WO2003033686A2 - Keratinozyten verwendbar als biologisch aktive substanz bei der behandlung von wunden - Google Patents

Keratinozyten verwendbar als biologisch aktive substanz bei der behandlung von wunden Download PDF

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    • C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"

Definitions

  • Keratinocytes useful as a biologically active substance in the treatment of wounds
  • This invention relates to novel in vitro cultivable keratinocytes as well as to their advantageous use for producing a product which can be used for the treatment of acute and chronic wounds.
  • the invention was thus in the field of medicine, especially in the field of wound healing by means of tissue engineering.
  • Allogeneic keratinocytes have long been used successfully for the treatment of wounds, in particular ulcers and / or burns (Maier, 1993, Schönfeld et al., 1993). Wounds that are resistant to treatment over a long period of time in comparison to conventional therapies can very successfully be successfully treated using allogeneic keratinocytes (Phillips and Gilchrest, 1993, Beele et al., 1991, Leigh et al., 1991, Lindgren et al. , 1998). In the beginning, when using allogeneic keratinocytes, the focus was primarily on skin replacement, ie on the regeneration of the transplanted epidermis.
  • the allogeneic keratinocytes are used therapeutically either directly in the form of so-called “keratinocyte sheets” consisting of a multi-layer, enzymatically detached cell composite or together with biocompatible carriers under the name “biologically active wound healing dressings".
  • the latter has the advantage that the cells do not have to be pretreated enzymatically by being detached from the substrate of the culture dish prior to their use.
  • biocompatible membranes as carriers for culturing the keratinocytes (EP 0 462 462, US 5,658,331, US 5,693,332, EP 0518 920) makes it possible to complete the biologically active wound dressings earlier in time since the cells no longer have to form a closed cell dressing.
  • subconfluent cell aggregates additionally has the advantage that correspondingly cultured keratinocytes are less heavily differentiated and thus are advantageous for the treatment of wounds.
  • Keratinocytes can be cryopreserved without adverse effect on wound healing directly or in association with biocompatible carrier materials at temperatures between -30 and -196 ° C, but preferably between -70 and -90 ° C (De Luca et al., 1992, Teepe et al , 1993). This has further improved their therapeutic utility as biologically active wound dressings can be made available to some extent.
  • Object of the invention
  • Another disadvantage is that with the re-isolation of the keratinocytes from different donors there is an increased risk of infection for the recipient of the wound healing dressing. For example, an increased risk of HIV or hepatitis is to be considered.
  • the invention relates to keratinocytes with a high proliferation potential, which are not immortalized and can be doubled at least 150 times by in vitro cell culture methods. This results in a cell proliferation of about 10 44 times.
  • the corresponding keratinocytes retain their advantageous properties for the treatment of wounds.
  • the keratinocytes according to the invention are primarily keratinocytes isolated from a donor and culturable in vitro, the isolation and initial Cultivation can be carried out by a person skilled in the art, for example, according to the method described by Rheinwald and Green 1975.
  • the invention preferably relates to keratinocytes isolated from the epidermal portion of a foreskin. Particular preference is given to keratinocytes of human origin, in particular keratinocytes of the culture KC-BI-1, which were obtained on June 27, 2001 by the DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, Braunschweig, Germany under the accession number DSM ACC2514 for the purposes of patent proceedings. Budapest Treaty are deposited.
  • the invention also includes those keratinocytes derived from culture KC-BI-1 (DSM ACC2514). The invention thus also relates to all cells and cultures which can be generated and / or generated by sub-passage and / or subcloning of the original culture KC-BI-1.
  • the cultivation according to the invention of the keratinocytes is illustrated by way of example for the keratinocytes KC-BI-1 (Example 1).
  • Advantageous for the cultivation is the use of the complex medium indicated in Example 1 and the use of Fee cells (English feeder cells, German: Nurse cells), preferably the use of lethally irradiated murine 3T3 fibroblasts.
  • the proportion of fetal calf serum should be between 2 and 10%.
  • the preparation of the Eee er cells is known to the person skilled in the art, and can be carried out, for example, according to the method given in Example 2.
  • Particularly advantageous here is the subcultivation of the keratinocytes according to the invention at a maximum confluency of 80%.
  • the keratinocytes can be cultivated at 35 to 38 ° C, preferably at 37 ° C, an atmospheric humidity of> 90%, preferably 95% and a CO 2 saturation of 5 to 9%.
  • the doubling time of the keratinocytes is between 1 and 2 days ( Figure 1).
  • the cells can be cultivated over long passages at an approximately constant doubling rate ( Figure 2).
  • the present invention is not limited to the keratinocytes KC-BI-1 alone, but it is possible for a person skilled in the art to carry out the invention under appropriate conditions with all keratinocytes according to claims 1-8.
  • non-immortalized means that primarily isolated keratinocytes, as well as the keratinocytes cultured here, are not spontaneously transformed and / or molecular biological, chemical or physical methods known in the art have been transformed in that the cells have not been treated using, for example, viral factors or sequences, chemically mutagenic substances or, for example, by irradiation or a combination of different processes.
  • Keratinocytes that are "not immortalized” also means that said keratinocytes have no or significantly less telomerase activity compared to transformed tumor cell lines (Härle-Bachor and Boukamp, 1993) or compared to immortalized cell lines, preferably to the HeLa cell line (cf. Figure 3), especially in comparison to the immortalized keratinocyte cell line HaCat.
  • non-immortalized further means that said keratinocytes can not be doubled in the absence of fetal calf serum and / or in the absence of feeder cells and / or in the absence of epidermal groth factor (EGF), such as This is possible, for example, with immortalized keratinocytes (Schoop et al., 1999).
  • EGF epidermal groth factor
  • non-immortalized also means that said keratinocytes do not alter their characteristic phenotype with increasing cell duplication (See Figure 4).
  • non-immortalized also means that the said keratinocytes after transplantation to nude mice, preferably BALB / c mice, show a normal differentiation profile.
  • Normal differentiation potential here means the ability of the keratinocytes to develop into terminally differentiated keratinocytes and suprabasal epidermal layers and form a stratum corneum according to autologous keratinocytes.
  • the invention also relates to keratinocytes which are not immortalized and can be doubled at least 200 times by in vitro cell culture methods.
  • the invention further relates to keratinocytes which are not immortalized and can be duplicated at least 250 times by in vitro cell culture techniques.
  • the invention also relates to those keratinocytes which are not immortalized and can be doubled at least 300 times by in vitro cell culture methods.
  • the present invention enables the beneficial propagation of said keratinocytes from only one or a few donors. Starting from a donation, for example, 1044 5 can be produced after 250 cell doublings and 1090 cells after 300 cell doublings after 150 cell doublings. As a result, the invention makes it possible for the first time to provide large quantities of standardized cell material for the production of biologically active wound dressings of consistent and controllable quality. A corresponding amount of standardized cell material can be propagated, for example, starting from a cryopreserved cell bank, which in turn is produced from keratinocytes having the properties according to the invention.
  • the use of standardized cell material as a starting material for the production of biologically active wound dressings also reduces the risk of infection for the possible recipients, since the isolation of the keratinocytes remains limited to a few donors, preferably to a donor.
  • the present invention overcomes significant disadvantages, which currently consists in the limited passability of the previously known keratinocytes.
  • the invention further relates to a product which consists of a carrier which is coated with the keratinocytes according to the invention.
  • “Coated” in the sense of the invention means that the carrier is partially or completely coated on its surface with the keratinocytes according to the invention
  • a partially grown carrier is particularly suitable because a shorter cultivation time is required until said carrier can be used for wound treatment.
  • a carrier suitable for the purposes of the invention is characterized in that it is a biocompatible carrier material which can be used for the preparation of a medicament.
  • hydrophobic biocompatible carrier materials such as those described in WO 91/13638 can be used.
  • carrier materials with predominantly hydrophilic properties can also be used.
  • a preferred embodiment of the present invention is the use of support materials consisting of a polymer of esterified hyaluronic acid.
  • it is a polymer of esterified hyaluronic acid, consisting of a perforated polymer film with a defined geometry.
  • the polymer film in this case has, for example, a thickness of 10 to 500 .mu.m and is perforated with holes with a size between 10 and 1000 .mu.m, wherein the holes have a defined and constant size and form an ordered series, wherein they by a constant distance of 50 to 1000 microns are separated.
  • a corresponding film is described in EP 0462 426.
  • Perforated support materials are particularly well suited because they do not require directional application of the biologically active wound dressing to the wound.
  • Example 3 describes the exemplary preparation of a perforated carrier matrix of esterified hyaluronic acid with defined geometry overgrown with the keratinocytes according to the invention.
  • the carrier matrix is a product marketed in Germany under the product name "Laserskin” by Fidia Advanced Biopolymers Ltd., Abano Tenne, Italy.
  • this carrier material for producing a biologically active wound dressing in combination with keratinocytes has already been demonstrated on the animal model (Lam et al., 1999) and on humans (Harris et al., 1999).
  • the hyaluronic acid ester matrix has a positive effect on angiogenesis and collagen production.
  • the wound dressings with hyaluronic acid ester as matrix currently used are coated with autologous keratinocytes and / or complex skin equivalents of keratinocytes and fibroblasts. For them, therefore, the above-described disadvantages of the prior art apply.
  • a further preferred embodiment of the invention relates to a product consisting of the keratinocytes according to the invention together with resorbable polymers consisting of polyesters, polycarbonates, polyanhydrides, polyorthoesters, polydepsipeptides, polyether esters, polyamino acids or polyphosphazenes, in particular of poly (L-lactide), poly (D, L-lactide), poly (L-lactide-co-D, L-lactide), poly (glycolide), poly (L-lactide-co-glycolide), poly (L-lactide-co-trimethylene carbonate), or poly (dioxanone).
  • the said polymers are both perforated and unperforated.
  • the present invention also relates to a method for cryopreserving the keratinocytes according to the invention at a temperature of -20 ° C to -196 ° C, preferably at a temperature below -180 ° C.
  • the said keratinocytes can be frozen according to standardized methods and familiar to a person skilled in the art.
  • a cryoprotectant u.a. Use DMSO.
  • other cryoprotectants such as glycerol, hydroxyethyl starch or a combination of these two and a combination of these with DMSO.
  • Corresponding methods are exemplified in WO 96/24018, US 5,891,617 or also US 5,298,417.
  • the present invention also provides the cryopreservation of the carriers coated with the keratinocytes according to the invention, which comprises ⁇ the keratinocytes with appropriate carriers at a temperature of from -20 ° C. to -196 ° C., preferably at -60 ° C. to -80 ° ° C are cryopreserved.
  • Cryopreservation has the advantage of being able to store the product which can be produced in large quantities and thus of being randomly tested for its uniform quality prior to its medical use.
  • the storage also makes it possible for the said wound dressings to be available for medical purposes at short notice.
  • cryoprotectant for the product according to the invention is exemplified hydroxyethyl starch in a concentration of 7-13% (w / w).
  • DMSO or glycerol as well as a combination of different cryoprotectants, in particular from hydroxyetyl starch, DMSO and / or glycerol.
  • trehalose as a cryoprotectant is possible.
  • the product with a freezing rate of ⁇ l ° C / min preferably from 0.2 to 0.6 ° C / min, more preferably from 0.4 ° C / min to a temperature of eg - 60 to - 80 ° C. cooled down.
  • Example 4 describes, by way of example, the cryopreservation of a carrier matrix of hyaluronic acid ester coated with KC-BI-1.
  • other methods of cryopreservation e.g. the method described in WO 95/707611, WO 96/24018, EP 0296475, the list is not exhaustive, but merely refers to the fact that methods for the cryopreservation of products consisting of biocompatible carriers and keratinocytes to the current state of the art ,
  • the present invention also relates to the medical use of the keratinocytes of the invention described herein and / or the described product of said keratinocytes and a carrier, in particular for use in the treatment of wounds.
  • One embodiment of the invention is the use of the keratinocytes according to the invention and / or the product of said keratinocytes and a carrier in the treatment of burns and / or ulcers.
  • the treatable burns are preferably second-degree burns, and ulcers are preferred Chronic poorly healing lower leg ulcers of the ulcus cruris type, preferably ulcus cruris venosum or also diabetic ulcers, in addition also to pressure ulcers.
  • the medical use includes a combined and / or complementary use of said keratinocytes and / or the product of keratinocytes and carriers according to the invention with conventional therapies known to those skilled in the art having a positive effect on wound healing.
  • a combined and / or complementary use of one or more other substances with positive effects for wound healing is meant here.
  • the invention also relates to the use of the keratinocytes according to the invention and / or the product of a biocompatible carrier and said keratinocytes for the manufacture of a medical product for the treatment of wounds, in particular for the treatment of burns and / or ulcers, such as, for example, for the treatment of second-degree burns, leg ulcers (venosum), diabetic ulcers or decubitus ulcers.
  • the invention furthermore also provides a method for treating said wounds, the method being characterized in that the keratinocytes according to the invention and / or the product according to the invention comprising keratinocytes and carriers are / is applied to the wounds to be treated. Said keratinocytes and said product can be used either fresh or after cryopreservation. A corresponding method for wound treatment is described under Example 5.
  • Fig. 1 Cell doubling of the keratinocytes KC-BI-1 as a function of the cultivation time. Shown is the number of cumulative population doublings (CPD) of keratinocytes KC-BI-1 over a culture period of 94 days. Within the observed 94 days, the cells doubled approximately 75 times. This corresponds to a mean doubling time of 1.25 days per cell doubling, or 12.5 per 10 days.
  • CPD cumulative population doublings
  • Fig. 2 Doubling of keratinocytes KC-BI-1 over a period of 10 months. Shown is the cell doubling of keratinocytes KC-BI-1 over 10 months, expressed as population doublings (PD) as a function of cell passage (passage) 1-67.
  • PD population doublings
  • Fig. 3 Determination of relative telomerase activity. Shown is the relative
  • Fig. 4 Morphology of keratinocytes KC-BI-1 according to passages 5 and 60. The
  • Keratinocytes KC-BI-1 show no morphological differences between cell passage 5 (culturing time 25 days) and cell passage 60 (culturing time 300 days) in light microscopy.
  • Eeec er cells can be used immediately or within 24 hours.
  • Incubation of the cells is carried out at 35-39 ° C, preferably at 37 ° C.
  • the humidity is> 90%, preferably 95% and the CO 2 concentration is 5-9%.
  • the keratinocytes are subcultured at a maximum confluency of 80%. For this purpose, the cell culture supernatant is discarded.
  • the feeder cells After rinsing twice with 0.02% EDTA (2-10 ml) and incubating for 5-10 min at 37 ° C., the feeder cells are detached from the cell culture flask by subsequent tapping (or with shaking). Subsequently, after a TrypsinEDTA treatment (0.05% / 0.01%, 1-6 ml), the keratinocytes are carefully detached by tapping for 5-10 min at 37 ° C.
  • the remaining cells are gently detached with a cell scraper.
  • the trypsin EDTA solution is neutralized by the addition of K l medium and the cells are separated by gentle up and down pipetting.
  • the cell sowing takes place with the number of cells given under 2.2.
  • the cell culture medium K l is then replaced on day 3 every two days.
  • rh-insulin (only soluble at pH ⁇ 4.0) 5g rh-insulin is added to 0.9L WFI and the pH is adjusted to 2.5M 6M HCl. After the rh insulin has dissolved, adjust the pH to 8.0 with IM NaOH. Fill the batch with WFI to 1 liter. 1 ml of this solution is needed per liter of medium. 4.2 Medium composition
  • the cultivation of the cells can also be carried out starting from a fresh biopsy material, for example starting from the epidermal portion of a foreskin.
  • the primary isolation of the undifferentiated, proliferating keratinocytes can be carried out according to the method described by Rheinwald and Green in 1975.
  • Example 2 the cells described in Example 2 can be used.
  • other, lethal fibroblasts is also conceivable, preferably the use of other murine fibroblasts, more preferably derivatives of the cell line 3T3.
  • Murine 3T3 fibroblasts (eg ATCC CCL 92, 3T3-Swiss albino, contact-inhibited fibroblasts) available from American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA, USA, DMEM + 10% fetal calf serum (FCS) ; PBS; 0.2% trypsin solution; 0.04% EDTA solution; Cell culture bottles (T-flasks): 25 cm 2 , 80 cm 2 , 175 cm 2
  • ATCC American Type Culture Collection
  • FCS fetal calf serum
  • PBS 0.2% trypsin solution
  • 0.04% EDTA solution Cell culture bottles
  • the cells are examined daily for their growth.
  • the cell density should not exceed a maximum confluency of 70-80%.
  • the Subcultivation takes place according to experience every 2 to 4 days. For this, the medium is discarded and the cells are washed with a suitable amount of a 1: 2 mixture of EDTA and trypsin (0.5-5 ml). Subsequently, the detaching cells are taken up in 3.5-20 ml of medium. 1
  • the cells are re-salted at a density of 10 3 to 10 4 cells cm 2 .
  • Irradiation of Feeder Cells occurs at a dose of approximately 60 Gy (6000 rads in a 137 Cs source).
  • Both the irradiated and the unirradiated cells can be cryopreserved according to standard protocols in liquid nitrogen and stored for a long time.
  • Example 3 Method of Coating a Carrier Matrix, here Laserskin, with Keratinocytes of Culture KC-BI-1 (DSMACC2514)
  • the production of the biologically active wound healing dressing according to the invention is described below by way of example.
  • the wound healing dressing described here consists of the inventive keratinocytes KC-BI-1 and Laserskin, a bioresorbable carrier matrix of hyaluronic acid ester.
  • the invention is not limited to the combination described here. Rather, all keratinocytes can be used for coating, which have the inventive properties according to claims 1-8.
  • suitable carrier matrices are conceivable, provided it is a biocompatible carrier material that can be used for the manufacture of a drug.
  • a biocompatible carrier material such as those described in WO 91/13638 can be used.
  • support materials with predominantly hydrophilic properties can also be used.
  • a further preferred embodiment of the invention is the use of the keratinocytes according to the invention together with resorbable polymers consisting of polyesters, polycarbonates, polyanhydrides, polyorthoesters, polydepsipeptides, polyether esters, polyamino acids or polyphosphazenes, in particular of poly (L-lactide), poly (D, L lactide), poly (L-lactide-co-D, L-lactide), poly (glycolide), poly (L-lactide-co-glycolide), poly (L-lactide-co-trimethylene carbonate) or poly (L-lactide-co-trimethylene carbonate). dioxanone) and the use of perforated films consisting of said polymers.
  • resorbable polymers consisting of polyesters, polycarbonates, polyanhydrides, polyorthoesters, polydepsipeptides, polyether esters, polyamino acids or polyphosphazenes, in particular
  • K / 1 medium see Example 1
  • PBS, 0.04% EDTA diluted to 0.02% with PBS
  • Trypsin / EDTA 0.05% / 0.01%
  • sterile Roux dishes T 25 cm 2 , T 80 cm 2 , D 175 cm 2 '
  • Laserskin Fidia Advanced Biopolymers srl, Abano Terme, Italy
  • keratinocytes according to the invention such as KC-BI-1
  • the feeder cells prepared according to Embodiment 2 are applied to Laserskin at a seeding density of about 15,000 to 25,000 cells / cm 2 (equivalent to about 3 x 10 6 cells / petri dish).
  • the Petri dish is then at> 90% humidity and 5-11% CO 2; preferably 7-9% incubated in a 37 ° C incubator incubated at 35 to 37 ° C.
  • the keratinocytes are sown either on the same day or at the latest on the next day (after 24 hours) on the feeder cell lawn.
  • the keratinocytes according to the invention are used to produce the biologically active wound healing dressing.
  • the subculturing of the keratinocytes can be carried out by way of example as described below:
  • the subconfluent cultures are rinsed once with 0.02% EDTA (80 cm rouge dish: 8 ml, 175 cm 2 rouge dish: 10 ml). Subsequently, the feeder cells are incubated with 0.02% EDTA for 5-10 min at 37 ° C (80 cm 2 Roux cup: 8 mL, 175 cm 2 Roux cup: 10 ml), and detached by gentle shaking.
  • the keratinocytes are dissolved according to embodiment 1 with a trypsin / EDTA mixture (0.05% / 0.0.1%) (80 cm 2 Rouxschale: 2-3 mL, 175 cm 2 Rouxschale: '5-6 ml), then in Zellkukturmendium taken (80 cm 2 Rouxschale: 7-8 mL, 175 cm 2 Rouxschale: 14-15 ml) and separated by careful up and down pipetting.
  • a trypsin / EDTA mixture 0.05% / 0.0.1%)
  • the keratinocytes according to the invention are applied at a sowing density of about 15,000 to 25,000 cells / cm 2 (corresponding to about 3 ⁇ 10 6 cells / petri dish). Subsequently, the cells are incubated to a confluency of 30-100%, preferably 80-100% at 35-39 ° C., preferably at 37 ° C. The humidity is> 90%, preferably 95% and the CO 2 concentration is 5 - 9%.
  • Example 4 Process for the cryopreservation of the biologically active wound healing dressing according to the invention
  • the product according to the invention can be converted into suitable Containers, eg weldable PP bags, can be frozen in a controlled manner.
  • suitable Containers eg weldable PP bags
  • culture medium is carefully removed and replaced by 20 ml of 2-6 ° C cold freezing K / 2.
  • the product is then packaged sterile and frozen according to the following program:
  • the product After a rapid temperature reduction to -5 to -10 ° C., preferably -6 to -8 ° C. within 2-5 minutes, the product is equilibrated at the appropriate temperature for 15-30 minutes, preferably for 23-25 minutes. Subsequently, the product with a freezing rate of ⁇ 1 ° C / min, preferably from 0.2 to 0.6 ° C / min, more preferably from 0.4 ° C / min to a temperature of z.b. -60 to -80 ° C cooled down. The product is stored at -60 to -80 ° C.
  • K / L growth medium (see Example 1) is added with »7-13% (w / w) hydroxyethyl starch.
  • Example 5 Exemplary Use of a Carrier Matrix Coated with the Keratinocytes According to the Invention for Covering Wounds Using the Example of Ulcus Cruris Venosum
  • the culture is rinsed one or more times with a suitable amount, preferably 30 ml, K / 3 transport medium.
  • the biologically active wound healing dressing is transported in a suitable amount, preferably in 20 ml of Ky3 transport medium.
  • the headspace of the Petri dish is briefly fumigated with an air mixture of 5-10% CO 2 , sealed with a tape, eg Parafilm, and immediately taken to the clinic in a transport box.
  • K / 3 transport medium growth medium K / l (see Example 1) without fetal calf serum (FCS). It is also conceivable, however, to use simple physiological salt solutions, for example based on phosphate borate, for example PBS, or else HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid) or MES base ([2-N-] mo holino] ethanesufonic acid). 2. Transport kroykonservierter wound healing bandages
  • Cryopreserved wound dressings can typically be delivered to dry ice in the clinics. But it is also conceivable another form of transport, provided that the Wundheilverbixe are transported at a temperature of below - 60 ° C.
  • cryopreserved wound healing bandages are thawed quickly. Subsequently, the freezing medium is removed and the dressing is treated with K 3 transport medium (see above) or other suitable physiological solution, e.g. Ringer solution) rinsed one to several times.
  • K 3 transport medium see above
  • suitable physiological solution e.g. Ringer solution
  • the dressing is then applied to the wound.
  • a directed application of the wound healing dressing with the cells in the direction of the wound is required.
  • perforated supports which allow bilateral overgrowth of the carriers with keratinocytes e.g., Laserskin
  • the treatment can be repeated several times.
  • KC-BI-1 cells were subcultured by the above-described method according to the invention over several passages.
  • Cells from passage 4, 13, and 121 were then subjected to genetic analysis, with the length polymorphism of 15 different loci examined (CSFIPO, D13S317, D16S539, D18S51, D21S11, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, FGA, Penta D, Penta E, TH01, TPOX and vWA).
  • the analysis was carried out according to a method known in the art.
  • the corresponding alleles were amplified using a test for determining paternity (PoewerPlex® 16 system) from Promega, (Mannheim, Germany) in accordance with the manufacturer's instructions.
  • the alleles can be identified by determining the fragment length (length end standard ILS 600 is part of the above-mentioned kit).
  • Information on allelic frequencies in the population can be found in the corresponding tables.
  • the analysis revealed a match of all alleles at all loci for all analyzed cell passages. The data thus permit a genetic assignment of the KC-BI-1 cells. From the frequency of frequencies, an allocation probability of> 99.999% was determined.
  • Teepe RGC Roseeuw DI; Hermans J .; Koebrugge EJ; Altena T; De Coninck A; Ponec M; Jan Vermeer B (1993): Randomized Trial Comparing Cryopreserved Cultured Epidermal Allografts with Hydrocolloid Dressings in Healing Chronic Venous Ulcers. Journal of the American Academy of Dermatology, 29/6 (982-988).

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Abstract

Die Erfindung betrifft neue in vitro kultivierbare Keratinozyten sowie deren vorteilhafte Verwendung zur Herstellung eines Erzeugnisses, welches zur Behandlung von akuten und chronischen Wunden verwendet werden kann.

Description

Keratinozyten verwendbar als biologisch aktive Substanz bei der Behandlung von Wunden
Feld der Erfindung Die Erfindung betrifft neue in vitro kultivierbare Keratinozyten so wie deren vorteilhafte Verwendung zur Herstellung eines Erzeugnisses, welches zur Behandlung von akuten und chronischen Wunden verwendet werden kann. Die Erfindung erfolgte somit auf dem Gebiet der Medizin, speziell auf dem Gebiet der Wundheilung mittels Tissue Engineering.
Stand der Technik
Allogene Keratinozyten werden seit längerem erfolgreich zur Behandlung von Wunden, insbesondere von Geschwüren und/oder Verbrennungen eingesetzt (Maier, 1993; Schönfeld et al., 1993). Wunden, die sich gegenüber herkömmlichen Therapien über einen lange Zeitraum therapieresistent zeigen, lassen sich unter Verwendung von allogenen Keratinozyten sehr oft erfolgreich therapieren (Phillips and Gilchrest, 1993; Beele et al., 1991; Leigh et al., 1991; Lindgren et al-, 1998). Zu Beginn war das Augenmerk bei der Verwendung allogener Keratinozyten vornehmlich auf den Hautersatz, d.h. auf die Regeneration der transplantierten Epidermis gerichtet. Es zeigte sich jedoch bald, dass der Therapieerfolg primär auf der Stimulation der körpereigenen Reepithelisierung beruht und nicht auf einem „Anwachsen" des allogenen Zelltransplantats in der Wunde. Zahlreiche Untersuchungen ergaben letztlich, dass die transplantierten Keratinozyten nur eine bestimmte Zeit in der Wunde verbleiben und dann von dem Körper klinisch nicht sichtbar eliminiert werden (Kawai et al., 1993). Die Stimulation der körpereigenen Wundheilung erfolgt also primär über eine räumlich und zeitlich optimale Freisetzung von einer Vielzahl an unterschiedlichen Wachstumsfaktoren, Zytokinen, Extrazellulärer Matrix (ECM), kleineren Moleküle und Proteasen durch die allogenen Keratinozyten (Lang et al., 1996; Marcusson et al., 1992). Die Komplexität und Vielzahl der freigesetzten Faktoren begründet hierbei den therapeutischen Vorteil gegenüber herkömmlichen Einzeltherapien, z.B. mit isolierten Wachstumsfaktoren. Neben dem Haupteffekt der Reepithelisierung treten durch Behandlung mit Keratinozyten aber auch makroskopisch und mikroskopisch nachweisbare Veränderungen im Granulationsgewebe auf (Lang et al., 1996). Ein weiterer, für den Patienten wohltuender und oft beschriebener Effekt der Keratinozyten betrifft die ausgeprägte Analgesie nach Transplantation (Schönfeld et al., 1993). Für die Wundheilung ist die Verwendung undifferenzierter, teilungsaktiver Keratinozyten vorteilhaft, denn teilungsaktive Keratinozyten scheinen über ein für die Wundheilung begünstigendes komplexes Sezernierungsprofil zu verfügen. Mit Ausnahme der Stammzellen verlieren undifferenzierte Keratinozyten in vivo ihr Proliferationspotential im Zuge der natürlicher Ausdifferenzierung bereits nach wenigen Zellteilungen, ein Prozess der bei der in vitro Kultivierung von Keratinozyten bisher immer beobachtet wurde (Barrandon and Green, 1987). Folglich lassen sich die bisher für die Wundheilung besonders geeigneten teilungsaktiven Keratinozyten nur endlich in vitro kultivieren, was ihre medizinische Verwendung aufwendig und kostenintensiv macht.
Die allogenen Keratinozyten werden entweder direkt in Form sog. „Keratinozyten-Sheets", bestehend aus einem mehrschichtigen, enzymatisch abgelösten Zellverbund oder zusammen mit biokompatiblen Trägern unter der Bezeichnung „biologisch aktive Wundheilverbände" therapeutisch eingesetzt. Letzteres hat den Vorteil, dass die Zellen nicht enzymatisch vorbehandelt werden müssen, indem sie vor ihrer Verwendung vom Untergrund der Kulturschale abgelöst werden. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von biokompatibler Membranen als Träger zur Kultivierung der Keratinozyten (EP 0 462 462, US 5,658,331; US 5,693,332; EP 0518 920) eine zeitlich frühere Fertigstellung der biologisch aktiven Wundheilverbände, da die Zellen keinen geschlossen Zellverband mehr ausbilden müssen. Es lassen sich bereits subkonfluent bewachsene Träger zur Wundbehandlung einsetzten. Neben einer früheren Verfügbarkeit hat die Verwendung subkonfluenter Zellverbände zusätzlich den Vorteil, dass entsprechend kultivierte Keratinozyten weniger stark ausdifferenziert sind und somit die vorteilhaft für Behandlung von Wunden sind.
Keratinozyten lassen sich ohne nachteiligen Effekt für die Wundheilung direkt oder in Verbindung mit biokompatiblen Trägermaterialien bei Temperaturen zwischen -30 und -196°C, bevorzugt jedoch zwischen -70 und -90°C kryokonservieren (De Luca et al., 1992; Teepe et al., 1993). Dies hat ihre therapeutische Nutzbarkeit weiter verbessert, da sich biologisch aktive Wundheilverbände im gewissen Umfang auf Vorrat herstellen lassen. Aufgabe der Erfindung
Die dem Stand der Technik bekannten Keratinozyten sowie aus diesen hergestellte biologisch aktive Wundheilverbände verfugen derzeit über gewisse Nachteile, deren Überwindung Ziel der vorliegenden Erfindung war.
Ein offensichtlicher Nachteil der bisher bekannten Keratinozyten primären Ursprungs besteht darin, dass sich die besagten Zellen durch in vitro Zellkulturverfahren nur wenige Zellgenerationen verdoppeln lassen ohne dabei ihre hohe Teilungsaktivität und somit ihre bevorzugte Eignung zur Herstellung biologisch aktiver Wundheilverbände zu verlieren. Nach dem Stand der Technik ist es dem Fachmann lediglich möglich die Zahl der Zellen mittels in vitro Kultivierung um etwa das 103 bis 104-fache zu vermehren (Tanczos et al., 1999).
Ein weiterer, hierdurch bedingter Nachteil besteht darin, dass die begrenzte in vitro Kultivierbarkeit der besagten Keratinozyten eine häufige und aufwändige Neuisolierung erforderlich macht; was wiederum zur Folge hat, dass das gewonnene und vermehrte Zellmaterial nicht einheitlich ist und somit die hieraus hergestellten Wundheilverbände mit hoher Wahrscheinlichkeit Qualitätsunterschiede aufweisen oder zumindest aufweisen kömien.
Ein weiterer Nachteil besteht darin, dass mit der Neuisolierung der Keratinozyten aus verschiedenen Spendern ein erhöhte Infektionsrisiko für den Empfanger des Wundheilverbandes besteht. Zu denken ist hier beispielsweise an ein erhöhtes HIV- oder Hepatitis-Risiko.
Beschreibung der Erfindung Gegenstand der Erfindung sind Keratinozyten mit hohem Proliferationspotential, die nicht immortalisiert sind und sich mindestens 150 mal durch in vitro Zellkulturverfahren verdoppeln lassen. Hieraus resultiert eine Zellvermehrung um ungefähr das 1044-fache. Die entsprechenden Keratinozyten behalten hierbei ihre vorteilhaften Eigenschaften für die Behandlung von Wunden.
Bei den erfindungsgemäßen Keratinozyten handelt es sich um primär aus einem Spender isolierte und in vitro kultivierbare Keratinozyten, wobei die Isolierung und anfängliche Kultivierung von einem Fachmann beispielsweise entsprechend dem von Rheinwald und Green 1975 beschriebenen Verfahren ausgeführt werden kann.
Die Erfindung betrifft bevorzugt Keratinozyten, die aus dem epidermalen Anteil einer Vorhaut isoliert werden. Besonders bevorzugt sind Keratinozyten humanen Ursprungs, insbesondere Keratinozyten der Kultur KC-BI-1, die am 27Juni 2001 bei der DSMZ- Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Deutschland unter der Hinterlegungsnummer DSM ACC2514 für die Zwecke von Patentverfahren gem. Budapester Vertrag hinterlegt sind. Unter die Erfindung fallen auch solche Keratinozyten, die sich von der Kultur KC-BI-1 (DSM ACC2514) ableiten. Gegenstand der Erfindung sind somit auch alle Zellen und Kulturen, die durch Subpassagieren und/oder Subklonieren der ursprünglichen Kultur KC-BI-1 generiert werden und/oder generiert werden können.
Die erfindungsgemäße Kultivierung der Keratinozyten ist beispielhaft für die Keratinozyten KC-BI-1 dargestellt (Beispiel 1). Vorteilhaft für die Kultivierung ist die Verwendung des in Beispiel 1 angegebenen komplexen Mediums sowie die Verwendung von Fee er-Zellen (engl. feeder cells, deutsch: Ammenzellen), bevorzugt die Verwendung von letal bestrahlten murinen 3T3 Fibroblasten. Der Anteil an fötalem Kälberserum sollte zwischen 2 und 10 % betragen. Die Herstellung der Eee er-Zellen ist dem Fachmann bekannt, und kann z.B. gemäß dem in Beispiel 2 angegebenen Verfahren durchgeführt werden. Besonders vorteilhaft ist hierbei die Subkultivierung der erfindungsgemäßen Keratinozyten bei einer maximalen Konfluenz von 80%. Die Keratinozyten lassen sich bei 35 bis 38°C, bevorzugt bei 37°C, einer Luftfeuchtigkeit von > 90%, bevorzugt 95% und einer CO2-Sättigung von 5 bis 9% kultivieren.
Mit dem unter Beispiel 1 dargestellten Verfahren beträgt die Verdopplungszeit der Keratinozyten, insbesondere die humaner Keratinozyten aus dem epidermalen Anteil einer Vorhaut, zwischen 1 und 2 Tagen (Abbildung 1). Die Zellen lassen sich hierbei über zahheiche Passagen mit annähernd konstanter Verdopplungsrate kultivieren (Abbildung 2). Die vorliegenden Erfindung ist hierbei allerdings nicht allein auf die Keratinozyten KC-BI-1 beschränkt, vielmehr ist es für einen Fachmann möglich, die Erfindung unter entsprechenden Bedingungen mit allen Keratinozyten gemäß der Ansprüche 1-8 auszufuhren. Der Ausdruck „nicht immortahsiert" meint in Bezug auf die vorliegende Erfindung, dass primär isolierte Keratinozyten sowie die hier in Kultur genommenen Keratinozyten nicht spontan transformiert sind und/oder durch dem Stand der Forschung bekannte molekularbiologische, chemische oder physikalische Verfahren transformiert worden sind. Letzteres meint, dass die Zellen weder unter Verwendung von z.B. viralen Faktoren oder Sequenzen, chemisch mutagenen Substanzen oder z.B. durch Bestrahlung oder einer Kombination aus verschiedenen Verfahren behandelt worden sind.
Keratinozyten, die „nicht immortahsiert sind" meint auch, dass die besagten Keratinozyten im Vergleich zu transformierten Tumorzellinien (Härle-Bachor and Boukamp, 1993) oder im Vergleich zu immortalisierten Zellienen, bevorzugt zu der Zellinie HeLa keine oder eine wesentliche geringere Telomeraseaktivität aufweist (Vgl. Abbildung 3). Dies gilt insbesondere auch im Vergleich zu der immortalisierten Keratinozytenzellinie HaCat.
Der Ausdruck „nicht immortahsiert" meint ferner, dass die besagten Keratinozyten nicht in Abwesenheit von fötalem Kälberserum und/oder nicht in Abwesenheit von Feederzellen und/oder nicht in Abwesenheit von Epidermalem Wachstumsfaktor (englisch: epidermal groth factor, EGF) verdoppelt werden können, wie dies beispielsweise bei immortalisierten Keratinozyten möglich ist (Schoop et al., 1999).
Der Ausdruck „nicht immortalisiert" meint aber auch, dass die besagten Keratinozyten ihren charakteristischen Phänotyp nicht mit zunehmender Zellverdopplung verändern (Vgl. Abbildung 4).
Ferner meint „nicht immortalisiert" auch, dass die besagten Keratinozyten, nach Transplantation auf Nacktmäuse, bevorzugt BALB/c Mäuse ein normales Differenzierungsprofil zeigen. „Normales Differenzierungspotential" meint hier die Fähigkeit der Keratinozyten, sich zu terminal differenzierten Keratinozyten zu entwickeln und suprabasale epidermale Schichten sowie ein Stratum corneum entsprechend autologer Keratinozyten auszubilden. Gegenstand der Erfindung sind auch solche Keratinozyten, die nicht immortalisiert sind und sich mindestens 200 mal durch in vitro Zellkulturverfahren verdoppeln lassen. Die Erfindung betrifft ferner Keratinozyten, die nicht immortalisiert sind und sich mindestens 250 mal durch in vitro Zellkulturverfahren verdoppeln lassen. Die Erfindung betrifft darüber hinaus auch solche Keratinozyten, die nicht immortalisiert sind und sich mindestens 300 mal durch in vitro Zellkulturverfahren verdoppeln lassen.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht die vorteilhafte Vermehrung der besagten Keratinozyten ausgehend von nur einem oder wenigen Spendern. Ausgehend von einer Spende lassen sich beispielsweise nach 150 Zellverdopplungen 10445 nach 250 Zellverdopplungen 1077 und nach 300 Zellverdopplungen 1090 Zellen herstellen. Dadurch ermöglicht die Erfindung erstmals die Bereitstellung großer Mengen an standardisiertem Zellmaterial für die Herstellung von biologisch aktiven Wundheilverbänden mit gleichbleibender und kontrollierbarer Qualität. Eine entsprechende Menge an standardisiertem Zellmaterial lässt sich z.B. ausgehend von einer kryokonservierten Zellbank vermehren, die wiederum aus Keratinozyten hergestellt wird, die über die erfindungsgemäßen Eigenschaften verfügen.
Mit der Verwendung von standardisiertem Zellmaterial als Ausgangsmaterial für die Herstellung von biologisch aktiven Wundheilverbänden wird auch das Infektionsrisiko für die möglichen Empfanger verringert, da die Isolierung der Keratinozyten auf wenige Spender, vorzugsweise auf einen Spender, beschränkt bleibt.
Damit überwindet die vorliegende Erfindung wesentliche Nachteile, die zur Zeit in der lediglich eingeschränkten Passagierbarkeit der bisher bekannten Keratinozyten besteht.
Gegenstand der Erfindung ist darüber hinaus ein Erzeugnis, das aus einem Träger besteht, der mit den erfindungsgemäßen Keratinozyten beschichtet ist. „Beschichtet" im Sinne der Erfindung meint, dass der Träger auf seiner Oberfläche partiell oder vollständig mit den erfindungsgemäßen Keratinozyten bewachsen ist. Ein partiell bewachsener Träger ist besonders geeignet, da eine kürzere Kultivierungszeit benötigt wird bis der besagte Träger zur Wundbehandlung verwendet werden kann. Ein im Sinne der Erfindung geeigneter Träger ist dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein biokompatibles Trägermaterial handelt, das zur Herstellung eines Arzneimittels verwendet werden kann. Verwendbar sind beispielsweise hydrophobe biokompatible Trägermaterialien, wie etwa die in WO 91/13638 beschriebenen. Es können aber auch Trägermaterialien mit vorwiegend hydrophilem Eigenschaften verwendet werden.
Eine bevorzugte Ausführung der vorliegenden Erfindung besteht in der Verwendung von Trägermaterialien die aus einem Polymer aus veresterter Hyaluronsäure bestehen. Bei einer besonders bevorzugten Ausführung handelt es sich um ein Polymer aus veresterter Hyaluronsäure, bestehend aus einer perforierten Polymerfolie mit definierter Geometrie. Die Polymerfolie hat hierbei beispielweise eine Dicke von 10 bis 500 μm und ist mit Löchern mit einer Größe zwischen 10 und 1000 μm durchlöchert, wobei die Löcher eine definierte und konstante Größe haben und eine geordnete Reihe bilden, worin sie durch einen konstanten Abstand von 50 bis 1000 μm voneinander getrennt sind. Eine entsprechende Folie ist in EP 0462 426 beschrieben. Perforierte Trägermaterialien eignen sich besonders gut, da sie kein gerichtetes Auflegen des biologisch aktiven Wundverbandes auf die Wunde erfordern. In Beispiel 3 wird die beispielhafte Herstellung einer mit den erfindungsgemäßen Keratinozyten bewachsenen perforierten Trägermatrix aus veresterter Hyaluronsäure mit definierter Geometrie beschrieben. Bei der Trägermatrix handelt es sich um ein in Deutschland unter dem Produktnamen „Laserskin" vertriebenes Produkt der Firma Fidia Advanced Biopolymers Ltd., Abano Tenne, Italien.
Die besonders bevorzugte Eignung dieses Trägermaterials zur Herstellung eines biologisch aktiven Wundverbandes in Kombination mit Keratinozyten wurde bereits am Tiermodell (Lam et al., 1999) und am Menschen gezeigt (Harris et al., 1999). Neben einer verbesserten Migration und Ausdifferenzierung der epithelialen Zellen hat die aus Hyaluronsäureester bestehende Matrix einen positiven Effekt auf die Angiogenese und die Kollagenproduktion. Die zur Zeit verwendeten Wundverbände mit Hyaluronssäureester als Matrix sind allerdings mit autologen Keratinozyten und/oder komplex aufgebauten Hautäquivalenten aus Keratinozyten und Fibroblasten beschichtet. Für sie gelten somit die oben beschriebenen Nachteile aus dem Stand der Technik. Dieser Nachteil kann insbesondere durch die Verwendung der vorteilhaften erfindungsgemäßen allogenen Keratinozyten überwunden werden. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Produkt bestehend aus den erfindungsgemäßen Keratinozyten zusammen mit resorbierbaren Polymeren, bestehend aus Polyester, Polycarbonate, Polyanhydride, Polyorthoester, Polydepsipeptide, Polyetherester, Polyaminosäuren oder Polyphosphazene, insbesondere aus Poly(L-lactid), Poly(D,L-lactid), Poly(L-lactid-co-D,L-lactid), Poly(glycolid), Poly(L-lactid-co-glycolid), Poly(L-lactid-co-trimethylen-carbonat) oder Poly(dioxanon). Die besagten Polymere sind dabei sowohl perforiert als auch unperforiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Kryokonservierung der erfindungsgemäßen Keratinozyten bei einer Temperatur von -20°C bis -196°C, bevorzugt bei einer Temperatur unter -180°C. Die besagten Keratinozyten lassen sich nach standardisierten und einem dem Fachmann geläufigen Verfahren einfrieren. Als Kryoprotektant lässt sich u.a. DMSO verwenden. Darüber hinaus ist auch die Verwendung anderer Kryoprotektanten möglich, wie etwa Glycerol, Hydroxyethylstärke oder eine Kombination aus diesen beiden sowie eine Kombination dieser mit DMSO. Entsprechende Verfahren sind beispielhaft in WO 96/24018, US 5,891,617 oder auch US 5,298,417 ausgeführt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Kryokonservierung der mit den' erfindungsgemäßen Keratinozyten beschichteten Träger, dadurch gekennzeichnet dass, die ■ Keratinozyten mit entsprechenden Träger bei einer Temperatur von -20°C bis -196°C, bevorzugt bei -60°C bis - 80°C kryokonserviert werden. Die Kryokonservierung hat den Vorteil, dass das in großen Mengen herstellbare Erzeugnis gelagert werden und somit vor seiner medizinischen Verwendung stichprobenartig auf seine einheitliche Qualität untersucht werden kann. Die Lagerung ermöglicht letztendlich auch dass die besagten Wundheiverbände kurzfristig für medizinische Zwecke verfügbar sind.
Als Kryoprotektant für das erfindungsgemäße Erzeugnis eignet sich beispielhaft Hydroxyethylstärke in einer Konzentration von 7-13% (w/w). Möglich ist aber auch die Verwendung von DMSO oder Glycerol sowie eine Kombination aus verschiedenen Kryoprotektanten, insbesondere aus Hydroxyetylstärke, DMSO und/oder Glycerol. Ferner ist auch die Verwendung von Trehalose als Kryoprotektant möglich. Nach einer schnellen Temperaturerniedrigung von 37°C auf -5 bis -10°C, bevorzugt -6 bis -8°C innerhalb von 2-5 min wird das erfindungsgemäße Produkt aus Träger und Keratinozyten bei entsprechender Temperatur für 15-30 min, bevorzugt für 23-26 min äquilibriert. Anschließend wird das Erzeugnis mit einer Einfrierrate von < l°C/min, bevorzugt von 0,2 bis 0,6°C/min besonders bevorzugt von 0,4°C/min auf eine Temperatur von z.B. - 60 bis - 80°C herabgekühlt.
Beispiel 4 beschreibt beispielhaft die Kryokonservierung einer mit KC-BI-1 beschichteten Trägermatrix aus Hyaluronsäureester. Es ist aber auch möglich, dass andere Verfahren zur Kryokonservierung angewendet werden, z.B. die in WO 95/707611, WO 96/24018, EP 0296475 beschriebenen Verfahren, wobei die Aufzählung nicht abschließend zu verstehen ist, sondern lediglich darauf verweist, dass Verfahren zur Kryokonservierung von Produkten bestehend aus biokompatiblen Trägern und Keratinozyten zu dem gegenwärtigen Stand der Technik gehören.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die medizinische Verwendung der hier beschriebenen erfindungsgemäßen Keratinozyten und/oder des beschriebenen Produkts aus besagten Keratinozyten und einem Träger, insbesondere auf die Verwendung zur Behandlung von Wunden. Eine Ausführungsform der Erfindung stellt die Verwendung der erfindungsgemäßen Keratinozyten und/oder des Produkts aus besagten Keratinozyten und einem Träger bei der Behandlung von Verbrennungen und/oder Geschwüren dar. Bei den behandelbaren Verbrennungen handelt es sich bevorzugt um Verbrennungen zweiten Grades, bei den Geschwüren bevorzugt um chronische schlecht heilenden Unterschenkelgeschwüre des Typs Ulcus cruris, bevorzugt Ulcus cruris venosum oder auch um diabetischen Ulcera, zusätzlich auch um Dekubitus.
Die medizinische Verwendung schließt eine kombinierte und/oder ergänzende Verwendung der besagten Keratinozyten und/oder des erfindungsgemäßen Produkts aus Keratinozyten und Träger mit klassischen dem Fachmann bekannten Therapien mit positivem Effekt für die Wundheilung mit ein. Gemeint ist hierbei eine kombinierte und/oder ergänzende Verwendung eines oder mehreren anderen Stoff(en) mit positiver Wirkung für die Wundheilung. Beispielhaft zu nennen ist hier die ergänzende und oder kombinierte Behandlung von Ulcus cruris venosum mit Hydrokolloidverbänden und/oder die zusätzliche Verwendung von antimikrobiellen Substanzen, beispielsweise die Gabe von Antibiotika.
Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls die Verwendung der erfindungsgemäßen Keratinozyten und/oder des Produkts aus einem biokompatiblen Träger und den besagten Keratinozyten zur Herstellung eines medizinischen Erzeugnisses zur Behandlung von Wunden, insbesondere zur Behandlung von Verbrennung und/oder Geschwüren, wie z.B. zur Behandlung von Verbrennungen zweiten Grades, Ulcus cruris (venosum), diabetische Ulcera oder Dekubitus.
Gegenstand der Erfindung ist ferner auch ein Verfahren zur Behandlung besagter Wunden, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass die erfindungsgemäßen Keratinozyten und/oder das erfindungsgemäße Produkt aus Keratinozyten und Träger auf die zu behandelnden Wunden aufgelegt werden/wird. Besagte Keratinozyten und besagtes Produkt können entweder frisch oder nach Kryokonservierung verwendet werden. Ein entsprechendes Verfahren zur Wundbehandlung ist unter Beispiel 5 beschrieben.
Beschreibung der Abbildungen:
Abb. 1: Zellverdopplung der Keratinozyten KC-BI-1 in Abhängigkeit der Kultivierungszeit. Dargestellt ist die Anzahl der Zellverdopplungen (CPD =Cumulative Population Doublings) der Keratinozyten KC-BI-1 über eine Kultivierungszeit von 94 Tagen (days). Innerhalb der beobachteten 94 Tagen verdoppelten sich die Zellen ungefähr 75 mal. Dies entspricht einer mittleren Verdopplungszeit von 1,25 Tagen pro Zellverdopplung, oder 12,5 pro 10 Tage.
Abb. 2: Verdopplung der Keratinozyten KC-BI-1 über einen Zeitraum von 10 Monaten. Dargestellt ist die Zellverdopplung der Keratinozyten KC-BI-1 über 10 Monate, angegeben als Population doublings (PD) in Abhängigkeit der Zellpassagen (Passage) 1-67.
Abb. 3: Bestimmung der relativen Telomeraseaktivität. Dargestellt ist die relative
Telomeraseaktivität für die Keratinozyten KC-BI-1 nach Passage 1, 12, 18, 40 und 57 im Vergleich zur Aktivität der Zellinie HeLa. Die Abbildung zeigt für die Keratinozyten KC-BI- 1 fast keine bzw. lediglich eine geringe Telomeraseaktivität im Vergleich zu der immortalisierten Zellinie HeLa.
Abb. 4: Morphologie der Keratinozyten KC-BI-1 nach den Passagen 5 und 60. Die
Keratinozyten KC-BI-1 zeigen in der lichtmikroskopischen Darstellung keine morphologischen Unterschiede zwischen Zellpassage 5 (Kultivierungszeit 25 Tage) und Zellpassage 60 (Kultivierungszeit 300 Tage).
Ausführungsbeispiele
Beispiel 1: Verfahren zur Kultivierung der erfindungsgemäßen Keratinozyten am Beispiel der Kultur KC-BI-1 (DSMACC2514)
1. Material
Keratinozyten KC-BI-1; bestrahlte 3T3-Mäusefibroblasten (Ammenzellen, cngl. feeder-cells, Herstellung vgl. Beispiel 2); Zellkulturmedium K -1 (Zusammensetzung siehe unten); EDTA (0,02%); Trypsin/EDTA (0,05%/0,01%); Zellkulturflaschen (T-flask): 25 cm2, 80 cm2, 175 cm2
2,Auftauen der Zellen
2.1 Auftauen der Feeder-Zellen
Zellen zügig auftauen und in 5-10 ml vorgewärmtes K l Medium geben. Eine entsprechende Menge an Eee er-Zellen wird in eine geeignete Zellkulturflasche überfuhrt und mit K/l Medium ergänzt:
25 cm2 T-flask 0,5x10 Zellen Εndvolumen an Medium: 5-6ml
80 cm2 T-flask 1,5x10° Zellen Εndvolumen an Medium: 20ml
175cm2 T-flask 3, 5xl06 Zellen Εndvolumen an Medium: 50ml Die Eeec er-Zellen können sofort oder innerhalb von 24 Std. verwendet werden.
2.2 Auftauen der Keratinozyten
Zellen zügig auftauen und in 5-10 ml vorgewärmtes K/l Medium geben. Eine entsprechende Menge an Zellen zu den mit Eee er-Zellen vorbereiteten Zellkulturflaschen geben und mit frischem Medium auffüllen:
25 cm2 T-flask 0,15 x 10 Zellen; Endvolumen an Medium: 6 - 10 mL
80 cm2 T-flask 0,4 x 106 Zellen; Endvolumen an Medium: 20 mL
175 cm2 T-flask 1 x 106 Zellen; Endvolumen an Medium: 50 mL
3.0 Kultivierung
Inkubation der Zellen erfolgt bei 35-39°C, bevorzugt bei 37°C. Die Luftfeuchtigkeit beträgt >90%, bevorzugt 95% und die CO2-Konzentration liegt bei 5-9%. Die Keratinozyten werden bei einer maximalen Konfluenz von 80% subkultiviert. Hierzu wird der Zellkulturüberstand verworfen. Die Feeder-Zellen werden nach zweimaligem Spülen mit 0,02% EDTA (2-10ml) und einer Inkubation für 5-10 min bei 37°C durch anschließendes Abklopfen (oder unter Schütteln) von der Zellkulturflasche gelöst. Nachfolgend werden die Keratinozyten nach einer TrypsinEDTA-Behandlung (0,05%/0,01%, 1-6 ml) für 5-10 min bei 37°C vorsichtig durch Abklopfen gelöst. Falls erforderlich, werden die restlichen Zellen vorsichtig mit einem Zellschaber gelöst. Die Trypsin EDTA-Lösung wird durch Zugabe von K l Medium neutralisiert und die Zellen werden durch vorsichtiges Auf- und Abpipetieren vereinzelt. Die Zellaussaat erfolgt mit der unter 2.2 angegebenen Zellzahl. Das Zellkulturmedium K l wird an Tag 3 anschließend alle zwei Tage ausgetauscht.
4.0 Herstellung des K/l Mediums
Alle Komponenten sowie die Stammlösungen werden nacheinander entsprechend der in Tabelle 1 angegebenen Reihenfolge zusammengegeben. Der Ansatz wird auf 1 liter mit WFI (engl.: water for injection) aufgefüllt. Anschließend wird der pH mit NaOH or HCl auf 7,0 bis 7,2 eingestellt. Die Osmolarität sollte zwischen 320-400 mOsm/kg betragen. Abschließend wird das Medium K/l sterilfiltriert.
4.1 Herstellung der Stammlösungen
Trij odothyronine
13,6mg Trij odothyronine in 1ml 0,1M NaOH lösen und 99ml hinzugeben PBS. Die gebrauchsfertige Lösung 1:100 in PBS verdünnen. Pro Liter Medium wird 1 ml dieser Lösung benötigt.
EGF lmg EGF in 100ml WFI lösen. Pro Liter Medium wird 1 ml dieser Lösung benötigt.
rh-Insulin (nur löslich bei pH <4,0) 5g rh-Insulin werden in 0,9L WFI gegeben und der pH wird 6M HCl auf 2,5 eingestellt. Nachdem sich das rh-Insulin gelöst hat, den pH mit IM NaOH auf 8,0 einstellen. Den Ansatz mit WFI auf 1 Liter auffüllen. Pro Liter Medium wird 1 ml dieser Lösimg benötigt. 4.2 Mediumzusammentsetzung
Figure imgf000015_0001
Die Kultivierung der Zellen kann aber auch ausgehend von einem frischem Biopsiematerial erfolgen, beispielsweise ausgehend von dem epidermalen Anteil einer Vorhaut. Die Primärisolierung der undifferenzierten, proliferierenden Keratinozyten kann hierbei nach dem von Rheinwald und Green 1975 beschriebenen Verfahren durchgeführt werden.
Als Eee er-Zellen können die unter Beispiel 2 beschriebenen Zellen verwendet werden. Darüber hinaus ist auch die Verwendung anderer, letaler Fibroblasten vorstellbar, bevorzugt die Verwendung von anderen murinen Fibroblasten, besonders bevorzugt Abkömmlinge der Zellinie 3T3.
Beispiel 2: Herstellung von bestrahlten 3T3 Feeder-Zellen zur Kultivierung von Keratinozyten
1. Material
Murine 3T3 Fibroblasten (z.B. ATCC CCL 92, 3T3-Swiss albino, contact-inhibited fibroblasts) zu beziehen bei der American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevar, Manassas, VA, USA, DMEM+10% Fötales Kälberserum (FCS); PBS; 0,2% Trypsin Lösung; 0,04% EDTA Lösung; Zellkulturflaschen (T-flasks): 25 cm2, 80 cm2, 175 cm2
2. Auftauen der Zellen
Zellen zügig auftauen und in 5-10 ml vorgewärmtes Medium geben. DMSO-haltiges Medium nach Zentrifugation entfernen. Zellen in 5-10 ml Medium suspendieren. Nach Bestimmung der Zellzahl werden die Zellen mit einer Dichte von 103 to 104 Zellen/cm2 in geeignete Zellkulturflaschen ausgesät. Die Inkubation erfolgt bei 35 - 39°C, bevorzugt bei 37°C. Die Luftfeuchtigkeit beträgt > 90%, bevorzugt 95% und die CO2-Konzentration liegt bei 5-9%.
3. Kultivierung der Zellen
Die Zellen werden täglich auf ihr Wachstum hin untersucht. Die Zelldichte sollte eine maximale Konfluenz von 70-80% nicht überschreiten. Die Subkultivierung erfolgt erfahrungsgemäß alle 2 bis 4 Tage. Hierzu wird das Medium verworfen und die Zellen mit einer geeigneten Menge einer 1 :2 Mischung an EDTA und Trypsin (0,5-5 ml) gewaschen. Anschließend werden die sich ablösenden Zellen in 3,5-20 ml Medium aufgenommen.1 Die Zellen werden mit einer Dichte von 103 to 104 Zellen cm2 neuausgesäl.
4. Bestrahlung der Feeder-Zellen Die Bestrahlung der Feeder-Zellen erfolgt mit einer Dosis von ungefähr 60 Gy (6000 rad in einer 137Cs-Quelle).
Sowohl die bestrahlten als auch die unbestrahlten Zellen lassen sich nach Standardprotokollen in flüssigen Stickstoff kryokonservieren und über längere Zeit aufbewahren.
Beispiel 3: Verfahren zur Beschichtung einer Trägermatrix, hier Laserskin, mit Keratinocyten der Kultur KC-BI-1 (DSMACC2514)
Nachfolgend wird beispielhaft die Herstellung des erfindungsgemäßen biologisch aktiven Wundheilverbandes beschrieben. Der hier beschriebene Wundheilverband besteht aus den findungsgemäßen Keratinozyten KC-BI-1 und Laserskin, einer bioresorbierbaren Trägermatrix aus Hyaluronsäureester. Die Erfindung ist dabei nicht auf die hier beschriebene Kombination beschränkt. Vielmehr können alle Keratinozyten zur Beschichtung verwendet werden, die über die erfinderischen Eigenschaften gemäß der Ansprüche 1-8 verfügen.
Darüber hinaus ist auch die Verwendung anderer geeigneter Trägermatrices denkbar, vorausgesetzt es handelt sich um ein biokompatibles Trägermaterial, das zur Herstellung eines Arzneimittels verwendet werden kann. Verwendbar sind beispielsweise hydrophobe biokompatible Trägermaterialien, wie etwa die in WO 91/13638 beschriebenen. Daneben können aber auch Trägermaterialien mit vorwiegend hydrophilen Eigenschaften verwendet werden.
Eine weitere bevorzugte Ausführung der Erfindung liegt in der Verwendung der erfindungsgemäßen Keratinozyten zusammen mit resorbierbaren Polymeren, bestehend aus Polyester, Polycarbonate, Polyanhydride, Polyorthoester, Polydepsipeptide, Polyetherester, Polyaminosäuren oder Polyphosphazene, insbesondere aus Poly(L-lactid), Poly(D,L-lactid), Poly(L-lactid-co-D,L-lactid), Poly(glycolid), Poly(L-lactid-co-glycolid), Poly(L-lactid-co- trimethylen-carbonat) oder Poly(dioxanon) sowie die Verwendung von perforierten Folien, bestehend aus den besagten Polymeren.
1. Material
K/1-Medium (vgl. Beispiel 1); PBS, 0,04% EDTA (wird mit PBS auf 0,02% verdünnt); Trypsin/EDTA (0,05%/0,01%); sterile Rouxschalen (T 25 cm2, T 80 cm2, T 175 cm2'),Laserskin (Fa. Fidia Advanced Biopolymers srl, Abano Terme, Italien) in 144x21 Petrischalen (145cm2 Fläche); 3T3-Feeder-Zellen; erfindungsgemäße Keratinozyten wie zum Beispiel KC-BI-1
2. Kultivierung des biologisch aktiven Wundheilungsverbandes 2.1. Material Bestrahlte Feeder-Zellen, z.B. die unter Beispiel 2 ausgeführten murinen 3T3 Fibroblasten; erfindungsgemäße Keratinozyten aus der Stammhaltung; 8,5cm x 8,5cm große Laserskinstücke in einer Petrischale (Fertigprodukt); K/2-Medium 2.2. Aussaat der 3T3 Feeder-Zellen
Die Feeder-Zellen, hergestellt gemäß des Ausführungsbeispiels 2, werden mit einer Einsaatdichte von ca. 15.000 bis 25.000 Zellen/cm2 (entspricht ungefähr 3xl06 Zellen/Petrischale) auf Laserskin aufgebracht. Die Petrischale wird anschließend bei >90% Luftfeuchtigkeit und 5-11 % CO2; vorzugweise 7-9% in einem 37°C Brutschrank inkubiert bei 35 bis 37°C inkubiert. Die Keratinozyten werden entweder am selben Tag oder spätestens am nächsten Tag (nach 24 Std.) auf den Feeder-Zellrasen gesät.
2.3. Aussaat und Kultivierung der Keratinozyten Mit den erfindungsgemäßen Keratinozyten werden die biologisch aktiven Wundheilverband hergestellt. Die Subkultivierung der Keratinozyten kann beispielhaft wie nachfolgend beschrieben erfolgen:
Die subkonfluenten Kulturen werden einmal mit 0,02% EDTA gespült (80 cm Rouxschale: 8 mL; 175 cm2 Rouxschale: 10 ml). Anschließend werden die Feeder-Zellen mit 0,02% EDTA für 5-10 min bei 37°C inkubiert (80 cm2 Rouxschale: 8 mL; 175 cm2 Rouxschale: 10 ml), und durch vorsichtiges Schütteln abgelöst.
Die Keratinozyten werden entsprechend Ausführungsbeispiel 1 mit einem Trypsin/EDTA Gemisch (0,05%/0,0.1%) gelöst (80 cm2 Rouxschale: 2-3 mL; 175 cm2 Rouxschale:' 5-6 ml), anschließend in Zellkukturmendium aufgenommen (80 cm2 Rouxschale: 7-8 mL; 175 cm2 Rouxschale: 14-15 ml) und durch vorsichtiges Auf- und Abpipetieren vereinzelt.
Auf die mit Feeder-Zellen vorbereitete Laserskin-Folie werden die erfindgungsgemäßen Keratinozyten mit einer Aussatdichte von ca. 15.000 bis 25.000 Zellen/cm2 (entspricht ungefähr 3xl06 Zellen/Petrischale) aufgebracht. Anschließend werden die Zellen bis zu einer Konfluenz von 30 - 100%, bevorzugt von 80 - 100% bei 35 - 39°C, bevorzugt bei 37°C inkubiert. Die Luftfeuchtigkeit beträgt > 90%, bevorzugt 95% und die CO2-Konzentration liegt bei 5 - 9%.
Beispiel 4: Verfahren zur Kryokonservierung des erfindungsgemäßen biologisch aktiven Wundheilverbandes
Nachdem die Keratinozyten die Trägermatrix mit einer Konfluenz von 30- 100% vorzugsweise 80-100% bewachsen haben, kann das erfindungsgemäße Produkt in geeigneten Behältnissen, z.B. verschweißbaren PP-Beuteln, kontrolliert eingefroren werden. Hierzu wird Kulturmedium vorsichtig entfernt und durch 20 ml 2-6°C kaltes Einfriermedium K/2 ausgetauscht. Das Produkt wird anschließend steril verpackt und entsprechend dem nachfolgenden Programm eingefroren:
Nach einer schnellen Temperaturerniedrigung auf - 5 bis - 10°C, bevorzugt -6 bis -8°C innerhalb von 2-5 min wird das Produkt bei entsprechender Temperatur für 15-30 min, bevorzugt für 23-25 min äquilibriert. Anschließend wird das Produkt mit einer Einfrierrate von < l°C/min, bevorzugt von 0,2 bis 0,6°C/min besonders bevorzugt von 0,4°C/min auf eine Temperatur von z.b. -60 bis -80°C herabgekühlt. Die Lagerung des Produktes erfolgt bei -60 bis -80°C.
K/2-Einfriermedium:
K/l -Wachstumsmedium (vgl. Beispiel 1) versetzt mit»7-13% (w/w) Hydroxyethylstärke.
Beispiel 5: Beispielhafte Verwendung einer mit den erfindungsgemäße Keratinozyten bewachsenen Trägermatrix zum Abdecken von Wunden am Beispiel von Ulcus cruris venosum
1. Transport frisch hergestellter Wundheilungsverbände
Nachdem die Keratinozyten 30-100%, bevorzugt 80-100% konfluent auf dem Laserskin bewachsen sind, wird die Kultur mit einer geeigneten Menge, vorzugsweise 30 ml, K/3- Transportmedium ein bzw. mehrmals gespült. Transportiert wird der biologisch aktive Wundheilverband in geeigneter Menge, vorzugsweise in 20 ml Ky3-Transportmedium. Der Kopfraum der Petrischale wird mit einem Luftgemisch aus 5-10% CO2 kurz begast, mit einem -Klebeband z.B. Parafilm verschlossen und sofort in einer Transportbox in die Klinik gebracht.
K/3-Transportmedium : Wachstumsmedium K/l (vgl. Beispiel 1) ohne Fötales Kälber Serum (FCS). Vorstellbar ist aber auch die Verwendung von einfachen physiologischen Salzlösungen etwa auf Phosphat- Borat-Basis, z.B. PBS, oder auch auf HEPES- (N-2-hydroxyethylpiperazin-N'-2- ethansulfonsäure) oder MES-Basis ([2-N-mo holino]ethansufonsäure). 2. Transport kroykonservierter Wundheilungsverbände
Kryokonservierte Wundheilverbände können typischerweise auf Trockeneis in den Kliniken angeliefert werden. Es ist aber auch eine andere Transportform vorstellbar, sofern die Wundheilverbände bei einer Temperatur von unter - 60°C transportiert werden.
Die kryokonservierten Wundheilverbände werden zügig aufgetaut. Anschließend wird das Einfriermedium entfernt und das Verband mit K 3 -Transportmedium (vgl. oben) oder einer anderen geeigneten physiologischen Lösung, z.B. Ringerlösung) ein bis mehrmals gespült.
3. Therapeutische Verwendung
Der Verband wird anschließend auf die Wunde aufgelegt. Bei der Verwendung nicht perforierter Trägermaterialien, ist ein gerichtetes Auflegen des Wundheilverbandes mit den Zellen in Richtung der Wunde erforderlich. Die Verwendung von perforierten Trägern, die ein beidseitiges Bewachsen der Träger mit Keratinozyten ermöglichen (z.B. Laserskin), erfordert kein gerichtetes Auflegen des erfindungsgemäßen Wundheilverbandes auf die zu behandelnde Wunde. Je nach Therapieerfolg kann die Behandlung mehrfach wiederholt werden.
Beispiel 6: genetische Charakterisierung der Keratinozytenzelle KC-BI-1 (DSM ACC2514)
KC-BI-1 Zellen wurden nach der oben beschriebenen erfindungsgemäßen Methode über mehrere Passagen subkultiviert. Zellen aus Passage 4, 13 und 121 wurden anschließend einer genetischen Analyse unterzogen wobei der Längenpolymorphismus von 15 verschiedenen Genorten untersucht wurde (CSFIPO, D13S317, D16S539, D18S51, D21S11, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, FGA, Penta D, Penta E, TH01, TPOX und vWA). Die Analyse erfolgte nach einem im Stand der Technik bekannten Verfahren. Hierzu wurden die entsprechenden Allele unter Verwendung eines Test zur Bestimmung der Vaterschaft (PoewerPlex® 16 System) der Firma Promega, (Mannheim, Deutschland) entsprechend der Herstellerangaben amplifiziert. Die Allele können durch Bestimmung der Fragmentlänge identifiziert werden (Längendstandard ILS 600 ist Bestandteil des oben genannten Kits). Angaben zu Allelhäufigkeiten in der Bevölkerung sind den entsprechenden Tabellen zu entnehmen. Die Analyse hat eine Übereinstimmung sämtlicher Allele an sämtlichen Genorten für alle analysierten Zellpassagen ergeben. Die Daten erlauben somit eine genetische Zuordnung der KC-BI-1 Zellen. Aus den AUelhäufigkeiten wurde eine Zuordnungswahrscheinlichkeit von > 99.999% ermittelt.
Bestimmung des DNA-Längenpolymorphismus:
Figure imgf000021_0001
Literatur:
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Claims

Patentansprtiche
I . Keratinozyten, dadurch gekennzeichnet, dass sie nicht immortalisiert sind und sich durch in vitro Zellkulturverfahren mindestens 150 mal verdoppeln lassen.
2. Keratinozyten gemäß Anspruch 1, isoliert aus den epidermalen Anteilen einer Norhaut.
3. Keratinozyten gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich dabei um Zellen aus der Kultur KC-BI-1 (DSM ACC 2514) handelt, oder um hiervon abgeleitete Keratinozyten.
4. Keratinozyten gemäß der Ansprüche 1-3, wobei die besagten Keratinozyten a. nicht in Abwesenheit von Fötalem Kälber Serum und/oder b. nicht in Abwesenheit von Feeder-Zellen und/oder c. nicht in Abwesenheit von Epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) verdoppelt werden können.
5. Keratinozyten gemäß der Ansprüche 1-4, wobei die Telomeraseaktivität der besagten Keratinozyten im Vergleich zu der Zellinie HaCaT um mindestens Faktor 2 niedriger ist.
6. Keratinozyten gemäß der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, dass sich die besagten Keratinozyten durch in vitro Zellkulturverfahren mindestens 200 mal verdoppeln lassen.
7. Keratinozyten gemäß der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, dass sich die besagten Keratinozyten durch in vitro Zellkulturverfahren mindestens 250 mal verdoppeln lassen.
8. Keratinozyten gemäß der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, dass sich die besagten Keratinozyten durch in vitro Zellkulturverfahren mindestens 300 mal verdoppeln lassen.
9. Produkt bestehend aus einem Träger, der mit Keratinozyten gemäß einem der Ansprüche 1-8 beschichtet ist, a. wobei der Träger partiell mit Keratinozyten bewachsen ist; oder b. wobei der Träger vollständig mit Keratinozyten bewachsen ist.
10. Produkt gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Träger um ein biokompatibles Trägermaterial handelt, das zur Herstellung eines Arzneimittels verwendet werden kann.
II. Produkt gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermaterial eine hydrophobe oder hydrophile biodegradierbare Membran ist.
12. Produkt gemäß der Ansprüche 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Träger um ein Polymer aus veresterter Hyaluronsäure handelt, bevorzugt um ein perforierte Polymerfolie mit definierter Geometrie, a. wobei die Polymerfolie eine Dicke von 10 bis 500 μm und mit Löchern mit einer Größe zwischen 10 und 1000 μm durchlöchert ist, wobei die Löcher eine definierte und konstante Größe haben und eine geordnete Reihe bilden, worin sie durch einen konstanten Abstand von 50 bis 1000 μm voneinander getrennt sind.
13. Produkt gemäß der Ansprüche 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Trägermaterial um Polyester, Polycarbonate, Polyanhydride, Polyorthoester, Polydepsipeptide, Polyetherester, Polyaminosäuren oder Polyphosphazene handelt, a. insbesondere um Poly(L-lactid), Poly(D,L-lactid), Poly(L-lactid-co-D,L-lactid), Poly(glycolid), Poly(L-lactid-co-glycolid), Poly(L-lactid-co-trimethylen-cabonat) oder Poly(dioxanon), b. wobei die besagten Polymere perforiert oder c. nicht perforiert sind.
14. Verfahren zur Kryokonservierung von Keratinozyten gemäß der Ansprüche 1-8 oder eines Produkts gemäß der Ansprüche 9-13, bei dem die Keratinozyten oder das Produkt bei einer Temperatur von -20°C bis -196°C, bevorzugt bei -60 bis -80°C kryokonserviert werden/wird.
15. Keratinozyten gemäß der Ansprüche 1-8 oder Produkt aus Keratinozyten und Träger gemäß der Ansprüche 9-13 die/das nach dem unter Anspruch 14 beanspruchten Verfahren behandelt worden sind/ist.
16. Keratinozyten gemäß der Ansprüche 1-8 und 15 oder Produkt gemäß der Ansprüche 10- 13 und 15 zur medizinischen Verwendung.
17. Verwendung von Keratinozyten gemäß der Ansprüche 1-8 und 15 oder eines Produkts gemäß der Ansprüche 10-13 und 15 zur Behandlung von Wunden.
18. Verwendung gemäß Anspruch 17, wobei es sich bei den Wunden bevorzugt um Verbrennungen und/oder Geschwüren handelt.
19. Verwendung gemäß Anspruch 17, wobei es sich bei den Wunden bevorzugt um Verbrennungen zweiten Grades handelt.
20. Verwendung gemäß Anspruch 17, wobei es sich bei den Wunden bevorzugt um chronisch schlecht heilende Unterschenkelgeschwüre des Typs Ulcus cruris, bevorzugt Ulcus cruris venosum handelt.
21. Verwendung gemäß Anspruch 17, wobei es sich bei den Wunden bevorzugt um diabetisch bedingten Ulcus handelt.
22. Verwendung gemäß Anspruch 17, wobei es sich bei den Wunden bevorzugt um Dekubitus handelt.
23. Verwendung gemäß der Ansprüche 16-22 in Ergänzung zur oder in Kombination mit der Verwendung eines oder mehreren anderen Stoff(en) mit positiver Wirkung für die Wundheilung.
24. Verwendung gemäß des Anspruchs 23, wobei es sich bei dem anderen Stoff um Hydrokolloidverbänden handelt.
25. Verwendung gemäß des Anspruchs 23, wobei es sich bei dem anderen Stoff antimikrobielle Substanzen handelt, wie (a) z.B. um Antibiotika.
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