WO2003060125A1 - Procede de production du peptide kiss-1 - Google Patents

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WO2003060125A1
WO2003060125A1 PCT/JP2003/000113 JP0300113W WO03060125A1 WO 2003060125 A1 WO2003060125 A1 WO 2003060125A1 JP 0300113 W JP0300113 W JP 0300113W WO 03060125 A1 WO03060125 A1 WO 03060125A1
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amino acid
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terminus
seq
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PCT/JP2003/000113
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Takao Yamada
Isamu Tsuji
Yuko Misumi
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Takeda Pharmaceutical Co Ltd
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Takeda Chemical Industries Ltd
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors

Definitions

  • the present invention provides a fusion protein or polypeptide in which a K i SS-1 peptide is linked to the N-terminus of a low-molecular peptide having a cysteine at the N-terminus, and then the fusion protein or polypeptide is prepared.
  • the present invention relates to a method for producing a KiSS-1 peptide or a salt thereof by subjecting the peptide bond to a cleavage reaction.
  • peptides When producing peptides using genetic recombination technology, peptides are often expressed in the form of fusion proteins because the peptides are susceptible to degradation in cells.
  • the target peptide can be cleaved from the fusion protein by a method of chemically cleaving with bromocyan (Itakura et al., Science, 198, 1056 (1977)), or a method of enzymatically cleaving using after Xa (Nagai et al. Methods in Enzymology, 153, 46 (1987)) are known.
  • WO 0/24890 and WO 1/75010 disclose KiSS-1 peptide or a salt thereof used in the present invention.
  • WO01 / 444469 discloses a fusion protein in which a KiSS-1 peptide is linked to the N-terminus of a protein or peptide having a cysteine at the N-terminus, a peptide or a salt thereof,
  • a method for producing a Ki SS_1 peptide or a salt thereof, characterized by subjecting the peptide to a cleavage reaction of a peptide bond on the amino group side of the compound, is disclosed as a protein or peptide having a cysteine at the N-terminus.
  • Interferons interleukins, various growth factors such as fibroblast growth factor (aFGF, bFGF), (pro) perokinase, lymphotoxin, Tumor Necrosis Factor (TNF),] 3-galactosidase , Storage proteins, streptavicin, protein A, protein G, Tissue Plasminogen Activator (TPA), mutins thereof, and parts (fragments) thereof.
  • aFGF fibroblast growth factor
  • bFGF fibroblast growth factor
  • pro perokinase
  • lymphotoxin lymphotoxin
  • Tumor Necrosis Factor TNF
  • the present inventors have conducted intensive studies on a method for efficiently producing a novel physiologically active peptide, KiSS-1 peptide or a salt thereof, and found that a low-molecular-weight peptide having a cysteine at the N-terminus was obtained.
  • a fusion protein or polypeptide in which a K i SS-1 peptide is linked to the N-terminus is produced, and then subjected to a reaction for cleaving the peptide bond, whereby a K i SS-1 peptide or a salt thereof is obtained.
  • a transformant carrying a vector having a fusion protein or a peptide coding DNA in which a KiSS-1 peptide is linked to the N-terminus of a low-molecular peptide having a cysteine at the N-terminus Culturing to express the fusion protein, peptide or salt thereof, and subjecting the expressed fusion protein, peptide or salt thereof to a cleavage reaction of the peptide bond on the amino group side of the cysteine residue.
  • K i SS a method for producing 1 peptide or a salt thereof
  • KiSS-1 peptide is a peptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • Ki SS-l peptide is (1) a peptide having an amino acid sequence consisting of the 40th to 54th amino acids from the N-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, (2) represented by SEQ ID NO: 1 A peptide having an amino acid sequence consisting of the 45th to 54th amino acid sequence from the N-terminus of the amino acid sequence, 3 a peptide having an amino acid sequence consisting of the 46th to 54th amino acid sequence from the N-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 4 sequence
  • the low-molecular-weight peptide having a cysteine at the N-terminus is a peptide having a cysteine at the N-terminus and comprising about 10 to about 50 amino acid residues.
  • the low-molecular peptide is a partial peptide on the C-terminal side of the precursor protein containing the KiSS_1 peptide, starting from an amino acid residue adjacent to the C-terminal amino acid of the KiSS-1 peptide
  • the above which is a peptide having an amino acid sequence
  • the low-molecular peptide having a cysteine at the N-terminus is a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 and a cysteine residue added to the N-terminus as described in (1) or (2) above. ) Described manufacturing method,
  • a low-molecular-weight peptide having a cysteine at the N-terminus is a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 and a cysteine residue added to the N-terminus; Is a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and the C-terminal of the produced Ki SS-1 peptide is an amide. Is a peptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • N-terminal of a low molecular weight peptide having a cysteine at the N-terminus (here, a low molecular weight peptide is a partial peptide at the C-terminal side of the precursor protein of the target matured peptide) Subjecting the peptide-linked fusion protein, peptide or salt thereof to a cleavage reaction of a peptide bond on the amino side of the cysteine residue.
  • N-terminal of a low molecular weight peptide having a cysteine at the N-terminus (here, a low molecular weight peptide refers to a partial peptide at the C-terminal side of the precursor protein of the target matured peptide)
  • a fusion protein linked to a peptide or a transformant carrying a vector having a DNA encoding the peptide is cultured to express the fusion protein, peptide or salt thereof, and the expressed fusion protein, peptide or salt thereof is expressed.
  • a process for producing a matured peptide of interest or a salt thereof To a cleavage reaction of the peptide bond on the amino group side of the cysteine residue, a process for producing a matured peptide of interest or a salt thereof,
  • the low-molecular peptide having a cysteine at the N-terminus is a peptide having a cysteine at the N-terminus and consisting of about 10 to about 50 amino acid residues (19) or (2). 0) described method,
  • a low-molecular-weight peptide having a cysteine at the N-terminus refers to a partial peptide at the C-terminal side of the precursor protein of the target matured peptide.
  • FIG. 1 shows the DNA fragment used in Example 1.
  • FIG. 2 shows the construction of the plasmid pTC2MetC24 obtained in Example 1 c .
  • FIG. 3 shows the construction of the plasmid pTC2MetC24 obtained in Example 5 c Best mode to implement
  • the Ki SS-1 peptide used in the method of the present invention includes, for example, human Ki SS-1 peptide described in WO 00/24890, and mouse described in WO 01/75 104 Alternatively, a rat K i S S — 1 peptide is used.
  • the human Ki SS-1 peptide specifically includes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the present application, which contains the 47th to 54th amino acid sequence from the N-terminal, and has 8 to 54 amino acids. And a peptide consisting of the following amino acid residues.
  • the peptide comprising the amino acid sequence of the 7th to 54th amino acids and consisting of 8 to 54 amino acid residues includes the amino acid sequence of the 47th to 54th amino acids from the N-terminal in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Any peptide may be used as long as the peptide contains 8 to 54 amino acid residues and has a peptide activity (for example, a peptide-receptor binding activity, which is induced by a peptide). Cell stimulation activity of the receptor-expressing cells, etc.) are substantially the same. Specifically, (1) the peptide represented by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the present application; and (2) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; Has the amino acid sequence of A peptide consisting of 15 amino acid residues is used.
  • human K i SS-1 peptide includes (1) a peptide represented by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the present application; and (2) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the present application.
  • the mouse Ki SS-1 peptide (A) includes, for example: (1) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 which contains the amino acid sequence of the 14th to 14th amino acids from the N-terminus; A peptide or the like consisting of two amino acid residues is used. Specifically, (1) a peptide having the 90th to 14th amino acid sequence from the N-terminal of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 (2) a peptide having the amino acid sequence of the 13th to 14th amino acids from the N-terminal of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16; (3) a peptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 from the N-terminal A peptide having an amino acid sequence of 127 to 14 1 is used.
  • the mouse KiSS-1 peptide (B) includes, for example, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 from the N-terminal to the 13th to 14th amino acid sequence; Peptides having the amino acid sequence of the 94th to 144th amino acids from the N-terminal of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 are used. Is used.
  • the rat Ki SS — peptide includes, for example, the amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18 from the N-terminal to the 11th to 11th amino acid sequence, and 8 to 52 amino acid sequences.
  • the above i SS-1 peptide has ligand activity for the receptor protein OT7T175 described in WO 00/24890 or WO 01/75010 .
  • the peptide has an N-terminus at the left end (amino terminus) and a C-terminus at the right end (carboxyl terminus) according to the convention of peptide notation.
  • the C-terminus of the peptide represented by SEQ ID NO: 1 is amide (_C0NH 2 ), carboxyl group (-C00H), carboxylate (-C00-I), alkylamide (-C0NHR) or ester (-C00R). ).
  • R in the ester or alkylamide examples include, for example, a C j-6 alkyl group such as methylene, ethyl, n-propyl, isopropyl or n-butyl, and a C Q - 8 alkyl group such as pentyl and hexyl. group, phenyl, ct - C e ⁇ 2 Ariru groups, naphthyl, benzyl, phenethyl, phenylene Lou such Benzuhi drill ⁇ 1 - 2 alkyl, or alpha - Nafuchirumechi Le etc. ⁇ - naphthyl, such as single C Bok 2 alkyl In addition to the C n 4 aralkyl group, a bivaloyloxymethyl group commonly used as an oral ester and the like can be mentioned.
  • a C j-6 alkyl group such as methylene, ethyl, n-propyl, isopropyl
  • the K i SS- 1 peptide, an amino group protecting group of Mechionin residues of N-terminal e.g., formyl group, etc. have 6 Ashiru group such as C 2 _ 6 Arukanoiru groups such Asechiru
  • a glutamic acid group generated by cleavage of the N-terminal side in vivo and pyroglutamine oxidation, a substituent on the side chain of an amino acid in the molecule eg, — ⁇ H, —SH, —C ⁇ H , an amino group, imidazo one group, indole group, Guanijino group, etc.
  • a suitable protecting group e.g., formyl group, a C physician 6 Ashiru group such as C 2 _ 6 Arukanoiru group such Asechiru
  • a complex peptide such as a so-called glycopeptide having a sugar chain bonded thereto.
  • the salt of the KiSS-1 peptide of the present invention includes a physiologically acceptable base.
  • Salts with (eg, alkali metals) and acids (organic acids, inorganic acids) are used, but physiologically acceptable acid addition salts are particularly preferred.
  • a salt for example, salts with inorganic acids (for example, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (for example, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, tartaric acid, quenched acid) Acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonate, benzenesulfonate) and the like.
  • inorganic acids for example, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids for example, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, tartaric acid, quenched acid
  • Acid malic acid, oxalic acid, benzoic
  • the protein or peptide having a cysteine at the N-terminal used in the method of the present invention is not specified.
  • cysteine may be provided at the N-terminal by a method known per se.
  • the “low molecular weight peptide” of the low molecular weight peptide having a cysteine at the N-terminal for example, about 10 to 50, preferably about 20 to 40, more preferably about 20 to 30 Those having two amino acid residues are preferred.
  • a human Ki SS — 1 peptide precursor containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 for example, J. Natl. Cancer Inst., 88, 1731, 1996; WO98
  • Partial peptides of the 5-1 peptide precursor are used, and among them, the partial peptide on the C-terminal side of these KisS-1 peptide precursors is preferable. More preferably, the low molecular weight peptide is a partial peptide on the C-terminal side of the precursor protein containing the KiSS-1 peptide, wherein the amino acid residue adjacent to the C-terminal amino acid of the KiSS-1 peptide is used. And a peptide having an amino acid sequence starting with ".”
  • the low molecular weight peptide for example,
  • KiSS-1 peptide is a human KiSS-1 peptide
  • a human KiSS-1 peptide precursor containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 The partial peptide at the c-terminal side of the body
  • KiSS-1 peptide is mouse KiSS-1 peptide (A) If the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 has the 142nd to 152nd amino acid sequence from the N-terminus, a partial peptide at the C-terminal side of the mouse SS-1 peptide precursor, etc. ,
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 is the first amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17.
  • KiSS-1 peptide is a rat KiSS-1 peptide
  • the amino acid sequence at the 120th to 130th amino acid from the N-terminal of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18 A partial peptide on the C-terminal side of the rat Ki SS-1 peptide precursor having the following is preferably used.
  • cysteine is linked to the N-terminus of these low molecular weight peptides.
  • the DNA encoding the fusion protein (including the fusion peptide) used in the method of the present invention may be (1) chemically synthesized from the entire base sequence, or (2) encoded with a low molecular weight peptide.
  • the DNA may be constructed by arranging a base sequence encoding cysteine at the N-terminal side of the base sequence, and further arranging a base sequence encoding the KiSS-1 peptide at the N-terminal side. . (3)
  • constructing the DNA in which the amino acid residue immediately after the desired fragment is replaced with cysteine by a technique such as site-directed mutagenesis. Good.
  • Examples of the production method in the case of the above (1) include, for example, a known method such as a phosphoramidite method, a phosphoric acid triester method, a diester method, and a hydrogen phosphonate method. After splitting and synthesizing, it can be created by ligation using T4 DNA ligase.
  • DAN encoding a protein at the C-terminal side may be obtained by digesting from a chromosome or cDNA with an appropriate restriction enzyme and ligating to a vector— Get cDN A. After that, cut with restriction enzymes so that the N-terminus becomes cysteine, or Alternatively, it is modified so that it binds to the 5'-end of some of its genes and the N-terminus becomes cysteine. At its 5'-end, a DAN (either chemically synthesized or cloned from a living organism) that encodes the target protein is connected.
  • Specific examples of the DNA encoding the fusion protein thus obtained include, for example,
  • R represents the base sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • a DNA containing a base sequence represented by the following formula SEQ ID NO: 6 or 7).
  • the above formula (I) is obtained through the nucleotide sequence (TGC or TGT) encoding cysteine in the DNA nucleotide sequence (SEQ ID NO: 2) coding for the peptide containing human KiSS-1 peptide. Indicates that the base sequence represented by R (SEQ ID NO: 4) is bound.
  • the DNA encoding the human KiSS_1 peptide is a human KiSS_1 containing the DNA represented by the above formula (I) or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15. It can also be produced according to a method known per se using a DNA encoding a peptide precursor or a modified DNA thereof (for example, J. Natl. Cancer Inst., 88, 1731, 1996; WO 98/39448).
  • the DNA encoding mouse KiSS-1 peptide is a DNA encoding mouse KiSS-1 peptide precursor (A) having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 (SEQ ID NO: 16). : 19) or a modified DNA thereof (WO01 / 75104) or a DNA (sequence) encoding the mouse KiSS-1 peptide precursor (B) having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 No. 20) or its modified DNA (WO 01 Z 75 104) can be produced according to a method known per se.
  • the DNA encoding rat KiSS-1 peptide is a DNA encoding rat KiSS-1 peptide precursor having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18 (SEQ ID NO: 18). 21) or its modified DNA (WO 01 75 1 04 ) Can be produced according to a method known per se.
  • a DNA (plasmid) having an ATG at the 5 ′ end and a region encoding the fusion protein downstream thereof, and a translation stop codon is a known DNA synthesized by chemical synthesis or genetic engineering. It can be produced by processing the cDNA of the protein or the chromosome-derived DNA of the protein.
  • the low-molecular-weight peptide having a cysteine at the N-terminus of the present invention is a fusion protein in which a KiSS-1 peptide is linked to the N-terminus or a DNA encoding the peptide is synthesized by a conventional DNA technique, for example, site-directed. Using mutagenesis techniques, the desired mutin can be converted into coding DNA.
  • the plasmid used as a vector includes, for example, pBR32 2 derived from Escherichia coli [Gene, 2 , 9 5 (1 9 7 7)], pBR 3 1 3 [Gene, 2, 7 5 (1 9 7 7)], ⁇ R 324, ⁇ ⁇ R 3 2 5 [Gene, 4, 1 24 (1 9 7 8)], ⁇ R 3 27, ⁇ R 3 2 8 [Gene, 9, 2 8 7 (1 98 0)], pBR 3 2 9 [Gene, 1 7, 7 9 (1 9 8 2 )], ⁇ 2 289 [Gene, 3, 1 (1 977)], ⁇ 2700 [Biochemistry, 52, 770 (1 980)], pAC YC 1.77, pAC YC 184 [Journal of Bacteriology, 13 4, 1 1 4 1 (1 9 7 8)], ⁇ RK 248, ⁇ RK 6 46, pD F Methods in En
  • bacteriophages such as phages Natl. Acad. Sci. USA 71, 45 79 (1974)], ⁇ gt ⁇ IB [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 7 2, 34 6 1 (1 9 7 5)], ⁇ Dam [Gene, 1, 2 5 5 (1 9 7 7)] ⁇ Shialon vector [Science, 1 96, 16] 1 (1 9 7 7); Journal of Virology, 2, 9, 5 5 5 (1 9 7 9)], nip-based mp 18 using filamentous phage , mpl 9 [Janish-Peron et al., Gene, 33, 103 (1989)] vector.
  • the DNA preferably has a promoter upstream of ATG, and the promoter may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for the production of the transformant.
  • trp promoter lac promoter, rec A promoter, LPL promoter, lpp promoter, T7 promoter, etc. for Escherichia coli, and SPO1 promoter, SP02 promoter for Bacillus subtilis, etc.
  • pen P promoter include the PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter, and ADH promoter in yeast (aaccharomyces cerevisiae), and the promoter derived from SV40 in animal cells. If necessary, a Shine and Dalgarno (SD) sequence may be inserted downstream of the promoter.
  • SD Shine and Dalgarno
  • the T7 promoter When the T7 promoter system is used, the T7 promoter includes 17 types of promoters found on T7 DNA [JL Oakley et al., Proc. Natl. Acad. Sci, US A, 74: 4. 2 6 6 -4 2 7 0 (1 9 7 7), MD Rosa, Cell 16: 8 15-8 2 5 (1 9 7 9), N. Panayotatos et al., Nature, 28
  • a terminator operating in an E. coli system preferably a ⁇ terminator [FW Studier et al., J. Mol. Biol., 189:
  • RNA polymerase genes include ⁇ 7 genes [FW Studier et al. J. Mol. Biol., 1 89: 1 13—1 3 0 (1 9 8 6)].
  • the vector is preferably constructed by incorporating a T7 promoter and a T7 terminator into the above vector.
  • Such vectors include pET-1, pET-2, pET-3, and pET. — 4, pET— 5 [AH Rosenberg, Gene 56: 1 2 5—1 3 5 (1 9 8 7)], TB 960-2 [EP-A-49 9 9 9 9
  • the transformant of the present invention can be prepared by subjecting the expression plasmid obtained by the above-described method to a method known per se [eg, Coen S, N, et al., Processing 'National' AcaDemi-1 'Ob' Science ( Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 69, 2110 (1972)].
  • Examples of the host of the microorganism to be transformed include Escherichia coli
  • Escherichia bacteria examples include Escherichia coli and E. coli.
  • Escherichia coli K12DH1 [Pecchia seeding of Ob. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 160 (19668)], JM-103 (Nucleic Acids Research), 9, 309 (1 1981)], JA 221 (Journal of Molecular Biology, 120, 5 17 (1978)], HB 10 1 [Journal 'ob' molecular bio-biochemistry, 41, 45 9 (196 9)], C 600 [Genetics, 39, 44 0 (19 54) , N4 830 (Cell, 25, 713 (1 1981)), K12MM2 94 [Proceedings of National Academy of Sciences, 73, 4 1 74 (1 9 7 6 )] B L— 21 and the like.
  • Bacillus genus examples include Bacillus subtilis. Specifically, Bacillus' Sacillus MI114 (Gene, 24, 25 (1978)), 20 07 -2 1 [Journal of Biochemistry, 95, 87 (1 1984)].
  • yeast examples include Saccharomyces cerevisiae, and specifically, Saccharomyces cerevisiae AH22 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1977) 8)], XSB 52-23 C [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 7 7 2 1 7 3 (1 980)], BH-641 A (ATCC 2 8 3 3 9 ), 20 B-12 (Genetics, 85, 23 (1 977 6)), GM3 C—2 [Proc. Natl. Acad. Sci. Usa, 7 8 2 2 5 8 (1 9 8 1 )].
  • monkey cells CO S-7 [Cell, 23, 17 5 (1 9 8 1)], Vero [(Japanese clinical 21 1, 12 9 (1 9 6 3) ], Chinese hamster cell CHO [Journal 'obexperimental' Medicin (J. Exp. Med.), 108, 945 (19985)], mouse L cell [journal obov ⁇ National Cancer Institute (J. Nat. Cancer Inst.), 4, 165 (1943)], human FL cells [Procedures' of the Society for Extracts] Biologic 'and' Medisin (Proc. Soc. Exp. Biol. Med.), 94, 53 (1957)], nomster C cells, and the like.
  • the host of the transformant may be T7 RNA polymerase gene (T7 gene 1) [FW Studier et al., J. Mol. Biol. 189: 113- Escherichia coli strains that have integrated the T7R ⁇ polymerase gene (eg, MM294, DH-1, C600, JM109, BL21, certain ⁇ Escherichia coli strains that incorporate 7 genes 1) together with other plasmids are used.
  • strain # 294 and strain BL21 in which a phage into which # 7 gene 1 is incorporated are lysogenized are used.
  • a lac promoter whose expression is induced by isopropyl-11-thio- ⁇ -D-galactopyranoside (sometimes abbreviated as IPTG) is used as the promoter of gene 7.
  • Transformation of a bacterium of the genus Bacillus as a host can be performed according to a known method such as, for example, Molecular and General Genetics, 168, 111 (1979).
  • the fusion protein can be produced by culturing the above-mentioned transformant in a medium and collecting the produced fusion protein. it can.
  • the pH of the medium is preferably about 6-8.
  • a medium for cultivating a bacterium belonging to the genus Escherichia for example, an M9 medium containing glucose and casamino acids (Miller, Journal 'Ob'Experimentin', Moleculara, Shea Intacts, Journal of Experiments in Molecular Genetics) 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972)] Force S preferred.
  • a drug such as 33-indolylacrylic acid or isopropyl i3-D-thiogalactobyranoside (IPTG) can be added to make the promoter work efficiently if necessary.
  • the cultivation is usually performed at about 15 to 43 ° C for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be added.
  • the cultivation is usually carried out at about 30 to 40 ° C for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be added.
  • the medium When culturing a transformant in which the host is yeast, for example, the medium may be Burkholder's minimal medium [Bostian, KL et al., Proceedin Das 'Ob National', Academy of Sciences (Pro Natl. Acad. Sci.) USA, 77, 4505 (1980)]. Adjust the pH of the medium to about 5-8 preferable. Culture is usually carried out at about 20 to 35 ° C for about 24 to 72 hours, and aeration and stirring are added as necessary.
  • the medium When culturing a transformant in which the host is an animal cell, the medium may be, for example, a MEM medium containing about 0.2 to 20%, preferably about 5 to 20% of fetal bovine serum [Science, 122, 501 (1952)], DME medium (Virology, 8, 396 (1959)), RPM I 1640 medium [Journal of Ob the American American Metical Canal Association (The Journal) of the American Medical Association), 199, 519 (1967)], 199 medium [Proceeding of the Society for the Biologcal Medicine] , 73, 1 (1950)].
  • the pH is about 6-8.
  • the cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C, and the culturing time is about 15 to 60 hours. Aeration and stirring are added as necessary.
  • the fusion protein can be produced by culturing the above transformant, producing and accumulating the fusion protein in a culture, and collecting this.
  • M9 medium containing glucose and casamino acid M9 medium containing glucose and casamino acid [Mira, J., Experimment in 'Experiments in Molecular Genetics', 4 3 1-4 3 3 (the old Spring Horbor Laboratort) , New York 197 2)] 2 XYT medium [Messing, Methods' Methods in Enzymology, 101, 20 (1 983)] LB medium.
  • the cultivation is usually performed at about 15 to 43 ° C for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be added.
  • the culture is carried out at about 15-36 ° C, preferably about 30-36 ° C.
  • the reaction is carried out at a temperature of ° C, and the inactivation of the AcIts repressor is carried out at about 37-42 ° C.
  • a drug such as mitomycin C, naldixic acid, or irradiate ultraviolet rays, or You may change pH to the side of the power.
  • T7 promoter system When the T7 promoter system is used, (1) When expressing the T7 gene (RNA polymerase gene) linked downstream of the lac promoter, add IPTG or the like, or 2) When expressing the T7 gene (RNA polymerase gene) linked downstream of the ⁇ promoter, increase the temperature of the culture, etc., to specifically generate the T7 phage RNA polymerase 1 Activate the promoter.
  • the cells After culturing, the cells are collected by a known method, suspended in a buffer, for example, treated with a protein denaturant, treated with an enzyme such as sonicated lysozyme, treated with glass beads, French pressed, frozen and thawed. And the like, to disrupt the cells, and obtain a supernatant by a known method such as centrifugation.
  • a buffer for example, treated with a protein denaturant, treated with an enzyme such as sonicated lysozyme, treated with glass beads, French pressed, frozen and thawed.
  • an enzyme such as sonicated lysozyme
  • a generally known protein purification method may be used. For example, gel filtration, ion exchange chromatography, adsorption chromatography, high performance liquid chromatography, affinity chromatography, hydrophobic chromatography, electrophoresis and the like can be appropriately combined. Further, the fusion protein may proceed to the next reaction step without purification or in a partially purified state.
  • the thus obtained fusion protein or peptide is subjected to a cleavage reaction of the peptide bond on the amino side of the cysteine residue.
  • the cleavage reaction include an S-cyanation reaction and a hydrolysis reaction.
  • the cleavage reaction includes, for example, an S-cyanolation reaction and then an ammonolysis.
  • the S-cyanation reaction is carried out by reacting a starting compound with an S-cyanation reagent.
  • S-cyanation reagent examples include 2-nitro-5-thiocyanobenzoic acid (NTC B), 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium salt (DMAP-C
  • the amount of the S-cyanation reagent may be about 2 to 50 times, and preferably about 5 to 10 times, the total number of thiol groups in moles.
  • the reaction temperature may be any as long as it is between about 0 to 80 ° C, and may be about 0 to 50 ° C. Between is more preferred.
  • any buffer may be used as long as it does not react with the S-cyanation reagent.
  • the organic solvent may be present as long as it does not react with the S-cyanation reagent.
  • the reaction is preferably performed between ⁇ 1 and 12.
  • the pH is preferably 7 to 10; when DMAP-CN is used, the pH is preferably 2 to 7 to prevent the SS exchange reaction.
  • a denaturant such as guanidine hydrochloride may be present in the reaction solution.
  • ammonolysis or hydrolysis reaction includes, for example, subjecting it to an alkaline treatment.
  • the alkali treatment is carried out by adjusting the pH of the aqueous solution containing the starting compound to 7 to 14.
  • the pH is adjusted by, for example, using a solution of ammonia, sodium hydroxide, an amino compound, trizumabase (tris [hydroxymethyl] monoaminomethane), disodium phosphate, potassium hydroxide, barium hydroxide, etc., as the starting compound.
  • An appropriate amount is added to the aqueous solution, but ammonia is particularly preferred.
  • the concentration of the solution in the above reaction may be, for example, about 0.01 to 1 in the case of ammonia or an amino compound, preferably about 0.1 to 3 N in the case of sodium hydroxide, or about 0 to 3 N in the case of sodium hydroxide.
  • 0.1 to 2 N preferably about 0.05 to 1 N, about 1 mM to 1 M, preferably about 20 mM to 200 mM for trizuma base, about 1 for sodium phosphate dibasic mM to 1 M, preferably about 1 O mM to 10 O mM, and in the case of potassium hydroxide, about 0.1 to 1 N, preferably about 0.1 to 2 N.
  • the reaction temperature may be any as long as it is between about ⁇ 20 and 80 ° C., and more preferably between about ⁇ 10 and 50 ° C.
  • the reaction time is preferably about 1 to 60 minutes, preferably about 15 to 30 minutes for the S-cyanation reaction, and about 5 to 100 hours, preferably 10 minutes to 15 for the hydrolysis reaction.
  • the time is about 5 minutes to 24 hours, preferably about 10 to 180 minutes for ammonolysis.
  • the amino compound includes, for example, a compound represented by the formula R 1 — (NR 2 ) _H (wherein R 1 and R 2 are the same or different, and (i) a hydrogen atom, (ii) C— 2 .
  • An alkyl group , C 3 _ 8 consequent opening alkyl group, C 6 - 14 Ariru (aryl) group, or a C 6 _ 14 Ariru one C ⁇ 3 alkyl group (which do not have a substituent or 1-3 amino groups , A hydroxyl group or the like may be present on a carbon atom), (iii) an amino group which may be substituted, (iv) a hydroxyl group or a C ⁇ e alkoxy group.) Can be
  • reaction shown in FIG. 1 occurs by the S-cyanation and ammonolysis or hydrolysis described above.
  • the above-mentioned by Uni ami de (- C0NH 2), carboxyl group, carboxylate (-C00-), Al Kiruami de (- C0NHR) or Esters (-C00R) may be used, and amides, carboxyl groups (-C00H) or alkylamides are preferable, and amides or alkylamides are particularly preferable.
  • the C-terminal of the KiSS-1 peptide obtained by the production method of the present invention may be one CO-X shown in FIG. 1.
  • X represents R 1 — (NR 2 ) — (wherein each symbol has the same meaning as described above.) Or ⁇ H.
  • alkyl examples include, for example, methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butinole, sec-butyl, pentinole, isopentyl, nesentia pentinole, 1-ethinole pentinole, hexinole, isohexinole, heptinole, octinole, Nonanyl, decanyl, pendecanil, dodecanyl, tetradecanyl, pentadecanyl, hexadenicil, heptadecanil, octadecanyl, nonadenicil and eicosanil.
  • cycloalkyl e.g., cyclopropyl, cyclo Buchinore, cyclopentyl Honoré, Kishinore cyclohexane, Puchinore cyclohexane, etc. Shikurookuchi Le and the like.
  • C 6 -arylalkyl examples include, for example, benzyl and phenyl. Enethyl, 3-phenylpropyl, (1-naphthyl) methyl, (2-naphthyl) methyl and the like.
  • Examples of the C alkoxy include methoxy, ethoxy, propoxy, butoxy, pentyloxy, hexyloxy and the like.
  • optionally substituted amino substituents of the above (ii) include, for example, amino acids and peptides composed of 2 to 10 amino acids.
  • the above amino acid may be L-integrated or D-isomer, for example, Ala, Arg, Asp, Asn, Glu, Gin, Gly, His, lie, Met, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val and the like.
  • Examples of the peptide for example, HD- Leu-Leu- Arg- Pro- NH-C 2 H 5,
  • R 2 is a hydrogen atom
  • R 1 is a hydrogen atom or C ⁇ 2 .
  • Alkyl groups are preferred.
  • the isolated target peptide can be isolated by following a generally known method for purifying a peptide. For example, gel filtration, ion exchange chromatography, high performance liquid chromatography, affinity chromatography, hydrophobic chromatography, thin layer chromatography, electrophoresis and the like can be appropriately combined.
  • KiSS-1 peptide or a salt thereof may be isolated and purified from the reaction solution by known purification means, for example, extraction, salting out, partitioning, recrystallization, chromatography and the like.
  • purification means for example, extraction, salting out, partitioning, recrystallization, chromatography and the like.
  • SP-Sepharose Pharmacia Biotech Co., Ltd.
  • DEAE-5 PW Tohoku Soichi Co., Ltd.
  • SP-5 PW Tohso Soichi Co., Ltd.
  • a purification method using ion-exchange chromatography for example, SP-Sepharose (Pharmacia Biotech Co., Ltd.), DEAE-5 PW (Tohoku Soichi Co., Ltd.)
  • SP-5 PW Tohso Soichi Co., Ltd.
  • Ki SS-1 peptide or a salt thereof can be lyophilized to a powder if necessary.
  • lyophilization use sorbitol, mannitol, dextrose, manoletose, trenperulose, and glycerol. Any stabilizer can be added.
  • the K i SS-1 peptide or a salt thereof produced by the method of the present invention can be mixed with sterilized water, human serum albumin (HSA), physiological saline or other known physiologically acceptable carriers. It can be administered parenterally or topically to mammals (eg, humans). For example, the daily dosage is about 0.01 mg to 50 mg, preferably about 0.1 mg to 10 mg per person, administered parenterally by intravenous injection or intramuscular injection. be able to.
  • HSA human serum albumin
  • Formulations containing KiSS_1-peptide or a salt thereof produced by the method of the present invention may contain physiologically active substances such as salts, diluents, adjuvants, other carriers, buffers, binders, surfactants and preservatives. It may also contain other chemically acceptable active ingredients. Preparations for parenteral administration may be sterile aqueous solutions or suspension samples in physiologically acceptable solvents, or sterile powders (usually diluted with a peptide solution) which can be diluted before use with physiologically acceptable diluents. It is provided as an ampoule (obtained by lyophilization).
  • Ki SS-1 peptide or a salt thereof obtained by the production method of the present invention has a cancer metastasis inhibitory activity, it can be used for any cancer (eg, lung cancer, stomach cancer, liver cancer, Teng cancer, colorectal cancer, rectal cancer, colon cancer). It is useful as a prophylactic or therapeutic drug for cancer, prostate cancer, ovarian cancer, cervical cancer, breast cancer, etc.
  • Ki SS-1 peptide or its salt since Ki SS-1 peptide or its salt has a placental function regulating action, it may cause choriocarcinoma, hydatidiform mole, invasive mole, miscarriage, fetal growth deficiency, abnormal glucose metabolism, abnormal lipid metabolism, or induced labor. Useful as a prophylactic or therapeutic agent.
  • the KiSS-1 peptide is replaced with another target mature peptide, and a low molecular weight peptide having a cysteine at the N-terminal is further substituted with a C-terminal of the precursor protein of the target mature peptide.
  • the target mature peptide can be produced in the same manner by substituting the partial peptide on the side.
  • the partial peptide at the C-terminal side of the precursor protein of the present invention is a partial peptide at the C-terminal side of the precursor protein containing the target mature peptide.
  • a peptide having an amino acid sequence starting from an amino acid residue adjacent to the C-terminal amino acid residue of the target mature peptide is used.
  • Examples of the partial peptide at the C-terminal side of the precursor protein of the target matured peptide include, for example, about 10 to 50, preferably about 10 to 50 at the C-terminal side of the precursor protein of the matured target peptide.
  • a partial peptide having 20 to 40, more preferably about 20 to 30 amino acid residues is used.
  • Glx Glutamine or glutamic acid
  • sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences.
  • the nucleotide sequence of DNA encoding a low molecular weight peptide is shown.
  • the base sequence 1 of a DNA fragment encoding the fusion protein represented by the formula (I) is shown.
  • nucleotide sequence 2 of the DNA fragment encoding the fusion protein represented by the formula (I) is shown. [SEQ ID NO: 8]
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of an oligomer used in the preparation of the structural gene for iS S-1 peptide in Example 1.
  • Example 1 shows the base sequence of the oligomer used in Example 1 for preparing the structural gene of the KiSS-1 peptide.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of an oligomer used in the preparation of the structural gene for iS S-1 peptide in Example 1.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of an oligomer used in the preparation of the structural gene for iS S-1 peptide in Example 1.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of the DNA fragment obtained in Example 1.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of the DNA fragment obtained in Example 1.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of the DNA fragment obtained in Example 1.
  • 3 shows the amino acid sequence of KiSS-1 peptide precursor.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of mouse KiSS_1 peptide precursor (A).
  • the DNA fragments # 1 to # 4 obtained in a) above were combined to give 40 ⁇ l.
  • the mixture was kept at 65 ° C. for 10 minutes, and then gradually cooled to room temperature for annealing.
  • a ligation reaction was performed on 10 ⁇ l of this annealing solution using T4 DNA Ligase (Takara Shuzo).
  • Ligation Knocker 2 ⁇ l and ⁇ 4 DNA Ligation 1 1 (350 units) was added, mixed well, reacted at 16 ° C for 17 hours, ligated, and then heat-treated at 65 ° C for 5 minutes.
  • the DNA fragment thus obtained was phosphorylated with T4 polynucleotide kinase (Takara Shuzo), and then subjected to 1.8% low melting point agarose gel electrophoresis to obtain a 96 bp DNA fragment (SEQ ID NO: 12).
  • SEQ ID NO: 12 was extracted using ELUTIP Minicolumn (S & S), dissolved in 201 TE buffer, and subjected to the following (c).
  • Escherichia coli JM109 competent cells (Takara Shuzo) were transformed with 10 ⁇ ⁇ ⁇ of this reaction solution, and seeded on an LB agar medium containing 10 ⁇ g / m1 tetracycline. The cells were cultured at 37 ° C, and the resulting tetracytaline-resistant colonies were selected. The transformant was cultured in an LB medium for 1 mm, and a plasmid pTC2MetC24 was prepared using a QIAprep8 Miniprep Kit (Qiagen). The nucleotide sequence of the C i SS-1 structural gene portion with the addition of the C-terminal 24 amino acids was confirmed using an Applied Biosystems model 3100 DNA sequencer.
  • Escherichia coli MM294 (DE3) was transformed with the plasmid pTC2MetC24 to obtain a KiSS-1 protein-expressing strain MM294 (DE3) /pTC2MetC24-1.3 with a C-terminal 24 amino acid addition.
  • MM294 (DE3) / pTC2MetC24-l.3 in a volume of 2 L using 1 L (1% peptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride) in LB medium containing OmgZL tetracycline
  • the cells were shake-cultured at 37 ° C for 8 hours in a flask.
  • the obtained culture solution was added to a 19 L main fermentation medium (1.68% sodium monohydrogen phosphate, 0.3% potassium dihydrogen phosphate, 0.1% ammonium chloride, 0.05% sodium chloride).
  • This solution was diluted 4-fold with a 1 M urea solution, adjusted to pH 6.0 with acetic acid, and equilibrated with 5 OmM MES-NaOH buffer (pH 6.0). 75 m on a 0 C column (5 cm I Dx20 cmL, Tosoichi) After passing through and adsorbing at a flow rate of L time, 5 OmM MES-NaOH buffer 0.2 M NaC 1 pH 6.0 Washing with 50 mM MES-NaOH buffer 0 Eluted with 5M NaC1 pH 6.0.
  • the lyophilized powder was dissolved in a 0.1M acetic acid 6M urea solution, about 1.5 mg of DMAP-CN (l-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate) was added, and the mixture was reacted at room temperature for 15 minutes. After the completion of the reaction, the reaction solution was passed through a Sephadex G_25 column (2.5 cm IDx50 cmL, Pharmacia) equilibrated with 1 potassium phosphate 5 OmM, and 5 OmM phosphate used for equilibration was passed. One capsule was developed at a flow rate of 1 OralZ to obtain an S-cyanated KiSS-1 peptide-24 amino acid adduct protein fraction.
  • DMAP-CN l-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate
  • the eluate was concentrated and desalted with Centriplus (fraction molecular weight: 3 kDa; Millipore) to obtain a desalted solution of a KiSS-1_24 amino acid adduct.
  • Centriplus fraction molecular weight: 3 kDa; Millipore
  • urea was added to this desalted solution to a final concentration of 6 M
  • 25% aqueous ammonia was further added to a 3 M ammonia concentration, and the mixture was reacted at room temperature for 15 minutes.
  • the pH was adjusted to 6.0 with acetic acid to obtain a KiSS-1 peptide.
  • the reaction solution was passed through a Sephadex G-25 column (2.5 cm IDx50 cmL) equilibrated with 50 mM potassium phosphate, and the 50 mM phosphoric acid was used for equilibration.
  • the lyme was developed at a flow rate of 1 OmlZ to obtain a KiSS_1 peptide fraction.
  • This fraction was passed through C4P-50 (21.5 mm ID 300 mmL, Showa Denko) equilibrated with 0.1% trifluoroacetic acid, adsorbed and washed, and then flowed at 5 mL / min.
  • Amino acid composition was determined using an amino acid analyzer (Hitachi L-8500A Amino Acid Analyzer). The results agreed with the amino acid composition predicted from the DNA base sequence of the KiSS_1 peptide [Table 1].
  • the N-terminal amino acid sequence was determined using a gas phase protein sequencer (PE Applied Biosystems model 4.92). As a result, it was consistent with the N-terminal amino acid sequence predicted from the DNA sequence of K i S S-1 peptide.
  • Example 5 Production of DNA Encoding K-SS-1 Peptide with Addition of C-terminal 24 Amino Acids (2)
  • cancer for example, lung cancer, stomach cancer, liver cancer, carcinoma, colon cancer, rectum cancer, colon cancer, prostate cancer, ovarian cancer, cervical cancer, breast cancer, etc.
  • cancer for example, lung cancer, stomach cancer, liver cancer, carcinoma, colon cancer, rectum cancer, colon cancer, prostate cancer, ovarian cancer, cervical cancer, breast cancer, etc.

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Description

明 細 書
K i S S— 1ぺプチドの製造法 技術分野
本発明は、 N末端にシスティンを有する低分子ペプチドの N末端に、 K i S S— 1ぺプチドを連結した融合蛋白質またはポリぺプチドを製造し、 次い で該融合蛋白質またはポリべプチドをぺプチド結合の切断反応に付すことに より、 K i S S— 1ペプチドまたはその塩を製造する方法に関する。 背景技術
遺伝子組換え技術を用いて、 ペプチドを製造するに際しては、 ペプチドが 細胞内で、 分解を受けやすいために、 融合蛋白質の形で発現させることがし ばしば行なわれている。 融合蛋白質からの目的ペプチドの切り出しには、 ブ ロムシアンを用い化学的に切断する方法 （イタクラら、 Science, 198, 1056 (1977) )、ファフター X aを用い酵素的に切断する方法（ナガイら、 Methods in Enzymology, 153, 46 (1987) ) が知られている。
さらに、 蛋白質中のペプチド結合を切断する方法として、 2—二トロ一 5 —チオシァノ安息香酸によるァシルシスティン結合の切断が知られている
( 「生化学実験講座」 1， タンパク質の化学 II, 日本生化学会編， 東京化学 同人発行， 第 2 4 7〜2 5 0頁 1 ' 9 7 6年） 。 しかしながら、 蛋白質からの 目的べプチドの切り出しについては、 開示されていない。
WO O 0 / 2 4 8 9 0号および WO O 1 / 7 5 1 0 4号には、 本発明で用 いられる K i S S— 1ぺプチドまたはその塩が開示されている。
WO 0 1 / 4 4 4 6 9号には、 N末端にシスティンを有する蛋白質または ペプチドの N末端に、 K i S S— 1ペプチドを連結した融合蛋白質、 ぺプチ ドまたはその塩を該システィン残基のァミノ基側のぺプチド結合の切断反応 に付すことを特徴とする K i S S _ 1ぺプチドまたはその塩の製造法が開示 されており、 N末端にシスティンを有する蛋白質またはペプチドとして、 ィ ンターフェロン類、 インターロイキン類、 線維芽細胞成長因子 （a FGF、 b FGF)等各種成長因子類、 （プロ）ゥロキナーゼ類、 リンホトキシン、 Tumor Necrosis Factor(TNF), ]3—ガラ トシターゼなどの酵素タンパク類、 貯蔵 タンパク類、 ストレプトアビシン、 プロテイン A、 プロテイン G、 Tissue Plasminogen Activator (T PA)、 これらのムティン又はこれらの一部（断片） が例示されている。
従来知られている技術において、 融合蛋白質からの目的べプチドの切り出 しに際し、 ブロムシアンを用いる場合には、 メチォニンを含有するペプチド の製造には適用することはできないし、 切り出し時の収率等に問題が多い。 このように、 融合蛋白質またはポリペプチドから目的とするペプチドを効 率良く切り出す方法が望まれている。 発明の開示
本発明者らは、 新規生理活性ペプチドである K i S S— 1ペプチドまたは その塩を効率良く製造する方法について鋭意検討を加えたところ、 N末端に システィンを有^"る低分子のぺプチドの N末端に、 K i S S— 1ぺプチドを 連結した融合蛋白質またはポリべプチドを製造し、 次いでこれをぺプチド結 合を切断する反応に付すことにより、 K i S S— 1ぺプチドまたはその塩を 効率良く製造できることを見い出した。
すなわち、 本発明は、
( 1) N末端にシスティンを有する低分子ペプチドの N末端に、 K i S S— 1ぺプチドを連結した融合蛋白質、 ぺプチドまたはその塩を該システィン残 基のアミノ基側のぺプチド結合の切断反応に付すことを特徴とする K i S S 一 1ぺプチドまたはその塩の製造法、
(2) N末端にシスティンを有する低分子ペプチドの N末端に、 K i S S— 1ぺプチドを連結した融合蛋白質またはべプチドをコ一ドする DNAを有す るベクターを保持する形質転換体を培養して融合蛋白質、 ぺプチドまたはそ の塩を発現させ、 発現された融合蛋白質、 ペプチドまたはその塩を該システ ィン残基のァミノ基側のぺプチド結合の切断反応に付すことを特徴とする K i S S— 1ペプチドまたはその塩の製造法、
(3) 製造される K i S S- 1ぺプチドの C末端がァミ ドである上記 （ 1 ) または （2) 記載の製造法、
(4) 切断反応が S—シァノ化反応、 次いでアンモノ リシスまたは加水分解 反応に付す反応である上記 （1) または （2) 記載の製造法、
(5) K i S S— 1ペプチドが配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有 するペプチドである上記 （1) または （2) 記載の製造法、
(6) K i S S— lペプチドが、 ①配列番号： 1で表されるアミノ酸配列の N末端から第 40〜 54番目からなるアミノ酸配列を有するぺプチド、 ②配 列番号： 1で表されるアミノ酸配列の N末端から第 45〜54番目からなる アミノ酸配列を有するペプチド、 ③配列番号： 1で表されるアミノ酸配列の N末端から第 46〜54番目からなるアミノ酸配列を有するぺプチドまたは ④配列番号： 1で表されるアミノ酸配列の N末端から第 47〜 54番目から なるアミノ酸配列を有するペプチドである上記 （ 1) または （2) 記載の製 造法、
(7) N末端にシスティンを有する低分子ペプチドが、 N末端にシスティン を有し、 約 1 0〜約 50個のァミノ酸残基からなるぺプチドである上記 （ 1 ) または （2) 記載の製造法、
(8) 低分子ペプチドが、 K i S S_ 1ペプチドを含む前駆体蛋白質の C末 端側の部分ペプチドであって、 該 K i S S— 1ペプチドの C末端アミノ酸に 隣接するアミノ酸残基から始まるアミノ酸配列を有するぺプチドである上記
(1) または （2) 記載の製造法、
(9) N末端にシスティンを有する低分子ペプチドが、 配列番号： 3で表さ れるアミノ酸配列を含有し、 その N末端にシスティン残基が付加したぺプチ ドである上記 （1) または （2) 記載の製造法、
( 10) N末端にシスティンを有する低分子ペプチドが配列番号： 3で表さ れるアミノ酸配列を含有し、 その N末端にシスティン残基が付加したぺプチ ドであり、 K i S S— 1ぺプチドが配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を 有するペプチドであり、 製造される K i S S— 1ペプチドの C末端がアミ ド である配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を有するぺプチドである上記
(I) または （2) 記載の製造法、
(I I) N末端にシスティンを有する低分子ペプチドの N末端に、 K i S S - 1ぺプチドを連結した融合蛋白質、 ぺプチドまたはその塩、
(1 2) 配列番号： 5で表わされるアミノ酸配列を含有する上記 （1 1) 記 載の融合蛋白質、 ペプチドまたはその塩、
(1 3) 上記 （1 1) 記載の融合蛋白質またはペプチドをコードする DNA を含有する DNA、
( 14) ①配列番号： 6で表される塩基配列または②配列番号： 7で表され る塩基配列を有する上記 （1 3) 記載の DNA、
(1 5) 上記 （1 3) 記載の DNAを有するベクタ一、
(1 6) 上記 （1 5) 記載のベクターを含有する形質転換体、 および
(1 7) FERM B P— 7823で表示されるエシュリ ヒア ' コリ MM2 94 (DE 3) /PTC 2Me t C 24- l . 3を提供する。
さらに、 本発明は、
(1 8) 次の①〜④の工程；
① N末端にシスティンを有する低分子べプチドの N末端システィンに、 K i S S- 1ぺプチドを連結した融合蛋白質またはべプチドをコ一ドする DNA を作製する、
②該 DNAを有するベクターを作製する、
③該ベクターを保持する形質転換体を培養して融合蛋白質、 ぺプチドまたは その塩を発現させる、
④発現された融合蛋白質、 ぺプチドまたはその塩を該システィン残基のアミ ノ基側のぺプチド結合の切断反応に付す、
からなる第 （2) 項記載の製造法、
(1 9) N末端にシスティンを有する低分子ペプチド （ここで低分子ぺプチ ドとは、 目的成熟ぺプチドの前駆体蛋白質の C末端側の部分べプチドをいう） の N末端に、 目的成熟ペプチドを連結した融合蛋白質、 ペプチドまたはその 塩を該システィン残基のァミノ基側のぺプチド結合の切断反応に付すことを 特徴とする目的成熟べプチドまたはその塩の製造法、
(2 0) N末端にシスティンを有する低分子ペプチド （ここで低分子べプチ ドとは、 目的成熟べプチドの前駆体蛋白質の C末端側の部分べプチドをいう） の N末端に、 目的成熟べプチドを連結した融合蛋白質またはべプチドをコ一 ドする DNAを有するベクターを保持する形質転換体を培養して融合蛋白質、 ペプチドまたはその塩を発現させ、 発現された融合蛋白質、 ペプチドまたは その塩を該システィン残基のアミノ基側のぺプチド結合の切断反応に付すこ とを特徴とする目的成熟べプチドまたはその塩の製造法、
(2 1 ) 切断反応が S _シァノ化反応、 次いでアンモノリシスまたは加水分 解反応に付す反応である上記 （1 9) または （2 0) 記載の製造法、
(2 2) 目的成熟べプチドが約 1 0〜 1 0 0個のアミノ酸残基を含有するぺ プチドである上記 （1 9) または （2 0) 記載の製造法、
(2 3) N末端にシスティンを有する低分子ペプチドが、 N末端にシスティ ンを有し、約 1 0〜約 5 0個のアミノ酸残基からなるぺプチドである上記（1 9) または （2 0) 記載の製造法、
(24) N末端にシスティンを有する低分子ペプチド （ここで低分子べプチ ドとは、 目的成熟べプチドの前駆体蛋白質の C末端側の部分べプチドをレヽう） の N末端に、 目的成熟ペプチドを連結した融合蛋白質、 ペプチドまたはその ノ ηη、
( 2 5) 上記 （24) 記載の融合蛋白質またはペプチドをコードする DNA を含有する DNA、
(2 6) 上記 （2 5) 記載の DNAを有するベクター、
(2 7) 上記 （2 6) 記載のベクターを含有する形質転換体、 および
(2 8) 次の①〜④の工程；
① N末端にシスティンを有する低分子ペプチド （ここで低分子ペプチドとは、 目的成熟べプチドの前駆体蛋白質の C末端側の部分べプチドをいう） の N末 端システィンに、 目的成熟べプチドを連結した融合蛋白質またはべプチドを コードする DNAを作製する、
②該 DN Aを有するベクターを作製する、 ③該ベクターを保持する形質転換体を培養して融合蛋白質、 ぺプチドまたは その塩を発現させる、
④発現された融合蛋白質、 ぺプチドまたはその塩を該システィン残基のァミ ノ基側のぺプチド結合の切断反応に付す、
からなる第 （20) 項記載の製造法を提供する。 図面の簡単な説明
図 1は実施例 1で用いられた DN Aフラグメントを示す。
図 2は実施例 1で得られたプラスミ ド p TC 2Me t C 24の構築図を示す c 図 3は実施例 5で得られたプラスミ ド p TC 2Me t C 24の構築図を示す c 発明を実施するための最良の形態
本発明の方法に用いられる K i S S— 1ぺプチドとしては、 例えば WO 0 0/24890号に記載のヒ ト K i S S - 1ぺプチド、 WO 0 1/75 1 0 4号に記載のマウスまたはラッ ト K i S S_ 1ぺプチドが用いられる。
ヒ ト K i S S— 1ペプチドとしては、 具体的には、 本願の配列番号： 1で 表されるアミノ酸配列において、 N末端から第 47〜54番目のアミノ酸配 列を含有し、 8乃至 54個のアミノ酸残基からなるぺプチドなどがあげられ る。
「本願の配列番号： 1で表されるアミノ酸配列において、 N末端から第 4
7〜 54番目のアミノ酸配列を含有し、 8乃至 54個のアミノ酸残基からな るペプチド」 としては、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列において、 N 末端から第 47〜54番目のアミノ酸配列を含有し、 かつ 8乃至 54個のァ ミノ酸残基からなるぺプチドであればいかなるものであってもよいが、 ぺプ チド活性 （例えば、 ペプチドと受容体の結合活性、 ペプチドによって引き起 こされる受容体発現細胞の細胞刺激活性など） などが、 実質的に同じである ことを意味する。 具体的には、 ①本願の配列番号： 1で表されるアミノ酸配 列で表されるペプチド、 ②本願の配列番号： 1で表されるアミノ酸配列にお いて、 N末端から第 47〜54番目のアミノ酸配列を C末端に有し、 8乃至 1 5個のアミノ酸残基からなるぺプチドなどが用いられる。
より具体的には、 ヒ ト K i S S— 1ぺプチドとしては、①本願の配列番号： 1で表されるアミノ酸配列で表されるペプチド、 ②本願の配列番号： 1で表 されるアミノ酸配列の N末端から第 4 0〜5 4番目からなるアミノ酸配列で 表されるペプチド、 ③本願の配列番号： 1で表されるアミノ酸配列の N末端 から第 4 5〜5 4番目からなるアミノ酸配列で表されるぺプチド、 ④本願の 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列の N末端から第 4 6〜5 4番目からな るアミノ酸配列で表されるペプチド、 ⑤本願の配列番号： 1で表されるアミ ノ酸配列の N末端から第 4 7〜5 4番目からなるアミノ酸配列で表されるぺ プチドなどがあげられる。
マウス K i S S— 1ペプチド （A) としては、 例えば、 ①配列番号： 1 6 で表されるアミノ酸配列の N末端から第 1 3 4〜 1 4 1番目のアミノ酸配列 を含有し、 8ないし 5 2個のアミノ酸残基からなるぺプチドなどが用いられ、 具体的には、 ①配列番号： 1 6で表されるアミノ酸配列の N末端から第 9 0 〜 1 4 1番目のアミノ酸配列を有するペプチド、 ②配列番号： 1 6で表され るアミノ酸配列の N末端から第 1 3 2〜1 4 1番目のアミノ酸配列を有する ペプチド、 ③配列番号： 1 6で表されるアミノ酸配列の N末端から第 1 2 7 〜1 4 1番目のアミノ酸配列を有するペプチドなどが用いられる。
マウス K i S S— 1ペプチド （B ) としては、 例えば、 配列番号： 1 7で 表されるアミノ酸配列の N末端から第 1 3 8〜1 4 5番目のアミノ酸配列を 含有し、 8ないし 5 2個のアミノ酸残基からなるペプチドなどが用いられ、 具体的には、 配列番号： 1 7で表されるアミノ酸配列の N末端から第 9 4〜 1 4 5番目のァミノ酸配列を有するぺプチドなどが用いられる。
ラッ ト K i S S _ lぺプチドとしては、 例えば、 配列番号： 1 8で表され るアミノ酸配列の N末端から第 1 1 2〜 1 1 9番目のアミノ酸配列を含有し, 8ないし 5 2個のアミノ酸残基からなるぺプチドなどが用いられ、 具体的に は、 ①配列番号： 1 8で表されるアミノ酸配列の N末端から第 6 8〜 1 1 9 番目のアミノ酸配列を有するペプチド、 ②配列番号： 1 8で表されるァミノ 酸配列の N末端から第 1 1 0〜 1 1 9番目のアミノ酸配列を有するぺプチド、 ③配列番号： 1 8で表されるアミノ酸配列の N末端から第 1 0 5〜 1 1 9番 目のァミノ酸配列を有するぺプチドなどが挙げられる。
上記 i S S - 1ぺプチドは、 WO 0 0 / 2 4 8 9 0号または W〇 0 1 / 7 5 1 0 4号に記載のレセプター蛋白質 O T 7 T 1 7 5に対し、 リガンド活 性を有する。
本明細書におけるぺプチドはぺプチド標記の慣例に従って左端が N末端 (ァミノ末端） 、 右端が C末端 （カルボキシル末端） である。 配列番号： 1 で表されるぺプチドの C末端は、アミ ド（_C0NH 2 )、カルボキシル基（- C00H)、 カルボキシレ一ト（- C00一）、アルキルアミ ド（-C0NHR)またはエステル（- C00R) であってもよい。 エステルまたはアルキルアミ ドの Rとしては、 例えばメチ ノレ、 ェチル、 n—プロピル、 イソプロピルもしくは n _ブチルなどの C j— 6 アルキル基、シク口ペンチル、シク口へキシルなどの C Q— 8シク口アルキル基、 フエニル、 ct —ナフチルなどの C e ^ 2ァリール基、 ベンジル、 フエネチル、 ベンズヒ ドリルなどのフエ二ルー〇1 - 2アルキル、もしくは α —ナフチルメチ ルなどの α—ナフチル一 C卜2アルキルなどの C n 4ァラルキル基のほか、 経口用エステルとして汎用されるビバロイルォキシメチル基などがあげられ る。
さらに、 K i S S— 1ペプチドには、 N末端のメチォニン残基のアミノ基 が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチルなどの C 2 _ 6アルカノィル基などの い 6ァシル基など）で保護されているもの、 N端側が生体内で切断され生成 したダル夕ミル基がピログルタミン酸化したもの、 分子内のアミノ酸の側鎖 上の置換基 （例えば、 —〇H、 — S H、 — C〇〇H、 アミノ基、 イミダゾ一 ル基、 インドール基、 グァニジノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホルミ ル基、 ァセチルなどの C 2 _ 6アルカノィル基などの Cい 6ァシル基など） で保 護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合 ぺプチドなども含まれる。
本発明の K i S S— 1ペプチドの塩としては、 生理学的に許容される塩基
(例えばアルカリ金属など） や酸（有機酸、 無機酸） との塩が用いられるが、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。 このような塩としては 例えば無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるい は有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コ ハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 シユウ酸、 安息香酸、 メタンスルホ ン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩などが用いられる。
本発明の方法に用いられる N末端にシスティンを有する蛋白質またはぺプ チドとしては、 特定されるものではない。 その N末端にシスティンを有しな い蛋白質またはぺプチドの場合は、 自体公知の方法により N末端にシスティ ンを有するようにすればよい。
該 N末端にシスティンを有する低分子べプチドの 「低分子べプチド」 とし ては、 例えば約 1 0〜5 0個、 好ましくは約 2 0〜4 0個、 さらに好ましく は約 2 0〜 3 0個アミノ酸残基を有するものが好ましい。 なかでも、 ①配列 番号： 1 5で表されるアミノ酸配列を含有するヒ ト K i S S _ 1ぺプチド前 駆体 （例えば、 J. Natl. Cancer Inst., 88, 1731, 1996； WO 9 8/3 94
4 8号） の部分ペプチド、 ②配列番号： 1 6で表されるアミノ酸配列を含有 するマウス K i S S— 1ペプチド前駆体 （A) (WO 0 1Z7 5 1 04号） の部分ペプチド、 ③配列番号： 1 7で表されるアミノ酸配列を含有するマウ ス K i S S - 1ぺプチド前駆体 （B) (WO 0 1 7 5 1 04号） の部分べ プチド、 ④配列番号： 1 8で表されるアミノ酸配列を含有するラット K i S
5 - 1ぺプチド前駆体 （WO 0 1 7 5 1 04号） の部分べプチドなどが用 いられ、 なかでもこれら K i S S— 1ペプチド前駆体の C末端側の部分ぺプ チドが好ましい。 より好ましくは、 低分子ペプチドとしては、 K i S S— 1 ペプチドを含む前駆体蛋白質の C末端側の部分ペプチドであって、 該 K i S S— 1ぺプチドの C末端アミノ酸に隣接するアミノ酸残基から始まるァミノ 酸配列を有するぺプチドなどが用いられる。
より具体的には、 該低分子べプチドとしては、 例えば、
( 1 ) K i S S— 1ぺプチドがヒ ト K i S S— 1ぺプチドである場合は、 配 列番号： 3で表わされるアミノ酸配列を含有する、 ヒ ト K i S S— 1ぺプチ ド前駆体の c末端側の部分べプチドなどが、
(2) K i S S- 1ぺプチドがマウス K i S S— 1ぺプチド （A) である場 合は、 配列番号： 1 6で表わされるアミノ酸配列の N末端から第 1 4 2〜1 5 2番目のアミノ酸配列を有する、 マウス S S— 1ぺプチド前駆体の C 末端側の部分べプチドなどが、
(3) K i S S— 1ぺプチドがマウス K i S S— 1ぺプチド （B) である場 合は、 配列番号： 1 7で表わされるアミノ酸配列の N末端から第 1 4 6〜1
5 6番目のアミノ酸配列を有する、 マウス i S S- 1ぺプチド前駆体の C 末端側の部分べプチドなどが、
(4) K i S S - 1ぺプチドがラッ ト K i S S— 1ぺプチドである場合は、 配列番号： 1 8表わされるアミノ酸配列の N末端から第 1 2 0〜1 3 0番目 のアミノ酸配列を有する、 ラット K i S S— 1ペプチド前駆体の C末端側の 部分べプチドなどが好ましく用いられる。
本発明の方法においては、 これらの低分子べプチドの N末端にシスティン が連結している。
本発明方法で用いられる融合蛋白質 （融合ペプチドを含む） をコードする DNAは、 （1)全塩基配列を化学的に合成してもよいし、 （2)低分子べプチ ドをコ一ドする塩基配列の N末端側にシスティンをコ一ドする塩基配列を配 置し、 さらにその N末端側に K i S S— 1ペプチドをコードする塩基配列を 配置することにより該 DNAを構築してもよい。 また、 （3) 該ペプチドのフ ラグメントを得るのが目的の場合には、 所望のフラグメン卜の直後のァミノ 酸残基を site- directed mutagenesis 等の手法でシスティンに置換した該 D N Aを構築すればよい。
上記の（1 )の場合の製造法としては、 例えば、 自体公知のホスホアミダイ ド法、 リン酸トリエステル法、 ジエステル法、 ハイ ドロジェンホスホネート 法などを用いて、 短いものなら一度に、 長いものでは分割して合成した後に T 4 DNAリガーゼを用いて連結して作成することが可能である。
上記の（2)の場合の製造法としては、 例えば、 C末端側の蛋白質をコード する DANは、 染色体または c DN Aから適当な制限酵素で切断し、 ベクタ —に連結して得るか、 もしくは cDN Aを取得する。 しかる後に N末端がシス ティンになるように制限酵素で切断するか、 もしくは、 合成 DNAを全蛋白 もしくはその一部の遺伝子の 5'—末端に結合し N末端がシスティンになる ように改変する。 その 5'—末端に目的の蛋白質をコ一ドする DAN (化学合 成したものでも、 生体よりクローニングしてきたものでもよレ、）をつなげる。 このようにして得られる融合蛋白質をコードする DNAの具体例としては、 例えば式
Figure imgf000012_0001
GAACTCTTTCGGTCTGCGTTTC (配列番号： 2) -TGC または TGT-R (I)
〔式中、 Rは配列番号： 4で表わされる塩基配列を示す。 〕 で表わされる塩 基配列 （配列番号： 6または 7) を含有する DN Aなどがあげられる。
上記式 （ I ) はヒ ト K i S S— 1ぺプチドを含有するぺプチドをコ一ドす る DNA塩基配列 （配列番号： 2) にシスティンをコードする塩基配列 （TGC または TGT) を介して Rで示される塩基配列 （配列番号： 4) が結合している ことを示す。
ヒ ト K i S S_ 1ぺプチドをコ一ドする DNAは、 上記式 （ I ) で表され る DN Aや配列番号： 1 5で表されるアミノ酸配列を含有するヒ ト K i S S _ 1ペプチド前駆体をコードする DNAまたはその改変 DNA (例えば、 J. Natl. Cancer Inst. , 88, 1731, 1996； WO 98/39448号） を用いて、 自体公知の方法に従って製造することもできる。
マウス K i S S— 1ぺプチドをコ一ドする DNAは、 配列番号： 1 6で表 されるアミノ酸配列を有するマウス K i S S— 1ペプチド前駆体 （A) をコ ードする DNA (配列番号： 1 9) またはその改変 DNA (WO 0 1/75 1 04号） や配列番号： 1 7で表されるアミノ酸配列を有するマウス K i S S— 1ペプチド前駆体 （B) をコードする DNA (配列番号： 20) または その改変 DNA (WO 01 Z 75 1 04号） を用いて、 自体公知の方法に従 つて製造することができる。
ラット K i S S— 1ぺプチドをコ一ドする DNAは、 配列番号： 1 8で表 されるアミノ酸配列を有するラット K i S S— 1ぺプチド前駆体をコ一ドす る DNA (配列番号： 21) またはその改変 DNA (WO 01 75 1 04 号） を用いて、 自体公知の方法に従って製造することができる。
5'末端に ATGを有し、 その下流に該融合蛋白質をコードする領域、 つい で翻訳終止コドンを有する DNA (プラスミ ド）は、 化学合成で、 あるいは遺 伝子工学的に製造された公知の該蛋白質の cDNA、 もしくは、 染色体由来の 該蛋白質の DN Aを加工することにより製造することができる。
本発明の N末端にシスティンを有する低分子べプチドの N末端に K i S S ― 1ぺプチドを連結した融合蛋白質またはべプチドをコ一ドする DNAを、 従来の DNA技術、 例えば特定部位指向性変異誘発技術を用いて目的のムテ ィンをコ一ドする DNAに変換することができる。
特定部位指向性変異誘発技術は周知であり、アール'エフ ·レイザー（Lather, R. F.)及びジエイ · ピー ' レコック（Lecoq, J. P. ) , ジェネティック 'ェン ジニァリング（Genetic Engineering), ァカデミックプレス社（1 9 8 3年）第 3 1 - 5 0頁に示されている。 オリゴヌクレオチドに指示された変異誘発は ェム · スミス（Smith, M. ) 及びエス · ギラム（Gillam, S. )、 ジエネティック · エンジニアリング：原理と方法、 プレナムプムス社（1 9 8 1年） 3卷 1一 3 2頁に示されている。
該融合蛋白質をコードする領域を有する DNAを有するプラスミ ドを製造 するにあたって、 ベクターとして用いられるプラスミ ドとしては、 例えば大 月昜菌 （Escherichia coli) 由来の pBR 3 2 2 〔ジーン（Gene), 2 , 9 5 (1 9 7 7)〕 ， pBR 3 1 3 〔ジーン， 2, 7 5 (1 9 7 7)] , ρΒ R 3 24 , ρ Β R 3 2 5 〔ジーン， 4, 1 24 (1 9 7 8)] , ρΒ R 3 2 7 , ρΒ R 3 2 8 〔ジーン， 9， 2 8 7 (1 9 8 0)〕 ， pBR 3 2 9 〔ジーン， 1 7， 7 9 (1 9 8 2)〕 ， ρΚΥ 2 2 8 9 〔ジーン， 3， 1 (1 9 7 8)〕 ， ρΚΥ 2 7 00 〔生化学， 5 2， 7 7 0 (1 9 8 0)〕 ， pAC YC 1.7 7 , pAC YC 1 84 〔ジャーナノレ ·ォプ '·ノ クテリォロジ一 (Journal of Bacteriology)， 1 3 4, 1 1 4 1 (1 9 7 8)〕 , ρ RK 24 8 , ρ RK 6 4 6 , pD F 〔メ ソッズ 'ィ ン.ェン ジーモ口ジー（Methods in Enzymology) , 6 8 , 2 6 8 (1 9 7 9)〕， pUC 1 8 , pUC 1 9 〔ャニシュ一ペロンら， ジーン（Gene) , 3 3， 1 0 3 (1 9 8 5)〕 などがあげられる。 また、 バクテリオファージ、 例えばえファージ を使用したえ gt系のえ gt · え C [Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 7 1 , 4 5 7 9 (1 9 74)] , λ gt · I B [Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 7 2, 34 6 1 (1 9 7 5)〕 ， λ Dam 〔ジーン， 1 , 2 5 5 (1 9 7 7)〕 ゃシ ヤロンべクタ一 〔サイエンス， （Science), 1 9 6, 1 6 1 (1 9 7 7) ； ジャ ーナノレ ·ォブ · ビ一口口ジー（Journal of Virology), 2 9, 5 5 5 (1 9 7 9)〕 ， 繊維状ファージを使用した nip系の mp 1 8 , mpl 9 〔ャニシュ一ペロン ら， ジーン（Gene), 3 3， 1 03 ( 1 9 8 5 )〕 ベクターなどもあげられる。 上記 DNAは、 ATGの上流にプロモーターを有しているのが好ましく、 該プロモーターは、 形質転換体の製造に用いる宿主に対応して適切なプロモ 一ターであればいかなるものでもよい。
例えば大月昜菌（Escherichia coli)では trpプロモーター， lacプロモーター， rec Aプロモーター， L P Lプロモーター， lppプロモーター， T 7プロモー ターなど、 枯草菌（Bacillus subtilis)では S PO 1プロモーター， S P02 フロモータ ^ ~， pen Pプロモーターなと、 酵母 (aaccharomyces cerevisiae)で は PH05プロモーター， PGKプロモーター， GAPプロモーター， AD Hプロモーターなど、 動物細胞では S V 4 0由来のプロモーターなどがあげ られる。 必要によ SD (シャインアンドダルガーノ）配列をプロモーターの 下流に挿入してもよい。
T 7プロモーターの系を用いる場合には、 T 7プロモーターとしては、 T 7 DNA上で見い出されている 1 7種のプロモーター〔J. L. Oakleyら， Proc. Natl. Acad. Sci, U. S. A, 74 : 4 2 6 6 -4 2 7 0 (1 9 7 7), M. D. Rosa, Cell 1 6 ： 8 1 5 - 8 2 5 (1 9 7 9), N. Panayotatos ら， Nature, 2 8
0 ： 3 5 (1 9 7 9), J. J. Dunn ら， Mol. Biol. , 1 6 6 : 4 7 7 - 5 3 5 (1 9 8 3)〕 のいずれでもよいが φ 1 0プロモーター 〔A. H. Rosenberg ら， Gene, 5 6 ： 1 2 5— 1 3 5 (1 9 8 7)〕 が好ましレ、。
転写ターミネータ一としては、 大腸菌の系で作動するターミネータ一、 好 ましくは Τ φターミネ一ター 〔F. W. Studier ら， J. Mol. Biol. , 1 8 9 :
1 1 3— 1 30 (1 9 8 6)〕 が用いられる。
Τ 7 RNAポリメラーゼ遺伝子としては Τ 7遺伝子 〔F. W. Studier ら， J. Mol. Biol. , 1 8 9 : 1 1 3— 1 3 0 (1 9 8 6)〕 をあげることが出来る。 ベクターは上記べクタ一に T 7プロモータ一， T 7ターミネ一ターを組み 込んで構築されるのが好ましく、 このようなベクタ一としては、 pET— 1， pE T- 2 , pET— 3 , pET— 4, pET— 5 [A. H. Rosenberg, Gene 5 6 ： 1 2 5— 1 3 5 (1 9 8 7)〕 、 T B 9 6 0 - 2 [E P - A- 4 9 9 9 9
0〕などをあげることができる力 好ましくは pTB 9 6 0— 2が用いられる。 本発明の形質転換体は、 上記方法で得られる発現用プラスミ ドを自体公知 の方法 〔例、 コーェン S， N， ら， プロシージング 'ォブ 'ナショナル 'ァカ デミ一 'ォブ 'サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.), 6 9， 2 1 1 0 (1 9 7 2)〕 で宿主を形質転換することにより製造することができる。 形質転換される微生物の宿主としては、 例えば、 ェシエリシァ
(Escherichia)属菌， バチリス（Bacillus)属菌， 酵母， 動物細胞などがあげら れる。
上記ェシェリシァ属菌の例としては、 ェシエリシァ， コリ（E. coli)があげ られ、 具体的にはェシェリシァ · コリ（Escherichia coli)K 1 2 DH 1 〔プ 口シーデイングス.ォブ ·ナショナル 'アカデミー'ォブ ·サイエンシズ（Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.), 6 0， 1 6 0 (1 9 6 8)〕 ， JM— 1 0 3 〔ヌ クレイック ♦ァシッズ ' リサーチ， （Nucleic Acids Research), 9， 3 0 9 (1 9 8 1)〕 ， J A 2 2 1 〔ジャーナル .ォブ 'モレキュラー 'バイオロジー (Journal of Molecular Biology), 1 2 0， 5 1 7 (1 9 7 8)] , HB 1 0 1 〔ジャーナル 'ォ ブ 'モレ キュラー ·バイオ口ジー， 4 1 , 4 5 9 (1 9 6 9)〕， C 6 0 0 〔ジェネティックス（Genetics), 3 9, 44 0 (1 9 5 4)〕， N4 8 3 0 〔セル（Cell), 2 5, 7 1 3 (1 9 8 1)〕 ， K 1 2MM2 94 〔プロシーディングス ·ォブ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシ ズ， 7 3， 4 1 74 (1 9 7 6)] B L— 2 1などがあげられる。
上記バチルス属菌としては、例えばバチルス.サチルス（Bacillus subtilis) があげられ、 具体的にはバチルス 'サチルス M I 1 1 4 (ジーン， 2 4, 2 5 5 (1 9 8 3)), 2 0 7 - 2 1 〔ジャーナル ·ォブ 'バイオケミス トリー (Journal of Biochemistry), 9 5， 8 7 (1 9 84)〕 などがあげられる。 上記酵母としては、例えばサッカロマイセス 'セレビシァェ（Saccharomyces cerevisiae)があげられ、 具体的には、 サッカロマイセス ·セレビシァェ AH 2 2 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 7 5， 1 9 2 9 (1 9 7 8)] , X S B 5 2 - 2 3 C [Proc. Natl. Acad. Sci. U SA, 7 7 2 1 7 3 ( 1 9 8 0)〕 ， BH- 6 4 1 A(ATCC 2 8 3 3 9), 20 B - 1 2 (Genetics, 8 5, 2 3 (1 9 7 6)〕 ， GM3 C— 2 [Proc. Natl. Acad. Sci. U SA, 7 8 2 2 5 8 (1 9 8 1)〕 などがあげられる。
動物細胞としては、 例えばサル細胞 CO S— 7 〔セル（Cell), 2 3, 1 7 5 (1 9 8 1)〕 ， Vero 〔 (日本臨床 2 1 , 1 2 0 9 (1 9 6 3)〕 ， チヤィニ ーズハムスター細胞 CHO 〔ジャーナル ' ォブ ·ェクスペリメンタル ' メデ イシン（J. Exp. Med.), 1 08, 94 5 ( 1 9 8 5 )〕 ， マウス L細胞 〔ジャ ーナル ·ォブ ·ナショナル ·キャンサー ·ィンスティチュート（J. Nat. Cancer Inst.), 4， 1 6 5 (1 94 3)〕 ， ヒ ト F L細胞 〔プロシーディンダス ' ォ ブ ·ザ · ソサエティ · フォー ·エキスぺリメンタル ·バイオロジー 'アンド ' メデイシン（Proc. Soc. Exp. Biol. Med. ) , 94, 5 3 2 (1 9 5 7)〕 ， ノヽ ムスター C細胞などがあげられる。
T 7プロモーターの系を用いる場合には、 その形質転換体の宿主としては、 T 7 RNAポリメラーゼ遺伝子（T 7遺伝子 1 ) 〔F. W. Studierら， J. Mol. Biol. 1 8 9 : 1 1 3— 1 3 0 (1 9 8 6)〕 を組み込んだ大腸菌株、 例えば MM 2 9 4, DH- 1 , C 6 00 , J M 1 0 9, B L 2 1 , あるレ、は T 7 R ΝΑポリメラーゼ遺伝子（Τ 7遺伝子 1)を他のプラスミ ドと共に組込んだ大 腸菌株などが用いられる。 好ましくは Τ 7遺伝子 1を組み込んだえファージ が溶原化した ΜΜ2 9 4株および B L 2 1株が用いられる。 この場合 Τ 7遺 伝子 1のプロモーターとしては、 ィソプロピル一 1一チォー β— D—ガラク トピラノシド（I PTGと略することがある。 ）で発現が誘導される lacプロモ 一ターが用いられる。
ェシエリヒア属菌を形質転換するには、 例えば、 プロシージングズ.ォブ · ザ .ナショナル 'アカデミー 'ォブ .サイェンジィズ ·ォブ ·ザ .ュ一エス エー （Proc. Natl. Acad. Sci. U SA) , 6 9卷， 2 1 1 0 (1 9 7 2)ゃジ ーン （Gene) , 1 7卷， 1 0 7 ( 1 9 8 2 )などに記載の方法に従って行なう ことができる。
バチルス属菌を宿主として形質転換するには、 例えばモレキュラー · アン ド · シエネラノレ · シエネティックス (Molecular and General Genetics) , 168, 111 (1979)など公知の方法に従って行なうことができる。
酵母菌を宿主として形質転換するには、例えば、 プロシージングズ 'ォブ · ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンジィズ ·ォブ ·ザ · ユーエス エー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 75, 1929 (1978)などの公知の方法に 従って行なうことができる。
動物細胞を宿主として形質転換するには、 例えば、 ヴィーロロジー
(Virology, 52, 456 (1973)などの公知の方法に従って行なうことができる。 融合蛋白は、 上述の形質転換体を培地に培養し、 産生された融合蛋白を採 取することにより製造することができる。
培地の pHは約 6〜8が望ましい。
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えばグルコース、 カザ ミノ酸を含む M 9培地 〔Mi ller， ジャーナル 'ォブ 'ェクスペリメンッ 'ィ ン ·モレキユラ一 · シェ不テイツクス uournal of Experiments in Molecular Genetics) , 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972)〕 力 S 好ましい。/ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、 例え ば 3 3—インドリル アクリル酸やイソプロピル i3—D—チォガラク トビラ ノシド （ I P T G ) のような薬剤を加えることができる。
宿主がェシェリヒア属菌の場合、 培養は通常約 1 5〜4 3 °Cで約 3〜2 4 時間行い、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 3 0〜4 0 °Cで約 6〜 2 4時間 行い、 必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えばバーク ホールダー（Burkholder)最小培地 〔Bostian, K. L. ら、 プロシージンダス ' ォブ ·ナショナル ' アカデミー ·ォブ · サイエンス（Pro Natl. Acad. Sci. ) USA, 77, 4505 (1980) ] があげられる。 培地の pHは約 5〜 8に調整するのが 好ましい。 培養は通常約 2 0〜 3 5 °Cで約 24〜 7 2時間行い、 必要に応じ て通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば約 0. 2-2 0 %好ましくは約 5〜 2 0 %の胎児牛血清を含む MEM培地〔サイ エンス（Science), 122, 501 (1952)] , DME培地 〔ヴイロロジー（Virology)， 8， 396(1959)〕 ， R PM I 1 64 0培地 〔ジャーナル 'ォブ ·ザ ·アメリカ ン ·メティカノレ · ァソシェ一ション (The Journal of the American Medical Association), 199, 519(1967)〕 ， 1 9 9培地 〔プロシ一デイング 'ォブ ' ザ . ソサイエティ 'フォー 'ザ'バイオ口ジカル ·メディスン（Proceeding of the Society for the Biologcal Medicine), 73, 1 (1950)〕 などがあげられ る。 pHは約 6〜8であるのが好ましい。 培養は通常約 3 0〜4 0°C、 培養時 間は約 1 5〜6 0時間行い、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
融合蛋白質は、上記形質転換体を培養し、培養物中に該融合蛋白質を生成， 蓄積せしめ、 これを採取することにより製造することができる。
培地としては、 例えばグルコース、 カザミノ酸を含む M 9培地 〔ミラ一， J.， ェクスペリメンッ ·イン 'モレキユラ一 · ジエネティクス（Experiments in Molecular Genetics) , 4 3 1—4 3 3 (し old Spring Horbor Laboratort, New York 1 9 7 2)〕 ， 2 XYT培地 〔メシング， メソッド 'イン ·ェンザ ィモロジ一（Methods in Enzymology), 1 0 1 , 2 0 (1 9 8 3)〕 LB培地な どがあげられる。
培養は通常約 1 5〜 4 3 °Cで約 3〜 24時間行い、 必要により、 通気ゃ撹 拌を加えてもよい。
え c I tsリプレッサーと、 え P L—プロモータ一を含有する発現べクタ一と を有する組換え体を使用する場合には、 培養は約 1 5〜3 6 °C好ましくは約 30〜3 6 °Cの温度で行い、 Ac I tsリプレッサーの不活化は約 3 7〜 4 2 °C で行うのが好ましい。 また recAプロモーターをより効率良く働かせるため、 すなわち recA遺伝子発現抑制機能を低下せしめるため、必要によりマイ トマ イシン C, ナルジキシン酸などのような薬剤を添加したり、 紫外線を照射す る、 あるいは培養液の p Hをアル力リ側に変化させてもよレ、。 T 7プロモーターの系を用いている場合には、 （ 1 ) lacプロモ一ターの下流 に連結されている T 7遺伝子（RN Aポリメラーゼ遺伝子）を発現させる時は I PTGなどを添加する、 もしくは（2) λ プロモーターの下流に連結され ている T 7遺伝子 （RN Aポリメラーゼ遺伝子） を発現させる時は培養の温 度を上昇させることなどにより、 生成する T 7ファージ RNAポリメラーゼ 1により特異的に T 7プロモーターを作動させる。
培養後、公知の方法で菌体を集め、例えば緩衝液に懸濁したのち、例えば、 蛋白変性剤処理， 超音波処理ゃリゾチームなどの酵素処理， グラスビーズ処 理， フレンチプレス処理， 凍結融解処理などを行って菌体を破砕し、 遠心分 離など公知の方法によって上清を得る。
上記により得られた上清から、 融合蛋白質を単離するには、 通常知られて いる蛋白質の精製法に従えばよい。 例えば、 ゲル濾過法， イオン交換クロマ トグラフィー， 吸着クロマ トグラフィー， 高速液体クロマ トグラフィー， ァ フィニティークロマトグラフィー， 疎水クロマトグラフィー， 電気泳動等を 適切に組み合せて行うことができる。 また、 該融合蛋白質は、 精製すること なく、 あるいは部分精製の状態で、 次の反応工程に進んでもよい。
次に、 このようにして得られる融合蛋白質やペプチドをシスティン残基の ァミノ基側のぺプチド結合の切断反応に付す。該切断反応としては、例えば、 S—シァノ化反応次いで加水分解反応があげられる。 K i S S— 1ペプチド のアミ ドまたはその塩を最終物として得る場合には、 該切断反応としては、 例えば、 S—シァノ化反応次いでアンモノ リシスを行うことがあげられる。 該 S—シァノ化反応は、 原料化合物に、 S—シァノ化試薬を作用させること により行なう。
S—シァノ化試薬としては例えば 2—二トロ一 5—チオシァノ安息香酸 (NTC B), 1—シァノ一 4—ジメチルァミノピリジゥム塩（DMAP— C
N), CN—イオンなどがあげられる。 該 S—シァノ化試薬の量は、 モル数で 全チオール基の約 2倍から 5 0倍量であればよく、 好ましくは約 5倍〜 1 0 倍量である。
反応温度は約 0〜8 0°Cの間であれば、 いずれでもよく、 約 0〜5 0°Cの 間がより好ましい。 用いる溶媒としては、 S—シァノ化試薬と反応しないも のであれば、 いずれの緩衝液でもよいが、 例えば、 トリスー塩酸緩衝液， ト リス一酢酸緩衝液， リン酸緩衝液， ホウ酸緩衝液， などがあげられる。 また、 有機溶媒は、 S—シァノ化試薬と反応しないものであれば、 存在していても よい。
該反応は、 ρΗ 1〜1 2の間で行なうのが良い。 特に、 N T C Bを用いる場 合には pH 7〜l 0， D MA P— C Nを用いる場合には S— S交換反応を防止 するため、 pH 2〜7の間が好ましい。 また、 反応液中には、 塩酸グァニジン 等の変性剤が存在していてもよい。
上記アンモノリシスまたは加水分解反応としては、 例えばアル力リ処理に 付すことがあげられる。
該ァルカリ処理としては、原料化合物を含有する水溶液の pHを 7〜 1 4に、 調整することにより行なわれる。
該 p Hの調整は、 例えばアンモニア、 水酸化ナトリウム， ァミノ化合物， トリツマベース （トリス 〔ヒ ドロキシメチル〕 一ァミノメタン） ， リン酸第 2ナトリウム， 水酸化カリウム， 水酸化バリウム等の溶液を原料化合物を含 有する水溶液に適当量加えて行うが特にアンモニアなどが好ましレ、。
上記反応の際の溶液の濃度としては、 たとえばアンモニアまたはァミノ化 合物の場合は約 0 . 0 1〜： I 5 N好ましくは約 0 . 1〜 3 N、 水酸化ナトリウ ムの場合は約 0 . 0 1〜2 N好ましくは約 0 . 0 5〜 1 N、 トリツマベースの 場合は約 1 mM〜 1 M好ましくは約 2 0 mM〜 2 0 0 mM、 リン酸第 2ナトリウ ムの場合は約 1 mM〜 1 M好ましくは約 1 O mM〜 1 0 O mM、水酸化力リウム の場合は約 0 . ◦ 1〜4 N好ましくは約0 . 1〜2 Nがあげられる。 反応温度 は約— 2 0〜8 0 °Cの間であればいずれでもよく、 約— 1 0〜5 0 °Cの間が より好ましい。
反応時間は、 好ましくは、 S—シァノ化反応は約 1〜 6 0分好ましくは約 1 5〜 3 0分が、 加水分解反応は約 5分〜 1 0 0時間好ましくは 1 0分〜 1 5時間が、 アンモノ リシスは約 5分〜 2 4時間好ましくは約 1 0〜 1 8 0分 があげられる。 該ァミノ化合物としては、 例えば、 式 R1— (NR2)_H (式中、 R1およ び R2は同一または異なって、 （i)水素原子、 （ii) Cェ— 2。アルキル基， C3_8 シク口アルキル基， C6— 14ァリール（aryl)基または C6_14ァリール一 C ^ 3 アルキル基（これらは置換基を有していないかあるいは 1〜3個のァミノ基， 水酸基などを炭素原子上に有していてもよい） 、 （iii)置換されていてもよい アミノ基、（iv)水酸基または C^eアルコキシ基を示す。 ） で表される化合物 などがあげられる。
上記の S—シァノ化およびアンモノ リシスまたは加水分解により、 〔図 1〕 に示される反応が起こると考えられる。
本発明の製造法で得られる K i S S— 1ペプチドの C末端は、 前記したよ うにアミ ド （- C0NH2) 、 カルボキシル基、 カルボキシレート（-C00―)、 アル キルアミ ド （- C0NHR) またはエステル（-C00R)であってもよく、 なかでもアミ ド、 カルボキシル基 （-C00H) またはアルキルアミ ドが好ましく、 特にアミ ド またはアルキルアミ ドが好適である。 具体的には、 本発明の製造法で得られ る K i S S— 1ペプチドの C末端は、 〔図 1〕 に示される一 CO— Xであつ てよい。 Xは R1— (NR2)— （式中、 各記号は前記と同意義を示す。 ） また は〇Hを示す。
上記 C 2。アルキルの例としては、 例えば、 メチル， ェチル， プロピル， イソプロピル， ブチノレ， sec-ブチル， ペンチノレ， イソペンチル， ネ才ペンチ ノレ， 1—ェチノレペンチノレ， へキシノレ， イソへキシノレ， ヘプチノレ， ォクチノレ， ノナニル， デカニル， ゥンデ力ニル， ドデカニル， テトラデカニル， ペンタ デカニル， へキサデ力ニル， ヘプタデカニル， ォクタデカニル， ノナデ力二 ルおよびエイコサニルなどがあげられる。
上記〇3— 8シクロアルキルの例としては、 例えば、 シクロプロピル， シクロ ブチノレ， シクロペンチノレ， シクロへキシノレ， シクロへプチノレ， シクロォクチ ルなどがあげられる。
上記〇6_1 ァリールの例としては、 フエ-ル， ナフチル， アンスリル， フ ェナンスリル， ァセナフチレニルなどがあげられる。
上記 C6— ァリール一 アルキルの例としては、 例えばベンジル， フ エネチル， 3—フエニルプロピル， （1—ナフチル）メチル， （2 —ナフチル） メチルなどがあげられる。
上記 C アルコキシの例としては、例えばメ トキシ， エトキシ， プロポキ シ， ブトキシ， ペンチルォキシ， へキシルォキシなどがあげられる。
上記（i i i)の置換されていてもよいァミノの置換基の例としては、例えばァ ミノ酸， 2〜 1 0個のァミノ酸からなるぺプチドなどがあげられる。
上記アミノ酸としては、 L一体でも D—体でもよく、 その例としては、 例 えば、 Ala, Arg, Asp, Asn, Glu, Gin, Gly, His, lie, Met, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val などがあげられる。
上記ペプチドの例としては、 例えば、 H-D- Leu-Leu- Arg- Pro-NH-C2H5 ,
H-Val-Ala-Leu-D-Ala-Ala-Pro-Leu-Ala-Pro-Arg-OH などがあげられる。 上記した中でも、 R 2としては水素原子、 R 1としては水素原子または C ^ 2。アルキル基が好ましい。
該アンモノ リシス反応において、 アンモニアまたはァミノ化合物を用いた 場合には、 対応するアミ ド体が得られる。
切り出された目的べプチドを単離するには、 通常知られているべプチドの 精製法に従えばよレ、。例えば、 ゲル濾過法， イオン交換クロマトグラフィー， 高速液体クロマトグラフィー， ァフィ二ティークロマトグラフィー， 疎水ク 口マトグラフィー， 薄層クロマトグラフィー， 電気泳動等を適宜組み合せて 行うことができる。
このようにして得られる K i S S— 1ぺプチドまたはその塩は、 公知の 精製手段、 例えば、 抽出、 塩析、 分配、 再結晶、 クロマ トグラフィーなど により、 反応溶液から単離 ·精製することもできるが、 好ましい例として、 例えば、 S P—セファロース （フアルマシア バイオテク（株）） 、 D E A E - 5 P W (東ソ一（株）） 、 あるレヽは S P— 5 P W (東ソ一（株）） を介し たイオン交換クロマトグラフィーなどによる精製法があげられる。
得られる K i S S— 1ペプチドまたはその塩は、 必要によりこれを凍結乾 燥により粉末とすることもできる。 凍結乾燥に際しては、 ソルビトール， マ ンニ トーノレ， デキス トロース， マノレトース， トレノヽロース， グリセ口一ノレな どの安定化剤を加えることができる。
本発明の方法で製造される K i S S— 1ぺプチドまたはその塩は滅菌水， ヒ ト血清アルブミン（H S A) , 生理食塩水その他公知の生理学的に許容され る担体と混合することができ、 哺乳動物 （例、 ヒ ト） に対して非経口的に又 は局所に投与することができる。 たとえば、 その 1 日投与量は 1人あたり、 約 0 . 0 1 mg- 5 0 mg、 好ましくは、 約 0 . 1 mg— 1 0 mgを、 静注または筋注 などにより非経口的に投与することができる。
本発明の方法で製造される K i S S _ 1ぺプチドまたはその塩を含有する 製剤は、 塩， 希釈剤， アジュバント， 他の担体， バッファー， 結合剤， 界面 活性剤， 保存剤のような生理的に許容される他の活性成分も含有していても よい。 非経口的投与製剤は、 滅菌水溶液又は生理学的に許容される溶媒との 懸濁液ァンプル、 または生理学的に許容される希釈液で用時希釈して使用し うる滅菌粉末（通常べプチド溶液を凍結乾燥して得られる）アンプルとして提 供される。
本発明の製造法によって得られる K i S S— 1ぺプチドまたはその塩は癌転 移抑制活性を有するため、 あらゆる癌 （例えば、 肺癌、 胃癌、 肝癌、 滕癌、 大 腸癌、 直腸癌、 結腸癌、 前立腺癌、 卵巣癌、 子宮頸癌、 乳癌等） の予防または 治療薬として有用である。
また、 K i S S— 1ぺプチドまたはその塩は胎盤機能調節作用を有するため、 絨毛癌、 胞状奇胎、 侵入奇胎、 流産、 胎児の発育不全、 糖代謝異常、 脂質代謝 異常または分娩誘発の予防または治療薬として有用である。
なお、 本発明の製造法において、 K i S S— 1ペプチドを他の目的成熟べ プチドに代え、 さらに N末端にシスティンを有する低分子べプチドを当該目 的成熟べプチドの前駆体蛋白質の C末端側の部分べプチドに代えることによ つて、 同様にして、 目的成熟ペプチドを製造することができる。
他の目的成熟ペプチドとしては、 例えば、 約 1 0〜2 0 0個、 好ましくは 約 1 0〜 1 0 0個程度のァミノ酸残基を含有するべプチドなどが用いられる c 当該目的成熟べプチドの前駆体蛋白質の C末端側の部分べプチドとしては、 当該目的成熟べプチドを含む前駆体蛋白質の C末端側の部分ぺプチドであつ て、 当該目的成熟べプチドの C末端ァミノ酸残基に隣接するアミノ酸残基か ら始まるアミノ酸配列を有するぺプチドなどが用いられる。
また、 当該目的成熟べプチドの前駆体蛋白質の C末端側の部分ぺプチドと しては、 例えば、 当該目的成熟べプチドの前駆体蛋白質の C末端側の約 1 0 〜50個、 好ましくは約 20〜40個、 さらに好ましくは約 20〜 30個の アミノ酸残基を有する部分ぺプチドが用いられる。
本明細書および図面において、 アミノ酸， ペプチド， 保護基， 活性基， そ の他に関し略号で表示する場合、それらは I UP AC— I UB (Commission on Biochemical Nomenclature)による略号あるいは当該分野における慣用略号に 基づくものであり、 その例を次にあげる。 また、 アミノ酸などに関し光学異 性体があり うる場合は、 特に明示しなければ L体を示すものとする。
DNA デォキシリボ核酸
A アデニン
T チミン
G グァニン
C シトシン
RN A リボ核酸
EDTA ェ ン四酢酸
Gly グリシン
Ala ァラニン
Val バリン
L eu ロイシン
I le イソロイシン
S er セリン
Thr スレオニン
Met メチォニン
Glu グルタミン酸
Asp ァスパラギン酸
L ys リジン Arg ： アルギニン
His ： ヒスチジン
Phe ： フェニールァラニン
Tyr ：チロシン
Trp ： トリブトファン
Pro ：プロリン
Asn ： ァスパラギン
Gin ： グノレタミン
C ys
Asx ： ァスパラギンまたはァスパラギン酸
Glx ： グルタミンまたはグルタミン酸
ATP ：アデノシン三リン酸
本願明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
[配列番号： 1 ]
ヒ ト K i S S— 1ぺプチドのァミノ酸配列を示す。
[配列番号： 2 ]
ヒ ト K i S S— 1ぺプチドをコ一ドする DN Aの塩基配列を示す。
[配列番号： 3 ]
低分子べプチドのァミノ酸配列を示す。
[配列番号： 4 ]
低分子べプチドをコ一ドする DN Aの塩基配列を示す。
[配列番号： 5 ]
融合蛋白質のアミノ酸配列を示す。
[配列番号： 6 ]
式 （I) で表される融合蛋白質をコードする DNAの断片の塩基配列 1を示 す。
[配列番号： 7 ]
式 （I) で表される融合蛋白質をコードする DNAの断片の塩基配列 2を示 す。 [配列番号： 8 ]
実施例 1において i S S— 1ぺプチドの構造遺伝子の調製に用いたオリ ゴマーの塩基配列を示す。
己列番号： 9 ]
実施例 1において K i S S— 1ペプチドの構造遺伝子の調製に用いたオリ ゴマーの塩基配列を示す。
[配列番号： 1 0]
実施例 1において i S S— 1ぺプチドの構造遺伝子の調製に用いたオリ ゴマーの塩基配列を示す。
[配列番号： 1 1]
実施例 1において i S S— 1ぺプチドの構造遺伝子の調製に用いたオリ ゴマーの塩基配列を示す。
[配列番号： 1 2]
実施例 1において得られた DN A断片の塩基配列を示す。
[配列番号： 1 3]
実施例 1において得られた DNA断片の塩基配列を示す。
己列番号： 14]
実施例 1において得られた DNA断片の塩基配列を示す。
[配列番号： 1 5]
K i S S - 1ぺプチド前駆体のァミノ酸配列を示す。
[配列番号： 1 6]
マウス K i S S _ 1ペプチド前駆体 （A) のアミノ酸配列を示す。
[配列番号： 1 7]
マウス K i S S— 1ペプチド前駆体 （B) のアミノ酸配列を示す。
[配列番号： 1 8]
ラット K i S S— 1ぺプチドのァミノ酸配列を示す。
[配列番号： 1 9]
マウス K i S S— 1ペプチド前駆体 （A) をコードする DNAの塩基配列 を示す。 [配列番号： 20]
マウス K i S S— 1ペプチド前駆体 （B) をコードする DNAの塩基配列 を示す。
[配列番号： 2 1]
ラット K i S S— 1ぺプチドをコ一ドする DN Aの塩基配列を示す。
後述の実施例 1で得られた形質転換体 E s c h e r i c h i a c o l i MM 294 (DE 3) /p TC 2Me t C 24- l . 3は、 2001年 1 2 月 1 0日から茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305— 8566) の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託 番号 FERM B P— 7823として、 2001年 1 0月 24日から大阪府 大阪市淀川区十三本町 2— 1 7— 85 (郵便番号 532— 8686) の財団 法人 ·発酵研究所 （ I FO) に寄託番号 I FO 1 6 71 7して寄託されて いる。
実施例
以下に実施例をあげて、 本発明をさらに詳しく説明するが、 本発明はこれら に限定されるものではない。
実施例 1 C末端 24アミノ酸付加 K i S S - 1ペプチドをコードする DN Aの製造 （1)
(a) DN A断片の合成
〔図 1〕 に示す 4種の DNA断片 （# 1、 # 2 ； 5 ' リン酸化済， # 3 ；
5 ' リン酸化済， # 4 : キコーテック社） （配列番号： 8〜 1 1) を用いて K i S S— 1ペプチドの C末端に付加 （24アミノ酸残基） する遺伝子を調 製した。
(b) C末端付加用 DNA断片の連結
上記 a) で得られた DNA断片 # 1〜# 4を合わせ 40 μ 1 とした。 この 混合液を 6 5°Cで 10分間保った後、室温まで徐冷しァニーリングを行った。 このアニーリング液のうち 1 0 μ 1について T4 DNA Ligase (宝酒造） を用レヽ てライゲーシヨン反応を行った。 アニーリング液 1 0 μ 1に 1 0倍濃縮添付 Ligation ノくッファー 2 μ 1および Τ 4 DNA ライゲース 1 1 (350ュニ ット） を加えよく混合した後、 1 6°C、 1 7時間反応させ、 ライゲーシヨン を行った後、 6 5°Cで 5分間の熱処理を行った。 この様にして得られた DN A断片を T 4ポリヌクレオチドキナーゼ （宝酒造） によるリン酸化を行った 後、 1. 8 %低融点ァガロースゲル電気泳動により 9 6 bpの DNA断片 （配列 番号： 1 2) を ELUTIP Minicolumn ( S & S社） を用いて抽出し、 2 0 1 の T E緩衝液に溶解し、 以下の（c)に供した。
(c) K i S S - 1遺伝子と C末端付加用 DNAフラグメン卜の連結
K i S S— 1ぺプチド発現べクター pTFC - KiSS_lを N d e I (宝酒造） およ び Xmn I (NE B社） で 3 7°C、 2時間消化した後、 1. 5%低融点ァガロ ースゲル電気泳動により 1 4 9bpの DNA断片 （配列番号： 1 3 ) を ELUTIP Minicolumn ( S & S社）を用いて抽出し、 2 0 μ 1 の Τ Ε緩衝液に溶解した。 この DNA断片と上記 b) で得られた DNA断片をライゲーシヨンした。 1 4 9 bpの D N A溶液 2 0 μ 1 と 9 6 bpの D N A溶液 1 0 μ 1 に 1 0倍濃縮添付 Ligationバッファー 3. 5 μ 1および T 4 DNA ライゲース 1. 5 /z 1 ( 5 2 5ユニット） を加えよく混合した後、 1 6°C、 1 7時間反応させた。 ライゲ ーシヨンを行った後、 6 5°Cで 5分間の熱処理を行った。 このライゲーショ ン液を用いて全量 3 5 0 μ Iで N d e Iおよび B a mH I消化を 1時間行つ た後、 エタノール沈殿によって DNA断片 （配列番号： 1 4) を回収し、 以 下の（d)に供した。
(d) C末端 2 4アミノ酸付加 K i S S— 1ぺプチド発現べクタ一の構築〔図
2]
発現用ベクター p T CIIを N d e Iおよび B a mH I (宝酒造）で 3 7°C、 1時間消化した後、 1 %ァガロースゲル電気泳動により 4. 6kbの DNA断片 を QIAquick Gel Extraction Kit (キアゲン社） を用いて抽出し、 2 5 μ 1 の TE緩衝液に溶解した。 この p T CIIの N d e I — B a mH I断片と上記 c) で得られた DNA断片を T4 DNA Ligase (宝酒造） を用いてライゲーショ ン反応を行った。
この反応液を 1 0 μ ΐ用いて大腸菌 JM 1 0 9コンビテントセル（宝酒造） を 形質転換し、 1 0 μ g/m 1のテトラサイクリンを含む L B寒天培地上に播き、 3 7 °Cでー晚培養し、 生じたテトラサイタリン耐性コ口ニー選んだ。 この形質 転換体を LB培地で 1晚培養し、 QIAprep8 Miniprep Kit (キアゲン社） を用い てプラスミ ド pTC2MetC24を調製した。 この C末端 24アミノ酸付加 K i S S— 1構造遺伝子部分の塩基配列をアプライ ドバイオシステムズ社モデル 3 1 00 DNAシーケンサーを用いて確認した。 プラスミ ドpTC2MetC24で大腸菌MM2 94 (DE 3) を形質転換し、 C末端 24アミノ酸付加 K i S S— 1タンパク 質発現株 MM294 (DE 3) /p TC 2Me t C 24— 1. 3を得た。
(e) C末端 24アミノ酸付加 K i S S— 1ペプチドの製造
MM294(DE3)/ pTC2MetC24-l.3 を 5. OmgZLのテトラサイクリンを含む L B培地に 1 L ( 1 %ペプトン、 0. 5%酵母エキス、 0. 5 %塩化ナトリ ゥム） を用いて 2 L容フラスコ中で 3 7°C、 8時間振とう培養した。 得られ た培養液を 1 9 Lの主発酵培地 （ 1. 6 8 %リン酸 1水素ナトリウム、 0. 3 %リン酸 2水素カリウム、 0. 1 %塩化アンモニゥム、 0. 0 5%塩化ナ トリウム、 0. 0 2 5 %硫酸マグネシゥム、 0. 0 2 %消泡剤、 0. 0 0 0 2 5 %硫酸第 1鉄、 0. 0 0 0 5 %塩酸チアミン、 1. 5 %ブドウ糖、 1. 5%カザミノ酸） を仕込んだ 5 0 L容発酵槽へ移植して、 3 0°Cで通気攪拌 を開始した。 培養液の濁度が 5 0 0クレット単位になったところで、 イソプ 口ピル一 ]3— D—チォガラタ トピラノシドの最終濃度が 1 SmgZLになる ように添加し、 さらに 6時間培養を行った。 培養終了後、 培養液を遠心分離 し、 約 4 3 0 gの湿菌体を取得し、 _ 8 0°Cで保存した。
実施例 2
実施例 1で得た菌体 70 gに 7Mグァニジン塩酸塩、 1 0 OmMトリス緩 衝液 1 mM ETDA (PH 8. 0) 溶液 2 1 Omlを力！]え、 攪拌溶解を行った 後、 遠心分離 （8 00 Orpm、 6 0分） を行った。 上澄液を 4. 2 Lの 5 0m M トリス緩衝液、 0. 2M アルギニン p H8. 0、 1 mM 還元型グルタ チオン、 0. 1 mM 酸化型ダルタチオンを含む溶液に希釈して低温室にー晚 放置した。本溶液を 1 M尿素溶液で 4倍に希釈し、酢酸で pH 6. 0に調整し、 5 OmM ME S -N a O H緩衝液 （pH 6. 0 ) で平衡化した S P— T o y o p e a r l 5 5 0 Cカラム （5 c m I Dx2 0 c mL、 東ソ一） に 7 5 0m Lノ時間の流速で通液、 吸着後、 5 OmM ME S— N a OH緩衝液 0. 2M N a C 1 p H 6. 0で洗浄した後に 5 0 mM ME S— N a OH緩衝液 0. 5M N a C 1 p H 6. 0で溶出した。 この溶出液を蒸留水で 3倍に希釈し た後、 5 0 mM ME S -N a OH緩衝液 p H 6. 0で平衡化した S P— 5 PW (2 1. 5 mm I Dx 1 5 0 mmL、東ソ一）に 5 m L Z分の流速で通液、 吸着した後 0— 8 0% B (B= 1 M N a C 1 5 0 mM ME S -N a O H緩 衝液 p H 6. 0) の段階勾配で溶出を行い、 K i S S— 1 _ 24アミノ酸付 加体画分をプールした。 本溶出画分を 0. 1 %トリフルォロ酢酸で平衡化し た C 4 P— 5 0 (2 1. 5 mm I Dx3 00mmL、 昭和電工） に通液、 吸着 した後 SmLZ分の流速で 2 0— 7 0%B (B= 0. 1 %トリフルォロ酢酸 + 8 0%ァセトニトリル） の段階勾配で溶出を行い、 K i S S— 1— 24ァ ミノ酸付加体画分を得、凍結乾燥を行った。凍乾粉末を 0. 1M 酢酸 6M 尿 素溶液に溶解した後、 DMA P - C N (l-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate) 約 1. 5mgを加えて、 室温で 1 5分間反応した。 反応終 了後、 反応液を 5 OmMリン酸 1カリウムで平衡化した Sephadex G_ 2 5 カラム （2. 5 c m I Dx5 0 c mL、 フアルマシア） に通液し、 平衡化に用 いた 5 OmMリン酸 1カリゥムを 1 OralZ分 の流速で展開し、 S—シァノ化 された K i S S - 1ぺプチド— 24アミノ酸付加体タンパク質画分を得た。 この溶出液をセントリプラス （分画分子量 3 kDa： ミリポア社） で濃縮 ·脱 塩を行い、 K i S S— 1 _ 2 4アミノ酸付加体の脱塩液を得た。 この脱塩液 に最終濃度 6 Mとなるように尿素を添加した後、 さらに、 3 Mアンモニア濃 度となるように 2 5%アンモニア水を加え、 室温で 1 5分間反応した。 反応 終了後、 酢酸で pH6. 0に調整し、 K i S S— 1ペプチドを得た。 この反 応液を 5 0 mMリン酸 1カリゥムで平衡化した Sephadex G— 2 5カラム（2. 5 c m I Dx5 0 c mL) に通液し、 平衡化に用いた 5 0 mMリン酸 1力リ ウ ムを 1 OmlZ分の流速で展開し、 K i S S_ 1ペプチド画分を得た。 この画 分を、 0. 1 %トリフルォロ酢酸で平衡化した C 4 P- 5 0 ( 2 1. 5 mm I D 3 00mmL、 昭和電工） に通液し、 吸着、 洗浄した後、 5mL/分の流速で 2 0 - 6 0 % B (B : 8 0%ァセ 卜- トリルノ 0. 1 %トリフルォ口酢酸） の段階勾配で溶出を行い、 K i S S— 1ペプチド画分をプールした後、 凍結 乾燥を行い、 K i S S _ 1ぺプチド凍結乾燥粉末約 0. 35 mgを得た。 実施例 3 K i S S— 1ペプチドの特徴の決定
a ) ァミノ酸組成分析
アミノ酸組成をアミノ酸分析計 （日立 L— 8500A Amino Acid Analyzer) を用いて決定した。 その結果、 K i S S _ 1ペプチドの D N A塩 基配列から予想されるアミノ酸組成と一致した 〔表 1〕 。
〔表 1〕
1モ 当たりの KiSS- 1へ。フ。チドの塩基配列 アミノ酸 残 基 数 力 予測される値
A s X 3. 4 4
Th r *) 0. 9 1
S e r 7. 1 8
G 1 x 7. 1 7
r o 〇
o o . Δ o
G 1 y 5. 1 5
A 1 a 3. 0 3
C y s 0 0
V a 1 1. 9 2
Me t 0 0
I 1 e 1. 0 1
L e u 5 5
T y r 1. 0 1
P h e 1. 9 2
H i s 1. 0 1
L y s 1. 0 1
A r g 3. 9 4
T r p 0. 4 1
酸加水分解（6N HCl-4%thioglycolic acid 24- 48hr加水分解の平均値） *) 0時間に外挿した値 b) N末端アミノ酸配列分析
N末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサー （PEアプライ ドバイ ォシステムズ モデル 4.92) を用いて決定した。 その結果、 K i S S— 1 ぺプチドの DN A塩基配列から予想される N末端アミノ酸配列と一致した
〔表 2〕 。
〔表 2〕
N末端アミノ酸配列分析
検出された KiSS- 1へ。フ。チ の塩基配列 残基 No. PTH*) -アミノ酸 から予測されるアミノ酸
G 1 y (56) G 1 y
2 T h r (52) T h r
3 S e r (41) S e r
4 L e u (45) L e u
5 S e r (33) S e r
6 P r o (28) P r o
7 P r o (34) P r o
8 P r o (30) P r o
9 G 1 u (14) G 1 u
0 S e r (12) S e r
100 p m o 1を用いた。
*) フェニールチオヒダントイン。
実施例 4 生物活性測定
実施例 2で取得したヒ ト K i S S- 1ぺプチドを用いて、 WO 99/339 76の実施例 3に記載の方法 （細胞内カルシゥムイオン濃度上昇活性） で活性 を測定し、 ヒ ト胎盤抽出液より精製した標品と同等の活性を有することを確認 した。 実施例 5 C末端 2 4アミノ酸付加 K i S S— 1ぺプチドをコ一ドする D N Aの製造 （2 )
実施例 1 (c)で用いた K i S S - 1ぺプチド発現ベクター pTFC- KiSS - 1に代え て、 pTC2KiSSlを用いることによつても、 C末端 2 4アミノ酸付加 K i S S— 1 ペプチド発現ベクター p T C 2 M e t C 2 4— 1 . 3を構築することができた 〔図 3〕 。 産業上の利用可能性
本発明の製造方法を用いると、 例えば、 癌 （例えば、 肺癌、 胃癌、 肝癌、 腌 癌、 大腸癌、 直腸癌、 結腸癌、 前立腺癌、 卵巣癌、 子宮頸癌、 乳癌等） 、 さら には絨毛癌、 胞状奇胎、 侵入奇胎、 流産、 胎児の発育不全、 糖代謝異常、 脂質 代 異常または分娩誘発の予防または治療薬などとして用いることができる κ i s s - 1ぺプチドまたはその塩を工業的かつ大量に製造できる。

Claims

請求の範囲
1. N末端にシスティンを有する低分子ペプチドの N末端に、 K i S S— l ぺプチドを連結した融合蛋白質、 ぺプチドまたはその塩を該システィン残基 のァミノ基側のペプチド結合の切断反応に付すことを特徴とする K i S S- 1ぺプチドまたはその塩の製造法。
2. N末端にシスティンを有する低分子ペプチドの N末端に、 K i S S _ l ぺプチドを連結した融合蛋白質またはべプチドをコ一ドする DNAを有する ベクターを保持する形質転換体を培養して融合蛋白質、 ぺプチドまたはその 塩を発現させ、 発現された融合蛋白質、 ペプチドまたはその塩を該システィ ン残基のアミノ基側のぺプチド結合の切断反応に付すことを特徴とする K i S S— 1ぺプチドまたはその塩の製造法。
3. 製造される K i S S— 1ぺプチドの C末端がアミ ドである請求項 1また は 2記載の製造法。
4. 切断反応が S—シァノ化反応、 次いでアンモノリシスまたは加水分解反 応に付す反応である請求項 1または 2記載の製造法。
5. K i S S— 1ペプチドが配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有す るぺプチドである請求項 1または 2記載の製造法。
6. K i S S _ lペプチドが、 ①配列番号： 1で表されるアミノ酸配列の N 末端から第 4 0〜54番目からなるアミノ酸配列を有するペプチド、 ②配列 番号： 1で表されるアミノ酸配列の N末端から第 4 5〜5 4番目からなるァ ミノ酸配列を有するぺプチド、 ③配列番号： 1で表されるアミノ酸配列の N 末端から第 4 6〜54番目からなるアミノ酸配列を有するぺプチドまたは④ 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列の N末端から第 4 7〜54番目からな るアミノ酸配列を有するぺプチドである請求項 1または 2記載の製造法。
7. N末端にシスティンを有する低分子ペプチドが、 N末端にシスティンを 有し、 約 1 0〜約 5 0個のアミノ酸残基からなるぺプチドである請求項 1ま たは 2記載の製造法。
8. 低分子ペプチドが、 K i S S— 1ペプチドを含む前駆体蛋白質の C末端 側の部分ペプチドであって、 該 K i S S— 1ペプチドの C末端アミノ酸に隣 接するアミノ酸残基から始まるアミノ酸配列を有するぺプチドである請求項
1または 2記載の製造法。
9. N末端にシスティンを有する低分子ペプチドが、 配列番号： 3で表される ァミノ酸配列を含有し、 その N末端にシスティン残基が付加したぺプチドであ る請求項 1または 2記載の製造法。
1 0. N末端にシスティンを有する低分子ペプチドが配列番号： 3で表される ァミノ酸配列を含有し、 その N末端にシスティン残基が付加したぺプチドであ り、 K i S S— 1ペプチドが配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を有するぺ プチドであり、 製造される K i S S— 1ペプチドの C末端がアミ ドである配列 番号： 1で表されるアミノ酸配列を有するペプチドである請求項 1または 2記 載の製造法。
1 1. N末端にシスティンを有する低分子ペプチドの N末端に、 K i S S— l ペプチドを連結した融合蛋白質、 ペプチドまたはその塩。
1 2. 配列番号： 5で表わされるアミノ酸配列を含有する請求項 1 1記載の融 合蛋白質、 ペプチドまたはその塩。
1 3. 請求項 1 1記載の融合蛋白質またはペプチドをコードする DN Aを含有 する DNA。
1 4. ①配列番号： 6で表される塩基配列または②配列番号： 7で表される塩 基配列を有する請求項 1 3記載の DNA。
1 5. 請求項 1 3記載の DNAを有するベクター。
1 6. 請求項 1 5記載のベクタ一を含有する形質転換体。
1 7. F ERM B P— 78 23で表示されるエシュリヒア ' コリ MM2 94 (DE 3) /p TC 2Me t C 24 ~ l . 3。
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