according to the present invention consist of fusion polypeptides comprising the amino acids defining said functional region and an amino acid sequence (transmembrane polypeptide) permitting anchoring within the double lipid membrane layer of the target cell or to the external surface of this bi -layer.
  • the nucleic sequences encoding many transmembrane polypeptides are described in the literature.
  • humanized antibodies are chimeric antibodies which comprise a minimal sequence derived from a non-human immunoglobulin.
  • humanized antibodies are human immunoglobulins (receptor antibodies) in which residues of a hypervariable region of the receptor are replaced by residues of a hypervariable region of a donor species (donor antibody), such as mouse, rat, rabbit or non-human primate, having the specificity, affinity and capacity desired.
  • donor antibody such as mouse, rat, rabbit or non-human primate
  • the residues (FR) of the Fv region of human immunoglobulin are replaced by corresponding non-human residues.
  • humanized antibodies may include residues which are not found in the recipient antibody or in the donor antibody. These modifications are made to improve the performance of the antibody.
  • the humanized antibody will comprise at least and preferably two variable domains, in which all or almost all of the hypervariable loops correspond to a non-human immunoglobulin and all or almost all of the FR regions will be those of an immunoglobulin. human.
  • the optionally humanized antibodies may also include at least part of a constant region (Fc) of an immunoglobulin, such as a human immunoglobulin (Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); and Presta et al., Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992).
  • antibody fragment By antibody fragment is meant fragments F (ab) 2, Fab, Fab ', sFv (Blazar et al., 1997, Journal of Immunology 159: 5821-5833 and Bird et al., 1988, Science 242: 423- 426) of a native antibody and by derivative means, among others, a chimeric derivative of a native antibody (see for example Arakawa et al., 1996, J. Biochem 120: 657-662 and Chaudray et al., 1989 , Nature 339: 394-397).
  • These antibodies can be incorporated into a pharmaceutical composition, in particular when they are neutralizing antibodies, in response to a viral infection by HIV-1 and the invention encompasses such a pharmaceutical composition.
  • the invention relates to a method for evaluating a therapeutic agent, according to which an animal is administered at least one mutated gene coding for a mutated envelope glycoprotein of the HIV-1 virus as described above and we carry out:
  • FIG. 2 represents the detection of gpl60 D and of gpl20 D in each cell lysate for each of the mutants produced and for the controls.
  • FIG. 3A represents the antigenicity tested in ELISA in cell lysates with respect to a pool of HIV positive sera and FIG. 3B represents the antigenicity tested in ELISA in culture supernatants with respect to the pool of HIV positive sera .
  • FIG. 4A shows the amount of CD4s detected in cell lysates and Figure 4B shows the amount of CD4s detected in culture supernatants.
  • FIG. 5A represents the recognition of the F105 epitope tested in ELISA in the culture supernatants and FIG. 5B represents the recognition of the F105 epitope tested in ELISA in cell lysates.
  • FIG. 6A represents the recognition of the CG10 epitope in the presence of CD4 tested by ELISA in cell lysates and FIG. 6B represents the recognition of the CG10 epitope alone (I) and in the presence of CD4 (D) tested by ELISA in culture supernatants.
  • FIG. 7A represents the recognition of the epitope 17b alone (D) and in the presence of CD4 (D) tested in ELISA in the cell lysates and
  • FIG. 7B represents the recognition of the epitope 17b alone (D) and in the presence of CD4 (D) tested in ELISA in the culture supernatants.
  • FIG. 8 illustrates the neutralization of the FR virus (primary virus X4) on Hela P4PCCR5 cells by the serum of mice immunized with different constructs (Example 4).
  • FIG. 9 illustrates the infection with pseudoparticles carrying the mutated glycoproteins identified in table 2, of GHOST-CCR5 and GHOST-CXCR4 cells.
  • FIG. 10 illustrates the neutralization of the pseudo-particles carrying the glycoproteins mutated by a neutralizing human CRI / LY serum.
  • Example 1 Expression and cleavage.
  • 293T cells (kidney epithelial cells) are co-transfected with each of the PCI-env constructs and the PCI-rev expression plasmid using the Lipofectamine-Plus kit (Gibco-BRL) according to the manufacturer's instructions.
  • Rev is an HIV-1 regulatory protein that plays an important role in the expression of the envelope protein.
  • the culture supernatant and the cells are recovered and tested in Western blot with a polyclonal sheep anti-gpl20 antibody (Biogenesis) diluted to 1/5000. For this, the samples are deposited on a denaturing gel of 8% acrylamide.
  • the samples are transferred to a PVDF membrane (ImmobilonP, Amersham) according to the manufacturer's instructions.
  • the normalization of the samples was made with an anti-Actin monoclonal antibody diluted to 1/5000 (A4700, Sigma) and anti-Rev 2D4D10 diluted to 1/5000 (bioMérieux).
  • For the supernatants normalization was made according to the serum albumin level of the culture medium.
  • the blots are revealed using the ECF kit (Amersham) and the bands revealed are quantified on Typhoon 8600 using ImageQuant software. All constructions express a protein that reacts with the anti-gpl20 polyclonal.
  • mutant proteins are affected by the loss of one or more glycosylations.
  • the decrease in gpl20 detected in the cell lysate is associated with the increase in the number of mutations ( Figure 2).
  • the specific band is totally absent (mutants glll2, gl22, gl3, gll3, gl4, gl23, gll23 and DV1V2). It is also absent from the corresponding culture supernatant: one might think that the cleavage rate is affected.
  • Moulard (15) has described this phenomenon which he associates with a bad translocation in the RE and / or a folding defect preventing the accessibility of the cutting site.
  • gpl20 is detected in the supernatant (approximately 8x more than the native protein, at the amount of normalized proteins) while this is not detected in the cell lysate. It therefore seems that the mutations present on this clone affect the interactions between them which bind the subunits of the envelope and not the cleavage rate of gpl60.
  • the cleavage rate for the single mutants is generally comparable to that observed for the native envelope (except for the g21 mutant). It is interesting to note that in comparison the mutant corresponding to the total deglycosylation of the loop VI seems little affected by the loss of 3 glycosylations.
  • Example 2 Ability of the mutants to form syncytia in vi tro.
  • the 293T cells which express the various mutants are subcultured at 1/10 and placed in the presence of GHOST-CCR5 or -CxCR4 cells at 50% density.
  • the cells are fixed for 15 minutes with 0.5% glutaraldehyde, then the nuclei and the cytoplasms are stained in May-Gr ⁇ nwald / Giemsa. Observation and counting of the syncytia formed is assessed by observation with an inverted optical microscope.
  • the ability to induce syncytia is reduced when the number of mutations is increased. It is null for the clones which are not cleaved (gll3, gll23 and perhaps glll2). This result confirms the previous results and gives an indication of the maintenance of the functionality of the various envelopes after mutation.
  • the constructs do not induce the formation of syncytia on CXCR4 indicator cells, as has been demonstrated by Pollakis (16) after partial deglycosylation of the V3 loop of gpl60 ADA.
  • Table 4 Ability of the envelope mutants to form syncytia in vi tro.
  • the lysates and the supernatants were tested in capture ELISA with a pool of H Vt- sera coming from the Croix-Rousse hospital in Lyon. This pool of sera consists of 2 subtype B samples and a subtype C sample. All ELISA results correspond to the average of 2 duplicate experiments.
  • the format of the test is as follows:
  • the supernatants are captured by the antibody D7324; lysates are captured either by D7324 or by 12G11B10.
  • the latter was mainly used because the D7324 epitope is little exposed on non-cleaved gpl60 and the signal detected then depends on the cleavage rate of the different mutants.
  • 2G12 is a human monoclonal antibody obtained by electrofusion of PBL HIV + and CB-F7 cells (17). It has a broad spectrum neutralizing power on primary isolates and certain TCLA viruses. The epitope recognized by this antibody is discontinuous and mainly covers the V3 and V4 regions as well as certain sugars present in these regions. The recognition of 2G12 was tested in ELISA on cell lysates and on the supernatants of the various mutants. The format of the test is the same as the previous one, except for the detection antibody which is 2G12 (l ⁇ g / l). No positive signal is detected even for the 133-native protein. This result confirms results obtained in RIPA and in ELISA by the team of D. Brand (Tours) on the envelope 133. Parren, in 1998, described a primary isolate resistant to the three neutralizing antibodies 2G12, 2F5 and B12. His results indicate that this resistance is probably due to an overall change in the oligomeric structure of the envelope.
  • the envelope glycoprotein has the ability to bind CD4 with high affinity. This bonding capacity is essential in the infection process.
  • CD4s diluted to I ⁇ g / ml in PBSlx-Tween 0.1% -BSA 20 ⁇ g / ml; 2 hour incubation at 22 ° C.
  • the quantity of CD4s detected varies in the same way on the lysates and on the supernatants (FIG. 4).
  • the signal intensity is a function of the number of deglycosyl sites except for the gl2 and gl4 mutants which correspond to double mutations.
  • Clones corresponding to envelope proteins whose antigenicity or cleavage rate are reduced have a low signal (gl22, gl3, gll3, gl23 and gll23).
  • IgGlbl2 epitope This human monoclonal antibody is described as having a significant neutralizing activity both on primary isolates (clade AD) and on laboratory strains.
  • the epitope is discontinuous and covers the CD4 binding site. Recognition is preferably done on oligomers on the surface of infected cells or viruses, at the expense of "debris" which prevents an effective neutralizing response. No positive signal was noted whatever the clones tested. This is in agreement with the preliminary results of D. Brand on envelope 133.
  • IgGlbl2 is described as being very sensitive to substitutions at the level of loops VI and V2. Certain amino acids in regions C2 and C3 are also described as playing a crucial role in the recognition of the bl2 epitope (18).
  • the 133 envelope has an atypical protein sequence compared to other envelope proteins of the same subtype. Recognition of the F105 epitope (see Figure 5).
  • the human monoclonal antibody F105 binds near the CD4 binding site. CD4s can inhibit its binding.
  • the F105 antibody neutralizes the TCLA strains. Some authors have described neutralization for some primary isolates (19), but the results are very controversial.
  • the binding of this antibody was tested on the lysates and the supernatants.
  • the format of the test is the same as that used with the 2G12.
  • the F105 antibody (NIBSC) is used at a concentration of l ⁇ g / ml.
  • An important signal is noted for the clone gl2 (up to 4.5 times the signal of the native protein with an equivalent amount of protein).
  • the mutation n ° 294 present on gl2 (but not on g2) is located at the level of the V3 loop; it is known that the attachment of F105 to glycoproteins deleted for V3 is improved.
  • Other mutations appear to have a crucial role in the recognition of the protein by the antibody. This is the case with mutation No.
  • the binding of CD4 induces changes in conformation and allows the formation of de novo epitopes whose emergence conditions the binding of the co-receptor.
  • CG10 is a murine monoclonal antibody capable of neutralizing certain TCLA strains. It binds near the "bridging-sheet" in competition with the 17b. Its fixation is strictly dependent on CD4 (21).
  • the ELISA used has the following format: Coating: D7324 (supernatants) or 12G11B10
  • Anti-mouse IgG conjugate coupled with peroxidase diluted to 1/5000 in PBSlx-Tween 0.1% - BSA 20 ⁇ g / ml
  • the ELISA results show good recognition of the CG10 epitope in the presence of CD4s and for the majority of the envelope proteins with the exception of the mutants gl22, gl3, gll3, gl23 and gll23.
  • the signal correlates well with the rate of binding to CD4s (see Figure 5).
  • 17b is a human monoclonal antibody directed against a CD4-induced epitope. It has limited neutralizing activity for both primary isolates and TCLA strains. If the exposure of the epitope does not strictly depend on the fixation of CD4 it is nevertheless improved by its presence.
  • the ELISA format used is the same as for CG10.
  • Antibody 17b is used at a concentration of l ⁇ g / ml. The detection is done with an anti-human FG IgG antibody coupled to peroxidase and diluted to 1/5000 (Jackson).
  • the immunogenicity of the gl2 and gll2 mutants must be good.
  • the mutants of the g4 / gl4 series are interesting because they have good reactivity with respect to the various antibodies tested.
  • Example 4 Selection of a Panel of Mutants and Evaluation of the Neutralizing Power of the Antibodies Generated After Immunization of Balb / C Mice
  • the following panel of mutants was chosen.
  • the gl3 mutant was also evaluated because of the cluster positioning of the mutated sites on the "silent" side of the external domain of gpl20.
  • the mutant gl23 (noncluster mutant), as well as the wild envelope gene, were used as references.
  • Each envelope gene was subcloned into a pCi-Rev vector which is derived from the pCi-Neo vector (Promega) by replacing the neomycin gene with the rev gene which is then under the dependence of the SV40 promoter.
  • Each construct was prepared with an endotoxin-free plasmid extraction kit (Macherey-Nagel PC2000 EF).
  • the immunizations were carried out as follows: for each construction, 5 female Balb / C mice were immunized by biolistics (GeneGun, Biorad) using gold particles previously coated with 4 ⁇ g of plasmid to be injected. Five successive injections took place on D0, D14, D28, D54 and D68. On D40 and D80 blood samples are taken from the eye of the animals. These samples were used to test the rise of the antibodies directed against the envelope after the various immunizations. To do this,
  • ELISAs were performed: gpl60 envelope protein
  • mice diluted to l ⁇ g / ml was adsorbed on 96-well plates (Nunc). After saturation of the non-specific sites, the sera of the mice immunized on days D0, D40 and D80 are used at dilutions ranging from 1/100 to 1/800, then revealed by an antibody directed against the mouse antibodies coupled to the peroxidase of horseradish (Jackson). A OD read greater than 0.35 is considered significant. Table 5 below summarizes the positive mice obtained, for each construct. Table 5
  • mice The sera of these mice were used in two neutralization tests described below: a- The FR virus (primary virus X4) was brought into contact with serial dilutions (at l / 10 le l / 20 d and 1/40 th ) of the various mouse sera for 1 h at 37 ° C. in DMEM medium (Euromedex) then added to 96-well plates in which Hela P4PCCR5 cells were previously cultured. These cells have the CD4 receptor and the CCR5 and CXCR4 co-receptors. They have the gene for B-galactosidase, dependent on a retroviral LTR. After 1 hour of co-culture, 200 ⁇ l of DMEM medium containing 5% fetal calf serum are added.
  • DMEM medium containing 5% fetal calf serum
  • the cells are then incubated for 48 hours at 37 ° C. At the end of these 24 hours, the expression of the B-galactosidase is revealed using a solution of X-gal at 400 ⁇ g / ml of 0.2M potassium ferricyanide / 0.2M potassium ferrocyanide 0.2M / MgCl 2 2M.
  • the percentage of neutralization corresponds to the percentage of uninfected cells, for which the synthesis of B-Galactosidase was not induced. Tests were carried out in parallel with virus but without mouse serum (infection control) or with serum from non-immunized mice (neutralization background noise control, Tneg). The results obtained are summarized in Table 6 below and Figure 8.
  • mice positive in ELISA (respectively S3 / S4 and S3 / S4) give a significant neutralizing response at the 1/10 dilution (70% of neutralization). This percentage is lower for a 1/20 dilution and joins the background noise value for a 1/40 dilution, except for the S3 mouse immunized with pCI-rev-gl2 whose value is slightly higher (40%).
  • the plasmid pNL4-3luc makes it possible to express all the viral genes except vpr and env (frame hopping) as well as the Luciferase gene.
  • viral pseudo-particles carrying the recombinant 133 wild envelopes are formed. Forty-eight hours after transfection, the culture supernatants are recovered and centrifuged in order to remove the debris. cell. They are then supplemented with 20% fetal calf serum, aliquoted and stored at -80 ° C.
  • An assay of p24 carried out on the VIDAS automated system (bioMérieux), makes it possible to evaluate the quantity of viral particles present in these supernatants.
  • Example 5 Evaluation of the functionality of all deglycosylation mutants: infection with pseudo-viruses and attempts to neutralize this infection with HIV-1 positive human sera.
  • Obtaining pseudoparticles expressing the different deglycosylation mutants is important because it makes it possible to study the envelope protein in its natural context, ie integrated into a viral particle.
  • 293T cells were co-transfected with each of the mutated pCI-env constructs (deglycosylation mutants, see list in Table 2) and with the plasmid pNL4-3 read (NIH AIDS Research and Reference Reagent Program) according to the protocol described in Example 1 above.
  • the culture supernatants are recovered and centrifuged in order to remove the cellular debris. They are then supplemented with 20% fetal calf serum, aliquoted and stored at -80 ° C.
  • An assay of p24 carried out on the VIDAS automated system (bioMérieux), makes it possible to evaluate the quantity of viral particles present in these supernatants.
  • GHOST-CCR5 or -CXCR4 cells The infection of GHOST-CCR5 or -CXCR4 cells (NIH AIDS Research and Reference Reagent Program) is carried out overnight, in 24-well culture plates, by contact with a volume of supernatant corresponding to 50 ng of p24 per well. The culture medium is then renewed. After an additional 3 days of incubation, the supernatants are eliminated, the cells are rinsed with PBS IX and lysed with 300 ⁇ l of CCLR (Cell Culture Lysis Reagent from Promega) for 15 minutes. A volume of 20 ⁇ l of these lysates is brought into contact with 80 ⁇ l of substrate
  • Env is detected only in the pseudo-particles that infect GHOST cells: when the number of deglycosyl sites is increased, the export of the envelope protein to the plasma membrane as well as the incorporation of the envelope into the pseudo -particles seem to be affected.
  • the infection is carried out in 96-well plates by contact with a volume equivalent to 10 ng of p24. Lysis and enzymatic reaction are carried out with the LucLite Plus kit (Perkin Elmer). The luminescence is read on a TopCount plate reader (Packard Biosciences). The results are illustrated in FIG. 10.
  • the “negative serum” curve corresponds to an experiment carried out on pseudo-virions expressing the wild envelope placed in the presence of a negative HIV-1 serum (CTS Lyon-Gerland). It is the curve determining the background noise. Neutralization is effective for a dilution of serum greater than 1/640 th . These results show that the pseudo-particles are neutralized differently depending on the envelope expressed on their surface.
  • the g30 and g22 mutants see their percentage of infection significantly reduced compared to the wild envelope (not mutated). Even if there is no direct correlation between this experience and the capacity of such a mutant to induce neutralizing antibodies in vivo, the g22 mutant could be an interesting candidate to test for its capacity to induce neutralizing antibodies after immunization. DNA of small animals.

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Abstract

Gène env muté codant pour une glycoprotéine d'enveloppe mutée du virus VIH-1, ledit gène présente par rapport au gène env d'un isolat primaire de primo-infection, dit de référence, au moins deux mutations au niveau des sites de glycosylation conservés d'un isolat primaire ô un autre, chaque mutation consistant en le remplacement d'un codon AAC ou AAT qui code pour une asparagine par un codon CAG ou CAA qui code pour une glutamine, les deux mutations au moins étant choisies parmi les suivantes :(a) au moins deux mutations dans la partie du gène env codant pour la région C3 de la protéine env,(b) au moins une mutation dans la partie codant pour la région C3 et au moins une mutation dans la partie codantpour la région V3,(c) au moins une mutation dans la partie codant pour la région C2 et au moins une mutation dans la partie codantpour la région V3 choisie parmi les sites de glycosylation au niveau des codons 862-864 et 970-972,(d) au moins une mutation dans la partie codant pour la région C2 choisie parmi les sites de glycosylation au niveau des codons 667-669, 679-681, 700-702, 763-765, 844-846, et au moins une mutation dans la partie codant pour la région V3, ou le gène env muté consiste en l'une quelconque des séquences SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 10 ou leurs séquences complémentaires, Glycoprotéine Env mutée, et utilisation du gène et de la glycoprotéine dans une composition pharmaceutique, pour obtenir des anticorps et pour évaluer un agent thérapeutique.

Description

GENE ENV MUTE, GLYCOPROTEINE ENV MUTEE ET UTILISATIONS
Le syndrome d' immunodéficience acquise (S.I.D.A) est une affection virale qui présente une importance majeure en Amérique, en Europe, en Afrique et en Asie. Les individus infectés présentent une immunodépression sévère et la maladie peut encore être fatale bien que des progrès aient été faits grâce à le trithérapie. La transmission de la maladie s'effectue le plus souvent par contact sexuel et par utilisation de stupéfiants par voie intraveineuse. La maladie est transmissible de la mère à l'enfant. Un des agents causals de cette maladie est le rétrovirus VIH-1. Le génome du VIH-1 a été caractérisé de façon complète par ain-Hobson et al., 1985 (22) ; Ratner et al., 1985 (23) ; Muesing et al., 1985 (24) ; Sanchez-Pescador et al., 1985
(25) . Les trois parties les plus importantes du génome du
VIH-1 sont les gènes gag, pol et env. La séquence du gène env code pour la protéine Env qui est synthétisée sous la forme d'un précurseur glycosylé, la gplβO, qui est clivé par une endoprotease cellulaire en deux sous unités, la protéine de surface gpl20 et la protéine transmembranaire gp41. Ces deux sous unités restent liées de manière non covalente et la glycoprotéine native ancrée à la membrane cytoplasmique ou à l'enveloppe virale est très probablement un trimère ou éventuellement un tétramère du complexe gpl20/gp41, stabilisé par des interactions au niveau des domaines extracellulaires des sous-unités gp41
(Mclnerney T.L et al., 1998 (5)). De par sa complexité structurale, la protéine Env est très difficile à purifier dans sa conformation native.
La mise au point d'un vaccin contre le V H-1 a focalisé des efforts internationaux soutenus depuis la découverte du virus en 1983. Aujourd'hui, après presque 20 années de recherches actives, non seulement il n'existe pas de vaccin crédible, mais de nombreuses équipes cherchent encore à identifier des approches vaccinales raisonnablement utilisables. Les stratégies classiques, à savoir l'utilisation de souches atténuées ou de virus inactivés ont été exclues ; les risques liés à l'emploi d'un rétrovirus réplicatif étant trop importants pour envisager une utilisation chez l'homme. Comme il n'existe aucun cas documenté de guérison naturelle de l'infection chez l'homme, les facteurs immunitaires de la protection n'ont pas pu être identifiés avec assurance. Pour un certain nombre d'infections virales, comme par exemple le virus de la rougeole ou le virus de la grippe, le principal facteur de protection est l'induction d'une réponse humorale neutralisante, c'est-à-dire d'anticorps dont la fixation sur la particule virale bloque l'entrée dans la cellule cible. Pour cette raison, les efforts pour le développement d'un vaccin contre le VIH-1 se sont concentrés initialement sur cette approche visant à induire des anticorps neutralisants. Dans de telles stratégies vaccinales, la glycoprotéine d'enveloppe virale (Env) constitue un immunogène de choix, parce qu'elle est la principale, voire l'unique, cible de la réponse neutralisante. Pourtant, les essais de vaccination réalisés avec les protéines d'enveloppe ont donné lieu jusqu'ici à des résultats très décevants. Avec de tels immunogènes, il est en effet possible d'induire des titres neutralisants élevés vis à vis des souches de laboratoire dans les modèles animaux du chimpanzé et du macaque, ainsi que chez des volontaires sains. Cependant, ces anticorps neutralisants efficaces contre les souches adaptées à la culture sur les lignées lymphocytaires T transformées (souches de laboratoires ou TCLA) ne protègent pas de l'infection par les virus primaires qui sont impliqués dans la transmission du VIH-1 (Moore J.P. and D.D. Ho, 1995
(D •
La distinction entre les souches adaptées au laboratoire et les isolats primaires obtenus par culture de courte durée sur les cellules T primaires est apparue en 1995 et s'est précisée avec la découverte des corécepteurs du VIH-1 dont les deux principaux sont les récepteurs à chimiokines CCR5 et CXCR4. La grande majorité des virus primaires utilisent le corécepteur CCR5 lors de leur entrée dans la cellule cible, en plus du récepteur CD4 commun à tous les virus. L'adaptation aux lignées T lymphoïdes se traduit par la perte de la capacité à utiliser le CCR5 et l'acquisition de la capacité à utiliser le CXCR4 , si le virus ne le possède pas déjà (Trkola A. et al, 1996 (2)). L'autre différence fondamentale entre les deux types de virus est d' ordre immunologique : les isolats primaires sont, d'une manière générale, beaucoup plus résistants que les souches de laboratoire à la neutralisation par les anticorps et les formes solubles du CD4. En effet, des épitopes comme le site de fixation au récepteur CD4 et la boucle V3 sont peu accessibles sur les protéines Env des isolats primaires, alors qu' ils sont exposés à la surface des virus adaptés à la culture. Par conséquent, les anticorps spécifiques de ces déterminants antigeniques neutralisent efficacement les souches adaptées mais pas les isolats primaires (1). De plus, la résistance des isolats primaires à la neutralisation est indépendante de l'usage différentiel de corécepteurs entre les souches adaptées et primaires. Les rares isolats primaires qui n'utilisent que le CXCR4 comme corécepteur sont aussi difficiles à neutraliser que ceux utilisant le CCR5. Par ailleurs, dans les modèles animaux, il est effectivement possible d'obtenir une protection contre les souches adaptées de laboratoire, mais celle-ci reste limitée à la souche autologue et à un petit nombre de variants qui sont proches. La réponse neutralisante demeure inefficace contre les souches hétérologues, même s'il s'agit de variants adaptés à la culture. Cette protection limitée est due probablement à l'induction d' anticorps dirigés contre la boucle V3 qui est une région hypervariable de la protéine d'enveloppe. En utilisant des mélanges d' immunogènes issus d' isolats différents, il a été possible d'élargir la spécificité de la réponse immunitaire ; cependant une protection à large spectre, couvrant plusieurs sous types, n'a jamais pu être induite (Girard, M. et al., 2000 (3)).
Face à cette situation, plusieurs équipes se sont focalisées sur l'induction d'une immunité cellulaire spécifique du VIH-1. En effet, il est possible d'obtenir chez les vaccinés humains, comme dans les modèles animaux, des réponses cellulaires à base de lymphocytes T CD8+ cytotoxiques (CTL) capables de tuer les cellules infectées ou d'y bloquer la réplication du VIH-1 par sécrétion de facteurs suppresseurs. Cependant, on ne parvient pas à induire de réponses CTL chez plus de 30 à 40% des vaccinés et les réponses obtenues restent souvent dirigées contre un nombre d' épitopes trop restreints.
Une troisième voie, encore peu explorée, est l'induction d'une immunité muqueuse. Des résultats peu nombreux indiquent qu'une transsudation d' immunoglobulines IgG neutralisantes et une sécrétion d' IgA pourraient jouer un rôle dans l'exclusion du virus à travers les épithéliums .
Les particularités du VIH-1, à savoir la réplication dans les cellules du système immunitaire et l'échec initial de la réponse immunitaire antivirale chez les sujets infectés, soulignent la nécessité de développer de nouvelles approches qui doivent viser à induire des anticorps qui se fixent sur les épitopes de neutralisation conservés entre les différents sous types et présents sur les glycoprotéines d'enveloppe des virus primaires.
Pour cela, les inventeurs se sont fixés plusieurs impératifs pour l'obtention d'un vaccin préventif efficace. Il faut utiliser de manière impérative des glycoprotéines d' enveloppe issues d' isolats primaires et non des souches de laboratoire TCLA. Il faut s'assurer de présenter cette protéine au système immunitaire dans sa conformation native oligomerique. Il faut identifier de nouveaux épitopes de neutralisation à large spectre en raison de l'extraordinaire capacité d'adaptation des virus primaires à muter pour résister à la neutralisation par un anticorps. En effet, dans le modèle de la souris SCID humanisée, une tentative thérapeutique consistant en l'administration d'un mélange des trois anticorps IgGlbl2, 2G12 et 2F5 a sélectionné, en l'espace d'une semaine, une sous population virale résistant à la neutralisation par chacun des trois anticorps (Poignard P. et al., 1999 (5)) .
La protéine d'enveloppe d'HIV-1 est fortement glycosylée (50% de la masse totale) . Les sucres présents à sa surface assurent entre autres une protection vis-à-vis de la réponse neutralisante (Reitter J.N. et al., 1998 (6)) . De nombreuses études ont montré le rôle que jouaient ces résidus dans l' infectivité ou la protection. Cependant, ces études, loin d'être systématiques, ont toujours pris en compte les sites de glycosylation soit indépendamment les uns des autres soit sur des éléments structuraux particuliers comme les boucles variables VI, V2 , V3 ou les extrémités N-terminale et C-terminale de la protéine (6-8) .
En 1998, un modèle de structure de gpl20 a été proposé par Kwong après cristallisation d'une molécule délétée de la majorité de ses boucles variables et complexée avec le CD4s et le Fab (fragment liant l'antigène) de l'anticorps 17b (Kwong P.D et al., 1998 (9)) . Curieusement, peu de travaux ont été fait sur la disposition des sites potentiels de glycosylation à la surface de la molécule oligomerique. On peut citer les travaux de Zhu X. et al., 2000 (10) qui propose un modèle pour la forme totalement glycosylée de la gpl20 et ceux de Whyatt R. et al., 1998 (11) concomitant aux travaux de cristallisation. Ainsi, selon le document WO-A-99/24464, les auteurs ont identifié, à partir de la structure cristallisée de la protéine Env du VIH-1 délétée des boucles V1/V2, les différents sites de glycosylation susceptibles d' interagir au niveau d'un même épitope de neutralisation et ont obtenu des mutants correspondants. Ceux-ci n'ont néanmoins été obtenus qu'à partir de souches de laboratoire, dont on a dit précédemment qu'elles ne sont plus appropriées à la recherche d'un vaccin efficace. Et, à l'exception de Kwong, (Kwong P.D et al., 2000 (12)) tous les résultats ont essentiellement été obtenus sur des souches TCLA. Or, les virus adaptés en culture ont des différences épitopiques très marquées par rapport aux virus primaires et les études de Zhu et Whyatt ne reflètent pas la réalité exacte de la structure antigénique de la gpl20 native du VIH-1. Les inventeurs ont tout d'abord émis et vérifié l'hypothèse qu'au niveau du tri ère d' hétéro-dimères présent à la surface des cellules infectées ou du virus, les sites potentiels de glycosylation les plus conservés sont regroupés de façon à protéger des éléments conformationnels importants pour le virus.
Pour tester cette hypothèse ils ont accompli un travail considérable. Ils ont positionné tous les sites potentiels de glycosylation présents sur les séquences d'enveloppes de 13 isolats primaires de primo-infection HIV-1 (133, 146, 153, 159, 160, 374, 384, Qz, 120, 309, 355, 373, 426) et à titre de comparaison sur 5 souches TCLA (MN, HXB2, OYI, RF SF2) . Les douze séquences primaires de primo-infection (à l'exception de QZ) ont été isolées et caractérisées dans le laboratoire à partir de PBMC (cellules mononucléées sanguines du sang périphérique) de patients en phase de primo-infection hospitalisés à l'hôpital de la Croix-rousse à Lyon (Ataman-Onal Y. et al., 1999 (13)). Le choix des primoinfections est justifié par le fait que le virus présent à ce stade de la maladie est proche du virus qui a initié l'infection. Les sites potentiels de glycosylation qui étaient conservés dans les 13 séquences de référence ont ensuite été repérés et les séquences correspondantes sélectionnées. Ces sites correspondent au motif protéique N.X.T/S dans lequel N signifie asparagine, X représente n'importe quel acide aminé à l'exception de la proline, T signifie thréonine et S signifie serine. Les résultats de cette étude sont illustrés par le tableau 1.
Tableau 1 : alignement des sites potentiel de glycosylation sur 13 séquences d' isolats primaire (IP) de patients en primo-infection et 5 sé uences de souche TCLA (délétées des boucles V1/V2)
Figure imgf000010_0001
4- : sites de glycosylation conservés
Transmission : HM : homosexuelle ; HT : hétérosexuelle
Isolât primaire : IP ; souche TCLA : TC
Utilisation des co-récepteurs : CCR5 : R5 ; CXCR4 : X4 ; double tropisme :
X4R5
NB : la numérotation des acides aminés est donnée par rapport à la séquence complète . Les inventeurs ont ensuite sélectionné les sites de glycosylation les plus fortement conservés et ont positionné ces sites conservés sur la structure 3D de la gpl20 (#PDB database : 1G9M) à l'aide du logiciel PDB-Vie (Glaxo-Welcorne) . Les sites enfouis dans la molécule ou présents dans le domaine interne de la gpl20, domaine qui interagit avec la gp41 et donc est peu ou pas exposé à la surface de l' oligomère, ont été éliminés de l'étude. Chaque séquence a été analysée indépendamment. Cette analyse a montré que les sites conservés avaient une disposition comparable à la surface de la molécule, quelle que soit la séquence des isolats primaires.
Les inventeurs ont ensuite défini des «groupes» ou «clusters de glycosylation» qui correspondent à des regroupements des sites conservés à la surface de la gpl20 d'un isolât primaire à un autre. Ces groupes étant définis, une liste de mutants de déglycosylation qui tient compte de ces résultats a été établie.
Un des groupes de glycosylation correspond à une région située à proximité du motif GPGS de la boucle V3 (groupe gl4) .
Un autre groupe (gll2/gl22) recoupe partiellement les sites de glycosylation qui définissent l'épitope neutralisant 2G12 (Trkolla A. et al., 1996 (14)) . Un troisième groupe est juxtaposé à une cavité où sont logés des acides aminés intervenant dans la liaison aux co-récepteurs (groupe 1112) .
Un quatrième groupe est situé au niveau de 4 feuillets bêta anti-parallèles localisés à la jonction des deux principaux domaines de la gpl20 (Bridging- sheet) .
Un cinquième groupe est présent sur la face « silencieuse » de la gpl20 (groupe 113) .
Les contrôles consistent soit en le gène d'enveloppe totalement déglycosylé pour la VI (6) soit en une délétion totale des boucles V1V2. En parallèle, et afin de valider la notion de « cluster » de glycosylation, deux mutants supplémentaires (gl23 et gll23) ont été définis qui correspondent à des déglycosylations, non pas au sein d'un même cluster, mais dans chaque différent « cluster » (une mutation par « cluster ») .
Au moins une mutation a été effectuée sur les séquences sélectionnées obtenues à partir du patient 133 (PHI133, numéro d'accession AF041126) . Chaque mutation consiste en le remplacement de l' asparagine du site potentiel de glycosylation (NXS/T) par une glutamine et ceci avec l'aide d'un kit de mutagenèse dirigé selon les instructions du fabriquant (Quickchange Site-directed Mutagenesis Kit, Stratagène) . Chaque mutant a été clone dans le vecteur d'expression pCI (Promega) et séquence entièrement afin de vérifier l'intégrité de la séquence après mutagenèse. La purification des plasmides mutants a été effectuée grâce au kit Nucleobond PC500 (Macherey- Nagel) . La figure 1 schématise la définition des clusters et la proximité de chaque site sur la molécule de gpl20 cristallisée.
Le tableau 2 récapitule la nature et le positionnement de chaque mutation pour un mutant déterminé. Dans le tableau 2, les séquences en acides aminés de référence sont la séquence de la protéine Env de l'isolât HIV-1 133 non mutée délétée et la séquence de la protéine Env de l'isolât HIV-1 133 non mutée complète. Les correspondances en acides aminés sont données dans le tableau 2. La séquence en acides aminés de la protéine Env de l'isolât HIV-1 133 non mutée complète est identifiée en SEQ ID NO : 11 et la séquence nucléotidique correspondante du gène env de l'isolât HIV-1 133 non mutée (complète) est identifiée en SEQ ID NO : 1. Les séquences SEQ ID Nos 2 à 10 et SEQ ID Nos 12 à 20 qui sont listées ci-dessous correspondent respectivement aux séquences des gènes env mutés complets et tronqués de l'isolât HIV-1 133 et aux séquences des protéines Env mutées complètes et tronquées de l'isolât HIV-1 133. La séquence de la gpl60 est donnée en référence à SEQ ID NO : 11. La séquence de la gpl20 commence à l'acide aminé 1 et se termine à l'acide aminé 498 par référence à la SEQ ID NO : 11. La séquence de la gpl40 (qui correspond à la gpl20 plus les domaines extracellulaires de la gp41) commence à l'acide aminé 1 et se termine à l'acide aminé 669 par référence à la séquence SEQ ID NO : 11.
Tableau 2 : caractéristiques des différents mutants de la séquence d'enveloppe 133.
Figure imgf000014_0001
(a) : d'après la séquence 133 délétée [9] (b) : d'après la séquence 133 complète.
Il est bien entendu qu'en fonction de l'isolât primaire la position des sites de glycosylation conservés peut varier de 1 à 8 acides aminés et l'invention englobe ces variations de positionnement. Le tableau 3 ci-dessous présente certains exemples de variation des sites de glycosylation et établit une récapitulation de tous les sites potentiels de glycosylation dans les gènes env des isolats primaires 133, 146, 153, 159, 160, 374 et 384. Les positions en acides aminés sont indiquées pour les séquences délétées selon Kwong et al. 1998. Chaque ligne du tableau correspond à un site potentiel, la correspondance entre les différentes positions a été déterminée par un alignement des séquences délétées. Les sites de glycosylation conservés dans toutes les séquences sont soulignés .
Tableau 3
Figure imgf000016_0001
Les inventeurs ont ensuite étudié les caractéristiques antigeniques et fonctionnelles de chacun de ces mutants et sélectionné les mutants qui présentent les meilleures caractéristiques dans une visée vaccinale préventive. Les mutants gl2, gll2 et gl4 ont été sélectionnés. Les résultats sont présentés dans les exemples et figures qui suivent .
La séquence SEQ ID NO: 2 représente la séquence nucleotidique du mutant gl2 (gène env) . La séquence SEQ ID NO:- 3 représente la séquence nucleotidique du mutant gl2 tronquée qui code pour la gpl20.
La séquence SEQ ID NO: 4 représente la séquence nucleotidique du mutant gl2. tronquée qui code pour la gpl40.
La séquence SEQ ID NO: 5 représente la séquence nucleotidique du mutant gll2 (gène env) .
La séquence SEQ ID NO: 6 représente la séquence nucleotidique du mutant gll2 tronquée qui code pour la gpl20.
La séquence SEQ ID NO: 7 représente la séquence nucleotidique du mutant gll2 tronquée qui code pour la gpl40.
La séquence SEQ ID NO: 8 représente la séquence nucleotidique du mutant gl4 (gène env) .
La séquence SEQ ID NO: 9 représente la séquence nucleotidique du mutant gl4 tronquée qui code pour la gpl20.
La séquence SEQ ID NO: 10 représente la séquence nucleotidique du mutant gl4 tronquée qui code pour la gpl40.
La séquence SEQ ID NO: 12 représente la séquence en acides aminés du mutant gl2 (protéine Env) .
La séquence SEQ ID NO: 13 représente la séquence en acides aminés de la gpl20 du mutant gl2. La séquence SEQ ID NO: 14 représente la séquence en acides aminés de la gpl40 du mutant gl2.
La séquence SEQ ID NO: 15 représente la séquence en acides aminés du mutant gll2 (protéine Env) . La séquence SEQ ID NO: 16 représente la séquence en acides aminés de la gpl20 du mutant gll2.
La séquence SEQ ID NO: 17 représente la séquence en acides aminés de la gpl40 du mutant gll2.
La séquence SEQ ID NO: 18 représente la séquence en acides aminés du mutant gl4 (protéine Env) .
La séquence SEQ ID NO: 19 représente la séquence en acides aminés de la gpl20 du mutant gl .
La séquence SEQ ID NO: 20 représente la séquence en acides aminés de la gpl40 du mutant gl4. Les séquences gpl20 et gpl40 sont obtenues soit par troncature du gène, soit par insertion d'un codon stop et/ou un décalage de trame de lecture sans délétion du gène. Les formes gpl20 et gpl40 sont solubles, donc plus faciles à purifier et à administrer que la protéine Env complète .
Ainsi, la présente invention a pour objet un gène env muté codant pour une glycoprotéine d' enveloppe mutée du virus VIH-1, ledit gène présentant par rapport au gène env d'un isolât primaire de primo- infection, dit de référence, au moins deux mutations au niveau des sites de glycosylation conservés d'un isolât primaire à un autre, chaque mutation consistant en le remplacement d'un codon AAC ou AAT qui code pour une asparagine par un codon CAG ou CAA qui code pour une glutamine, les deux mutations au moins étant choisies parmi les suivantes :
(a) au moins deux mutations dans la partie du gène env codant pour la région C3 de la protéine env,
(b) au moins une mutation dans la partie codant pour la région C3 et au moins une mutation dans la partie codant pour la région V3, (c) au moins une mutation dans la partie codant pour la région C2 et au moins une mutation dans la partie codant pour la région V3 choisie parmi les sites de glycosylation au niveau des codons 862-864 et 970-972, (d) au moins une mutation dans la partie codant pour la région C2 choisie parmi les sites de glycosylation au niveau des codons 667-669, 679-681, 700-702, 763-765, 844-846, et au moins une mutation dans la partie codant pour la région V3, la position d'au moins l'un quelconque desdits codons pouvant varier de trois à vingt-quatre nucléotides, ou le gène env muté consiste en l'une quelconque des séquences SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 10 , ou leurs séquences complémentaires, Un des intérêts des multiples mutants (au moins deux mutations) selon l'invention réside dans la diminution de la probabilité d'avoir des mutations compensatoires qui conduiraient à retrouver un phénotype sauvage . Les mutations préférentielles selon l'invention sont les suivantes.
Selon les mutations (a) , au moins une mutation est effectuée au niveau des codons 976-978, 991-993 de la partie codant pour la région C3 et au moins une mutation est effectuée au niveau des codons 1039-1041 ou 1060-1062 de la partie codant pour la région C3, la position d'au moins l'un quelconque desdits codons pouvant varier de trois à vingt-quatre nucléotides. De préférence, le gène consiste en une séquence choisie parmi les séquences identifiées en SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 et SEQ ID NO: 23 ou leurs séquences complémentaires.
Selon les mutations (b) , au moins une mutation est effectuée au niveau des codons 976-978, 991-993, 1039- 1041 ou 1060-1062 de la partie codant pour la région C3 et au moins une mutation est effectuée au niveau du codon 880-882 de la partie codant pour la région V3, la position d'au moins l'un quelconque desdits codons pouvant varier de trois à vingt-quatre nucléotides ; selon cette variante, le gène comprend au moins trois mutations, à savoir au moins deux mutations dans la partie codant pour la région C3 et au moins une mutation dans la partie codant pour la région V3 : de préférence, ces mutations sont effectuées au niveau des codons 976-978, 991-993 et 880-882, la position d'au moins l'un quelconque desdits codons pouvant varier de trois à vingt-quatre nucléotides ; avantageusement, la séquence du gène ainsi muté consiste en une séquence choisie parmi les séquences identifiées en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 et SEQ ID NO: 4 ou leurs séquences complémentaires, ou au moins une mutation est effectuée au niveau du codon 976-978 ou 991-993, au moins une mutation est effectuée au niveau du codon 880-882, et au moins une mutation est effectuée au niveau du codon 1039-1041 ou 1060-1062 ; préférentiellement , les mutations sont effectuées au niveau des codons 976-978, 991-993, 880-882, 1039-1041 et 1060-1062 ; avantageusement, la séquence du gène ainsi muté consiste en une séquence choisie parmi les séquences identifiées en SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 et SEQ ID NO: 7 ou leurs séquences complémentaires, étant entendu que la position d'au moins l'un quelconque desdits codons précité peut varier de trois à vingt-quatre nucléotides.
Selon les mutations (c) , au moins une mutation est effectuée au niveau du codon 805-807 de la partie codant pour la région C2 , la position d'au moins l'un quelconque desdits codons pouvant varier de trois à vingt- quatre nucléotides.
Selon les mutations (d) , au moins une mutation est effectuée au niveau du codon 880-882 de la partie codant pour la région V3, la position d'au moins l'un quelconque desdits codons pouvant varier de trois à vingt- quatre nucléotides.
La séquence du gène muté peut aussi consister en une séquence choisie parmi les séquences identifiées en SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO : 9 et SEQ ID NO: 10 ou leurs séquences complémentaires.
L' invention concerne également une glycoprotéine Env mutée du virus VIH-1, laquelle glycoprotéine présente par rapport à une protéine Env native d'un isolât primaire de primo-infection, dit de référence, au moins deux mutations au niveau des sites de glycosylation conservés de ladite protéine de référence, d'un isolât primaire à un autre, chaque mutation consistant en le remplacement d'une asparagine par une glutamine, les deux mutations au moins étant choisies parm les suivantes :
(a' ) au moins deux mutations dans la région C3 de la protéine Env,
(b' ) au moins une mutation dans la région C3 et au moins une mutation dans la région V3, (c' ) au moins une mutation dans la région C2 et au moins une mutation dans la région V3 choisie parmi les sites de glycosylation au niveau de l'acide aminé 288 ou 324,
(d' ) au moins une mutation dans la région C2 choisie parmi les sites de glycosylation au niveau de l'un quelconque des acides aminés 223, 227, 234, 255, 282, et au moins une mutation dans la région V3, la position desdits sites de glycosylation conservés d'un isolât primaire de primo-infection à un autre pouvant varier d'un à huit acides aminés, ou la glycoprotéine Env mutée consiste en l'une quelconque des séquences ou le gène env muté consiste en l'une quelconque des séquences SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 ou SEQ ID NO: 20. La position des acides aminés des sites de glycosylation mutés est donnée par référence à la séquence de la protéine Env native.
Les mutations préférentielles selon l'invention sont les suivantes.
Selon les mutations (a' ) , au moins une mutation est effectuée au site de glycosylation au niveau de l'acide aminé 326 ou 331 et au moins une mutation est effectuée au site de glycosylation au niveau de l'acide aminé 347 ou 354, la position desdits sites de glycosylation conservés d'un isolât primaire de primoinfection à un autre pouvant varier d'un à huit acides aminés. De préférence, la glycoprotéine consiste en une séquence choisie parmi les séquences identifiées en SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 et SEQ ID NO: 23.
Selon les mutations (b' ) , au moins une mutation est effectuée au niveau de l'acide aminé 326 ou 331 et au moins une mutation est effectuée au niveau de l'acide aminé 294, la position d'au moins l'un quelconque desdits sites de glycosylation conservés d'un isolât primaire de primo-infection à un autre, pouvant varier d'un à huit acides aminés ; selon une variante, la glycoprotéine comporte au moins trois mutations, de préférence au moins deux mutations dans la région C3 et au moins une mutation dans la région V3 :
De préférence, ces mutations sont effectuées au niveau des acides aminés 326, 331 et 294 ,- avantageusement , une glycoprotéine Env mutée de l' invention consiste en une séquence choisie parmi les séquences identifiées en SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 et SEQ ID NO: 14 ; ou au moins une mutation est effectuée au niveau de l'acide aminé 326 ou 331, au moins une mutation est effectuée au niveau de l'acide aminé 347 ou 354 et au moins une mutation est effectuée au niveau de l'acide aminé 294, ; avantageusement, les mutations sont effectuées au niveau des acides aminés 326, 331, 294, 347 et 354 ; mieux encore, une glycoprotéique Env mutée de l'invention consiste en une séquence choisie parmi les séquences identifiées en SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 et SEQ ID NO: 17, étant entendu que la position desdits sites de glycosylation conservés d'un isolât primaire de primoinfection à un autre pouvant varier d'un à huit acides aminés . Selon les mutations (c' ) , au moins une mutation est effectuée au niveau de l'acide aminé 269 de la région C2.
Selon les mutations (d' ) , au moins une mutation est effectuée au niveau de l'acide aminé 294 de la région V3.
Une glycoprotéine Env mutée de l'invention peut consister en une séquence choisie parmi les séquences identifiées en SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 et SEQ ID NO: 20. L'invention a aussi pour objet une composition pharmaceutique comprenant :
(i) au moins un gène muté codant pour une glycoprotéine d'enveloppe mutée gpl20 du virus VIH-1, ledit gène muté étant choisi parmi l'un quelconque des gènes décrits ci-dessus et étant placé sous le contrôle de séquences de régulation permettant son expression dans une cellule hôte, un véhicule pharmaceutiquement acceptable, et de manière facultative un agent additionnel qui facilite la pénétration dudit gène muté dans ladite cellule et/ou qui permet de cibler ladite cellule, ou
(ii) au moins le gène muté identifié en (i) clone dans un vecteur viral recombinant. Parmi les séquences de régulation, on peut citer le promoteur intermédiaire/précoce du CMV humain (« intermediate/early CMV human promotor ») et le gène rev du VIH-1.
Si souhaité, on peut cibler lesdites cellules hôtes ou un compartiment cellulaire déterminé desdites cellules hôtes et pour ce faire il est possible de coupler au principe actif, à savoir l'ADN muté de l'invention, au moins un agent de ciblage. Par agent de ciblage, on entend une molécule chimique ou biologique qui permet de cibler in vivo ladite cellule hôte. Il peut, entre autres, s'agir d'un ligand spécifique, d'un anti-ligand naturellement présent au niveau de la cellule hôte ou du compartiment cellulaire à cibler, en particulier présent à la surface de ladite cellule hôte, et on peut citer à titre d'exemple les anticorps comme ligands et les antigènes comme anti- ligands. Ainsi, si un anticorps est couplé au principe actif et est spécifique d'un antigène de surface de la cellule hôte, il agira comme agent de ciblage de ladite cellule hôte par l'intermédiaire de la formation spécifique d'un complexe anticorps/antigène. Par agent qui facilite la pénétration dudit gène muté dans une cellule hôte, on entend, entre autres, des agents tels que la bupivacaïne et la cardiotoxine.
Par véhicule pharmaceutiquement acceptable, on entend, entre autres, les liposomes, les virosomes, les nanoparticules, les microparticules (exemple : les billes d'or), les iscoms.
Pour le vecteur viral recombinant, on peut citer à titre d'exemple le MVA (Modified Vaccinia Ankara), les alphavirus, le SFV (Semliki Forest Virus), les adénovirus, le AAV (Adeno-Associated Virus) .
Les compositions pharmaceutiques définies ci- dessus sont des compositions vaccinales à ADN particulièrement avantageuses, en particulier par rapport aux compositions vaccinales « classiques » à base de protéine recombinante. En effet, l'utilisation à visée vaccinale de protéines recombinantes est un système lourd et onéreux, notamment parce qu' il exige de très importantes étapes de purification des antigènes recombinants. De plus, une des difficultés rencontrées est d'obtenir une persistance du vaccin suffisamment longue pour maintenir une bonne mémoire immunitaire. Au contraire, la méthode de vaccination par l'ADN, dont les avantages sont inhérents aux propriétés intrinsèques de l'ADN, est simple et peu coûteuse et est effectuée simplement par injection intramusculaire ou intradermique. De plus, il convient de noter que :
- les vaccins à ADN sont non infectieux/non réplicatifs,
- que du fait que l'immunisation par l'ADN est une forme de transfection in vivo, l'antigène viral est exprimé dans les cellules mammifères sous sa conformation native,
- comme dans le cas d'une infection virale, une large réponse immune, à la fois humorale et cellulaire est induite, et que - de plus, les vaccins à ADN peuvent facilement être combinés en raison de leur homogénéité physicochimique .
Mais, l'invention n'est pas limitée à une composition vaccinale à ADN telle que définie ci-dessus et concerne également une composition pharmaceutique comprenant :
- au moins une glycoprotéine d' enveloppe mutée gpl20 du virus VIH-1, ladite glycoprotéine mutée étant choisie parmi l'une quelconque des glycoprotéines décrites ci-dessus,
- un véhicule et/ou excipient et/ou adjuvant et/ou diluant pharmaceutiquement acceptable.
Une telle composition vaccinale préparée est injectable, c'est-à-dire en solution liquide ou en suspension. En option, la préparation peut aussi être émulsifiée. La molécule antigénique, c'est à dire la glycoprotéine mutée, peut être mélangée avec des excipients qui sont pharmaceutiquement acceptables et compatibles avec l'ingrédient ou principe actif. Des exemples d'excipients favorables sont l'eau, une solution saline, le dextrose, le glycérol, l'éthanol ou des équivalents et leurs combinaisons. Si désiré, le vaccin peut contenir des quantités mineures de substances auxiliaires comme des agents mouillants ou émulsifiants, des agents qui tamponnent le pH ou des adjuvants comme l'hydroxyde d'aluminium, le dipeptide muramyl ou leurs variations, les polymères cationiques, les nanoparticules de polymères cationiques ou leurs variants (polyacide lactique, polyacide lactique - coglycoside) .
Le vaccin est administré conventionnellement par injection, par exemple intramusculaire.
Par « véhicule pharmaceutiquement acceptable » , on entend les supports et véhicules administrables à l'être humain ou à un animal, tels que décrits par exemple dans Remington' s Pharmaceutical Sciences 16th éd., Mac Publishing Co . Le véhicule pharmaceutiquement acceptable est de préférence isotonique, hypotonique ou présente une faible hypertonicité et a une force ionique relativement basse. Les définitions des excipients et adjuvants pharmaceutiquement acceptables sont également données dans Remington' s Pharmaceutical Sciences précité.
La présente invention concerne également un procédé pour induire une réponse humorale et/ou cellulaire améliorée contre le virus VIH-1 chez un animal mammifère selon lequel : - on administre à un animal mammifère par injection intramusculaire ou intradermique une quantité, suffisante pour être efficace, d'une composition vaccinale à ADN, comprenant au moins le gène muté qui code pour une protéine mutée de l'invention telle que définie précédemment, ou - on administre à un animal mammifère par injection intramusculaire ou intradermique une quantité, suffisante pour être efficace, d'une composition vaccinale comprenant au moins la protéine mutée de l'invention telle que définie ci-dessus.
Dans le cas de vaccins ADN, la concentration en acide nucléique dans la composition utilisée pour une administration in vivo est d'environ 100 μg/ml à 10 mg/ml, de préférence 1 mg/ml. La quantité de protéine administrée est fonction de l'addition ou non d'un adjuvant, mais sera généralement comprise entre 10 et 50 μg/ml de protéine.
Le vaccin est administré à une dose déterminée en une ou plusieurs injection(s) par voie intramusculaire ou intradermique, suivie(s) de rappel(s), si nécessaire. L'effet immunisant du vaccin est suivi par un dosage d'anticorps anti-VIH-1 chez l'individu ou l'animal vacciné .
L'administration d'acide (s) nucléique (s) ou de protéine (s) d'intérêt ou de leur (s) fragment (s), seuls ou en combinaison, est utilisée pour la prophylaxie et/ou la thérapie. Quand un ou des acide (s) nucléiques ou leurs fragments ou une ou des protéine (s) ou leurs fragments sont administrés, leur caractéristique est de ne pas présenter la virulence du VIH-1 mais d'avoir la propriété d'induire une réponse immunitaire, humorale et/ou cellulaire, chez l'individu ou l'animal auquel ils ou elles sont administrés. Quand il s'agit de protéine(s), celles ci peuvent être obtenues par des techniques synthétiques ou de recombinaison génétique ou par modification de protéine (s) naturelles par des traitements chimiques ou physiques .
La ou les protéine (s) ou leurs fragments, candidate (s) pour la formulation d'un vaccin sont identifiées et analysées dans un test fonctionnel pour s'assurer qu'elles ont perdu leur toxicité et pour vérifier leur immunogénicité (i) en réalisant un test in vi tro de prolifération de lymphocytes T CD44- spécifiques de l'antigène administré (T cell assay) ou un test in vi tro de cytotoxicité des lymphocytes CD84- spécifiques de l'antigène administré et, (ii) en mesurant, entre autres, le taux d' anticorps circulants dirigés contre la protéine naturelle et leur capacité à neutraliser des isolats primiares. Ces formes modifiées sont utilisées pour immuniser des hommes par des procédures standardisées avec des adjuvants appropriés.
L' invention concerne encore :
- un procédé pour obtenir des anticorps selon lequel on immunise un animal mammifère, tel que souris ou rat ou singe, avec au moins un gène muté codant pour une glycoprotéine d'enveloppe mutée du virus VIH-1, ledit gène muté étant choisi parmi l'un quelconque des gènes décrits précédemment et étant placé sous le contrôle de séquences de régulation permettant son expression in vivo et les anticorps susceptibles d'être obtenus par ce procédé, et - un procédé pour obtenir des anticorps selon lequel on immunise un animal mammifère, tel que souris ou rat ou singe, avec au moins une glycoprotéine d'enveloppe mutée du virus VIH-1, ladite glycoprotéine mutée étant choisie parmi l'une quelconque des glycoprotéines décrites précédemment et les anticorps susceptibles d' être obtenus par ce procédé.
Par anticorps, on entend les anticorps polyclonaux, les anticorps monoclonaux, les anticorps transmembraires et les anticorps humanisés ou des fragments desdits anticorps. La production d'anticorps polyclonaux et monoclonaux fait partie des connaissances générales de l'homme du métier. On peut citer à titre de référence Kôhler G. et Milstein C. (1975) : Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature 256 : 95-497 et Galfre G. et al. (1977) Nature, 266 : 522-550 pour la production d'anticorps monoclonaux et Roda A., Bolelli G. F. : Production of high-titer antibody to bile acids, Journal of Steroid Biochemistry, Vol. 13, pp. 449-454 (1980) pour la production d'anticorps polyclonaux. Pour la production d'anticorps monoclonaux, l'immunogene peut être couplé à de l' hémocyanine de Lymphet Keyhole (peptide KLH) comme support pour l'immunisation ou à de l'albumine sérique (peptide SA) . Les animaux sont soumis à une injection d' immunogène en utilisant de l'adjuvant complet de Freund. Les sérums et les surnageants de culture d'hybridome issus des animaux immunisés sont analysés pour leur spécificité et leur sélectivité en utilisant des techniques classiques, telles que par exemple des tests ELISA ou de Western Blot. Les hybridomes produisant les anticorps les plus spécifiques et les plus sensibles sont sélectionnés. Des anticorps monoclonaux peuvent également être produits in vi tro par culture cellulaire des hybridomes produits ou par récupération de liquide d' ascite, après injection intrapéritonéale des hybridomes chez la souris. Quel que soit le mode de production, en surnageant ou en ascite, les anticorps sont ensuite purifiés. Les méthodes de purification utilisées sont essentiellement la filtration sur gel échangeur d'ions et la chromatographie d'exclusion ou la chromatographie d'affinité (protéine A ou G). Un nombre suffisant d'anticorps sont criblés dans des tests fonctionnels pour identifier les anticorps les plus performants. La production in vi tro d'anticorps, de fragments d'anticorps ou de dérivés d'anticorps, tels que des anticorps chimères produits par génie génétique est bien connue de l'homme du métier.
Par anticorps transmembranaire on entend un anticorps dont au moins la région fonctionnelle capable de reconnaître et de se fixer à son antigène spécifique est exprimée à la surface des cellules cibles pour permettre lesdites reconnaissance et fixation. Plus particulièrement, les anticorps selon la présente invention consistent en des polypeptides de fusion comprenant les amino acides définissant ladite région fonctionnelle et une séquence d' amino acides (polypeptide transmembranaire) permettant l'ancrage au sein de la double couche lipidique membranaire de la cellule cible ou à la surface externe de cette bi-couche. Les séquences nucléiques codant pour de nombreux polypeptides transmembranaires sont décrites dans la littérature.
Les formes « humanisées » d' anticorps non humains, par exemple murins, sont des anticorps chimères qui comprennent une séquence minimale dérivée d' une immunoglobuline non humaine. Pour la plupart, les anticorps humanisés sont des immunoglobulines humaines (anticorps récepteur) dans lesquelles des résidus d'une région hypervariable du récepteur sont remplacés par des résidus d'une région hypervariable d'une espèce donneur (anticorps donneur) non humaine, telle que souris, rat, lapin ou primate non humain, ayant la spécificité, l'affinité et la capacité souhaitées. Dans certains cas, les résidus (FR) de la région Fv de l' immunoglobuline humaine sont remplacés par des résidus correspondants non humains. De plus, les anticorps humanisés peuvent comprendre des résidus qui ne sont pas trouvés dans l'anticorps receveur ou dans l'anticorps donneur. Ces modifications sont effectuées pour améliorer les performances de l'anticorps. En général, l'anticorps humanisé comprendra au moins et de préférence deux domaines variables, dans lesquels tout ou à peu près tout des boucles hypervariables correspondent à une immunoglobuline non humaine et tout ou à peu près tout des régions FR seront celles d'une immunoglobuline humaine. Les anticorps humanisés facultativement pourront aussi comprendre au moins une partie d'une région constante (Fc) d'une immunoglobuline, telle qu'une immunoglobuline humaine (Jones et al., Nature 321 : 522-525 (1986) ; Reichmann et al., Nature 332 : 323-329 (1988) ; et Presta et al., Curr. Op. Struct . Biol . 2 : 593-596 (1992).
Par fragment d'anticorps on entend les fragments F(ab)2, Fab, Fab' , sFv (Blazar et al., 1997, Journal of Immunology 159 : 5821-5833 et Bird et al., 1988, Science 242 : 423-426) d'un anticorps natif et par dérivé on entend, entre autres, un dérivé chimérique d'un anticorps natif (voir par exemple Arakawa et al., 1996, J. Biochem 120 : 657-662 et Chaudray et al., 1989, Nature 339 : 394- 397) .
Ces anticorps peuvent être incorporés dans une composition pharmaceutique, en particulier quand il s'agit d'anticorps neutralisants, pour répondre à une infection virale par le VIH-1 et l'invention englobe une telle composition pharmaceutique.
Enfin, l'invention concerne un procédé d'évaluation d'un agent thérapeutique, selon lequel on administre à un animal au moins un gène muté codant pour une glycoprotéine d'enveloppe mutée du virus VIH-1 tel que décrit précédemment et on réalise :
- un dosage d'anticorps spécifiques de la gpl20 mutée, et/ou
- un dosage des anticorps neutralisants spécifiques de la glycoprotéine mutée ou native qui vont induire une diminution de l' infectivité du virus, et/ou
- un dosage de la réponse immune cellulaire induite contre la gpl20 mutée par exemple par un test d' activation in vi tro de cellules lymphocytes T « helper » spécifique (s) de la glycoprotéine mutée. Pour une meilleure compréhension de la partie expérimentale qui va suivre, il convient de revenir en quelques lignes sur le mécanisme d'infection du VIH-1. Au cours de l'infection, la gpl20 se fixe au récepteur CD . Suite à cette interaction, la gpl20 subit un réarrangement structural libérant des épitopes dits « CD4 induits » qui permettent la fixation du co- récepteur . La fixation du CD4 puis celle du co-récepteur sont des événements pré-requis pour l'ancrage du peptide de fusion de la gp41 dans la membrane cellulaire et donc l'infection de la cellule. Figures . La figure 1 schématise la définition des clusters et la proximité de chaque site sur la molécule de gpl20 cristallisée.
La figure 2 représente la détection de gpl60 D et de gpl20 D dans chaque lysat cellulaire pour chacun des mutants réalisés et pour les contrôles.
La figure 3A représente l' antigénicité testé en ELISA dans les lysats cellulaires vis à vis d'un pool de sérums HIV positif et la figure 3B représente l' antigénicité testé en ELISA dans les surnageants de culture vis à vis du pool de sérums HIV positif.
La figure 4A représente la quantité de CD4s détectée dans les lysats cellulaires et la figure 4B représente la quantité de CD4s détectée dans les surnageants de culture. La figure 5A représente la reconnaissance de l'épitope F105 testée en ELISA dans les surnageants de culture et la figure 5B représente la reconnaissance de l'épitope F105 testée en ELISA dans les lysats cellulaires . La figure 6A représente la reconnaissance de l'épitope CG10 en présence de CD4 testée en ELISA dans les lysats cellulaires et la figure 6B représente la reconnaissance de l'épitope CG10 seule (I) et en présence de CD4 (D) testée en ELISA dans les surnageants de culture. La figure 7A représente la reconnaissance de l'épitope 17b seul (D) et en présence de CD4 (D) testée en ELISA dans les lysats cellulaires et la figure 7B représente la reconnaissance de l'épitope 17b seul (D) et en présence de CD4 (D) testée en ELISA dans les surnageants de culture. La figure 8 illustre la neutralisation du virus FR (virus primaire X4) sur des cellules Hela P4PCCR5 par le sérum de souris immunisées par différentes constructions (Exemple 4) . La figure 9 illustre l'infection par des pseudoparticules portant les glycoprotéines mutées identifiées dans le tableau 2, de cellules GHOST-CCR5 et GHOST-CXCR4.
La figure 10 illustre la neutralisation des pseudo-particules portant les glycoprotéines mutées par un sérum humain CRI/LY neutralisant.
Exemples .
Exemple 1 : Expression et clivage.
Des cellules 293T (cellules épithéliales de rein) sont co-transfectées par chacune des constructions PCI-env et le plasmide d'expression PCI-rev à l'aide du kit Lipofectamine-Plus (Gibco-BRL) selon les instructions du fabriquant. Rev est une protéine de régulation de HIV-1 qui joue un rôle important dans l'expression de la protéine d'enveloppe. Quarante-huit heures après transfection, le surnageant de culture et les cellules sont récupérées et testés en Western-blot avec un anticorps polyclonal de mouton anti-gpl20 (Biogenesis) dilué au 1/5000. Pour cela, les échantillons sont déposés sur un gel dénaturant d' acrylamide 8%. Après séparation, les échantillons sont transférés sur une membrane de PVDF (ImmobilonP, Amersham) selon les instructions du fabricant. Pour les lysats, la normalisation des échantillons a été faite avec un anticorps monoclonal anti-Actine dilué au 1/5000 (A4700, Sigma) et anti-Rev 2D4D10 dilué au 1/5000 (bioMérieux) . Pour les surnageants la normalisation a été faite d'après le taux d'albumine sérique du milieu de culture. La révélation des blots est effectuée à l'aide du kit ECF (Amersham) et les bandes révélées sont quantifiées sur Typhoon 8600 grâce au logiciel ImageQuant . Toutes les constructions expriment une protéine qui réagit avec le polyclonal anti-gpl20. La migration des protéines mutantes est affectée par la perte d'une ou de plusieurs glycosylation. La baisse de gpl20 détectée dans le lysat cellulaire est associée à l'augmentation du nombre de mutations (figure 2). Parfois, la bande spécifique est totalement absente (mutants glll2, gl22, gl3, gll3, gl4, gl23, gll23 et DV1V2) . Elle est également absente du surnageant de culture correspondant : on peut penser que le taux de clivage est affecté. Moulard (15) a décrit ce phénomène qu'il associe à une mauvaise translocation dans le RE et/ou un défaut de repliement empêchant l'accessibilité du site de coupure. A contrario, Pour le mutant gl4, une quantité importante de gpl20 est détectée dans le surnageant (environ 8x plus que la protéine native, à quantité de protéines normalisées) alors que celle-ci n'est pas détectée dans le lysat cellulaire. Il semble donc que les mutations présentes sur ce clone affectent les interactions liant entre-elles les sous-unites de l'enveloppe et non pas le taux de clivage de la gpl60. Le taux de clivage pour les simples mutants est en général comparable à celui observé pour l'enveloppe native (excepté pour le mutant g21) . Il est intéressant de noter qu'en comparaison le mutant correspondant à la déglycosylation totale de la boucle VI semble peu affectée par la perte de 3 glycosylations .
Exemple 2 : Aptitude des mutants à former des syncytia in vi tro .
Quarante-huit heures après transfection, les cellules 293T qui expriment les différents mutants sont repiqués au 1/10 et mises en présence de cellules GHOST- CCR5 ou -CxCR4 à 50% de densité.
Après 16 heures de co-culture, les cellules sont fixées 15 minutes au glutaraldéhyde 0,5% puis les noyaux et les cytoplasmes sont colorés en May-Grϋnwald/Giemsa. L'observation et le comptage des syncytia formés sont appréciés par observation au microscope optique inversé.
Pour les GHOST-CCR5, la capacité à induire des syncytia est réduite quand le nombre des mutations est augmenté. Elle est nulle pour les clones qui ne sont pas clivés (gll3, gll23 et peut-être glll2) . Ce résultat confirme les résultats précédents et donne une indication sur le maintien de la fonctionnalité des différentes enveloppes après mutation. Les constructions n'induisent pas la formation de syncytia sur des cellules indicatrices CXCR4 comme cela a pu être mis en évidence par Pollakis (16) après déglycosylation partielle de la boucle V3 de la gpl60 ADA.
Les résultats sont présentés dans le tableau 4.
Tableau 4 : Aptitude des mutants de l'enveloppe à former des syncytia in vi tro .
Figure imgf000035_0001
FS CCR5 : formation syncytia CCR5 FS CCR4 : formation syncytia CCR4
Antigénicité vis-à-vis d'un pool de sérums HIV positif
(cf . figure 3) .
Les lysats et les surnageants ont été testés en ELISA de capture avec un pool de sérums H V-t- provenant de l'hôpital de la Croix- Rousse à Lyon. Ce pool de sérums est constitué de 2 échantillons sous-types B et d'un échantillon sous-type C. Tous les résultats d'ELISA correspondent à la moyenne de 2 expériences en duplicate. Le format du test est le suivant :
- Anticorps de capture : D7324 (dirigé contre le site de clivage alterne situé dans la région C5; Aalto) à Iμg/ml en PBSlx ou 12G10B11 (dirigé contre la gp41, bioMérieux) à 5μg/ml en PBSlx ; incubation la nuit à 6°C.
- Saturation par PBSlx-Tween 0,1%-lait écrémé en poudre 3% ; incubation lheure à 22 °C.
- Lysats dilués au 1/10 en PBS-NP40 1%-BSA 20μg/ml ou surnageants au pur ; incubation 2 heures à
22°C.
- Pool de sérums HIV4- dilué au 1/100 en PBSlx- Tween 0,1%-BSA 20μg/ml ; incubation 1 heure à 22 °C.
- Conjugué anti-Fc IgG humain couplé à la peroxydase (Jackson) dilué au 1/5000 en PBSlx-Tween 0,1%-
BSA 20ug/ml ; incubation 30 minutes à 22 °C.
- Révélation par un mélange de 20mg OPD (Pierce) et de 10ml de Color2 (BioMérieux) ; incubation de 15 minutes à 22 °C avant lecture à 492 nm sur un lecteur de plaques (Biorad) .
Entre chaque incubation 4 lavages au PBSlx-Tween 0,1% sont effectués avec un laveur de plaques Biorad.
Les surnageants sont capturés par l'anticorps D7324 ; les lysats sont capturés soit par le D7324, soit par le 12G11B10. Ce dernier a principalement été utilisé car l'épitope D7324 est peu exposé sur les gpl60 non clivées et le signal détecté dépend alors du taux de clivage des différents mutants.
Les résultats montrent que la perte d' antigénicité corrèle avec le nombre de mutations. Les résultats sur les lysats (coating 12G11B10) et sur les surnageants coïncident et confirment l'absence de gpl20 dans les surnageants pour les mutants gll3 et gll23. Exemple 3 : Reconnaissance Reconnaissance de l'épitope 2G12.
2G12 est un anticorps monoclonal humain obtenu par électrofusion de PBL HIV+ et de cellules CB-F7 (17) . II a un pouvoir neutralisant à large spectre sur des isolats primaires et certains virus TCLA. L'épitope reconnu par cet anticorps est discontinu et couvre principalement les régions V3 et V4 ainsi que certains sucres présents dans ces régions. La reconnaissance de 2G12 a été testée en ELISA sur les lysats cellulaires et sur les surnageants des différents mutants. Le format du test est le même que le précédent, excepté pour l'anticorps de détection qui est le 2G12 (lμg/ l). Aucun signal positif n'est détecté même pour la protéine 133- native. Ce résultat confirme des résultats obtenus en RIPA et en ELISA par l'équipe de D. Brand (Tours) sur l'enveloppe 133. Parren, en 1998, a décrit un isolât primaire résistant aux trois anticorps neutralisant 2G12 , 2F5 et B12. Ses résultats indiquent que cette résistance est probablement due à un changement global de la structure oligomerique de l'enveloppe.
Reconnaissance du site de fixation au CD4.
La glycoprotéine d' enveloppe a la capacité de lier le CD4 avec une forte affinité. Cette capacité de liaison est primordiale dans le processus d'infection.
- Fixation du CD4 soluble (CD4s) . Le format ELISA suivant a été utilisé :
- Coating D7324 (surnageant) ou 12G11B10 (lysat) . - Saturation.
- Lysat dilué au 1/10 ou surnageant au pur.
- CD4s (NIAID) dilué à Iμg/ml en PBSlx-Tween 0,1%-BSA 20 μg/ml ; incubation 2 heures à 22 °C.
- Polyclonal anti-CD4 biotinylé dilué à lμg/ml en PBSlx-Tween 0,1%-BSA 20 μg/ml ; incubation 1 heure à 22 °C. - Streptavidine-peroxidase (Jackson) dilué au 1/10000 en PBSlx-Tween 0,1%-BSA 20 μg/ml ; incubation 30 minutes à 22 °C.
- Révélation par un mélange de 20mg OPD (Pierce) et de 10ml de Color2 (bioMérieux) .
- Lecture à 492nm.
La quantité de CD4s détectée varie de la même façon sur les lysats et sur les surnageants (figure 4) . L' intensité du signal est fonction du nombre de sites déglycosyles exception faite pour les mutants gl2 et gl4 qui correspondent à des doubles mutations. Les clones correspondant à des protéines d' enveloppe dont l' antigénicité ou le taux de clivage sont réduits ont un signal bas (gl22, gl3 , gll3, gl23 et gll23) .
Reconnaissance de l'épitope IgGlbl2. Cet anticorps monoclonal humain est décrit comme ayant une importante activité neutralisante à la fois sur isolats primaires (clade A-D) et sur souches de laboratoire. L'épitope est discontinu et recouvre le site de fixation au CD4. La reconnaissance se fait préférentiellement sur les oligomères à la surface des cellules infectées ou des virus, au dépend des « débris » qui empêchent une réponse neutralisante efficace. Aucun signal positif n'a été noté quels que soient les clones testés. Ceci est en accord avec les résultats préliminaires de D. Brand sur l'enveloppe 133. IgGlbl2 est décrit comme étant très sensible aux substitutions au niveau des boucles VI et V2. Certains acides aminés dans les régions C2 et C3 sont aussi décrits comme jouant un rôle crucial dans la reconnaissance de l'épitope bl2 (18) . Une des particularités de l'enveloppe 133 est d' avoir une séquence protéique atypique comparée aux autres protéines d'enveloppe du même sous -type. Reconnaissance de l'épitope F105 (cf. figure 5) . L'anticorps monoclonal humain F105 se lie à proximité du site de fixation au CD4. Le CD4s peut inhiber sa fixation. L'anticorps F105 neutralise les souches TCLA. Certains auteurs ont décrit une neutralisation pour quelques isolats primaires (19) mais les résultats sont très controversés.
La fixation de cet anticorps a été testée sur les lysats et les surnageants. Le format du test est le même que celui utilisé avec le 2G12. L'anticorps F105 (NIBSC) est utilisé à une concentration de lμg/ml. Un signal important est noté pour le clone gl2 (jusqu'à 4,5x le signal de la protéine native à quantité de protéine équivalente) . La mutation n°294 présente sur gl2 (mais non sur g2) est située au niveau de la boucle V3 ; on sait que l'attachement de F105 sur des glycoprotéines délétées pour V3 est amélioré. D'autres mutations semblent avoir un rôle crucial dans la reconnaissance de la protéine par l'anticorps. C'est le cas de la mutation n°255, présente dans les clones gl3 et gll3. Elle est localisée dans un peptide de la C2 décrit comme important dans l'échappement à la neutralisation par F105 (20) . Il n'y pas de signal pour les mutants glll2 et ceux de la série g22/gl22.
Reconnaissance des épitopes CD4 induits.
La fixation du CD4 induit des changements de conformation et permet la formation d' épitopes de novo dont l'émergence conditionne la fixation du co-récepteur .
- Reconnaissance de l'épitope CG10 (figure 6) . CG10 est un anticorps monoclonal murin capable de neutraliser certaines souches TCLA. Il se lie à proximité du « bridging-sheet » en compétition avec le 17b. Sa fixation est strictement dépendante du CD4 (21) . L' ELISA utilisé a le format suivant: Coating: D7324 (surnageants) ou 12G11B10
(lysats) . Saturation.
Lysats dilués au 1/10 ou surnageants au pur. Ajout (ou non ajout) de CD4s à Iμg/ml dilué en PBSlx-Tween 0,1%-BSA 20μg/ml ; incubation 2 heures à 22 °C. CG10 (don de Francisco Veas , UMR 5087,
Montpellier) à lμg/ml dilué en PBSlx-Tween 0,1%-BSA 20μg/ml ; incubation 1 heure à 22°C.
Conjugué anti-IgG de souris couplé à la peroxydase (Jackson) dilué au 1/5000 en PBSlx-Tween 0,1%- BSA 20μg/ml
Révélation : 20mg OPD (Pierce) et de 10ml de Color2 (bioMérieux) .
Lecture à 492nm.
Les résultats en ELISA montrent une bonne reconnaissance de l'épitope CG10 en présence de CD4s et pour la majorité des protéines d'enveloppe à l'exception des mutants gl22, gl3, gll3, gl23 et gll23. Le signal corrèle bien avec le taux de fixation au CD4s (cf. figure 5) . L'utilisation de CG10 seul conduit à une absence de signal .
- Reconnaissance de l'épitope 17b (cf. figure 7). 17b est un anticorps monoclonal humain dirigé contre un épitope CD4 -induit. Il a une activité neutralisante limitée à la fois pour les isolats primaires et les souches TCLA. Si l'exposition de l'épitope ne dépend pas strictement de la fixation du CD4 elle est néanmoins améliorée par sa présence. Le format d' ELISA utilisé est le même que pour CG10. L'anticorps 17b est utilisé à la concentration de lμg/ml. La détection se fait avec un anticorps anti-Fc IgG humain couplé à la peroxydase et dilué au 1/5000 (Jackson). Dans l'expérience, on observe que certains mutants ont une bonne reconnaissance de cet anticorps et notamment les mutants gl2/gll2, g3 et g4/gl4. Pour gl2, le signal est environ 3x supérieur à celui enregistré pour la protéine native à quantité de protéine équivalente. Les mutations présentes dans gl2/gll2 concernent la boucle V3 et le début de la région C3. Selon Wyatt (11) V2 et V3 couvriraient partiellement l'épitope 17b et c'est la fixation du CD4 qui permettrait un retrait de la boucle V2. On peut imaginer que la déglycosylation de la boucle V3 (NB: la boucle V3 de la séquence 133 a un seul site potentiel de glycosylation) et des sites situés à sa base permettent à la fois un démasquage partiel de la boucle V3 et une augmentation de sa flexibilité qui pourraient en conséquence conduire à une meilleure accessibilité de l'épitope 17b.
Les expériences détaillées ci-dessus montrent l'intérêt des mutants gl2, gll2 et gl4 au regard de leurs caractéristiques antigeniques et fonctionnelles .
L' immunogénicité des mutants gl2 et gll2 (bonne affinité pour F105 et pour 17b) doit être bonne. Les mutants de la série g4/gl4 sont intéressants car ils ont une bonne réactivité vis à vis des différents anticorps testés .
Exemple 4 : sélection d' un panel de mutants et évaluation du pouvoir neutralisant des anticorps générés après immunisation de souris Balb/C
D'après les résultats d'ELISA, le panel de mutants suivant : gl2 , gll2, gl4 a été choisi. Le mutant gl3 a aussi été évalué du fait du positionnement en cluster des sites mutés sur la face « silencieuse » du domaine externe de la gpl20. Le mutant gl23 (mutant non- cluster) , ainsi que le gène de l'enveloppe sauvage, ont été utilisés comme références. Chaque gène d'enveloppe a été sous-cloné dans un vecteur pCi-Rev qui dérive du vecteur pCi-Néo (Promega) par remplacement du gène de la néomycine par le gène rev qui se trouve alors sous la dépendance du promoteur SV40. Chaque construction a été préparée avec un Kit d'extraction de plasmide endotoxine-free (Macherey-Nagel PC2000 EF) . Les immunisations ont été effectuées de la façon suivante : pour chaque construction 5 souris Balb/C femelles ont été immunisées par biolistique (GeneGun, Biorad) à l'aide de particules d'or préalablement recouvertes de 4 μg de plasmide à injecter. Cinq injections successives ont eu lieu à J0, J14, J28, J54 et J68. A J40 et J80 des échantillons de sang sont prélevés dans l'oeil des animaux. Ces échantillons ont servi à tester la montée des anticorps dirigés contre l'enveloppe après les différentes immunisations. Pour ce faire, des
ELISA ont été effectués : de la protéine d'enveloppe gpl60
(ABL) diluée à lμg/ml été adsorbée sur des plaques 96 puits (Nunc) . Après saturation des sites non spécifiques, les sérums des souris immunisées aux jours J0, J40 et J80 sont utilisés à des dilutions allant de 1/100 à 1/800, puis révélés par un anticorps dirigé contre les anticorps de souris couplé à la peroxidase de raifort (Jackson) . Une DO lue supérieure à 0,35 est considérée comme significative. Le tableau 5 ci-dessous récapitule les souris positives obtenues, pour chaque construction. Tableau 5
Figure imgf000042_0001
Les sérums de ces souris ont été utilisés dans deux tests de neutralisation décrits ci-après : a- Le virus FR (virus primaire X4) a été mis en contact avec des dilutions sériées (au l/10le l/20d et l/40ιeme) des différents sérums de souris pendant lh à 37 °C dans du milieu DMEM (Euromedex) puis rajouté dans des plaques 96 puits où ont été préalablement mises en culture des cellules Hela P4PCCR5. Ces cellules possèdent le récepteur CD4 et les co-récepteurs CCR5 et CXCR4. Elles ont le gène de la B-galactosidase, sous la dépendance d'un LTR retroviral. Après lh de co-culture, 200μl de milieu DMEM contenant 5% de sérum de veau fœtal sont rajoutés. Les cellules sont alors incubées 48h à 37°C. A l'issue de ces 24h, l'expression de la B-galactosidase est révélée grâce à une solution d'X-gal à 400μg/ml en potassium ferricyanide 0 , 2M/potassium ferrocyanide 0,2M/MgCl2 2M. Le pourcentage de neutralisation correspond au pourcentage de cellules non infectées, pour lesquelles la synthèse de B- Galactosidase n'a pas été induite. Des essais ont été effectués en parallèle avec du virus mais sans sérum de souris (contrôle d' infection) ou avec du sérum de souris non immunisées (contrôle du bruit de fond de la neutralisation, Tneg) . Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau 6 ci-dessous et la figure 8.
TABLEAU 6
Figure imgf000044_0001
On observe que pour la majorité des sérums, il n'y a pas de réponse neutralisante se différenciant du bruit de fond (environ 30% de neutralisation) . Cependant, pour les constructions pCI-rev-gl2 et pCI-rev-gl4, les souris positives en ELISA (respectivement S3/S4 et S3/S4) donnent une réponse neutralisante significative à la dilution 1/10 (70% de neutralisation) . Ce pourcentage est moindre pour une dilution au 1/20 et rejoint la valeur du bruit de fond pour une dilution au 1/40, excepté pour la souris S3 immunisée par pCI-rev-gl2 dont la valeur est légèrement supérieure (40%) . Les sérums des souris immunisées par les constructions non mutées (Pci-rev-env sauvage = wt) et positifs en ELISA ne sont pas neutralisants dans ce format de test.
b- Les sérums de souris ont été évalués pour leur capacité à neutraliser l'infection de cellules permissives par des pseudo-particules portant l'enveloppe 133 sauvage
(= autologue non mutée) . Les sérums des souris positives ainsi que 2 sérums de souris non immunisées ont été incubés pendant lh à 37°C en dilutions sériées (de 1/8 à 1/128) avec les surnageants de culture contenant les pseudo-particules. Les pseudo-particules portant l'enveloppe 133 sauvage ont été obtenues de la façon suivante : Des cellules 293T ont été co-transfectées par la construction pCI-e.nvl.33 et par le plasmide pNL4-3luc (NIH AIDS Research and Référence Reagent Program) avec un rapport pNL4-3l c/pCI-env!33 de 1/3. Cette transfection est réalisée grâce au kit Calcium Phosphate Transfection System (Gibco) . Le plasmide pNL4-3luc permet d'exprimer tous les gènes viraux sauf vpr et env (saut de trame) ainsi que le gène de la Luciférase. Par complémentation, des pseudo-particules virales portant les enveloppes recombinantes 133 sauvage sont formées. Quarante-huit heures après transfection, les surnageants de culture sont récupérés et centrifugés afin d'éliminer les débris cellulaires. Ils sont ensuite complétés à 20% de sérum de veau fœtal, aliquotés et stockés à -80 °C. Un dosage de la p24, réalisé sur l'automate VIDAS (bioMérieux), permet d' évaluer la quantité de particules virales présente dans ces surnageants.
L'infection de cellules GHOST-CCR5 ou GHOST-CXCR4
(NIH AIDS Research and Référence Reagent Program ; ces cellules expriment le CD4) est effectuée sur la nuit, en plaques de culture de 96 puits, par contact avec un volume de surnageant contenant les pseudoparticules préalablement mises en contact avec les sérums (lOng d'équivalent p24 par puit) . Du milieu de culture est ensuite rajouté. Après 3 jours supplémentaires d'incubation, les surnageants sont éliminés, les cellules sont rincées avec du PBS IX. La lyse et la réaction enzymatique sont effectuées avec le kit LucLite Plus (Perkin Elmer) ; la lecture de la luminescence est réalisée sur un lecteur de plaques TopCount (Packard Biosciences) .
Les résultats montrent que pour les sérums gl2- S3 , gl4-S3 et gl4-S4, on observe une légère neutralisation pour une dilution au 1/8 puisque, pour ces échantillons, la luminescence est environ 23% moins importante que celle enregistrée pour les sérums de souris avant immunisation
(Vgi9-S3= 85 000 contre Vτo= 111 000) . Ces résultats semblent aller dans le même sens que ceux décrits dans l'expérience précédente. L'exception vient du sérum gl2-S4 pour lequel aucune activité neutralisante n'est constatée.
Exemple 5 : évaluation de la fonctionnalité de tous les mutants de déglycosylation : infection par des pseudo-virus et essais de neutralisation de cette infection par des sérums humains HIV-1 positifs.
L' obtention de pseudoparticules exprimant les différents mutants de déglycosylation est importante car elle permet d'étudier la protéine d'enveloppe dans son contexte naturel c'est à dire intégrée dans une particule virale .
Des cellules 293T ont été co-transfectées par chacune des constructions pCI-env mutées (mutants de déglycosylation, cf. liste sur tableau 2) et par le plasmide pNL4-3 lue (NIH AIDS Research and Référence Reagent Program) suivant le protocole décrit dans l'exemple 1 ci-dessus.
Quarante-huit heures après transfection, les surnageants de culture sont récupérés et centrifugés afin d'éliminer les débris cellulaires. Ils sont ensuite complétés à 20% de sérum de veau fœtal, aliquotés et stockés à -80°C. Un dosage de la p24, réalisé sur l'automate VIDAS (bioMérieux), permet d'évaluer la quantité de particules virales présentes dans ces surnageants .
L' infection de cellules GHOST-CCR5 ou -CXCR4 (NIH AIDS Research and Référence Reagent Program) est effectuée sur la nuit, en plaques de culture de 24 puits, par contact avec un volume de surnageant correspondant à 50ng de p24 par puit . Le milieu de culture est alors renouvelé. Après 3 jours supplémentaires d'incubation, les surnageants sont éliminés, les cellules sont rincées avec du PBS IX et lysées par 300μl de CCLR (Cell Culture Lysis Reagent de Promega) pendant 15 minutes. Un volume de 20μl de ces lysats est mis en contact avec 80μl de substrat
(Luciferase Assay System de Promega) et la mesure de la luminescence est réalisée sur un luminomètre (Turner
Designs TD 20/20) . Les résultats sont regroupés dans la figure 9.
Cette expérience indique que plus le nombre de mutations est important, plus la capacité des enveloppes recombinantes à induire l'infection des GH0ST-CCR5 diminue. Elle est nulle pour les constructions qui sont peu ou pas clivées. Aucun mutant n'induit l'infection des cellules GHOST-CXCR4. Ces résultats sont en accord avec les tests de formation de syncytia précédemment décrits
(cf. tableau 4). Cependant aucune infection n'est détectée pour les mutants gll2, gl22, gl3 et gl23, alors qu'une légère activité de fusion cellule à cellule était observée. Pour le mutant gl4, utilisé dans les expériences de neutralisation, un faible taux d'infection est observé. Afin de compléter cette étude, nous avons contrôlé la présence de la protéine d'enveloppe dans les virions. Pour cela, nous avons concentré et purifié les pseudo- particules par ultracentrifugation sur un coussin de saccharose 20% pendant 3h à 70000g. Les culots ont été lysés en PBS-Triton 0.5% et un dosage de la p24 a permis de normaliser les échantillons. Un Western-Blot a alors été réalisé en utilisant un anticorps polyclonal anti- gpl20 (Biogenesis) . Env est détectée uniquement dans les pseudo-particules qui infectent les cellules GHOST : lorsqu'on augmente le nombre de sites déglycosyles, l'exportation de la protéine d'enveloppe à la membrane plasmique ainsi que l'incorporation de l'enveloppe dans les pseudo-particules semble être affectée.
Enfin, la sensibilité de ces pseudo-particules vis-à-vis de sérums neutralisants a été évaluée : avant l'infection de cellules indicatrices GH0ST-CCR5, les surnageants de culture contenant les pseudo-particules sont incubés pendant lh à 37 °C en présence de dilutions sériées de sérum humain. Il s'agit du sérum GRl/LY (don du Dr C. Moog, INSERM U544, Strasbourg) dont le titre neutralisant a été déterminé pour 5 isolats primaires de différents sous- types. En parallèle, les sérums HIV-1 neutralisants de référence #1 et #2 (NIBSC) ont été utilisés en contrôle sur les pseudo-particules portant l'enveloppe 133 native. Le protocole d'infection est similaire à celui décrit plus haut. L'infection est réalisée en plaques 96 puits par contact avec un volume équivalent à lOng de p24. La lyse et la réaction enzymatique sont effectuées avec le kit LucLite Plus (Perkin Elmer) . La lecture de la luminescence est réalisée sur un lecteur de plaques TopCount (Packard Biosciences) . Les résultats sont illustrés dans la figure 10. La courbe « sérum négatif » correspond à une expérience menée sur des pseudo-virions exprimant l'enveloppe sauvage mis en présence d'un sérum HIV-1 négatif (CTS Lyon-Gerland). C'est la courbe déterminant le bruit de fond. La neutralisation est effective pour une dilution de sérum supérieure à l/640eme. Ces résultats montrent que les pseudo-particules sont neutralisées différemment suivant l'enveloppe exprimée à leur surface. Cependant, seuls les mutants g30 et g22 voient leur pourcentage d'infection significativement réduit par rapport à l'enveloppe sauvage (non mutée). Même si il n'y a pas de corrélation directe entre cette expérience et la capacité d'un tel mutant à induire des anticorps neutralisants in vivo, le mutant g22 pourrait être un candidat intéressant à tester pour sa capacité à induire des anticorps neutralisants après immunisation ADN de petits animaux.
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Claims

REVENDICATIONS
1. Gène env muté codant pour une glycoprotéine d'enveloppe mutée du virus VIH-1, caractérisé en ce que ledit gène présente par rapport au gène env d'un isolât primaire de primo-infection, dit de référence, au moins deux mutations au niveau des sites de glycosylation conservés d'un isolât primaire à un autre, chaque mutation consistant en le remplacement d'un codon AAC ou AAT qui code pour une asparagine par un codon CAG ou CAA qui code pour une glutamine, les deux mutations au moins étant choisies parmi les suivantes :
(a) au moins deux mutations dans la partie du gène env codant pour la région C3 de la protéine env,
(b) au moins une mutation dans la partie codant pour la région C3 et au moins une mutation dans la partie codant pour la région V3 ,
(c) au moins une mutation dans la partie codant pour la région C2 et au moins une mutation dans la partie codant pour la région V3 choisie parmi les sites de glycosylation au niveau des codons 862-864 et 970-972,
(d) au moins une mutation dans la partie codant pour la région C2 choisie parmi les sites de glycosylation au niveau des codons 667-669, 679-681, 700-702, 763-765, 844-846, et au moins une mutation dans la partie codant pour la région V3, la position d'au moins l'un quelconque desdits codons pouvant varier de trois à vingt-quatre nucléotides, ou le gène env muté consiste en l'une quelconque des séquences SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 10 ou leurs séquences complémentaires,
2. Gène selon la revendication 1, caractérisé en ce que selon les mutations (a) , au moins une mutation est effectuée au niveau des codons 976-978, 991-993 de la partie codant pour la région C3 et au moins une mutation est effectuée au niveau des codons 1039-1041 ou 1060-1062 de la partie codant pour la région C3, la position d'au moins l'un quelconque desdits codons pouvant varier de trois à vingt-quatre nucléotides.
3. Gène selon la revendication 2, caractérisé en ce que sa séquence consiste en une séquence choisie parmi les séquences identifiées en SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 et SEQ ID NO: 23 ou leurs séquences complémentaires.
4. Gène selon la revendication 1, caractérisé en ce que selon les mutations (b) , au moins une mutation est effectuée au niveau des codons 976-978, 991-993, 1039-1041 ou 1060-1062 de la partie codant pour la région C3 et au moins une mutation est effectuée au niveau du codon 880- 882 de la partie codant pour la région V3 , la position d'au moins l'un quelconque desdits codons pouvant varier de trois à vingt-quatre nucléotides.
5. Gène selon la revendication 4, caractérisé en ce que les mutations sont effectuées au niveau des codons 976-978, 991-993 et 880-882, la position d'au moins l'un quelconque desdits codons pouvant varier de trois à vingt- quatre nucléotides.
6. Gène selon la revendication 5, caractérisé en ce que sa séquence consiste en une séquence choisie parmi les séquences identifiées en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 et SEQ ID NO: 4 ou leurs séquences complémentaires.
7. Gène selon la revendication 4, caractérisé en ce que, au moins une mutation est effectuée au niveau du codon 976-978 ou 991-993, au moins une mutation est effectuée au niveau du codon 880-882, et au moins une mutation est effectuée au niveau du codon 1039-1041 ou 1060-1062 , la position d'au moins l'un quelconque desdits codons pouvant varier de trois à vingt-quatre nucléotides.
8. Gène selon la revendication 7, caractérisée en ce que les mutations sont effectuées au niveau des codons 976-978, 991-993, 880-882, 1039-1041 et 1060-1062.
9. Gène selon la revendication 8, caractérisé en ce que sa séquence consiste en une séquence choisie parmi les séquences identifiées en SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6 et SEQ ID NO : 7 ou leurs séquences complémentaires.
10. Gène selon la revendication 1, caractérisé en ce que selon les mutations (c) , au moins une mutation est effectuée au niveau du codon 805-807 de la partie codant pour la région C2, la position d'au moins l'un quelconque desdits codons pouvant varier de trois à vingt-quatre nucléotides .
11. Gène selon la revendication 1, caractérisé en ce que selon les mutations (d) , au moins une mutation est effectuée au niveau du codon 880-882 de la partie codant pour la région V3 , la position d'au moins l'un quelconque desdits codons pouvant varier de trois à vingt-quatre nucléotides .
12. Glycoprotéine Env mutée du virus VIH-1, caractérisée en ce qu'elle présente par rapport à une protéine Env native d'un isolât primaire de primoinfection, dit de référence, au moins deux mutations au niveau des sites de glycosylation conservés de ladite protéine de référence, d'un isolât primaire à un autre, chaque mutation consistant en le remplacement d'une asparagine par une glutamine, les deux mutations au moins étant choisies parm les suivantes :
(a' ) au moins deux mutations dans la région C3 de la protéine Env,
(b' ) au moins une mutation dans la région C3 et au moins une mutation dans la région V3,
(c' ) au moins une mutation dans la région C2 et au moins une mutation dans la région V3 choisie parmi les sites de glycosylation au niveau de l'acide aminé 288 ou 324,
(d' ) au moins une mutation dans la région C2 choisie parmi les sites de glycosylation au niveau de l'un quelconque des acides aminés 223, 227, 234, 255, 282, et au moins une mutation dans la région V3, la position desdits sites de glycosylation conservés d'un isolât primaire de primo-infection à un autre pouvant varier d'un à huit acides aminés, ou la glycoprotéine Env mutée consiste en l'une quelconque des séquences ou le gène env muté consiste en l'une quelconque des séquences SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 ou SEQ ID NO: 20.
13. Glycoprotéine selon la revendication 12, caractérisée en ce que selon les mutations (a' ) , au moins une mutation est effectuée au site de glycosylation au niveau de l'acide aminé 326 ou 331 et au moins une mutation est effectuée au site de glycosylation au niveau de l'acide aminé 347 ou 354, la position desdits sites de glycosylation conservés d'un isolât primaire de primo-infection à un autre pouvant varier d'un à huit acides aminés.
14. Glycoprotéine selon la revendication 13, caractérisée en ce que sa séquence consiste en une séquence choisie parmi les séquences identifiées en SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 et SEQ ID NO: 23.
15. Glycoprotéine selon la revendication 12, caractérisée en ce que selon les mutations (b' ) , au moins une mutation est effectuée au niveau de l'acide aminé 326 ou 331 et au moins une mutation est effectuée au niveau de l'acide aminé 294, la position d'au moins l'un quelconque desdits sites de glycosylation conservés d'un isolât primaire de primo-infection à un autre, pouvant varier d'un à huit acides aminés.
16. Glycoprotéine selon la revendication 15, caractérisée en ce que les mutations sont effectuées au niveau des acides aminés 326, 331 et 294, la position d'au moins l'un quelconque desdits sites de glycosylation conservés d'un isolât primaire de primo- infection à un autre pouvant varier d'un à huit acides aminés.
17. Glycoprotéine selon la revendication 16, caractérisée en ce que sa séquence consiste en une séquence choisie parmi les séquences identifiées en SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 et SEQ ID NO: 14.
18. Glycoprotéine selon la revendication 12 , caractérisée en ce, selon les mutations (b' ) , au moins une mutation est effectuée au niveau de l'acide aminé 326 ou 331, au moins une mutation est effectuée au niveau de l'acide aminé 347 ou 354 et au moins une mutation est effectuée au niveau de l'acide aminé 294, la position d'au moins l'un quelconque desdits sites de glycosylation conservés d'un isolât primaire de primo-infection à un autre pouvant varier d'un à huit acides aminés.
19. Glycoprotéine selon la revendication 18, caractérisée en ce que les mutations sont effectuées au niveau des acides aminés 326, 331, 294, 347 et 354, la position d'au moins l'un quelconque desdits sites de glycosylation conservés d'un isolât primaire de primo- infection à un autre pouvant varier d'un à huit acides aminés .
20. Glycoprotéine selon la revendication 19, caractérisée en ce que sa séquence consiste en une séquence choisie parmi les séquences identifiées en SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 et SEQ ID NO: 17.
21. Glycoprotéine selon la revendication 12, caractérisée en ce que, selon les mutations (c' ) , au moins une mutation est effectuée au niveau de l'acide aminé 269 de la région C2, la position desdits sites de glycosylation conservés d'un isolât primaire de primoinfection à un autre pouvant varier d'un à huit acides aminés .
22. Glycoprotéine selon la revendication 12, caractérisée en ce que, selon les mutations (d' ) , au moins une mutation est effectuée au niveau de l'acide aminé 294 de la région V3, la position desdits sites de glycosylation conservés d'un isolât primaire de primoinfection à un autre pouvant varier d'un à huit acides aminés .
23. Composition pharmaceutique comprenant : (i) au moins un gène muté codant pour une glycoprotéine d'enveloppe mutée du virus VIH-1, ledit gène muté étant choisi parmi l'un quelconque des gènes décrits dans l'une quelconque des revendications 1 à 11 et étant placé sous le contrôle de séquences de régulation permettant son expression dans une cellule hôte, un véhicule pharmaceutiquement acceptable, et de manière facultative un agent additionnel qui facilite la pénétration dudit gène muté dans ladite cellule et/ou qui permet de cibler ladite cellule ; ou
(ii) au moins le gène identifié en (i) clone dans un vecteur viral recombinant .
24. Composition pharmaceutique comprenant :
-au moins une glycoprotéine d'enveloppe mutée du virus VIH-1, ladite glycoprotéine mutée étant choisie parmi l'une quelconque des glycoprotéines décrites dans l'une quelconque des revendications 12 à 22,
-un véhicule et/ou excipient et/ou adjuvant et/ou diluant pharmaceutiquement acceptable.
25. Procédé pour obtenir des anticorps selon lequel on immunise un animal mammifère, tel que souris ou rat ou singe, avec au moins un gène muté codant pour une glycoprotéine d'enveloppe mutée du virus VIH-1, ledit gène muté étant choisi parmi l'un quelconque des gènes décrits dans l'une quelconque des revendications 1 à 11 et étant placé sous le contrôle de séquences de régulation permettant son expression in vivo .
26. Procédé pour obtenir des anticorps selon lequel on immunise un animal mammifère, tel que souris ou rat ou singe, avec au moins une glycoprotéine d'enveloppe mutée du virus VIH-1, ladite glycoprotéine mutée étant choisie parmi l'une quelconque des glycoprotéines décrite dans l'une quelconque des revendications 12 à 22.
27. Anticorps obtenus selon le procédé de la revendication 25 ou 26.
28. Composition pharmaceutique comprenant au moins un anticorps selon la revendication 27.
29. Procédé d'évaluation d'un agent thérapeutique, selon lequel on administre à un animal au moins un gène muté codant pour une glycoprotéine d'enveloppe mutée du virus VIH-1 tel que décrit dans l'une quelconque des revendications 1 à 11, et on réalise :
- un dosage d'anticorps spécifiques de la glycoprotéine mutée, et/ou
- un dosage des anticorps neutralisants spécifiques de la glycoprotéine mutée ou native, et/ou
- un dosage de la réponse immune cellulaire induite contre la glycoprotéine mutée par exemple par un test d' activation in vitro de cellules lymphocytes T « helper » spécifique (s) de la glycoprotéine mutée.
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