WO2003059516A1 - Reaktionsgefäss zur durchführung von array-verfahren - Google Patents

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Definitions

  • the invention relates to a reaction vessel, a device and a method for the detection of specific interactions between molecular target and probe molecules.
  • Biomedical tests are often based on the detection of an interaction between a molecule that is present in a known quantity and position (the molecular probe) and an unknown molecule to be detected or unknown molecules (the molecular target or target molecules).
  • the probes are stored in the form of a substance library on supports, the so-called micro-arrays or chips, so that a sample can be analyzed in parallel on several probes simultaneously (DJ Lockhart, EA Winzeler, Genomics, gene expression and DNA arrays; Nature 2000, 405, 827-836).
  • the probes are usually immobilized in a predetermined manner on a suitable matrix, for example described in WO 00/12575 (see, for example, US Pat. No. 5,412,087, WO 98/36827) or generated synthetically (see, for example, US Pat. No. 5,143,854 ).
  • An interaction between the probe and the target molecule is usually detected as follows: After the probe or the probes have been fixed in a predetermined manner to a specific matrix in the form of a microarray, the targets are brought into contact with the probes in a solution and incubated under defined conditions, due to the incubation there is a specific interaction between probe and target. The binding that occurs is significantly more stable than the binding of target molecules to probes that are not specific for the target molecule. To remove target molecules that have not been specifically bound, the system is washed with appropriate solutions or heated.
  • a target and its probe can then be demonstrated by a variety of methods, usually by depend on the type of marker which has been introduced into target molecules before, during or after the interaction of the target molecule with the microarray.
  • markers are fluorescent groups, so that specific target-probe interactions with high spatial resolution and compared to other conventional detection methods, especially mass-sensitive methods, can be read with fluorescence optics with little effort (A. Marshall, J. Hodgson , DNA chips: An array of possibilities, Nature Biotechnology 1998, 16, 27-31; G. Ramsay, DNA Chips: State of the art, Nature Biotechnology 1998, 16 "40-44).
  • this test principle can be used to investigate interactions between nucleic acids and nucleic acids, between proteins and proteins and between nucleic acids and proteins (for an overview, see F. Lott Tips, H. Zorbas, 1998 , Bioanalytics, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg Berlin).
  • Antibody libraries, receptor libraries, peptide libraries and nucleic acid libraries can be used as substance libraries that can be immobilized on microarrays or chips.
  • the nucleic acid libraries play by far the most important role. These are microarrays on which deoxyribonucleic acid (DNA) molecules or ribonucleic acid (RNA) molecules are immobilized.
  • DNA deoxyribonucleic acid
  • RNA ribonucleic acid
  • a prerequisite for binding a target molecule, for example marked with a fluorescence group, in the form of a DNA or RNA molecule to a nucleic acid probe of the microarray is that both the target molecule and the probe molecule are in the form of a single-stranded nucleic acid.
  • An efficient and specific hybridization can only occur between such molecules occur.
  • Single-stranded nucleic acid target and nucleic acid probe molecules are usually obtained by heat denaturation and optimal selection of parameters such as temperature, ionic strength and concentration of helix-destabilizing molecules. This ensures that only probes with almost perfectly complementary, ie corresponding sequences remain paired with the target sequence (AA Leitch, T. Schwarzacher, D. Jackson, IJ Leitch, 1994, hl vitro hybridization, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg Berlin Oxford) ,
  • a typical example of the use of microarrays in biological test methods is the detection of microorganisms in samples in biomedical diagnostics. It takes advantage of the fact that the genes for ribosomal R A (rRNA) are ubiquitous and have sequence segments that are characteristic of the respective species. These species-characteristic sequences are applied to a microarray in the form of single-stranded DNA oligonucleotides.
  • the target DNA molecules to be examined are first isolated from the sample to be examined and provided with markers, for example fluorescent markers.
  • the labeled target DNA molecules are then incubated in a solution with the probes applied to the microarray, unspecific interactions are removed by appropriate washing steps and specific interactions are detected by fluorescence-optical evaluation.
  • micro-arrays or chips are fixed in closed chambers which have inlets and outlets for changing the liquids required for the washing steps and hybridization steps.
  • closed chambers Such systems are described, for example, in US Pat. No. 6,287,850 and WO 01/02094.
  • DE 199 40 750 describes a carrier for analyte determination methods which, after slight structural changes, is also suitable for use in arrays in the context of this invention.
  • a flow cell which is suitable for carrying out a PCR as well as hybridization reactions on DNA chips.
  • the flow cell described there is a complex component that is provided with a number of technical features that preclude the use of equipment commonly used in laboratories, such as a The ⁇ nomixer (Eppendorf, Germany, Hamburg) or a laboratory centrifuge (Heraeus, Hanau, Germany) ,
  • WO 01/02094 describes a cartridge which comprises a DNA chip. Both a PCR and a hybridization reaction can be carried out on a DNA chip in this cartridge.
  • WO 95/33846 describes a body with a recess into which a substrate with nucleic acid molecules of known sequence is installed in defined areas. The body has a closed cavity into which the sample liquid can be injected. The filling channels are sealed with septa and opened with suitable puncture needles to infect the body or the cartridge. The Use of the cartridges described above also requires dedicated devices.
  • a miniaturized integrated nucleic acid diagnostic device is described in US Pat. No. 5,856,174. This device enables the collection of one or more samples, their preparation and the subsequent execution of several sample analyzes. Such a device is used to automatically carry out a DNA chip-based analysis by combining and miniaturizing all the steps involved on a cartridge. The provision of such a device is extremely complex and expensive.
  • US Pat. No. 5,545,531 describes a method for producing microtiter plates, the bottom of which is a wafer which has a sample matrix at every point where there is a depression in the microtiter plate.
  • No. 5,874,219 describes a method for the competing implementation of biological tests, in which a large number of reaction vessels are arranged contiguously next to one another and each vessel is provided with a molecular sample matrix.
  • This biological chip reaction vessel plate is designed in such a way that the interactions on the molecular sample matrix can be read out with appropriate reading devices. In this way, a number of biological samples can be examined side by side and in parallel with molecular sample matrices.
  • the reaction vessel plate described there is not suitable for carrying out individual tests. The production of such a reaction vessel plate is described in US 5,545,531.
  • WO 99/35499 describes a device in which substance libraries are addressably mounted on a disk which is similar to a modern compact disk (CD). A certain substance can be approached on the disk by rotating the disk. The reading head of the reading device can then be moved along the radius of the disk. The position of the disc can be determined by integrated tracks that can be read with a standard CD player. The Interaction of the sample with a target substance can take place by absorption measurements and fluorescence measurements in transmitted or incident light. Magnetic particles can also be deposited, which can be detected with a magnetic reading head. In order to visualize the interaction reaction, a staining by means of a
  • Silver precipitate proposed, the deposition is mediated via a streptavidin / biotin gold conjugate.
  • WO 00/72018 discloses a method for silver deposition on slides for the visualization of interaction reactions of substance libraries. Furthermore, necessary reading devices are described.
  • the present invention is therefore based on the object of providing a device for carrying out array methods which is distinguished by simple construction, easy handling and thus cost-effective production.
  • Another object of the present invention is to provide a reaction vessel which can be used in such a device and which is also distinguished by ease of handling and by compatibility with devices conventionally used in laboratories, such as, for example, table centrifuges and pipettes. It is also a
  • Object of the present invention to provide a reaction vessel which allows microarray-based tests to be carried out in a single-chamber system while avoiding sources of contamination. Furthermore, it is an object of the present invention to provide a device for performing array methods, which allows the use of detection methods with relatively little technical effort.
  • reaction vessel which has a shape and / or size typical for a laboratory reaction vessel and in which a carrier element with probe molecules immobilized thereon on predetermined areas is arranged on one of its base areas.
  • reaction vessel according to the invention for the detection of specific interactions between molecular target and probe molecules offers the essential advantage that the purchase of additional devices or additional equipment for carrying out the detection reactions is not necessary, since they are usually carried out in laboratories, especially in biological laboratories used devices for standard laboratory reaction vessels, such as table centrifuges and pipettes, can be used. Another advantage of the invention
  • the reaction vessel is that a separate incubation chamber is unnecessary, since the reaction vessel also serves as a hybridization chamber.
  • the surface of the carrier with the probe molecules immobilized on it is protected against contamination and other disadvantageous external influences by the lid lock typical of conventional laboratory reaction vessels, for example the Safe-Lock lid lock in Eppendorf reaction vessels.
  • laboratory reaction vessels with a typical shape and size are understood to be reaction vessels which are usually used as disposable reaction vessels, in the standard version having a capacity of 1.5 ml, in, in particular biological or molecular biological, laboratories.
  • Such laboratory reaction vessels are also referred to as tubes and, after the most important manufacturer, in particular as Eppendorf tubes or "Eppis” (Hamburg, Germany).
  • Laboratory tubes with a typical shape and size from Eppendorf are used as standard tubes or safe-lock Reaction vessels offered.
  • reaction vessels from manufacturers such as Greiner (Frickenhausen, Germany), Millipore (Eschborn, Germany), Heraeus (Hanau, Germany) and BlOplastics (Landgraaf, Netherlands) and other manufacturers can also be used within the scope of the present invention, which have a shape and size have, as is typical for laboratory reaction vessels, in particular from Eppendorf. Examples of laboratory tubes with a typical shape and size are shown in Figure 21.
  • laboratory reaction vessels of typical shape and size are in particular not understood to mean round-bottom flasks or other flasks such as Erlenmeyer flasks, beakers or measuring cylinders.
  • the reaction vessel according to the invention differs from the above-mentioned reaction vessels in that a support element with immobilized on predetermined areas on one of its base surfaces
  • Probe molecules is arranged. Such a carrier element with probe molecules immobilized thereon on predetermined areas is also referred to below as a chip or affinity matrix. The predetermined areas on the carrier are also referred to below as array elements.
  • the reaction vessel has a shape and / or size that is typical of a laboratory reaction vessel.
  • the reaction vessel according to the invention thus has a rotationally symmetrical shape, in particular a cylindrical or essentially cylindrical shape.
  • Laboratory vessels typical shapes and thus conceivable shapes for the reaction vessel according to the invention also includes a conical shape deviating from the cylindrical basic shape, the taper preferably occurring in the direction of the affinity matrix. Typical shapes are also combinations of cylindrical or essentially cylindrical areas and conical areas Areas (see also Figures 1-4 and 21). Because of the shape and size typical of laboratory reaction vessels, the reaction vessel according to the invention is particularly compatible with conventional table centrifuges, such as from manufacturers such as Eppendorf or Heraeus, ie the reaction vessel according to the invention is suitable for centrifugation in conventional table centrifuges.
  • Usual maximum outer diameters for standard laboratory reaction vessels and thus also for the reaction vessel according to the invention are in the range from 0.8 cm to 2 cm, preferably 1.0 cm to 1.5 cm and particularly preferably 1.1 cm to 1.3 cm. Further preferred outer diameters are up to 0.9 cm, up to 1.2 cm, up to 1.4 cm, up to 1.6 cm and up to 1.7 cm.
  • the height of the reaction vessel according to the invention is usually 1.5 cm to 5.0 cm, preferably 2.0 cm to 4.0 cm, particularly preferably 2.5 cm to 3.5 cm, and most preferably 2.8 cm to 3 , 2 cm. Further preferred heights are up to 2.6 cm, up to 2.7 cm, up to 2.9 cm, up to 3.0 cm, up to 3.1 cm, up to 3.3 cm and up to 3.4 cm. In special configurations, the height can also be 1.0 cm or more.
  • the reaction vessel according to the invention is conventional
  • Table centrifuges can be centrifuged and can therefore be used, for example, in conventional table centrifuges such as a standard table centrifuge with a standard rotor from Eppendorf, as well as in conventional racks and holders for reaction vessels such as a tube rack from Eppendorf.
  • Conventional pipettes or syringes such as, for example, variable and fixed-volume pipettes from Eppendorf can be used to introduce the sample to be examined and other reagents required to carry out the detection reaction into the reaction vessel.
  • the arrangement of the chip in the reaction vessel according to the invention enables the interaction reaction between target and probe molecules to be detected by conventional methods such as, for example, by fluorescence detection or radiochemical methods.
  • absorption measurements has proven to be particularly advantageous since they can be carried out particularly inexpensively.
  • Such an absorption measurement can be made using a reactive Staining method, which takes place on the surface areas where an interaction reaction has taken place, are significantly improved and cheaper.
  • the deposition of silver on target molecules labeled with gold nanospheres has proven particularly useful here (see DE 100 33 334.6 and WO 02/02810).
  • a device can be used that uses one or more light-emitting diodes of any emission wavelength as the light source and, for example, has a CCD camera for spatially resolved detection of the interaction reaction on the predetermined areas of the chip.
  • a probe array is understood to mean an arrangement of molecular probes on a surface, the position of each probe being determined separately.
  • the array preferably comprises defined locations or predetermined areas, so-called array elements, which are particularly preferably arranged in a specific pattern, each array element usually containing only one species of probe.
  • a probe or a probe molecule is understood to be a molecule which is used to detect other molecules due to a specific, characteristic binding behavior or a specific reactivity. Any type of molecule that can be coupled to solid surfaces and has a specific affinity is suitable for the probes arranged on the array. In a preferred embodiment, these are biopolymers from the classes of peptides, proteins, nucleic acids and / or their analogs.
  • the probes are particularly preferably nucleic acids and / or nucleic acid analogs. Both DNA and RNA molecules can be used as nucleic acids.
  • the Oligonucleotide probes are oligonucleotides with a length of 10 to 100 bases, preferably 15 to 50 bases and particularly preferably 20 to 30 bases in length, which are immobilized on the array surface.
  • a target or a target molecule means the molecule to be detected with a molecular probe.
  • the targets to be detected are nucleic acids.
  • the probe array according to the invention can be used analogously for the detection of protein / probe interactions, antibody / probe interactions, etc.
  • an array element or a predetermined area is understood to mean an area on a surface intended for the deposition of a molecular probe; the sum of all occupied array elements is the probe array.
  • a label denotes a detectable unit, for example a fluorophore or an anchor group, to which a detectable unit can be coupled.
  • a substrate is understood to mean a molecule or a combination of molecules present in solution in the reaction medium, which is locally deposited with the aid of a catalyst or a crystallization seed and / or a converting agent.
  • the converting agent can be, for example, a reducing agent, such as in the case of silver deposition, or an oxidizing agent, such as in the production of a dye by enzymatic oxidation.
  • a carrier element or carrier is understood to mean a solid body on which the probe array is constructed.
  • the Carrier element with the probes arranged thereon is also referred to below as a chip and, in special configurations of the present invention, can also include a basic element on which the actual chip is arranged.
  • the carrier element can be arranged in the reaction vessel according to the invention by simply inserting or clamping it in a laboratory reaction vessel, preferably by designing the chip area in such a way that it can be inserted or clamped in a precisely fitting manner in a laboratory reaction vessel, for example in its lid.
  • a base of the laboratory reaction vessel is flattened in such a way that the carrier element can be attached to it. If technical reasons require it, the carrier or the chip can also be installed in the side walls of the reaction vessel according to the invention.
  • the base preferably the bottom of the laboratory reaction vessel has a recess for receiving the carrier.
  • the carrier or chip can be glued and / or clamped and / or screwed and / or welded, in particular by laser welding, and / or latched into this recess, for example from the inside and / or from the outside.
  • the reaction vessel according to the invention has a shape and size typical of a laboratory reaction vessel and a breakthrough shaped as an enclosure for receiving the affinity matrices, in particular surface-bound substance libraries. Examples of such embodiments of the reaction vessel according to the invention are given in Figures 1 to 4. In addition to the variants shown there, other combinations of the type of fastening of the carrier are of course conceivable.
  • the installation of the carrier or chip from the inside has the advantage that the carrier or chip can also be used at higher internal pressures, for example when used in a centrifuge or when the sample liquid is heated to temperatures near the boiling point, it cannot be pressed out of its attachment in the reaction vessel.
  • assembly requires more effort than installation from the outside.
  • Clamp connections or threads or grids ensure a non-positive and liquid-impermeable connection between the reaction vessel and carrier or chip.
  • Such variants combine the advantages of inserting the carrier or chip from the inside into the reaction vessel with those of simplified assembly.
  • Another connection point e.g. the clamp connection and the higher number of components.
  • reaction vessel In the manufacture of the reaction vessel according to the invention, an injection molded standard laboratory reaction vessel, in particular from one of the manufacturers mentioned above, is usually assumed. This is cut at the bottom and then remelted in a specially designed device. Such a method is particularly suitable for smaller quantities. For large quantities, it is advisable to injection-mold the reaction vessel directly in one of the above-mentioned configurations.
  • the base area on which the carrier element with the probe molecules immobilized thereon on predetermined areas is usually arranged is the base of the reaction vessel according to the invention.
  • the carrier can also be attached in the lid of the reaction vessel.
  • the installation of the carrier element or the chip area in the lid of the reaction vessel is particularly advantageous if the affinity matrix sensitive to the conditions in one or more of the reaction steps for preparing and / or performing the detection reaction.
  • reaction steps can be carried out in the upright reaction vessel, as a result of which the affinity matrix or the chip does not come into contact with the reaction and sample solutions and is thus protected.
  • the reaction vessel according to the invention is then rotated or placed on the lid so that the sample comes into contact with the surface-bound probes. In this way, the thermal and chemical loads on the affinity matrix or the chip are reduced.
  • the carrier element of the reaction vessel according to the invention is preferably optically transparent and / or non-fluorescent in the area of the detection surface.
  • the detection area is to be understood as the area of the carrier element on which probe molecules are immobilized in predetermined areas.
  • the probe molecules are applied directly to the carrier element without the carrier element comprising a further basic element.
  • the probe molecules are applied to a preferably optically transparent and / or non-fluorescent chip, which in turn is firmly connected to a base element which is preferably optically transparent and / or non-fluorescent at least in the detection range defined by the chip.
  • the dimensions of the chip are smaller than the dimensions of the basic element.
  • the chip carrying the probe molecules and the base element together form the carrier element.
  • the base area opposite the detection surface of the carrier element is likewise optically transparent and / or non-fluorescent in the area corresponding to the detection surface.
  • a probe array according to the present invention includes a support that allows arrays with probes to be formed on its surface.
  • a carrier can be produced, inter alia, from materials selected from the group consisting of glass, filters, electronic devices, polymers, metallic materials and the like. as well as any combination of these materials.
  • the carrier element preferably consists of optically transparent and / or non-fluorescent materials.
  • Such materials are, for example, glass, Borofloat 33 (for example available from Schott, Jena, Germany), quartz glass, single-crystal CaF 2 (for example available from Schott), single-crystal silicon, phenylmethyl methacrylate and / or polycarbonate.
  • the chip likewise preferably consists of optically transparent and / or non-fluorescent materials.
  • the materials are in particular glass, borofloat 33, quartz glass, single-crystal CaF 2 , single-crystal silicon, phenylmethyl methacrylate and / or polycarbonate.
  • the material of the container of the reaction vessel corresponds to the materials usually used for laboratory reaction vessels and is selected, for example, from the group consisting of glass, glass ceramic, plastic-coated glass and plastics or organic polymers such as polypropylene, polyethylene, polystyrene, polycarbonate, PVC, polymethyl methacrylate, silicone plastic,
  • Rubber, polytetrafluoroethylene and / or nylon Rubber, polytetrafluoroethylene and / or nylon.
  • metals in particular stainless steels, platinum and / or aluminum, are also conceivable as materials.
  • the reaction vessel has a size that is typical for a laboratory reaction vessel. Typical filling volumes are in the range from 100 ⁇ l to 2.5 ml, but can also be higher or lower in special configurations.
  • the reaction vessel particularly preferably has a filling volume of up to 1.5 ml customary for a standard Eppendorf tube. Further preferred filling volumes are up to 0.4 ml, up to 0.5 ml, up to 0.7 ml, up to 1.0 ml or up to 2.0 ml.
  • the immobilized probe molecules on the carrier element are usually a substance library.
  • a substance library is understood to be a collection of different substances that are immobilized on a surface.
  • the substances are arranged on the surface in such a way that each substance is assigned a specific, uniquely identifiable location and that each substance is immobilized completely separately from the others.
  • the substance libraries can be protein substance libraries, peptide substance libraries and nucleic acid substance libraries.
  • Protein substance libraries can in particular be antibody, receptor molecule and membrane protein libraries. Possible peptide libraries are in particular receptor ligand libraries, pharmacologically active peptide libraries and peptide hormone libraries.
  • Nucleic acid substance libraries are in particular DNA and RNA molecule libraries. In the case of DNA molecule libraries, ribosomal DNA sequences of microorganisms are particularly preferably attached to the carrier element. It can also be nucleic acid substance libraries for SNP analysis. Protein or nucleic acid substance libraries which allow expression profiling are also conceivable. Another alternative is combinatorial substance libraries.
  • the substance libraries are applied to the carrier element in such a way that they contact the sample space of the reaction vessel.
  • the carrier element of the reaction vessel is thus preferably characterized in that it has a detection surface with a substance library on its surface and is optically transparent at least in the detection area.
  • a further advantageous embodiment of the invention is that the resulting reaction vessel is tight and aqueous samples can be heated to temperatures of up to 100 ° C. for hours without liquid escaping or the samples evaporating. That the reaction vessels according to the invention can be used in wide temperature ranges and are just as functional when freezing in liquid nitrogen (at -196 ° C.) as in a boiling water bath. They are also suitable, for example, to withstand autoclaving at 121 ° C for 15 minutes. Furthermore, the reaction vessels according to the invention are preferably chemically resistant to acids, bases and organic solvents such as alcohols, acetone or phenol.
  • the reaction vessel according to the invention preferably has the lids or lid locks usually used in laboratory reaction vessels, such as, for example, the Easy-to-Open systems (Biozym, Oldendorf, Germany), Safe- Lock (Eppendorf) and the like. In this way, the tightness and easy, in particular one-handed opening of the reaction vessel is ensured.
  • the Easy-to-Open systems Biozym, Oldendorf, Germany
  • Safe- Lock Eppendorf
  • the carrier element is inserted into a recess in the reaction vessel, sufficient tightness of the reaction vessel is usually achieved by gluing and / or clamping the carrier element in the recess and, if appropriate, subsequently applying a sealing material to the required areas.
  • the adhesives are usually applied using commercially available dispensers. Platinum-crosslinking polydimethylsiloxanes such as Sylgard 182 or Sylgard 184 (Dow Coming, Midland, Michigan, USA) are preferred as adhesives. Alternatively, other adhesives such as silicone adhesive, polyurethane adhesive, epoxy resin adhesive, cyanoacrylate adhesive, acrylic adhesive and / or heating adhesive can be used. Different rubbers such as silicone rubber and / or rubber materials and the like can be used as sealing materials.
  • the carrier element arranged in the reaction vessel is preferably a so-called DNA chip.
  • a DNA chip is a DNA library, for example bound on a glass surface, with a clear assignment of the DNA sequences to predetermined areas of the surface.
  • probe arrays used in the context of the present invention with probes immobilized at defined locations can generally be produced by conventionally known methods.
  • DNA chips are preferably produced by generally customary spotting methods or by special spatially resolved synthesis methods. Alternative methods such as synthesis methods via light-guided DNA synthesis are also suitable for the production. Processes for the production of probe arrays or chips, especially DNA chips, are Known to those skilled in the art and described, inter alia, in DE 197 06 570, EP 0 969 918 and WO 98/36827.
  • the probe arrays are preferably produced alternatively by two fundamentally different methods.
  • separately synthesized probes for example oligonucleotides
  • mockers which ensure the location-specific depositing of very small amounts of liquid and are covalently or non-covalently linked to them.
  • the process works in series. Each spot is individually equipped with the probe.
  • probe arrays are generated by site-specific in sttw synthesis of the probes, for example the oligonucleotide probes.
  • the synthesis takes place in parallel, for example on a wafer scale.
  • Suitable reagents for activating the array surface or suitable protective groups for probe synthesis on the array surface are known to the person skilled in the art.
  • the immobilization of molecules on the array surface can either be specific or non-specific.
  • the specific immobilization presupposes a selectivity of the interaction of certain chemical functions of the molecule to be immobilized with the surface of the substrate.
  • An example of a specific, non-covalent immobilization is the binding of biotin-labeled nucleic acid to a substrate coated with streptavitin.
  • Aniino-modified nucleic acids can be specifically determined via the reaction of the
  • Immobilize amino group with an epoxy, a carboxy function or an aldehyde is preferably carried out on an animated surface via a terminal phosphate group of the probe or the monomer unit of a biopolymer probe.
  • the site-specific immobilization takes place via a variety of mechanisms and chemical functions and can be both covalent and non-covalent.
  • An example of this is the immobilization of nucleic acids on a substrate surface modified with poly-L-lysine, but also the immobilization of chemically unmodified nucleic acids on epoxidized, aminated or aldehyde-functional substrate surfaces.
  • the reaction vessel (1) in Figure 1 essentially has the dimensions of commercially available reaction vessels and preferably resembles a 1.5 ml standard reaction vessel made of polypropylene, as it is manufactured in large quantities. It has a breakthrough (also referred to as a recess in the context of the present invention) (8, 10) which is provided with a holder into which the affinity matrix (100) can be inserted.
  • the version generally comprises a support surface (6, 11) for the affinity matrix (100), a liquid opening (8) in order to be able to bring the surface-bound substance library (102) into contact with the sample, and a viewing opening (10) to allow the To enable transmitted light detection.
  • the opening (8, 10) can be provided with an adhesive edge (7, 9) in order to simplify the bonding of the affinity matrix into the reaction vessel (2).
  • an adhesive edge (7, 9) in order to simplify the bonding of the affinity matrix into the reaction vessel (2).
  • special quick fasteners can be used. be seen.
  • the sealing effect can be achieved with seals.
  • the reaction vessel can be closed by a lid (3).
  • the affinity matrix (100) incorporated into the holder can be located at various positions in the reaction vessel (2). It is thus possible to attach the affinity matrices to the bottom of the reaction vessel as shown in Figures 1 to 4. In this case, the affinity matrix (100) is always exposed to the sample substances.
  • the matrix can also be installed in the cover (3).
  • the necessary conditioning steps of the sample are then carried out with the reaction vessel (1) upright, the affinity matrix not coming into contact with the sample and thus being protected.
  • the reaction vessel is then turned upside down so that the sample comes into contact with the surface-bound substance library (102). This would reduce the thermal and chemical loads on the affinity matrix (100).
  • the affinity matrices (100) can be connected to the in different ways
  • Reaction vessel (2) are connected.
  • the affinity matrix is placed from the outside in a liquid opening (8) on a support (6).
  • Adhesive is placed in an adhesive edge (7) which, by means of flow and capillary action, encloses the affinity matrix (100) and connects it to the reaction vessel (2) in a liquid-tight and temperature-stable manner.
  • the affinity matrix 100
  • Affinity matrix (100) can also be welded to the reaction vessel (2), for example by laser welding.
  • the affinity matrix (100) is built into the reaction vessel in such a way that the surface-bound substance library (102) can come into contact with the sample solution. After installing the affinity matrix (100) an optical transmitted light detection is possible with the reading devices (1000) according to Figures 5 to 15.
  • the affinity matrix (100) can also be installed from the inside, as shown in Figure 2.
  • the contact surface and the adhesive edge lie in the reaction chamber of the reaction vessel.
  • Figure 3 shows a variant in which the affinity matrix (100) is built into a chip carrier.
  • the chip carrier (200) is then pressed onto the reaction vessel (2).
  • a clamp connection or a thread (201) ensure a force-locking and liquid-impermeable connection between
  • This variant combines the advantages of an affinity matrix (100) inserted from the inside into the reaction vessel with those of a simplified assembly.
  • Another connection point e.g. the clamp connection and the higher number of components.
  • FIG. 4 shows a variant in which the affinity matrix (100) is clamped between the reaction vessel (2) and the clamping sleeve (300) by a clamping sleeve (300) inserted from the inside in such a way that the affinity matrix (100) is bonded to the reaction vessel ( 2) becomes superfluous.
  • this version requires a very high manufacturing precision of the clamping sleeve (300) and
  • a method for detecting the specific interaction between target and probe molecular molecules comprises the following steps:
  • the targets to be examined can be present in any type of sample, preferably in a biological sample. Before being detected and quantified, the targets are preferably isolated, cleaned, copied and / or amplified by the method according to the invention.
  • the amplification is usually carried out using conventional PCR methods.
  • the amplification is preferably carried out as a multiplex PCR in a two-stage process (see also WO 97/45559).
  • a multiplex PCR is carried out using fusion primers whose 3 'ends are gene-specific and whose 5' ends represent a universal region. The latter is the same for all forward and reverse primers used in the multiplex reaction.
  • the amount of primer is limited. This allows all multiplex products to be amplified to a uniform molar level, provided that the number of cycles is sufficient to achieve primer limitation for all products.
  • universal primers are added, which are identical to the 5 'regions of the fusion primers. Amplification takes place up to the desired amount of DNA.
  • the detection is preferably carried out in that the bound targets are provided with at least one marking which is detected in step c).
  • the probe molecules arranged on the probe array which serve to detect the molecular interactions with the target molecule, comprise at least one marking and at least one predetermined breaking point, i.e. a labile or selectively cleavable bond that can be specifically destabilized or cleaved.
  • the selectively cleavable bond arranged between the marking and the position of the linkage of the probes to the array surface enables the marking or detectable unit to also be used for the specific detection of the molecular interaction between probes and targets.
  • the predetermined breaking point or selective cleavable bond is positioned within the probe molecule in such a way that breaking the bond leads to detachment of the detectable unit or the anchor group with the detectable unit from the array surface.
  • the selectively cleavable bonds are preferably such that they are effectively cleavable even when the probes are immobilized on the array surface.
  • the selectively cleavable bond can preferably be cleaved selectively by chemical and / or physical methods. An efficient cleavage on the surface is particularly due to agents guaranteed to a small extent such as atoms and ions.
  • the labile bond can therefore preferably be selectively cleaved by simple chemical agents, for example by adding ions, particularly preferably acid anions, base cations, fluoride and / or heavy metal ions such as mercury and / or silver ions.
  • the selectively cleavable binding is stable under the conditions which are used for the immobilization of the probes on the array surface. If the probes are produced in situ by site-specific synthesis on the array surface, it is preferred that the labile binding can be generated efficiently as part of the course of the synthesis. The provision of the labile bond by means of phosphoramidite chemistry is particularly preferred. The same applies to the installation of the detectable unit.
  • the selectively cleavable bond be in a nuclear acid that can be made by conventional DNA or RNA synthesis.
  • the probe molecules of the probe array according to the invention particularly preferably comprise a nucleic acid of the formula A ⁇ -SA 2 , where S is a nucleic acid or a nucleotide building block which comprises at least one selectively cleavable bond, and Aj . and A 2 are any nucleic acids or nucleic acid analogs.
  • the probe molecule is immobilized on the surface of the probe array according to the invention via one of the two nucleic acids or nucleic acid analogs Ai and A 2 , while the other has at least one label.
  • S is preferably a nucleotide dimer bridged by a selectively cleavable bond.
  • X and Y can be selected independently of one another from the group preferably consisting of O, NH and S, where X and Y are not simultaneously O.
  • B stands for a nucleobase such as the purine derivatives adenine and guanine and the pyrimidines cytosine and thymine.
  • the selectively cleavable bond within the nucleotide sequence of such oligonucleotide probes is preferably a phosphothioate bond or a phosphoramidate bond.
  • the phosphothioate bond replaces, i.e. a sugar-O-P-S-sugar bond a phosphodiester bond, i.e. a sugar-O-P-O-sugar bond of an unmodified oligonucleotide.
  • two nucleosides are linked by a phosphotliioate bond.
  • the selectively cleavable bond within the nucleotide sequence can also be another sulfur- or nitrogen-modified ester bond, such as a phosphonothioate bond.
  • the selectively cleavable bond can be cleaved photolytically.
  • Nucleotide building blocks which comprise a photolytically selectively cleavable bond and which can be used for the synthesis of the probe molecules of the probe array according to the invention are described, for example, in US Pat. Nos. 5,367,066, 5,552,538 and 5,578,717.
  • RNA nucleotide building blocks which comprise a chemically or physically selectively cleavable bond are given in the following formula II:
  • X and Y can be selected independently of one another from the Grappe preferably consisting of O, NH and S, where X and Y are not simultaneously O if PG is not an unstable protective group.
  • PG is preferably selected from the group consisting of H and labile protecting groups such as
  • B in formula II stands for a nucleobase such as the purine derivatives adenine and guanine and the pyrimidines cytosine and uracil.
  • probe molecules with selectively cleavable bonds that are stable under normal atmospheric, temperature, and light conditions.
  • the labile bond can be selectively cleaved by enzymatic methods.
  • nucleotide building blocks which comprise such labile bonds are described in US Pat. No. 4,775,619 and US Pat. No. 4,876,187.
  • Enzymatic methods for cleaving the selectively cleavable bond are, however, less preferred in the context of the present invention, since enzymatic activities are severely hampered by the proximity of the selectively cleavable bond to the surface due to the immobilization of the probe molecules.
  • an enzymatic cleavage reaction has a very low efficiency, which results in an undesirable high signal background due to incorrectly positive measurement results.
  • the selectively cleavable bond cannot be cleaved selectively by enzymatic methods.
  • the selectively cleavable bond is located approximately in the middle between the point at which the probe is immobilized on the array surface and the position the marking of the probe. This ensures that the probability of the target interacting with the immobilized probe fragment, which corresponds to the remainder of the probe remaining on the surface after the bond cleavage, is substantially reduced or virtually excluded. If, on the other hand, the selectively cleavable bond is too close to the array surface, the complex of probe and target molecule is no longer sufficiently stabilized after cleavage, since the hybridization of the target with the probe fragment immobilized on the array surface is not sufficiently stable , This would incorrectly lead to negative measurement results.
  • the marking which is coupled to the targets or probes is preferably a detectable unit or a detectable unit which is coupled to the targets or probes via an anchor group.
  • the method according to the invention is extremely flexible with regard to the possibilities of detection or marking.
  • the method according to the invention is thus compatible with a large number of physical, chemical or biochemical detection methods.
  • the only requirement is that the unit or structure to be detected can be coupled directly to a probe or a target, for example an oligonucleotide, or linked via an anchor group that can be coupled to the oligonucleotide.
  • the detection of the label can be based on fluorescence, magnetism, charge, mass, affinity, enzymatic activity, reactivity, a gold label and the like. based.
  • the marking can be based on the use of fluorophore-labeled structures or building blocks.
  • the label can be any dye that can be coupled to targets or probes during or after their synthesis. Examples include Cy dyes (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden), Alexa dyes, Texas red, fluorescein, rhodamine (Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA), lanthanides such as samarium, ytterbium and Europium (EG&G, Wallac, Freiburg, Germany).
  • luminescence markers, metal markers, enzyme markers, radioactive markers and / or polymeric markers can also be used in the context of the present invention as a marker or as a detection unit which is coupled to the targets or probes.
  • a nucleic acid can also be used as a label (tag), which can be detected by hybridization with a labeled reporter (sandwich hybridization).
  • a labeled reporter such as primer extension, ligation and RCA are used to detect the tag.
  • the detectable unit is coupled to the targets or probes via an anchor group.
  • Preferred anchor groups are biotin, digoxygenin and the like.
  • Anchor groups are reacted in a subsequent reaction with specifically binding components, for example streptavidin conjugates or antibody conjugates, which are themselves detectable or trigger a detectable reaction.
  • specifically binding components for example streptavidin conjugates or antibody conjugates, which are themselves detectable or trigger a detectable reaction.
  • the anchor groups can be converted into detectable units before, during or after addition of the sample comprising the targets or, if appropriate, before, during or after the cleavage of the selectively cleavable bond in the probes.
  • the labeling can also take place by interaction of a labeled molecule with the probe molecules.
  • the labeling can be carried out by hybridizing an oligonucleotide labeled as described above with an oligonucleotide probe or an oligonucleotide target. Further marking methods and detection systems suitable within the scope of the present invention are described, for example, in Lott Industries and Zorbas, Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin, 1998, chapters 23.3 and 23.4.
  • detection methods are used which, as a result, provide an adduct with a specific solubility product which results in precipitation.
  • substrates are used for the marking, which can be converted into a poorly soluble, usually colored product.
  • Labeling reaction enzymes are used that catalyze the conversion of a substrate into a poorly soluble product.
  • a number of possible reactions which are suitable for leading to a deposit on array elements, and possibilities for the detection of the deposit are described, for example, in international patent application WO 00/72018 and in international patent application WO 02/02810 , the content of which is hereby expressly referred to.
  • the bound targets are provided with a marking which
  • the use of the method according to the invention permits the simultaneous qualitative and quantitative analysis of a large number of probe / target interactions, individual array elements with a size of ⁇ IOOO ⁇ m, preferably of ⁇ IOO ⁇ m and particularly preferably of ⁇ 50 ⁇ m.
  • enzymes catalyze the conversion of a substrate into a poorly soluble, usually colored product.
  • Arrays consist of the use of metal markings.
  • colloidal gold or defined gold clusters are coupled to the targets, possibly via certain mediator molecules such as streptavidin.
  • the coloration resulting from the gold marking is preferably carried out by subsequent reaction with less noble metals such as e.g. Silver reinforced, the one coupled with the targets
  • Gold marking acts as a seed or catalyst, for example for the reduction of silver ions to a silver deposit.
  • the targets coupled with gold markings are also referred to below as gold conjugates.
  • a relative quantification of the probe / target interaction can also take place.
  • the relative quantification of the concentration of the bound targets on a probe array by detecting a precipitate or a precipitate is carried out via the concentration of the labels coupled to the targets, which indicate the reaction of a soluble substrate to a poorly soluble precipitate on the array element a probe / target interaction has taken place, catalyze or act as a seed for such reactions.
  • the ratio of bound target to gold particle is 1: 1.
  • Embodiments of the present invention can be a multiple or a fraction thereof.
  • the detection in this embodiment of the detection method according to the invention is thus carried out by measuring the transmitted light absorption or reflected light reflection, which is caused by the precipitation, on the array elements on which a probe / target interaction has taken place, by the catalytic effect of the targets bound coupled marker is generated.
  • Targets provided with gold clusters a non-transparent precipitate deposited.
  • gold conjugates the use of silver as a precipitate has proven to be particularly advantageous.
  • the procedure described below is not limited to the silver / gold staining described above, but can accordingly be applied to all detection methods in which the bound targets are provided with a label which shows the reaction of a soluble substrate to form a sparingly soluble precipitate catalyzed on the array element on which a probe / target interaction took place or which acts as a seed for the conversion of a soluble substrate to a sparingly soluble precipitate on the array element on which a probe / target interaction took place ,
  • the target molecule is biotinylated, for example using PCR.
  • the PCR product is hybridized against a substance library (102), for example a DNA library.
  • Streptavidin-functionalized gold beads are then added to the reaction vessel (1) according to the invention, which react with the biotinylated hybrids, for example DNA hybrids.
  • a silver precipitate can be generated on the gold spheres now specifically bound to the surface, for example by reducing silver nitrate with hydroquinone under the catalytic effect of gold (see, inter alia, WO 00/72018, DE 100 33 334.6, MA Hayat, In munogold-Silver Staining, CRC Press, New York, 1995).
  • the absorption of light by the silver precipitate depends on the amount of silver deposited. Consequently, the light intensity I that shines through the precipitate can be calculated according to a function similar to the Lambert-Beer law:
  • I is the light intensity after the absorption
  • I 0 the light intensity before the absorption
  • Intensity I and time t are available as measured variables. These measurands are obtained by illuminating the carrier element with the substance library and recording the transmitted light with a camera (see Figure 19). This recording is repeated at regular intervals while the silver deposition is being carried out. The brightness values of the individual library regions (spots) are evaluated for each shot, whereby the intensity I of each spot is obtained. These brightness values can be calculated automatically using standard software such as IconoClust® (Clondiag, Jena, Germany). By plotting I / I 0 against time t you get that in Figure 20 shown measurement curves. The Lambert-Beer law according to equation (I) can be related to the silver deposition time series thus obtained in the following way.
  • the area F that shadows a silver ball is:
  • the shading per unit area b by the silver precipitate is proportional to the number of silver beads per unit area N, the shading area per silver bead F and a constant k.
  • the function for the intensity I is thus calculated as a function of the time t
  • O is a device-dependent offset value
  • the number of gold beads that are deposited per unit area depends on the one hand on the amount of targets marked with gold beads and on the other hand on the binding strength of the targets, for example the target D A, with the probes, for example the spot D ⁇ A. If there is no target in the sample that interacts with a probe on the corresponding array element, gold balls are not deposited on the surface of this array element or spot. If the bond between the probe and target is weak, very few gold spheres will settle on the surface of this array element.
  • a' represents a measure of the concentration of the target D ⁇ A and the binding strength of the target D ⁇ A at the array element or spot i.
  • Figure 20 shows the silver deposition time series of two spots that are hybridized against a target D ⁇ A.
  • the D ⁇ A probes of the spots differ by one base, so that the target D ⁇ A is perfectly complementary to the probe of one spot, while it has a mismatch to the probe of the other spot.
  • nonlinear Regression using equation (VI) calculate the silver absorption constant a '. In the case of the perfect match, it is
  • Another variant of the evaluation consists in using the gray values of the individual spots directly as measured values after a specified time.
  • this method has the disadvantages that it cannot be assessed in advance which time is optimal for the evaluation and that the measured values have a lower statistical certainty.
  • any lighting inhomogeneity can only be carried out using a flatfield correction.
  • the temporal course of the precipitation formation on the array elements is thus detected in the form of signal intensities in step c).
  • an accurate determination of the relative quantitative amount of bound targets can be ensured.
  • the targets are preferably provided with markings which catalyze the reaction of a soluble substrate to form a sparingly soluble precipitate on the array element on which a probe / target interaction has taken place, or act as a seed for such reactions ,
  • the targets can be provided directly with such markings.
  • the targets are not marked directly and the
  • Labeling takes place via sandwich hybridization or sandwich reactions with the probe interacting with the target and a labeled compound. Examples of such a procedure are: - Sandwich hybridization with a labeled oligonucleotide complementary to the target sequence.
  • Labeled oligonucleotides hybridizing target sequence is understood in the context of the present invention to be a set of labeled oligonucleotides, at least one of which has complementarity both with the target sequence and with another oligonucleotide.
  • the other oligonucleotides are self-complementary or mutually complementary, so that during the hybridization a chain of labeled oligonucleotides is formed which is bound to the target sequence.
  • a further preferred possibility of coupling the targets with a marking range is the synthetic or enzymatic addition of a homopolymeric region, for example a polyA sequence, to the targets to form a continuous sequence, as is described, for example, in US Pat. No. 6,103,474.
  • the labeling is preferably carried out via sandwich hybridization with a labeled oligonucleotide complementary to the homopolymer sequence with the variations described above.
  • signal amplification is carried out by amplifying parts of the homopolymer sequence attached to the targets with simultaneous incorporation of labeled bases, particularly preferably using an RCA mechanism using a circular single-stranded template that is complementary to the homopolymer sequence.
  • the targets are provided with a catalyst, preferably an enzyme, which catalyzes the conversion of a soluble substrate into an insoluble product.
  • the reaction which leads to the formation of a precipitate on the array elements in this case is the conversion of a soluble substrate into an insoluble product in the presence of a catalyst, preferably enzyme, coupled to the targets.
  • the enzyme is preferably selected from the group consisting of horseradish peroxidase, alkaline phosphatase and glucose oxidase.
  • the soluble substrate will preferably selected from the Grappe, consisting of 3,3'-diaminobenzidine, 4-chloro-1-naphthol, 3-amino-9-ethylcarbazole, p-phenylenediamine-HCl / pyrocatechol, 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine , Naphthol pyronine, bromochloroindoyl phosphate, nitrotetraazolium blue and phenazine methosulfate.
  • a colorless soluble hydrogen donor for example 3,3'-diaminobenzidine, in the presence of
  • Hydrogen peroxide converted to an insoluble colored product.
  • the enzyme horseradish peroxidase transfers hydrogen ions from the donors to hydrogen peroxide to form water.
  • reaction leading to the formation of a precipitate on the array elements is particularly preferably the chemical reduction of a silver compound, preferably silver nitrate, silver lactate, silver acetate or silver tartrate, to elemental silver.
  • a silver compound preferably silver nitrate, silver lactate, silver acetate or silver tartrate
  • Formaldehyde and / or hydroquinone are preferably used as reducing agents.
  • the metallic compound is particularly preferably precipitated in the presence of metal clusters or colloidal metal particles coupled to the targets, in particular gold clusters or colloidal gold particles. That in this case, the metal clusters or colloidal metal particles represent the markings coupled to the targets.
  • Formaldehyde or hydroquinone can be reduced. This creates an insoluble precipitate of elemental silver.
  • the metallic compound is precipitated in the presence of polyanions coupled to the targets. If the target itself is not a poly anion, then there is Possibility to use one for nucleation.
  • the target labeled with a poly anion is exposed, for example, to a silver nitrate solution. The silver cations selectively attach to the poly anion. Then silver ions are converted into elemental silver with a reducing agent.
  • the enzymes or catalysts or metal clusters or colloidal metal particles or polyanions can be coupled to the targets directly or via anchor molecules coupled to the targets. Basically, there is no need to directly mark the target with the markings described above. It is also possible to use suitable anchor molecules, e.g. Streptavidin, which are coupled to the target, to achieve a subsequent coupling of the label.
  • suitable anchor molecules e.g. Streptavidin
  • a conjugate consisting of the respective catalyst or crystallization seed and a specific binding partner for the anchor molecule also allows the procedures described above to be carried out.
  • the reaction which leads to the formation of a precipitate on the array elements is then the binding of a specific binding partner to an anchor molecule coupled to the target.
  • binding partner / anchor molecule pairs are preferably selected from the Grappe, consisting of biotin / avidin or streptavidin or anti-biotin antibodies, digoxigeniii / antidigoxigenin immunoglobulin, FITC / anti-FITC immunoglobulin and DNP / anti-DNP-immunoglobulin ,
  • a soluble substrate is catalytically converted into an insoluble and precipitating product. Due to the proximity to the surface, the product is deposited directly on the surface and forms a solid, insensitive to various washes. It is also possible in the context of the present invention that the markings, in particular the enzymes or metal clusters or colloidal metal particles or polyanions, are coupled to the targets before, during or after the interaction with the probes.
  • the interaction between the target and the probe is a hybridization between two nucleotide sequences.
  • the hybridization of the targets with the probes arranged on a probe array takes place according to one of the known standard protocols (see, inter alia, Lott Eat and Zorbas, 1998).
  • the resulting hybrids can be stabilized by covalent binding, for example via psoralen intercalation and subsequent cross-linking, or, as described in US Pat. No. 4,599,303, by noncovalent binding, for example by binding intercalators.
  • a washing step is usually carried out, with which components which are non-specific and thus less bound are removed.
  • the interaction between the target and the probe is a reaction between an antigen structure and the corresponding antibody or a hypervariable portion thereof or a reaction between a receptor and a corresponding ligand.
  • the binding or recognition of the targets by specific probes is usually a spontaneous non-covalent reaction under optimal conditions. This also includes non-covalent chemical bonds.
  • the composition of the medium and other chemical and physical factors influence it Binding speed and strength. In nucleic acid detection, for example, lower stringency and higher temperatures lower the rate and strength of the bond between two not perfectly complementary strands. Optimization of the binding conditions is also necessary for antigen / antibody or ligand / receptor interactions, but the binding conditions are usually less specific.
  • the presence of a precipitate on an array element is detected by reflection, absorption or diffusion of a light beam, preferably a laser beam or
  • the precipitate modifies the reflection of a light beam. Furthermore, the precipitation leads to a strong light diffusion which can be recorded by conventional detection devices. If the precipitation, such as the silver deposit, appears as a dark surface, the absorption of light can also be detected and recorded. The resolution of the detection then depends on the number of pixels in the camera. In a particularly preferred embodiment, the presence of a precipitate is detected on an array element in which the light source scans the array elements homogeneously with a scanning speed, the scanning speed particularly preferably ensuring that an exposure time of the recording camera all signals of the sample united into one picture.
  • the areas amplified by the specific reaction can be detected by means of a very simple optical structure in transmitted light (contrast by shadowing) or incident light (contrast by reflection).
  • the detected intensity of the shadowed area is directly proportional to the coverage with markings such as gold particles and the nucleation state of the particles.
  • markings such as gold particles and the nucleation state of the particles.
  • the electrical measurements can be made using conductivity measurements
  • Microelectrode array arrangements or via an arrangement of microcapacitance sensors or via potential measurements using field-effect transistor arrays FET arrays.
  • FET arrays field-effect transistor arrays
  • Dielectric measurements with micro capacitance sensors measure the change in the capacitance of two electrodes arranged in relation to one another (M. Madou, Fundamentals of Microfabrication, CRC Press, Boca Raton, 1997).
  • potentiometric measurements using FET arrays the change in the potential on the sensor surfaces is measured (M. Madou, Fundamentals of Microfabrication, CRC Press, Boca Raton, 1997).
  • the presence of a precipitate on an array element can be detected by autoradiography, fluorography and / or indirect autoradiography.
  • autoradiography an area covered with a radiating precipitate is brought into direct contact with an X-ray film.
  • fluorography an area covered with a radiating precipitate is covered with fluorescent chemicals such as Sodium salicylate, which covers the radioactive
  • the presence of a precipitate on an array element is detected by scanning electron microscopy, electron probe microanalysis (EPMA), magneto-optical Kerr microscopy, magnetic force microscopy (MFM), atomic force microscopy (AFM), Measurement of the Mirage effect, scanning tunneling microscopy (STM) and / or ultrasound reflection tomography.
  • EPMA electron probe microanalysis
  • MFM magnetic force microscopy
  • AFM atomic force microscopy
  • STM scanning tunneling microscopy
  • STM scanning tunneling microscopy
  • Detection of the reaction by means of SEM and / or EPMA is almost independent of the type of substrate.
  • SEM scanning electron microscopy
  • EPMA electron probe microanalysis
  • the secondary processes that are triggered by a focused electron steel are used for spatially resolved analysis (J. Goldstein et al. Scanning Electron Microscopy and X-Ray Microanalysis, Plenum, New York, 1981).
  • the reaction can be detected by magneto-optical Kerr microscopy or MFM.
  • Magneto-optical Kerr microscopy uses the rotation of the plane of polarization of light through magnetic fields (Kerr and Faraday effect) (A. Hubert, R. Shufer, Magnetic Domains, Springer, 1998).
  • the change in the optical density due to the substrate on the surface due to the reaction can be detected by means of the mirage effect.
  • the mirage effect the local heating of a surface is measured by absorption of a bundled laser beam via the associated change in refractive index. By scanning the surface gives an image of the local surface absorption properties (A. Mandelis, Progress in Photothermal and Photoacoustic Science and Technology, Volume 1, Elsevier, New York 1992).
  • Another thermal, spatially resolved method for detecting the interaction reaction through the substrate is an array arrangement of microthermophiles, which measure the crystallization and deposition enthalpies of the substrate deposits (JM Koehler, M. Zieren, Thermochimica acta, 25, vol 310, 1998).
  • STM and AFM are also suitable for detecting the reaction using a substrate.
  • AFM atomic force microscope
  • a micro or nano tip scans the surfaces, whereby the surface topography is measured (E. Braun, Y. Eichen, U. Sivan, G. Ben-Yoseph, Nature, 775, vol 391, 1998)
  • the magnetic force microscope MFM detects local magnetic susceptibility differences via a nanotip (A.Hubert, R. Shufer, Magnetic Domains, Springer, 1998).
  • scanning tunneling microscop STM the tunnel current is measured via a nanotip to determine the nano-surface topography (O. Marti, M. Amrein, STM and SFM in biology, Academic Press Inc., San Diego, 1993)
  • the tomographies are processes in which a 3-dimensional image is compiled in slices (F. Natterer, Mathematical Methods of Computer Tomography, Westdt. Vlg., Wiesbaden, 1997).
  • ultrasound reflection tomography the measurement of ultrasound reflection is used to generate the tomogram (V. Fleischer, F. Bergner, DGZfP NDT Conference Dresden 1997).
  • Another aspect of the present invention relates to an apparatus for performing the method described above, comprising: a) at least one reaction vessel according to the invention described above; and b) a detection device for detecting the specific interaction.
  • Interaction such as the hnmunogold / silver staining described above, in contrast to the fluorescence measurements usually used, can be carried out by simple absorption or reflection measurements, so that the overall costs for the device according to the invention are very low.
  • the device according to the invention is preferably used in a detection method in which, as described above, the detection takes place via a reaction which leads to precipitation on the array elements on which an interaction between probes and targets has taken place.
  • Reaction vessels which can be inserted into the detection device or the reading device, form interaction products in the form of a precipitate on some array elements due to the specific interaction of the sample or the target with the probes. These interaction products have a different absorption coefficient than the pure substances. This effect can be considerably enhanced by suitable reactions, as described above.
  • the detection device is preferably a camera, in particular a CCD or CMOS camera or similar cameras, which usually records the entire area of the probe array. Alternatively, scanning methods can also be used for the detection device for reading out the reaction vessel. In special configurations of the device according to the invention, the detection device additionally comprises a reading optic.
  • the device according to the invention additionally comprises at least one light source.
  • a light source in the context of the present invention preferably ensures homogeneous illumination of the wearer.
  • the light source is particularly preferably selected from the group consisting of lasers, light-emitting diodes (LED), surface emitters and high-pressure lamps.
  • light sources in the form of lighting arrays can also be used in the device according to the invention.
  • homogeneous illumination of the carrier can be ensured, for example, by the light source comprising a plurality of diffusely radiating light sources, the superimposition of which in a homogeneous manner
  • Illumination results For example, diffusely scattering LED arranged matrixfb 'RMIG, at short distances to the sample a homogeneous illumination allow.
  • the homogeneity of the lighting can also be ensured by an appropriate
  • the lid of the reaction vessel according to the invention takes on the function of a diffuser.
  • the light source is in one
  • Swivel arm installed, which can be swiveled to the side for introducing the reaction vessel into the device. It can then be swiveled over the reaction vessel to illuminate the affinity matrix. In this way, the reaction vessel can be pressed into a reaction vessel holder so that the substance library lies in the correct imaging plane. A refocusing the imaging optics or readout optics is therefore superfluous.
  • the reading device or the detection device can be equipped with a focusing device in order to be able to accommodate different types of reaction vessels.
  • an adjustment recess is located in the device according to the invention, into which the lid of the reaction vessel can be pressed. This avoids twisting the affinity matrix.
  • Apparatus for optically detecting precipitation formation consist of a low-power (500 mcd) light source, e.g. an LED, for homogeneous lighting and a detector, e.g. a CCD camera. Due to the reinforcing effect via the catalytic deposition of the substrate, especially when using a gold / silver system, the changes in the optical properties of the surface are so pronounced that a simple flat bed scanner, a slide scanner or a comparable device is sufficient to detect the precipitation.
  • a low-power (500 mcd) light source e.g. an LED
  • a detector e.g. a CCD camera
  • Typical detection times are significantly less than one second, while comparable sensitive CCD systems for the detection of fluorescence require around 10-18 seconds, so that inexpensive consumer cameras can be used whose signal transmission corresponds to the video standard.
  • the device additionally comprises optical filters.
  • optical filters make it possible, on the one hand, to spectrally limit the homogeneous illumination and, on the other hand, to illuminate the samples with different wavelengths.
  • the device according to the invention additionally comprises filter changers. With these filter changers, the optical filters can be changed quickly and thus possible misinformation, which occurs, for example, due to contamination, can be clearly identified and eliminated.
  • the device additionally comprises a semitransparent mirror between the light source and carrier element.
  • the light from the light source reaches the sample through a semitransparent mirror and the image is reflected in a reflection through the semitransparent mirror and possibly the readout optics on a camera.
  • a surface mirror on the underside of the carrier element.
  • the disadvantage of poor reflection of the sample is supplemented by transmission effects in that the illuminating light is reflected via a mirror layer behind the sample, either as an independent mirror or as a layer applied to the back of the sample carrier.
  • an area radiator can be arranged on the opposite side of the carrier element and thus also to the sensor, for example of a CCD camera. A very compact arrangement is made possible in this way.
  • the sample is located in a cuvette which has direct contact with the sensor of a CCD camera by means of a reading optic.
  • the readout optics or the coupling medium between the cuvette and the camera is preferably a Fase ⁇ latte, available for example from Fimia Schott, or an image guide cable.
  • the reaction vessel according to the invention is a cuvette made of two plane-parallel plates with a sample volume in between. The chip with the surface-bound substance library is inserted in this cuvette and can be read out like a cuvette in a spectrometer.
  • the device according to the invention preferably additionally has a temperature control unit which ensures that the sample is stored in a temperature-stable manner during the measurement. This ensures the reproducibility of the results.
  • a plurality of reaction vessels are arranged in the device in such a way that successive detection is ensured.
  • a chronologically staggered, successive reading can be achieved by arranging the samples in the form of magazines or a carousel in the device according to the invention.
  • the device according to the invention additionally comprises a computer which is programmed to:
  • an image is understood to mean a grape of pixels which represents an illustration of the measured signal intensities for a probe array and which can be transmitted directly, for example, to a screen or a printer for recording.
  • time-resolved detection during the amplification process can result in the deposition of a precipitate, such as elemental silver, on gold particles acting as crystallization nuclei, and the calculation of the relative occupancy densities from the time behavior according to the inventive method Extremely increase the resolution of the measurement data even when using an 8 bit detection technique.
  • the structure of a device necessary for this differs in the mechanical accommodation of a reaction chamber and a modified acquisition software.
  • the software for example the Iconoclust® software (Clondiag), is characterized by the fact that it allows the processing of the successively recorded recordings. For this purpose, the gray values determined over the individual probe array elements are determined at every point in time.
  • the virtual signal intensity is calculated as a function of the formation of precipitation over time. Based on this value, for example, the gray values of the last measurement are related to the product of the rate and the measurement duration, thus spreading the measurement range. This ensures excellent resolution of weak and strong probe / target interactions, as well as precise quantification of the bound targets, even when using inexpensive 8-bit cameras.
  • the miniaturization potential of such a structure is very high, so that the entire system can be designed as an autonomous handheld device for field use.
  • the device according to the invention can also be implemented as a highly integrated autonomous unit. This makes highly sensitive applications of micro-arrays such as medical diagnostics, forensics, bacterial screening and the like Can be carried out quickly by laypeople regardless of medical or biological laboratories.
  • the reaction vessel according to the invention thus comprises a standard laboratory reaction vessel or standard microtube with one on one of the base areas, e.g. B. at the top or in the lid of a conventional reaction vessel such as e.g. a commercially available Eppendorff tube, inserted carrier or chip or array.
  • a conventional reaction vessel such as e.g. a commercially available Eppendorff tube, inserted carrier or chip or array.
  • This design allows a much easier handling and a higher
  • Solutions can be easily pipetted into the reaction vessel according to the invention and using almost any incubated and processed especially in molecular biological laboratories existing Microtube equipment, z. B. centrifuged.
  • Figures 5 to 12 illustrate various optical principles that can be used to read surface-bound substance libraries (102).
  • a specific interaction of the sample or target with probes of some library elements of the substance library (102) takes place in the reaction vessel which is inserted into the detection or reading device, as a result of which interaction products form on some surfaces.
  • FIGS. 5 to 17 show two specific embodiments for depicting a precipitate on surface-bound substance libraries (100). Instead of the readers (1000) shown here, scanning methods for reading out the reaction vessel (1) can also be used. Furthermore, the description of FIGS. 5 to 17 is based on the use of DNA chips (100) in connection with the above-described silver deposition reaction, but is of course not restricted to this.
  • Figure 5 shows the basic arrangement of the device according to the invention for reading out the reaction vessel (1).
  • Light from an incoherent light source (1001) illuminates the surface-bound DNA library on a library chip (100), which is located in a tube (1), by means of illumination optics (1002).
  • the signal is recorded by a CCD camera (1005) by means of reading optics (1004).
  • Figure 6 shows the same arrangement as that of Figure 5, with the variant of narrowing the spectral range of the illumination by introducing optical filters (1006) into the illumination beam path.
  • Light from an incoherent light source (1001) illuminates the surface-bound DNA library on a library chip (100) which is located in a reaction vessel (1) by means of illumination optics (1002).
  • the signal is recorded by a CCD camera (1005) by means of reading optics (1004).
  • the ability to quickly change this filter using a filter changer (1007) has the advantage for the evaluation of possible misinformation, e.g. caused by contamination, clearly recognizable and eliminated.
  • the point light source (1001) is replaced by an illumination array (1008).
  • Light from an illumination array (1008) illuminates the surface-bound DNA library (102) on a library chip (100), which is located in a reaction vessel (1), by means of illumination optics (1002).
  • the signal is recorded by a CCD camera (1005) by means of reading optics (1004).
  • a compact reading device (1000) is shown in the arrangement of the device according to the invention according to FIG. 8, in which the CCD sensor (1005) of the camera is contacted directly with the affinity matrix (100).
  • This contact can also be made by using a Fase ⁇ latte (1012) or, if the distance is even greater, by an image guide cable if direct contact is not possible.
  • Light from an incoherent light source (1001) illuminates the surface-bound DNA library on a library chip (100) which is located in a reaction vessel (1) by means of illumination optics (1002).
  • the signal of the sample is recorded directly by a CCD camera (1005).
  • the samples are measured in incident light in the reader (1000) shown in Figure 9.
  • the reflectivity of the DNA library (102) is measured in this device.
  • Light from an incoherent light source (1001) illuminates the surface-bound DNA library on a library chip (100), which is located in a reaction vessel (1), by means of an illumination optics (1002) through a semi-transparent mirror.
  • the reflected signal is deflected by the semitransparent mirror (1009) onto the reading optics (1004) and is imaged by the latter onto a CCD camera (1005).
  • the arrangement shown in Figure 10 is advantageous for reflected light measurements.
  • Light from an incoherent light source (1001) illuminates the surface-bound DNA library (102) on a library chip (100), which is located in a reaction vessel (1), by means of an illumination optics (1002) through a semi-transparent mirror.
  • the reflected signal is deflected by the semitransparent mirror (1009) onto the reading optics (1004) and is imaged by the latter onto a CCD camera (1005).
  • the disadvantage of the poor reflection of the sample is supplemented by transmission effects by placing the illuminating light over a mirror layer (1010) behind the sample, either as an independent mirror or as a layer applied to the back of the sample carrier.
  • Figure 11 shows the possible arrangement of the device according to the invention in a transparent sample space, preferably in a cuvette (1011), which allows a good coupling of the receiver to the sample space by means of a fiber plate (1012) due to the optically flat outer surfaces.
  • Light from an incoherent light source (1001) illuminates the surface-bound DNA library (102) on a library chip (100) by means of illumination optics (1002) through the transparent wall of the cuvette.
  • the signal of the sample is recorded directly by a CCD camera (1005) through the transparent wall of the cuvette.
  • a fiber plate (1012) or an image guide cable can be used as the coupling medium between the cuvette and the CCD camera.
  • the device shown in Figure 12 represents a very compact arrangement of the reader (1000) shown in Figure 11.
  • diffuse surface emitters (1013) e.g.
  • Very compact sensors can be implemented using electroluminescence or cold cathode fluorescence methods.
  • Light from an incoherent light source (1001), in this case a diffuse surface lamp (1013) illuminates the library chip (100) directly through the transparent wall of the cuvette.
  • the signal of the sample is recorded directly by a CCD camera (1005).
  • Figures 13 and 14 show an embodiment in top view and as a sectional drawing of a reader (1000).
  • the principle of operation corresponds to that of the device shown in Figure 1.
  • a deflection mirror was installed between the affinity matrix (100) and the imaging optics (1004) in order to achieve compact device dimensions.
  • the light from the light source (1008) shines into the reaction vessel (1) and then through the DNA chip (100) onto a deflecting mirror. From there, the mapping of the DNA chip (100) over the Imaging optics (1004) projected onto a CCD camera (1005).
  • the light source (1008) consists of light-emitting diodes which are built into a swivel arm which can be swiveled to the side to insert the reaction vessel (1) into the reader (1000).
  • the reaction vessel (1) is pivoted over the reaction vessel (1) to illuminate the affinity matrix (100). He presses the reaction vessel (1) into the reaction vessel holder (1100) so that the DNA library (102) lies in the correct imaging plane. Refocusing the imaging optics (1004) is therefore unnecessary. On the top there is an adjustment recess (1102) into which the lid of the reaction vessel (1) is pressed. This avoids twisting the affinity matrix (102).
  • a Peltier element (1200) on the reaction vessel holder (1100). This allows the temperature in the reaction vessel (1) to be regulated.
  • the reaction vessel holder (1100) can also be equipped with a resistance heater in order to be able to set higher temperatures. Alternatively, the reaction vessel holder (1100) can also be tempered with circulating cooling media.
  • Figure 15 shows a reader (1000) that differs from that in Figure 13 in that the swivel arm (1101) is replaced by a slide (1300).
  • the slide (1300) is pushed over the reaction vessel (1) via a linear bearing (1310).
  • a slide (1320) presses the reaction vessel (1) into the reaction vessel holder (1100) by means of four compression springs (1321).
  • An adjustment gap (1322) engages around the lid (3) of the reaction vessel (1) in such a way that the reaction vessel (1) is rotated into its correct position and fixed by the sliding movement of the slide (1300).
  • Figure 17 shows the position of the slide (1300) in relation to the reaction vessel (1) when the reader is open.
  • the carriage (1300) moves along the arrow shown there and thereby closes the reaction vessel (1).
  • the light source (1008) is pushed over the reaction vessel (1) so that measurements can be made with the reader (1000).
  • the slide (1300) is closed, the slide (1320) lies between Light source and reaction vessel (1).
  • the carriage therefore has a detection opening (1323) in order to be able to illuminate the affinity matrix (100).
  • a standard reaction tube made of polypropylene with a 1.5 ml volume of Nemiaufiahm by Eppendorf was used for the remelting.
  • the reaction tube was cut off at the bottom and some material was turned off from the sides. It was then placed on a pin and pressed under force onto a hot mold, which stamped the opening or recess (8), the chip support (6) and the adhesive edge (7) into the tube (see Figure 1).
  • Example 2 Detection and specificity of the hybridization of nucleic acids in the reaction vessel (1) by means of silver detection
  • the human cyp2D6 gene encodes a human cytochrome P450. This enzyme plays an important role in the metabolism of various drugs and active ingredients. Mutations in the cyp2D6 gene can lead to hypersensitivity or intolerance to certain drugs. At least 14 such mutations (point mutations and deletions) have been described for cyp2D6. For a selection of these mutations (G1749C, dT1795, G1934A, G2064A) it should be tested whether the respective wild type or the mutation is present in a sample to be analyzed. b) Preparation of the DNA library (102) and assembly with the reaction vessel (1)
  • oligonucleotides with a length of 21-25 nucleotides were placed at defined locations on an epoxidized glass surface (slide size: 75 mm x 25 mm) (101) using a MicroGrid II array (BioRobotics, Cambridge, Great Britain) and covalently immobilized (library or array elements). The probes were divided into pairs of library elements, the first representing the wild type and the second the mutation.
  • sequences of the oligonucleotides were as follows (sequence in 5 '- 3' direction with 5'-NH 2 modification):
  • G1934A-WT-2 CTCCCACCCCCAGGACGCCCC
  • G1934A-2 CTCCCACCCCCAAGACGCCCC
  • G1934A-WT-4 ATCTCCCACCCCCAGGACGCC
  • G1934A-4 ATCTCCCACCCCCAAGACGCC
  • G2064A-WT-2 CCTAGCTCAGGAGGGACTGAAGGAG
  • G2064A-WT-4 GACCTAGCTCAGGAGGGACTGAAGG
  • G2064A-4 GACCTAGCTCAGGAGGAACTGAAGG
  • Each of the 40 oligonucleotide probes was placed in triplicate on the DNA library (102) (for the arrangement of the library elements, see Figure 18).
  • the library elements were spaced 0.2 mm apart, the entire DNA library (102) covered an area of 2.4 mm ⁇ 2.4 mm. In total, over 100 identical DNA libraries (102) could be generated per slide.
  • the library elements were placed on the slides from a 10 ⁇ M solution of the oligonucleotides in 0.1 M phosphate buffer / 2.2% sodium sulfate. The library elements were then covalently linked to the epoxy grapples on the glass surface by baking at 60 ° C. for 30 minutes. A multi-part washing process followed in the following order:
  • DNA chip (100) Exactly one DNA library (102) of the size 2.4 mm ⁇ 2.4 mm was located on each of the chips (100). The chips (100) were then inserted into the reaction vessel (1) in the manner shown in FIG. 1 and glued with polydimethsiloxane, which was placed in the adhesive rim (7).
  • the sample to be analyzed (hereinafter called the target) was a biotin-labeled PCR of a patient's DNA (KDL24, directed against the exon 3/4 of cyp2D6, by sequencing as wild-type for the concerned Mutations genotyped).
  • the PCR approach used was as follows:
  • Primer 1 cyp2D6_ 3/4-f, sequence 5 '-CACGCGCACGTGCCCGTCCCA-3', final concentration 200 nM
  • the PCR was then carried out according to the following program: 1 denaturation (10 min, 95 ° C.)
  • the chip (100) in the reaction vessel (1) was in each case 10 min in 2x SSC / 0.2% SDS (500 ⁇ l at 30 ° C.), 2x SSC (500 ⁇ l at 20 ° C.) and 0.2x SSC (500 ⁇ l at 20 ° C) washed with shaking.
  • the built-in chip (100) in the reaction vessel (1) was overlaid with a silver development solution (British Biocell International, SEKL15, Cambridge, Great Britain) and the reaction vessel (1) was inserted into the silver reader (1000).
  • the reader (1000) consists of a sample holder with temperature control, the readout section and a swivel arm (1101) with the lighting (see Figures 13 and 14).
  • the samples were illuminated in transmission by means of a diffusely illuminated array of several LEDs (1008).
  • An additional diffuser enabled homogeneous illumination of the samples with deviations of less than 10% from the maximum.
  • the sample was read out in transmission.
  • the samples were inserted into the intended receptacle.
  • the correct position of the samples was ensured through a special shape of the holder (1102).
  • the reaction vessel (1) was placed in this with the closure open. In this position, the lid of the reaction vessel (1) does not permit any twisting of the affinity matrix (100).
  • the lighting can only be swiveled into the measuring position if it is in the correct position. The fixes in the measuring position
  • reaction vessel (1) and thus the affinity matrix are swiveled at the same time.
  • a distortion-free reading optic (1004) is used for reading out.
  • the CCD camera (1005) used is either in CCIR format or even higher.
  • the samples were kept temperature stable by resistance heating and a Peltier element (1200).
  • the silver developing solution was prepared by mixing equal parts of initiator and enhancer solutions. During the 20-minute incubation at 25 ° C ( ⁇ 0.1 ° C), the time course of the silver reinforcement was documented by a series of photos (a picture every 10 s) (see Figure 19)
  • Figure 20 shows the time series for the element G1934A + 4 (mutation) and G2064A-WT (wild type).
  • the affinity matrix (100) is glued in that the adhesive is placed in a designated adhesive edge (7).
  • reaction vessel (2) In the bottom of a reaction vessel (2) is an opening (10) with a
  • the affinity matrix (100) is glued in that the adhesive is placed in a designated adhesive edge (9).
  • the bottom of a reaction vessel (2) is provided with a clamp connection (201).
  • a chip carrier (200) can be pressed onto this clamp connection (201) in a liquid-tight manner.
  • the chip carrier has an opening (10) into which the affinity matrix (100) can be placed and then glued onto a support surface provided for this purpose.
  • FIG 4 In the embodiment shown in Figure 4, the affinity matrix (100) is clamped liquid-tight between the reaction vessel (2) and a clamping sleeve (300), so that gluing is not absolutely necessary.
  • Figure 5 In the embodiment shown in Figure 4, the affinity matrix (100) is clamped liquid-tight between the reaction vessel (2) and a clamping sleeve (300), so that gluing is not absolutely necessary.
  • Figure 5 shows a basic arrangement for reading an array in the reaction vessel according to the invention.
  • Light from an incoherent light source (1001) illuminates the surface-bound DNA library on a library chip (100), which is located in a tube, homogeneously by means of illumination optics (1002).
  • the signal is recorded by a CCD camera (1005) by means of reading optics (1004).
  • Figure 6 shows the same arrangement as Figure 5, with the variant that by inserting optical filters (1006) into the illumination beam path to narrow the spectral range of the illumination.
  • optical filters 1006
  • the ability to quickly change this filter using a filter changer 1007) has the advantage for the evaluation of possible misinformation, e.g. caused by contamination, clearly recognizable and eliminated.
  • classic lighting is replaced by a lighting array (1008).
  • a lighting array 1008
  • diffusely scattering LEDs arranged in a matrix, enable homogeneous illumination at short distances from the sample.
  • Figure 8 shows a compact form of the arrangement from Figure 1, in which the CCD sensor (1005) of the camera is contacted directly with the affinity matrix (100). This contact can also be made by using a Fase ⁇ latte (1012) or, if the distance is even greater, by an image guide cable if direct contact is not possible.
  • Figure 9 :
  • Figure 9 shows an arrangement for reading out the samples in reflected light.
  • a semi-transparent mirror (1009) is used.
  • the syllable samples do not have very good reflection properties, an arrangement as shown in this figure is advantageous.
  • the disadvantage of poor reflection is supplemented here by transmission effects, in that the illuminating light is reflected via a mirror layer (1010), either as an independent mirror or as a layer applied to the back of the sample carrier.
  • Figure 11 shows an arrangement in a transparent sample space, preferably in a cuvette (1011), which enables a good coupling of the receiver to the sample space by means of a fiber plate (1012) due to the optically flat outer surfaces.
  • diffuse surface emitters (1013) e.g. Based on electroluminescence or cold cathode fluorescence methods, very compact sensors can be implemented, as shown in Figure 8.
  • Figure 12 shows a very compact arrangement of the reader (1000) shown in Figure 11.
  • the light source (1008) consists of light emitting diodes which are built into a swivel arm (1101), the can be pivoted to the side to insert the reaction vessel (1) into the reader. It is then pivoted over the reaction vessel (1) to illuminate the affinity matrix (100).
  • Figure 14 corresponds to Figure 13, only as a supervision (from the operator side). On the top there is an adjustment recess (1102) into which the lid of the reaction vessel (1) is pressed. This avoids twisting the affinity matrix.
  • a reading device (1000) is shown which differs from that in Figure 13 in that the swivel arm (1101) is replaced by a slide (1300).
  • the slide (1300) is pushed over the reaction vessel (1) via a linear bearing (1310).
  • a slide (1320) presses the reaction vessel (1) into the reaction vessel holder (1100).
  • the slide (1320) of the slide (1300) is shown in the top view.
  • the slide (1320) is pressed onto the reaction vessel (1) by four drain springs (1321).
  • An adjustment gap (1322) engages around the lid (3) of the reaction vessel (1) in such a way that the reaction vessel (1) is rotated into its correct position and fixed.
  • the slide (1300) moves along the arrow and thereby closes the reader.
  • the slide consists of the dracked springs (1321), which push the slide (1320) down, which has a detection opening (1323) through which the light from the light source (1001) can radiate.
  • reaction vessel with a breakthrough (recess) which is shaped as an enclosure for receiving affinity matrices.
  • 1008 lighting array preferably an array of LEDs
  • reaction vessel holder 1101 swivel arm

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Reaktionsgefäss, eine Vorrichtung sowie ein Verfahren zum Nachweis von spezifischen Wechselwirkungen zwischen molekularen Target-und Sondenmolekülen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Reaktionsgefäss, welches eine für ein Laborreaktionsgefäss typische Form und Grösse aufweist und bei dem auf einer seiner Grundflächen ein Träger-Element mit darauf auf vorbestimmten Bereichen immobilisierten Sonden-Molekülen angeordnet ist.

Description

Reaktionsgefäß zur Durchf hrung von Array-Nerfahren
Die Erfindung betrifft ein Reaktionsgefäß, eine Vorrichtung sowie ein Verfahren zum Nachweis von spezifischen Wechselwirkungen zwischen molekularen Target- und Sondenmolekülen.
Biomedizinische Tests basieren häufig auf dem Nachweis einer Wechselwirkung zwischen einem Molekül, das in bekannter Menge und Position vorhanden ist (der molekularen Sonde) und einem nachzuweisenden, unbekannten Molekül bzw. nachzuweisenden, unbekannten Molekülen (den molekularen Ziel- oder Targetmolekülen). Bei modernen Tests sind die Sonden in Form einer Substanzbibliothek auf Trägern, den so genannten Mikro-Arrays oder Chips abgelegt, so dass eine Probe parallel an mehreren Sonden gleichzeitig analysiert werden kann (D. J. Lockhart, E. A. Winzeler, Genomics, gene expression and DNA arrays; Nature 2000, 405, 827-836). Für die Herstellung der Mikro-Arrays werden die Sonden dabei üblicherweise in vorgegebener Art und Weise auf einer geeigneten, beispielsweise in WO 00/12575 beschriebenen Matrix immobilisiert (siehe z.B. US 5,412,087, WO 98/36827) bzw. synthetisch erzeugt (siehe z.B. US 5,143,854).
Der Nachweis einer Wechselwirkung zwischen der Sonde und dem Targetmolekül erfolgt üblicherweise folgendermaßen: Nach der Fixierung der Sonde bzw. der Sonden in vorgegebener Art und Weise an einer bestimmten Matrix in Form eines Mikro-Arrays werden die Targets in einer Lösung mit den Sonden in Kontakt gebracht und unter definierten Bedingungen inkubiert, infolge der Inkubation findet zwischen Sonde und Target eine spezifische Wechselwirkung statt. Die dabei auftretende Bindung ist deutlich stabiler als die Bindung von Targetmolekülen an Sonden, die für das Targetmolekül nicht spezifisch sind. Zum Entfernen von Targetmolekülen, die nicht spezifisch gebunden worden sind, wird das System mit entsprechenden Lösungen gewaschen oder erwärmt.
Der Nachweis der spezifischen Wechselwirkung zwischen einem Target und seiner Sonde kann dann durch eine Vielzahl von Verfahren erfolgen, die in der Regel von der Art des Markers abhängen, der vor, während oder nach der Wechselwirkung des Targetmoleküls mit dem Mikro-Array in Targetmoleküle eingebracht worden ist. Typischerweise handelt es sich bei solchen Markern um fluoreszierende Gruppen, so dass spezifische Target-Sonden- Wechselwirkungen mit hoher Ortsauflösung und im Vergleich zu anderen herkömmlichen Nachweismethoden, vor allem massensensitiven Methoden, mit geringem Aufwand fluoreszenzoptisch ausgelesen werden können (A. Marshall, J. Hodgson, DNA chips: An array of possibilities, Nature Biotechnology 1998, 16, 27-31; G. Ramsay, DNA Chips: State of the art, Nature Biotechnology 1998, 16„ 40-44).
Abhängig von der auf dem Mikro-Array immobilisierten Substanzbibliothek und der chemischen Natur der Targetmoleküle können anhand dieses Testprinzips Wechselwirkungen zwischen Nukleinsäuren und Nukleinsäuren, zwischen Proteinen und Proteinen sowie zwischen Nukleinsäuren und Proteinen untersucht werden (zur Übersicht siehe F. Lottspeich, H. Zorbas, 1998, Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg Berlin).
Als Substanzbibliotheken, die auf Mikro-Arrays oder Chips immobilisiert werden können, kommen dabei Antikörper-Bibliotheken, Rezeptor-Bibliotheken, Peptid- Bibliotheken und Nukleinsäure-Bibliotheken in Frage.
Die Nukleinsäure-Bibliotheken nehmen die mit Abstand wichtigste Rolle ein. Es handelt sich dabei um Mikro-Arrays, auf denen Desoxyribonukleinsäure- (DNA) Moleküle oder Ribonukleinsäure- (RNA) Moleküle immobilisiert sind.
Voraussetzung für die Bindung eines beispielsweise mit einer Fluoreszenzgruppe markierten Targetmoleküls in Form eines DNA- oder RNA-Moleküls an eine Nukleinsäuresonde des Mikro-Arrays ist, dass sowohl Targetmolekül als auch Sondenmolekül in Form einer einzelsträngigen Nukleinsäure vorliegen. Nur zwischen solchen Molekülen kann eine effiziente und spezifische Hybridisierung stattfinden. Einzelsträngige Nukleinsäureziel- und Nukleinsäuresondenmoleküle erhält man in der Regel durch Hitzedenaturierung und optimale Wahl von Parametern wie Temperatur, Ionenstärke und Konzentration helixdestabilisierender Moleküle. Somit wird gewährleistet, dass nur Sonden mit nahezu perfekt komplementären, d.h. einander entsprechenden Sequenzen mit der Zielsequenz gepaart bleiben (A.A. Leitch, T. Schwarzacher, D. Jackson, I. J. Leitch, 1994, hl vitro Hybridisierung, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg Berlin Oxford).
Ein typisches Beispiel für die Verwendung von Mikro-Arrays in biologischen Testverfahren ist der Nachweis von Mikroorganismen in Proben in der biomedizinischen Diagnostik. Dabei macht man sich die Tatsache zunutze, dass die Gene für ribosomale R A (rRNA) ubiquitär verbreitet sind und über Sequenzabschnitte verfügen, die für die jeweilige Spezies charakteristisch sind. Diese Spezies-charakteristischen Sequenzen werden in Form von einzelsträngigen DNA-Oligonukleotiden auf ein Mikro-Array aufgebracht. Die zu untersuchenden Target-DNA-Moleküle werden zunächst aus der zu untersuchenden Probe isoliert und mit Markern, beispielsweise fluoreszierenden Markern versehen. Anschließend werden die markierten Target-DNA-Moleküle in einer Lösung mit den auf dem Mikro-Array aufgebrachten Sonden inkubiert, unspezifisch auftretende Wechselwirkungen werden durch entsprechende Waschschritte entfernt und spezifische Wechselwirkungen durch fluoreszenzoptische Auswertung nachgewiesen. Auf diese Art und Weise ist es möglich, mit einem einzigen Test in einer Probe gleichzeitig z. B. mehrere Mikroorganismen nachzuweisen. Die Anzahl der nachweisbaren Mikroorganismen hängt bei diesem Testverfahren theoretisch nur von der Anzahl der spezifischen Sonden ab, die auf dem Mikro-Array aufgebracht worden sind.
Zur praktischen Durchführung dieser Tests werden die Mikro-Arrays oder Chips in geschlossenen Kammern fixiert, die über Ein- und Auslässe zum Wechsel der für die Waschschritte und Hybridisierungsschritte notwendigen Flüssigkeiten verfügen. Solche Systeme sind z.B. in US 6,287,850 und WO 01/02094 beschrieben. In DE 199 40 750 ist ein Träger für Analytbestimmungsverfahren beschrieben, der sich nach leichten konstruktiven Änderungen zur Verwendung für Array- Anwendungen auch im Rahmen dieser Erfindung eignet.
Zur Sequenzanalyse von DNA werden üblicherweise oberflächengebundene DNA- Bibliotheken verwendet, die auf Objektträgern aufgebracht sind. Zur Durchfuhrung der Hybridisierungsreaktion auf diesen Objektträgern werden bislang spezielle Hybridisierungskammern oder Inkubationskammern verwendet. Um die Temperierung und das Vermischen der Hybridisierungslösung in diesen bislang bekannten Kammern zu gewährleisten, ist eine für die verwendete Vorrichtung speziell angepasste und deshalb aufwändige und teure Ausstattung erforderlich.
hi DE 101 49 684.2 ist eine Durchflusszelle beschrieben, die zur Durchfuhrung einer PCR sowie von Hybridisierungsreaktionen auf DNA-Chips geeignet ist. Die dort beschriebene Durchflusszelle ist ein komplexes Bauteil, welches mit einer Reihe von technischen Merkmalen versehen ist, die eine Benutzung einer üblicherweise in Laboratorien verwendeten Ausstattung wie beispielsweise einem Theπnomixer (Eppendorf, Deutschland, Hamburg) oder einer Laborzentrifuge (Heraeus, Hanau, Deutschland) ausschließen.
In WO 01/02094 ist eine Kartusche beschrieben, die einen DNA-Chip umfasst. In dieser Kartusche kann sowohl eine PCR als auch eine Hybridisierungsreaktion auf einem DNA-Chip durchgeführt werden. In WO 95/33846 ist ein Körper mit einer Vertiefung beschrieben, in die ein Substrat mit Nukleinsäuremolekülen bekannter Sequenz auf definierten Bereichen eingebaut wird. Der Körper weist einen abgeschlossenen Hohlraum auf, in den die Probenflüssigkeit injiziert werden kann. Die Einfüllkanäle werden über Septen abgedichtet und mit geeigneten Einstechkanülen geöffnet, um den Körper bzw. die Kartusche zu befallen. Die Nerwendung der vorstehend beschriebenen Kartuschen erfordert ebenfalls speziell dafür vorgesehene Vorrichtungen.
In US 5,856,174 ist eine miniaturisierte integrierte Νukleinsäurediagnostik- Vorrichtung beschrieben. Diese Vorrichtung ermöglicht das Sammeln einer oder mehrerer Proben, deren Präparierung und die anschließende Durchführung mehrerer Probenanalysen. Eine derartige Vorrichtung dient zur automatischen Durchführung einer DNA-Chip basierten Analyse durch Vereinigung und Miniaturisierung aller anfallenden Schritte auf einer Kartusche. Die Bereitstellung einer derartigen Vorrichtung ist äußerst aufwändig und teuer.
In US 5,545,531 ist ein Verfahren zur Herstellung von Mikrotiterplatten beschrieben, deren Boden ein Wafer ist, der an jeder Stelle, an der sich eine Vertiefung in der Mikrotiterplatte befindet, eine Probenmatrize aufweist. In US 5,874,219 ist ein Verfahren für die konkurrierende Durchführung von biologischen Tests beschrieben, bei dem eine Vielzahl von Reaktionsgefäßen zusammenhängend nebeneinander angeordnet sind und jedes Gefäß mit einer molekularen Probenmatrize versehen ist. Diese biologische Chip-Reaktionsgefäßplatte ist so ausgestaltet, dass die Wechselwirkungen an der molekularen Probenmatrize mit entsprechenden Lesegeräten ausgelesen werden können. Auf diese Weise können eine Reihe von biologischen Proben nebeneinander und parallel mit molekularen Probenmatrizen untersucht werden. Für die Durchführung von einzelnen Tests ist die dort beschriebene Reaktionsgefäßplatte nicht geeignet. Die Herstellung einer derartigen Reaktionsgefäßplatte ist in US 5,545,531 beschrieben.
Anhand des vorstehend beschriebenen Standes der Technik wird deutlich, dass ein großer Bedarf an Vorrichtungen besteht, die zum einen auf einfache und kostengünstige Weise bereitgestellt werden können und zum anderen eine einfache Durchfuhrung von auf Mikro-Arrays basierenden Nachweistests ermöglichen. Insbesondere besteht ein Bedarf an Vorrichtungen zur Durchführung von auf Mikro- Arrays basierenden Tests, die die Verwendung von typischen im Laboralltag verwendeten Geräten und Instrumenten erlaubt. Allgemein besteht ein Bedarf an Geräten zur Durchführung von auf Mikro-Arrays basierenden Tests, die sich durch eine einfache Konstruktion, eine leichte Handhabbarkeit, das Vermeiden von Kontaminationsquellen, eine reproduzierbare Durchführbarkeit der Tests und niedrige Herstellungskosten auszeichnen.
Analysen basierend auf Sonden- Arrays werden somit zum derzeitigen Zeitpunkt in der Regel fluoreszenzoptisch ausgelesen (siehe A. Marshall und J. Hodgson, DNA Chips: An array of possibilities, Nature Biotechnology, 16, 1998, 27-31; G. Ramsay, DNA Chips: State of the Art, Nature Biotechnology, 16, Jan. 1998, 40-44). Nachteilig an den herkömmlichen Detektionsverfahren ist jedoch der teilweise erhebliche technische Aufwand sowie die hohen Kosten, die mit den Nachweisverfahren verbunden sind.
In letzter Zeit wurden eine Reihe von Array- Verfahren entwickelt, die mit relativ geringem technischen Aufwand einen qualitativ und/oder quantitativen Nachweis der
Wechselwirkung zwischen Sonden und Targets erlauben.
In DE 100 33 334.6 und WO 02/02810 sind Verfahren zum quantitativen und qualitativen Nachweis von molekularen Wechselwirkungen auf Sonden- Arrays durch zeitlich aufgelöste Fällungsreaktionen sowie die zugehörigen Geräte und Einwegartikel beschrieben.
In WO 99/35499 wird eine Vorrichtung besclirieben, bei der Substanzbibliotheken adressierbar auf einer Scheibe angebracht sind, die einer modernen Compact Disk (CD) ähnlich ist. Durch Rotation der Scheibe kann eine bestimmte Substanz auf der Scheibe angefahren werden. Der Lesekopf des Lesegerätes ist dann entlang des Radius der Scheibe bewegbar. Die Position der Scheibe kann durch integrierte mit einem Standard CD-Player auslesbare Spuren bestimmt werden. Die Wechselwirkung der Probe mit einer Targetsubstanz kann durch Absorptionsmessungen und Fluoreszenzmessungen im Durch- oder Auflicht erfolgen. Ebenso können magnetische Partikel abgelegt werden, die mit einem magnetischem Lesekopf detektiert werden können. Zur Visualisierung der Wechselwirkungsreaktion wird insbesondere eine Anfärbung durch ein
Silberpräzipitat vorgeschlagen, dessen Abscheidung über ein Streptavidin/Biotin- Goldkonjungat vermittelt wird.
In WO 00/72018 wird ein Verfahren zur Silberabscheidung auf Objektträgern zur Visualisierung von Wechselwirkungsreaktionen von Substanzbibliotheken offenbart. Des Weiteren werden dazu notwendige Lesegeräte beschrieben.
Der vorliegende Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung zur Durchführung von Array- Verfahren bereitzustellen, die sich durch einfache Konstruktion, leichte Handhabbarkeit und damit kostengünstige Herstellung auszeichnet. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Reaktionsgefäß zur Verfügung zu stellen, das in einer derartigen Vorrichtung verwendet werden kann und sich ebenfalls durch eine leichte Handhabbarkeit sowie durch eine Kompatibilität mit üblicherweise in Laboratorien verwendeten Geräten wie beispielsweise Tischzentrifugen und Pipetten auszeichnet. Ferner ist es eine
Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Reaktionsgefäß zur Verfügung zu stellen, die die Durchführung von Mikro- Array-basierten Tests in einem Ein-Kammer- System unter Vermeidung von Kontaminationsquellen erlaubt. Des Weiteren ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Vorrichtung zur Durchfühnmg von Array- Verfahren bereitzustellen, die den Einsatz von Detektionsverfahren mit relativ geringem technischen Aufwand erlaubt.
Diese und weitere Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen angegebenen Gegenstände gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den Unteransprüchen definiert. Die Aufgaben werden erfindungsgemäß dadurch gelöst, dass ein Reaktionsgefäß bereitgestellt wird, welches eine für ein Laborreaktionsgefäß typische Form und/oder typische Größe aufweist und bei dem auf einer seiner Grundflächen ein Trägerelement mit darauf auf vorbestimmten Bereichen immobilisierten Sondenmolekülen angeordnet ist.
Die Verwendung des erfindungsgemäßen Reaktionsgefäßes für den Nachweis von spezifischen Wechselwirkungen zwischen molekularen Target- und Sondenmolekülen bietet den wesentlichen Vorteil, dass die Anschaffung von zusätzlichen Geräten bzw. einer zusätzlichen Ausstattung für die Durchführung der Nachweisreaktionen nicht erforderlich ist, da die üblicherweise in Laboren, insbesondere in biologischen Laboren verwendeten Geräte für Standard- Laborreaktionsgefäße, wie beispielsweise Tischzentrifugen und Pipetten, zum Einsatz kommen können. Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen
Reaktionsgefäßes ist, dass eine getrennte Inkubationskammer überflüssig ist, da das Reaktionsgefäß auch als Hybridisierungskammer dient. Zusätzlich wird die Oberfläche des Trägers mit den darauf immobilisierten Sondenmolekülen durch die für herkömmliche Laborreaktionsgefäße typische Deckelverriegelung, beispielsweise die Safe-Lock-Deckelverriegelung bei Eppendorf-Reaktionsgefäßen, vor Kontaminationen und anderen nachteiligen äußeren Einflüssen geschützt.
Unter Laborreaktionsgefäßen mit einer typischen Form und Größe werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung Reaktionsgefäße verstanden, die als Einweg- Reaktionsgefäße, in der Standardausführung 1,5 ml fassend, in, insbesondere biologischen bzw. molekularbiologischen, Laboratorien üblicherweise verwendet werden. Derartige Laborreaktionsgefäße werden auch als Tubes und, nach dem bedeutendsten Hersteller, insbesondere als Eppendorf-Tubes oder "Eppis" (Hamburg, Deutschland) bezeichnet. So werden Laborreaktionsgefäße mit einer typischen Form und Größe von Eppendorf als Standard-Reaktionsgefäße oder Safe-Lock- Reaktionsgefäße angeboten. Selbstverständlich können im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch Reaktionsgefäße von Herstellern wie Greiner (Frickenhausen, Deutschland), Millipore (Eschborn, Deutschland), Heraeus (Hanau, Deutschland) und BlOplastics (Landgraaf, Niederlande) sowie anderen Herstellern eingesetzt werden, die eine Form und Größe aufweisen, wie sie für Laborreaktionsgefäße insbesondere von Eppendorf typisch ist. Beispiele für Laborreaktionsgefäße mit einer typischen Form und Größe sind in Abbildung 21 gezeigt.
Unter Laborreaktionsgefäßen typischer Form und Größe werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung insbesondere nicht Rundkolben oder andere Kolben wie Erlenmeyerkolben, Bechergläser oder Messzylinder verstanden.
Das erfindungsgemäße Reaktionsgefäß unterscheidet sich von den vorstehenden genannten Reaktionsgefäßen dadurch, dass auf einer seiner Grundflächen ein Trägerelement mit darauf auf vorbestimmten Bereichen immobilisierten
Sondenmolekülen angeordnet ist. Ein derartiges Trägerelement mit darauf auf vorbestimmten Bereichen immobilisierten Sondenmolekülen wird im Folgenden auch als Chip oder Affinitätsmatrix bezeichnet. Die vorbestimmten Bereiche auf dem Träger werden im Folgenden auch als Array-Elemente bezeichnet.
Trotz der Modifizierung eines herkömmlichen Laborreaktionsgefäßes durch Einbau eines derartigen Chips weist das Reaktionsgefäß eine für ein Laborreaktionsgefäß typische Form und/oder Größe auf. Das erfindungsgemäße Reaktionsgefäß weist somit eine rotationssymmetrische Form, insbesondere eine zylindrische bzw. im Wesentlichen zylindrische Form auf. Von den für herkömmliche
Laborreaktionsgefäße typischen Formen und damit für das erfindungsgemäße Reaktionsgefäß denkbaren Formen ist ferner eine von der zylindrischen Grundform abweichende konische Form umfasst, wobei die Verjüngung vorzugsweise in Richtung der Affinitätsmatrix auftritt. Typische Formen sind ferner Kombinationen von zylindrischen bzw. im Wesentlichen zylindrischen Bereichen und konischen Bereichen (siehe u.a. Abbildungen 1-4 und 21). Aufgrund der für Laborreaktionsgefäße typischen Form und Größe ist das erfindungsgemäße Reaktionsgefäß insbesondere mit üblichen Tischzentrifugen wie beispielsweise von Herstellern wie Eppendorf oder Heraeus kompatibel, d.h. das erfindungsgemäße Reaktionsgefäß ist zur Zentrifugation in üblichen Tischzentrifugen geeignet. Übliche maximale Außendurchmesser für Standard-Laborreaktionsgefäße und damit auch für das erfindungsgemäße Reaktionsgefäß liegen im Bereich von 0,8 cm bis 2 cm, vorzugsweise 1,0 cm bis 1,5 cm und besonders bevorzugt 1,1 cm bis 1,3 cm. Weitere bevorzugte Außendurchmesser sind bis 0,9 cm, bis 1,2 cm, bis 1,4 cm, bis 1,6 cm und bis 1,7 cm. Die Höhe des erfindungsgemäßen Reaktionsgefäßes beträgt üblicherweise 1,5 cm bis 5,0 cm, vorzugsweise 2,0 cm bis 4,0 cm, besonders bevorzugt 2,5 cm bis 3,5 cm, und am meisten bevorzugt 2,8 cm bis 3,2 cm. Weitere bevorzugte Höhen sind bis 2,6 cm, bis 2,7 cm, bis 2,9 cm, bis 3,0 cm, bis 3,1 cm, bis 3,3 cm und bis 3,4 cm. In speziellen Ausgestaltungen kann die Höhe auch 1,0 cm oder mehr betragen. Das erfindungsgemäße Reaktionsgefäß ist in üblichen
Tischzentrifugen zentrifugierbar und kann somit beispielsweise in herkömmlichen Tischzentrifugen wie einer Standard-Tischzentrifuge mit Standard-Rotor von Eppendorf sowie auch in üblichen Racks und Haltern für Reaktionsgefäße wie beispielsweise einem Tube-Rack von Eppendorf eingesetzt werden. Zum Einbringen der zu untersuchenden Probe sowie anderer zur Durchführung der Nachweisreaktion erforderlicher Reagenzien in das Reaktionsgefäß können übliche Pipetten oder Spritzen wie beispielsweise variable und Fixvolumen-Pipetten von Eppendorf verwendet werden.
Die Anordnung des Chips in dem erfindungsgemäßen Reaktionsgefäß ermöglicht die Detektion der Wechselwirkungsreaktion zwischen Target- und Sondenmolekülen durch übliche Verfahren wie beispielsweise durch Fluoreszenzdetektion oder radiochemische Methoden. Als besonders vorteilhaft hat sich die Anwendung von Absorptionsmessungen erwiesen, da diese besonders kostengünstig durchzuführen sind. Eine derartige Absorptionsmessung kann durch Verwendung einer reaktiven Färbemethode, die an den Oberflächenbereichen stattfindet, an denen eine Wechselwirkungsreaktion stattgefunden hat, wesentlich verbessert und verbilligt werden. Hier hat sich insbesondere die Abscheidung von Silber an mit Goldnanokügelchen markierten Targetmolekülen bewährt (siehe DE 100 33 334.6 und WO 02/02810). Zum Nachweis der Silberabscheidung kann ein Gerät verwendet werden, das eine oder mehrere Leuchtdioden beliebiger Emissionswellenlänge als Lichtquelle verwendet und beispielsweise eine CCD-Kamera zur ortsaufgelösten Detektion der Wechselwirkungsreaktion auf den vorbestimmten Bereichen des Chips aufweist.
Zur Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden unter anderem folgende Definitionen verwendet:
Unter einem Sonden- Array wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Anordnung von molekularen Sonden auf einer Oberfläche verstanden, wobei die Position einer jeden Sonde separat bestimmt ist. Vorzugsweise umfasst der Array definierte Stellen bzw. vorbestimmte Bereiche, so genannte Array-Elemente, die besonders bevorzugt in einem bestimmten Muster angeordnet sind, wobei jedes Array-Element üblicherweise nur eine Spezies an Sonden beinhaltet.
Unter einer Sonde bzw. einem Sondenmolekül wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Molekül verstanden, das zum Nachweis anderer Moleküle durch ein bestimmtes, charakteristisches Bindungsverhalten bzw. eine bestimmte Reaktivität verwendet wird. Für die auf dem Array angeordneten Sonden kommt jede Art von Molekülen in Frage, die sich an feste Oberflächen koppeln lassen und eine spezifische Affinität aufweisen. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um Biopolymere aus den Klassen der Peptide, Proteine, Nukleinsäuren und/oder deren Analoga. Besonders bevorzugt sind die Sonden Nukleinsäuren und/oder Nukleinsäureanaloga. Als Nukleinsäuren können sowohl DNA- als auch RNA- Moleküle verwendet werden. Beispielsweise kann es sich bei den Oligonukleotidsonden um Oligonukleotide mit einer Länge von 10 bis 100 Basen, vorzugsweise 15 bis 50 Basen und besonders bevorzugt von 20 bis 30 Basen Länge handeln, die auf der Array-Oberfläche immobilisiert sind.
Unter einem Target bzw. einem Targetmolekül wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung das mit einer molekularen Sonde nachzuweisende Molekül verstanden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den zu detektierenden Targets um Nukleinsäuren. Der erfindungsgemäße Sonden-Array kann jedoch analog zum Nachweis von Protein/Sonden- Wechselwirkungen, Antikörper/Sonden- Wechselwirkungen, usw. eingesetzt werden.
Unter einem Array-Element bzw. einem vorbestimmten Bereich wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein für die Deposition einer molekularen Sonde bestimmtes Areal auf einer Oberfläche verstanden, die Summe aller belegten Array-Elemente ist das Sonden-Array.
Eine Markierung bezeichnet im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine detektierbare Einheit, beispielsweise ein Fluorophor oder eine Ankergruppe, an die eine detektierbare Einheit gekoppelt werden kann.
Unter einem Substrat wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein im Reaktionsmedium gelöst vorliegendes Molekül bzw. eine Kombination von Molekülen verstanden, die mit Hilfe eines Katalysators bzw. eines Kristallisationskeimes und/oder eines umsetzenden Agens lokal abgeschieden wird. Das umsetzende Agens kann beispielsweise ein reduzierenden Agens wie bei der Silberabscheidung oder ein oxidierendes Agens wie bei der Erzeugung eines Farbstoffs durch enzymatische Oxidation sein.
Unter einem Trägerelement bzw. Träger wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Festkörper verstanden, auf dem das Sonden-Array aufgebaut ist. Das Trägerelement mit den darauf angeordneten Sonden wird im Folgenden auch als Chip bezeichnet und kann bei speziellen Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung auch ein Grundelement umfassen, auf dem der eigentliche Chip angeordnet ist.
Das Trägerelement kann in dem erfindungsgemäßen Reaktionsgefäß angeordnet sein, indem es einfach in ein Laborreaktionsgefäß eingesetzt bzw. eingeklemmt wird, vorzugsweise indem die Chipfläche derart gestaltet ist, dass sie passgenau in ein Laborreaktionsgefäß, beispielsweise in dessen Deckel, eingesetzt bzw. eingeklemmt werden kann. Alternativ ist eine Grundfläche des Laborreaktionsgefäßes derart abgeflacht, dass das Trägerelement darauf angebracht werden kann. Sollten es technische Gründe erfordern, so kann der Träger bzw. der Chip auch in die Seitenwände des erfindungsgemäßen Reaktionsgefäßes eingebaut werden.
Bei einer vorteilhaften Ausgestaltung weist die Grundfläche, vorzugsweise der Boden des Laborreaktionsgefäßes jedoch eine Aussparung zur Aufnahme des Trägers auf. In diese Aussparung kann der Träger bzw. Chip beispielsweise von innen und/oder von außen eingeklebt und/oder eingeklemmt und/oder geschraubt und/oder geschweißt, insbesondere durch Laser-Schweißen, und/oder eingerastet werden. Bei diesen Ausgestaltungen weist das erfindungsgemäße Reaktionsgefäß eine für ein Laborreaktionsgefäß typische Form und Größe und einen als Einfassung geformten Durchbruch zur Aufnahme der Affinitätsmatrizen, insbesondere von oberflächengebundenen Substanzbibliotheken auf. Beispiele für derartige Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Reaktionsgefäßes sind in den Abbildungen 1 bis 4 angegeben. Neben den dort gezeigten Varianten sind selbstverständlich weitere Kombinationen der Art der Befestigimg des Trägers denkbar.
Der Einbau des Trägers bzw. Chips von innen hat den Vorteil, dass der Träger bzw. Chip auch bei höherem Imiendruck, z.B. bei Verwendung in einer Zentrifuge bzw. bei Erwärmung der Probenflüssigkeit auf Temperaturen nahe des Siedepunktes, im Reaktionsgefäß nicht aus seiner Befestigung nach außen gedrückt werden kann. Allerdings erfordert die Montage einen höheren Aufwand als der Einbau von außen.
Klemmverbindungen bzw. Gewinde bzw. Rasterungen sorgen für eine kraftschlüssige und flüssigkeitsundurchlässige Verbindung zwischen Reaktionsgefäß und Träger bzw. Chip. Durch derartige Varianten werden die Vorteile des Einsetzen des Trägers bzw. Chips von innen in das Reaktionsgefäß mit denen einer vereinfachten Montage vereint. Nachteilig wirkt sich eine weitere Verbindungsstelle, z.B. die Klemmverbindung sowie die höhere Anzahl an Bauteilen aus.
Bei der Herstellung des erfindungsgemäßen Reaktionsgefäßes wird üblicherweise von einem spritzgussgefertigten Standard-Laborreaktionsgefäß insbesondere von einem der vorstehend genannten Hersteller ausgegangen werden. Dieses wird an der Unterseite gekappt und dann in einer speziell dafür vorgesehenen Vorrichtung umgeschmolzen. Ein derartiges Verfahren eignet sich insbesondere für kleinere Stückzahlen. Bei großen Stückzahlen bietet es sich an, das Reaktionsgefäß direkt in einer der vorstehend genannten Ausgestaltungen spritzzugießen.
Um die Affinitätsmatrix von außen vor Dreck zu schützen, ist es vorteilhaft, auf die Unterseite des Reaktionsgefäßes eine Schutzfolie aufzuspannen bzw. aufzukleben, die kurz vor der Verwendung des Reaktionsgefäßes abgezogen wird.
Üblicherweise ist die Grundfläche, auf der das Trägerelement mit den darauf auf vorbestimmten Bereichen immobilisierten Sondenmolekülen angeordnet ist, der Boden des erfindungsgemäßen Reaktionsgefäßes.
Alternativ kann der Träger auch im Deckel des Reaktionsgefäßes angebracht sein. Der Einbau des Trägerelements bzw. der Chipfläche in den Deckel des Reaktionsgefäßes ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn die Affinitätsmatrix empfindlich gegenüber den Bedingungen bei einem oder mehreren der Reaktionsschritte zur Vorbereitung und/oder Durchführung der Nachweisreaktion reagiert. Derartige Reaktionsschritte können in dieser Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Reaktionsgefäßes in dem aufrecht stehenden Reaktionsgefäß durchgeführt werden, wodurch die Affinitätsmatrix bzw. der Chip nicht mit den Reaktions- und Probenlösungen in Kontakt kommt und so geschützt wird. Zur Durchführung der Nachweisreaktion wird das erfindungsgemäße Reaktionsgefäß dann auf den Deckel gedreht bzw. gestellt, so dass die Probe mit den oberflächengebundenen Sonden in Berührung kommt. Auf diese Weise wird die thermische und chemische Belastungen der Affinitätsmatrix bzw. des Chips verringert.
Das Trägerelement des erfindungsgemäßen Reaktionsgefäßes ist vorzugsweise im Bereich der Detektionsfläche optisch durchlässig und/oder oder nicht fluoreszierend. Unter Detektionsfläche ist der Bereich des Trägerelements zu verstehen, auf dem auf vorbestimmten Bereichen Sondenmoleküle immobilisiert sind. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Sondenmoleküle direkt auf dem Trägerelement aufgebracht, ohne dass das Trägerelement ein weiteres Grundelement umfasst.
In anderen bevorzugten Ausführungsformen sind die Sondenmoleküle auf einem vorzugsweise optisch durchlässigen und/oder nicht fluoreszierenden Chip aufgebracht, der wiederum fest mit einem Grundelement, das vorzugsweise mindestens in dem durch den Chip definierten Detektionsbereich optisch durchlässig und/oder nicht fluoreszierend ist, verbunden ist. Die Dimensionen des Chips sind dabei kleiner als die Dimensionen des Grundelements. In diesem Fall bilden der die Sondenmoleküle tragende Chip und das Grundelement zusammen das Trägerelement. Bei einer bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Reaktionsgefäßes ist die der Detektionsfläche des Trägerelements gegenüberliegende Grundfläche in dem der Detektionsfläche entsprechenden Bereich ebenfalls optisch durchlässig und/oder nicht fluoreszierend.
Allgemein umfasst ein Sonden-Array gemäß der vorliegenden Erfindung einen Träger, der die Bildung von Arrays mit Sonden auf seiner Oberfläche erlaubt. Ein derartiger Träger kann unter anderem hergestellt werden aus Materialien, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Glas, Filtern, elektronischen Vorrichtungen, Polymeren, metallischen Materialien u.dgl. sowie beliebigen Kombinationen dieser Materialien.
Das Trägerelement besteht vorzugsweise aus optisch durchlässigen und/oder nicht fluoreszierenden Materialien. Bei derartigen Materialien handelt es sich beispielsweise um Glas, Borofloat 33 (beispielsweise erhältlich von Schott, Jena, Deutschland), Quarzglas, einkristallines CaF2 (beispielsweise erhältlich von Schott), einkristallines Silizium, Phenylmethylmethacrylat und/oder Polycarbonat.
Sind die Sondenmoleküle nicht direkt auf dem Trägerelement, sondern auf einem Chip aufgebracht, besteht der Chip ebenfalls vorzugsweise aus optisch durchlässigen und/oder nicht fluoreszierenden Materialien. Bei den Materialien handelt es sich insbesondere um Glas, Borofloat 33, Quarzglas, einkristallines CaF2, einkristallines Silizium, Phenylmethylmethacrylat und/oder Polycarbonat.
Neben den vorstehend beschriebenen optisch durchlässigen oder nicht fluoreszierenden Materialien für das Trägerelement bzw. der Chip sind herkömmliche Filter-, Keramik-, Metall-, Halbmetall- und/oder Kunststoffmaterialien denkbar. So können beispielsweise auch speziell für DNA- Bibliotheken gefertigte Nylonmembranen als Trägermaterialien eingesetzt werden. Das Material des Behälters des Reaktionsgefäßes entspricht den üblicherweise für Laborreaktionsgefäße verwendeten Materialien und ist beispielsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glas, Glaskeramik, kunststoffbeschichtetem Glas und Kunststoffen bzw. organischen Polymeren wie Polypropylen, Polyethylen, Polystyrol, Polycarbonat, PVC, Polymethylmethacrylat, Silikonkunststoff,
Kautschuk, Polytetrafluorethylen und/oder Nylon. Für spezielle Ausführungsformen sind als Materialien auch Metalle, insbesondere nicht rostende Stähle, Platin und/oder Aluminium, denkbar.
Das Reaktions gefäß weist eine für ein Laborreaktionsgefäß typische Größe auf. Typische Füllvolumina liegen im Bereich von 100 μl bis 2,5 ml, können aber bei speziellen Ausgestaltungen auch höher oder niedriger sein. Besonders bevorzugt hat das Reaktionsgefäß ein für ein Standard-Eppendorf-Tube übliches Füllvolumen von bis zu 1,5 ml. Weitere bevorzugte Füllvolumina sind bis 0,4 ml, bis 0,5 ml, bis 0,7 ml, bis 1 ,0 ml oder bis 2,0 ml.
Üblicherweise handelt es sich bei den immobilisierten Sondenmolekülen auf dem Trägerelement um eine Substanzbibliothek. Unter einer Substanzbibliothek wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Ansammlung von unterschiedlichen Substanzen, die auf einer Oberfläche immobilisiert sind, verstanden. Die Anordnung der Substanzen auf der Oberfläche erfolgt derart, dass jeder Substanz ein bestimmter, eindeutig zu identifizierender Ort zugeordnet ist und dass jede Substanz vollkommen getrennt von den anderen immobilisiert ist.
Bei den Substanzbibliotheken kann es sich um Proteinsubstanzbibliotheken, Peptid- substanzbibliotheken und Nukleinsäuresubstanzbibliotheken handeln. Bei Proteinsubstanzbibliotheken kann es sich insbesondere um Antikörper-, Rezeptormolekül- und Membranproteinbibliotheken handeln. Denkbare Peptidbibliotheken sind insbesondere Rezeptorligandenbibliotheken, pharmakologisch aktive Peptid- bibliotheken und Peptidhormonbibliotheken. Nukleinsäuresubstanzbibliotheken sind insbesondere DNA- und RNA- Molekülbibliotheken. Bei DNA-Molekülbibliotheken köm en besonders bevorzugt ribosomale DNA-Sequenzen von Mikroorganismen auf dem Trägerelement angebracht sein. Femer kann es sich um Nukleinsäuresubstanzbibliotheken zur SNP- Analyse handeln. Ebenfalls denkbar sind Protein- oder Nukleinsäuresubstanz- bibliotheken, die ein so genanntes "expression profiling" erlauben. Eine weitere Alternative sind kombinatorische Substanzbibliotheken.
Die Substanzbibliotheken sind dabei so auf das Trägerelement aufgebracht, dass sie den Probenraum des Reaktionsgefäßes kontaktieren. Das Trägerelement des Reaktionsgefäßes ist somit vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass es auf seiner Oberfläche eine Detektionsfläche mit einer Substanzbibliothek aufweist und mindestens in dem Detektionsbereich optisch durchlässig ist.
Eine weitere vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung ist, dass das entstehende Reaktionsgefäß dicht ist und wässrige Proben auf Temperaturen von bis zu 100°C über Stunden erhitzt werden können, ohne dass es zu einem Austritt von Flüssigkeit kommt oder die Proben verdampfen. D.h. die erfindungsgemäßen Reaktionsgefäße können in weiten Temperaturbereichen eingesetzt werden und sind beim Einfrieren in flüssigem Stickstoff (bei -196°C) ebenso funktionsfähig wie im siedendem Wasserbad. Ebenso sind sie beispielsweise geeignet, um 15-minütiges Autoklavieren bei 121 °C auszuhalten. Femer sind die erfindungs gemäßen Reaktions gefäße vorzugsweise chemisch resistent gegen Säuren, Basen und organische Lösungsmittel wie Alkohole, Aceton oder Phenol.
Das erfindungsgemäße Reaktionsgefäß weist vorzugsweise die üblicherweise in Labor-Reaktionsgefäßen verwendeten Deckel bzw. Deckelverriegelungen auf, wie beispielsweise die Systeme Easy-to-Open (Biozym, Oldendorf, Deutschland), Safe- Lock (Eppendorf) und dergleichen. Auf diese Weise ist die Dichtheit sowie das leichte, insbesondere einhändige Öffnen des Reaktionsgefäßes gewährleistet.
Falls das Trägerelement in eine Aussparung des Reaktionsgefäßes eingesetzt wird, wird eine ausreichende Dichtheit des Reaktionsgefäßes üblicherweise dadurch erreicht, dass das Trägerelement in die Aussparung eingeklebt und/oder eingeklemmt wird und gegebenenfalls anschließend ein Dichtmaterial an den erforderlichen Bereichen aufgebracht wird.
Die Klebstoffe werden üblicherweise mit handelsüblichen Dispensiergeräten aufgetragen. Als Klebstoff kommen vorzugsweise platinvernetzende Polydimethyl- siloxane wie Sylgard 182 oder Sylgard 184 (Dow Coming, Midland, Michigan, USA) in Betracht. Alternativ köm en andere Klebstoffe wie beispielsweise Silikonkleber, Polyurethankleber, Epoxidharzkleber, Cyanacrylatkleber, Acrylkleber und/oder Heizkleber verwendet werden. Als Dichtmaterialien können unterschiedliche Kautschuke wie Silikonkautschuk und/oder Gummimaterialen und dergleichen eingesetzt werden.
Vorzugsweise ist das in dem Reaktionsgefäß angeordnete Trägerelement ein so genannter DNA-Chip. Bei einem derartigen DNA-Chip handelt es sich um eine beispielsweise auf einer Glasoberfläche gebundene DNA-Bibliothek mit eindeutiger Zuordnung der DNA-Sequenzen zu vorbestimmten Bereichen der Oberfläche.
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzten Sonden- Arrays mit an definierten Stellen immobilisierten Sonden können allgemein nach herkömmlich bekannten Verfahren hergestellt werden. DNA-Chips werden vorzugsweise durch allgemein übliche Spotting- Verfahren oder durch spezielle ortsaufgelöste Synthese- Verfahren hergestellt. Für die Herstellung kommen auch Alternativ-Verfahren wie Synthese- Verfahren über eine lichtgeführte DNA-Synthese in Frage. Verfahren zur Herstellung von Sonden- Arrays bzw. Chips, speziell von DNA-Chips sind dem Fachmann bekannt und unter anderem in DE 197 06 570, EP 0 969 918 und WO 98/36827 beschrieben.
Vorzugsweise werden die Sonden- Arrays alternativ nach zwei prinzipiell unterschiedlichen Verfahren hergestellt.
Bei einer Methode werden separat synthetisierte Sonden, beispielsweise Oligonukleotide, mit Hilfe von Automaten, so genannten Spöttern, die das ortsspezifische Ablegen kleinster Flüssigkeitsmengen gewährleisten, auf Oberflächen aufgebracht und kovalent oder nicht kovalent mit dieser verknüpft. Das Verfahren arbeitet seriell. Jeder Spot wird individuell mit der Sonde bestückt.
Alternativ werden Sonden- Arrays durch ortsspezifische in sttw-Synthese der Sonden, beispielsweise der Oligonukleotidsonden erzeugt. Die Synthese erfolgt parallel, beispielsweise im Wafer-Maßstab. Geeignete Reagenzien zur Aktivierung der Array- Oberfläche bzw. geeignete Schutzgruppen für die Sondensynthese auf der Array- Oberfläche sind dem Fachmann bekannt.
Die Immobilisierung von Molekülen auf der Array-Oberfläche kann entweder spezifisch oder unspezifisch erfolgen. Die spezifische Immobilisierung setzt eine Selektivität der Wechselwirkung bestimmter chemischer Funktionen des zu immobilisierenden Moleküls mit der Oberfläche des Substrats voraus. Ein Beispiel für eine spezifische, nicht kovalente Immobilisierung ist die Bindung von Biotin- markierter Nukleinsäure an ein mit Streptavitin beschichtetes Substrat. Aniino- modifizierte Nukleinsäuren lassen sich spezifisch über die Reaktion der
Aminogruppe mit einem Epoxid, einer Carboxy-Funktion oder einem Aldehyd immobilisieren. Vorzugsweise wird die Immobilisierung über eine endständige Phosphatgruppe der Sonde bzw. des Monomer-Bausteins einer Biopolymer-Sonde an einer animierten Oberfläche durchgeführt. Die ortsspezifische Immobilisierung erfolgt über eine Vielzahl von Mechanismen und chemischen Funktionen und kann sowohl kovalent als auch nicht kovalent sein. Beispiel hierfür ist die Immobilisierung von Nukleinsäuren auf einer mit Poly-L- Lysin modifizierten Substratoberfläche, aber auch die Immobilisierung von chemisch nicht modifizierten Nukleinsäuren auf epoxidierten, aminierten oder mit Aldehyd- Funktionen besetzten Substratoberflächen.
Für das Ablegen geringer Mengen Material an vorgesehenen Stellen auf einem Substrat zur Herstellung eines Sonden- Arrays, der in das erfindungsgemäße Reaktionsgefäß eingesetzt wird, können ebenfalls dem Fachmann bekannte
Verfahren eingesetzt werden. Eine Reihe derartiger Verfahren ist beispielsweise in DJ. Lockhart, E.A. Winzeler; Genomics, gene expression and DNA arrays; Nature, 405, Seiten 827-836, 2000 beschrieben.
Im Folgenden werden spezielle Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Reaktionsgefäß anhand von Abbildungen detailliert beschrieben.
Das Reaktionsgefäß (1) in Abbildung 1 weist im Wesentlichen die Dimensionen von marktüblichen Reaktionsgefäßen auf und ähnelt vorzugsweise einem 1,5 ml Standard-Reaktionsgefäß aus Polypropylen, wie es in hohen Stückzahlen gefertigt wird. Es weist einen Durchbruch (im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch als Aussparung bezeichnet) (8, 10) auf, der mit einer Fassung versehen ist, in die die Affinitätsmatrix (100) eingelegt werden kann. Die Fassung umfasst im Allgemeinen eine Auflagefläche (6,11) für die Affinitätsmatrix (100), einen Flüssigkeitsdurchbrach (8), um die oberflächengebundene Substanzbibliothek (102) mit der Probe in Kontakt bringen zu können, sowie einen Sichtdurchbruch (10), um die Durchlichtdetektion zu ermöglichen. Des Weiteren kann der Durchbruch (8,10) mit einem Kleberand (7, 9) versehen sein, um die Verklebung der Affinitätsmatrix in das Reaktionsgefäß (2) zu vereinfachen. Um die Affmitätsmatrix (100) nicht in das Reaktionsgefäß einkleben zu müssen, können spezielle Schnellverschlüsse vor- gesehen werden. Dabei kann die Dichtwirkung durch Dichtungen erreicht werden. Das Reaktionsgefäß kann durch einen Deckel (3) verschließbar sein.
Die in die Fassung eingearbeitete Affmitätsmatrix (100) kann sich an verschiedenen Positionen im Reaktionsgefäß (2) befinden. So ist es möglich, die Affinitätsmatrizen wie in den Abbildungen 1 bis 4 dargestellt am Boden des Reaktionsgefäßes zu befestigen. In diesem Fall ist die Affmitätsmatrix (100) immer den Probensubstanzen ausgesetzt.
Sollte die Affinitätsmatrix (100) empfindlich gegenüber einem oder mehreren Prozessschritten reagieren, so kann die Matrix auch in den Deckel (3) eingebaut werden. Die notwendigen Konditionierungsschritte der Probe werden dann bei aufrecht stehendem Reaktionsgefäß (1) durchgeführt, wobei die Affinitätsmatrix nicht mit der Probe in Berührung kommt und so geschützt wird. Zur Detektions- reaktion wird das Reaktionsgefäß dann auf den Kopf gestellt, so dass die Probe mit der oberflächengebundenen Substanzbibliothek (102) in Berührung kommt. Dies würde die thermischen und chemischen Belastungen der Affmitätsmatrix (100) verringern.
Die Affinitätsmatrizen (100) können auf unterschiedlich Weise mit dem
Reaktionsgefäß (2) verbunden werden. Bei der in Abbildung 1 dargestellten Variante wird die Affinitätsmatrix von außen in einen Flüssigkeitsdurchbrach (8) auf eine Auflage (6) gelegt. In einen Kleberand (7) wird Klebstoff gegeben, der durch Fließ- und Kapillarwirkung die Affinitätsmatrix (100) umschließt und mit dem Reaktions- gefäß (2) flüssigkeitsdicht und temperaturstabil verbindet. Alternativ kann die
Affinitätsmatrix (100) auch mit dem Reaktionsgefäß (2) beispielsweise durch Laser- Schweißen verschweißt werden. Die Affinitätsmatrix (100) wird so in das Reaktionsgefäß eingebaut, dass die oberflächengebundene Substanzbibliothek (102) mit der Probenlösung in Kontakt treten kann. Nach dem Einbau der Affinitätsmatrix (100) ist eine optische Durchlichtdetektion mit den Lesegeräten (1000) entsprechend den Abbildungen 5 bis 15 möglich.
Alternativ kann die Affmitätsmatrix (100) auch von innen eingebaut werden, wie in Abbildung 2 dargestellt. Bei dieser Variante liegen die Auflagefläche und der Kleberand im Reaktionsraum des Reaktionsgefäß. Das hat den Vorteil, dass die Affmitätsmatrix (100) auch bei höherem Innendruck, z.B. bei Verwendung in einer Zentrifuge bzw. bei Erwärmung der Probenflüssigkeit auf Temperaturen nahe des Siedepunktes, des Reaktionsraum nicht aus ihrer Halterung gedrückt werden kann. Allerdings erfordert die Montage einen höheren Aufwand.
In Abbildung 3 wird eine Variante gezeigt, bei der die Affinitätsmatrix (100) in einen Chipträger eingebaut wird. Anschließend wird der Chipträger (200) auf das Reaktionsgefäß (2) gedrückt. Eine Klemmverbindung oder ein Gewinde (201) sorgen für eine kraftschlüssige und flüssigkeitsundurchlässige Verbindung zwischen
Reaktionsgefäß (2) und Chipträger (200). Diese Variante vereint die Vorteile einer von innen eingesetzten Affinitätsmatrix (100) in das Reaktionsgefäß mit denen einer vereinfachten Montage. Nachteilig wirkt sich eine weitere Verbindungsstelle wie z.B. die Klemmverbindung sowie die höhere Anzahl an Bauteilen aus.
hl Abbildung 4 ist eine Variante dargestellt, bei der die Affinitätsmatrix (100) durch eine von innen eingesetzte Klemmhülse (300) zwischen Reaktionsgefäß (2) und Klemmhülse (300) so eingeklemmt wird, das eine Verklebung der Affinitätsmatrix (100) mit dem Reaktionsgefäß (2) überflüssig wird. Jedoch erfordert diese Ausführung eine sehr hohe Fertigungspräzision von Klemmhülse (300) und
Reaktionsgefäß (2), um eine flüssigkeitsdichte Verklemmung der Affinitätsmatrix (100) zu gewährleisten. Die Klemmhülse (300) kann in einer weiteren Variante in das Reaktionsgefäß (2) eingeschraubt werden. Bei einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweis der spezifischen Wechselwirkung zwischen molekularen Target- und Sondenmolekülen bereitgestellt, das die folgenden Schritte umfasst:
a) Bereitstellung eines vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Reaktionsgefäßes; b) Wechselwirkung des Targets mit den auf vorbestimmten Bereichen (Array- Elementen) angeordneten Sonden; und c) Detektion der Wechselwirkung.
Die zu untersuchenden Targets können in jeder Art von Probe, vorzugsweise in einer biologischen Probe vorliegen. Vorzugsweise werden die Targets vor ihrer Detektion und Quantifizierung durch das erfindungsgemäß Verfahren isoliert, gereinigt, kopiert und/oder amplifiziert.
Die Amplifikation erfolgt üblicherweise durch herkömmliche PCR-Methoden. Vorzugsweise wird die Amplifikation als Multiplex-PCR in einem zweistufigen Prozess ausgeführt (siehe auch WO 97/45559). In einer ersten Stufe wird eine Multiplex-PCR durchgeführt, indem Fusionsprimer eingesetzt werden, deren 3'- Enden genspezifisch sind und deren 5 '-Enden eine universelle Region darstellen. Letztere ist bei allen in der Multiplex-Reaktion eingesetzten forward- und reverse- Primern gleich. In dieser ersten Stufe ist die Primermenge limitierend. Dadurch können alle Multiplex-Produkte bis zu einem einheitlichen molaren Niveau amplifiziert werden, vorausgesetzt, dass die Zyklenzahl hinreichend ist, um für alle Produkte Primerlimitation zu erreichen. In einer zweiten Stufe werden universelle Primer zugegen, die identisch mit den 5 '-Regionen der Fusionsprimer sind. Es erfolgt Amplifikation bis zur gewünschten DNA-Menge. Der Nachweis erfolgt bei dem erfmdungsgemäßen Verfahren vorzugsweise dadurch, dass die gebundenen Targets mit mindestens einer Markierung versehen sind, die in Schritt c) detektiert wird.
Bei einer alternativen Ausführungsform umfassen die auf dem Sonden-Array angeordneten Sondenmoleküle, die dem Nachweis der molekularen Wechselwirkungen mit dem Targetmolekülen dienen, mindestens eine Markierung sowie mindestens eine Sollbruchstelle, d.h. eine labile bzw. selektiv spaltbare Bindung, die spezifisch destabilisiert bzw. gespalten werden kann. Die zwischen der Markierung und der Position der Verknüpfung der Sonden mit der Array-Oberfläche angeordnete selektiv spaltbare Bindung ermöglicht, dass die Markierung bzw. detektierbare Einheit auch zum spezifischen Nachweis der molekularen Wechselwirkung zwischen Sonden und Targets eingesetzt werden kann. Dabei ist die Sollbruchstelle bzw. selektive spaltbare Bindung innerhalb des Sondenmoleküls so positioniert, dass ein Brach der Bindung zum Ablösen der detektierbaren Einheit bzw. der Ankergruppe mit der detektierbaren Einheit von der Array-Oberfläche führt. Dagegen bleiben solche Markierungen mit der Array-Oberfläche verknüpft, deren Sonden-Moleküle spezifisch mit Target-Molekülen wechselgewirkt haben, da das mit der Markierung verknüpfte Spaltprodukt der Sonde bzw. das Sondenfragment über die Wechselwirkung mit dem Target mit dem zweiten Spaltprodukt der Sonde, das auf der Oberfläche des Arrays immobilisiert ist, gekoppelt bleibt. Die Bereitstellung derartiger Sonden-Moleküle, die mindestens eine Sollbruchstelle umfassen, ist ausführlich in der deutschen Patentanmeldung DE 101 42 643.7 beschrieben.
Die selektiv spaltbaren Bindungen sind in dieser Ausführungsform vorzugsweise derart beschaffen, dass sie auch dann effektiv spaltbar sind, wenn die Sonden an der Array-Oberfläche immobilisiert sein. Die selektiv spaltbare Bindung kann vorzugsweise durch chemische und/oder physikalische Methoden selektiv gespalten werden. Eine effiziente Spaltung an der Oberfläche ist insbesondere durch Agenzien mit geringem Ausmaß wie Atome und Ionen gewährleistet. Vorzugsweise ist die labile Bindung deshalb durch einfache chemische Agenzien selektiv spaltbar, beispielsweise durch Zugabe von Ionen, besonders bevorzugt von Säureanionen, Basekationen, Fluorid- und/oder Schwermetallionen wie Quecksilber- und/oder Silberionen.
Im Falle der Herstellung der Arrays durch Immobilisierung von separat synthetisierten Oligonukleotiden ist die selektiv spaltbare Bindung unter den Bedingungen, die bei der Immobilisierung der Sonden auf der Array-Oberfläche angewendet werden, stabil. Erfolgt die Herstellung der Sonden in situ durch ortsspezifische Synthese auf der Array-Oberfläche, ist es bevorzugt, dass die labile Bindung im Rahmen des Syntheseverlaufes effizient erzeugt werden kann. Besonders bevorzugt ist die Bereitstellung der labilen Bindung mittels Phosphoramiditchemie. Gleiches gilt im Übrigen für den Einbau der detektierbaren Einheit.
Folglich ist es bevorzugt, dass die selektiv spaltbare Bindung in einer Nuklemsäure vorliegt, die durch herkömmliche DNA- oder RNA-Synthese hergestellt werden kann. Besonders bevorzugt umfassen die Sondenmoleküle des erfindungsgemäßen Sonden- Arrays eine Nukleinsäure der Formel Aι-S-A2, wobei S eine Nukleinsäure bzw. ein Nukleotidbaustein ist, die bzw. der mindestens eine selektiv spaltbare Bindung umfasst, und Aj. und A2 beliebige Nukleinsäuren oder Nukleinsäureanaloga sind. Über eine der beiden Nukleinsäuren oder Nukleinsäureanaloga Ai und A2 ist das Sondenmolekül auf der Oberfläche des erfindungsgemäßen Sonden- Arrays immobilisiert, während die andere mindestens eine Markierung aufweist. S ist vorzugsweise ein Nukleotid-Dimer, das durch eine selektiv spaltbare Bindung verbrückt ist.
Beispiele für besonders bevorzugte DNA-Nukleotid-Bausteine S, die eine selektiv spaltbare Bindung umfassen, sind in der folgenden Formel I angegeben:
Figure imgf000029_0001
Dabei kann X und Y unabhängig voneinander ausgewählt werden aus der Gruppe vorzugsweise bestehend aus O, NH und S, wobei X und Y nicht gleichzeitig O sind.
B steht für eine Nucleobase wie die Purin-Derivate Adenin und Guanin sowie die Pyrimidine Cytosin und Thymin.
Die selektiv spaltbare Bindung innerhalb der Nukleotidsequenz derartiger Oligonukleotidsonden ist vorzugsweise eine Phosphothioatbindung oder eine Phosphoramidatbindung. Besonders bevorzugt ersetzt die Phosphothioatbindung, d.h. eine Zucker-O-P-S-Zucker-Bindung eine Phosphodiesterbindung, d.h. eine Zucker-O-P-O-Zucker-Bindung eines unmodifizierten Oligonukleotids. In dieser Ausführangsform sind zwei Nukleoside durch eine Phosphotliioatbindung verbunden.
Alternativ kann die selektiv spaltbare Bindung innerhalb der Nukleotidsequenz auch eine andere Schwefel- oder Stickstoff-modifizierte Esterbindung wie beispielsweise eine Phosphonothioat-Bindung sein.
Weitere Beispiele für die Bereitstellung von selektiv spaltbaren Bindungen in den Sondenmolekülen des erfindungs gemäßen Sonden- Arrays sind Amid-, 1,2-Diol-, Disulfid- und/oder Sulfonyl-Grappen sowie weitere Gruppen, die in US 5,118,605 beschrieben sind und unter den dort genannten Bedingungen spaltbar sind. Diese Gruppen sind allerdings weniger bevorzugt, da u.a. ihre Inkorporation in Oligonukleotidsonden mittels herkömmlicher Nukleinsäure-Synthese nicht möglich ist.
Alternativ können auch physikalische Methoden zur Spaltung der selektiv spaltbaren Bindung in den Sondenmolekülen eingesetzt werden. So kann die selektiv spaltbare Bindung beispielsweise photolytisch selektiv gespalten werden. Nukleotidbausteine, die eine photolytisch selektiv spaltbare Bindung umfassen und für die Synthese der Sondenmoleküle des erfindungsgemäßen Sonden- Arrays eingesetzt werden können, sind beispielsweise in US 5,367,066, US 5,552,538 und US 5,578,717 beschrieben.
Weitere Beispiele für besonders bevorzugte RNA-Nukleotid-Bausteine, die eine chemisch oder physikalisch selektiv spaltbare Bindung umfassen, sind in der folgenden Formel II angegeben:
Figure imgf000030_0001
II Dabei kann X und Y unabhängig voneinander ausgewählt werden aus der Grappe vorzugsweise bestehend aus O, NH und S, wobei X und Y nicht gleichzeitig O sind, wenn PG keine labile Schutzgruppe ist. PG wird vorzugsweise ausgewählt der Gruppe bestehend aus H und labilen Schutzgruppen wie
Figure imgf000031_0001
(photolabil) oder (labil z.B. gegen Fluorionen).
B steht in Formel II für eine Nucleobase wie die Purin-Derivate Adenin und Guanin sowie die Pyrimidine Cytosin und Uracil.
Bevorzugt sind allerdings Sondenmoleküle mit selektiv spaltbaren Bindungen, die unter normalen atmosphärischen, Temperatur-, und Licht-Bedingungen stabil sind.
Bei einer alternativen Ausführungsform ist die labile Bindung selektiv durch enzymatische Methoden spaltbar. Beispiele für Nukleotidbausteine, die derartige labile Bindungen umfassen, sind in US 4,775,619 und US 4,876, 187 beschrieben. Enzymatische Methoden zur Spaltung der selektiv spaltbaren Bindung sind allerdings im Rahmen der vorliegenden Erfindung weniger bevorzugt, da enzymatische Aktivitäten durch die Nähe der selektiv spaltbaren Bindung zur Oberfläche aufgrund der Immobilisierung der Sondenmoleküle stark behindert werden. Folglich weist eine enzymatische Spaltungsreaktion nur eine sehr niedrige Effizienz auf, was einen unerwünschten hohen Signalhintergrund durch fälschlicherweise positive Messergebnisse zur Folge hat. Somit kann bei einer bevorzugten Ausführangsform des erfindungsgemäßen Sonden-Arrays die selektiv spaltbare Bindung nicht durch enzymatische Methoden selektiv gespalten werden.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Sonden- Arrays befindet sich die selektiv spaltbare Bindung ungefähr in der Mitte zwischen der Stelle der Immobilisierung der Sonde auf der Array-Oberfläche und der Position der Markierung der Sonde. Somit wird gewährleistet, dass die Wahrscheinlichkeit der Wechselwirkung des Targets mit dem immobilisierten Sondenfragment, welches dem nach der Bindungsspaltung an der Oberfläche verbleibenden Rest der Sonde entspricht, wesentlich vermindert bzw. nahezu ausgeschlossen ist. Befindet sich die selektiv spaltbare Bindung dagegen zu nahe an der Array-Oberfläche, so ist der Komplex aus Sonden- und Targetmolekül nach der Spaltung nicht mehr ausreichend stabilisiert, da die Hybridisierung des Targets mit dem an der Array-Oberfläche immobilisierten Sondenfragments nicht stabil genug ist. Dies würde zu fälschlicherweise negativen Messergebnissen führen.
Wie bereits vorstehend erwähnt, ist die Markierung, die an die Targets oder Sonden gekoppelt ist, vorzugsweise eine detektierbare Einheit oder eine über eine Ankergrappe an die Targets oder Sonden gekoppelte detektierbare Einheit. Hinsichtlich der Möglichkeiten der Detektion bzw. der Markierung ist das erfindungsgemäße Verfahren äußerst flexibel. So ist das erfindungsgemäße Verfahren mit einer Vielzahl physikalischer, chemischer oder biochemischer Detektionsverfahren kompatibel. Voraussetzung ist lediglich, dass die zu detektierende Einheit bzw. Struktur direkt an eine Sonde oder ein Target, beispielsweise ein Oligonukleotid gekoppelt bzw. über eine mit dem Oligonukleotid koppelbare Ankergruppe verknüpft werden kann.
Die Detektion der Markierung kann auf Fluoreszenz, Magnetismus, Ladung, Masse, Affinität, enzymatischer Aktivität, Reaktivität, einer Goldmarkierung u.dgl. beruhen. So kann die Markierung beispielsweise auf der Verwendung von Fluorophor- markierten Strukturen bzw. Bausteinen basieren. In Verbindung mit der Fluoreszenz- Detektion kann die Markierung ein beliebiger an Targets oder Sonden während oder nach deren Synthese koppelbarer Farbstoff sein. Beispiele hierfür sind Cy-Farbstoffe (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden), Alexa-Farbstoffe, Texas-Rot, Fluorescein, Rhodamin (Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA), Lanthanide wie Samarium, Ytterbium und Europium (EG&G, Wallac, Freiburg, Deutschland). Neben Fluoreszenz-Markern können im Rahmen der vorliegenden Erfindung als Markierung bzw. als Detektiereinheit, die mit den Targets bzw. Sonden gekoppelt ist, auch Lumineszenz-Marker, Metall-Marker, Enzym-Marker, radioaktive Marker und/oder polymere Marker eingesetzt werden.
Ebenso kann eine Nukleinsäure als Markierung (Tag) genutzt werden, die durch Hybridisierung mit einer markierten Reporter detektiert werden kann (Sandwich- Hybridisierung). Einsatz zum Nachweis des Tags finden diverse molekularbiologische Nachweisreaktionen wie Primer-Extension, Ligation und RCA.
Bei einer alternativen Ausfuhrangsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die detektierbare Einheit über eine Ankergruppe mit den Targets oder Sonden gekoppelt. Bevorzugt verwendete Ankergruppen sind Biotin, Digoxygenin u.dgl. Die
Ankergruppe werden in einer anschließenden Reaktion mit spezifisch bindenden Komponenten, beispielsweise Streptavidin-Konjugaten oder Antikörper-Konjugaten umgesetzt, die selbst detektierbar sind oder eine detektierbare Reaktion auslösen. Bei Einsatz von Ankergrappen kann die Umsetzung der Ankergruppen in detektierbare Einheiten vor, während oder nach Zugabe der Probe umfassend die Targets bzw. ggf. vor, während oder nach der Spaltung der selektiv spaltbarer Bindung in den Sonden erfolgen.
Die Markierung kann erfindungsgemäß auch durch Wechselwirkung eines markierten Moleküls mit den Sonden-Molekülen erfolgen. Beispielsweise kann die Markierung durch Hybridisierung eines wie vorstehend beschrieben markierten Oligonukleotids mit einer Oligonukleotid-Sonde bzw. einem Oligonukleotid-Target erfolgen. Weitere im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignete Markierungsverfahren und Nachweissysteme sind beispielsweise in Lottspeich und Zorbas, Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin, 1998, Kapitel 23.3 und 23.4 beschrieben.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden Nachweisverfahren eingesetzt, die im Ergebnis ein Addukt mit einem bestimmten Löslichkeitsprodukt, das eine Präzipitation zur Folge hat, liefern. Zur Markierung werden insbesondere Substrate eingesetzt, die in ein schwer lösliches, üblicherweise gefärbtes Produkt umgesetzt werden können. Beispielsweise können bei dieser
Markierungsreaktion Enzyme verwendet werden, die den Umsatz eines Substrats in ein schwer lösliches Produkt katalysieren. Eine Reihe von in Frage kommenden Reaktionen, die geeignet sind, um zu einem Niederschlag an Array-Elementen zu führen, sowie Möglichkeiten für die Detektion des Niederschlags sind beispielsweise in der internationalen Patentanmeldung WO 00/72018 und in der internationalen Patentanmeldung WO 02/02810 beschrieben, auf deren Inhalt hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die gebundenen Targets mit einer Markierung versehen, die die
Reaktion eines löslichen Substrats zu einem schwer löslichen Niederschlag auf dem Array-Element katalysiert, an dem einen Sonden/Target- Wechselwirkung stattgefunden hat bzw. die als Kristallisationskeim für die Umwandlung eines löslichen Substrats zu einem schwer löslichen Niederschlag auf dem Array-Element wirkt, an dem eine Sonden Target- Wechselwirkung stattgefunden hat.
Der Einsatz des erfindungsgemäßen Verfahrens erlaubt auf diese Weise die simultane qualitative und quantitative Analyse einer Vielzahl von Sonden/Target- Wechselwirkungen, wobei einzelne Array-Elemente mit einer Größe von ≤IOOO μm, vorzugsweise von ≤IOO μm und besonders bevorzugt von <50 μm realisiert werden können.
In der Immunzytochemie und bei immunologischen Mikrotiterplatten-basierten Tests ist der Einsatz von enzymatischen Markierungen bekannt (siehe E. Lidell und I. Weeks, Antibody Technology, BIOS Scientific Publishers Limited, 1995). So katalysieren beispielsweise Enzyme den Umsatz eines Substrats in ein schwerlösliches, in aller Regel gefärbtes Produkt.
Eine weitere Möglichkeit des Nachweises molekularer Wechselwirkungen auf
Arrays besteht im Einsatz von Metallmarkierungen. Hierbei werden beispielsweise kolloidales Gold oder definierte Goldcluster mit den Targets gekoppelt, ggf. über bestimmte Vermittlermoleküle wie Streptavidin. Die durch die Goldmarkierung entstehende Färbung wird vorzugsweise durch nachfolgende Reaktion mit unedleren Metallen wie z.B. Silber verstärkt, wobei die mit den Targets gekoppelte
Goldmarkierung als Kristallisationskeim bzw. Katalysator beispielsweise für die Reduktion von Silberionen zu einem Silberniederschlag wirkt. Die mit Goldmarkierungen gekoppelten Targets werden im Folgenden auch als Goldkonjugate bezeichnet.
Bei dieser Ausführungsform des erfmdungsgemäßen Verfahrens kann auch eine relative Quantifizierung der Sonden-/Target- Wechselwirkung erfolgen. Die relative Quantifizierung der Konzentration der gebundenen Targets auf einem Sonden-Array durch Nachweis eines Präzipitats bzw. eines Niederschlags erfolgt über die Konzentration der mit den Targets gekoppelten Markierungen, die die Reaktion eines löslichen Substrats zu einem schwerlöslichen Niederschlag auf dem Array-Element, an dem eine Sonden/Target- Wechselwirkung stattgefunden hat, katalysieren bzw. als Kristallisationskeim für derartige Reaktionen wirken. Beispielsweise beträgt im Fall von mit Nanogold markierten HPLC-gereinigten Oligonukleotidsonden das Verhältnis von gebundenem Target zu Goldpartikel 1 : 1. In anderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann es ein Vielfaches oder auch einen Bruchteil davon betragen.
Die Detektion bei dieser Ausführungsfoπn des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens erfolgt somit durch Messung der Durchlichtabsoφtion oder Auflichtreflektion, die durch den Niederschlag hervorgerafen wird, der auf den Array-Elementen, an denen einen Sonden/Target- Wechselwirkung stattgefunden, durch die katalytische Wirkung der mit den gebundenen Targets gekoppelten Markierung erzeugt wird.
Die Lichtabsoφtion wird im Fall der Kopplung von kolloidalem Gold oder definierten Goldcluster mit den Targets bereits durch die Gegenwart dieser metallischen Markierungen hervorgerafen. Zur Verstärkung der Lichtabsoφtion wird allerdings vorzugsweise katalytisch durch derartige Wechselwirkungshybride, d.h. die mit einer Markierung wie beispielsweise kolloidalem Gold oder definierten
Goldclustern versehene Targets, ein nicht transparentes Präzipitat abgeschieden. Als besonders vorteilhaft hat sich im Fall von Goldkonjugaten die Verwendung von Silber als Präzipitat herausgestellt.
Im Folgenden wird der qualitative und/oder quantitative Nachweis der Sonden- /Target- Wechselwirkung durch Messung der Durchlichtabsoφtion anhand eines Beispiel erläutert. Selbstverständlich ist die im Folgenden beschriebene Vorgehensweise nicht auf die vorstehend beschriebene Silber/Gold-Färbung beschränkt, sondern kann entsprechend auf alle Nachweisverfahren angewendet werden, bei denen die gebundenen Targets mit einer Markierung versehen sind, die die Reaktion eines löslichen Substrats zu einem schwer löslichen Niederschlag auf dem Array-Element katalysiert, an dem einen Sonden/Target- Wechselwirkung stattgefunden hat bzw. die als Kristallisationskeim für die Umwandlung eines löslichen Substrats zu einem schwer löslichen Niederschlag auf dem Array-Element wirkt, an dem eine Sonden/Target-Wechselwirkung stattgefunden hat. Zunächst wird das Targetmolekül z.B. mittels PCR biotiniliert. Das PCR-Produkt wird gegen eine Substanzbibliothek (102), beispielsweise eine DNA-Bibliothek, hybridisiert. Anschließend werden dem erfindungsgemäßen Reaktionsgefäß (1) Streptavidin-funktionalisierte Goldkügelchen zugegeben, die mit den biotinilierten Hybriden, beispielsweise DNA-Hybriden reagieren. An den nun spezifisch an der Oberfläche gebundenen Goldkügelchen kann ein Silberniederschlag erzeugt werden, indem beispielsweise Silbernitrat mit Hydrochinon unter der katalytischen Wirkung von Gold reduziert wird (siehe u.a. WO 00/72018, DE 100 33 334.6, M.A. Hayat, In munogold-Silver Staining, CRC Press, New York, 1995).
Die Lichtabsoφtion durch das Silbeφräzipitat hängt von der Menge des abgeschiedenen Silbers ab. Folglich kann die Lichtintensität I, die das Präzipitat durchstrahlt, nach einem dem Lambert-Beerschen Gesetz ähnlichen Funktion berechnet werden:
I = I0 * exp ( - a * b ) (I)
Dabei ist I die Lichtintensität nach der Absoφtion, I0 die Lichtintensität vor der Absoφtion, a ein Absoφtionskoeffizient multipliziert mit der Abschattung pro
Flächeneinheit b durch das Silbeφräzipitat. Als Messgrößen stehen die Intensität I und die Zeit t zur Verfügung. Diese Messgrößen erhält man, indem das Trägerelement mit der Substanzbibliothek beleuchtet wird und das durchstrahlte Licht mit einer Kamera aufgenommen wird (siehe Abbildung 19). Diese Aufnahme wird in regelmäßigen Abständen wiederholt, während die Silberabscheidung durchgeführt wird. Die Helligkeitswerte der einzelnen Bibliotheksregionen (Spots) werden für jede Aufnahme ausgewertet, wodurch die Intensität I eines jeden Spot erhalten wird. Diese Helligkeitswerte können mittels Standardsoftware, wie zum Beispiel IconoClust® (Clondiag, Jena, Deutschland) automatisch berechnet werden. Durch Auftragen von I/I0 gegen die Zeit t erhält man die in Abbildung 20 dargestellten Messkurven. Das Lambert-Beersche Gesetz entsprechend der Gleichung (I) kann mit den derart erhaltenen Silberabscheidungszeitreihen auf folgende Weise in Zusammenhang gebracht werden.
Die Fläche F, die ein Silberkügelchen abschattet, beträgt:
F= π * r2 (II)
Da die Abscheidungsgeschwindigkeit pro Flächenelement für einen Spot als konstant angenommen werden kann, wächst der Radius r der Silberkügelchen ebenfalls mit konstanter Geschwindigkeit:
r = dr/dt * t (III)
Die Abschattung pro Flächeneinheit b durch das Silbeφräzipitat ist proportional zur der Zahl der Silberkügelchen pro Flächeneinheit N, der Abschattungsfläche pro Silberkügelchen F und einer Konstante k.
b = N* F *k (III)
Damit berechnet sich die Funktion für die Intensität I in Abhängigkeit von der Zeit t zu
I = I0 * exp ( - α' * t2 ), (IV)
wobei a' eine unbekannte zusammengesetzte Silberabsoφtionskonstante ist.
Für jede Silberabscheidungsreaktion muss eine eigene Abscheidungsrate angenommen werden, so auch für die unspezifische Reaktion an der Oberfläche: I = I0 * exp ( - Ω'tf * t2 ), (N)
wobei a'u die unspezifische Silberabsoφtionskonstante ist.
An jedem Spot i, findet also sowohl eine spezifische Abscheidungsreaktion als auch eine unspezifische Abscheidungsreaktion statt:
li = loi * ( exV ( -a'i * t2 ) + exV ( -a'H * ) ) + , (NI)
wobei O ein geräteabhängiger Offsetwert ist.
Die Zahl der Goldkügelchen, die pro Flächeneinheit abgeschieden werden, hängt einerseits von der Menge an mit Goldkügelchen markierten Targets und andererseits von der Bindungsstärke der Targets, beispielsweise der Target-D A, mit den Sonden, beispielsweise der Spot-DΝA, ab. Liegt kein Target in der Probe vor, das mit einer Sonde auf dem entsprechenden Array-Element wechselwirkt, so kommt es auch nicht zur Abscheidung von Goldkügelchen auf der Oberfläche dieses Array- Elements bzw. Spots. Ist die Bindung zwischen Sonde und Target schwach, so werden sich nur sehr wenige Goldkügelchen an der Oberfläche dieses Array- Elements absetzen.
Da b und damit a' direkt proportional zur Goldkügelchen - und damit Silberkügelchenanzahl N ist, stellt a' ein Maß für die Konzentration der Target-DΝA und der Bindungsstärke der Target-DΝA am Array-Element bzw. Spot i da.
In Abbildung 20 sind die Silberabscheidungszeitreihen zweier Spots dargestellt, die gegen eine Target-DΝA hybridisiert werden. Die DΝA-Sonden der Spots unterscheiden sich um eine Base, so dass die Target-DΝA zu der Sonde des einen Spot perfekt komplementär ist, während sie zu der Sonde des anderen Spots einen Mismatch aufweist. Aus den beiden Messkurven lässt sich durch nichtlineare Regression mit Hilfe der Gleichung (VI) die Silberabsoφtionskonstante a' berechnen. Im Falle des Perfect Match beträgt sie
2,566 x 10"6 sek"2 und im Falle des Mismatch 4,83 x 10"7 sek"2 (siehe auch Beispiel 2). Die beiden Konstanten unterscheiden sich damit um fast eine Zehneφotenz. Damit kann die Berechnung der Konstanten a ' als signifikante Messgröße für die Bindungsstärke und die Konzentration der Target-DNA an einem Spot genutzt werden. Des Weiteren kann man aus der Konstanten a' die Zeitkonstante τ der Abscheidungsreaktion bestimmen:
τt = (l l a'i Ϋ5 (NU)
Durch die Regression können als weitere Parameter I0 und O ermittelt werden. Mit der Lichtintensität I0 können Beleuchrungsinhomogenitäten der DΝA-Bibliothek korrigiert werden. Alternativ kann mittels des Abbildes der gesamten DΝA- Bibliothek zum Zeitpunkt t = 0 eine Flatfieldkorrektur aller weiteren Bilder, die für die Zeitreihe zu einem späteren Zeitpunkt aufgenommen wurden, vorgenommen werden. Anhand des Parameters O lässt sich die Nalidität einer Messung abschätzen.
Da die korrekte Anpassung einer Exponentialfunktion an die Messwerte einen nicht- linearen Regressionsalgorithmus, beispielsweise eine nicht-lineare Regression nach Marquardt (H.R. Schwarz, Numerische Mathematik, Teubner Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1998) erfordert, kann es vorteilhaft sein, auf eine weniger genaue, aber dafür robustere und daher lineare Methode zur Bestimmung der Messwerte aus den Zeitreihen zuzugreifen. Dazu werden die Zeitwerte quadriert und die Intensitätsmesswerte logarithmiert. Die so erhaltenen Werte werden dann an eine lineare Gleichung 1. Gerades angepasst. Die dabei erhaltenen Regressionsparameter können als Messwert und zur Testung der Validität herangezogen werden. Beleuchtungsinhomogenitäten lassen sich bei Verwendung einer linearen Methode über I0 nicht mehr korrigieren, es verbleibt aber die Möglichkeit der Flatfieldkorrektur. Eine weitere Variante der Auswertung besteht darin, nach einer festgelegten Zeit die Grauwerte der einzelnen Spots direkt als Messwerte zu verwenden. Dieses Verfahren hat allerdings die Nachteile, dass nicht im Voraus beurteilt werden kann, welcher Zeitpunkt zur Auswertung optimal ist und dass die Messwerte eine geringere statistische Sicherheit aufweisen. Darüber hinaus lässt sich eine etwaige Beleuchtungsinhomogenität nur über eine Flatfieldkorrektur durchführen.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird somit in Schritt c) der zeitliche Verlauf der Niederschlagsbildung an den Array-Elementen in Form von Signalintensitäten detektiert. Auf diese Weise kann eine genaue Bestimmung der relativen quantitativen Menge an gebundenen Targets gewährleistet werden. Eine derartige Vorgehensweise ist ausführlich in der internationalen Patentanmeldung WO 02/02810 beschrieben.
Wie bereits vorstehend erwähnt, sind die Targets vorzugsweise mit Markierungen versehen, die die Reaktion eines löslichen Substrats zu einem schwer löslichen Niederschlag auf dem Array-Element, an dem eine Sonden/Target- Wechselwirkung stattgefunden hat, katalysieren, bzw. Kristallisationskeim für derartige Reaktionen wirken.
Dabei können bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die Targets direkt mit derartigen Markierungen versehen sein.
Alternativ wird auf eine direkte Markierung der Targets verzichtet und die
Markierung erfolgt über Sandwich-Hybridisierung oder Sandwich-Reaktionen mit der mit dem Target wechselwirkenden Sonde und einer markierten Verbindung. Beispiele für eine derartige Vorgehensweise sind: - Sandwich-Hybridisierung mit einem zur Targetsequenz komplementären markierten Oligonukleotid.
- Sandwich-Hybridisierung von in Kettenform mit der Targetsequenz hybridisierenden markierten Oligonukleotiden: Unter in Kettenform mit der
Targetsequenz hybridisierenden markierten Oligonukleotiden wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Satz von markierten Oligonukleotiden verstanden, von denen mindestens eines Komplementarität sowohl zur Targetsequenz als auch zu einem weiteren Oligonukleotid aufweist. Die anderen Oligonukleotide sind selbstkomplementär bzw. wechselseitig zueinander komplementär, so dass während der Hybridisierung eine Kette von an der Targetsequenz gebundenen markierten Oligonukleotiden entsteht.
- Sandwich-Hybridisierung mit einem zur Targetsequenz komplementären Oligonukleotid, das mit einer vielfach markierten Struktur, beispielsweise einem
Dendrimer, beschrieben z.B. in WO 99/10362, gekoppelt ist.
Eine weitere bevorzugte Möglichkeit der Kopplung der Targets mit einer Markierang stellt das synthetische oder enzymatische Anfügen eines homopolymeren Bereichs, beispielsweise einer polyA-Sequenz, an die Targets unter Bildung einer fortlaufenden Sequenz dar, wie es beispielsweise in US 6,103,474 beschrieben ist. Bei dieser Ausfuhrungsform erfolgt die Markierang vorzugsweise über Sandwich- Hybridisierung mit einem zur Homopolymer-Sequenz komplementären markierten Oligonukleotid mit den vorstehend beschriebenen Variationen.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt eine Signalamplifikation durch Amplifikation von Teilen der an die Targets angefügten Homopolymersequenz bei gleichzeitigem Einbau von markierten Basen, insbesondere bevorzugt über einen RCA-Mechanismus durch Verwendung eines zirkulären einzelsträngigen Templates, das Komplementarität zur Homopolymersequenz aufweist.
Die nachfolgende Tabelle 1 gibt, ohne den Anspruch zu erheben, vollständig zu sein, einen Überblick über eine Reihe von in Frage kommenden Reaktionen, die geeignet sind, um zu einem Niederschlag an Array-Elementen zu führen, an denen eine Wechselwirkung zwischen Target und Sonde erfolgt ist:
Tabelle 1
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Die Markierang von biologischen Proben mit Enzymen bzw. Gold, insbesondere nanokristallinem Gold ist hinlänglich beschrieben (siehe u.a. F. Lottspeich und H. Zorbas, Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin, 1998; E. Lidell und I. Weeks, Antibody Technology, BIOS Scientific Publishers Limited, 1995).
Weitere Möglichkeiten für den Nachweis der Sonde/Target- Wechselwirkungen über unlösliche Präzipitate bei dem erfindungsgemäßen Verfahren sind beschreiben in: Immunogold-Silver Staining, Principles, Methods and Applications, Hrsg.: M.A.Hayat, 1995, CRC Press; Eur J Immunogenet 1991 Feb-Apr;18(l-2):33-55 HLA-DR, DQ and DP typing using PCR amplification and immobilized probes. Erlich H, Bugawan T, Begovich AB, Scharf S, Griffith R, Saiki R, Higuchi R, Walsh PS. Department of Human Genetics, Cetus Coφ., Emeryville, California 94608; Mol Cell Probes 1993 Jun;7(3): 199-207 A combined modified reverse dot-blot and nested PCR assay for the specific non-radioactive detection of Listeria monocytogenes. Bsat N, Batt CA. Department of Food Science, Comell University, Ithaca, NY 14853. Immunogenetics 1990;32(4):231-41 Erratum in: Immunogenetics 1991;34(6):413 Rapid HLA-DPB typing using enzymatically amplified DNA and nonradioactive sequence-specific oligonucleotide probes. Bugawan TL, Begovich AB, Erlich HA. Department of Human Genetics, Cetus Coφoration, Emeryville, CA 94608. Hum Immunol 1992 Dec;35(4):215-22 Generic HLA-DRB1 gene oligotyping by a nonradioactive reverse dot-blot methodology. Eliaou JF, Palmade F, Avinens O, Edouard E, Ballaguer P, Nicolas JC, Clot J. Laboratory of Immunology, Saint Eloi Hospital, CHU Montpellier, France. J Immunol Methods 1984 Nov 30;74(2):353-60 Sensitive visualization of antigen-antibody reactions in dot and blot immune overlay assays with immunogold and immunogold/silver staining. Moeremans M, Daneeis G, Van Dijck A, Langanger G, De Mey J. Histochemistry 1987;86(6):609-15 Non- radioactive in situ hybridization. A comparison of several immunocytochemical detection Systems using reflection-contrast and electron microscopy. Cremers AF, Jansen in de Wal N, Wiegant J, Dirks RW, Weisbeek P, van der Ploeg M, Landegent JE.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind u.a. folgende Varianten für den
Nachweis der Sonde/Target- Wechselwirkungen über unlösliche Präzipitate denkbar.
Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Targets mit einem Katalysator, vorzugsweise einem Enzym versehen, das die Umwandlung eines löslichen Substrats in ein unlösliches Produkt katalysiert. Die Reaktion, die zur Bildung eines Niederschlags an den Array-Elementen führt, ist in diesem Fall die Umwandlung eines löslichen Substrats in ein unlösliches Produkt in Gegenwart eines mit den Targets gekoppelten Katalysators, vorzugsweise Enzyms. Das Enzym wird vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Meerettichperoxidase, alkalischer Phosphatase und Glucoseoxidase. Das lösliche Substrat wird vorzugsweise ausgewählt aus der Grappe, bestehend aus 3,3'-Diaminobenzidin, 4- Chlor- 1 -naphthol, 3 -Amino-9-ethylcarbazol, p-Phenylendiamin-HCl/Pyrocatechol, 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin, Naphthol Pyronin, Bromchlorindoylphosphat, Nitrotetraazoliumblau und Phenazinmethosulfat. Beispielsweise wird ein farbloser löslicher Wasserstoffdonor, z.B. 3,3 '-Diaminobenzidin, in Anwesenheit von
Wasserstoffperoxid in ein unlösliches farbiges Produkt umgewandelt. Das Enzym Meerrettichperoxidase überträgt Wasserstoffionen aus den Donoren auf Wasserstoffperoxid unter Bildung von Wasser.
Bei einer bevorzugten Ausführangsform der vorliegenden Erfindung ist die
Reaktion, die zur Bildung eines Niederschlags an den Array-Elementen führt, die Bildung eines metallischen Niederschlags. Besonders bevorzugt ist die zur Bildung eines Niederschlags an den Array-Elementen führende Reaktion die chemische Reduktion einer Silberverbindung, vorzugsweise Silbemitrat, Silberlactat, Silberacetat oder Silbertartrat, zu elementarem Silber. Als Reduktionsmittel werden vorzugsweise Formaldehyd und/oder Hydrochinon eingesetzt.
Besonders bevorzugt erfolgt die Ausfällung der metallischen Verbindung in Gegenwart von mit den Targets gekoppelten Metallclustern bzw. kolloidalen Metallpartikeln, insbesondere Goldclustem oder kolloidalen Goldpartikeln. D.h. in diesem Fall stellen die Metallcluster bzw. kolloidalen Metallpartikel die mit den Targets gekoppelten Markierungen dar. Beispielsweise wird Silbemitrat in elementares Silber umgesetzt, wobei sich Silberionen aus der Lösung an Gold als Kristallisationskeim anlagern und in einem zweiten Schritt mit Hilfe eines Reduktionsmittels wie z.B. Formaldehyd oder Hydrochinon reduziert werden. Hierbei entsteht ein unlöslicher Niederschlag elementaren Silbers.
Bei einer alternativen Ausführungsforin erfolgt die Ausfällung der metallischen Verbindung in Gegenwart von mit den Targets gekoppelten Polyanionen. Wenn es sich beim Target selbst nicht um ein Poly-Anion handelt, dann besteht die Möglichkeit, ein solches zur Keimbildung einzusetzen. Das mit einem Poly-Anion markierte Target wird beispielweise einer Silbemitratlösung ausgesetzt. Dabei lagern sich die Silber-Kationen am Poly-Anion selektiv an. Danach werden mit einem Reduktionsmittel Silberionen in elementares Silber umgewandelt.
Die Kopplung der Enzyme bzw. Katalysatoren bzw. Metallcluster bzw. kolloidalen Metallpartikel bzw. Polyanionen an die Targets kann direkt oder über an die Targets gekoppelte Ankermoleküle erfolgen. Grundsätzlich besteht keine Notwendigkeit, das Target direkt mit den oben beschriebenen Markierungen zu versehen. Es besteht auch die Möglichkeit, über geeignete Ankermoleküle, z.B. Streptavidin, die an das Target gekoppelt werden, eine nachfolgende Ankopplung der Markierung zu erreichen.
Ein Konjugat bestehend aus dem jeweiligen Katalysator bzw. Kristallisationskeim und einem spezifischen Bindungspartner für das Ankermolekül erlaubt ebenfalls die Durchführung der oben beschriebenen Prozeduren. Die Reaktion, die zur Bildung eines Niederschlags an den Array-Elementen führt, ist dann die Bindung eines spezifischen Bindungspartners an ein an das Target gekoppeltes Ankermolekül darstellt.
Derartige Bindungspartner/Ankermolekül-Paare werden vorzugsweise ausgewählt aus der Grappe, bestehend aus Biotin/Avidin bzw. Streptavidin bzw. Anti-Biotin- Antiköφer, Digoxigeniii/Antidigoxigenin-Immunoglobulin, FITC/Anti-FITC- Immunoglobulin und DNP/Anti-DNP-lminunoglobulin.
In jeder der vorstehend beschriebenen Ausführungsformen wird katalytisch ein lösliches Substrat in ein unlösliches und ausfallendes Produkt umgesetzt. Aufgrund der Nähe zur Oberfläche wird das Produkt unmittelbar an der Oberfläche abgeschieden und bildet einen festen, für diverse Wäschen unempfindlichen Niederschlag. Femer ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung möglich, dass die Markierungen, insbesondere die Enzyme bzw. Metallcluster bzw. kolloidalen Metallpartikel bzw. Polyanionen, an die Targets vor, während oder nach der Wechselwirkung mit den Sonden gekoppelt werden.
Bei einer bevorzugten Ausfumτmgsform der vorliegenden Erfindung ist die Wechselwirkung zwischen dem Target und der Sonde eine Hybridisierung zwischen zwei Nukleotidsequenzen. Die Hybridisierung der Targets mit den auf einem Sonden-Array angeordneten Sonden findet nach einem der bekannten Standardprotokolle statt (siehe u.a. Lottspeich und Zorbas, 1998). Die entstandenen Hybride können durch kovalente Bindung, beispielsweise über Psoralen-Interkalation und nachfolgendes "Cross-Linking", oder wie in US 4,599,303 beschrieben, durch nichtkovalente Bindung, beispielsweise durch Bindung von Interkalatoren, stabilisiert werden.
Im Anschluss an die Hybridisierung der Targets mit den auf einem Sonden-Array angeordneten Sonden bzw. der Markierung der hybridisierten Targets erfolgt üblicherweise ein Waschschritt, mit dem unspezifisch und dadurch schwächer gebundene Komponenten entfernt werden.
Alternativ ist die Wechselwirkung zwischen dem Target und der Sonde eine Reaktion zwischen einer Antigenstruktur und dem entsprechenden Antiköφer oder einem hypervariablen Abschnitt davon oder eine Reaktion zwischen einem Rezeptor und einem entsprechenden Liganden.
Die Bindung oder Erkennung der Targets durch spezifische Sonden ist üblicherweise ein spontane nicht-kovalente Reaktion unter optimalen Bedingungen. Davon umfasst sind ebenfalls nicht-kovalente chemische Bindungen. Die Zusammensetzung des Mediums sowie weitere chemische und physikalische Faktoren beeinflussen die Geschwindigkeit und Stärke der Bindung. So erniedrigen beispielsweise bei der Nukleinsäure-Erkennung eine niedrigere Stringenz und höhere Temperaturen die Rate und Stärke der Bindung zwischen zwei nicht perfekt komplementären Strängen. Die Optimierung der Bindungsbedingungen ist für Antigen/Antiköφer- oder Ligand/Rezeptor- Wechselwirkungen ebenfalls erforderlich, die Bindungsbedingungen sind aber üblicherweise weniger spezifisch.
Der Nachweis der Gegenwart eines Niederschlags auf einem Array-Element erfolgt bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung durch Reflexion, Absoφtion oder Diffusion eines Lichtstrahls, vorzugsweise eines Laserstrahls oder einer
Leuchtdiode, durch den Niederschlag. Aufgrund seiner granulären Form modifiziert der Niederschlag die Reflexion eines Lichtstrahls. Femer führt der Niederschlag zu einer starken Lichtdiffusion die durch herkömmliche Detektionsvorrichtungen aufgezeichnet werden kann. Falls der Niederschlag wie beispielsweise der Silbemiederschlag als dunkle Oberfläche erscheint, kann auch die Absoφtion von Licht detektiert und aufgezeichnet werden. Die Auflösung der Detektion hängt dann von der Anzahl der Pixel der Kamera ab. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Detektion der Gegenwart eines Niederschlags auf einem Array-Element, in dem die Lichtquelle die Array-Elemente scannend mit einer Abtastgeschwindigkeit homogen beleuchtet, wobei die Abtastgeschwindigkeit besonders bevorzugt gewährleistet, dass eine Belichtungszeit der aufnehmenden Kamera alle Signale der Probe zu einem Bild vereinigt.
Beispielsweise kann der Nachweis der durch die spezifische Reaktion verstärkten Bereiche mittels eines sehr einfachen optischen Aufbaus im Durchlicht (Kontrast durch Abschattung) bzw. Auflicht (Kontrast durch Reflexion) erfolgen. Die detektierte Intensität des abgeschatteten Bereiches ist direkt proportional zur Belegungsdichte mit Markierungen wie beispielsweise Gold-Partikeln und dem Keimbildungszustandes der Partikel. Bei Verwendung eines Niederschlags, der elektrisch leitfähig ist oder dessen Dielektrizitätskonstante sich von der Umgebung unterscheidet, ist der Nachweis der Reaktion bei einer alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung auch elektrisch möglich.
Die elektrischen Messungen können über Leitfähigkeitsmessungen mittels
Mikroelektrodenarray-Anordungen oder über eine Anordnung von Mikrokapazitätssensoren oder über Potentialmessungen mittels Feld-Effekt- Transistoren- Arrays (FET-Arrays) erfolgen. Bei Leitfähigkeitsmessungen mittels Mikroelektroden wird die Änderung des elektrischen Widerstandes zwischen zwei Elektroden bei einer Abscheidungsreaktion verfolgt (E. Braun, Y. Eichen, U. Sivan, G. Ben-Yoseph, Nature, 775, vol 391, 1998). Bei Dielektrizitätsmessungen mit Mikrokapazitätssensoren wird die Änderung der Kapazität zweier zueinander angeordneten Elektroden gemessen (M. Madou, Fundamentals of Microfabrication, CRC Press, Boca Raton, 1997). Bei Potentiahnessungen mittels FET-Arrays wird die Änderung des Potentials auf den Sensoroberflächen gemessen (M. Madou, Fundamentals of Microfabrication, CRC Press, Boca Raton, 1997).
Bei Verwendung eines Substrates, das radioaktiv ist, oder radioaktiv markiert ist, kann der Nachweis der Gegenwart eines Niederschlags auf einem Array-Element durch Autoradiographie, Fluorographie und/oder indirekte Autoradiographie erfolgen. So wird bei der Autoradiographie eine mit strahlendem Präzipitat bedeckte Fläche direkt mit einem Röntgenfilm in Kontakt gebracht. Bei der Fluorographie wird eine mit strahlendem Präzipitat bedeckte Fläche mit fluoreszierenden Chemikalien wie z.B. Natriumsalicylat überschichtet, die die radioaktive
Strahlungsenergie in Fluoreszenz umwandeln. Bei der indirekten Autoradiographie mit Verstärkungsfolien (intensifier screens) wird eine mit ß-strahlendem Präzipitat bedeckte Fläche auf eine Verstärkerfolie gelegt, die die Strahlung in blaues Licht umwandelt. (siehe F. Lottspeich, H. Zorbas, siehe oben). Auf Radioaktivität basierende Detektionsverfaliren sind jedoch aufgrund der gesundheitlichen Risiken und der deswegen zu erfüllenden Sicherheitsvorschriften häufig unerwünscht.
Bei weiteren alternativen Ausfϊihrangsformen der vorliegenden Erfindung erfolgt der Nachweis der Gegenwart eines Niederschlags auf einem Array-Element durch Rasterelektronenmikroskopie, Elektronensonden-Mikroanalyse (EPMA), magnetooptische Kerr-Mikroskopie, magnetic force-Mikroskopie (MFM), atomic force-Mikroskopie (AFM), Messung des Mirage-Effekts, Rastertunnelmikroskopie (STM) und/oder Ultraschall-Reflexions-Tomographie.
Nahezu unabhängig von der Art des Substrates ist der Nachweis der Reaktion mittels SEM und/oder EPMA. Bei der Rasterelektronen-Mikroskopie (scanning electron microscopy (SEM)) tastet ein fokussierter Elektronenstrahl die Probe ab (J. Goldstein et al. Scanning Electron Microscopy and X-Ray Microanalysis, Plenum, New York, 1981). Bei der electron probe microanalysis (EPMA) werden die Sekundäφrozesse, die durch einen fokussierten Elektronenstahl ausgelöst werden, zur ortsaufgelösten Analyse genutzt (J. Goldstein et al. Scanning Electron Microscopy and X-Ray Microanalysis, Plenum, New York, 1981).
Bei Verwendung eines Substrates, das magnetisch ist, oder mit Magnetpartikeln markiert ist, kann der Nachweis der Reaktion durch Magnetooptische Kerr- Mikroskopie oder MFM erfolgen. Bei der Magnetooptischen Kerr-Mikroskopie wird die Drehung der Polarisationsebene des Lichtes durch magnetische Felder (Kerr- und Faradayeffekt) ausgenutzt (A. Hubert, R. Schäfer, Magnetic Domains, Springer, 1998).
Die Änderung der optischen Dichte durch das Substrat auf der Oberfäche infolge der Reaktion kann mittels des Mirrage-Effektes detektiert werden. Beim Mirrage-Effekt wird die lokale Erwärmung einer Oberfläche durch Absoφtion eines gebündelten Laserstrahls über die damit verbundene Brechungsindexänderung gemessen. Durch das Abrastem der Oberfläche erhält man ein Bild von den lokalen Oberflächenabsoφtionseigenschaften (A. Mandelis, Progress in Photothermal and Photoacoustic Science and Technology, Volume 1, Elsevier, New York 1992). Ein weiteres thermisches ortsaufgelöstes Verfahren zum Nachweis der Wechselwirkungsreaktion durch das Substrat ist eine Array- Anordung von Mikrothermophiles, die die Kristallisations- bzw. Abscheidungsenthalpien der Substratabscheidungen messen (J.M. Köhler, M. Zieren, Thermochimica acta, 25, vol 310, 1998).
Ebenfalls geeignet zum Nachweis der Reaktion mittels Substrat sind STM und AFM. Beim atomic force microscope (AFM) tastet eine Mikro- oder Nanospitze die Oberflächen ab, wodurch die Oberflächentopographie vermessen wird (E. Braun, Y. Eichen, U. Sivan, G. Ben-Yoseph, Nature, 775, vol 391, 1998). Das magnetic force microscope MFM detektiert über eine Nanospitze lokale magnetische Suszeptibilitätsunterschiede (A.Hubert, R. Schäfer, Magnetic Domains, Springer, 1998). Beim scanning tunneling microscop STM wird über eine Nanospitze der Tunnelstrom gemessen, um die Nanooberflächentopographie zu ermitteln (O. Marti, M. Amrein, STM and SFM in biology, Academic Press Inc., San Diego, 1993)
Exotischere Verfahren wie die Ultraschall-Reflexions-Tomograpliie können ebenfalls zur Anwendung kommen. Bei den Tomografien handelt es sich um Verfahren, bei denen scheibchenweise ein 3-dimensionales Bild zusammengetragen wird (F. Natterer, Mathematische Methoden der Computer-Tomographie, Westdt. Vlg., Wiesbaden, 1997). Im Falle der Ultraschall-Reflexions-Tomographie wird die Messung der Ultraschall - Reflexion ausgenutzt, um das Tomogramm zu erzeugen (V. Fleischer, F. Bergner, DGZfP NDT Conference Dresden 1997).
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Durchführung des vorstehend beschriebenen Verfahrens, umfassend: a) mindestens ein vorstehend beschriebenes erfindungsgemäßes Reaktionsgefäß; und b) eine Detektionsvorrichtung zum Nachweis der spezifischen Wechselwirkung.
Bei Verwendung einer reaktiv verstärkend wirkenden Färbemethode der
Wechselwirkung wie der vorstehend beschriebenen hnmunogold/Silber-Anfärbung kann die Detektion im Gegensatz zu den üblicherweise eingesetzten Fluoreszenzmessungen durch einfache Absoφtions- bzw. Reflexionsmessungen erfolgen, so dass die Gesamtkosten für die erfindungsgemäße Vorrichtung sehr niedrig sind.
Vorzugsweise wird die erfindungsgemäße Vorrichtung bei einem Nachweisverfahren eingesetzt, bei dem wie vorstehend beschrieben die Detektion über eine Reaktion erfolgt, die zu einem Niederschlag an den Array-Elementen führt, an denen eine Wechselwirkung zwischen Sonden und Targets stattgefunden hat. In dem
Reaktionsgefäß, das in die Detektionsvorrichtung bzw. das Lesegerät eingesetzt werden kann, bilden sich auf einigen Array-Elementen aufgrund der spezifischen Wechselwirkung der Probe bzw. des Targets mit den Sonden Wechselwirkungsprodukte in Form eines Niederschlags. Diese Wechselwirkungsprodukte weisen einen anderen Absoφtionskoeffizienten als die reinen Substanzen auf. Durch geeignete Reaktionen kann dieser Effekt wie vorstehend beschrieben erheblich verstärkt werden.
Die Detektionsvorrichtung ist vorzugsweise eine Kamera, insbesondere eine CCD- oder CMOS-Kamera oder ähnliche Kameras, die üblicherweise den gesamten Bereich des Sonden-Arrays aufzeichnet. Alternativ können auch scannende Verfahren für die Detektionsvorrichtung zum Auslesen des Reaktionsgefäßes eingesetzt werden. Bei speziellen Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Vorrichtung umfasst die Detektionsvorrichtung zusätzlich eine Ausleseoptik.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die erfindungsgemäße Vorrichtung zusätzlich mindestens eine Lichtquelle. Eine Lichtquelle im Rahmen der vorliegenden Erfindung gewährleistet vorzugsweise eine homogene Beleuchtung des Trägers. Besonders bevorzugt wird die Lichtquelle ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Lasern, Licht-emittierenden Dioden (LED), Flächenstrahlern und Hochdrucklampen.
Neben punktförmigen Lichtquellen können auch Lichtquellen in Form von Beleuchtungsarrays in der erfindungsgemäßen Vorrichtung Verwendung finden. Eine homogene Beleuchtung des Trägers kann in dieser Ausgestaltung beispielsweise dadurch gewährleistet werden, dass die Lichtquelle mehrere diffus strahlende Lichtquellen umfasst, deren Überlagerung in einer homogenen
Beleuchtung resultiert. So ermöglichen beispielsweise diffus streuende LED, die matrixfb'rmig angeordnet sind, auf kurze Entfernungen zur Probe eine homogene Beleuchtung.
Die Homogenität der Beleuchtung kann auch durch eine entsprechende
Strukturierung des Deckels des erfindungsgemäßen Reaktionsgefäßes erreicht werden. Auf diese Weise übernimmt der Deckel des erfindungsgemäßen Reaktionsgefäßes die Funktion einer Streuscheibe.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Lichtquelle in einen
Schwenkarm eingebaut, der zum Einführen des Reaktionsgefäßes in die Vorrichtung zur Seite geschwenkt werden kann. Danach ist er über das Reaktionsgefäß schwenkbar, um die Affinitätsmatrix zu beleuchten. Auf diese Weise kann das Reaktionsgefäß in einen Reaktionsgefäßhalter gedrückt werden, so dass die Substanzbibliothek in der richtigen Abbildungsebene liegt. Eine Nachfokussierung der Abbildungsoptik bzw. Ausleseoptik wird dadurch überflüssig. Alternativ kann das Lesegerät bzw. die Detektionsvorrichtung mit einer Fokussierungseinrichtung ausgestattet werden, um unterschiedliche Typen von Reaktionsgefäßen aufnehmen zu können.
Bei einer weiterem Ausgestaltung befindet sich in der erfindungsgemäßen Vorrichtung eine Justiervertiefung, in die der Deckel des Reaktionsgefäßes gedrückt werden kann. Dadurch wird eine Verdrehung der Affmitätsmatrix vermieden.
Die Komponenten eines beispielhaften Aufbaus einer erfindungsgemäßen
Vorrichtung zum optischen Nachweis einer Niederschlagsbildung bestehen aus einer leistungsschwachen (500 mcd) Lichtquelle, z.B. einer LED, zur homogenen Beleuchtung und einem Detektor, z.B. einer CCD-Kamera. Aufgrund des Verstärkungseffekts über die katalytische Abscheidung des Substrats, insbesondere bei der Verwendung eines Gold/Silber-Systems, sind die Änderungen der optischen Eigenschaften der Oberfläche derart ausgeprägt, dass ein einfacher Flachbettscanner, ein Diascanner oder ein vergleichbares Gerät zur Detektion des Niederschlags ausreicht.
Typische Detektionszeiten liegen deutlich unter einer Sekunde, während vergleichbare sensitive CCD-Systeme zur Detektion von Fluoreszenz etwa 10-18 Sekunden benötigen, so dass preiswerte Consumer-Kameras Verwendung finden können, deren Signalübertragung der Videonorm entspricht.
Bei einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung umfasst die Vorrichtung zusätzlich optische Filter. Derartige Filter ermöglichen zum einen die spektrale Eingrenzung der homogenen Beleuchtung und zum anderen die Beleuchtung der Proben mit verschiedenen Wellenlängen. Bei einer weiteren Variante umfasst die erfindungsgemäße Vorrichtung zusätzlich Filterwechsler. Mit diesen Filterwechslem können die optischen Filter schnell gewechselt werden und somit mögliche Fehlinformationen, die z.B. durch Verunreinigungen auftreten, eindeutig erkannt und eliminiert werden.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung, insbesondere wenn die Reflektivität des Trägerelements gemessen wird, umfasst die Vorrichtung zusätzlich einen halbdurchlässigen Spiegel zwischen Lichtquelle und Trägerelement. Bei dieser Ausfuhrungsform gelangt das Licht der Lichtquelle durch einen halbdurchlässigen Spiegel auf die Probe und das Bild wird in Reflexion durch den halbdurchlässigen Spiegel und ggf. die Ausleseoptik auf eine Kamera abgebildet.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform zur Messung der Reflektivität befindet sich zusätzlich ein Oberflächenspiegel auf der Unterseite des Trägerelements. Der Nachteil der schlechten Reflexion der Probe wird in dieser Ausgestaltung durch Transmissionseffekte ergänzt, indem das Beleuchtungslicht über eine Spiegelschicht hinter der Probe, entweder als eigenständiger Spiegel oder als auf der Rückseite des Probenträgers aufgetragene Schicht, reflektiert wird. Dabei kann beispielsweise ein Flächenstrahler auf der gegenüberliegenden Seite des Trägerelements und damit auch zum Sensor beispielsweise einer CCD-Kamera angeordnet werden. Auf diese Weise wird eine sehr kompakte Anordnung ermöglicht.
Bei einer weiteren Ausführungsform befindet sich die Probe in einer Küvette, die mittels einer Ausleseoptik unmittelbaren Kontakt zum Sensor einer CCD-Kamera hat. In diesem Fall ist die Ausleseoptik bzw. das Koppelmedium zwischen Küvette und Kamera vorzugsweise eine Faseφlatte, erhältlich beispielsweise von der Fimia Schott, oder ein Bildleitkabel. In dieser Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Reaktionsgefäß eine Küvette aus zwei planparallelen Platten mit dazwischenliegendem Probenvolumen. Der Chip mit der oberflächengebunden Substanzbibliothek ist in dieser Küvette eingesetzt und kann ähnlich wie Küvetten in einem Spektrometer ausgelesen werden. Vorzugsweise weist die erfindungsgemäße Vorrichtung zusätzlich eine Temperatursteuerungseinheit auf, durch die gewährleistet wird, dass die Probe während der Messung temperaturstabil gelagert wird. Dies gewährleistet die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse.
Bei einer weiteren Ausführungsform sind mehrere Reaktionsgefäße in der Vorrichtung so angeordnet, dass eine aufeinander folgende Detektion gewährleistet ist. Beispielsweise kann eine zeitlich versetzte, aufeinanderfolgende Auslesung durch Anordnung der Proben in Form von Magazinen oder einem Karussell in der erfindungsgemäßen Vorrichtung erreicht werden.
Femer ist es bevorzugt, dass die erfmdungsgemäße Vorrichtung zusätzlich einen Computer umfasst, der programmiert ist, um:
- die von der Detektionsvorrichtung aufgenommenen Signalintensitäten zu sammeln; und gegebenenfalls die Umwandlung der Signalintensitäten in ein analoges Bild zu gewährleisten.
Unter einem Bild wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Grappe von Pixeln verstanden, die eine Veranschaulichung der gemessenen Signalintensitäten für einen Sonden-Array darstellt und die direkt beispielsweise an einen Bildschirm oder einen Drucker zur Aufzeichnung übermittelt werden kann.
Wie bereits vorstehend ausfülirlich beschrieben, lässt sich durch zeitaufgelöste Detektion während des Verstärkungsprozesses durch die Ablagerung eines Niederschlags, wie beispielsweise elementarem Silber auf als Kristallisationskeimen wirkenden Goldpartikeln, und die Berechnung der relativen Belegungsdichten aus dem Zeitverhalten nach dem erfindungsgemäßen Verfahren die dynamische Auflösung der Messdaten selbst bei Verwendung einer 8 bit-Detektionstechnik extrem erhöhen. Der Aufbau einer hierzu nötigen Vorrichtung unterscheidet sich durch die mechanische Aufnahme einer Reaktionskammer und eine modifizierte Akquisitions-Software. Die Software, beispielsweise die Software Iconoclust® (Clondiag), ist dadurch gekennzeiclmet, dass sie die Verarbeitung der sukzessive aufgenommenen Aufnahmen gestattet. Hierzu werden die über den einzelnen Sondenarray-Elementen ermittelten Grauwerte zu jedem Zeitpunkt ermittelt. Für alle Array-Elemente wird die virtuelle Signalintensität in Abhängigkeit der Niederschlagbildung von der Zeit berechnet. Ausgehend von diesem Wert werden beispielsweise die Grauwerte der letzten Messung mit dem Produkt aus Rate und Messdauer in Beziehung gesetzt und damit eine Spreizung des Messbereichs erreicht. Somit ist selbst bei Verwendung von kostengünstigen 8 bit -Kameras eine ausgezeichnete Auflösung von schwachen neben starken Sonden/Target- Wechselwirkungen sowie eine genaue Quantifizierung der gebundenen Targets gewährleistet.
Das Miniaturisierungspotential eines solchen Aufbaus ist sehr hoch, so dass das gesamte System als autonomes Handgerät für den Feldeinsatz konzipiert werden kann. Femer kann die erfindungsgemäße Vorrichtung bei einer besonders bevorzugten Ausführangsform als hochintegrierte autonome Einheit realisiert werden. Damit sind hoch sensitive Anwendungen von Mikro-Arrays wie z.B. medizinische Diagnostik, Forensik, bakterielle Screening u.dgl. unabhängig von medizinischen bzw. biologischen Laboratorien von Laien schnell durchführbar.
Das erfindungsgemäße Reaktionsgefäß umfasst somit ein Standard- Laborreaktionsgefäß bzw. Standard-Microtube mit einem an einer der Grundflächen, z. B. an der Spitze oder im Deckel eines herkömmlichen Reaktionsgefäßes wie z.B. einem handelsüblichen Eppendorff-Tube, insertierten Träger bzw. Chip bzw. Array.
Diese Gestaltung erlaubt eine wesentlich leichtere Handhabbarkeit und eine höhere
Reproduzierbarkeit. Lösungen können leicht in das erfindungsgemäße Reaktionsgefäß pipeltiert werden und unter Verwendung von in nahezu jedem, insbesondere in molekularbiologischen Laboren vorhandener Microtube- Ausstattung inkubiert und verarbeitet, z. B. zentrifugiert werden.
Im Folgenden werden spezielle Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Vorrichtung anhand von Abbildungen detailliert beschrieben:
In den Abbildungen 5 bis 12 werden verschiedene optische Prinzipien verdeutlicht, die zum Auslesen von oberflächengebundenen Substanzbibliotheken (102) herangezogen werden können. In dem Reaktionsgefäß, das in das Detektions- bzw. Lesegerät eingesetzt wird, findet eine spezifische Wechselwirkung der Probe bzw. des Targets mit Sonden einiger Bibliothekselemente der Substanzbibliothek (102) statt, wodurch sich auf einigen Flächen Wechselwirkungsprodukte bilden.
Diese Wechselwirkungsprodukte weisen einen anderen Absoφtionskoeffizienten als die reinen Substanzen auf, wobei dieser Effekt durch geeignete Reaktionen noch erheblich verstärkt werden kann. Durch die in den Abbildungen 5 bis 17 dargestellten Auslesesysteme (1000) die Absoφtions- oder Reflektionsverhältnisse der oberflächengebundenen Substanzbibliothek vor, während und/oder nach der Wechselwirkungsreaktion abgebildet.
In den Abbildungen 5 bis 12 wurde zur besseren Verdeutlichung des Ausleseprinzips die Darstellung des Reaktionsgefäßes (1) auf die Darstellung der oberflächengebundenen Substanzbibliothek (100) beschränkt. In den Abbildungen 13 bis 17 sind zwei konkrete Ausführungsformen zum Abbilden eines Niederschlages auf oberflächengebundenen Substanzbibliotheken (100) dargestellt. Anstelle der hier abgebildeten Lesegeräte (1000) können auch scannende Verfahren zum Auslesen der Reaktionsgefäßes (1) eingesetzt werden. Des Weiteren erfolgt die Beschreibung der Abbildung 5 bis 17 anhand der Verwendung von DNA-Chips (100) in Verbindung mit der vorstehend beschriebenen Silberabscheidungsreaktion, ist aber selbstverständlich nicht auf diese beschränkt.
In Abbildung 5 ist die prinzipielle Anordnung der erfindungsgemäßen Vorrichtung zum Auslesen der Reaktionsgefäßes (1) dargestellt. Licht einer inkohärenten Lichtquelle (1001) leuchtet mittels einer Beleuchtungsoptik (1002) die oberflächengebundene DNA-Bibliothek auf einem Bibliothekenchip (100) aus, der sich in einem Tube (1) befindet. Mittels einer Ausleseoptik (1004) wird das Signal von einer CCD-Kamera ( 1005) aufgenommen.
Die Abbildung 6 zeigt die gleiche Anordnung wie die der Abbildung 5, mit der Variante, durch Einbringen von optischen Filtern (1006) in den Beleuchtungsstrahlengang den spektralen Bereich der Beleuchtung einzugrenzen. Licht einer inkohärenten Lichtquelle (1001) leuchtet mittels einer Beleuchtungsoptik (1002) die oberflächengebundene DNA-Bibliothek auf einem Bibliothekenchip (100) aus, der sich in einem Reaktionsgefäß (1) befindet. Mittels einer Ausleseoptik (1004) wird das Signal von einer CCD-Kamera (1005) aufgenommen. Die Möglichkeit, diesen Filter mittels Filterwechsler (1007) schnell zu wechseln, hat für die Auswertung den Vorteil, mögliche Fehlinformationen, die z.B. durch Verunreinigungen auftreten, eindeutig zu erkennen und zu eliminieren.
In der in Abbildung 7 gezeigten Vorrichtung wird die Punktlichtquelle (1001) durch ein Beleuchtungsarray (1008) ersetzt. Licht eines Beleuchtungsarray (1008) leuchtet mittels einer Beleuchtungsoptik (1002) die oberflächengebundene DNA-Bibliothek (102) auf einem Bibliothekenchip (100) aus, der sich in einem Reaktionsgefäß (1) befindet homogen aus. Mittels einer Ausleseoptik (1004) wird das Signal von einer CCD-Kamera (1005) aufgenommen. Vorzugsweise diffus streuende LED, matrixförmig angeordnet, ermöglichen auf kurze Entfernungen zur Probe eine homogene Beleuchtung. In der Anordnung der erfindungsgemäßen Vorrichtung gemäß Abbildung 8 wird ein kompaktes Lesegerät (1000) dargestellt, bei der der CCD-Sensor (1005) der Kamera unmittelbar mit der Affinitätsmatrix (100) kontaktiert ist. Dieser Kontakt kann auch durch den Einsatz einer Faseφlatte (1012) oder bei noch größeren Abständen durch ein Bildleitkabel hergestellt werden, wenn ein unmittelbarer Kontakt nicht möglich ist. Licht einer inkohärenten Lichtquelle (1001) leuchtet mittels einer Beleuchtungsoptik (1002) die oberflächengebundene DNA-Bibliothek auf einem Bibliothekenchip (100) aus, der sich in einem Reaktionsgefäß (1) befindet. Das Signal der Probe wird direkt von einer CCD-Kamera (1005) aufgenommen.
In dem in Abbildung 9 gezeigten Lesegerät (1000) werden die Proben im Auflicht vermessen. Im Unterschied zu den vorher beschriebenen Lesegeräten bzw. Detektionsvorrichtungen (1000) wird bei diesem Gerät die Reflektivität der DNA- Bibliothek (102) gemessen. Licht einer inkohärenten Lichtquelle (1001) leuchtet mittels einer Beleuchtungsoptik (1002) durch einen halbdurchlässigen Spiegel die oberflächengebundene DNA-Bibliothek auf einem Bibliothekenchip (100) aus, der sich in einem Reaktionsgefäß (1) befindet. Durch den halbdurchlässigen Spiegel (1009) wird das reflektierte Signal auf die Ausleseoptik (1004) umgelenkt und von dieser auf eine CCD-Kamera (1005) abgebildet.
Da der Silbemiederschlag keine sehr guten Reflexionseigenschaften besitzt, ist bei Auflichtmessungen die in Abbildung 10 gezeigte Anordnung vorteilhaft. Licht einer inkohärenten Lichtquelle (1001) leuchtet mittels einer Beleuchtungsoptik (1002) durch einen halbdurchlässigen Spiegel die oberflächengebundene DNA-Bibliothek (102) auf einem Bibliothekenchip (100) aus, der sich in einem Reaktionsgefäß (1) befindet. Durch den halbdurchlässigen Spiegel (1009) wird das reflektierte Signal auf die Ausleseoptik (1004) umgelenkt und von dieser auf eine CCD-Kamera (1005) abgebildet. Der Nachteil der schlechten Reflexion der Probe wird durch Transmissionseffekte ergänzt, indem das Beleuchtungslicht über eine Spiegelschicht (1010) hinter der Probe, entweder als eigenständiger Spiegel oder als auf der Rückseite des Probenträgers aufgetragene Schicht, reflektiert wird.
Abbildung 11 zeigt die mögliche Anordnung der erfindungsgemäßen Vorrichtung in einem transparenten Probenraum, vorzugsweise in einer Küvette (1011), die durch die optisch planen Außenflächen eine gute Kopplung des Empfängers mittels Faseφlatte (1012) an den Probenraum ermöglichen. Licht einer inkohärenten Lichtquelle (1001) leuchtet mittels einer Beleuchtungsoptik (1002) durch die transparente Wand der Küvette die oberflächengebundene DNA-Bibliothek (102) auf einem Bibliothekenchip (100) aus. Durch die transparente Wand der Küvette wird das Signal der Probe direkt von einer CCD-Kamera (1005) aufgenommen. Als Koppelmedium zwischen Küvette und CCD-Kamera kann eine Faseφlatte (1012) oder ein Bildleitkabel verwendet werden.
Die in der Abbildung 12 gezeigte Vorrichtung stellt eine sehr kompakte Anordnung des in Abbildung 11 dargestellten Lesegerätes (1000) dar. Bei dem Einsatz von diffusen Flächenstrahlem (1013), die z.B. auf Elektrolumineszenz- oder Kaltkathodenfluoreszenz- Verfahren beruhen, lassen sich sehr kompakte Sensoren realisieren. Licht einer inkohärenten Lichtquelle (1001) in diesem Falle eines diffusen Flächenstrahlem (1013) leuchtet durch die transparente Wand der Küvette den Bibliothekenchip (100) direkt aus. Das Signal der Probe wird direkt von einer CCD-Kamera (1005) aufgenommen.
In den Abbildung 13 und 14 ist ein Ausführungsbeispiel in der Aufsicht und als Schnittzeichnung eines Lesegerätes (1000) dargestellt. Das Arbeitsprinzip entspricht dem des in Abbildung 1 dargestellten Vorrichtung. Zwischen der Affinitätsmatrix (100) und der abbildenden Optik (1004) wurde ein Umlenkspiegel eingebaut, um zu kompakten Geräteausmaßen zu kommen. Das Licht der Lichtquelle (1008) leuchtet in das Reaktionsgefäß (1) und anschließend durch den DNA-Chip (100) auf einen Umlenkspiegel. Von dort wird die Abbildung des DNA-Chips (100) über die Abbildungsoptik (1004) auf eine CCD-Kamera (1005) projiziert. Die Lichtquelle (1008) besteht aus Leuchtdioden, die in einen Schwenkarm eingebaut sind, der zum Einfuhren des Reaktionsgefäßes (1) in das Lesegerät (1000) zur Seite geschwenkt werden kann. Danach wird er über das Reaktionsgefäß (1) geschwenkt, um die Affmitätsmatrix (100) zu beleuchten. Dabei drückt er das Reaktionsgefäß (1) in den Reaktionsgefäßhalter (1100), so dass die DNA-Bibliothek (102) in der richtigen Abbildungsebene liegt. Eine Nachfokussierung der Abbildungsoptik (1004) wird dadurch überflüssig. Auf der Oberseite befindet sich eine Justiervertiefung (1102), in die der Deckel des Reaktionsgefäßes (1) gedrückt wird. Dadurch wird eine Verdrehung der Affinitätsmatrix (102) vermieden. Um die Bedingungen in dem Reaktionsgefäß (1) reproduzierbar zu halten, befindet sich an dem Reaktionsgefäßhalter (1100) ein Peltierelement (1200). Dadurch kann die Temperatur im Reaktionsgefäß (1) geregelt werden. Der Reaktionsgefäßhalter (1100) kann zudem mit einer Widerstandsheizung versehen werden, um auch höhere Temperaturen einstellen zu können. Alternativ kann der Reaktions gefäßhalter (1100) auch mit umlaufenden Kühlmedien temperiert werden.
In Abbildung 15 wird ein Lesegerät (1000) dargestellt, dass sich von dem in der Abbildung 13 dadurch unterscheidet, dass der Schwenkarm (1101) durch einen Schieber (1300) ersetzte wird. Der Schieber (1300) wird über ein Linearlager (1310) über das Reaktionsgefäß (1) geschoben. Dabei drückt ein Schlitten (1320) durch vier Druckfedern (1321) das Reaktionsgefäß (1) in den Reaktionsgefäßhalter (1100). Ein Justierspalt (1322) umgreift den Deckel (3) des Reaktionsgefäßes (1) derart, dass durch die Schiebebewegung des Schiebers (1300) das Reaktionsgefäß (1) in seine richtige Position gedreht und fixiert wird. In der Abbildung 17 wird die Lage des Schiebers (1300) zum Reaktionsgefäß (1) bei geöffnetem Reader dargestellt. Der Schlitten (1300) bewegt sich entlang des dort dargestellten Pfeils und verschließt dadurch den das Reaktionsgefäß (1). Gleichzeitig wird die Lichtquelle (1008) über das Reaktionsgefäß (1) geschoben, so dass mit dem Lesegerät (1000) gemessen werden kann. Bei geschlossenem Schieber (1300) liegt der Schlitten (1320) zwischen Lichtquelle und Reaktionsgefäß (1). Der Schlitten weist daher eine Detektionsöffhung (1323) auf, um die Affinitätsmatrix (100) beleuchten zu können.
Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung und sollen in nicht einschränkender Weise ausgelegt werden.
Beispiele
Beispiel 1: Herstellung des Reaktionsgefäßes (1)
Es wurde ein Standard-Reaktionsröhrchen aus Polypropylen mit 1,5 ml- Nemiaufiiahmevolumen der Firma Eppendorf zum Umschmelzen verwendet. Dazu wurde das Reaktionsröhrchen an der Unterseite gekappt und von den Seiten her etwas Material abgedreht. Anschließend wurde es auf einen Stift gesteckt und unter Kraft auf eine heiße Form gedrückt, die den Durchbrach bzw. die Aussparung (8), die Chipauflage (6) sowie den Kleberand (7) in das Röhrchen einprägte (siehe Abbildung 1).
Beispiel 2: Nachweis und Spezifität der Hybridisierung von Nukleinsäuren im Reaktionsgefäß (1) mittels Silberdetektion
a) Testsystem
Das humane cyp2D6-Gen kodiert für ein humanes Cytochrom-P450. Dieses Enzym spielt eine wichtige Rolle beim Metabolismus diverser Drogen und Wirkstoffe. Mutationen im cyp2D6-Gen können zu Überempfindlichkeit oder Unverträglichkeit gegenüber bestimmten Medikamenten führen. Mindestens 14 solcher Mutationen (Punktmutationen und Deletionen) sind für cyp2D6 beschrieben. Für eine Auswahl dieser Mutationen (G1749C, dT1795, G1934A, G2064A) sollte getestet werden, ob in einer zu analysierenden Probe der jeweilige Wildtyp oder die Mutation vorhanden ist. b) Herstellung der DNA-Bibliothek (102) und Assemblierung mit dem Reaktionsgefäß (1)
Auf einer epoxidierten Glasoberfläche (Objektträgergröße: 75 mm x 25 mm) (101) wurden mit einem MicroGrid II-Arrayer (Fa. BioRobotics, Cambridge, Großbritannien) 40 aminomodifizierte Oligonukleotide (Sonden) mit einer Länge von 21-25 Nukleotiden an definierten Stellen abgelegt und kovalent immobilisiert (Bibliotheks- bzw. Array-Elemente). Die Sonden gliederten sich in Paare von Bibliothekselementen, wobei die erste jeweils den Wildtyp und die zweite die Mutation darstellt.
Die Sequenzen der Oligonukleotide waren wie folgt (Sequenz in 5' - 3'-Richtung mit 5'-NH2-Modifikation):
Name Sequenz
G1749C-WT GCTTCTCCGTGTCCACCTTGC
G1749C GCTTCTCCGTCTCCACCTTGC
G1749C-WT-2 GCGCTTCTCCGTGTCCACCTT
G1749C-2 GCGCTTCTCCGTCTCCACCTT
G1749C-WT-4 AGGCGCTTCTCCGTGTCCACC
G1749C-4 AGGCGCTTCTCCGTCTCCACC
G1749C-WT+2 TTCTCCGTGTCCACCTTGCGC
G1749C+2 TTCTCCGTCTCCACCTTGCGC
G1749C-WT+4 CTCCGTGTCCACCTTGCGCAA
G1749C+4 CTCCGTCTCCACCTTGCGCAA dT1795-WT GCTGGAGCAGTGGGTGACCGA dT1795 GCTGGAGCAGGGGTGACCGAG dT1795-WT-2 TCGCTGGAGCAGTGGGTGACC dTl 795-2 TCGCTGGAGCAGGGGTGACCG dT1795-WT-4 AGTCGCTGGAGCAGTGGGTGA dT1795-4 AGTCGCTGGAGCAGGGGTGAC dT1795-WT+2 TGGAGCAGTGGGTGACCGAGG dT1795+2 TGGAGCAGGGGTGACCGAGGA dT1795-WT+4 GAGCAGTGGGTGACCGAGGAG dT1795+4 GAGCAGGGGTGACCGAGGAGG
G1934A-WT CCCACCCCCAGGACGCCCCTT
G1934A CCCACCCCCAAGACGCCCCTT
G1934A-WT-2 CTCCCACCCCCAGGACGCCCC
G1934A-2 CTCCCACCCCCAAGACGCCCC
G1934A-WT-4 ATCTCCCACCCCCAGGACGCC
G1934A-4 ATCTCCCACCCCCAAGACGCC
G1934A-WT+2 CACCCCCAGGACGCCCCTTTC
G1934A+2 CACCCCCAAGACGCCCCTTTC
G1934A-WT+4 CCCCCAGGACGCCCCTTTCGC
G1934A+4 CCCCCAAGACGCCCCTTTCGC
G2064A-WT TAGCTCAGGAGGGACTGAAGGAGGA
G2064A TAGCTCAGGAGGAACTGAAGGAGGA
G2064A-WT-2 CCTAGCTCAGGAGGGACTGAAGGAG
G2064A-2 CCTAGCTCAGGAGGAACTGAAGGAG
G2064A-WT-4 GACCTAGCTCAGGAGGGACTGAAGG
G2064A-4 GACCTAGCTCAGGAGGAACTGAAGG
G2064A-WT+2 GCTCAGGAGGGACTGAAGGAGGAGT
G2064A+2 GCTCAGGAGGAACTGAAGGAGGAGT
G2064A-WT+4 TCAGGAGGGACTGAAGGAGGAGTCG
G2064A+4 TCAGGAGGGACTGAAGGAGGAGTCG
Eine einzelne komplette (rechteckige) DNA-Bibliothek (102) auf der Objektträger- Oberfläche (101) bestand aus insgesamt 12 x 10 = 120 abgelegten Bibliothekselementen und 7 Markierungen zur optischen Orientierang der Abbildung des Lesegerätes (1000). Jede der 40 Oligonukleotid-Sonden wurde dabei in dreifacher Wiederholung auf der DNA-Bibliothek (102) abgelegt (zur Anordnung der Bibliothekselemente siehe Abbildung 18). Die Bibliothekselemente hatten einen Abstand von 0,2 mm, die gesamte DNA-Bibliothek (102) bedeckte eine Fläche von 2,4 mm x 2,4 mm. Insgesamt konnten auf diese Weise pro Objektträger über 100 identische DNA-Bibliotheken (102) erzeugt werden.
Das Ablegen der Bibliothekselemente auf die Objektträger erfolgte aus einer jeweils 10 μM-Lösung der Oligonukleotide in 0,1 M Phosphatpuffer/2,2%-Natriumsulfat. Anschließend wurden die Bibliothekselemente durch 30-minütiges Backen bei 60 °C kovalent mit den Epoxid-Grappen auf der Glasoberfläche verknüpft. Es folgte ein mehrteiliger Waschprozess der in folgender Reihenfolge:
• 5 min in 600 ml H2O bidest + 600 μl Triton xl 00 • 2 x 2 min in 600 ml H2O bidest + 60 μl HCL (konz.)
• 30 min in 100 mM KCl-Lösung
• 1 min in H2O bidest spülen
• mit Druckluft trocknen
Nach Beendigung der Waschschritte und Trocknen der Objektträger wurden diese in 3,15 mm x 3,15 mm große Glasstücke (nachfolgend DNA-Chip (100) genannt) zerschnitten. Auf jedem der Chips (100) befand sich genau eine DNA-Bibliothek (102) der Größe 2,4 mm x 2,4 mm. Anschließend wurden die Chips (100) in der wie in Abbildung 1 dargestellten Weise in das Reaktionsgefäß (1) eingefügt und mit Polydimethlysiloxan, das in den Kleberand (7) gegeben wurde, verklebt. c) Vorbereitung der Targets für die Hybridisierung gegen die DNA-Bibliothek Als zu analysierende Probe (im Folgenden Target genannt) diente eine gegen das Exon 3/4 von cyp2D6 gerichtete biotinmarkierte PCR einer Patienten-DNA (KDL24, durch Sequenzierung als Wildtyp für die betreffenden Mutationen genotypisiert). Der verwendete PCR-Ansatz sah wie folgt aus:
• Primer 1 : cyp2D6_ 3/4-f, Sequenz 5 '-CACGCGCACGTGCCCGTCCCA-3', Endkonzentration 200 nM
• Primer 2: cyp2D6_ 3/4r-5'Bio, Sequenz 5 '-Bio-CTCTCGCTCCGCACCTCGCGCAGA-3 ' , Endkonzentration 200 nM
• dNTPs, Endkonzentration 200 μM
• Advantage cDNA-Polymerase-Mix (50fach, Clontech, Palo Alto, USA), Endkonzentration lfach
• Advantage cDNA PCR reaction buffer (1 Ofach, Clontech, Palo Alto, USA), Endkonzentration lfach
• Template-DNA (KDL24), 80 ng
• Wasser ad 50 μl
Anschließend wurde die PCR nach folgendem Programm durchgeführt: 1 Denaturierung (10 min, 95°C)
2 Denaturierung (30 s, 95°C)
3 Annealing (30 s, 65°C)
4 Elongation (80 s, 72°C)
5 29fache Wiederholung der Schritte 2-4 6 Elongation (7 min, 72°C)
7 Kühlen (4°C, bis zur weiteren Bearbeitung) d) Hybridisierung und Konjugation der Sondenarrays im Reaktionsgefäß (1) Für die Hybridisierungs-Reaktion im Reaktionsgefäß (1) wurden 4 μl des hergestellten PCR-Produktes mit 146 μl 6x SSPE-Puffer (52,59 g NaCl, 8,28 g NaH2PO4 x H2O, 2,22 g EDTA x 2H2O in 11 H2O bidest, auf pH 7,4 mit NaOH eingestellt)/0,l % SDS vermischt und in das fertig assemblierte Reaktionsgefäß (1) gegeben. Nach einer Denaturierang der Hybridisierungslösung (5 min 95 °C) folgte eine Inkubation unter leichtem Schütteln für 60 min bei 65 °C. Anschließend wurde die Hybridisierungslösung aus dem Reaktionsgefäß (1) abgesaugt. Es schlössen sich zwei Waschschritte an: je 10 min in 2xSSC/0,2 % SDS (500 μl bei 30 °C) und 2xSSC (500 μl bei 20°C). Danach wurde die vorbereitete Konjugationslösung (Streptavidin-Gold, British Biocell International, EM.STP5, Endkonzentration 250pg/μl in 6xSSPE/0,l% SDS) auf den Chip (100) im Reaktionsgefäß (1) gegeben und das Reaktionsgefäß (1) 15 min bei 37 °C inkubiert. Nach dem Absaugen der Konjugat-Lösung wurde der Chip (100) im Reaktionsgefäß (1) je 10 min in 2x SSC/0,2 % SDS (500 μl bei 30 °C), 2x SSC (500 μl bei 20 °C) und 0,2x SSC (500 μl bei 20°C) unter Schütteln gewaschen.
e) Detektion
Zur Silberverstärkung wurde der eingebaute Chip (100) im Reaktionsgefäß (1) mit einer Silberentwicklungslösung (British Biocell International, SEKL15, Cardiff, Großbritannien) überschichtet und das Reaktionsgefäß (1) in das Silberlesegerät (1000) eingeführt. Das Lesegerät (1000) besteht aus einer Probenaufnahme mit Temperierung, der Auslesestrecke und einem Schwenkarm (1101) mit der Beleuchtung (siehe Abbildungen 13 und 14). Die Proben wurden in Transmission mittels eines diffus leuchtenden Arrays aus mehreren LED (1008) beleuchtetet. Ein zusätzlicher Diffusor ermöglichte die homogene Beleuchtung der Proben mit Abweichungen von weniger als 10 % vom Maximum.
Ausgelesen wurde die Probe in Transmission. Dazu wurden die Proben in die vorgesehene Aufnahme gesteckt. Die Lagerichtigkeit der Proben wurde gewährleistet durch eine spezielle Ausformung der Aufnahme (1102). In diese wurde das Reaktionsgefäß (1) mit geöffnetem Verschluss eingelegt. Der Deckel des Reaktionsgefäßes (1) lässt in dieser Position keine Verdrehungen der Affinitätsmatrix (100) zu. Nur bei Lagerichtigkeit ist das Einschwenken der Beleuchtung in die Messstellung möglich. In der Messstellung fixiert der
Schwenkarm gleichzeitig das Reaktionsgefäß (1) und damit die Affinitätsmatrix.
Für das Auswerteverfahren hat es sich als vorteilhaft erwiesen, dass zum Auslesen eine verzeichnungsfreie Ausleseoptik (1004) verwendet wird. Durch die Verwendung einer Optik mit großer Tiefenschärfe erübrigte sich eine Justierung der Proben zur Kamera. Das Scharfstellen war überflüssig. Je nach Dichte der Substanzen pro Flächeneinheit auf der Affinitätsmatrix ist die verwendete CCD- Kamera (1005) entweder im CCIR-Format oder noch höher auflösend. Während der Messung wurden die Proben durch eine Widerstandsheizung und ein Peltierelement (1200) temperaturstabil gehalten.
Die Silberentwicklungslösung wurde durch Mischen von gleichen Teilen Initiator- und Enhancer-Lösung hergestellt. Während der 20-minütigen Inkubation bei 25 °C (± 0,1 °C) wurde der zeitliche Verlauf der Silberverstärkung durch ein Fotoserie (alle 10 s ein Bild) dokumentiert (siehe Abbildung 19)
Die optische Dichte der Bibliothekselemente aller Bilder der Zeitreihe wurde anschließend mit der Bildauswertungs-Software IconoClust® der Firma Clondiag® ermittelt. In Abbildung 20 sind die Zeitreihen für das Element G1934A+4 (Mutation) und G2064A-WT (Wildtyp) dargestellt.
Entsprechend der in der Beschreibung angegebenen Vorgehensweise zur Auswertung wurden die Messwerte aβi934A+4 und ac2064A-wτ berechnet. Sie betragen IGI934A+4 = 4.83 * 10"7 sek"2 und 2.566 * 10"6 sek"2. Beschreibungen der Abbildungen
Abbildung 1:
In den Boden eines Reaktionsgefäßes (2) ist ein Durchbrach bzw. eine Aussparung (8) eingearbeitet mit einer Auflagefläche (6), auf die die Affmitätsmatrix (100) von außen aufgelegt werden kann.
Die Affinitätsmatrix (100) wird verklebt, indem der Klebstoff in einen dafür vorgesehenen Klebrand (7) gegeben wird.
Abbildung 2:
In den Boden eines Reaktionsgefäßes (2) ist ein Durchbruch (10) mit einer
Auflagefläche (11) eingearbeitet, auf die die Affinitätsmatrix (100) von innen aufgelegt werden kann.
Die Affinitätsmatrix (100) wird verklebt, indem der Klebstoff in einen dafür vorgesehenen Klebrand (9) gegeben wird.
Abbildung 3:
Der Boden eines Reaktionsgefäßes (2) ist mit einem Klemmverbindung (201) versehen. Auf diese Klemmverbindung (201) kann ein Chipträger (200) flüssigkeitsdicht gedrückt werden. Der Chipträger weist einen Durchbrach (10) auf, in den auf einer dafür vorgesehenen Auflagefläche die Affinitätsmatrix (100) gelegt und dann verklebt werden kann.
Abbildung 4: In der in Abbildung 4 gezeigten Ausführangsform wird die Affinitätsmatrix (100) zwischen dem Reaktionsgefäß (2) und einer Klemmhülse (300) flüssigkeitsdicht verklemmt, so dass eine Verklebung nicht unbedingt notwendig ist. Abbildung 5:
Abbildung 5 zeigt eine prinzipielle Anordnung zum Auslesen eines Arrays im erfindungsgemäßen Reaktionsgefäß. Licht einer inkohärenten Lichtquelle (1001) leuchtet mittels einer Beleuchtungsoptik (1002) die oberflächengebundene DNA- Bibliothek auf einem Bibliothekenchip (100), der sich in einem Tube befindet, homogen aus. Mittels einer Ausleseoptik (1004) wird das Signal von einer CCD- Kamera (1005) aufgenommen.
Abbildung 6: Abbildung 6 zeigt die gleiche Anordnung wie Abbildung 5, mit der Variante, durch Einbringen von optischen Filtern (1006) in den Beleuchtungsstrahlengang den spektralen Bereich der Beleuchtung einzugrenzen. Die Möglichkeit, diesen Filter mittels Filterwechsler (1007) schnell zu wechseln, hat für die Auswertung den Vorteil, mögliche Fehlinformationen, die z.B. durch Verunreinigungen auftreten, eindeutig zu erkennen und zu eliminieren.
Abbildung 7:
In dieser Ausführangsform wird die klassische Beleuchtung durch ein Beleuchtungsarray (1008) ersetzt. Vorzugsweise diffus streuende LED, matrixförmig angeordnet, ermöglichen auf kurze Entfernungen zur Probe eine homogene Beleuchtung.
Abbildung 8:
Abbildung 8 zeigt eine kompakte Form der Anordnung aus Abbildung 1, bei der der CCD-Sensor (1005) der Kamera unmittelbar mit der Affmitätsmatrix (100) kontaktiert ist. Dieser Kontakt kann auch durch den Einsatz einer Faseφlatte (1012) oder bei noch größeren Abständen durch ein Bildleitkabel hergestellt werden, wenn ein unmittelbarer Kontakt nicht möglich ist. Abbildung 9:
Abbildung 9 zeigt eine Anordnung zum Auslesen der Proben im Auflicht. Dabei kommt ein halbdurchlässiger Spiegel (1009) zum Einsatz.
Abbildung 10:
Da die Silbeφroben keine sehr guten Reflexionseigenschaften besitzen, ist eine wie in dieser Abbildung gezeigte Anordnung vorteilhaft. Hier wird der Nachteil der schlechten Reflexion durch Transmissionseffekte ergänzt, indem das Beleuchtungslicht über eine Spiegelschicht (1010), entweder als eigenständiger Spiegel oder als auf der Rückseite des Probenträgers aufgetragene Schicht, reflektiert wird.
Abbildung 11 :
Abbildung 11 zeigt eine Anordnung in einem transparenten Probenraum, vorzugsweise in einer Küvette (1011), die durch die optisch planen Außenflächen eine gute Kopplung des Empfängers mittels Faseφlatte (1012) an den Probenraum ermöglichen. Bei dem Einsatz von diffusen Flächenstrahlem (1013), die z.B. auf Elektrolumineszenz- oder Kaltkathodenfluoreszenz- Verfahren beruhen, lassen sich sehr kompakte Sensoren realisieren, wie sie in Abbildung 8 dargestellt sind.
Abbildung 12:
Abbildung 12 stellt eine sehr kompakte Anordnung des in Abbildung 11 dargestellten Lesegerätes (1000) dar.
Abbildung 13:
Schnittzeichnung eines Lesegerätes, das entsprechend dem in Abbildung 7 dargestellten Prinzip arbeitet, mit dem Unterschied, dass zwischen der Affmitätsmatrix (100) und der abbildenden Optik (1004) ein Umlenkspiegel eingebaut wurde, um zu kompakten Geräteausmaßen zu kommen. Die Lichtquelle (1008) besteht aus Leuchtdioden, die in eine Schwenkarm (1101) eingebaut sind, der zum Einsetzen des Reaktionsgefäßes (1) in den Reader zur Seite geschwenkt werden kann. Danach wird er über das Reaktionsgefäß (1) geschwenkt, um die Affinitätsmatrix (100) zu beleuchten.
Abbildung 14:
Abbildung 14 entspricht der Abbildung 13, nur als Aufsicht (von der Bedienerseite). Auf der Oberseite befindet sich eine Justiervertiefung (1102), in die der Deckel des Reaktionsgefäßes (1) gedrückt wird. Dadurch wird eine Verdrehung der Affinitätsmatrix vermieden.
Abbildung 15:
Es wird ein Lesegerät (1000) dargestellt, dass sich von dem in der Abbildung 13 dadurch unterscheidet, dass der Schwenkarm (1101) durch einen Schieber (1300) ersetzt wird. Der Schieber (1300) wird über ein Linearlager (1310) über das Reaktionsgefäß (1) geschoben. Dabei drückt ein Schlitten (1320) das Reaktionsgefäß (1) in den Reaktionsgefäß-Halter (1100).
Abbildung 16:
Der Schlitten (1320) des Schiebers (1300) wird in der Aufsicht gezeigt. Der Schlitten (1320) wird durch vier Drackfedem (1321) auf das Reaktionsgefäß (1) gedrückt. Ein Justierspalt (1322) umgreift den Deckel (3) des Reaktionsgefäßes (1) derart, dass das Reaktionsgefäß (1) in seine richtige Position gedreht und fixiert wird.
Abbildung 17: In der Darstellung wird im Querschnitt die Lage des Schiebers (1300) zum
Reaktionsgefäß (1) bei geöffnetem Reader dargestellt. Der Schlitten (1300) bewegt sich entlang des Pfeils und verschließt dadurch den Reader. Der Schieber besteht aus den Drackfedem (1321), die den Schlitten (1320) herunterdrücken, der eine Detektionsöffhung (1323) aufweist, durch die das Licht der Lichtquelle (1001) strahlen kann. Abbildung 18:
Layout des Arrays (102) der Größe 2,4 mm x 2,4 mm; Angegeben sind jeweils die
Namen der 3 fach redundanten Sonden. "M" = Markierung.
Abbildung 19:
Ausgewähltes Zeitreihenbild (nach 15-minütiger Silber-Entwicklungszeit) der
Hybridisierung einer biotinmarkierten Wildtyp-PCR (Exon 3/4, KDL24) im erfindungsgemäßen Reaktionsgefäß. Das Layout des Chips ist in Abbildung 1 dargestellt.
Abbildung 20:
Darstellung des zeitlichen Verlaufs der Schwärzung zweier Spots durch Silberabscheidung. Ein Spot weißt die perfekte Komplementärsequenz der Target- DNA auf (Wildtyp G2064A-WT), der andere unterscheidet sich um eine Base (Mutation GI934A+4). Die zugehörigen Regressionsfunktionen sind ebenfalls dargestellt.
Abbildung 21:
Foto zweier Standard - Reaktionsgefäße aus Polypropylen mit 1,5 ml Füllvolumen.
Legende
1 Reaktionsgefäß
2 Reaktionsgefäß mit einem Durchbrach (Aussparung), der als Einfassung zur Aufnahme von Affinitätsmatrizen ausgeformt ist.
3 Deckel
4 Lasche
5 Dichtung
6 Chipauflage außen 7 Kleberand außen 8 Flüssigkeitsdurchbrach
9 Kleberand innen
10 Sichtdurchbrach
11 Chipauflage innen
100 Bibliothekenchip, Affmitätsmatrix bzw. DNA-Chip
101 Substrat
102 oberflächengebundene Substanzbibliothek
200 Chipträger
201 Klemmverbindung
300 Klemmhülse
301 Dichtflächen 1000 Lesegerät
1001 Lichtquelle
1002 Beleuchtungsoptik
1004 Ausleseoptik
1005 Sensor, vorzugsweise eine CCD-Kamera 1006 Optischer Transmissionsfilter
1007 Filterwechsler
1008 Beleuchtungsarray, vorzugsweise eine Anordnung von LED
1009 Halbdurchlässiger Spiegel
1010 Spiegel bzw. Verspiegelung des Trägers der DNA-Bibliothek 1011 Küvette
1012 Faseφlatte
1013 Diffuser Flächenstrahler
1014 Umlenkspiegel
1100 Reaktionsgefäß-Halter 1101 Schwenkarm
1102 Justiervertiefung
1200 Peltierelement
1300 Schieber
1310 Linearlager
1320 Schlitten
1321 Druckfeder 1322 Justierspalt
1323 Detektionsöffhung
1324 Andruckfläche

Claims

A N S P R U C H E
1. Reaktionsgefäß zum Nachweis der spezifischen Wechselwirkung zwischen molekularen Target- und Sondenmolekülen, dadurch gekennzeichnet, dass es eine für ein Laborreaktionsgefäß (Tube) typische Form und Größe aufweist, wobei auf einer seiner Grundflächen ein Trägerelement mit darauf auf vorbestimmten Bereichen immobilisierten Sondenmolekülen angeordnet ist.
2. Reaktionsgefäß nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Grundfläche des Laborreaktionsgefäßes eine Aussparung zur Aufnahme des Trägerelements aufweist.
3. Reaktionsgefäß nach Ansprach 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägerelement im Bereich einer Detektionsfläche optisch durchlässig ist.
4. Reaktionsgefäß nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die der Detektionsfläche gegenüberliegende Grundfläche optisch durchlässig ist.
5. Reaktionsgefäß nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Material für das Trägerelement Glas und/oder Silizium ist und vorzugsweise ausgewählt ist aus der Grappe bestehend aus Borofloat 33, Quarzglas, einkristallinem CaF2 und einkristallinem Silizium.
6. Reaktionsgefäß nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Material für das Gefäß ausgewählt ist aus der Grappe bestehend aus Glas, Glaskeramik, kunststoffbeschichtetem Glas, Kunststoffen wie Polypropylen, Polyethylen, Polystyrol, Polycarbonat, PVC, Polymethylmethacrylat, Silikonkunststoff, Kautschuk, Polytetrafluorethylen und/oder Nylon, und Metallen wie nicht rostenden Stählen, Platin und/oder Aluminium.
7. Reaktionsgefäß nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Füllvolumen im Bereich von 100 μl bis 2,5 ml, und vorzugsweise ein Füllvolumen von 1,5 ml aufweist.
8. Reaktionsgefäß nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei immobilisierten Sondenmolekülen um eine Substanzbibliothek ausgewählt aus der Grappe bestehend aus Proteinbibliotheken, Peptidbibliotheken und Nukleinsäurebibliotheken handelt.
9. Reaktionsgefäß nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Proteinbibliothek eine Antiköφerbibliothek, eine Rezeptoφroteinbibliothek und/oder eine Membranproteinbibliothek ist.
10. Reaktionsgefäß nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Peptidbibliothek eine Bibliothek von
Rezeptorliganden, eine Bibliothek pharmakologisch aktiver Peptide und/oder eine Bibliothek von Peptidhormonen ist.
11. Reaktionsgefäß nach Ansprach 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäurebibliothek eine DNA- Molekülbibliothek und/oder eine RNA-Molekülbibliothek ist.
12. Vorrichtung zum Nachweis der spezifischen Wechselwirkung zwischen molekularen Target- und Sondenmolekülen, umfassend: a) mindestens ein Reaktionsgefäß nach einem der Ansprüche 1 bis 11; und b) eine Detektionsvorrichtung zum Nachweis der spezifischen Wechselwirkung.
13. Vorrichtung nach Ansprach 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektionsvorrichtung eine Kamera und ggf. eine Ausleseoptik umfasst.
14. Vorrichtung nach Ansprach 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Kamera eine CCD- oder CMOS-Kamera ist.
15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass sie zusätzlich eine Lichtquelle umfasst.
16. Vorrichtung nach Ansprach 15 , dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle eine homogene Beleuchtung des Trägers gewährleistet.
17. Vorrichtung nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle ein Beleuchtungsarray ist, welches mehrere diffus strahlende Lichtquellen umfasst, die durch Überlagerung die homogene Beleuchtung des Trägers gewährleisten.
18. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Lasern, Licht-emittierenden Dioden (LED), Flächenstrahlem und Hochdracklampen.
19. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Deckel des Reaktionsgefäßes strukturiert ist, um eine homogene Beleuchtung zu gewährleisten.
20. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass sie zusätzlich optische Filter und ggf. einen Filterwechsler umfasst.
21. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass sie zusätzlich einen halbdurchlässigen Spiegel zwischen Lichtquelle und Träger umfasst.
22. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Reaktionsgefäß in unmittelbarem Kontakt mit der Detektionsvorrichtung ist.
23. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Reaktionsgefäße so angeordnet sind, dass eine aufeinanderfolgende Detektion gewährleistet ist.
24. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass sie zusätzlich eine Temperatursteuerungseinheit umfasst.
25. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass sie zusätzlich einen Computer umfasst, der programmiert ist, um:
- die von der Detektionsvorrichtung aufgenommenen Signalintensitäten zu sammeln; und - ggf. die Umwandlung der virtuellen Signalintensitäten in ein analoges Bild zu gewährleisten.
26. Verfahren zum Nachweis der spezifischen Wechselwirkung zwischen molekularen Target- und Sondenmolekülen, umfassend die folgenden Schritte: a) Bereitstellung eines Reaktionsgefäßes nach einem der Ansprüche 1 bis 11 bzw. einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 25; b) Wechselwirkung der Targets mit den auf vorbestimmten Bereichen bzw. Array- Elementen angeordneten Sonden; und c) Detektion der Wechselwirkung.
27. Verfahren nach Ansprach 26, dadurch gekennzeichnet, dass zur Detektion der Wechselwirkung eine Reaktion durchgeführt wird, die zu einem Niederschlag an den Array-Elementen fuhrt, an denen eine Wechselwirkung erfolgt ist.
28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt c) der zeitliche Verlauf der Niederschlagsbildung an den Array-Elementen in Form von Signalintensitäten delektiert wird.
29. Verfahren nach Ansprach 27 oder 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion, die zur Bildung eines Niederschlags an den Array-Elementen führt, die Umwandlung eines löslichen Substrats in einen metallischen Niederschlag ist.
30. Verfahren nach Ansprach 29, dadurch gekennzeichnet, dass die zur Bildung eines Niederschlags an den Array- Elementen führende Reaktion die chemische Reduktion einer Silberverbindung, vorzugsweise Silbemitrat, Silberlactat, Silberacetat oder Silbertartrat, zu elementarem Silber ist.
31. Verfahren nach Ansprach 30, dadurch gekennzeichnet, dass das Reduktionsmittel ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Formaldehyd und Hydrochinon.
32. Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 31 , dadurch gekennzeichnet, dass die Umwandlung eines löslichen Substrats in einen metallischen Niederschlag in Gegenwart von mit den Targets gekoppelten Metallclustern bzw. kolloidalen Metallpartikeln erfolgt.
33. Verfahren nach Ansprach 32, dadurch gekennzeichnet, dass die Umwandlung eines löslichen Substrats in einen metallischen Niederschlag in Gegenwart von Goldclustem oder kolloidalen Goldpartikeln erfolgt.
34. Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 33, dadurch gekennzeichnet, dass die Kopplung der Metallcluster bzw. kolloidalen Metallpartikel an die Targets direkt oder über an die Targets gekoppelte Ankermoleküle erfolgt.
35. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 34, dadurch gekennzeichnet, dass die Wechselwirkung zwischen dem Target und der Sonde eine Hybridisierung zwischen zwei Nukleotidsequenzen ist.
36. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 35 , dadurch gekennzeichnet, dass die Detektion der Gegenwart eines Niederschlags auf einem Array-Element durch Reflexion, Absoφtion oder Diffusion eines Lichtstrahls, vorzugsweise eines Laserstrahls oder einer Leuchtdiode, durch den Niederschlag erfolgt.
37. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 11 bzw. einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 12 bis 25 zur Durchfuhrung von Mikro-Array basierten Tests.
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