WO2003023391A2 - Verfahren und mittel zur direkten messung von vitamin-d-verbindungen in serum oder plasma - Google Patents

Verfahren und mittel zur direkten messung von vitamin-d-verbindungen in serum oder plasma Download PDF

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Sabine Friedl
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites

Definitions

  • the invention relates to a method for the quantitative determination of vitamin D compounds in serum or plasma.
  • Vitamin D 3 cholecalciferol
  • vitamin D 2 ergocalciferol
  • Vitamin D 2 and D 3 differ only slightly in the side chains.
  • the body stores vitamin D as 25-hydroxyvitamin-D, which is therefore the vitamin D metabolite with the highest concentration in the circulation.
  • D-hormone which regulates calcium absorption from the intestine, bone mineralization, osteoplast differentiation, bone matrix synthesis and also neuromuscular functions.
  • Vitamin D deficiency is an important risk factor for senile osteoporosis. Its early diagnosis and vitamin D supplementation enable effective fracture prevention. A severe vitamin D deficiency of less than 5 micrograms of 25-hydroxyvitamin-D per milliliter of serum (12.5 ⁇ mol / L) leads to rickets in children or to osteomalacia in adults. An excess of vitamin D, for example due to drug overdose, causes hypercalcaemia syndrome.
  • WO 99/67211 (Armbruster et al) teaches the preparation of the serum and plasma sample for the vitamin D determination by ethanol precipitation of the serum or plasma proteins.
  • the protein precipitate is centrifuged off and the ethanolic supernatant with the soluble vitamin D metabolites is used in the binding assay.
  • This object is achieved by a method for the determination of vitamin D compounds in plasma or serum by protein binding analysis, which is characterized in that the plasma or serum before the protein binding analysis contains at least 0.05% by weight of a soluble hydroxylated aromatic carboxylic acid, based on the weight is added to the sample liquid and that the protein binding analysis is based on antibodies against the vitamin D compound to be determined.
  • the pH of the sample is preferably adjusted to 3.0 to 9.0.
  • the salt of a salicylic acid is added to the sample from 0.5 to 15% by weight, preferably from 1 to 12% by weight, particularly preferably from 2 to 8% by weight, based in each case on the weight of the sample.
  • the binding analysis is carried out in the presence of 1 to 7% by weight of sodium or potassium salicylate at a pH between 3.0 and 7.0.
  • 0.1 to 5 preferably 1 to 3% by weight of natural and / or chemically modified cyclodextrin can also be added to the sample, in particular if the serum or plasma sample is lipemic.
  • the sample can also be purified by binding the vitamin D compound to an antibody, preferably a monoclonal antibody against the D hormone.
  • the method according to the invention is particularly suitable for measuring a vitamin D compound selected from 25-hydroxy-vitamin D 2 , 25-hydroxy-vitamin D 3 , 1 ⁇ , 25-dihydroxy-vitamin D 2 , 1 ⁇ , 25 -Dihydroxy-Vitamin-D 3 .
  • the competitive bond analysis is carried out as part of an ELISA, RIA, FIA or LIA.
  • the binding analysis can be carried out using an antibody-coated solid phase, the antibody binding the vitamin D compound to be determined.
  • the vitamin D tracer is preferably coupled to a directly determinable coloring, fluorescent or chemiluminescent marker.
  • Another aspect of the invention relates to a release and analysis buffer for the direct measurement of vitamin D, 25-hydroxy-vitamin D 2 , 25-hydroxy-vitamin D 3l 1 ⁇ , 25-dihydroxy-vitamin D 2 , 1 ⁇ , 25-dihydroxy-vitamin D 3 or another derivative of vitamin D in plasma or serum by protein binding analysis, the buffer having a pH of 3.0 to 9.0 and containing at least 0.05% by weight of a soluble hydroxylated aromatic carboxylic acid ,
  • the buffer preferably contains a salt of salicylic acid in an amount of 1 to 15% by weight, preferably 2 to 8% by weight.
  • the release and analysis buffer according to the invention particularly preferably has a pH between 3.0 and 7.0 and sodium or potassium salicylate in an amount of 1 to 15% by weight, preferably 2 to 8% by weight. It can also contain 0.1 to 5% by weight, preferably 1 to 3% by weight, of natural and / or chemically modified cyclodextrin.
  • Another aspect of the invention relates to a reagent set for direct measurement of vitamin D, 25-hydroxy-vitamin D 2 , 25-hydroxy-vitamin D 3 , 1 ⁇ , 25-dihydroxy-vitamin D 2 , 1 ⁇ , 25-dihydroxy -Vitamin-D 3 or another derivative of vitamin D in plasma or serum by protein binding analysis, comprising a release and analysis buffer according to the invention, at least one antibody against the vitamin D compound to be measured and a vitamin D tracer for a competitive protein binding analysis.
  • the tracer can be coupled to a directly determinable coloring, fluorescent or chemiluminescent marker
  • 2A, B are graphical representations of the comparative analysis with measured values from conventional external vitamin D determinations (purified by ethanol precipitation or column chromatography) and from direct determination according to the method according to the invention; 3A-B graphical representation of the recovery of different amounts of added vitamin D in different serum samples and buffers. 4A-B graphical representation of the linearity of the direct determination method according to the invention with different (increasing) vitamin D concentration
  • the method according to the invention differs from the prior art in that at least 0.05% by weight of a soluble hydroxylated aromatic carboxylic acid, based on the weight of the sample, is added to the plasma or serum sample before the protein binding analysis and the protein binding analysis on antibodies against the The determining vitamin D connection takes place and not on the vitamin D binding protein (DBP) or other vitamin D binding proteins.
  • DBP vitamin D binding protein
  • the pH of the sample is preferably set between 3.0 and 9.0 for protein binding analysis on the antibody.
  • a slightly acidic pH in the range from 3.0 to 7.0 has proven to be particularly advantageous.
  • Protein binding analysis on the antibody is very particularly preferably carried out at a pH of about 6.0.
  • a salicylate salt such as sodium or potassium salicylate is added to the sample before the protein binding analysis, preferably 1 to 12% by weight, particularly preferably 2 to 8% by weight of salicylate salt.
  • the binding analysis is particularly preferably carried out in the presence of 1 to 7% by weight of sodium or potassium salicylate at a pH between 3.0 and 7.0. All weight percentages relate to the weight of the sample.
  • the samples can optionally contain 0.1 to 5% by weight, preferably 1 to 3% by weight of natural and / or chemically modified cyclodextrin can be added.
  • foodstuffs such as milk, cheese, etc. can in principle also be examined directly for their vitamin D content.
  • the method according to the invention can be carried out together with conventional sample preparation methods. In individual cases, it may be appropriate to first partially remove the interfering substances and serum proteins from the plasma or serum sample by organic extraction or denaturing precipitation and then to carry out a protein binding analysis according to the invention.
  • the disruptive influence of the vitamin D-binding proteins remaining in the sample after processing is neutralized by the addition of a hydroxylated aromatic carboxylic acid, for example by salicylic acid, a salt or other derivative of salicylic acid, possibly also by acetylsalicylic acid.
  • a previous sample purification is particularly useful if the content of D-hormone in human serum is determined in addition to the form of vitamin D storage.
  • the D hormone can, for example, be easily isolated from the human serum or plasma by binding to an antibody which is specific only for the dihydroxy form. Monoclonal antibodies that specifically recognize the D hormone but not 25-hydroxyvitamin D are known and easy to produce. It is then advisable to carry out the binding between the D hormone and the monoclonal antibody in the presence of a salicylate salt in order to eliminate the simultaneous competing binding to vitamin D binding proteins naturally occurring in human serum, such as DBP (vitamin D binding protein).
  • DBP vitamin D binding protein
  • the method according to the invention is suitable for the quantitative determination of all types of vitamin D compounds. Diagnostically particularly interesting and important are: 25-Hydroxyvitamin-D 2 , 25-Hydroxyvitamin-D 3 , 1 ⁇ , 25-Dihydroxyvitamin-D 2 and 1 ⁇ , 25-Dihydroxyvitamin-D 3 .
  • the competitive protein binding assay according to the invention can be carried out as an enzyme-linked immunoabsorbent assay (ELISA - enzyme linked immunosorbent assay) or radioimmunoassay (RIA).
  • ELISA - enzyme linked immunosorbent assay enzyme-linked immunosorbent assay
  • RIA radioimmunoassay
  • Non-radioactive detection systems based on fluorescence and chemiluminescence markers are particularly preferred. If the vitamin D tracer is coupled with the enzyme for the detection system, for example with alkaline phosphatase or a fluorescence or chemiluminescence marker, then the fixed phase or the wall of the microtiter plate with antibodies against the vitamin D to be determined -Connection coated.
  • An advantage of the method according to the invention is that the quantitative determination of the vitamin D compounds can be carried out directly in a liquid sample such as serum or plasma.
  • the sample does not have to be prepared by problematic protein precipitation, organic extraction and / or by column chromatography. Instead, the vitamin D compounds to be determined are displaced by the addition of salicylic acid, a salicylic acid salt or a derivative of salicylic acid in vitro by the vitamin D-binding proteins naturally present in the plasma or serum, so they are released in the sample and can then are determined directly using the principle of competing binding to anti-vitamin D antibodies.
  • Derivatives or salts thereof not only effectively displace the 25-hydroxy or 1 ⁇ , 25-dihydroxy-vitamin D from the binding sites on the vitamin D binding protein (DBP), but generally from all binding sites in the plasma or Serum-occurring proteins that can bind vitamin D
  • the vitamin D-binding proteins include not only the highly specific, highly affine binding DBP (Gc-globulin), which is also known as Gc-globulin or group-specific component, but also abundant proteins such as albumin, ⁇ -fetoprotein and many others more. These proteins can also bind 25-hydroxy- and 1 ⁇ , 25-dihydroxy-vitamin-D with more or less high specificity and affinity.
  • the purification of the vitamin D compounds is comparatively incomplete as in the case of ethanol or denaturing protein precipitation, residual amounts of vitamin D binding proteins such as serum albumin are present in the binding assay despite the purification.
  • the proteins remaining in the sample solution can then not only bind the vitamin D or the vitamin D tracer in the competitive binding assay, but also go to the hydrophobic wall of the sample vessel or the solid phase, so that the quantitative vitamin D determination of Randomness depends on how complete the protein precipitation and the cholesterol level of the sample is.
  • the method according to the invention offers the advantage that the vitamin D compounds do not have to be isolated and purified, but rather the competitive protein binding assay can be done directly in plasma or serum.
  • Z is the oxygen or sulfur atom of an ether group or a carbon atom
  • X is a substituted or unsubstituted hydrocarbon group of 0.8 to 4.2 ⁇ m in length, preferably a C 8 - to C 2 group, which may optionally have the heteroatoms S, O, N or P, very preferably a hexamido, octamido or Decamido-amidopropyl linker group;
  • Y is hydrogen or a hydroxy group;
  • A is a functional group selected from groups bound by a high affinity protein, for example antibodies or streptavidin, reactive groups for coupling the functional vitamin D derivative to a solid support such as beads, labeled solid particles or magnetic particles; functional proteins such as green fluorescent protein (GFP), enzymes such as alkaline phosphatase or peptides and signaling groups such as fluorescent or chemiluminescent groups;
  • GFP green fluorescent protein
  • enzymes such as alkaline phosphatase or peptides
  • signaling groups such as fluorescent or chemiluminescent groups
  • R is the side group of a vitamin D metabolite, preferably the side group of
  • Vitamin D 2 or D 3 preferably the 25-hydroxylated side group of vitamin D 2 or D 3 .
  • the dissociation constant K should here be greater than 10 8 , dissociation constants greater than 10 16 are preferred.
  • A is selected from biotin, digoxigenin, tyrosine, substituted tyrosine, substituted amino acids, characteristic amino acid and peptide sequences, FITC, proteins and protein groups such as protein A or protein G or another vitamin D derivative.
  • the vitamin D tracer is particularly preferably covalently coupled to a color or signal-giving group such as a ruthenium complex, fluorescein, etc.
  • the spacer group X is preferably selected from substituted and unsubstituted C bodies with a length of 0.8 to 4.2 nm, a spacer group of 0.12 nm in length is particularly preferred.
  • An aminocarboxylic acid in particular an aminoundecanoic acid, peptide and keto groups or a substituted or unsubstituted aminopolyether radical with a length of 0.8 to 4.2 nm, preferably about 0.9 to 1.5 nm, is very particularly preferred. This distance between group A and the binding or recognition site for the vitamin D residue allows the binding proteins to bind to their respective binding site and not interfere with each other.
  • vitamin D tracer derivatives which contain a further vitamin D group as functional group A.
  • the advantage of these dimeric vitamin D derivatives as tracers is that they do not introduce non-systemic groups into the assay and allow increased sensitivity and reliability of the competitive binding analysis. Symmetrical vitamin D dimers are particularly favorable.
  • Vitamin D tracers in which A is a solid phase or a fluorescent or chemiluminescent group are also suitable.
  • examples include: fluorescein, ruthenium complex compounds, etc.
  • vitamin D In the direct determination of vitamin D in serum, all vitamin D that is bound to DBP (Gc-globulin) or other vitamin D-binding proteins such as albumin is first displaced from their binding sites and used for binding with the vitamin D Antibodies made available. According to the invention, this is done by adding a hydroxylated aromatic carboxylic acid, for example a salicylic acid compound, preferably sodium or potassium salicylate.
  • the salicylic acid compound has the property of displacing the vitamin D from the DBP / Gc globulin and other vitamin D-binding proteins such as albumin.
  • the salicylate does not block the binding of anti-vitamin D antibodies to 25-hydroxyvita- min-D or 1 ⁇ , 25-dihydroxyvitamin-D, so that a direct quantitative determination in serum or plasma is possible in a competitive binding analysis. Because of the omitted sample preparation steps, the method according to the invention can be automated easily, quickly and easily. In addition, the measured values are not disturbed by the individual properties of the sample and randomnesses in the preparation of the sample.
  • the method according to the invention thus enables a non-radioactive, quantitative determination of 25-hydroxy- and 1 ⁇ , 25-dihydroxyvitamin-D in serum or plasma without complex sample preparation steps.
  • the direct method is therefore particularly suitable for routine examinations in the context of osteoporosis prophylaxis, in the case of suspected D-hypovitaminosis or D-hypervitaminosis, for general diagnosis and in research.
  • Another aspect of the invention relates to a set of reagents for the determination of vitamin D metabolites such as 25-hydroxy and 1 ⁇ , 25-dihydroxyvitamin-D, which contains, inter alia, a functional vitamin D derivative and salicylic acid or a salicylic acid compound in a binding or dilution buffer.
  • the reagent set optionally includes anti-vitamin D antibodies, that is to say antibodies to 25-hydroxyvitamin D 2 3 or 1 ⁇ , 25-dihydroxyvitamin D2 / 3 or other metabolites of vitamin D, coated microtiter plates and / or magnetic or other microparticles and reagents.
  • the reagent set also contains cyclodextrin (CD) for sequestering and masking disruptive hydrophobic molecules such as fatty acids, cholesterol, etc. in the plasma or serum sample.
  • CD cyclodextrin
  • the alpha, beta or gamma cyclodextrin is preferably used in amounts of 0.1 to 10% by weight, preferably about 0.2 to 7.5% by weight, particularly preferably in an amount of 1 to 5% by weight. based on the final concentration in the sample.
  • the aqueous cyclodextrin stock solution is preferably neutral to slightly alkaline, since cyclodextrins are usually split by acid.
  • the cyclodextrin (CD) can also be chemically modified, for example with methyl, ethyl, propyl, hydroxyethyl, 2-hydroxypropyl, glycosyl, maltosyl, carboxymethyl. Natural cyclodextrins and 2-hydroxypropyl-beta-cyclodextrin are particularly preferred. Examples
  • Example 1 Determination of 25-hydroxyvitamin-D in serum or plasma (i) Binding of vitamin D tracer to a solid phase. 25-Hydroxyvitamin-D-3ß-3- [6-N- (biotinyl) hexamidojamidopropyl ether was converted into Streptavidin bound to a solid phase. For this purpose, 100 ng streptavidin was first added to the wells of a microtiter plate, dissolved in 200 ⁇ l 60 mmol sodium hydrogen carbonate, pH 9.6, and the plate was incubated at 4 ° C. overnight. The streptavidin solution was removed and the wells washed five times with 200 ⁇ l wash buffer (PBS, pH 7.4 with 0.05% Tween-20).
  • PBS pH 7.4 with 0.05% Tween-20
  • the serum and plasma samples were only stored briefly at room temperature. The sample was stored at 4 to 8 ° C if the determination was made within 24 hours after collection. Otherwise, the samples were frozen at -20 ° C until determined. Multiple freezing and thawing of the sample was avoided. Hemolysis did not interfere with the result. Whole blood, however, could not be used as sample material. Lipemic samples were centrifuged at approx. 30,000 x G for 10 minutes until the fat phase floated upwards and the aqueous phase could be removed with the pipette through the fat layer. In the case of strongly lipemic material, use was made of a delipidation kit for lipemic sample material.
  • cyclodextrin was added to the sample, either as natural cyclodextrin or as chemically modified cyclodextrin. However, not every cyclodextrin proved to be suitable.
  • concentration of natural alpha-cyclodextrin in the sample was preferably set to about 2.5% by weight.
  • the sample, serum or plasma was diluted 1:20 in sample dilution buffer, e.g. B. 20 ul serum to 400 ul phosphate buffer, pH 6.0, 0.1% gelatin with 0.05% by weight, 0.5% by weight and 5% by weight sodium salicylate. The samples were mixed well and left for 5 to 10 minutes at room temperature (21 to 25EC).
  • concentration of salicyl compound in the binding buffer was 0.05% by weight, preferably 0.5% by weight, particularly preferably 5% by weight sodium salicylate in phosphate buffer, pH 6.0.
  • the micro titer plate was 24 hours at 4 ! ° C shaken in the dark.
  • the 25-hydroxyvitamin-D present in the sample then competed with the vitamin D tracer for the binding sites of the antibody.
  • the solutions were then removed from the wells and the wells were washed five times with 200 ⁇ l of washing buffer.
  • the presence of the salicyl compound in the assay meant that the vitamin D-binding proteins present in the sample (such as, for example, the serum albumin) could not bind to the vitamin D tracer, which leads to false high vitamin D contents in the prior art , Bonds of proteins that bind vitamin D directly to the hydrophobic wall of the microtiter plate also had no influence on the measurement values, because the 25-hydroxyvitamin-D to be determined in the sample could not, due to the presence of the salicyl compound, also not bind to the vitamin adhering to the wall -D bind binding proteins.
  • the 2-hydroxyvitamin D values in the sample are false low. According to the invention, both binding processes are largely blocked by the added salicyl compound.
  • FIGS. 1A-D the calibration curves shown in FIGS. 1A-D were created.
  • the ordinate shows the optical density as the mean of the two measurements at 450 nm; the abscissa shows the concentration of 25-hydroxyvitamin-D in nmoles.
  • the results show that the best conditions are achieved with pH 6.0 and 0.1% gelatin and 5% sodium salicylate.
  • Example 3 Recovery in different serum samples.
  • sample preparation or the competing binding analysis was carried out as stated in the example at pH 6.0, 0.1% gelatin, 5% sodium salicylate in serum.

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Abstract

Der Erfindung betrifft ein Verfahren und einen Probenpuffer für einen direktmessenden Assay zur Bestimmung von Vitamin-D-Verbindungen wie 25-Hydroxy-Vitamin-D2, 25-Hydroxy-Vitamin-D3. 1α,25-Dihydroxy-Vitamin-D2, 1α,25-Dihydroxy-Vitamin-D3 .in Plasma oder Serum. Der Assay beruht einer Proteinbindungsanalyse an Antikörpern -anstelle von Vitamin-D-Bindungsprotein- gegen die zu bestimmende Vitamin-D-Verbindung und der Proben- und Analysepuffer enthält bei bevorzugt leicht saurem pH mindestens 0.05 Gew.% einer löslichen hydroxylierten aromatischen Carbonsäure oder eines Salzes hiervon, bevorzugt 1 bis 7 Gew. % Natrium- oder Kaliumsalicylat bei einem pH zwischen 3,0 und 7,0, sowie optional Cyclodextrin.

Description

VERFAHREN UND MITTEL ZUR DIREKTEN MESSUNG VON VITAMIN-D-VERBINDUNGEN IN SERUM ODER PLASMA
GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Vitamin-D- Verbindungen in Serum oder Plasma.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG Der Mensch kann D-Vitamine oder Calciferole nur unter Zuhilfenahme von
Sonnenlicht in der Haut bilden. Sowohl das Cholecalciferol (Vitamin-D3) in der menschlichen Haut als auch das in Lebensmitteln vereinzelt zugesetzte Ergocalciferol (Vitamin- D2) werden in der Zirkulation vom Vitamin-D-Bindungsprotein (DBP) gebunden, zur Leber transportiert und zu 25-Hydroxyvitamin-D2 bzw. -D3 metabolisiert. Vitamin-D2 und -D3 unterscheiden sich nur geringfügig in den Seitenketten. Der Körper speichert Vitamin-D als 25-Hydroxyvitamin-D, das somit auch der Vitamin-D-Metabolit mit der höchsten Konzentration in der Zirkulation ist. Er wird bei Bedarf in der Niere zum biologisch aktiven 1α,25-Dihydroxyvitamin-D, dem sogenannten D-Hormon, hydroxyliert, das die Calciumaufnahme aus dem Darm regelt, die Knochenmineralisierung, die Osteo- plastendifferenzierung, die Knochenmatrixsynthese und auch neuromuskuläre Funktionen.
Bereits ein leichter Mangelzustand von unter 15 Mikrogramm 25-Hydroxyvitamin- D pro Milliliter Serum (37,5 μMol/L) führt wegen der geringeren Calciumaufnahme zu einem Ansteigen des Parathormonspiegels und zu einer gesteigerten Knochen- resorption. Vitamin-D-Mangel ist ein wichtiger Risikofaktor für die senile Osteoporose. Seine frühzeitige Diagnose und die Supplementierung mit Vitamin-D erlauben eine wirksame Prävention von Frakturen. Ein schwerer Vitamin-D-Mangel von weniger als 5 Mikrogramm 25-Hydroxyvitamin-D pro Milliliter Serum (12,5 μMol/L) führt bei Kindern zur Rachitis oder bei Erwachsenen zur Osteomalazie. Ein Überschuss an Vitamin-D, bspw. durch Medikamenten-Überdosierung, verursacht ein Hypercalcämie-Syndrom.
In Deutschland leidet im Winter bis zu einem Drittel der Normalbevölkerung über 50 Jahren an Vitamin-D-Mangel. Gründe sind der Mangel an Sonnenlicht und die bei älteren Menschen verminderte Vitamin-D-Synthese in der Haut. Eine besondere Risikogruppe bilden Menschen mit dunkler Hautfarbe. Bei geriatrischen Patienten ist in ca. 3% der Behandlungsfälle ein Vitamin-D-Mangel nachweisbar. Auch jüngere Menschen können an Vitamin-D-Mangel leiden: bei Magen-Darmerkrankungen, Leberfunktions- Störungen, Maladsorption oder medikamentös erhöhtem Metabolismus, bspw. durch Antiepileptika. Der Gehalt an Vitamin-D in Humanserum und -plasma ist deshalb ein wichtiger diagnostischer Parameter.
Die derzeitigen Laborverfahren zur Bestimmung von Vitamin-D in Humanserum und -plasma sind aufwendig und mühsam (siehe Tanner et al. (1988), J. Assoc. of Analyt. Chem., 17, 607-710).
US 5 981 779 (Holick et al) und WO 89/01631 (DeLuca et al) beschreiben Vitamin-D-Assays für Hydroxy- und Dihydroxyvitamin-D durch Analyse ihrer Bindung an DBP im Vergleich zu einer konkurrierenden Vitamin-D-Verbindungen. Zuvor müssen die Vitamin-D-Metaboliten aber erst durch organische Extraktion aus der Blut- und Serumprobe isoliert und chromatographisch aufgereinigt werden.
WO 99/67211 (Armbruster et al) lehrt die Aufbereitung der Serum- und Plasmaprobe für die Vitamin-D-Bestimmung durch Ethanolfällung der Serum- bzw. Plasmaproteine. Das Proteinpräzipitat wird abzentrifugiert und der ethanolische Überstand mit den löslichen Vitamin-D-Metaboliten im Bindungsassay eingesetzt.
Alle vorgenannten Verfahren sind aber wegen der notwendigen Probenaufbereitung fehlerträchtig und umständlich. Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur direkten quantitativen Messung von Vitamin-D-Verbindungen in Serum oder Plasma bereitzustellen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Bestimmung von Vitamin-D- Verbindungen in Plasma oder Serum durch Proteinbindungsanalyse, das sich dadurch auszeichnet, dass dem Plasmas oder Serum vor der Proteinbindungsanalyse mindestens 0.05 Gew.% einer löslichen hydroxylierten aromatischen Carbonsäure, bezogen auf das Gewicht der Probenflüssigkeit, zugesetzt wird und dass die Proteinbindungsanalyse auf Antikörpern gegen die zu bestimmende Vitamin-D-Verbindung beruht. Der pH der Probe wird dabei bevorzugt auf 3,0 bis 9,0 eingestellt.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird der Probe 0,5 bis 15 Gew.%, bevorzugt 1 bis 12 Gew.%, besonders bevorzugt 2 bis 8 Gew.%, jeweils bezogen auf das Gewicht der Probe, das Salz einer Salicylsäure zugesetzt. In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Bindungsanalyse in Gegenwart von 1 bis 7 Gew.% Natriumoder Kaliumsalicylat bei einem pH zwischen 3,0 und 7,0. Der Probe kann ferner 0,1 bis 5, bevorzugt 1 bis 3 Gew.% natürliches und/oder chemisch modifiziertes Cyclodextrin zugesetzt werden, insbesondere wenn die Serum- oder Plasmaprobe lipämisch ist. Falls erforderlich kann die Probe zudem durch Bindung der Vitamin-D-Verbindung an einen Antikörper, bevorzugt einen monoklonalen Antikörper gegen das D- Hormon, aufgereinigt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders geeignet für die Messung einer Vitamin-D-Verbindung, ausgewählt aus 25-Hydroxy-Vitamin-D2, 25-Hydroxy-Vitamin-D3, 1α,25-Dihydroxy-Vitamin-D2, 1α,25-Dihydroxy-Vitamin-D3. Die kompetitive Bindungsanalyse erfolgt dabei im Rahmen eines ELISA, RIA, FIA oder LIA. Die Bindungsanalyse kann mithilfe einer Antikörper-beschichteten Festphase erfolgen, wobei der Antikörper die zu bestimmende Vitamin-D-Verbindung bindet. Der Vitamin-D- Tracer ist bevorzugt mit einem direkt bestimmbaren Färb-, Fluoreszenz- oder Chemi- lumineszenz-Marker gekoppelt.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft einen Freisetzungs- und -analysepuffer für die direkte Messung von Vitamin-D, 25-Hydroxy-Vitamin-D2, 25-Hydroxy-Vitamin-D3l 1α,25-Dihydroxy-Vitamin-D2, 1α,25-Dihydroxy-Vitamin-D3 oder eines anderen Derivates von Vitamin-D in Plasma oder Serum durch Proteinbindungsanalyse, wobei der Puffer einen pH von 3,0 bis 9,0 besitzt und mindestens 0.05 Gew.% einer löslichen hydroxylierten aromatischen Carbonsäure enthält. Bevorzugt enthält der Puffer ein Salz der Salicylsäure in einer Menge von 1 bis 15 Gew.%, bevorzugt 2 bis 8 Gew.%. Besonders bevorzugt weist der erfindungsgemäße Freisetzungs- und -analysepuffer einen pH zwischen 3,0 und 7,0 auf und Natrium- oder Kaliumsalicylat in einer Menge von 1 bis 15 Gew.%, bevorzugt 2 bis 8 Gew.%. Er kann ferner 0,1 bis 5 Gew.%, bevorzugt 1 bis 3 Gew.% natürliches und/oder chemisch modifiziertes Cyclodextrin enthalten.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft einen Reagenziensatz zur direkten Messung von Vitamin-D, 25-Hydroxy-Vitamin-D2, 25-Hydroxy-Vitamin-D3, 1α,25- Dihydroxy-Vitamin-D2, 1α,25-Dihydroxy-Vitamin-D3 oder eines anderen Derivates von Vitamin-D in Plasma oder Serum durch Proteinbindungsanalyse, umfassend einen erfindungsgemäßen Freisetzungs- und Analysepuffer, mindestens einen Antikörper gegen die zu messende Vitamin-D-Verbindung sowie einen Vitamin-D-Tracer für eine kompetitive Proteinbindungsanalyse. Der Tracer kann mit einem direkt bestimmbaren Färb-, Fluoreszenz- oder Chemilumineszenz-Marker gekoppelt sein
Weitere Vorteile, Merkmale und Ausführungsformen der Erfindung ergeben sich aus den nachstehenden Beispielen und den anliegenden Zeichnungen. KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN Es zeigt:
Fig. 1 A-D ELISA-Eichkurven mit verschiedenen 0, 0.05, 0.5 und 5 Gewichtsprozent Natriumsalicylat im Analysepuffer;
Fig. 2 A,B graphische Darstellungen der Vergleichsanalyse mit Messwerten aus herkömmlichen externen Vitamin-D-Bestimmungen (aufgereinigt durch E- thanolfällung oder Säulenchromatographie) und aus direkten Bestimmung gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren; Fig. 3A-B graphische Darstellung der Wiederfindung von unterschiedlichen Mengen zugesetztem Vitamin-D in verschiedenen Serumproben und Puffern. Fig. 4A-B graphische Darstellung der Linearität des erfindungsgemäßen Direktbe- stimmungsverfahrens bei unterschiedlichen (zunehmenden) Vitamin-D- Konzentration
EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Das erfindungsgemäße Verfahren unterscheidet sich vom Stand der Technik dadurch, dass der Plasma- oder Serumprobe vor der Proteinbindungsanalyse mindestens 0,05 Gew.% einer löslichen hydroxylierten aromatischen Carbonsäure, bezogen auf das Gewicht der Probe, zugesetzt wird und die Proteinbindungsanalyse an Antikörpern gegen die zu bestimmende Vitamin-D-Verbindung erfolgt und nicht am Vitamin- D-Bindungsprotein (DBP) oder anderen Vitamin-D-bindenden Proteinen.
Der pH der Probe wird für die Proteinbindungsanalyse am Antikörper bevorzugt zwischen 3,0 bis 9,0 eingestellt. Ein leicht saurer pH im Bereich von 3,0 bis 7,0 hat sich als besonders vorteilhaft herausgestellt. Ganz besonders bevorzugt erfolgt die Proteinbindungsanalyse am Antikörper bei einem pH von etwa 6,0.
Die Probe wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren vor der Proteinbindungsanalyse mit 0,5 bis 15 Gew.% eines Salicylatsalzes wie Natrium- oder Kaliumsalicylat versetzt, bevorzugt mit 1 bis 12 Gew.%, besonders bevorzugt 2 bis 8 Gew.% Salicylat- salz. Besonders bevorzugt erfolgt die Bindungsanalyse in Gegenwart von 1 bis 7 Gew.% Natrium- oder Kaliumsalicylat bei einem pH zwischen 3,0 und 7,0. Alle Gewichtsprozent- Angaben beziehen sich auf das Gewicht der Probe.
Damit die Bindungsanalyse nicht von freien Fettsäuren, Cholesterin und anderen lipidischen Molekülen gestört wird, kann den Proben wahlfrei 0,1 bis 5 Gew.%, bevorzugt 1 bis 3 Gew.% natürliches und/oder chemisch modifiziertes Cyclodextrin zugesetzt werden.
Anstelle der Plasma- oder Serumprobe können prinzipiell auch Nahrungsmittel wie Milch, Käse, etc. direkt auf ihren Vitamin-D-Gehalt untersucht werden. Das erfindungsgemäße Verfahren kann zusammen mit herkömmlichen Verfahren der Probenaufbereitung erfolgen. So kann es sich in Einzelfällen anbieten, die Plasma- oder Serumprobe erst partiell durch organische Extraktion oder denaturierende Fällung von störenden Substanzen und Serum proteinen zu befreien und dann eine Proteinbindungsanalyse gemäß der Erfindung vorzunehmen. Der noch störende Einfluss der nach der Aufbereitung in der Probe zurück gebliebenen Vitamin-D bindenden Proteine wird durch den Zusatz einer hydroxylierten aromatischen Carbonsäure neutralisiert, beispielsweise durch Salicylsäure, ein Salz oder sonstiges Derivat der Salicyl- säure, ggf. auch durch Acetylsalicylsäure.
Eine vorige Probenaufreinigung bieten sich insbesondere auch an, wenn der Gehalt an D-Hormon im Humanserum neben der Vitamin-D-Speicherform bestimmt wird. Das D-Hormon kann bspw. leicht durch Bindung an einen nur für die Dihydroxy- form spezifischen Antikörper aus dem Humanserum oder -plasma isoliert werden. Monoklonale Antikörper, welche spezifisch das D-Hormon, nicht aber 25-Hydroxy- vitamin-D erkennen, sind bekannt und einfach herzustellen. Es empfiehlt sich dann dabei, die Bindung zwischen dem D-Hormon und dem monoklonalen Antikörper in Gegenwart eines Salizylatsalzes vorzunehmen, um die gleichzeitige konkurrierende Bindung an natürlich im Humanserum vorkommenden Vitamin-D bindenden Proteinen wie DBP (Vitamin-D-Bindungsprotein) zu eliminieren.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist geeignet zur quantitativen Bestimmung aller Arten von Vitamin-D-Verbindungen. Derzeit diagnostisch besonders interessant und wichtig sind: 25-Hydroxyvitamin-D2, 25-Hydroxyvitamin-D3, 1α,25-Dihydroxyvitamin-D2 und 1α,25-Dihydroxyvitamin-D3.
Der erfindungsgemäße kompetitive Proteinbindungsassay kann als enzymgekoppelter Immunoabsorbens-Assay (ELISA - enzyme linked immunosorbent assay) oder Radioimmunoassay (RIA) erfolgen. Besonders bevorzugt sind nicht-radioaktive Nachweissysteme auf der Basis von Fluoreszenz- und Chemilumineszenz- Markern (FIA oder LIA). Ist der Vitamin-D-Tracer mit dem Enzym für das Nachweissystem gekoppelt, z.B. mit alkalischer Phosphatase oder einem Fluoreszenz- oder Chemilumineszenz-Marker, dann ist die feststehende Phase bzw. die Wand der Mikro- titerplatte mit Antikörper gegen die zu bestimmende Vitamin-D-Verbindung beschichtet. Vorteilhaft am erfindungsgemäßen Verfahren ist, dass die quantitative Bestimmung der Vitamin-D-Verbindungen direkt in einer flüssigen Probe wie Serum oder Plasma erfolgen kann. Die Probe muss nicht durch eine problematische Proteinfällung, organische Extraktion und/oder durch eine Säulenchromatographie aufbereitet werden. Statt dessen werden die zu bestimmenden Vitamin-D-Verbindungen durch den Zusatz von Salicylsäure, eines Salicylsäuresalzes oder eines Derivats der Salicylsäure in vitro von den im Plasma bzw. Serum natürlich vorhandenen Vitamin-D bindenden Proteinen verdrängt, so in der Probe freigesetzt und können dann direkt bestimmt werden mit Hilfe des Prinzips der konkurrierenden Bindung an Anti-Vitamin-D-Antikörpern. Überraschenderweise wird durch den Zusatz von Salicylsäure oder eines
Derivats bzw. Salzen hiervon davon das 25-Hydroxy- bzw. das 1α,25-Dihydroxy-Vitamin- D nicht nur wirksam aus den Bindungsstellen am Vitamin-D-Bindungsprotein (DBP) verdrängt, sondern allgemein aus allen Bindungsstellen der im Plasma bzw. Serum vorkommenden Proteine, welche Vitamin-D binden können. Die Vitamin-D bindenden Proteine umfassen nämlich nicht nur das hochspezifisch, hochaffin bindende DBP (Gc- Globulin), das auch als Gc-Globulin oder Group-specific Component bekannt ist, sondern auch so abundante Proteine wie Albumin, α-Fetoprotein und viele andere mehr. Auch diese Proteine können 25-Hydroxy- und 1α,25-Dihydroxy-Vitamin-D mit mehr oder minder hoher Spezifität und Affinität binden. Ist die Aufreinigung der Vitamin-D-Ver- bindungen vergleichsweise unvollständig wie im Fall einer Ethanol- oder denaturierenden Proteinfällung, so sind im Bindungsassay trotz der Aufreinigung Restmengen an Vitamin-D bindenden Proteinen wie Serumalbumin zugegen. Die in der Probelösung verbliebenen Proteine können dann im kompetitiven Bindungsassay nicht nur das Vitamin-D bzw. den Vitamin-D-Tracer binden, sondern gehen an die hydrophobe Wand des Probengefäßes oder der festen Phase, so dass die quantitative Vitamin-D-Bestimmung von Zufälligkeiten abhängt wie der Vollständigkeit der Proteinfällung und des Cholesterinwertes der Probe. Aber auch die organische Extraktion und/oder die chromatographische Aufreinigung der Vitamin-D-Verbindungen verbessern nicht die quantitativen Bestimmung, denn auch diese Schritte beeinflussen und verändern die Menge an nachweisbarer biologisch aktiver Vitamin-D-Verbindung und zwar abhängig von den Eigenschaften der Probe - unter anderem davon, welche und wieviel Vitamin-D bindenden Proteine in der Probe zugegen sind, ob die Probe lipämisch ist, etc.
Demgegenüber bietet das erfindungsgemäße Verfahren den Vorteil, dass die Vitamin-D-Verbindungen nicht isoliert und aufgereinigt werden müssen, sondern der kompetitive Proteinbindungsassay einheitlich direkt in Plasma oder Serum erfolgen kann.
Die Erfindung umfasst auch die Verwendung von markierten Vitamin-D-Derivaten und auch nachstehende nicht-radioaktiven Vitamin-D-Derivate der Formel I:
worin ist:
Figure imgf000008_0001
Z das Sauerstoff- oder Schwefelatom einer Ethergruppe oder ein Kohlenstoffatom;
X eine substituierte oder unsubstituierte Kohlenwasserstoffgruppe von 0,8 bis 4,2 μm Länge, bevorzugt eine C8- bis Cι2-Gruppe, die optional die Heteroatome S, O, N oder P aufweisen kann, ganz bevorzugt eine Hexamido, Octamido- oder Decamido-Amidopropyl-Linkergruppe; Y Wasserstoff oder eine Hydroxygruppe;
A eine funktioneile Gruppe, ausgewählt aus Gruppen, die von einem Protein mit hoher Affinität gebunden werden, zum Beispiel Antikörper oder Streptavidin, reaktiven Gruppen zum Koppeln des funktioneilen Vitamin-D-Derivats an einen festen Träger wie Beads, markierten festen Partikeln oder magnetischen Teilchen; funktioneilen Proteinen wie grünfluoreszierendes Protein (GFP), Enzymen wie alkalische Phosphatase oder Peptiden und signalgebenden Gruppen wie fluoreszierenden oder chemilumineszierenden Gruppen;
R die Seitengruppe eines Vitamin-D-Metabolits, bevorzugt die Seitengruppe von
Vitamin-D2 oder -D3, bevorzugt die 25-hydroxylierte Seitengruppe von Vitamin-D2 oder -D3.
Für die in-vitro-Bestimmung direkt in Serum oder Plasma ist wichtig, dass entweder eine hohe Affinität zwischen der funktionellen Gruppe A und seinem Bindungsprotein, z.B. einem Antikörper besteht. Die Dissoziationskonstante K sollte hierbei größer als 108 sein, bevorzugt sind Dissoziationskonstanten größer als 1016. In bevorzugten Ausführungsformen ist A ausgewählt aus Biotin, Digoxigenin, Tyrosin, substituiertem Tyrosin, substituierten Aminosäuren, charakteristischen Aminosäure- und Peptidsequenzen, FITC, Proteinen und Proteingruppen wie Protein A oder Protein G oder einem weiteren Vitamin-D-Derivat.
Besonders bevorzugt ist der Vitamin-D-Tracer kovalent gekoppelt mit einer Farboder Signal-gebenden Gruppe wie einem Ruthenium-Komplex, Fluorescein, etc.
Die Abstandsgruppe X ist bevorzugt ausgewählt aus substituierten und unsubsti- tuierten C-Körpern mit 0,8 bis 4,2 nm Länge, besonders bevorzugt ist eine Abstands- gruppe von 0,12 nm Länge. Ganz besonders bevorzugt ist eine Aminocarbonsäure, insbesondere eine Aminoundecansäure, peptidische und Ketogruppen oder ein substituierter oder unsubstituierter Aminopolyetherrest mit einer Länge von 0,8 bis 4,2 nm, bevorzugt etwa 0,9 bis 1,5 nm. Dieser Abstand zwischen der Gruppe A und der Bindungs- bzw. Erkennungsstelle für den Vitamin-D-Rest erlaubt, dass die bindenden Proteine an ihre jeweilige Bindungsstelle binden können und dabei sich nicht gegenseitig stören.
Bevorzugt sind 25-Hydroxyvitamin-D-3ß-3-[6-N-(biotinyl)hexamido]amidopropyl- ether und die entsprechende 1α,25-Dihydroxyvitamin-D-Biotin-Verbindung. Geeignet sind auch Vitamin-D-Tracerderivate, die als funktioneile Gruppe A eine weitere Vitamin- D-Gruppe enthalten. Der Vorteil dieser dimeren Vitamin-D-Derivate als Tracer ist, dass sie keine systemfremden Gruppen in den Assay einführen und eine erhöhte Empfindlichkeit und Zuverlässigkeit der kompetitiven Bindungsanalyse erlauben. Besonders günstig sind symmetrische Vitamin-D-Dimere.
Weiter geeignet sind Vitamin-D-Tracer, in denen A eine feste Phase oder eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Gruppe ist. Beispielhaft seien hier genannt: Fluorescein, Rutheniumkomplex-Verbindungen, etc.
Bei der Direktbestimmung von Vitamin-D in Serum wird zunächst alles Vitamin-D, das an DBP (Gc-Globulin) oder anderen Vitamin-D bindenden Proteinen wie Albumin gebunden ist, aus ihren Bindungsstellen verdrängt und für die Bindung mit dem Vitamin- D-Antikörper verfügbar gemacht. Dies erfolgt erfindungsgemäß durch Zugabe einer hydroxylierten aromatischen Carbonsäure, bspw. einer Salicylsäureverbindung, bevorzugt von Natrium- oder Kaliumsalicylat. Die Salicylsäureverbindung besitzt die Eigenschaft, das Vitamin-D aus dem DBP/Gc-Globulin und anderen Vitamin-D bindenden Proteinen wie Albumin zu verdrängen. Andererseits blockiert das Salicylat über- raschenderweise nicht die Bindung von Anti-Vitamin-D-Antikörpern an 25-Hydroxyvita- min-D bzw. 1α,25-Dihydroxyvitamin-D, so dass eine direkte quantitative Bestimmung in Serum oder Plasma in einer kompetitiven Bindungsanalyse möglich ist. Das erfindungsgemäße Verfahren ist wegen der entfallenden Probenaufbereitungsschritte einfach, schnell sowie leicht automatisierbar. Zudem werden die Messwerte nicht durch indi- viduelle Eigenschaften der Probe und Zufälligkeiten in der Aufbereitung der Probe gestört.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht damit eine nicht-radioaktive, quantitative Bestimmung von 25-Hydroxy- und 1α,25-Dihydroxyvitamin-D in Serum oder Plasma ohne aufwendige Probenaufbereitungsschritte. Das Direktverfahren ist somit insbesondere für Routineuntersuchungen im Rahmen der Osteoporose-Prophylaxe, bei einer vermuteten D-Hypovitaminose oder D-Hypervitaminose, zur Diagnostik allgemeiner Art und in der Forschung geeignet.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft einen Reagenziensatz zur Bestimmung von Vitamin-D-Metaboliten wie 25-Hydroxy- und 1α,25-Dihydroxyvitamin-D, der unter anderem ein funktionelles Vitamin-D-Derivat enthält sowie Salicylsäure oder eine Salicylsäureverbindung in einem Bindungs- oder Verdünnungspuffer. Der Reagenziensatz um- fasst wahlfrei Anti-Vitamin-D-Antikörper, das heißt, Antikörper gegen 25-Hydroxyvitamin- D23 bzw. 1α,25-Dihydroxyvitamin-D2/3 oder andere Metaboliten des Vitamin-D, beschichtete Mikrotiterplatten und/oder magnetische oder andere Mikropartikel und Reagenzien. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Reagenziensatz zudem Cyclodextrin (CD) für eine Sequestrierung und Maskierung störender hydrophober Moleküle wie Fettsäuren, Cholesterin, etc. in der Plasma- oder Serumprobe. Das alpha-, beta- oder gamma-Cyclodextrin wird bevorzugt in Mengen von 0,1 bis 10 Gew.%, bevorzugt von etwa 0,2 bis 7,5 Gew., besonders bevorzugt in einer Menge von 1 bis 5 Gew.%, bezogen auf die Endkonzentration in der Probe, zugesetzt. Die wässrige Cyclodextrin- Stammlösung ist bevorzugt neutral bis leicht alkalisch, da Cyclodextrine in der Regel durch Säure gespalten werden. Das Cyclodextrin (CD) kann auch chemisch modifiziert sein, bspw. mit Methyl, Ethyl, Propyl, Hydroxyethyl, 2-Hydroxypropyl, Glycosyl, Maltosyl, Carboxymethyl. Besonders bevorzugt sind natürliche Cyclodextrine und 2-Hydroxy- propyl-beta-cyclodextrin. Beispiele
Beispiel 1 - Bestimmung von 25-Hydroxyvitamin-D in Serum oder Plasma (i) Bindung von Vitamin-D-Tracer an eine feste Phase Es wurde 25-Hydroxyvitamin-D-3ß-3-[6-N-(biotinyl)hexamidojamidopropylether über Streptavidin an eine feste Phase gebunden. Hierzu wurde in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte zunächst jeweils 100 ng Streptavidin gegeben, gelöst in 200 μl 60 mMol Natriumhydrogencarbonat, pH 9,6 und die Platte über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Streptavidin-Lösung wurde entfernt und die Vertiefungen fünfmal mit 200 μl Waschpuffer (PBS, pH 7,4 mit 0,05% Tween-20) gewaschen. Dann wurde in eine jede Vertiefung 250 ocl Blockpuffer (Phosphatpuffer pH 7,4 mit 0,5% Casein, 1% Thimerosal) gegeben, eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, der Assaypuffer entfernt und jede Vertiefung nochmals fünfmal mit je 200 μl Waschpuffer gewaschen. In die Vertiefungen wurde dann jeweils 10 ng 25-Biotinhydroxyvitamin-D in 200 μl Waschpuffer gegeben, eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln und unter Rütteln inkubiert, die Biotin- Vitamin- D-Lösung aus den Vertiefungen entfernt und jede Vertiefung 5 mal mit je 200 μl Waschpuffer gewaschen. Es folgte in flüssiger Phase die kompetitive Bindung von einem monoklonalen Maus-Antikörper (ID2) gegen Vitamin-D in Gegenwart von 25- Hydroxyvitamin-D aus Standard oder Probe. (ii) Probenvorbereitung und Probenhandhabung
Die Serum- und Plasmaproben wurden nur kurzzeitig bei Raumtemperatur gelagert. Die Probe wurde bei 4 bis 8°C aufbewahrt, wenn die Bestimmung innerhalb 24 Stunden nach Abnahme erfolgte. Ansonsten wurden die Proben bis zur Bestimmung bei -20°C eingefroren. Ein mehrfaches Einfrieren und Auftauen der Probe wurde vermieden. Eine Hämolyse störte das Ergebnis nicht. Vollblut hingegen konnte nicht als Probenmaterial eingesetzt werden. Lipämische Proben wurden 10 Minuten bei ca. 30 000 x G zentrifugiert bis die Fettphase nach oben schwamm und die wässrige Phase durch die Fettschicht hindurch mit der Pipette abgenommen werden konnte. Bei stark lipämischem Material wurde Gebrauch gemacht von einem Delipidierungskit für lipämisches Probenmaterial. Zur Erhöhung der Reproduzierbarkeit des Bindungsassays wurde der Probe noch Cyclodextrin zugesetzt, entweder als natürliches Cyclodextrin oder als chemisch modifiziertes Cyclodextrin. Nicht jedes Cyclodextrin erwies sich aber als gegeignet. Die Konzentration von natürlichem alpha-Cyclodextrin in der Probe wurde bevorzugt auf etwa 2,5 Gew.% eingestellt. Die Probe, Serum oder Plasma wurde 1:20 in Probenverdünnungspuffer verdünnt, z. B. 20 μl Serum auf 400 μl Phosphatpuffer, pH 6,0, 0,1% Gelatine mit 0,05 Gew.%, 0.5 Gew.% und 5 Gew.% Natriumsalicylat. Die Proben wurden gut gemischt und 5 bis 10 Minuten bei Raumtemperatur (21 bis 25EC) stehen gelassen. In dieser Zeit konnte das Natriumsalicylat das 25-Hydroxyvitamin-D aus seiner Bindung mit dem DBP (Gc-Globulin) und anderen Vitamin-D bindenden Proteinen verdrängen, so dass das 25- Hydroxyvitamin-D und der Vitamin-D-Tracer um die Bindungsstellen des Antikörpers konkurrieren konnte. (iii) Kompetitive Bindungsanalyse Es wurde jeweils 100 μl monoklonaler Antikörper (2D8) aus Maus (1:20000) in
Waschpuffer zusammen mit 100 μl Standard, Kontrolle oder Probe (20 μl Serum in 400 Probenverdünnungspuffer) in die Vertiefungen gegeben. Die Konzentration an Salicylverbindung im Bindungspuffer betrug 0,05 Gew.%, bevorzugt 0,5 Gew.%, besonders bevorzugt 5 Gew.% Natriumsalicylat in Phosphatpuffer, pH 6.0. Die Mikro- titerplatte wurde 24 Stunden bei 4!°C im Dunkeln gerüttelt. Das in der Probe vorhandene 25-Hydroxyvitamin-D konkurrierte dann mit dem Vitamin-D-Tracer um die Bindungsstellen des Antikörpers. Dann wurden die Lösungen aus den Vertiefungen entfernt und die Vertiefungen je fünfmal mit 200 μl Waschpuffer gewaschen.
Die Anwesenheit der Salicylverbindung im Assay bewirkte, dass die in der Probe vorhandenen Vitamin-D bindenden Proteine (wie bspw. das Serumalbumin) nicht am Vitamin-D-Tracer binden konnte, was im Stand der Technik zu falsch hohen Vitamin-D- Gehalten führt. Banden Vitamin-D bindende Proteine direkt an der hydrophoben Wand der Mikrotiterplatte, so hatte dies auch keinen Einfluss auf den Messwerte, denn das zu bestimmende 25-Hydroxyvitamin-D der Probe konnte wegen der Anwesenheit der Salicylverbindung auch nicht an die an der Wand anhaftenden Vitamin-D bindenden Proteine binden. Im Stand der Technik hingegen verursacht ein Angehen von Vitamin-D bindenden Proteinen an die Wand der Mikrotiterplatte zu falsch niedrigen 2-Hydroxy- vitamin-D-Werten in der Probe. Beide Bindungsvorgänge werden erfindungsgemäß durch die zugesetzte Salicylverbindung weitestgehend blockiert. (iv) Bestimmung der ko petitiven Bindung
Es wurde jeweils 200 μl Konjugat (Ziege-Anti-Maus-MAB-Antikörper-Peroxidase markiert) 1 :2500 in Waschpuffer verdünnt, in die Vertiefungen gegeben und eine halbe Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln und unter Rütteln inkubiert. Die Lösungen wurden entfernt und die Vertiefungen fünfmal mit je 200 μl Waschpuffer gewaschen. Für die Farbreaktion wurden 200 μl Tetramethylbenzidin(TMB)-Substratlösung (von NOVUM Diagnostika GmbH, Dietzenbach, DE) in die Vertiefungen gegeben. Nach 30 Minuten wurde die Farbentwicklung gestoppt durch Zugabe von 50 μl 2 M H2SO pro Vertiefung. Die Messungen der optischen Dichte erfolgten bei 450 nm.
Als Standard wurden Lösungen von 25-Hydroxyvitamin-D3-Assaypuffer mit folgenden Konzentrationen eingesetzt, 0, 6.4, 16, 40, 100 und 250 nMol/l (siehe Eichkurve).
Als Kontrolle bzw. Proben dienten Sera von Patienten aus einem Normalkollektiv. Als weitere Kontrolle dienten Lösungen, bei denen die jeweilige Konzentration an 25- Hydroxyvitamin-D aus anderweitigen Bestimmungen bekannt war. Aus den Mittelwerten und den bekannten Konzentrationen an 25-Hydroxyvitamin-
D wurde die in Figur 1A-D gezeigten Eichkurven erstellt. Die Ordinate zeigt die optische Dichte als Mittelwert der beiden Messungen bei 450 nm; die Abszisse die Konzentration an 25-Hydroxyvitamin-D in nMol. Die Ergebnisse zeigen, dass mit pH 6,0 und 0,1% Gelatine sowie 5% Natriumsalicylat beste Bedingungen erreicht werden.
Beispiel 2: Vergleichende Bindungsanalysen
Soweit nicht anders angegeben, waren alle Reagenzien und Puffer und Materialien gleich wie im vorgenannten Beispiel mit Ausnahme der Probenvorbereitung. Zum einen wurden in externen Labors an unseren Seren bestimmte Messwerte verwendet. Zum anderen wurden zusätzlich Vitamin-D-Bestimmungen vorgenommen. Hierzu wurde für die kompetitive Bindungsanalyse 50 μl Serum in einem 1 ,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß mit 200 μl Ethanol absolut (vorgekühlt auf -20°C) durch vortexen gemischt und 20 Minuten bei -20°C ausgefällt. Die Proben wurden in einer Tischzentrifuge bei maximaler Drehzahl zentrifugiert, die Überstände abgenommen und im ELISA eingesetzt. Die nachstehenden Tabellen zeigen tabellarisch und graphisch die Korrelation zwischen den ELISA-Werten gegenüber den Direktbestimmungen.
TABELLE I
Korrelation Routine-Proben (externes Labor): ELISA vs direkt Korrelation (n = 47)
Figure imgf000014_0002
Figure imgf000014_0001
Tabelle II
Korrelation 25-Vitamin D: Direkt vs CPBA Normalkollektiv (n=40)
Figure imgf000015_0001
Die vergleichende Analyse bzw. Vitamin-D-Bestimmung aus Serum mit verschiedenen Verfahren zeigt eine gute Übereinstimmung für eine Vielzahl von Seren. Allerdings waren auch erhebliche Diskrepanzen festzustellen, welche die Zuverlässigkeit der Vitmain-D-Bestimmungen in Frage stellten. Die Nachanalyse und Nachschau einzelner Werte legte aber dabei, dass die erfindungsgemäße Direkt- Bestimmung die zuverlässigere Methode ist. Mit anderen Worten, die Diskrepanzen waren zumeist eine Folge der bereits oben angesprochenen systematischen und serumprobenbedingten Fehlerquellen. Diese zeigte insbesondere die nachstehende Analyse der Wiederfindung in verschiedenen Proben.
Beispiel 3: Wiederfindung in verschiedenen Serumproben.
Die Probenaufbereitung bzw. die konkurrierenden Bindungsanalyse erfolgte wie in Beispiel angegeben bei pH 6,0, 0,1% Gelatine, 5% Natriumsalicylat in Serum.
Die Bindungsanalyse in den Wiederfindung; gemessen in 1 Probe - ELISA mit ID2
TABELLE
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Wiederfindung, gemessen in 2 Plasmen (ID2)
Figure imgf000017_0001
Figure imgf000017_0002
Beispiel 4 Untersuchung der Linearität
In analoger Weise wurde dann auch die Linearität des erfindungsgemäßen Verfahrens in verschiedenen Plasmen und Seren untersucht. Die Bestimmungen erfolgten wie in Beispiel 1 angegeben bei pH 6,0, 0,1% Gelatine, 5% Natriumsalicylat. Tabelle IVa Linearität in Plasma 8 (ID2)
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Linearität in Plasma 4 (ID2)
Figure imgf000018_0002
Es wird eine hervorragende lineare Regression erhalten.

Claims

P A T E N T A N S P R Ü C H E
1. Verfahren zur Bestimmung von Vitamin-D-Verbindungen in Plasma oder Serum durch Proteinbindungsanalyse, dadurch gekennzeichnet, dass der Probe des Plasmas oder Serum vor der Proteinbindungsanalyse mindestens
0.05 Gew.% einer löslichen hydroxylierten aromatischen Carbonsäure, bezogen auf das Gewicht der Probenflüssigkeit, zugesetzt wird und dass die Proteinbindungsanalyse auf Antikörpern gegen die zu bestimmende Vitamin- D-Verbindung beruht.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der pH der Probe auf 3,0 bis 9,0 eingestellt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Probe 0,5 bis 15 Gew.%, bevorzugt von 1 bis 12 Gew.%, besonders bevorzugt von 2 bis 8 Gew.%, jeweils bezogen auf das Gewicht der Probe, das Salz einer Salicylsäure zugesetzt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Bindungsanalyse in Gegenwart von 1 bis 7 Gew.% Natrium- oder Kaliumsalicylat bei einem pH zwischen 3,0 und 7,0 erfolgt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Probe 0,1 bis 5, bevorzugt 1 bis 3 Gew.% natürliches und/oder chemisch modifiziertes Cyclodextrin zugesetzt wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe zudem durch Bindung eines Typs einer Vitamin-D-Verbindung an einen Antikörper, bevorzugt einen monoklonalen Antikörper gegen das D- Hormon, aufgereinigt wird.
7. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die zu bestimmende Vitamin-D-Verbindung ausgewählt ist aus 25-Hydroxy-Vitamin-D2, 25-Hydroxy-Vitamin-D3, 1α,25-Dihydroxy- Vitamin-D2, 1 α,25-Dihydroxy-Vitamin-D3.
8. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die kompetitive Bindungsanalyse ein ELISA, RIA, FIA oder LIA ist.
9. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekenn- zeichnet, dass die Bindungsanalyse mithilfe einer Antikörper-beschichteten
Festphase erfolgt, wobei der Antikörper die zu bestimmende Vitamin-D- Verbindung bindet.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Vitamin-D- Tracer mit einem direkt bestimmbaren Färb-, Fluoreszenz- oder Chemi- lumineszenz-Marker gekoppelt ist.
11. Verdrängungs- und -analysepuffer für die direkte Messung von Vitamin-D, 25-Hydroxy-Vitamin-D2, 25-Hydroxy-Vitamin-D3, 1 α,25-Dihydroxy-Vitamin-D2, 1α,25-Dihydroxy-Vitamin-D3 oder eines anderen Derivates von Vitamin-D in Plasma oder Serum durch Proteinbindungsanalyse, wobei der Puffer einen pH von 3,0 bis 9,0 besitzt und mindestens 0.05 Gew.% einer löslichen hydroxylierten aromatischen Carbonsäure enthält.
12. Verdrängungs- und -analysepuffer nach Anspruch 11, wobei der Puffer ein Salz der Salicylsäure in einer Menge von 1 bis 15 Gew.%, bevorzugt 2 bis 8 Gew.%, enthält.
13. Verdrängungs- und -analysepuffer nach Anspruch 11 , wobei der Puffer bei einem pH zwischen 3,0 und 7,0 Natrium- oder Kaliumsalicylat in einer Menge von 1 bis 15 Gew.%, bevorzugt 2 bis 8 Gew.%, enthält.
14. Verdrängungs- und -analysepuffer nach einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei der Puffer 0,1 bis 5 Gew.%, bevorzugt 1 bis 3 Gew.% natürliches und/- oder chemisch modifiziertes Cyclodextrin enthält.
15. Reagenziensatz zur direkten Messung von Vitamin-D, 25-Hydroxy-Vitamin- D2, 25-Hydroxy-Vitamin-D3, 1α,25-Dihydroxy-Vitamin-D2, 1α,25-Dihydroxy- Vitamin-D3 oder eines anderen Derivates von Vitamin-D in Plasma oder Serum durch Proteinbindungsanalyse, umfassend einen Verdrängungs- und Analysepuffer gemäß einem der Ansprüche 11 bis 14; mindestens einen
Antikörper gegen die zu messende Vitamin-D-Verbindung; und einen Tracer für eine kompetitive Proteinbindungsanalyse.
16. Reagenziensatz nach Anspruch 15, wobei der Tracer mit einem direkt bestimmbaren Färb-, Fluoreszenz- oder Chemilumineszenz-Marker gekoppelt ist.
PCT/EP2002/009740 2001-09-12 2002-08-30 Verfahren und mittel zur direkten messung von vitamin-d-verbindungen in serum oder plasma Ceased WO2003023391A2 (de)

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