JPS60232097A - ヒト癌壊死因子ポリペプチドの製造法 - Google Patents
ヒト癌壊死因子ポリペプチドの製造法Info
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- JPS60232097A JPS60232097A JP59082653A JP8265384A JPS60232097A JP S60232097 A JPS60232097 A JP S60232097A JP 59082653 A JP59082653 A JP 59082653A JP 8265384 A JP8265384 A JP 8265384A JP S60232097 A JPS60232097 A JP S60232097A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は遺伝子組み換え技術を応用したヒト癌壊死因子
ポリペプチドの製造法に関する。
ポリペプチドの製造法に関する。
本明細書では記載の簡略化のために以下の略号を使用す
る。
る。
Ａ アデニ／
Ｃシトシン
Ｇ グアニ／
Ｔ チミン
Ａｌａ アラニン
Ａｒｇ アルギニン
Ａｓｎ アスパラギン
ＡｓＰ アスパラギン酸
Ｃｙｓ システィン
Ｇｌｎ グルタミン
Ｇｌｕ グルタミン酸
ａｎｙ グリシ／
Ｈｉｓ ヒスチジン
Ｉｃｅ イソロイシ／
Ｌｅｕ ロイシン
Ｌｙｓ リジン
Ｍｅｔ メチオニン
Ｐｈｅ フェニルアラニ／
Ｐｒｏ プロリン
Ｓｅｒセリ／
Ｔｈｒ スレオニン
Ｔｒｐ）リプトフ７ン
Ｔｙｒ チロシン
Ｖａｌ バリン
ＤＮＡ デオキシリボ核酸
ｃ ＤＮＡ 相補ＤＮＡ
ＲＮＡ リボ核酸
ｍＲＮＡ 伝令ＲＮＡ
ｄＡＴＰ デオキシアデノシン三リン酸ｄＣＴＰ デオ
キシシチジン三リン酸 ｄＧＴＰ デオキシグアノシン三リン酸ｄＴＴＰ デオ
キシチミジン三リン酸 オリゴ（ｄＣ） オリゴデオキシシチジル酸オリゴ（ｄ
Ｇ） オリゴデオキシグアニル酸オリゴ（ｄＴ） オリ
ゴデオキシチミジル酸ポリ（Ａ） ポリアデニル酸 ポリ（Ｕン ポリウリジル酸 ポリ（ｄＡ） ポリデオキシアデニル酸ポリ（ｄＣ）
ポリデオキシシチジル酸ポリ（ｄＧ） ポリデオキシグ
アニル酸ポリ（ｄＴ） ポリデオキシチミジル酸ＡＴＰ
アデノシン三すノ酸 ＳＤＳ ドデシル硫酸ナトリウム ＥＤＴＡ エチレンジアミ７四酢酸 ｋｂｐ キロ塩基対 ｂｐ 塩基対 Ｃａｒｓｗｅｌｌらは、あらかじめｂａｃＮｌｕｓ Ｃ
ａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕ〆ｒｉｎ （ＢＣＧ ）で感染さ
せ、次いでエンドトキシンで処理したマウスの血清中に
は、移植したＭｅｔｈＡ肉腫による癌を壊死させる物質
が含まれていることを見いだし、この物質を壊死死因子
と名づけた［Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
ＵＳＡ、７２．３６６６（１９７５）］。
キシシチジン三リン酸 ｄＧＴＰ デオキシグアノシン三リン酸ｄＴＴＰ デオ
キシチミジン三リン酸 オリゴ（ｄＣ） オリゴデオキシシチジル酸オリゴ（ｄ
Ｇ） オリゴデオキシグアニル酸オリゴ（ｄＴ） オリ
ゴデオキシチミジル酸ポリ（Ａ） ポリアデニル酸 ポリ（Ｕン ポリウリジル酸 ポリ（ｄＡ） ポリデオキシアデニル酸ポリ（ｄＣ）
ポリデオキシシチジル酸ポリ（ｄＧ） ポリデオキシグ
アニル酸ポリ（ｄＴ） ポリデオキシチミジル酸ＡＴＰ
アデノシン三すノ酸 ＳＤＳ ドデシル硫酸ナトリウム ＥＤＴＡ エチレンジアミ７四酢酸 ｋｂｐ キロ塩基対 ｂｐ 塩基対 Ｃａｒｓｗｅｌｌらは、あらかじめｂａｃＮｌｕｓ Ｃ
ａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕ〆ｒｉｎ （ＢＣＧ ）で感染さ
せ、次いでエンドトキシンで処理したマウスの血清中に
は、移植したＭｅｔｈＡ肉腫による癌を壊死させる物質
が含まれていることを見いだし、この物質を壊死死因子
と名づけた［Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
ＵＳＡ、７２．３６６６（１９７５）］。
癌壊死因子はマクロファージから放出される生理活性物
質と考えられており、その特徴として、（１）ある種の
癌細胞（例えばＭｅｔｈ へ肉腫）を移植した担癌動物
に投与すると、その癌を壊死させ治癒せしめること （
Ｎ） ＋ｎ ｖｉｔｒｏである種の癌細胞（例えばマウ
スの癌細胞であるＬ ＃Ｂ１胞、ヒト癌由来のＰＣ−１
０細胞）を傷害するが、正常細胞にはほとんど有害な作
用を及ぼさないこと、及び（ｉｉｉ）その作用が種特異
的でないことなどが知られている。このような特徴の故
に壊死死因子は、新しいタイプの制癌剤としてその臨床
的応用が強く期待されている。
質と考えられており、その特徴として、（１）ある種の
癌細胞（例えばＭｅｔｈ へ肉腫）を移植した担癌動物
に投与すると、その癌を壊死させ治癒せしめること （
Ｎ） ＋ｎ ｖｉｔｒｏである種の癌細胞（例えばマウ
スの癌細胞であるＬ ＃Ｂ１胞、ヒト癌由来のＰＣ−１
０細胞）を傷害するが、正常細胞にはほとんど有害な作
用を及ぼさないこと、及び（ｉｉｉ）その作用が種特異
的でないことなどが知られている。このような特徴の故
に壊死死因子は、新しいタイプの制癌剤としてその臨床
的応用が強く期待されている。
従来の壊死死因子製造法はマウスやウサギなどの動物に
ＢＣＧ又はＰｒｏｐ＋ｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃ
ｎｅｓを注射し、次いでエンドトキシンを投与した後そ
の血液及び体液より壊死死因子を単離精製するものであ
るため、安定して多量の壊死死因子を安価に得ることは
難しい状況であった。また、壊死死因子を医薬として使
用するためには、抗原性等の観点からヒト由来の壊死死
因子がより好ましいが、上記方法はヒト由来の壊死死因
子製造には採用できない。
ＢＣＧ又はＰｒｏｐ＋ｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃ
ｎｅｓを注射し、次いでエンドトキシンを投与した後そ
の血液及び体液より壊死死因子を単離精製するものであ
るため、安定して多量の壊死死因子を安価に得ることは
難しい状況であった。また、壊死死因子を医薬として使
用するためには、抗原性等の観点からヒト由来の壊死死
因子がより好ましいが、上記方法はヒト由来の壊死死因
子製造には採用できない。
本発明者らは、ヒト由来の壊死死因子の大量生産法を確
立するために、遺伝子組換え技術に着目して鋭意研究を
行い、まずウサギ癌壊死因子をコードするクローン化Ｄ
ＮＡの単離に成功しく特願昭５８−２２８７９０号明細
書参照）、次いでこのクローン化ＤＮＡをプローブとし
て、ヒト癌壊死因子をコードするｃ ＤＮＡをクローン
化することに成功した（特願昭５９−４３１（１７号明
細書参照）。更に研究を続けた結果、このクローン化Ｄ
ＮＡを形質発現ベクターに組み込み、それらベクターで
形質転換された宿主を培養することにより、ヒト癌壊死
因子を大量に生産することに成功し本発明を完成した。
立するために、遺伝子組換え技術に着目して鋭意研究を
行い、まずウサギ癌壊死因子をコードするクローン化Ｄ
ＮＡの単離に成功しく特願昭５８−２２８７９０号明細
書参照）、次いでこのクローン化ＤＮＡをプローブとし
て、ヒト癌壊死因子をコードするｃ ＤＮＡをクローン
化することに成功した（特願昭５９−４３１（１７号明
細書参照）。更に研究を続けた結果、このクローン化Ｄ
ＮＡを形質発現ベクターに組み込み、それらベクターで
形質転換された宿主を培養することにより、ヒト癌壊死
因子を大量に生産することに成功し本発明を完成した。
本発明は、ヒト癌壊死因子のアミノ酸配列又はその活性
中心部分を含むポリペプチドをコードする塩基配列を有
するクローン化ＤＮＡを組み込んた形質発現ベクターに
よる形質転換体を培養し、培養物中にヒト癌壊死因子の
アミノ酸配列又はその活性中心部分を含むポリペプチド
を産生させることを特徴とするヒト癌壊死因子ポリペプ
チドの製造法を提供するものである。特に、次のアミノ
酸配列（Ｉ） Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｓ
ｅｒ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｐｒ。
中心部分を含むポリペプチドをコードする塩基配列を有
するクローン化ＤＮＡを組み込んた形質発現ベクターに
よる形質転換体を培養し、培養物中にヒト癌壊死因子の
アミノ酸配列又はその活性中心部分を含むポリペプチド
を産生させることを特徴とするヒト癌壊死因子ポリペプ
チドの製造法を提供するものである。特に、次のアミノ
酸配列（Ｉ） Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｓ
ｅｒ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｐｒ。
Ｖａｔ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｖａｔ Ａｌａ Ａ
ｓｎ Ｐｒｏ Ｇｌｎ ＡｌａＧｌｕ Ｇｌｙ Ｇｉｎ
Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｒｇ
ＡｒｇＡｌａ Ａｓｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｌ
ａ Ａｓｎ Ｇｌｙ ＶａｊＧｌｕＬｅｕ Ａｒｇ Ａ
ｓＰ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｌｅｕ、 ＶａｌＶａｌ Ｐｒ
ｏ ５ｅｒＧｌｕＧｌｙＬｅｕＴｙｒＬｅｕＩｌｅＴｙ
ｒＳｅｒＧｌｎＶａｔＬｅｕ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｇｌｙ
Ｇｌｎ Ｇｌｙ ＣｙＳＰｒｏ Ｓｅｒ ＴｈｒＨｉ
ｓ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｔｈｒ
Ｉｌｅ Ｓｃｒ Ａｒｇｌｌｅ Ａｌａ Ｖａｌ Ｓ
ｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓ
ｎＬａｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｙｓ
Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｃｙｓ ＧｉｎＡｒｇ Ｇｌｕ Ｔｈ
ｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ
ＬｙｓＰｒｏ Ｔｒｐ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｉ
ｌｅ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙｖａ＋ Ｐｈｅ
Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ
Ａｒｇ ＬｅｕＳｅｒ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ａｓ
ｎ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ ＬｅｕＡＳｐ
Ｐｈｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｖ
ａｔ Ｔｙｒ ＰｈｅＧｌｙ Ｉｌｅ ｌｉｅ Ａｌａ
Ｌｅｕ （Ｉ ）を有するヒト癌壊死因子［以下ポリ
ペプチド（Ｉ）ということもある］の製造法を提供する
ものである。
ｓｎ Ｐｒｏ Ｇｌｎ ＡｌａＧｌｕ Ｇｌｙ Ｇｉｎ
Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｒｇ
ＡｒｇＡｌａ Ａｓｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｌ
ａ Ａｓｎ Ｇｌｙ ＶａｊＧｌｕＬｅｕ Ａｒｇ Ａ
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Ｇｌｎ Ｇｌｙ ＣｙＳＰｒｏ Ｓｅｒ ＴｈｒＨｉ
ｓ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｔｈｒ
Ｉｌｅ Ｓｃｒ Ａｒｇｌｌｅ Ａｌａ Ｖａｌ Ｓ
ｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓ
ｎＬａｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｙｓ
Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｃｙｓ ＧｉｎＡｒｇ Ｇｌｕ Ｔｈ
ｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ
ＬｙｓＰｒｏ Ｔｒｐ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｉ
ｌｅ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙｖａ＋ Ｐｈｅ
Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ
Ａｒｇ ＬｅｕＳｅｒ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ａｓ
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Ｐｈｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｖ
ａｔ Ｔｙｒ ＰｈｅＧｌｙ Ｉｌｅ ｌｉｅ Ａｌａ
Ｌｅｕ （Ｉ ）を有するヒト癌壊死因子［以下ポリ
ペプチド（Ｉ）ということもある］の製造法を提供する
ものである。
本明細書において、ヒト癌壊死因子のアミノ酸配列を含
むポリペプチドとは、ポリペプチド（Ｉ）、その対立遺
伝子変異体ポリペプチド及びそれらのＮ末端又はＣ末端
にアミノ酸又はペプチド（オリゴ又はポリペプチド）が
結合しているポリペプチドであって、それら自体、又は
それらから酵素等により切断されて生ずるポリペプチド
がヒト癌壊死因子活性を示すものを意味する。また、ヒ
ト癌壊死因子のアミノ酸配列の活性中心部分を含むポリ
ペプチドとは、ポリペプチド（Ｉ）又はその対立遺伝子
変異体ポリペプチドのアミノ酸配列のうちヒト癌壊死因
子活性を発現するのに必須のアミノ酸配列（特願昭５９
−４３ｆｔ＋’７号明細書参照）を含むポリペプチドで
あって、それら自体、又はそれらから酵素等により切断
されて生ずるポリペプチドがヒト癌壊死因子活性を示す
ものを意味する。更に、ヒト癌壊死因子のアミノ酸配列
を含むポリペプチド及びヒト癌壊死因子のアミノ酸配列
の活性中心部分を含むポリペプチドの総称として、「ヒ
ト癌壊死因子ポリペプチド」を用いる。
むポリペプチドとは、ポリペプチド（Ｉ）、その対立遺
伝子変異体ポリペプチド及びそれらのＮ末端又はＣ末端
にアミノ酸又はペプチド（オリゴ又はポリペプチド）が
結合しているポリペプチドであって、それら自体、又は
それらから酵素等により切断されて生ずるポリペプチド
がヒト癌壊死因子活性を示すものを意味する。また、ヒ
ト癌壊死因子のアミノ酸配列の活性中心部分を含むポリ
ペプチドとは、ポリペプチド（Ｉ）又はその対立遺伝子
変異体ポリペプチドのアミノ酸配列のうちヒト癌壊死因
子活性を発現するのに必須のアミノ酸配列（特願昭５９
−４３ｆｔ＋’７号明細書参照）を含むポリペプチドで
あって、それら自体、又はそれらから酵素等により切断
されて生ずるポリペプチドがヒト癌壊死因子活性を示す
ものを意味する。更に、ヒト癌壊死因子のアミノ酸配列
を含むポリペプチド及びヒト癌壊死因子のアミノ酸配列
の活性中心部分を含むポリペプチドの総称として、「ヒ
ト癌壊死因子ポリペプチド」を用いる。
本発明の方法について以下に詳細に説明する。
ヒト癌壊死因子ポリペプチドをコートするクローン化Ｄ
ＮＡを調製するために、例えば、特願昭５９−４３１３
１７号明細書に開示されている方法に従って得た、組み
換え体プラスミドｐＨＴＮＦ−１３により形質転換させ
たＥ、ｃｏｌｉ ８８１０１株を用いる。ｐＨＴＮＦ−
１３は、ヒト癌壊死因子前駆体をコードする領域を含む
ＤＮＡをポリ（ｄａ）−ポリ（ｄＣ）ホモポリマー伸長
法［Ｎｏｄａ、Ｍ、、ｅｔ ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、２
９５，２０２ （１９Ｂ２）］によりプラスミドｐＢＲ
３２２の制限酵素ｐｓｔ Ｉ切断部位に組み込んだもの
である。このＰＨＴＮＦ−１３による形質転換体を、例
えばＬＢゾロスで培養し菌体を採取し、この菌体からＷ
ｉｌｋｉｅらの方法［Ｎｕｃｌ。
ＮＡを調製するために、例えば、特願昭５９−４３１３
１７号明細書に開示されている方法に従って得た、組み
換え体プラスミドｐＨＴＮＦ−１３により形質転換させ
たＥ、ｃｏｌｉ ８８１０１株を用いる。ｐＨＴＮＦ−
１３は、ヒト癌壊死因子前駆体をコードする領域を含む
ＤＮＡをポリ（ｄａ）−ポリ（ｄＣ）ホモポリマー伸長
法［Ｎｏｄａ、Ｍ、、ｅｔ ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、２
９５，２０２ （１９Ｂ２）］によりプラスミドｐＢＲ
３２２の制限酵素ｐｓｔ Ｉ切断部位に組み込んだもの
である。このＰＨＴＮＦ−１３による形質転換体を、例
えばＬＢゾロスで培養し菌体を採取し、この菌体からＷ
ｉｌｋｉｅらの方法［Ｎｕｃｌ。
Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、、 ７．８５９（１９７９＞］に
従ってプラスミドＤＮＡを得る。次いで、このプラスミ
ドＤＮＡから制限酵素Ｐｓｔ Ｉでヒト癌壊死因子前駆
体をコードする領域を含むクローン化ＤＮＡを切り出す
。
従ってプラスミドＤＮＡを得る。次いで、このプラスミ
ドＤＮＡから制限酵素Ｐｓｔ Ｉでヒト癌壊死因子前駆
体をコードする領域を含むクローン化ＤＮＡを切り出す
。
このクローン化ＤＮＡのヒト癌壊死因子前駆体をコート
する領域近辺の塩基配列及び、この塩基配列から翻訳さ
れるアミノ酸配列は第１表の通りである。ヒト癌壊死因
子は、第１表の第２３５〜２３７番のＴＣＡのコト／（
セリンに対応）から始まり、第６９７〜６９９番のＣＴ
Ｇのコドン（Ｉｊイシンに対応）で終わる１５５残基の
アミノ酸（第１表中〔〕で囲まれた領域）から成る。塩
基配列第１〜２３４番はヒト癌壊死因子の前駆体をコー
ドするために必要な配列と考えられる。
する領域近辺の塩基配列及び、この塩基配列から翻訳さ
れるアミノ酸配列は第１表の通りである。ヒト癌壊死因
子は、第１表の第２３５〜２３７番のＴＣＡのコト／（
セリンに対応）から始まり、第６９７〜６９９番のＣＴ
Ｇのコドン（Ｉｊイシンに対応）で終わる１５５残基の
アミノ酸（第１表中〔〕で囲まれた領域）から成る。塩
基配列第１〜２３４番はヒト癌壊死因子の前駆体をコー
ドするために必要な配列と考えられる。
形質発現ベクターに組み込むために使用する、ヒト癌壊
死因子ＤＮＡとしては、例えば第１表の第２３５〜７０
２番（第７００〜７０２番は終止コドン）の塩基配列又
は該塩基配列に前駆体部分の塩基配列（第１〜２３４番
）の一部又は全部が付加したものが挙げられるが、対立
遺伝子変異、遺伝子コードの縮重又は一部の修飾を含む
これらＤＮＡの変異体であっても、ベクターに適切に組
み込まれたときに形質転換体中で形質発現し得るもので
あれば、０ずれも使用することができる。
死因子ＤＮＡとしては、例えば第１表の第２３５〜７０
２番（第７００〜７０２番は終止コドン）の塩基配列又
は該塩基配列に前駆体部分の塩基配列（第１〜２３４番
）の一部又は全部が付加したものが挙げられるが、対立
遺伝子変異、遺伝子コードの縮重又は一部の修飾を含む
これらＤＮＡの変異体であっても、ベクターに適切に組
み込まれたときに形質転換体中で形質発現し得るもので
あれば、０ずれも使用することができる。
（以下余白）
第１表
ＧＡＣＣＣＡＣＧＧ
ＳｅｒＡｒｇ’１ｒｌｒＰｒ０５ｅｒＡＳＰ１．！／５
ｒｒＯ，ＶａＪＡ１ａＧｌｎＬｅｕ（ｊｌｕＬＹｓ（ｊ
ｌＶＡｓＰＡｒｇＬｅｕｉ）ｅｒＡＩａ（以下余白） ヒト癌壊死因子ポリペプチドを産生ずる能力を「する形
質転換体を得るには、ヒト癌壊死因子又はその活性中心
部分をコードする領域を含むＤＮＡあるいは対立遺伝子
変異、ｉｌｌ伝子コードの縮重又は一部の修飾を含む該
ＤＮＡの変異体を、転写及び翻訳が正しくなされるよう
に形質発現ベクターに組み込み、次いで該形質発現ベク
ターを適当な宿主に導入することにより行われる。
ｒｒＯ，ＶａＪＡ１ａＧｌｎＬｅｕ（ｊｌｕＬＹｓ（ｊ
ｌＶＡｓＰＡｒｇＬｅｕｉ）ｅｒＡＩａ（以下余白） ヒト癌壊死因子ポリペプチドを産生ずる能力を「する形
質転換体を得るには、ヒト癌壊死因子又はその活性中心
部分をコードする領域を含むＤＮＡあるいは対立遺伝子
変異、ｉｌｌ伝子コードの縮重又は一部の修飾を含む該
ＤＮＡの変異体を、転写及び翻訳が正しくなされるよう
に形質発現ベクターに組み込み、次いで該形質発現ベク
ターを適当な宿主に導入することにより行われる。
例えば、前記の方法で得られた、ヒト壊死死囚子前駆体
をコードする領域を含むクローノ化ＤＮＡからヒト癌壊
死因子をフードする領域の全部又は一部を適当な制限酵
素で切り出した後、公知の方法に従って（ｉ）宿主中で
発現し得るオペロンの構造遺伝子の翻訳領域の途中に、
ヒト癌壊死因子をコードするＤＮＡ （ヒト癌壊死因子
の前駆体部分をコードするＤＮＡの一部又は全部を含ん
でいてもよい）を挿入することによって、ヒト癌壊死因
子と他のポリペプチドとの融合蛋白質（以下、単に融合
蛋白質ということもある）を産生させる形質発現ベクタ
ーを作製するか、又は（ｉｉ） １１当なプロモーター
、ＳＤ（シャイン ダルガ−７）配列及び開始コドンＡ
ＴＧの下流に、ヒト癌壊死因子をコードするＤＮＡを組
ろ込むことによって、非融合型ヒト癌壊死因子を産生さ
せる形質発現ベクターを作製することにより行われる。
をコードする領域を含むクローノ化ＤＮＡからヒト癌壊
死因子をフードする領域の全部又は一部を適当な制限酵
素で切り出した後、公知の方法に従って（ｉ）宿主中で
発現し得るオペロンの構造遺伝子の翻訳領域の途中に、
ヒト癌壊死因子をコードするＤＮＡ （ヒト癌壊死因子
の前駆体部分をコードするＤＮＡの一部又は全部を含ん
でいてもよい）を挿入することによって、ヒト癌壊死因
子と他のポリペプチドとの融合蛋白質（以下、単に融合
蛋白質ということもある）を産生させる形質発現ベクタ
ーを作製するか、又は（ｉｉ） １１当なプロモーター
、ＳＤ（シャイン ダルガ−７）配列及び開始コドンＡ
ＴＧの下流に、ヒト癌壊死因子をコードするＤＮＡを組
ろ込むことによって、非融合型ヒト癌壊死因子を産生さ
せる形質発現ベクターを作製することにより行われる。
宿主としては、大腸菌（例えばＥ、ｃｏｌｉ ＨＢＩＯ
Ｉ。
Ｉ。
Ｅ、ｃｏｌｉ ＪＭＩ０３＞、枯草菌、酵母などの微生
物、ＣＯＳｍｏｎｋｅｙ細胞などの動物培養細胞及び植
物培養細胞などを用いることができる。以下の説明にお
いては、宿主として大腸菌を用いる場合について述べる
が、適当なプロモーターを有するベクターを選択するこ
とにより、他の宿主中で形質発現し得るベクターを作製
できることは当業者にとって明らかである。
物、ＣＯＳｍｏｎｋｅｙ細胞などの動物培養細胞及び植
物培養細胞などを用いることができる。以下の説明にお
いては、宿主として大腸菌を用いる場合について述べる
が、適当なプロモーターを有するベクターを選択するこ
とにより、他の宿主中で形質発現し得るベクターを作製
できることは当業者にとって明らかである。
プロモーターとしては、例えばｌａｃプロモーター。
里プロモーター、９にプロモーター、 ｐｈｏＳプロモ
ーター、ＰＬプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター
等が挙げられる。ｌａｃプロモーター、 ｔａｃプロモ
ーター及びυ」−プロモーターからのｍＲＮＡの転写は
、培養時にイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドや
インドール−３−アクリル酸のようなインジューサーを
添加することにより誘導される。ｐｈｏＳプロモーター
の場合は、培地中のリン酸含量を低下させることにより
ｍＲＮＡの転写が誘導される。
ーター、ＰＬプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター
等が挙げられる。ｌａｃプロモーター、 ｔａｃプロモ
ーター及びυ」−プロモーターからのｍＲＮＡの転写は
、培養時にイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドや
インドール−３−アクリル酸のようなインジューサーを
添加することにより誘導される。ｐｈｏＳプロモーター
の場合は、培地中のリン酸含量を低下させることにより
ｍＲＮＡの転写が誘導される。
また、λ）７−ジのＰＬプロモーターの場合は、温度感
受性ＣＩリプレッサーを利用し、低温（約３０℃）でＣ
ＩリプレッサーによりＰＬプロモーターからの転写を抑
制し、高温（約３７〜４２℃）でリプレッサーの失活に
より転写を誘導させることができる。
受性ＣＩリプレッサーを利用し、低温（約３０℃）でＣ
ＩリプレッサーによりＰＬプロモーターからの転写を抑
制し、高温（約３７〜４２℃）でリプレッサーの失活に
より転写を誘導させることができる。
ベクターとしては、形質転換させる宿主中で増殖するも
のはすべて用いることができる。例えばプラスミド（ｐ
ＢＲ３２２，ＰＤＲ５４０，ｐｓＮ５１８２など）、フ
ァージ（λ）７一ジ誘導体など）、ウィルス（ＳＶ４０
など）が挙げられる。これらは単独で、又はそれらの組
み合わせ、例えばｆ）ＢＲ３２２−３Ｖ４０ハイブリツ
ドプラスミドなどの形で用いてもよい。
のはすべて用いることができる。例えばプラスミド（ｐ
ＢＲ３２２，ＰＤＲ５４０，ｐｓＮ５１８２など）、フ
ァージ（λ）７一ジ誘導体など）、ウィルス（ＳＶ４０
など）が挙げられる。これらは単独で、又はそれらの組
み合わせ、例えばｆ）ＢＲ３２２−３Ｖ４０ハイブリツ
ドプラスミドなどの形で用いてもよい。
融合蛋白質生産用形質発現ベクターとしては、例えばＰ
Ｌプロモーター支配下のＮ蛋白の構造遺伝子［初期調節
遺伝子；音訳純−９“バクテリオファージの実験、′音
波書店、１９７８．ｐ、１８１］内へヒト癌壊死因子を
コードするＤＮＡを組み込んだベクター。
Ｌプロモーター支配下のＮ蛋白の構造遺伝子［初期調節
遺伝子；音訳純−９“バクテリオファージの実験、′音
波書店、１９７８．ｐ、１８１］内へヒト癌壊死因子を
コードするＤＮＡを組み込んだベクター。
ｐｈｏＳ□プロモーター支配下の枳夏チー構造遺伝子内
へヒト癌壊死因子をコードするＤＮＡを組み込んたベク
ター等が挙げられる。このようにヒト癌壊死因子を融合
蛋白質として産生させるように構築した形質発現ベクタ
ーの利点は、産生されたヒト癌壊死因子の形質転換体内
での分解が最小限に抑えられることであるが、産生され
た融合蛋白質からヒト癌壊死因子を切り出す必要がある
。
へヒト癌壊死因子をコードするＤＮＡを組み込んたベク
ター等が挙げられる。このようにヒト癌壊死因子を融合
蛋白質として産生させるように構築した形質発現ベクタ
ーの利点は、産生されたヒト癌壊死因子の形質転換体内
での分解が最小限に抑えられることであるが、産生され
た融合蛋白質からヒト癌壊死因子を切り出す必要がある
。
融合蛋白質からヒト癌壊死因子を効率よく切り出すため
の一つの方法は、形質発現ベクターを構築する際、融合
部位に相当する塩基配列部位にメチオニ７ コドン（Ａ
ＴＧ ）を入れることである。
の一つの方法は、形質発現ベクターを構築する際、融合
部位に相当する塩基配列部位にメチオニ７ コドン（Ａ
ＴＧ ）を入れることである。
このような形質発現ベクターを適当な宿主に導入するこ
とにより形質転換体を得、次いで該形質転換体を培養す
ることにより融合蛋白質を産生させ、得られた融合蛋白
質を、臭化シアン処理［例えば、１ｔａｋｕｒａ、に、
、ｅｔ ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ、１９８，１０５４
（１９７７）］することにより、メチオニ７部分で分解
しヒト癌壊死因子を切り出すことができる。本発明のヒ
ト癌壊死因子はメチオニンを含まないポリペプチドなの
で、この方法はを用である。
とにより形質転換体を得、次いで該形質転換体を培養す
ることにより融合蛋白質を産生させ、得られた融合蛋白
質を、臭化シアン処理［例えば、１ｔａｋｕｒａ、に、
、ｅｔ ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ、１９８，１０５４
（１９７７）］することにより、メチオニ７部分で分解
しヒト癌壊死因子を切り出すことができる。本発明のヒ
ト癌壊死因子はメチオニンを含まないポリペプチドなの
で、この方法はを用である。
また、第１表から明らかなように、ヒト癌壊死因子とそ
の前駆体部分との結合はＡｒｇ −Ｓｅｔであり、蛋白
質分解酵素トリプシンの切断認識部位である。従って、
ヒト癌壊死因子の前駆体構造部分の少なくとも一部を含
む融合蛋白質を産生させた後、トリプシン又はトリプシ
ン様酵素（例えばプラスミン）で限定水解することによ
り、ヒト癌壊死因子を容易に切り出すことができる。
の前駆体部分との結合はＡｒｇ −Ｓｅｔであり、蛋白
質分解酵素トリプシンの切断認識部位である。従って、
ヒト癌壊死因子の前駆体構造部分の少なくとも一部を含
む融合蛋白質を産生させた後、トリプシン又はトリプシ
ン様酵素（例えばプラスミン）で限定水解することによ
り、ヒト癌壊死因子を容易に切り出すことができる。
非融合型ヒト癌壊死因子を産生させるための形質発現ベ
クターとしては、例えばｔａｃプロモーター又はｔｒｐ
プロモーター、ＳＤ配列の後に開始コドンＡＴＧを付加
し、更に続いてヒト癌壊死因子をコードするＤＮＡを結
合させて構築したものが挙げられる。このような形質発
現ベクターによる形質転換体を培養することにより、ヒ
ト癌壊死因子を非融合蛋白質として生産することができ
る。そのＮ末端側にメチオニンが付加したポリペプチド
が得られた場合には、必要に応じて臭化シアン処理する
ことにより、ヒト癌壊死因子を得る乙とができる。
クターとしては、例えばｔａｃプロモーター又はｔｒｐ
プロモーター、ＳＤ配列の後に開始コドンＡＴＧを付加
し、更に続いてヒト癌壊死因子をコードするＤＮＡを結
合させて構築したものが挙げられる。このような形質発
現ベクターによる形質転換体を培養することにより、ヒ
ト癌壊死因子を非融合蛋白質として生産することができ
る。そのＮ末端側にメチオニンが付加したポリペプチド
が得られた場合には、必要に応じて臭化シアン処理する
ことにより、ヒト癌壊死因子を得る乙とができる。
大量生産時の精製を容易にするためには、ヒト癌壊死因
子ポリペプチドが形質転換体の細胞質外に分泌されるの
が好ましい。この目的を達成するためには、例えばアル
カリ性ホスフ１ターゼの構造遺伝子ｐｈｏ＾やリン酸結
合蛋白質の構造遺伝子ｐｈｏＳを用いて分泌型ベクター
を作製する。即ち、それらプロモーター、ＳＤ配列及び
構造遺伝子のシグナルペプチドをコードする配列を利用
することにより、ヒト癌壊死因子ポリペプチドをペリブ
ラスムに分泌させるベクターを作製することができる。
子ポリペプチドが形質転換体の細胞質外に分泌されるの
が好ましい。この目的を達成するためには、例えばアル
カリ性ホスフ１ターゼの構造遺伝子ｐｈｏ＾やリン酸結
合蛋白質の構造遺伝子ｐｈｏＳを用いて分泌型ベクター
を作製する。即ち、それらプロモーター、ＳＤ配列及び
構造遺伝子のシグナルペプチドをコードする配列を利用
することにより、ヒト癌壊死因子ポリペプチドをペリブ
ラスムに分泌させるベクターを作製することができる。
例えば、ｐｈｏＳ遺伝子のシグナルペプチドをコードす
る領域に続くプロセス部位に、直接ヒト癌壊死因子をコ
ードするＤＮＡを結合させることにより、形質転換体の
ベリプラスムにヒト癌壊死因子を産生蓄積させることが
できる。また、ｐｈｏＳ遺伝子のシグナルペプチドをコ
ードする領域及び構造遺伝子の一部に続いて少なくとも
前駆体部分の一部を残したヒト癌壊死因子をブードする
ＤＮＡを結合させ、融合蛋白質発現ベクターを構築し、
その形質転換体を培養して融合蛋白質を産生させた後、
トリプシン又はトリプシン様＃素（例えばプラスミン）
で限定水解することにより、ヒト壊死゛死因子を切り出
すことができる。
る領域に続くプロセス部位に、直接ヒト癌壊死因子をコ
ードするＤＮＡを結合させることにより、形質転換体の
ベリプラスムにヒト癌壊死因子を産生蓄積させることが
できる。また、ｐｈｏＳ遺伝子のシグナルペプチドをコ
ードする領域及び構造遺伝子の一部に続いて少なくとも
前駆体部分の一部を残したヒト癌壊死因子をブードする
ＤＮＡを結合させ、融合蛋白質発現ベクターを構築し、
その形質転換体を培養して融合蛋白質を産生させた後、
トリプシン又はトリプシン様＃素（例えばプラスミン）
で限定水解することにより、ヒト壊死゛死因子を切り出
すことができる。
上述のような方法を用いて作製した、融合型又は非融合
型ヒト癌壊死因子生産用形質発現ベクターを用い、例え
ばＣｏｈｅｎらの方法［Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ 。
型ヒト癌壊死因子生産用形質発現ベクターを用い、例え
ばＣｏｈｅｎらの方法［Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ 。
＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ、ｆｉ９，２１１０（＋９７
２＞］により宿主を形質転換させる。
２＞］により宿主を形質転換させる。
このようにして得られた形質転換体を、それぞれの形質
転換体に店じた適当な培養条件下に目的のポリペプチド
が十分に産生ずるまで、例えば２〜２４時間培養した後
、培養物から適当な方法で目的のポリペプチドを分離す
る。例えば、目的のポリペプチドが形質転換体内に蓄積
している場合には、常法に従って菌体を破壊した後、上
清液から、また目的のポリペプチドがベリブラスムに蓄
積している場合には、例えばＷｉｌｌｓｋｙらの方法［
Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、。
転換体に店じた適当な培養条件下に目的のポリペプチド
が十分に産生ずるまで、例えば２〜２４時間培養した後
、培養物から適当な方法で目的のポリペプチドを分離す
る。例えば、目的のポリペプチドが形質転換体内に蓄積
している場合には、常法に従って菌体を破壊した後、上
清液から、また目的のポリペプチドがベリブラスムに蓄
積している場合には、例えばＷｉｌｌｓｋｙらの方法［
Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、。
１２７．５９５（１９７Ｂ）］に従って得た抽出液から
、更に目的のポリペプチドが細胞外に分泌される場合に
は、その培養液から分離することができる。産生された
ポリペプチドが融合型ヒト癌壊死因子の場合には必要に
応じて、例えば前記の酵素による限定氷解又は臭化シア
ン処理法によりヒト癌壊死因子を得ることができる。
、更に目的のポリペプチドが細胞外に分泌される場合に
は、その培養液から分離することができる。産生された
ポリペプチドが融合型ヒト癌壊死因子の場合には必要に
応じて、例えば前記の酵素による限定氷解又は臭化シア
ン処理法によりヒト癌壊死因子を得ることができる。
このようにして得られた粗製ヒト癌壊死因子は、一般的
な蛋白質の精製法、例えば限外濾過による濃縮、透析脱
塩、イオン交換クロマトグラフィー。
な蛋白質の精製法、例えば限外濾過による濃縮、透析脱
塩、イオン交換クロマトグラフィー。
ゲル濾過、特異抗体を用いたアフィニティクロマＦグラ
フィー等の組み自わせにより精製することができる。
フィー等の組み自わせにより精製することができる。
本発明及び特願昭５９−４３６１７号明細書に記載され
た発明により明らかにされたヒト癌壊死因子のアミノ酸
配列やＤＮＡ塩基配列に関する知見に基づいて、遺伝子
組み換え技術の常法に従い、ヒト癌壊死因子のアミノ酸
配列を含むポリペプチド又はヒト癌壊死因子のアミノ酸
配列の活性中心部分を含むポリペプチドをコードするＤ
ＮＡあるいは一部修飾されたヒト癌壊死因子ＤＮＡの変
異体を得ることができる。また、本発明で明らかにされ
たＤＮＡ塩基配列の一部を化学合成し、これをプローブ
として用いることにより、対立遺伝子変異や遺伝子コー
ドの縮重のあるヒト癌壊死因子ＤＮＡも容易に人手でき
る。更に、ヒト癌壊死因子のアミノ酸配列に基づいて、
それをコードする塩基配列のＤＮＡを全合成することも
可能である。それらを用いて、上述の方法を産月するこ
とにより、ヒト癌壊死因子活性を有するポリペプチドを
生産することができる。
た発明により明らかにされたヒト癌壊死因子のアミノ酸
配列やＤＮＡ塩基配列に関する知見に基づいて、遺伝子
組み換え技術の常法に従い、ヒト癌壊死因子のアミノ酸
配列を含むポリペプチド又はヒト癌壊死因子のアミノ酸
配列の活性中心部分を含むポリペプチドをコードするＤ
ＮＡあるいは一部修飾されたヒト癌壊死因子ＤＮＡの変
異体を得ることができる。また、本発明で明らかにされ
たＤＮＡ塩基配列の一部を化学合成し、これをプローブ
として用いることにより、対立遺伝子変異や遺伝子コー
ドの縮重のあるヒト癌壊死因子ＤＮＡも容易に人手でき
る。更に、ヒト癌壊死因子のアミノ酸配列に基づいて、
それをコードする塩基配列のＤＮＡを全合成することも
可能である。それらを用いて、上述の方法を産月するこ
とにより、ヒト癌壊死因子活性を有するポリペプチドを
生産することができる。
本発明の方法により得られるヒト癌壊死因子ポリペプチ
ドは、それら自体、又はそれらから酵素等により切断し
て生ずるポリペプチドが優れた抗腫瘍作用を仔するので
、抗Ｍ瘍剤又はその前駆体として有用である。
ドは、それら自体、又はそれらから酵素等により切断し
て生ずるポリペプチドが優れた抗腫瘍作用を仔するので
、抗Ｍ瘍剤又はその前駆体として有用である。
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが
、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。な
お、ヒト癌壊死因子活性は、Ｌ−９２９細胞傷害活性を
指標にしてＲｕＮらの方法［Ｊ、１ｍｍｕｎｏｔ、、１
２５．１６７１（１９８Ｇ＞１に従って測定した。
、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。な
お、ヒト癌壊死因子活性は、Ｌ−９２９細胞傷害活性を
指標にしてＲｕＮらの方法［Ｊ、１ｍｍｕｎｏｔ、、１
２５．１６７１（１９８Ｇ＞１に従って測定した。
実施例１
（１）ヒト癌壊死因子をコードするＤＮＡの調製特願昭
５９−４３ｆｉ１７号明細書に開示された方法に従って
得た、ヒト癌壊死因子前駆体をコードするＤＮＡを組み
込んだ組み換え体プラスミドｐＨＴＮＦ −１３により
形質転換させたＥ、ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩをＬＢブロス
（組成＝ＩＩ当たり、トリプトン１０ｇ、酵母エキス５
ｇ 、 ＮａＣ１］Ｏｇ ： ｐＨ７，５）で培養し
、菌体を採取し、この菌体からＷｉｌｋｊｅらの方法［
Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓＲｅｓ、、？、８５９ （１９７
９）］に従ってプラスミドＤＮＡを得た。
５９−４３ｆｉ１７号明細書に開示された方法に従って
得た、ヒト癌壊死因子前駆体をコードするＤＮＡを組み
込んだ組み換え体プラスミドｐＨＴＮＦ −１３により
形質転換させたＥ、ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩをＬＢブロス
（組成＝ＩＩ当たり、トリプトン１０ｇ、酵母エキス５
ｇ 、 ＮａＣ１］Ｏｇ ： ｐＨ７，５）で培養し
、菌体を採取し、この菌体からＷｉｌｋｊｅらの方法［
Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓＲｅｓ、、？、８５９ （１９７
９）］に従ってプラスミドＤＮＡを得た。
このプラスミドＤＮＡから、制限酵素ＰｓｔＩでヒト癌
壊死因子前駆体をコードする領域を含むクローン化ＤＮ
Ａを切り出し、更に非翻訳領域の一部を制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩで分解し、約１．１ ｋｂｐの断片を得た。
壊死因子前駆体をコードする領域を含むクローン化ＤＮ
Ａを切り出し、更に非翻訳領域の一部を制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩで分解し、約１．１ ｋｂｐの断片を得た。
これをプラスミドｐ、ＢＲ３２２のＰｓｔＩ −Ｅｃｏ
ＲＩ断片（約３．（ｉ ｋｂｐ）に組み込むことにより
再りロー二／グし、とのプラスミドをｐＨＴ１１３と名
づけた（第１図参照）。
ＲＩ断片（約３．（ｉ ｋｂｐ）に組み込むことにより
再りロー二／グし、とのプラスミドをｐＨＴ１１３と名
づけた（第１図参照）。
ｐＨＴ１１３の構築（第１及び２図参照）去プロモータ
ー ベクター１）ＤＲ５４０［Ｒｕ５ｓｅｌｌ。
ー ベクター１）ＤＲ５４０［Ｒｕ５ｓｅｌｌ。
Ｄ、Ｒ，、ｅｔ ａｌ、、Ｇｅｎｅ、２０，２３１（１
９８２ＣＰ−Ｌバイオケミカルス社（米国）より購入コ
の３００μｇに制限酵素’ ＥｃｏＲＩ （４８００単
位）及びＢａｎ）ＩＩ （２０００単位）を含む２１の
反応緩衝液［１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ ’ｔ＝衝液（
Ｐｌ）７．５＞、 ５０ｍＭ ＮａＣ１、６ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ２．６ ｍＭ ２−メルカプトエタノール］を加え
、３７℃で６０分間反応させた。終Ｉ！１度０．３Ｍに
なるようにＮａＣ＋を加え、更に２倍容のエタノールを
加え、ＤＮＡ断片をエタノール沈殿として回収した。５
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により亜プロモータ
ー領域を含む３８７ｂｐの断片を約８．３μｇ得た。こ
のＤＮＡ断片に１．トリエステル法で化学合成した、開
始コドンＡＴＧとヒト癌壊死因子構造遺伝子の一部を含
み、その両端がそれぞれ制限酵素Ｂａｎ）ｌ ＩとＡｖ
ａＩの認識配列を存する、次の式 で示されるオリゴヌクレオチド アダプターをＴ４ＤＮ
ＡＩＪガーゼを用いて結合させた。ここに得られた［）
ＮＡ断片を、以下ｔａｃプロモーター・アダプター断片
という（第２図参照）。
９８２ＣＰ−Ｌバイオケミカルス社（米国）より購入コ
の３００μｇに制限酵素’ ＥｃｏＲＩ （４８００単
位）及びＢａｎ）ＩＩ （２０００単位）を含む２１の
反応緩衝液［１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ ’ｔ＝衝液（
Ｐｌ）７．５＞、 ５０ｍＭ ＮａＣ１、６ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ２．６ ｍＭ ２−メルカプトエタノール］を加え
、３７℃で６０分間反応させた。終Ｉ！１度０．３Ｍに
なるようにＮａＣ＋を加え、更に２倍容のエタノールを
加え、ＤＮＡ断片をエタノール沈殿として回収した。５
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により亜プロモータ
ー領域を含む３８７ｂｐの断片を約８．３μｇ得た。こ
のＤＮＡ断片に１．トリエステル法で化学合成した、開
始コドンＡＴＧとヒト癌壊死因子構造遺伝子の一部を含
み、その両端がそれぞれ制限酵素Ｂａｎ）ｌ ＩとＡｖ
ａＩの認識配列を存する、次の式 で示されるオリゴヌクレオチド アダプターをＴ４ＤＮ
ＡＩＪガーゼを用いて結合させた。ここに得られた［）
ＮＡ断片を、以下ｔａｃプロモーター・アダプター断片
という（第２図参照）。
一方、第（１）項で得たヒト癌壊死因子をコードするＤ
ＮＡの組み込まれたプラスミドｐＨＴ１１３の３００ｕ
ｇに、制限酵素旧ｎｄｍ （１２００単位）と八ｖａＩ
（１２００単位）を上記と同じ反応緩衝液中で３７°
Ｃ１６０分間作用させた後、ＤＮＡ断片をエタノール沈
殿として回収した。５％ポリアクリルアミドゲル電気泳
動により、ヒト癌壊死因子の翻訳領域の大部分を含む５
７ＢｂｐのＤＮＡ断片（以下ＨＴＮＦ断片という）を分
離精製し、約２μｇ得た。
ＮＡの組み込まれたプラスミドｐＨＴ１１３の３００ｕ
ｇに、制限酵素旧ｎｄｍ （１２００単位）と八ｖａＩ
（１２００単位）を上記と同じ反応緩衝液中で３７°
Ｃ１６０分間作用させた後、ＤＮＡ断片をエタノール沈
殿として回収した。５％ポリアクリルアミドゲル電気泳
動により、ヒト癌壊死因子の翻訳領域の大部分を含む５
７ＢｂｐのＤＮＡ断片（以下ＨＴＮＦ断片という）を分
離精製し、約２μｇ得た。
別途に、プラスミドｐＢＲ３２２の５０μｇに制限酵素
Ｈｉｎｄｌｌ＋ （１２００単位）とＥｃｏＲＩ （２
５００単位）を上記と同じ反応緩衝液中で３７℃、１２
０分間作用させた後、エタノール沈殿させ、次いで０．
７％低融点アガロースゲル電気泳動により、アンピシリ
ン耐性遺伝子を含む約４．３ｋｂｐのＤＮＡ断片（以下
ｐＢＲ３２２−Ａｍｐｒ断片という）を約１０μｇ得た
。
Ｈｉｎｄｌｌ＋ （１２００単位）とＥｃｏＲＩ （２
５００単位）を上記と同じ反応緩衝液中で３７℃、１２
０分間作用させた後、エタノール沈殿させ、次いで０．
７％低融点アガロースゲル電気泳動により、アンピシリ
ン耐性遺伝子を含む約４．３ｋｂｐのＤＮＡ断片（以下
ｐＢＲ３２２−Ａｍｐｒ断片という）を約１０μｇ得た
。
ｐＢＲ３２２−Ａｍｐ’断片ｆ３ｕｇとＨＴＮＦ断片１
μｇを６．１３ｍＭ ＭｇＣ１ｚを含有するｆ１６ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液（Ｐ）１７．６）に溶解し、５
５℃で１０分間加温した後、室温で１０分間放置し、次
いで１ ｍＭ ＡＴＰ、 １０ｍＭジチオスレイトール
存在下にＴ４ＤＮＡリガーゼ１１３８４１位を添加し、
２２℃で１２０分間反応させた後、フェノール抽出によ
りＤＮＡ約４μｇを回収した。
μｇを６．１３ｍＭ ＭｇＣ１ｚを含有するｆ１６ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液（Ｐ）１７．６）に溶解し、５
５℃で１０分間加温した後、室温で１０分間放置し、次
いで１ ｍＭ ＡＴＰ、 １０ｍＭジチオスレイトール
存在下にＴ４ＤＮＡリガーゼ１１３８４１位を添加し、
２２℃で１２０分間反応させた後、フェノール抽出によ
りＤＮＡ約４μｇを回収した。
このＤＮＡ断片０．８μｇとｔａｃプロモーター・アダ
プター断片０．３μｇを上記と同様の反応条件（但し、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼは６３単位用いる）で２２℃。
プター断片０．３μｇを上記と同様の反応条件（但し、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼは６３単位用いる）で２２℃。
１２０分間反応させた後、蒸留水で６倍希釈し、下記の
方法でカルシウム処理したＥ、ｃｏｌｉ ＪＭＩ０３［
１ａｃｌＱ；Ｒｕ５ｓｅｌｌ、Ｄ、Ｒ，、ｅｔ ａｌ、
、Ｇｅｎｅ、２０，２３１（＋９８２）］（Ｐ−Ｌバイ
オケミカルス社より購入）を等容量添加した。
方法でカルシウム処理したＥ、ｃｏｌｉ ＪＭＩ０３［
１ａｃｌＱ；Ｒｕ５ｓｅｌｌ、Ｄ、Ｒ，、ｅｔ ａｌ、
、Ｇｅｎｅ、２０，２３１（＋９８２）］（Ｐ−Ｌバイ
オケミカルス社より購入）を等容量添加した。
これを氷水中で２０分間、４２℃で１分間、室昌で１０
分間インキュベートした後、ＬＢブロスを加え、３７℃
で６０分間振盪した。その菌体懸濁液の一部を２５μｇ
１１のアンビシリフを含むＬＢ寒天平板に播き、３７℃
で一夜培養した後、アンピシリン耐性株を選択して形質
転換体を得た。ここで得たヒト癌壊死因子生産用形質発
現プラスミドをｐＨＴＴ２６、それによるＪＭＩ０３株
の形質転換体をＥ、ｃｏ目ＪＭＩ０３／１）ＨＴＴ２Ｅ
ｌと名づけた。
分間インキュベートした後、ＬＢブロスを加え、３７℃
で６０分間振盪した。その菌体懸濁液の一部を２５μｇ
１１のアンビシリフを含むＬＢ寒天平板に播き、３７℃
で一夜培養した後、アンピシリン耐性株を選択して形質
転換体を得た。ここで得たヒト癌壊死因子生産用形質発
現プラスミドをｐＨＴＴ２６、それによるＪＭＩ０３株
の形質転換体をＥ、ｃｏ目ＪＭＩ０３／１）ＨＴＴ２Ｅ
ｌと名づけた。
Ｅ、ｃｏｌｉ ＪＭ１０３のカルシウム処理法は次の通
りである。ＪＭＩ０３株をＬグロス（組成＝１１当たり
、トリプトンＩＯｇ、酵母エキＸ ５ ｇ＋ ＮａＣ１
５ｇ。
りである。ＪＭＩ０３株をＬグロス（組成＝１１当たり
、トリプトンＩＯｇ、酵母エキＸ ５ ｇ＋ ＮａＣ１
５ｇ。
ブドウ糖１ ｇ ； ＰＨ７，２）の５１に接種し、３
７℃で一夜培養した。その菌体懸濁液の１１１を１００
１のＬグロスに接種し、濁度（吸光度ｅ５０ｎｍ）が０
．６になるまで３７℃で培養した。氷水中で３０分間静
置後、菌体を遠心分離により集め、これを５０■１の５
０ ｍＭＣａＣ＋□に懸濁し、０℃で６０分間静置した
。次いで、遠心分離により菌体を集め、２０％グリセリ
ンを含む５０ｍＭ ＣａＣ＋２のｌ０ｍ１に再懸濁し、
これをカルシウム処理Ｅ、ｃｏｌｉ ＪＭ１０３とした
。
７℃で一夜培養した。その菌体懸濁液の１１１を１００
１のＬグロスに接種し、濁度（吸光度ｅ５０ｎｍ）が０
．６になるまで３７℃で培養した。氷水中で３０分間静
置後、菌体を遠心分離により集め、これを５０■１の５
０ ｍＭＣａＣ＋□に懸濁し、０℃で６０分間静置した
。次いで、遠心分離により菌体を集め、２０％グリセリ
ンを含む５０ｍＭ ＣａＣ＋２のｌ０ｍ１に再懸濁し、
これをカルシウム処理Ｅ、ｃｏｌｉ ＪＭ１０３とした
。
第１図はヱプロモーター付き形質発現プラスミドｐ）（
ＴＴ２Ｂの構築工程を示す。
ＴＴ２Ｂの構築工程を示す。
（３）非融合型ヒト癌壊死因子の生産
第（２１項で得た形質転換体Ｅ、ｃｏｌｉ ＪＭＩ０３
／ＰＨＴＴ２６をＬＢジブロス中７℃で一夜振盪培養し
た。その菌体懸濁液の０．５１を５１のＬＢグロスに接
種し、３７℃で１時間培養後、終濃度１ ｍＭになるよ
うにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを
添加し、更に４時間培養した。菌体を遠心分離により集
め洗浄した後、０．１％リゾチームを含む５０ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣＩＩ衝液（ｐｌイ８．０） −３（１ｍＭ
ＮａＣＩ液の１１に再懸濁し、０℃で３０分間静置した
後、トライアイス／エタノール浴での凍結と３７℃での
融解を６回繰り返した。次いで、遠心分離により菌体残
渣を除き、清澄な上清液を得た。
／ＰＨＴＴ２６をＬＢジブロス中７℃で一夜振盪培養し
た。その菌体懸濁液の０．５１を５１のＬＢグロスに接
種し、３７℃で１時間培養後、終濃度１ ｍＭになるよ
うにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを
添加し、更に４時間培養した。菌体を遠心分離により集
め洗浄した後、０．１％リゾチームを含む５０ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣＩＩ衝液（ｐｌイ８．０） −３（１ｍＭ
ＮａＣＩ液の１１に再懸濁し、０℃で３０分間静置した
後、トライアイス／エタノール浴での凍結と３７℃での
融解を６回繰り返した。次いで、遠心分離により菌体残
渣を除き、清澄な上清液を得た。
この上清液中のヒト癌壊死因子活性（Ｌ−９２９細胞傷
害活性）は９．９Ｘ １０’単位／−１であった。
害活性）は９．９Ｘ １０’単位／−１であった。
また、この上清液に特願昭５８−２２８７９０号明細書
、 に開示された方法で調製した抗つサギ癌壊死因子抗
体を添加しても、そのｔ−９２８細胞傷害活性には何ら
有意な低下は認められず、ヒト癌壊死因子はウサギ癌壊
死因子と免疫学的に交差しないことを確認した。
、 に開示された方法で調製した抗つサギ癌壊死因子抗
体を添加しても、そのｔ−９２８細胞傷害活性には何ら
有意な低下は認められず、ヒト癌壊死因子はウサギ癌壊
死因子と免疫学的に交差しないことを確認した。
実施例２
匹プロモーターを用いて、ヒト癌壊死因子生産用形質発
現プラスミドを構築した。制限酵素による切断及びＴａ
ＤＮＡリガーゼによる結合の反応条件は、実施例１の
第（２）項とほぼ同じである。
現プラスミドを構築した。制限酵素による切断及びＴａ
ＤＮＡリガーゼによる結合の反応条件は、実施例１の
第（２）項とほぼ同じである。
（１１ＬｒＪ７’ロモーター付き形質発現プラスミドｐ
ＨＴＲ９１の構築（第３及び４図参照）実施例１の第（
」〕項で得たプラスミドｐＨ７１１３に制限酵素＾ｖａ
ｊと５ａｌＩを作用させることにより、３＠のＤＮＡ断
片（それぞれ約０．８ｋｂｐ、 １．３ｋｂｐ及び２．
６ｋｂｐ）が生じた。これらの断片のうち、ヒト癌壊死
因子をコードする領域の大部分とプラスミドｐ１３Ｒ３
２２のテトラサイクリン耐性遺伝子の一部を含む約１．
３ｋｂｐのＤＮＡ断片を分離精製した。この断片に、次
の式 で示される合成オリゴヌクレオチド アダプターをＴａ
ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた。ここに得られた
ＤＮＡ断片を、以下ＨＴＮＦ−アダプター断片という（
第３図参照）。
ＨＴＲ９１の構築（第３及び４図参照）実施例１の第（
」〕項で得たプラスミドｐＨ７１１３に制限酵素＾ｖａ
ｊと５ａｌＩを作用させることにより、３＠のＤＮＡ断
片（それぞれ約０．８ｋｂｐ、 １．３ｋｂｐ及び２．
６ｋｂｐ）が生じた。これらの断片のうち、ヒト癌壊死
因子をコードする領域の大部分とプラスミドｐ１３Ｒ３
２２のテトラサイクリン耐性遺伝子の一部を含む約１．
３ｋｂｐのＤＮＡ断片を分離精製した。この断片に、次
の式 で示される合成オリゴヌクレオチド アダプターをＴａ
ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた。ここに得られた
ＤＮＡ断片を、以下ＨＴＮＦ−アダプター断片という（
第３図参照）。
一方、ｙエプロモーター ベクターｐＤＲ７２０［Ｒｕ
５ｓｅｌｌ、Ｄ、Ｒ，、ｅｔ ａｌ、、Ｇｅｎｅ、２０
，２３１（１９８２）； Ｐ−Ｌバイオケミカルス社よ
り購入］に制限酵素ＥｃｏＲＩと）１ｐａＩを作用させ
、ｖ７−プロモーター領域の一部を含むＤＮＡ断片（３
５ｂｐ）を切り出し、これに次の式で示される合成オリ
ゴヌクレオチド アダプターをＴａ ＤＮＡリガーゼを
用いて結合させた。ここに得られたＤＮＡ断片を、以下
ｔｒｐプロモーター断片という。
５ｓｅｌｌ、Ｄ、Ｒ，、ｅｔ ａｌ、、Ｇｅｎｅ、２０
，２３１（１９８２）； Ｐ−Ｌバイオケミカルス社よ
り購入］に制限酵素ＥｃｏＲＩと）１ｐａＩを作用させ
、ｖ７−プロモーター領域の一部を含むＤＮＡ断片（３
５ｂｐ）を切り出し、これに次の式で示される合成オリ
ゴヌクレオチド アダプターをＴａ ＤＮＡリガーゼを
用いて結合させた。ここに得られたＤＮＡ断片を、以下
ｔｒｐプロモーター断片という。
別途に、プラスミドＰＢＲ３２２に制限酵素ＥｃｏＲＩ
と５ａｌｌを作用させ、大きなりＮＡ断片（約３．７ｋ
ｂｐ）を切り出した。これに、先に調製したＨＴＮＦ−
アダプター断片とｔｒｐプロモーター断片をＴ４ＤＮＡ
リガーゼを用いて結合させ、ヒト癌壊死因子発現プラス
ミドを構築し、実施例１の第Ｃ）項と同様にして形質転
換体を得た。但し、宿主としてＥ、ｃｏｌｉＨ旧Ｏ１を
用い、形質転換体の選択はテトラサイタリン（１２，５
μｇ ／ｍｌ）耐性で行った。ここで得た形質発現プラ
スミドをｐＨＴＲ９Ｌそれによる形質転換体をＥ、ｃｏ
ｌｉ ＨＢＩＯＩ／ ＰＨＴＲ９１と名づけた。
と５ａｌｌを作用させ、大きなりＮＡ断片（約３．７ｋ
ｂｐ）を切り出した。これに、先に調製したＨＴＮＦ−
アダプター断片とｔｒｐプロモーター断片をＴ４ＤＮＡ
リガーゼを用いて結合させ、ヒト癌壊死因子発現プラス
ミドを構築し、実施例１の第Ｃ）項と同様にして形質転
換体を得た。但し、宿主としてＥ、ｃｏｌｉＨ旧Ｏ１を
用い、形質転換体の選択はテトラサイタリン（１２，５
μｇ ／ｍｌ）耐性で行った。ここで得た形質発現プラ
スミドをｐＨＴＲ９Ｌそれによる形質転換体をＥ、ｃｏ
ｌｉ ＨＢＩＯＩ／ ＰＨＴＲ９１と名づけた。
第４図はＷプロモーター付き形質発現プラスミドｐＨＴ
Ｒ９１の構築工程を示す。
Ｒ９１の構築工程を示す。
に）非融合型ヒト癌壊死因子の生産
第（１）項で得た形質転換体Ｅ、ｃｏｌｉ ）ＩＢＩＯ
Ｉ／ｐＨＴＲ９１を改良Ｍ９培地（組成：０．７％Ｎａ
ｚＨＰＯ４・１２Ｈ２０゜０６３％ＫＨ２ＰＯ４，０，
０５％ＮａＣ］、 ０．１％ＮＨ４ＣＩ、２ ｎ／ｌビ
タミ７ Ｂ＋＋ ０．４５％カザミノ酸、 １ ｍＭ
Ｍｇ ＳＯａ。
Ｉ／ｐＨＴＲ９１を改良Ｍ９培地（組成：０．７％Ｎａ
ｚＨＰＯ４・１２Ｈ２０゜０６３％ＫＨ２ＰＯ４，０，
０５％ＮａＣ］、 ０．１％ＮＨ４ＣＩ、２ ｎ／ｌビ
タミ７ Ｂ＋＋ ０．４５％カザミノ酸、 １ ｍＭ
Ｍｇ ＳＯａ。
０．１ｍＭ ＣａＣｌ２．０．５％ブドウ糖）中３７°
Ｃで一夜振盪培養した。その菌体懸濁液０．０５ｍ１を
５１の同組成培地に接種し、３７℃で１時間培養し、次
いでイノドール−３−アクリル酸を終濃度２０μｇ ／
ｍｌになるように加え、更に４時間培養を継続した後、
遠心分離により菌体を集めた。
Ｃで一夜振盪培養した。その菌体懸濁液０．０５ｍ１を
５１の同組成培地に接種し、３７℃で１時間培養し、次
いでイノドール−３−アクリル酸を終濃度２０μｇ ／
ｍｌになるように加え、更に４時間培養を継続した後、
遠心分離により菌体を集めた。
この菌体から実施例１の第（３）項と同様にして、菌体
抽出物を得た。この抽出液中のヒト癌壊死因子活性（Ｌ
−９２９細胞傷害活性）は１．０１Ｘ １０６単位／１
であった。
抽出物を得た。この抽出液中のヒト癌壊死因子活性（Ｌ
−９２９細胞傷害活性）は１．０１Ｘ １０６単位／１
であった。
実施例３
ｐｈｏｓ遺伝子を用いて、ヒト癌壊死因子とリン酸結合
蛋白質との融合蛋白質を分泌する形質発現プラスミドを
構築した。制限酵素による切断及びＴ４ＤＮＡリガーゼ
による結合の反応条件は、実施例１の第（２１項とほぼ
同じである。
蛋白質との融合蛋白質を分泌する形質発現プラスミドを
構築した。制限酵素による切断及びＴ４ＤＮＡリガーゼ
による結合の反応条件は、実施例１の第（２１項とほぼ
同じである。
実施例２の第（凰）項と同様に、プラスミドｐＨＴ１１
３に制限酵素Ａｖａ Ｉと５ａｌＩを作用させ、約１．
３ｋｂ−ｐのＤＮＡ断片を分離精製した。このＤＮＡ断
片に、トリエステル法で化学合成した、開始コドンＡＴ
Ｇとヒト癌壊死因子構造遺伝子の一部を含み、両端がそ
れぞれ制限酵素Ｂａ■ＩＩＩと＾ｖａｌの認識配列を存
する、次の式 で示されるオリゴヌクレオチド アダプターをＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを用いて結合させ、次いで制限酵素ＢａｍＨ
Ｉを作用させた。
３に制限酵素Ａｖａ Ｉと５ａｌＩを作用させ、約１．
３ｋｂ−ｐのＤＮＡ断片を分離精製した。このＤＮＡ断
片に、トリエステル法で化学合成した、開始コドンＡＴ
Ｇとヒト癌壊死因子構造遺伝子の一部を含み、両端がそ
れぞれ制限酵素Ｂａ■ＩＩＩと＾ｖａｌの認識配列を存
する、次の式 で示されるオリゴヌクレオチド アダプターをＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを用いて結合させ、次いで制限酵素ＢａｍＨ
Ｉを作用させた。
以上の操作により、開始コドンＡＴＧが付加したヒト癌
壊死因子をコードするＤＮＡ領域と、テトラサイタリン
耐性遺伝子の一部（制限酵素ＢａｗｌｌＩ切断部位より
上流域）を含み、両端がＢａ間）ＩＩ認識配列を有する
ＤＮＡ断片（以下ＨＴＮＦ−Ｔｅ ｔｒ４ａｍＨＩ断片
という）を得た（第５図参照）。
壊死因子をコードするＤＮＡ領域と、テトラサイタリン
耐性遺伝子の一部（制限酵素ＢａｗｌｌＩ切断部位より
上流域）を含み、両端がＢａ間）ＩＩ認識配列を有する
ＤＮＡ断片（以下ＨＴＮＦ−Ｔｅ ｔｒ４ａｍＨＩ断片
という）を得た（第５図参照）。
一方、ｐｈｏｓｉｌｌ伝子を含むブラＸ ミＦ ｐｓＮ
５１Ｂ２［Ｍｏｒｉｔａ、Ｔ、、ｅｔ ａｌ、、Ｅｕｒ
、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、リル４２７（１９８３）］に
制限酵素Ｈｐａ Ｉを作用させ、続いてＥｃｏＲＩで分
解することにより、ｐｈｏＳ□遺伝子のプロモーター領
域。
５１Ｂ２［Ｍｏｒｉｔａ、Ｔ、、ｅｔ ａｌ、、Ｅｕｒ
、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、リル４２７（１９８３）］に
制限酵素Ｈｐａ Ｉを作用させ、続いてＥｃｏＲＩで分
解することにより、ｐｈｏＳ□遺伝子のプロモーター領
域。
ＳＤ配列、シグナルペプチドをフードする領域及びリン
酸結合蛋白質をコードする領域の一部を残し、それ以外
のｐｈｏＳ−遺伝子部分が欠失したＨｐａ Ｉ−Ｅｃｏ
ＲＩ断片（約４ ｋｂｐ）を得た。この時、同時に切り
出されたＨｐａＩ −ＨｐａＩ断片（約０．２ｋｂｐ）
と）Ｉｐａｌ −ＥｃｏＲＩ断片（約０．８ｋｂＰ）は
１％低融点アガロースゲル電気泳動により除いた。
酸結合蛋白質をコードする領域の一部を残し、それ以外
のｐｈｏＳ−遺伝子部分が欠失したＨｐａ Ｉ−Ｅｃｏ
ＲＩ断片（約４ ｋｂｐ）を得た。この時、同時に切り
出されたＨｐａＩ −ＨｐａＩ断片（約０．２ｋｂｐ）
と）Ｉｐａｌ −ＥｃｏＲＩ断片（約０．８ｋｂＰ）は
１％低融点アガロースゲル電気泳動により除いた。
この）ＩｐａＩ −ＥｃｏＲＩ断片（約４ ｋｂＰ）に
、制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列を有する、次の式で示
される合成オリゴヌクレオチド リンカ−・（Ｐ−Ｌバ
イオケミカルス社）をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合
させた。更に、このリンカ−の付加したＤＮＡ断片に制
限酵素Ｄａ■ＨＩを作用させ、ｐｈｏＳプロモーター領
域、ＳＤ配列、シグナルペプチドをコードする領域及び
リン酸結合蛋白質をコードする領域の一部とテトラサイ
クリン耐性遺伝子の大部分（ＢａｍＨＩ切断部位より下
流域）を含むＤＮＡ断片（約３．１３ ｋｂｐ）を得た
。このＤＮＡ断片を、以下ｐｈｏＳプロモーター−Ｂａ
ｍＨＩ ・Ｔｅｔ’断片という。
、制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列を有する、次の式で示
される合成オリゴヌクレオチド リンカ−・（Ｐ−Ｌバ
イオケミカルス社）をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合
させた。更に、このリンカ−の付加したＤＮＡ断片に制
限酵素Ｄａ■ＨＩを作用させ、ｐｈｏＳプロモーター領
域、ＳＤ配列、シグナルペプチドをコードする領域及び
リン酸結合蛋白質をコードする領域の一部とテトラサイ
クリン耐性遺伝子の大部分（ＢａｍＨＩ切断部位より下
流域）を含むＤＮＡ断片（約３．１３ ｋｂｐ）を得た
。このＤＮＡ断片を、以下ｐｈｏＳプロモーター−Ｂａ
ｍＨＩ ・Ｔｅｔ’断片という。
先に調製したＩ（ＴＮＦ−Ｔｅｔ’−Ｂａｍ）ＩＩ断片
とｐｈｏＳプロモーター−ＢａｍＨＩ ・Ｔｅｔ’断片
をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させ、ｐｈｏＳプロ
モーターの付いた、ヒト壊死因子とリン酸結合蛋白質と
の融合蛋白質を生産する形質発現プラスミドを構築し、
実施例２の第（１）項と同様にしてＥ、ｃｏｌｉ ＨＢ
ＩＯ＋を形質転換した。ここで得た形質発現プラスミド
をｐＨＴＳ ｌ １５、それによる形質転換体をＥ、ｃ
ｏｌ ｉ ＨＢＩＯＩ／ ｆ）ＨＴＳ １１５と名づけ
だ。
とｐｈｏＳプロモーター−ＢａｍＨＩ ・Ｔｅｔ’断片
をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させ、ｐｈｏＳプロ
モーターの付いた、ヒト壊死因子とリン酸結合蛋白質と
の融合蛋白質を生産する形質発現プラスミドを構築し、
実施例２の第（１）項と同様にしてＥ、ｃｏｌｉ ＨＢ
ＩＯ＋を形質転換した。ここで得た形質発現プラスミド
をｐＨＴＳ ｌ １５、それによる形質転換体をＥ、ｃ
ｏｌ ｉ ＨＢＩＯＩ／ ｆ）ＨＴＳ １１５と名づけ
だ。
第６図はＥ１疹−フロモーター付き形質発現プラスミド
ｐＨＴＳ１１５の構築工程を示す。
ｐＨＴＳ１１５の構築工程を示す。
第（皿）項で得た形質転換体Ｅ、ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩ
／ ｐＨＴＳ１１５を以下の条件で培養し、ベリプラス
ムに蓄積したヒト癌壊死因子とリン酸結合蛋白質との融
合蛋白質をＷｉｌｌｓｋｙらの方法［Ｊ、Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ、、１２７，５９５：＋９７６）コに従って抽出
した。
／ ｐＨＴＳ１１５を以下の条件で培養し、ベリプラス
ムに蓄積したヒト癌壊死因子とリン酸結合蛋白質との融
合蛋白質をＷｉｌｌｓｋｙらの方法［Ｊ、Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ、、１２７，５９５：＋９７６）コに従って抽出
した。
基本培地にはＴＧ培地を用いた。その組成は次の通りで
ある。
ある。
＋２０ｍＭ Ｔｒ ｉ ｓ −ＨＣＩ緩衝液（ｐｌ＋７
．４）、 ０．２％ブドウ糖、 ８０ｍＭ ＮａＣ＋、
２０ｍＭ ＫＣＩ、 ２０ｍＭ ＮＨａＣｌ。
．４）、 ０．２％ブドウ糖、 ８０ｍＭ ＮａＣ＋、
２０ｍＭ ＫＣＩ、 ２０ｍＭ ＮＨａＣｌ。
３ ｍＭ ＮａｚＳＯ４１１ｍＭ ＭｇＣｌ２．０．２
ｍＭ ＣａＣ＋２゜０．２μＭ ＦｅＣ１３，２Ｗｇ／
ｄｌ ｌ’イシン、２ｕ／ｄｌプロリ／、１■／ｄ＋
ビタミンＢ１゜ 以下の記述において、ＴＧ培地にＫＨ２ＰＯ４を６４×
１０−４Ｍになるように添加したものをＴＧＨＰ培地と
いい、６．４Ｘ １０−５Ｍになるように添加したもの
をＴＧＬＰ培地という。
ｍＭ ＣａＣ＋２゜０．２μＭ ＦｅＣ１３，２Ｗｇ／
ｄｌ ｌ’イシン、２ｕ／ｄｌプロリ／、１■／ｄ＋
ビタミンＢ１゜ 以下の記述において、ＴＧ培地にＫＨ２ＰＯ４を６４×
１０−４Ｍになるように添加したものをＴＧＨＰ培地と
いい、６．４Ｘ １０−５Ｍになるように添加したもの
をＴＧＬＰ培地という。
形質転換体をＴＧＨＰ培地５１に接種し、３７℃で２０
時間振盪培養した後、遠心分離により菌体を採取した。
時間振盪培養した後、遠心分離により菌体を採取した。
これをＴＧＬＰ培地の２１に再懸濁し、３７℃で６時間
培養した。
培養した。
菌体を遠心分離により集め、１−Ｉのｌ０ｍＭ Ｔｒ
ｉ ５−ＨＣＩ緩衝液（ｐ １１．７ 、２ ）含有３
０ｍＭ ＮａＣ＋で洗浄した後、３３ｍＭ Ｔｒ ｉ
ｓ −ＨＣ１緩衝液（、ｐＨ７，２）の０．２１に再懸
濁し、更に０．１ｍＭ ＥＤＴＡ及び４０％ンヨ糖を含
む’ ３３ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液（ＰＨ７，２
）の０．２１を添加し、３７℃に１０分間加温した。菌
体を遠心分離により集め、冷却した０、５ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２の０．４１に再懸濁し、時々激しく撹拌しながら氷
水中に１０分間浸漬した。
ｉ ５−ＨＣＩ緩衝液（ｐ １１．７ 、２ ）含有３
０ｍＭ ＮａＣ＋で洗浄した後、３３ｍＭ Ｔｒ ｉ
ｓ −ＨＣ１緩衝液（、ｐＨ７，２）の０．２１に再懸
濁し、更に０．１ｍＭ ＥＤＴＡ及び４０％ンヨ糖を含
む’ ３３ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液（ＰＨ７，２
）の０．２１を添加し、３７℃に１０分間加温した。菌
体を遠心分離により集め、冷却した０、５ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２の０．４１に再懸濁し、時々激しく撹拌しながら氷
水中に１０分間浸漬した。
この菌体竪濁液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、 ５
分間）し、上清液（以下ペリプラスム抽出液という）を
得た。このベリプラスム抽出液中のヒト癌壊死因子活性
（Ｌ−９２９細胞傷害活性）は１．３４Ｘ １０５単位
／菖１であった。ヒト癌壊死因子活性を示すポリペプチ
ドは、分子量１９Ｘ １０３ダルトンの融合蛋白質であ
ることが５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り示された。
分間）し、上清液（以下ペリプラスム抽出液という）を
得た。このベリプラスム抽出液中のヒト癌壊死因子活性
（Ｌ−９２９細胞傷害活性）は１．３４Ｘ １０５単位
／菖１であった。ヒト癌壊死因子活性を示すポリペプチ
ドは、分子量１９Ｘ １０３ダルトンの融合蛋白質であ
ることが５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り示された。
実施例４
ｐｈｏＳ遺伝子遺伝子実施例３と同様の分泌型形質発現
プラスミドを構築した。但し、実施例３とは異なり、合
成オリゴヌクレオチド アダプターを用いることなく、
ヒト癌壊死因子前駆体塩基配列の一部を残して形質発現
プラスミドを構築した。
プラスミドを構築した。但し、実施例３とは異なり、合
成オリゴヌクレオチド アダプターを用いることなく、
ヒト癌壊死因子前駆体塩基配列の一部を残して形質発現
プラスミドを構築した。
そのため産生された融合蛋白質はヒト癌壊死因子の前駆
体から成熟体への変換のための切断部位（Ａｒｇ −Ｓ
ｅｔ ）を保持している。制限酵素による切断及びＴａ
ＤＮＡリガーゼによる結合の反応条件は、実施例１の第
（２）項とほぼ同じである。
体から成熟体への変換のための切断部位（Ａｒｇ −Ｓ
ｅｔ ）を保持している。制限酵素による切断及びＴａ
ＤＮＡリガーゼによる結合の反応条件は、実施例１の第
（２）項とほぼ同じである。
ヒト癌壊死因子ＤＮＡの調製には、実施例１の第０）項
に示した組み換え体プラスミドｐＨＴＮＦ −１３を用
いた。このプラスミドに制限酵素Ｐｓｔ Ｉを作用させ
、ヒト癌壊死因子前駆体全領域をコードするＤＮＡを含
む約１．２ ｋｂＰのＤＮＡ断片を切り出した。
に示した組み換え体プラスミドｐＨＴＮＦ −１３を用
いた。このプラスミドに制限酵素Ｐｓｔ Ｉを作用させ
、ヒト癌壊死因子前駆体全領域をコードするＤＮＡを含
む約１．２ ｋｂＰのＤＮＡ断片を切り出した。
このＤＮＡ断片に制限酵素９ｂｅＩを作用させ、約０．
９ｋｂｐの断片（以下ＢｂｅＩ −Ｐｓｔｌ断片という
）を得た。
９ｋｂｐの断片（以下ＢｂｅＩ −Ｐｓｔｌ断片という
）を得た。
この［１ｂｅｌ −ＰｓｔＩ断片の約６μｇをヌクレア
ーゼＢａｌ ３１の約０．０２単位を含む８０μ！の反
応緩衝液［＋２ｍＭ ＣａＣ＋２．１２ｍＭ ＭｇＣｌ
２．０．２ Ｍ ＮａＣｌ。
ーゼＢａｌ ３１の約０．０２単位を含む８０μ！の反
応緩衝液［＋２ｍＭ ＣａＣ＋２．１２ｍＭ ＭｇＣｌ
２．０．２ Ｍ ＮａＣｌ。
１ ｍＭ ＥＤＴＡ、 ２０ｍＭ Ｔｒ ｉ ｓ （ｐ
Ｈ８，０）］に溶解し、３０℃で３０分間作用させ、こ
のＤＮＡ断片の両端からそれぞれ約５０〜１５０ ｂｐ
程度ＤＮＡ鎖を短くした。続いて大腸菌ＤＮＡポリメラ
ーゼＩ（ラージフラグメント）の１０単位を、各０．１
ｍＭのｄＡＴＰ、 ｄＣＴＰ。
Ｈ８，０）］に溶解し、３０℃で３０分間作用させ、こ
のＤＮＡ断片の両端からそれぞれ約５０〜１５０ ｂｐ
程度ＤＮＡ鎖を短くした。続いて大腸菌ＤＮＡポリメラ
ーゼＩ（ラージフラグメント）の１０単位を、各０．１
ｍＭのｄＡＴＰ、 ｄＣＴＰ。
ｄＧＴＰ、 ｄＴＴＰ及び５０μｇ７ｍ１の牛血清アル
ブミ／の存在下で３７℃、６０分間反応させ、二本鎖に
完全修復させた後、制限酵素ＥｃｏＲＩの２５単位を作
用させ、約７５０ ｂｐのＤＮＡ断片（以下Ｂａｌ ３
１− ＥｃｏＲＩ断片という）を約３μｇ得た。
ブミ／の存在下で３７℃、６０分間反応させ、二本鎖に
完全修復させた後、制限酵素ＥｃｏＲＩの２５単位を作
用させ、約７５０ ｂｐのＤＮＡ断片（以下Ｂａｌ ３
１− ＥｃｏＲＩ断片という）を約３μｇ得た。
一方、ベクターには、実施例３の第（１）項で作製した
ＨｐａＩ −ＥｃｏＲＩ断片（約４ ｋｂｐ）を用いた
。
ＨｐａＩ −ＥｃｏＲＩ断片（約４ ｋｂｐ）を用いた
。
ＨｐａＩ −ＥｃｏＲＩ断片とＢａｌ ３１− Ｅｃｏ
ＲＩ断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させるこ
とにより、ｐｈｏｓ’ ａモーター、ＳＤ配列、ヒのシ
グナルペプチドのコード領域及びリン酸結合蛋白質構造
逍伝子の一部に続いて、前駆体部分の一部を含むヒト癌
壊死因子の構造遺伝子から成る、融合蛋白質を分泌する
形質発現プラスミドを構築し、実施例２の第（１）項と
同様にしてＥ、ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩを形質転換した。
ＲＩ断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させるこ
とにより、ｐｈｏｓ’ ａモーター、ＳＤ配列、ヒのシ
グナルペプチドのコード領域及びリン酸結合蛋白質構造
逍伝子の一部に続いて、前駆体部分の一部を含むヒト癌
壊死因子の構造遺伝子から成る、融合蛋白質を分泌する
形質発現プラスミドを構築し、実施例２の第（１）項と
同様にしてＥ、ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩを形質転換した。
ここで得た形質発現プラスミドをｆ）ＨＴＳ３７、それ
による形質転換体をＥ、ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩ／ ｐＨ
ＴＲ９１と名づけた。
による形質転換体をＥ、ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩ／ ｐＨ
ＴＲ９１と名づけた。
第７図はｐｈｏＳ−プロモーター付き形質発現プラスミ
ドＰＨＴＳ３７の構築工程を示す。図中、ｄＮＴＰｓは
ｄＡＴＰ、 ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを示して
いる。
ドＰＨＴＳ３７の構築工程を示す。図中、ｄＮＴＰｓは
ｄＡＴＰ、 ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを示して
いる。
（２１ヒト癌壊死因子の生産
第（１）項で得た形質転換体Ｅ、ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩ
／ｐＨＴＳ３７を実施例３の第■項に記載したのと同じ
条件で培養し、産生されたヒト癌壊死因子を菌体のベリ
プラスムより抽出した。
／ｐＨＴＳ３７を実施例３の第■項に記載したのと同じ
条件で培養し、産生されたヒト癌壊死因子を菌体のベリ
プラスムより抽出した。
Ｅ、ｃｏｌｉ １（ＢＩＯＩ／ ｐＨＴＲ９１の菌体内
で産生されたヒト癌壊死因子は、そのＮ末端部分に、ヒ
ト癌壊死因子前駆体の一部と、ｐｈｏＳ、遺伝子に由来
するリン酸結合蛋白質の一部が結合した融合蛋白質であ
る。しかしながら、ペリプラスム抽出液を５ＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動［ゲル濃度１２．５％；０
．１％ＳＤＳを含むＴｒｉｓ−グリシン緩衝液（ｐＨ８
，３）。
で産生されたヒト癌壊死因子は、そのＮ末端部分に、ヒ
ト癌壊死因子前駆体の一部と、ｐｈｏＳ、遺伝子に由来
するリン酸結合蛋白質の一部が結合した融合蛋白質であ
る。しかしながら、ペリプラスム抽出液を５ＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動［ゲル濃度１２．５％；０
．１％ＳＤＳを含むＴｒｉｓ−グリシン緩衝液（ｐＨ８
，３）。
３５Ｖ、１２時間］に付し、このゲルを２１簡幅（厚さ
２工、長さ２ ａｍ ）で切り出し、１％牛脂児血清を
含むアールのＭＥＭ培地（フロー社、米国）の１ｍｌ・
中、４℃で一夜振盪し、ゲル中の蛋白質を抽出しそれぞ
れのゲル片からの抽出液についてＬ−９２９細胞傷害活
性を測定したところ、分子量が１６．５Ｘ１０３タルト
ンの蛋白質バンド（クーマシー・ブリリアント′・ブル
ー染色）と一致して強い活性を認めた。形質転換体Ｅ、
ＣＯ１＋ ＨＢＩＯＩ／ ＰＨＴＳ３７が産生ずる融合
蛋白質の分子量の理論値は２３ Ｘ １０３ダルト／で
あり、ヒト癌壊死因子のそれは１７Ｘ １０３ダルトン
である。この結果は、融合蛋白質が菌体中のトリプシン
様酵素の作用をうけて、ヒト癌壊死因子の前駆体から成
熟体への変換のための切断部位（Ａｒｇ −Ｓｅｔ ）
のペプチド結合が限定水解され、ヒト癌壊死因子が切り
出されたことを強く示唆するものである。
２工、長さ２ ａｍ ）で切り出し、１％牛脂児血清を
含むアールのＭＥＭ培地（フロー社、米国）の１ｍｌ・
中、４℃で一夜振盪し、ゲル中の蛋白質を抽出しそれぞ
れのゲル片からの抽出液についてＬ−９２９細胞傷害活
性を測定したところ、分子量が１６．５Ｘ１０３タルト
ンの蛋白質バンド（クーマシー・ブリリアント′・ブル
ー染色）と一致して強い活性を認めた。形質転換体Ｅ、
ＣＯ１＋ ＨＢＩＯＩ／ ＰＨＴＳ３７が産生ずる融合
蛋白質の分子量の理論値は２３ Ｘ １０３ダルト／で
あり、ヒト癌壊死因子のそれは１７Ｘ １０３ダルトン
である。この結果は、融合蛋白質が菌体中のトリプシン
様酵素の作用をうけて、ヒト癌壊死因子の前駆体から成
熟体への変換のための切断部位（Ａｒｇ −Ｓｅｔ ）
のペプチド結合が限定水解され、ヒト癌壊死因子が切り
出されたことを強く示唆するものである。
また、ベリプラスム抽出液にトリプシン牽５μｇ／ｍｌ
の濃度で添加し、３７℃で１時間作用させた後、上記き
同じ条件で５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
付したところ、トリプシン非処理時に存在した、融合蛋
白質と考られる分子量２２ Ｘ １０３ダルトンの蛋白
質バンドが消失した。この結果も、ヒト癌壊死因子前駆
体部分を含む融合蛋白質がトリプシンにより限定水解さ
れることを示している。
の濃度で添加し、３７℃で１時間作用させた後、上記き
同じ条件で５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
付したところ、トリプシン非処理時に存在した、融合蛋
白質と考られる分子量２２ Ｘ １０３ダルトンの蛋白
質バンドが消失した。この結果も、ヒト癌壊死因子前駆
体部分を含む融合蛋白質がトリプシンにより限定水解さ
れることを示している。
なお、ペリプラスム抽出液中のヒト癌壊死因子活性（Ｌ
−９２９細胞傷害活性）は４．９３Ｘ １０５単位／■
１であった。
−９２９細胞傷害活性）は４．９３Ｘ １０５単位／■
１であった。
第１図は、実施例１のｔａｃプロモーター付き形質発現
プラスミドｆ）ＨＴＴ２６の構築工程を示し、第２図は
、実施例１のｔａｃプロモーター・アダプター断片の構
築工程を示し、第３図は、実施例２の）ＩＴＮＦ−アダ
プター断片の構築工程を示し、第４図は、実施例２のｔ
ｒｐプロモーター付き形質発現プラスミＦ ｐＨＴＲ９
１の構築工程を示し、第５図は、実施例３のＨＴＮＦ−
Ｔｅ ｔｒ−ＢａｍＨＩ断片の構築工程を示し、第６図
は、実施例３のｐｈｏＳプロモーター付き形質発現プラ
スミドｐＨＴＳ １１５の構築工程を示し、第７図は実
施例４のｐｈｏＳプロモーター付き形質発現プラスミド
ｐＨＴＳ３７の構築工程を示す。 第１図 第２図 ｔａｃ７’ｏぞ−たアダシン−閉テ片 第３図 ＨＴＮＦ−アクη−α斤１ト 第４図 第５図 ＨＴＮＦ−Ｔｅｔｒ−ｓａｍ＋ｎ１ｆ７第６図 第７図 手続補正書印発） 昭和６０年６月６日 １、事件の表示 昭和５９年特許願第８２６５３号 ２発明の名称 ヒト癌壊死因子ポリペプチドの製造法 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所大阪市東区道修町３丁目２５番地 名称２９１ 大日本製薬株式会社 代表取締役 藤 原 冨 男 ４、代理人 〒５６４ 住所大阪府吹田市江の本町３３番９４号大日本製薬株式
会社 総合研究所内 ＆補正により増加する発明の数 ３ α補正の対象 明細書の「特許請求の範囲」、「発明の詳細な説明」の
欄及び図面 ７、補正の内容 （１） 図面第７図を別紙第７図の通り訂正する。 （２） 明細書の「特許請求の範囲」の欄を別紙の通り
訂正する。 （３） 明細書の第２頁第１２〜１３行において、「本
発明は・・・・ポリペプチドの製造法に関する。」との
記載をｒ本発明はヒト癌壊死因子ポリペプチド及び遺伝
子組み換え技術を応用した該ポリペプチドの製造法に関
する。」と訂正する。 （４） 明細書の第７頁第８〜９行において、「・・・
・ポリペプチドの製造法を提供するものである。」との
記載を「・・・・ポリペプチドの製造法並びに該ポリペ
プチドを提供するものである。」と訂正する。 ６） 明細書の第８頁第８行において、「ということも
ある］の製造法を提供する・・・・」との記載を「とい
うこともある］及びその製造法を提供する・・・・Ｊと
訂正する。 （６） 明細書の第９頁第１３行において、「・・・・
に開示されている方法に従って・・・・」との記載を「
・・・・に開示されている方法（例えば参考例１の方法
）に従って・・・・」と訂正する。 （７） 明細書の第２４頁第３行において、［・・・・
に開示された方法に・・・司との記載を「・・・・に開
示された方法（参考例１の方法）に・・・・」と訂正す
る。 （８） 明細書の第２９頁第１３行において、「に開示
された方法で調製した・・・・」との記載を１に開示さ
れた方法（参考例３の方法）で調製した・・・・ｊと訂
正する。 （９） 明細書の第４２頁第６行と第７行の間、即ち図
面の簡単な説明の欄の前に次の「参考例１．参考例２．
第２表、参考例３及び参考例４Ｊを挿入する。 「参考例１ 特願昭５８−２２８７９０号に開示されている方法（参
考例２の方法）に従って、第２表に示すウサギ癌壊死因
子をコードするクローン化ＤＮＡを得た。このＤＮＡを
制限酵素Ｈａｅ Ｕ及びＡｖａ Ｉを用いて切り出し、
それぞれ第３３〜１２０番の８８ ｂｐから成るＤＮＡ
断片と第２８５〜５８３番の２９９ ｂｐから成るＤＮ
Ａ断片を得た。 制限酵素＾ｖａＩで切り出した２９９ ｂｐのＤＮＡ断
片はウサギ癌壊死因子をコードする領域であり、Ｈａｅ
Ｉｌで切り出した８８ ｂｐのＤＮＡ断片はウサギ壊死
死囚子前駆体をコードする領域に相当する部分である。 この２種のＤＮＡ断片を３２ｐで標識して、ヒト癌壊死
因子ｃ ＤＮＡのクローニングのためのプローブとし、
（８）項で使用した。 Ｃ）ヒト肺胞マクロファージからのｍＲＮＡ画分の単離 ヒト肺からリン酸緩衝化生理食塩液を用いて肺胞マクロ
ファージを１３．３Ｘ １０７個採取した。この肺胞マ
クロファージを１０％牛脂児血清含有のＰＰＭＩ−１６
４０培地に懸濁させてベトリディッシュ（直径８ｃ、）
に１枚当たり９ Ｘ １０’個となるように播き、３７
℃で５％炭酸ガス含有空気中、湿度８０〜１００％で前
培養した。１時間の前培養の後、−工／ドトキンン（大
腸菌由来のりボボリサツカライド）。 ＴＰＡ（ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセ
テート）及びンクロヘキシミドをそれぞれ最終濃度が１
０ｐｇ／ｍ＋、 ＩＯｎｇ／−ｌ及び１ ｐｇ／＊Ｉと
なるように添加混和し、更に培養を継続した。４〜４．
５時間後（通算５〜５５時間）に培養液を吸引除去し、
ディツシュ上に残ったマクロファージを０．６％ラウロ
イル号ルコ７ノ酸ナトリウムと６ｍＭクエノ酸ナトリウ
ムを含む５Ｍグアニジルチオンアネート液で溶解し、；
１モジナイズした。このホモジネートを０．１Ｍ ＥＤ
ＴＡ含Ｃｒ５．７Ｍ塩化セシウム水溶液上に重層し、超
遠心分離機（ＲＰＳ２７−２０一ター１日立製作所）を
用い２［ｉ、５００ ｒｐｍで２０時間遠心し、全ＲＮ
Ａ画分をペレットとして得た。これを０．３５Ｍ Ｎａ
ＣＩ。 ２０ｍＭＴｒｉｓ及び２０ｍＭ ＥＤＴＡを含む７Ｍ尿
素液の少量に溶解し、エタノール沈殿として回収した。 全ＲＮＡとして１５９μｇが得られた。 この全ＲＮＡ画分を１ ｍＭ ＥＤＴＡを含むｌＯｍＭ
Ｔｒｊｓ−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ７，４）（以下ＴＥ液と
いう）１１に溶解し、６５℃で５分間加熱した。これに
ＮａＣＨ＆液を０．５Ｍとなるように加えた後、あらか
じめ０５ＭＮａＣｌを含むＴＥ液で平衡化したオリゴ（
ｄＴ）セルロースカラムに付し、吸着したｐｏｌｙ（＾
）ｍＲＮＡ ヲＴＥ液で溶出することにより、ａ ｕｇ
のｐｏｌｙ（＾）ｍＲＮＡを得た。 とのｐｏｌｙ（Ａ
＞ｍＲＮＡを１．９ ｎｇ／ｎｌの濃度て蒸留水に溶解
し、これをアフリカッメガエルの卵母細胞１個当たり５
０ｎ１ずつ注入し、前述の方法に従って、卵母細胞中で
翻訳された蛋白質のＬ−９２９細胞傷害活性を測定した
。その結果、１０個の卵母細胞のホモジネート０，１１
中に６．６単位／１の活性を認め、とのｐｏｌｙ（＾）
ｍＲＮＡ調製品中にヒト癌壊死因子のｍＲＮＡが含まれ
ていることを確認した。 （３１ｃＤＮＡの合成。 （２）項で得られたｐｏｌｙ（Ａ＞ｍＲＮＡを鋳型とし
てグブラー（Ｇｕｂｌｅｒ）らの方法［Ｇｅｎｅ、２５
，２６３（＋９８３＞］に従ってｃ ＤＮＡを合成した
。 反応液量；４０μ！ ５０ｍＭ Ｔｒｊｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８，３） ；
１０ｍＭ ＭｇＣｌ２；１０ｍＭジチオスレイ゛トー
ル； ４ ｍＭピロホスフェート す ト リ ウ ム
； １．２５ｍＭ ｄＧＴＰ、 ｄＡＴＰ、 ｄＴＴ
Ｐ；０．５ｍＭ ｄｃＴＰ：Ｏ，１Ｂ７μＭ ａ−”Ｐ
−ｄＣＴＰ（比活性３０００Ｃｉ／ｓｍｏｔｅ）； ４
８ｇ オ リ ゴ（ｄ’Ｔ）＋２−１８ ： ６ ８
ｇ ｐｏｌｙ（八）ｍＲＮＡ ； １２０単位トリ骨髄
性白血病ウィルス由来逆転写酵素。 ４３°Ｃで３０分間反応させた後、ＥＤＴＡを加えて反
応を停止させ、フェノール−クロロホルム混液（１：
１）で抽出し、その水層に酢酸アンモニウムを最終濃度
２．５Ｍになるように加え、エタノールにより反応生成
物（単鎖ｃＤＮＡ −ＲＮＡ 複合体）を沈殿させた。 この単鎖ｃＤＮＡ−ＲＮＡ複合体を下記組成の反応緩衝
液１００μ！に溶解した。 反応緩衝液組成： ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−）ＩＣ＋緩衝液（ｐＨ７，５）
； ５ ｍＭ ＭｇＣ＋２；１０ｍＭ （Ｎ＋−１４）
２ＳＯ４； ｌ００ｍＭ ＫＣｌ ； ０．１５ｍＭ
β−ニコチンアミド アデニン ジヌクレオチド；５０
μｇ１１ウシ血清アルブミン：４０μＭ ｄＧＴＰ、
ｄＡＴＰ、 ｄＴＴＰ。 ｄＣＴＰ； ０．９単位大腸菌リボヌクレアーゼＨ；２
３単位大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■。 １２℃で６０分間、続いて２２℃で６０分間反応させた
後、 ＥＤＴＡを加えて反応を停止させ、上記と同様に
フェノール−クロロホルム混液て抽出し、エタノールに
より沈殿させて二重鎖ｃ ＤＮＡを得た。 （４）オリゴ（ｄｃ）テール付加ｃ ＤＮＡの調製（３
）項で得られた二重鎖ｃ ＤＮＡに次の組成の反応緩衝
液１００μｌを加え、３７°Ｃで３０分間反応させ、二
重鎖ｃＤＮＡにオリゴ（ｄＣ）テールを（（加させた。 反応緩衝液； ２ ｍＭ ＣＯＣｌ２．０．２ｍＭジチオスレイトール
、０．１ｍＭ ａ−”Ｐ−ｄＣＴＰ（比活性３ Ｃｉ／
ｍ＋＋ｏｌｅ）及び１０単位ターミナルデオキシヌクレ
オチジルトラ７スフェラーゼを含有する＋００ｍＭカコ
ジル酸ナトリウム（ｐＨ７，２）。 反応はＥＤＴＡ水溶液を添加して停止させ、フェノール
−クロロホルム混液で抽出し、オリゴ（ｄＣ）テール付
加ｃ ＤＮＡをエタノールにより沈殿させ回収した。こ
れをｌ０ｍＭ Ｔｒ ＋ ５−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７，
４）’。 １ ｍＭ ＥＤＴＡ及びｌ００ｍＭ ＮａＣ１を含む水
溶液に１１当たり２μｇのオリゴ（ｄＣ）テール付加ｃ
ＤＮＡを含むように溶解した。 Ｉ５１オリゴ（ｄｃ）テール付加プラスミドＰＢＲ３２
２ＤＮＡの調製 ２０ｍＭ Ｔｒ ｉ ｓ −ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７，４
）、ｌ０ｍＭ ＭｇＣ１２゜５０ｍＭ （ＮＨ４） ２
Ｓ０４及び１１当たり０．１．のラン血清アルブミ／を
含む水溶液１００μｐにｐＢＲ３２２を１０８ｇ溶解し
、制限酵素リツ□■エンドヌクレアーゼ１５単位を加え
、３７℃て１時間反応させた。反応終了後、反応液を７
．／−ルークロロオルム混液で抽出し、水層からエタノ
ール沈殿によってＤＮＡを回収した。得られたＤＮＡを
前述のオリゴ（ｄＣ）テール付加に用いた水溶液（但し
”Ｐ−ｄＣＴＰの代わりに’ｌ−１−ｄ Ｇ Ｔ ｌ）
を含む）２００μｌに溶解し、ターミナルデオキ７ヌク
レオチジルトランスフェラーゼ８０単位を用いて３７℃
で２０分間反応させ、約１０〜１５個のｄＧ残基を取り
込ませた。反応液をフェノール−クロロホルム混液で抽
出し、水層からエタノール沈殿によってオリゴ（ｄＣ）
テール付加プラスミドｐ１３Ｒ３２２ＤＮＡを回収した
。これをオリゴ（ｄＣ）テール付加ｃ ＤＮＡの場合と
同様の緩衝液に１１当たり２０μｇのオリゴ（ｄＧ）テ
ール付加プラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡを含むように溶
解した。 （６）組み換え体プラスミドの作製 （４）項で得られたオリゴ（ｄＣ）テール付加ｃＤＮＡ
ｊｅ液１２０μｌを、Ｃ５）項で得られたオリゴ（ｄＣ
）テール付加ｆ）ＢＲ３２２ＤＮＡ溶液１２０ｔｔｌト
ＫＡ合し、６５℃で５分間、５７℃で１２０分間インキ
ュベートしてアニーリングを行い、組み換え体プラスミ
ド溶液を調製した。 −１ （７）形質転換体の選択 （６）項で得られたｌ１ＩＩ口換え体プラスミド溶液を
用い、Ｅ、ｃｏ’ｌｉχＩ；１００株を形質転換させた
。即ち、Ｅ’、ｃｏｌｉχ１７７６株を、ジアミノピメ
リン酸１００μｇ／ｍｌ及びデミシフ ４０８ｇ７＊Ｉ
を補ったＬ−プ’Ｘ２０ｗ＋ｌ中、３７°Ｃで吸光度（
６００ｎ譜）が０．５となるまで培養し、菌体を４℃で
遠心して集め、５０ｍＭ ＣａＣＩｚ含有１０ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ７，３） １０ｍ１に分散し
、４℃で再度遠心して沈殿させた。集めた菌体を同じ緩
衝液２１に分散し、０℃で５分間静置した。この分散液
０．２１に（６）項で得られた組み換え体プラスミド溶
液０．１■１を添加混合し、０℃で１５分間静置し、更
に４２℃で２分間保持した後、前の培養で用いたのと同
一組成のＬ−ブロス０．５■１を加えて１時間振盪培養
を行った。この培養液の一部を取り、前述の成分の他に
テトラサイタリン１５μｇ／ｍｌを含むＬ−グロス寒天
平板に広げ、３７°Ｃで約１２時間培養し、テトラサイ
タリン耐性菌を選択してｃＤＮＡライブラリーを作製し
た。 （８）クローニング （７）項で得られたｃ ＤＮＡライブラリーについて、
ヒト癌壊死因子をコードするｃ ＤＮＡを含むプラスミ
ドを持つ形質転換体をスクリーニングするため、（１１
項で得られたウサギ癌壊死因子をフードするＤＮＡの制
限酵素Ａｖａ Ｉで切り出した断片（２Ｈｂｐ）の１２
ｐ標識物をプローブとし、コロニー・ハイフリ。 グイゼーシタノ試験をハナハン（Ｈａｎａｈａｎ）らの
方法［Ｇｅｎｅ、１０．６３（１９８０）コに従って行
った。約２万個のコロニーから、この標識プローブと強
く結合する塩基配列を含む組ろ換え体プラスミドを持つ
形質転換体４３個を選び出した。 ｊ 更に、この４３個のコロニーについて、制限酵素ｌａｅ
ＩＩで切り出したウサギ癌壊死因子コード領域の上流
に相当するＤＮＡ断片（８８ｂｐ）の３２ｐ標…物をプ
ローブとし、二次スクリーニングを行い、とのプローブ
と強くハイブリダイズする６個のコロニーを選び出した
。この２回のスクリーニングにより、ウサギ癌壊死因子
をコードするＤＮＡ塩基配列及びその上流部分と相同性
の高い塩基配列を含むＤＮＡを得た。 （９）形質発現 （８）項で選ばれた６個のクローン（プラスミド番号ｐ
ＨＴＮＦ−１，−４，−５，−１３，−２２，−２６’
）から、それぞれの組み換え体プラスミドを取り出し、
Ｅ、ｃｏｌｔ■旧０１株を宿主として形質転換体を得た
。それぞれの形質転換体について、ナガタ（Ｎａｇａｔ
ａ）らの方法［Ｎａｔｕｒｅ、２８４，３１６（１９８
０）’］に準じて５０１培養を行った。培地にはＬＢプ
ロスを用いた。吸光度（ｅｏｏｎｍ）が約０．８になる
まで培養し、約３〜５×３０１０個の菌体を集めた。０
，１％リゾチームを含む５゜ｍＭＴｒｆｓ−ＨＣＩ＠衡
液（ｐＨ８，０＞と３０ｒｎＭ ＮａＣｌより成る溶液
の１■１に菌体をＭ’ｉ１Ｍさせ、氷水中で３０分間静
置した後、凍結融解を６回繰返して菌体を破壊し、遠心
分離して菌体抽出液を得た。それぞれの形質転換体から
得られた抽出液について、Ｌ〜９２９細胞傷害活性を測
定した結果、プラスミドＰＨＴＮＦ −１３による形質
転換体の抽出液に１８１３．１単位／−１の活性を認め
た。 ｔＩＯ） クローン化ＤＮＡの塩基配列の決定（９）項
で選択された組み換え体プラスミドｐＨＴＮＦ−１３に
よる形質転換体をＬＢブロスで培養して菌体を得た。こ
の菌体をウィルキー（Ｗｉ １ｋｉｅ）らの方法［〜ｕ
ｃｌｅｔｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、、７，８５９（＋９
７９）コに従って処理し、プラスミドＤＮＡを得た。こ
のプラスミドＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩで分解し、分離
精製してクローン化ＤＮＡを得た。このクローン化ＤＮ
Ａ断片を種々の制限酵素で分解し、１６種の制限酵素断
片について、それぞれの塩基配列をマキサム−ギルバー
ト（Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ）法により脱リン酸化
、Ｐによる末端標識、塩基特異的化学分解反応、ゲル電
気泳動及びオートラジオグラフィーを行い決定した。 その塩基配列及びこの塩基配列から翻訳されたアミノ酸
配列は第１表の通りである。 参考例２ （１）ウサギ肺胞マクロファージからのｍＲＮＡ分画の
単離精製 ウサギ（体重的２．５ｈｇ）にプロピオニバクテリウム
アクネス（ＰｒｏｐｔｏｎｉｂａｃｔｅｒＩｕｍ ａ
ｃｎｅｓ）死菌体を１羽当り１００■の投与量で静脈内
に注入し、８日後に屠殺した。直ちに開胸気管切開し、
気管内に挿入したチューブを介してリン酸緩衝化生理食
塩液を用い肺洗浄を繰返し、肺胞マクロファージを採取
した。１２羽のウサギより約３ Ｘ １０９個の肺胞マ
クロファージが得られた。この肺胞マクロファージをｌ
θ％牛脂児血清含有のＲＰ〜ｌｌ−１６４０培地に懸濁
させてベトリゾイノシュ（直径８ ｃ＋＋ ）に１枚当
り２ Ｘ １０７個となるように播き、３７℃で５％炭
酸ガス含有空気中、湿度９０〜１００ ％で前培養した
６ １時間の前培養の後、エンドトキンン（大腸菌由来
のりボボリサッカライド）、 ＴＰＡ（ホルボール−１
２−ミリステート−１３−アセテート）及びシクロヘキ
ンミトをそれぞれ最終濃度が１０μｇ／纏ｌ、 ＩＯｎ
ｇ／■１及びｌμｇ／纏１となるように添加混和し、更
に培養を継続した。４〜４．５時間後（通算５〜５５時
間）に培養液を吸引除去し、ディソンユ上に残ったマク
ロファージを０６％ラウロイルサルコシ／酸ナトリウム
と６ｍＭクエン酸ナトリウムを含イｆする５Ｍグアニジ
ルチオシアネート液で溶解しホモジナイズした。このホ
モジネート！−０，ＩＭＥＤＴＡ含イ１５７含塩１５フ
ウム水溶液上に重層し、超遠心分ｍ機（ＲＰＳ２７−２
ｏ −９−、日立製作所）を用い２１３，５００μ！ｍ
で２０時間遠心し全ＲＮＡ画分をベレットとして得た。 これを０．３５Ｍ ＮａＣ］、 ２０ｍＭＴｒｉｓ及び
２０ｍＭ ＥＤＴＡを含む７Ｍ尿素液の少量に溶解し、
エタノール沈殿として回収した。１２羽のウサギより全
ＲＮＡとして５．２．が得られた。 この全ＲＮＡ画分を１ ｍＭ ＥＤＴＡを含むｌ０ｍＭ
Ｔｒ ｉ ５−ＨＣＩ緩衝液（ｐ）１７．４） （以
下ＴＥ液という）２１に溶解し、６５℃で５分間加熱し
た。これにＮａＣ１溶液を０．５Ｍとなるように加えた
後、あらかじめ０．５ＭＮａＣｌを含むＴＥ液で平衡化
したオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムに付し、吸着した
ｐｏｌｙ（＾）ｍＲＮＡをＴＥ液で溶出することにより
、３１４ｕｇのｐｏｌｙ（Ａ）ｍＲＮＡを得た。ここで
得たｐｏｌｙ（＾）ｍＲＮＡの２００μｇをアガロース
ゲル電気泳動（ゲル濃度１％、６Ｍ尿素存在下。 ｐｌ＋４）に付し、その分子サイズに従って７つの両分
に分け、ゲルを融解（７０℃、１０分間）させた後、水
飽和フェノールによる抽出とクロロホルムによる抽出の
のち、エタノールにより沈殿させて各画分よりｐｏｌｙ
（＾）ｍＲＮＡを回収した。各画分のｐｏｌｙ（Ａ）ｍ
ＲＮＡについてアフリカッメガエルの卵母細胞を用いる
方法でウサギ癌壊死因子ｍＲＮＡ量を測定し、分子サイ
ズとして１．６〜２．７ｋｂに相当する両分にウサギ癌
壊死因子ｍＲＮＡを高濃度に回収した。 この精製ｐｏｌｙ（＾）ｍＲＮＡの比活性は約１，２３
０単位／ｕｇＲＮＡであり、未精製ｐｏｌｙ（＾）ｍＲ
ＮＡ調製品の比活性約３２０単位／μｇＲＮＡに比べて
約４倍に濃縮された。 ここで得られた精製ｐｏｌｙ（＾）ｍＲＮＡを以下の実
験に用いた。 （２）ｃ ＤＮＡの合成 精製ｐｏｌｙ（＾）ｍＲＮＡ ４μｇを用い以下に示す
条件でｃ ＤＮＡを合成した。 反応液量；１００μ！ ５０ｍＭ Ｔｒ ｉ ｓ −ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ８，３
）ｉｌＯｍＭ ＭｇＣ１ｚ；７０ｍＭ ＫＣＩ ； １
ｍＭジチオスレイトール； ０．５ｍＭｄＴＴＰ、ｄ
ＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ（但しｄＣＴＰは１２ ｐ
で標識、比活性４．４Ｘ １０６ｃｐｓ／ ｎｍｏｌｅ
） ：３９ｇオリゴ（ｄＴ）＋２〜＋８． ｇｏ単位ト
リ骨髄性白血病ウィルス由来逆転写酵素。 ４３°Ｃて９０分間反応させた後、ＥＤＴＡ水溶液で反
応を停止させた。フェノール−クロロホルム混液（１：
１）によりｃＤＮＡ−ｍＲＮＡ複合体を抽出し、エタ
ノールにより沈殿させ回収した。更に、アルカリ加温処
理することによりｍＲＮＡを分解除去した後、合成され
た単鎖ｃ ＤＮＡをエタノールにより沈殿させ回収した
。 この単鎖ｃ ＤＮＡの沈殿を下記組成の反応緩衝液４０
μｌに溶解した。 反応緩衝液； ０．５ｍＭ ｄＡＴＰ、 ｄＴＴＰ、 ｄＧＴＰ、 ｄ
ＣＴＰ； ５ ｍＭＭｇＣＩｚ： ７０ｍＭＫＣｌ：
１．５ｍＭβ−メルカプトエタノール；８単位大腸菌Ｄ
Ｎ’ＡポリメラーゼＩ（ラージフラグメント）を含有す
る０、１Ｍヘペス（Ｈｅｐｅｓ）緩衝液（ｐＨ６，９）
。 １５℃で２００時間反応せ二重鎖ｃ ＤＮＡを合成した
。 反応液にドデシル硫酸ナトリウム水溶液を加えて反応を
停止させ、二重鎖ｃ ＤＮＡをフェノール−クロロホル
ム混液で抽出し、エタノールにより沈殿させ回収した。 得られた二重鎖ｃ ＤＮＡの沈殿を、５（１ｍＭ酢酸ナ
トリウム（ｐＨ４，５）、 １ ｍＭ ＺｎＳＯ４，２
００ｍＭ ＮａＣ＋、 ０．５％グリセロール及びＳ１
ヌクレアーゼ０．５単位を含有する水溶液１００μ７１
．：溶解し、３７°Ｃで２０分間反応させてヘアピン構
造を開裂させた。反応はＥＤＴＡ水溶液を添加して停止
させ、フェノール−クロロホルム混液で抽出し、更にエ
ーテルで再抽出した後、エタノールにより沈殿させｃ
ＤＮＡを回収した。 （３）オリゴ（ｄＣ）テール付加ｃＤＮＡの調製上記に
より得られた二重鎖ｃ ＤＮＡに次の組成の反応緩衝液
１００μ！を加え３７℃で２０′分間反応させ、二重鎖
ｃ ＤＮＡにオリゴ（ｄＣ）テールを付加させた。 反応緩衝液： １ ｍＭ ＣＯＣｌ２． Ｏ，１ｍＭジチオスレイトー
ル、０．２μｇポリ（＾）、 Ｏ，ＩｍＭ ’Ｈ−ｄＣ
ＴＰ （比活性５４００ｃｐｗ／ｐｍｏ ｌ ＞及びｌ
Ｏ単位ターミナルデオキシヌクレオチンルトラ／スフェ
ラーゼを含有する１３０ｍＭカフジル酸ナトリウＡ −
３０ｍＭ Ｔｒｊｓ−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ６８ン。 反応はＥＤＴＡ水溶液を添加して停止させ、フェノール
ークロロホルム混液で抽出し、更にエーテルで再抽出し
た後、オリゴ（ｄＣ）テール付加ｃＤＮＡをエタノール
により沈殿させ回収した。これを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
１−ＩＣＩ緩衝液（ｐＨ７，４＞、 １ ｍＭ ＥＤＴ
Ａ及び１００ｍＭ ＮａＣ＋を含む水溶液に１−１当り
０．２μｇのオリゴ（ｄＣ）テール付加ｃＤＮＡを含む
ように溶解した。 （４）オリゴ（ｄａ）テール付加プラスミドＰＢＲ３２
２ＤＮＡの調製 ２０ｍＭ Ｔｒ １ｓ−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ７，４）、
ｌ０ｍＭ Ｍ、ｇＣｌｚ。 ５０ｍＭ （ＮＨ４） ２５０４及び１１１当りＯ，Ｉ
ｇのウシ血清アルブミンを含む水溶液１００μｌにＰＢ
Ｒ３２２を１０μｇ溶解し、制限酵素Ｐｓｔ Ｉ工／ド
ヌクレアーゼ１５単位を加え、３７℃で１時間反応させ
た。反応終了後、反応液をフェノール抽出し、水層から
エタノール沈殿によってＤＮＡを回収した。得られたＤ
ＮＡを前述のオリゴ（ａＣ）テール付加に用いた水溶液
（但し’Ｈ−ｄｃＴＰ）代すｅ’Ｈ−ｄＧＴＰヲ含ム）
２００／ｚ／に：ｊｉｆｆ解し、ターミナルデオキシ
ヌクレオチジルトラ／ス込エラーゼ８０単位を用いて３
７℃で２０分間反応させ、約１０〜１５個のｄＧ残基を
取り込ませた。反応液を水飽和フェノール−クロロホル
ム混液で抽出し、水層からエタノール沈殿によってオリ
ゴ（ｄＣ）テール付加プラスミドｐＨＲ３２２ＤＮＡを
回収した。 これをオリゴ（ｄＣ）テール付加ｃ ＤＮＡの場合と同
様の緩衝液に１■１当り２μｇのオリゴ（ｄＣ）テール
付加プラスミドＩ） Ｂ Ｒ３２２ＤＮＡを含むように
溶解した。 ６）組み換え体プラスミドの作製 オリゴ（ｄｃ）テール付加ｃ ＤＮＡ溶液５０μｌをオ
リゴ（ｄｃ）テール付加ｐＢＲ３２２ＤＮＡ溶液５０μ
！と混合し、６５℃で１０分間、５７℃で１２０分間、
４５℃で６０分間、３５℃で６０分間及び室温で６０分
間インキュベートしてアニーりングを行い、組み換え体
プラスミド溶液を調製した。 （６）形質転換体の選択 上記で得られた組み換え体プラスミド溶液を用い、Ｅ、
ｃｏｌｉχ１７７６株を形質転換させた。即ち、Ｅ、ｃ
ｏｌｉ χ１７７６株を、ジアミノピメリン＠１００μ
ｇ／ｌ及びデミジノ４０μｇ／■１を補ったＬ−ブロス
２０１中、３７°Ｃで吸光度（１３００ｒｖ）が０，５
となるまで培養し、菌体を冷却器付遠心分離機で集め、
５０ｍＭ ＣａＣｌ２含有１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
緩衝液（ｐｌ（７，３）１０ｍ ｌに分散し、０°Ｃで
再度遠心して沈殿させた。集めた菌体を同じ緩衝液２園
１に分散し、０℃で５分間静置した。 この分散液０２−１に上記組み換え体プラスミド溶液０
．ＩＮを添加混合し、０℃で１５分間静置し、更に４２
°Ｃで２分間保持した後、前の培養で用いたのと同一組
成のＬ−ブロス０．５ ｍｌを加えて１時間振盪培養を
行った。この培養液の一部を取り、前述の成分の他にテ
トラサイクリン１５μｇ／■１を含むＬ−プロス寒天平
板に広げ３７℃で約１２時間培養し、テトラサイクリン
耐性菌を選択してｃ ＤＮＡライブラリーを作製した。 （７１ハイプリダイゼーンヨン試験 前記のｃ ＤＮＡライブラリーについて、ウサギ癌壊死
因子をコードするｃ ＤＮＡを含むプラスミドを持つ形
質転換体をスクリーニングするため３２ ｐ標１ｃＤＮ
Ａプローブを用いるコロニー・ハイブリダイゼーシ９）
試験をハナハン（）ｆａｎλｈａｎ）らの方法（Ｇｅｎ
ｅ、１０．６３（１９８０）］に従って行った。３２
ｐ標識ｃ ＤＮＡプローブは、誘導プラス及びマイナス
肺胞マクロファージより上記（１）項の方法で得たｍＲ
ＮＡを鋳型として、し）項の方法で合成した。但し、３
２Ｐ−ｄＣＴＰは高放射能比活性のものを用い、高ａ度
に標識した。この試験により誘導プラスのプローブと強
く結合し、誘導マイナスのプローブとはハイブリダイズ
しない塩基配列を含む組み換え体プラスミドを有する形
質転換体を選別した。約２万個のコロニーから５０個の
コロニーが選び出された。 次いで、これらの選択された菌株についてハイブリダイ
ゼーシヨン・トランスレージタンｉ［を“モレキュラー
クローニング（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、。 ｅｔ ａｌ、、（ｅｄ） ”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ” 、３２９（＋９８０）。 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ）Ｉａｒｂｏｒ Ｌａｂ、）
に記載の方法に従って行った。それぞれの形質転換体
よりプラスミドＤＮＡを抽出し、ニトロセルロースフィ
ルター上に加熱変性させたのち固定し、これに上記（１
）項で得たウサギ癌壊死因子ｍＲＮＡを含むｐｏｌｙ（
＾）ｍＲＮＡ画分を加え、５０°Ｃで１８０分間反応さ
せ、ハイブリダイゼーン、Ｊノを行った。結合したｍＲ
ＮＡを溶出回収した後アフリカッメガエルの卵母細胞に
注入し、回収されたｍＲＮＡかウサギ癌壊死因子ｍＲＮ
Ａであるか否かを検定した。この試験により、上記で選
択された２０個の形質転換体よりウサギ癌壊死因子ｍＲ
ＮＡと強くハイブリダイズするｃＤＮＡを含むプラスミ
ドを持つ菌株３個を見いたした。そのうち最も長いｃＤ
ＮＡ（約７５０ｂｐ）を存するプラスミドより、制限酵
素Ｄｄｅ ＩでＤＮＡ断片を切り出し、二次スクリーニ
ング用のプローブとした。このＤＮＡ断片を３２ ｐで
標識し、上記（６）項で得たｃ ＤＮＡライブラリー
）について再度フａニーφハイプリダイゼーシクン試験
を行い、標識プローブと強く結合するｃ ＤＮＡを含む
プラスミドを持つ形質転換体を選んたａＣＤＮＡライブ
ラリーの約６万個のコロニーのうち９８個が陽性コロニ
ーであった。これらからｃＤＮＡを制限酵素Ｐｓｔ Ｉ
で切り出し、そのサイズをボーノアクリルアミドゲル電
気泳動で調べ、１ｋｂｐ以」二のサイズを有する１７個
のりＶ−ノを選び出した。 これらのうち最も大きなｃ ＤＮＡを含む形質転換体（
菌体番号： ＲＴＮＦ８０２．クローン化ＤＮＡ番号：
ｐＲＴＮＦ８０２）につい“Ｃ、クローン化ＤＮＡを単
離し、後述の方法で塩基配列を決定した。 （８）クローン化ＤＮＡの塩基配列の決定ｑ）項で選択
された菌株（ＲＴＮＦ８０２）をジアミノピメリン酸及
びチミジンを添加したし一プロスで培養して菌体を得た
。この菌体をウィルキー（−Ｗｉｌｋｉｅ）らの方法［
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、、７，８５９（
１９７９）］に従って処理し、プラスミドＤＮＡを得た
。 このプラスミドＤＮＡを制限酵素Ｐｓｔ Ｉで分解し、
精製分離してクローン化ＤＮＡを得た。このクローン化
ＤＮＡ断片を種々の制限酵素で分解し、適当な制限酵素
断片についてそれぞれの塩基配列をマキサム−ギルバー
） （Ｍａｘａｍ−Ｇ＋１ｂｅｒｔ）法により脱リン
酸化、３７Ｐによる末端Ｗ識、塩基特異的イヒ学分解反
応、ゲル電気泳動及びオートラジオグラフィーから決定
した。 その塩基配列は第２表の通りである。 （以下余白） 参考例３ ウサギ癌壊死因子の単離精製 ウサギ（体重２．５〜３．０＋ｔｇ）にプロピオニバク
テリウム アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ａｃｎｅｓ）死菌体５０＠を耳静脈より注射した
。８日後に工／トドキシン（大腸菌由来のりポボリサブ
カライド）１００μｇを耳静脈より注射し、２時間後に
心臓より全採血した。採取した血液に１００１当り１０
０単位のヘパリンナトリウムを加えた後、５，０００ｒ
ｐ園で３０分間冷却遠心操作を行い、血球及び不溶固形
物を除去した。 ４００羽のウサギより３，０００単位
１１の力価を存する血漿２４１が得られた。 と１７１ 血’１１２４１ ニＥＤＴＡ２４ｇ 及ヒセ
５４ ） ２４０ｇ ヲ加え１時間撹拌した後、孔径３
μ、１μ及び０．２μのフィルターで順次濾過した。 濾液２４１に０．０４Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液（Ｐ
Ｈ１，８）１’２Ａ’を加えた後、０．１Ｍ ＮａＣｌ
を含む０．０４Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ７，
８）で十分に平衡化したＤＥＡＥ−セファ０−スＣＬ−
６Ｂ（ファルマシア社）のカラム（２７Ｘ４５ｃｍ）に
徐々に付した。次いでカラム−平衡化緩衝液１５１及び
０．１５Ｍ ＮａＣ１を含む０．０４Ｍ Ｔｒ ＋ ｓ
−ＨＣ１緩衝液（ｐＨ７，８）５０ Ｉｔで順次洗浄
後、０．１８Ｍ ＮａＣ１を含む０．０４Ｍ Ｔ ｒ
ｉ ｓ −ＨＣＩ緩衝液（ｐ４１７．２＞を用いて溶出
した。溶出液は８１ずつ分画して活性画分を集めた。こ
の活性画分に同容量の０．０４Ｍ Ｔｒ ｉ ｓ −Ｈ
Ｃ１緩衝液（ｐＨ７，８＞を加えて希釈した後、ＤＥＡ
Ｅ−セファ０−スＣＬ−６Ｂのカラム（１０ｘ １３ｃ
ｍ ）に付した。次いでＯ，ＩＭ ＮａＣＩを含む０．
０４Ｍ Ｔ ｒ ｉ ｓ −ＭＣＩ緩衝液（ｐＨ７，８
Ｈｌを用いて洗浄した後、０．１８Ｍ ＮａＣＩを含む
０．０４Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩｌｉ！衡液（ｐＨ７，２
）５ｊ！を用いて溶出した。溶出液は２５０１ずつ分画
して活性画分を集めた。 次にこの溶出液を容器に移し７０℃の湯浴中に浸し、撹
拌しながら溶出液の温度が６０℃になるまで加熱した。 その後６０℃の別の湯浴に移し、３０分間加熱処理した
後、速やかに４°Ｃに冷却した。加熱処理した溶液は、
限外自適により濃縮した。 ０、ＩＭ ＮａＣＩを含む０．００５Ｍリン酸緩衝液（
Ｐ１１７．４）で十分に平衡化したセファクリルＳ−２
００（ファルマシア社）のカラム（５Ｘ ８０ｃｍ ）
に上記濃縮液を付し、同緩衝液で溶出した。４０１ずつ
分画して活性画分を採取し、限外濾過により濃縮した。 ゲル濾過によって得られた活性画分の濃縮液をｚｎ２十
キレートセファ０−スカラムに付した。ポラス（Ｐｏｒ
ａｔｈ）らの方法（Ｎａｔｕｒｅ、２５８，５９８（＋
９７５））で得られたキレートセファ０−ス（イミノジ
酢酸固定化樹Ｍｒ１）を充填したカラム（１，６Ｘ ２
０ｃ１１ ＞に、１■／−１の塩化亜鉛水溶液１２０１
を流した。次いで０．１Ｍ ＮａＣＩを含む０．０５Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７，４＞で十分に平衡化した後、前
工程で得られたＩＯ縮液を付し、同緩衝液で溶出した非
吸着画分を採取した。活性はこの画分にほとんどが回収
された。 前精製工程で得られた活性画分を濃縮し、０．＋５ＭＮ
ａＣｌを含む０．００５ Ｍリン酸緩衝液（ｐｌ＋７．
４＞で十分に平衡化したトヨパールＨＷ−５５（東洋ソ
ーダ株式会社）のカラム（１，５Ｘ ９０ｃｍ ）に付
した。同緩衝液で溶出し活性画分を採取した。全精製工
程を通しての活性の回収率は６０％、精製度は７．５Ｘ
１０’倍であった。このようにして得られた精製ウサ
ギ癌壊死因子の比活性はｅ、ｏｘ ｔｏ’単位／ｗｇ蛋
白質であった（活性単位の定義は特開昭５８−１７４３
３０号のそれと同じである）。また、マウスに移植した
Ｍｅｔｈ Ａ肉腫を用いる生物評価において、１匹当り
３ 、０００〜５ 、０００単位を静脈内に投与した場
合の活性は（＋）以上であった。 参考例４ 抗つサギ癌壊死因子抗体の作製 参考例３で得られた精製ウサギ壊死死因子１．９×１０
５単位を含む溶液を等量の７０イ／ドの完全アジュバン
トで乳濁化し、それをモルモットの背部皮下数カ所に注
射した。その後、１．３及び６週後に同様の方法で免疫
した。更に８週後に、同量の精製ウサギ癌壊死因子を水
酸化アルミニウムゲルとともに腹腔内に注射した。最初
の免疫から９週後に心臓より全採血し、遠心分離により
血清を分離することによって抗つサギ癌壊死因子抗体を
含む抗血清を得た。 この抗血清を、正常ウサギ血清成分を吸着させたセフ１
ｏ−ス４Ｂ（ファルマシア社）カラムに３回繰返して通
過させることにより非特異的な抗体を除去し、ウサギ癌
壊死因子に対する特異抗体のみを含む精製抗血清を得た
。この抗血清は、免疫電気泳動法及びゲル内二重拡散法
により精製ウサギ癌壊死因子との間にのみ単一の沈降線
を形成した。」 以上 別紙 「特許請求の範囲 （区）ヒト癌壊死因子のアミノ酸配列もしくはその活性
中心部分を含むポリペプチド又はそれらと同様の生物活
性を有し、かつ免疫学的に交差するポリペプチド。 （２）ヒト癌壊死因子のアミノ酸配列がＳｅｒ Ｓｅｒ
Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｓｐ
Ｌｙｓ Ｐｒ。 Ｖａｌ Ａｌａ １ｌｉｓ Ｖａｌ Ｖａｌ ＡｆＥＬ
Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｇｌｎ ＡｌａＧｌｕ Ｇｌｙ Ｇｉ
ｎ Ｌｅｕ Ｇｌｎ ＴｒＰ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｒｇ
ＡｒｇＡｌａ Ａｓｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｌ
ａ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ ＧｌｕＬｅｕＡｒｇＡｓ
ｐＡｓｎＧｌｎＬｅｕＶａｔＶａｌＰｒｏＳｅｒＧｌｕ
Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｌｅｕ ｌｌｅ Ｔｙｒ
Ｓｅｒ Ｇｌｎ ＶａｔＬｅｕ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｇｌ
ｙ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｓｅｒ、Ｔｈｒ
Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｌｃｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｔ
ｈｒ ｌｉｅ Ｓｅｒ Ａｒｇｌｌｅ Ａｌａ Ｖａｌ
Ｓｅｒ 丁ｙｒ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ
ＡｓｎＬｅｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｙ
ｓ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｃｙｓ ＧｉｎＡｒｇ Ｇｌｕ
Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａ
ｌａ ＬｙｓＰｒｏ ＴｒＰ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ
Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｇｌｙ ＧｌｙＶａｌ Ｐ
ｈｅ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｓ
Ｐ Ａｒｇ ＬｅｕＳｅｒ Ａｌａ Ｇ、Ｉｕ ｌｉｅ
Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ ＬｅｕＡ
ｓｐ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌ
ｎ Ｖａｔ Ｔｙｒ ＰｈｅＧＩＳＴ ｌｌｅ ｌｌｅ
Ａｌａ Ｌｅｕである特許請求の範囲第１項記載のポ
リペプチド。 （３）特許請求の範囲第２項記載のポリペプチドのＮ末
端に他のポリペプチドが結合している特許請求の範囲第
１項記載のポリペプチド。 （４）特許請求の範囲第２項記載のポリペプチドのＮ末
端にＮｅｔが結合している特許請求の範囲第１項記載の
ポリペプチド。 （５）次のアミノ酸配列 Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｉ
ｒｅ Ａｒｇ Ａ４ｐ ＶａｔＧｌｕ Ｌｅｕ Ａｌａ
Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ
ＬｙｓＴｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇｌ
ｙ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ａｒｇ ＣｙｓＬｅｕ Ｐｈｅ
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｌ
ｅｕ ｌ１ｅＶａｔ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｔｈｒ
” Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｃｙｓ ＬｅｕＬｅｕ
Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｖａｔ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｐ
ｒｏ Ｇｌｎ ＡｒｇＧｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｐｒｏ
Ａｒｇ ＡｓＰ Ｌｅａ Ｓｅｒ Ｌｅｕ ＩＩｅＳ
ｅｒ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｖａ
ｔ ＾ＦＩＺ Ｓｅｒ ５ｅｒＳｅｒ Ａｒｇ Ｔｈｒ
Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｓ１）Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｖａｔ
ＡｌａＨｉｓ Ｖａｔ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｓｎ Ｐｒ
ｏ Ｇｉｎ Ａｌａ Ｇｌｕ ＧｌｙＧｌｎ Ｌｅｕ
Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａ
ｌａ ＡｓｎＡｌａ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｓｎ
Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｌｅｕ ＡｒｇＡｓｐ Ａ
ｓｎ Ｇｉｎ Ｌｅｕ Ｖ、ａｌ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓ
ｅｒ Ｇｌｕ ＧｌｙＬｅｕ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｉｌｅ
丁ｙｒ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｌｅｕ ＰｈｅＬ
ｙＩＩ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｃｙａ Ｐｒｏ Ｓ
ｅｒ Ｔｈｒ Ｈｉｓ ＶａｌＬｅｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ
Ｈｉｓ、Ｔｈｒ ｌｉｅ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｉｌｅ
ＡｌａＶａｌ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｉｎ Ｔｈｒ Ｌｙ
ｓ Ｖａｌ Ａｇｎ Ｌｅｕ ＬｅｕＳｅｒ Ａｌａ
Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｓｅｔ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ａ
ｒｇ ＧｌｕＴｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｌａ
Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｐｒｏ ＴｒｐＴｙｒ Ｇ
ｌｕ Ｐｒｏ ｌｌｅ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌ
ｙ Ｖｉｌ ＰｈｅＧｉｎ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｙｓ
Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｓｅｒ ＡｌａＧｌ
ｕ ＩＩＣＡｓｎ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ
Ｌｅｕ ＡｓＰ、ＰｈｅＡｌａ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌ
ｙ Ｇｌｎ Ｖａｔ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｇｌｙ １ｉｅ
ｌｉｅ Ａｌａ Ｌｅｕ を有する特許請求の範囲第１項又は第３項記載のポリペ
プチド。 （６）微生物又は培養細胞により産生される特許請求の
範囲第１項〜第５項のいずれかに記載あポリペプチド。 ■ ヒト癌壊死因子のアミノ酸配列もしくはその活性中
心部分を含むポリペプチドをコードする塩基配列を有す
るＤＮＡ又は対立遺伝子変異、ａ伝子コードの縮重もし
くは一部の修飾を含む該ＤＮＡの変異体。 Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａ
ｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ ＬｙｓＰｒｏ Ｔｒｐ Ｔｙｒ
Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｇｌｙ
ＧｌｙＡｓｌ）’Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｖ
ａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｇｌｕ ＧｌｙＬｅｕＴｙｒＬ
ｅｕＩｌｅＴｙｒＳｅｒＧｌｎＶａｌＬｅｕＰｈｅ＋ｌ
ｅ Ａｌａ Ｌｅｕ （ＩＩ ヒト癌壊死因子のアミノ酸配列をコードする塩
基配列が （５′）−ＴＣＡ ＴＣＴ ＴＣＴ ＣＧＡ ＡＣＣＣ
ＣＧ ＡＧＴ ＧＡＣＡＡＧＣＣＴ ＧＴＡ ＧＣＣＣ
ＡＴ ＧＴＴ ＧＴＡ ＧＣＡ ＡＡＣＣＣＴ ＣＡＡ
ＧＣＴ ＧＡＧ ＧＧＧ 、ＣＡＧ ＣＴＣＣＡＧ Ｔ
ＧＧ ＣＴＧ ＡＡＣＣＧＣＣＧＧ ＧＣＣＡＡＴ Ｇ
ＣＣＣＴＣＣＴＧ ＧＣＣＡＡＴ ＧＧＣＧＴＧＧＡＧ
ＣＴＧ ＡＧＡ ＧＡＴ ＡＡＣＣＡＧ ＣＴＧ Ｇ
ＴＧ ＧＴＧ ＣＣＡＴＣＡ ＧＡＧ ＧＧＣＣＴＧ
ＴＡＣＣＴＣＡＴＣＴＡＣＴＣＣＣＡＧＧＴＣＣＴＣＴ
ＴＣＡＡＧ ＧＧＣＣＡＡ ＧＧＣＴＧＣＣＣＣＴＣＣ
ＡＣＣＣＡＴ ＧＴＧ ＣＴＣＣＴＣＡＣＣＣＡＣＡＣ
ＣＡＴＣＡＧＣＣＧＣＡＴＣＧＣＣＧＴＣＴＣＣＴＡＣ
ＣＡＧ ＡＣＣＡＡＧ ＧＴＣＡＡＣＣＴＣＣＴＣＴＣ
Ｔ ＧＣＣＡＴＣＡＡＧ ＡＧＣＣＣＣＴＧＣＣＡＧ
ＡＧＧ ＧＡＧ ＡＣＣＣＣＡ ＧＡＧ ＧＧＧ ＧＣ
Ｔ ＧＡＧ ＧＣＣＡＡＧ ＣＣＣＴＧＧ ＴＡＴ Ｇ
ＡＧ ＣＣＣＡＴＣＴＡＴ ＣＴＧ ＧＧＡＧＧＧ Ｇ
ＴＣＴＴＣＣＡＧ ＣＴＧ ＧＡＧ ＡＡＧ ＧＧＴ
ＧＡＣＣＧＡＣＴＣＡＧＣＧＣＴ ＧＡＧ ＡＴＣＡＡ
Ｔ ＣＧＧ ＣＣＣＧＡＣＴＡ丁ＣＴＣＧＡＣＴＴＴ
ＧＣＣＧＡＧ ＴＣＴ ＧＧＧ ＣＡＧ ＧＴＣＴＡＣ
ＴＴＴ ＧＧＧ ＡＴＣＡＴＴ ＧＣＣＣＴＧ−（３′
）である特許請求の範囲第７項又は第８項記載のＤＮＡ
。 の５′末端に開始コドンＡＴＧを存する特許請求の範囲
第７項記載のＤＮＡ ０ ａ２１次の塩基配列 （ｓ′＋−ＡＴｃ ＡＧＣＡＣＴ ＧＡＡ ＡＧＣＡＴ
Ｇ ＡＴＣｃａＧ′ＧＡＣＧＴＧ ＧＡＧ ＣＴＧ Ｇ
ＣＣＧＡＧ ＧＡＧ ＧＣＧ ＣＴＣＣＣＣＡＡＧＡＡ
Ｇ ＡＣＡ ＧＧＧ ＧＧＧ ＣＣＣＣＡＧ ＧＧＣＴ
ＣＣＡＧＧ ＣＧＧＴＧＣＴＴＧ ＴＴＣＣＴＣＡＧＣ
ＣＴＣＴＴＣＴＣＣＴＴＣＣＴＧＡＴＣＧＴＧ ＧＣＡ
ＧＧＣＧＣＣＡＣＣＡＣＧ ＣＴＣＴＴＣＴＧＣＣＴ
Ｇ ＣＴＧ ＣＡＣＴＴＴ ＧＧＡ ＧＴＧ ＡＴＣＧ
ＧＣＣＣＣＣＡＧＡＧＧ ＧＡＡ ＧＡＧ ＴＴＣＣＣ
Ｃ’ＡＧＧ ＧＡＣＣＴＣＴＣＴ ＣＴＡＡＴＣＡＧＣ
ＣＣＴ ＣＴＧ ＧＣＣＣＡＧ ＧＣＡ ＧＴＣＡＧＡ
ＴＣＡＴＣＴ ＴＣＴ ＣＧＡ ＡＣＣＣＣＧ ＡＧ
Ｔ ＧＡＣＡＡＧ ＣＣＴ ＧＴＡＧＣＣＣＡＴ ＧＴ
Ｔ ＧＴＡ ＧＣＡ ＡＡＣＣＣＴ ＣＡＡ ＧＣＴ
ＧＡＧＧＧＧ ＣＡＧ ＣＴＣＣＡＧ ＴＧＧ ＣＴＧ
ＡＡＣＣＧＣＣＧＧ ＧＣＣＡＡＴ ＧＣＣＣＴＣＣ
ＴＧ ＧＣＣＡＡＴ ＧＧＣＧＴＧ ＧＡＧ ＣＴＧＡ
ＧＡ ＧＡＴ ＡＡＣＣＡＧ ＣＴＧ ＧＴＧ ＧＴＧ
ＣＣＡ ＴＣＡ ＧＡＧＧＧＣＣＴＧ ＴＡＣＣＴＣ
ＡＴＣＴＡＣＴＣＣＣＡＧ ＧＴＣＣＴＣＴＴＣＡＡＧ
ＧＧＣＣＡＡ ＧＧＣＴＧＣＣＣＣＴＣＣＡＣＣＣＡ
ＴＧＴＧ ＣＴＣＣＴＣＡＣＣＣＡＣＡＣＣＡＴＣＡＧ
ＣＣＧＣＡＴＣＧＣＣＧＴＣＴＣＣＴＡＣＣＡＧ ＡＣ
ＣＡＡＧ ＣＴＣＡＡＣＣＴＣＣＴＣＴＣＴ ＧＣＣＡ
ＴＣＡＡＧ ＡＧＣＣＣＣＴＧＣＣＡＧ ＡＧＧＧＡＧ
ＡＣＣＣＣＡ ＧＡＧ ＧＧＧ ＧＣＴ ＧＡＧ Ｇ
ＣＣＡＡＧ ＣＣＣＴＧＧ ＴＡＴ ＧＡＧ ＣＣＣＡ
ＴＣＴＡＴ ＣＴＧ ＧＧＡ ＧＧＧ ＧＴＣＴＴＣＣ
ＡＧ ＣＴＧ ＧＡＧ ＡＡＧ ＧＧＴ ＧＡＣＣＧＡ
ＣＴＣＡＧＣＧＣＴ ＧＡＧ ＡＴＣＡＡＴ ＣＧＧ
ＣＣＣＧＡＣＴＡＴ ＣＴＣＧＡＣＴＴＴ ＧＣＣＧ
ＡＧ ＴＣＴ ＧＧＧ ＣＡＧ ＧＴＣＴＡＣＴＴＴ
ＧＧＧＡＴＣＡＴＴ ＧＣＣＣＴＧ−（３′）ををする
特許請求の範囲第７項又は第９項記載のＤＮＡ 。 ａ３特許請求の範囲第７項〜第１２項のいずれかに記載
のＤＮＡを組込んたベクター。 Ｇ＠ベクターが形質発現ベクターである特許請求の範囲
第１３項記載のベクター。 ０９ 特許請求の範囲第１３項又は第１４項記載のベク
ターで形質転換された宿主。 ＣＯ形質転換された宿主が微生物又は培養細胞である特
許請求の範囲第１５項記載の宿主。 以上
プラスミドｆ）ＨＴＴ２６の構築工程を示し、第２図は
、実施例１のｔａｃプロモーター・アダプター断片の構
築工程を示し、第３図は、実施例２の）ＩＴＮＦ−アダ
プター断片の構築工程を示し、第４図は、実施例２のｔ
ｒｐプロモーター付き形質発現プラスミＦ ｐＨＴＲ９
１の構築工程を示し、第５図は、実施例３のＨＴＮＦ−
Ｔｅ ｔｒ−ＢａｍＨＩ断片の構築工程を示し、第６図
は、実施例３のｐｈｏＳプロモーター付き形質発現プラ
スミドｐＨＴＳ １１５の構築工程を示し、第７図は実
施例４のｐｈｏＳプロモーター付き形質発現プラスミド
ｐＨＴＳ３７の構築工程を示す。 第１図 第２図 ｔａｃ７’ｏぞ−たアダシン−閉テ片 第３図 ＨＴＮＦ−アクη−α斤１ト 第４図 第５図 ＨＴＮＦ−Ｔｅｔｒ−ｓａｍ＋ｎ１ｆ７第６図 第７図 手続補正書印発） 昭和６０年６月６日 １、事件の表示 昭和５９年特許願第８２６５３号 ２発明の名称 ヒト癌壊死因子ポリペプチドの製造法 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所大阪市東区道修町３丁目２５番地 名称２９１ 大日本製薬株式会社 代表取締役 藤 原 冨 男 ４、代理人 〒５６４ 住所大阪府吹田市江の本町３３番９４号大日本製薬株式
会社 総合研究所内 ＆補正により増加する発明の数 ３ α補正の対象 明細書の「特許請求の範囲」、「発明の詳細な説明」の
欄及び図面 ７、補正の内容 （１） 図面第７図を別紙第７図の通り訂正する。 （２） 明細書の「特許請求の範囲」の欄を別紙の通り
訂正する。 （３） 明細書の第２頁第１２〜１３行において、「本
発明は・・・・ポリペプチドの製造法に関する。」との
記載をｒ本発明はヒト癌壊死因子ポリペプチド及び遺伝
子組み換え技術を応用した該ポリペプチドの製造法に関
する。」と訂正する。 （４） 明細書の第７頁第８〜９行において、「・・・
・ポリペプチドの製造法を提供するものである。」との
記載を「・・・・ポリペプチドの製造法並びに該ポリペ
プチドを提供するものである。」と訂正する。 ６） 明細書の第８頁第８行において、「ということも
ある］の製造法を提供する・・・・」との記載を「とい
うこともある］及びその製造法を提供する・・・・Ｊと
訂正する。 （６） 明細書の第９頁第１３行において、「・・・・
に開示されている方法に従って・・・・」との記載を「
・・・・に開示されている方法（例えば参考例１の方法
）に従って・・・・」と訂正する。 （７） 明細書の第２４頁第３行において、［・・・・
に開示された方法に・・・司との記載を「・・・・に開
示された方法（参考例１の方法）に・・・・」と訂正す
る。 （８） 明細書の第２９頁第１３行において、「に開示
された方法で調製した・・・・」との記載を１に開示さ
れた方法（参考例３の方法）で調製した・・・・ｊと訂
正する。 （９） 明細書の第４２頁第６行と第７行の間、即ち図
面の簡単な説明の欄の前に次の「参考例１．参考例２．
第２表、参考例３及び参考例４Ｊを挿入する。 「参考例１ 特願昭５８−２２８７９０号に開示されている方法（参
考例２の方法）に従って、第２表に示すウサギ癌壊死因
子をコードするクローン化ＤＮＡを得た。このＤＮＡを
制限酵素Ｈａｅ Ｕ及びＡｖａ Ｉを用いて切り出し、
それぞれ第３３〜１２０番の８８ ｂｐから成るＤＮＡ
断片と第２８５〜５８３番の２９９ ｂｐから成るＤＮ
Ａ断片を得た。 制限酵素＾ｖａＩで切り出した２９９ ｂｐのＤＮＡ断
片はウサギ癌壊死因子をコードする領域であり、Ｈａｅ
Ｉｌで切り出した８８ ｂｐのＤＮＡ断片はウサギ壊死
死囚子前駆体をコードする領域に相当する部分である。 この２種のＤＮＡ断片を３２ｐで標識して、ヒト癌壊死
因子ｃ ＤＮＡのクローニングのためのプローブとし、
（８）項で使用した。 Ｃ）ヒト肺胞マクロファージからのｍＲＮＡ画分の単離 ヒト肺からリン酸緩衝化生理食塩液を用いて肺胞マクロ
ファージを１３．３Ｘ １０７個採取した。この肺胞マ
クロファージを１０％牛脂児血清含有のＰＰＭＩ−１６
４０培地に懸濁させてベトリディッシュ（直径８ｃ、）
に１枚当たり９ Ｘ １０’個となるように播き、３７
℃で５％炭酸ガス含有空気中、湿度８０〜１００％で前
培養した。１時間の前培養の後、−工／ドトキンン（大
腸菌由来のりボボリサツカライド）。 ＴＰＡ（ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセ
テート）及びンクロヘキシミドをそれぞれ最終濃度が１
０ｐｇ／ｍ＋、 ＩＯｎｇ／−ｌ及び１ ｐｇ／＊Ｉと
なるように添加混和し、更に培養を継続した。４〜４．
５時間後（通算５〜５５時間）に培養液を吸引除去し、
ディツシュ上に残ったマクロファージを０．６％ラウロ
イル号ルコ７ノ酸ナトリウムと６ｍＭクエノ酸ナトリウ
ムを含む５Ｍグアニジルチオンアネート液で溶解し、；
１モジナイズした。このホモジネートを０．１Ｍ ＥＤ
ＴＡ含Ｃｒ５．７Ｍ塩化セシウム水溶液上に重層し、超
遠心分離機（ＲＰＳ２７−２０一ター１日立製作所）を
用い２［ｉ、５００ ｒｐｍで２０時間遠心し、全ＲＮ
Ａ画分をペレットとして得た。これを０．３５Ｍ Ｎａ
ＣＩ。 ２０ｍＭＴｒｉｓ及び２０ｍＭ ＥＤＴＡを含む７Ｍ尿
素液の少量に溶解し、エタノール沈殿として回収した。 全ＲＮＡとして１５９μｇが得られた。 この全ＲＮＡ画分を１ ｍＭ ＥＤＴＡを含むｌＯｍＭ
Ｔｒｊｓ−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ７，４）（以下ＴＥ液と
いう）１１に溶解し、６５℃で５分間加熱した。これに
ＮａＣＨ＆液を０．５Ｍとなるように加えた後、あらか
じめ０５ＭＮａＣｌを含むＴＥ液で平衡化したオリゴ（
ｄＴ）セルロースカラムに付し、吸着したｐｏｌｙ（＾
）ｍＲＮＡ ヲＴＥ液で溶出することにより、ａ ｕｇ
のｐｏｌｙ（＾）ｍＲＮＡを得た。 とのｐｏｌｙ（Ａ
＞ｍＲＮＡを１．９ ｎｇ／ｎｌの濃度て蒸留水に溶解
し、これをアフリカッメガエルの卵母細胞１個当たり５
０ｎ１ずつ注入し、前述の方法に従って、卵母細胞中で
翻訳された蛋白質のＬ−９２９細胞傷害活性を測定した
。その結果、１０個の卵母細胞のホモジネート０，１１
中に６．６単位／１の活性を認め、とのｐｏｌｙ（＾）
ｍＲＮＡ調製品中にヒト癌壊死因子のｍＲＮＡが含まれ
ていることを確認した。 （３１ｃＤＮＡの合成。 （２）項で得られたｐｏｌｙ（Ａ＞ｍＲＮＡを鋳型とし
てグブラー（Ｇｕｂｌｅｒ）らの方法［Ｇｅｎｅ、２５
，２６３（＋９８３＞］に従ってｃ ＤＮＡを合成した
。 反応液量；４０μ！ ５０ｍＭ Ｔｒｊｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８，３） ；
１０ｍＭ ＭｇＣｌ２；１０ｍＭジチオスレイ゛トー
ル； ４ ｍＭピロホスフェート す ト リ ウ ム
； １．２５ｍＭ ｄＧＴＰ、 ｄＡＴＰ、 ｄＴＴ
Ｐ；０．５ｍＭ ｄｃＴＰ：Ｏ，１Ｂ７μＭ ａ−”Ｐ
−ｄＣＴＰ（比活性３０００Ｃｉ／ｓｍｏｔｅ）； ４
８ｇ オ リ ゴ（ｄ’Ｔ）＋２−１８ ： ６ ８
ｇ ｐｏｌｙ（八）ｍＲＮＡ ； １２０単位トリ骨髄
性白血病ウィルス由来逆転写酵素。 ４３°Ｃで３０分間反応させた後、ＥＤＴＡを加えて反
応を停止させ、フェノール−クロロホルム混液（１：
１）で抽出し、その水層に酢酸アンモニウムを最終濃度
２．５Ｍになるように加え、エタノールにより反応生成
物（単鎖ｃＤＮＡ −ＲＮＡ 複合体）を沈殿させた。 この単鎖ｃＤＮＡ−ＲＮＡ複合体を下記組成の反応緩衝
液１００μ！に溶解した。 反応緩衝液組成： ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−）ＩＣ＋緩衝液（ｐＨ７，５）
； ５ ｍＭ ＭｇＣ＋２；１０ｍＭ （Ｎ＋−１４）
２ＳＯ４； ｌ００ｍＭ ＫＣｌ ； ０．１５ｍＭ
β−ニコチンアミド アデニン ジヌクレオチド；５０
μｇ１１ウシ血清アルブミン：４０μＭ ｄＧＴＰ、
ｄＡＴＰ、 ｄＴＴＰ。 ｄＣＴＰ； ０．９単位大腸菌リボヌクレアーゼＨ；２
３単位大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■。 １２℃で６０分間、続いて２２℃で６０分間反応させた
後、 ＥＤＴＡを加えて反応を停止させ、上記と同様に
フェノール−クロロホルム混液て抽出し、エタノールに
より沈殿させて二重鎖ｃ ＤＮＡを得た。 （４）オリゴ（ｄｃ）テール付加ｃ ＤＮＡの調製（３
）項で得られた二重鎖ｃ ＤＮＡに次の組成の反応緩衝
液１００μｌを加え、３７°Ｃで３０分間反応させ、二
重鎖ｃＤＮＡにオリゴ（ｄＣ）テールを（（加させた。 反応緩衝液； ２ ｍＭ ＣＯＣｌ２．０．２ｍＭジチオスレイトール
、０．１ｍＭ ａ−”Ｐ−ｄＣＴＰ（比活性３ Ｃｉ／
ｍ＋＋ｏｌｅ）及び１０単位ターミナルデオキシヌクレ
オチジルトラ７スフェラーゼを含有する＋００ｍＭカコ
ジル酸ナトリウム（ｐＨ７，２）。 反応はＥＤＴＡ水溶液を添加して停止させ、フェノール
−クロロホルム混液で抽出し、オリゴ（ｄＣ）テール付
加ｃ ＤＮＡをエタノールにより沈殿させ回収した。こ
れをｌ０ｍＭ Ｔｒ ＋ ５−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７，
４）’。 １ ｍＭ ＥＤＴＡ及びｌ００ｍＭ ＮａＣ１を含む水
溶液に１１当たり２μｇのオリゴ（ｄＣ）テール付加ｃ
ＤＮＡを含むように溶解した。 Ｉ５１オリゴ（ｄｃ）テール付加プラスミドＰＢＲ３２
２ＤＮＡの調製 ２０ｍＭ Ｔｒ ｉ ｓ −ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７，４
）、ｌ０ｍＭ ＭｇＣ１２゜５０ｍＭ （ＮＨ４） ２
Ｓ０４及び１１当たり０．１．のラン血清アルブミ／を
含む水溶液１００μｐにｐＢＲ３２２を１０８ｇ溶解し
、制限酵素リツ□■エンドヌクレアーゼ１５単位を加え
、３７℃て１時間反応させた。反応終了後、反応液を７
．／−ルークロロオルム混液で抽出し、水層からエタノ
ール沈殿によってＤＮＡを回収した。得られたＤＮＡを
前述のオリゴ（ｄＣ）テール付加に用いた水溶液（但し
”Ｐ−ｄＣＴＰの代わりに’ｌ−１−ｄ Ｇ Ｔ ｌ）
を含む）２００μｌに溶解し、ターミナルデオキ７ヌク
レオチジルトランスフェラーゼ８０単位を用いて３７℃
で２０分間反応させ、約１０〜１５個のｄＧ残基を取り
込ませた。反応液をフェノール−クロロホルム混液で抽
出し、水層からエタノール沈殿によってオリゴ（ｄＣ）
テール付加プラスミドｐ１３Ｒ３２２ＤＮＡを回収した
。これをオリゴ（ｄＣ）テール付加ｃ ＤＮＡの場合と
同様の緩衝液に１１当たり２０μｇのオリゴ（ｄＧ）テ
ール付加プラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡを含むように溶
解した。 （６）組み換え体プラスミドの作製 （４）項で得られたオリゴ（ｄＣ）テール付加ｃＤＮＡ
ｊｅ液１２０μｌを、Ｃ５）項で得られたオリゴ（ｄＣ
）テール付加ｆ）ＢＲ３２２ＤＮＡ溶液１２０ｔｔｌト
ＫＡ合し、６５℃で５分間、５７℃で１２０分間インキ
ュベートしてアニーリングを行い、組み換え体プラスミ
ド溶液を調製した。 −１ （７）形質転換体の選択 （６）項で得られたｌ１ＩＩ口換え体プラスミド溶液を
用い、Ｅ、ｃｏ’ｌｉχＩ；１００株を形質転換させた
。即ち、Ｅ’、ｃｏｌｉχ１７７６株を、ジアミノピメ
リン酸１００μｇ／ｍｌ及びデミシフ ４０８ｇ７＊Ｉ
を補ったＬ−プ’Ｘ２０ｗ＋ｌ中、３７°Ｃで吸光度（
６００ｎ譜）が０．５となるまで培養し、菌体を４℃で
遠心して集め、５０ｍＭ ＣａＣＩｚ含有１０ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ７，３） １０ｍ１に分散し
、４℃で再度遠心して沈殿させた。集めた菌体を同じ緩
衝液２１に分散し、０℃で５分間静置した。この分散液
０．２１に（６）項で得られた組み換え体プラスミド溶
液０．１■１を添加混合し、０℃で１５分間静置し、更
に４２℃で２分間保持した後、前の培養で用いたのと同
一組成のＬ−ブロス０．５■１を加えて１時間振盪培養
を行った。この培養液の一部を取り、前述の成分の他に
テトラサイタリン１５μｇ／ｍｌを含むＬ−グロス寒天
平板に広げ、３７°Ｃで約１２時間培養し、テトラサイ
タリン耐性菌を選択してｃＤＮＡライブラリーを作製し
た。 （８）クローニング （７）項で得られたｃ ＤＮＡライブラリーについて、
ヒト癌壊死因子をコードするｃ ＤＮＡを含むプラスミ
ドを持つ形質転換体をスクリーニングするため、（１１
項で得られたウサギ癌壊死因子をフードするＤＮＡの制
限酵素Ａｖａ Ｉで切り出した断片（２Ｈｂｐ）の１２
ｐ標識物をプローブとし、コロニー・ハイフリ。 グイゼーシタノ試験をハナハン（Ｈａｎａｈａｎ）らの
方法［Ｇｅｎｅ、１０．６３（１９８０）コに従って行
った。約２万個のコロニーから、この標識プローブと強
く結合する塩基配列を含む組ろ換え体プラスミドを持つ
形質転換体４３個を選び出した。 ｊ 更に、この４３個のコロニーについて、制限酵素ｌａｅ
ＩＩで切り出したウサギ癌壊死因子コード領域の上流
に相当するＤＮＡ断片（８８ｂｐ）の３２ｐ標…物をプ
ローブとし、二次スクリーニングを行い、とのプローブ
と強くハイブリダイズする６個のコロニーを選び出した
。この２回のスクリーニングにより、ウサギ癌壊死因子
をコードするＤＮＡ塩基配列及びその上流部分と相同性
の高い塩基配列を含むＤＮＡを得た。 （９）形質発現 （８）項で選ばれた６個のクローン（プラスミド番号ｐ
ＨＴＮＦ−１，−４，−５，−１３，−２２，−２６’
）から、それぞれの組み換え体プラスミドを取り出し、
Ｅ、ｃｏｌｔ■旧０１株を宿主として形質転換体を得た
。それぞれの形質転換体について、ナガタ（Ｎａｇａｔ
ａ）らの方法［Ｎａｔｕｒｅ、２８４，３１６（１９８
０）’］に準じて５０１培養を行った。培地にはＬＢプ
ロスを用いた。吸光度（ｅｏｏｎｍ）が約０．８になる
まで培養し、約３〜５×３０１０個の菌体を集めた。０
，１％リゾチームを含む５゜ｍＭＴｒｆｓ−ＨＣＩ＠衡
液（ｐＨ８，０＞と３０ｒｎＭ ＮａＣｌより成る溶液
の１■１に菌体をＭ’ｉ１Ｍさせ、氷水中で３０分間静
置した後、凍結融解を６回繰返して菌体を破壊し、遠心
分離して菌体抽出液を得た。それぞれの形質転換体から
得られた抽出液について、Ｌ〜９２９細胞傷害活性を測
定した結果、プラスミドＰＨＴＮＦ −１３による形質
転換体の抽出液に１８１３．１単位／−１の活性を認め
た。 ｔＩＯ） クローン化ＤＮＡの塩基配列の決定（９）項
で選択された組み換え体プラスミドｐＨＴＮＦ−１３に
よる形質転換体をＬＢブロスで培養して菌体を得た。こ
の菌体をウィルキー（Ｗｉ １ｋｉｅ）らの方法［〜ｕ
ｃｌｅｔｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、、７，８５９（＋９
７９）コに従って処理し、プラスミドＤＮＡを得た。こ
のプラスミドＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩで分解し、分離
精製してクローン化ＤＮＡを得た。このクローン化ＤＮ
Ａ断片を種々の制限酵素で分解し、１６種の制限酵素断
片について、それぞれの塩基配列をマキサム−ギルバー
ト（Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ）法により脱リン酸化
、Ｐによる末端標識、塩基特異的化学分解反応、ゲル電
気泳動及びオートラジオグラフィーを行い決定した。 その塩基配列及びこの塩基配列から翻訳されたアミノ酸
配列は第１表の通りである。 参考例２ （１）ウサギ肺胞マクロファージからのｍＲＮＡ分画の
単離精製 ウサギ（体重的２．５ｈｇ）にプロピオニバクテリウム
アクネス（ＰｒｏｐｔｏｎｉｂａｃｔｅｒＩｕｍ ａ
ｃｎｅｓ）死菌体を１羽当り１００■の投与量で静脈内
に注入し、８日後に屠殺した。直ちに開胸気管切開し、
気管内に挿入したチューブを介してリン酸緩衝化生理食
塩液を用い肺洗浄を繰返し、肺胞マクロファージを採取
した。１２羽のウサギより約３ Ｘ １０９個の肺胞マ
クロファージが得られた。この肺胞マクロファージをｌ
θ％牛脂児血清含有のＲＰ〜ｌｌ−１６４０培地に懸濁
させてベトリゾイノシュ（直径８ ｃ＋＋ ）に１枚当
り２ Ｘ １０７個となるように播き、３７℃で５％炭
酸ガス含有空気中、湿度９０〜１００ ％で前培養した
６ １時間の前培養の後、エンドトキンン（大腸菌由来
のりボボリサッカライド）、 ＴＰＡ（ホルボール−１
２−ミリステート−１３−アセテート）及びシクロヘキ
ンミトをそれぞれ最終濃度が１０μｇ／纏ｌ、 ＩＯｎ
ｇ／■１及びｌμｇ／纏１となるように添加混和し、更
に培養を継続した。４〜４．５時間後（通算５〜５５時
間）に培養液を吸引除去し、ディソンユ上に残ったマク
ロファージを０６％ラウロイルサルコシ／酸ナトリウム
と６ｍＭクエン酸ナトリウムを含イｆする５Ｍグアニジ
ルチオシアネート液で溶解しホモジナイズした。このホ
モジネート！−０，ＩＭＥＤＴＡ含イ１５７含塩１５フ
ウム水溶液上に重層し、超遠心分ｍ機（ＲＰＳ２７−２
ｏ −９−、日立製作所）を用い２１３，５００μ！ｍ
で２０時間遠心し全ＲＮＡ画分をベレットとして得た。 これを０．３５Ｍ ＮａＣ］、 ２０ｍＭＴｒｉｓ及び
２０ｍＭ ＥＤＴＡを含む７Ｍ尿素液の少量に溶解し、
エタノール沈殿として回収した。１２羽のウサギより全
ＲＮＡとして５．２．が得られた。 この全ＲＮＡ画分を１ ｍＭ ＥＤＴＡを含むｌ０ｍＭ
Ｔｒ ｉ ５−ＨＣＩ緩衝液（ｐ）１７．４） （以
下ＴＥ液という）２１に溶解し、６５℃で５分間加熱し
た。これにＮａＣ１溶液を０．５Ｍとなるように加えた
後、あらかじめ０．５ＭＮａＣｌを含むＴＥ液で平衡化
したオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムに付し、吸着した
ｐｏｌｙ（＾）ｍＲＮＡをＴＥ液で溶出することにより
、３１４ｕｇのｐｏｌｙ（Ａ）ｍＲＮＡを得た。ここで
得たｐｏｌｙ（＾）ｍＲＮＡの２００μｇをアガロース
ゲル電気泳動（ゲル濃度１％、６Ｍ尿素存在下。 ｐｌ＋４）に付し、その分子サイズに従って７つの両分
に分け、ゲルを融解（７０℃、１０分間）させた後、水
飽和フェノールによる抽出とクロロホルムによる抽出の
のち、エタノールにより沈殿させて各画分よりｐｏｌｙ
（＾）ｍＲＮＡを回収した。各画分のｐｏｌｙ（Ａ）ｍ
ＲＮＡについてアフリカッメガエルの卵母細胞を用いる
方法でウサギ癌壊死因子ｍＲＮＡ量を測定し、分子サイ
ズとして１．６〜２．７ｋｂに相当する両分にウサギ癌
壊死因子ｍＲＮＡを高濃度に回収した。 この精製ｐｏｌｙ（＾）ｍＲＮＡの比活性は約１，２３
０単位／ｕｇＲＮＡであり、未精製ｐｏｌｙ（＾）ｍＲ
ＮＡ調製品の比活性約３２０単位／μｇＲＮＡに比べて
約４倍に濃縮された。 ここで得られた精製ｐｏｌｙ（＾）ｍＲＮＡを以下の実
験に用いた。 （２）ｃ ＤＮＡの合成 精製ｐｏｌｙ（＾）ｍＲＮＡ ４μｇを用い以下に示す
条件でｃ ＤＮＡを合成した。 反応液量；１００μ！ ５０ｍＭ Ｔｒ ｉ ｓ −ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ８，３
）ｉｌＯｍＭ ＭｇＣ１ｚ；７０ｍＭ ＫＣＩ ； １
ｍＭジチオスレイトール； ０．５ｍＭｄＴＴＰ、ｄ
ＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ（但しｄＣＴＰは１２ ｐ
で標識、比活性４．４Ｘ １０６ｃｐｓ／ ｎｍｏｌｅ
） ：３９ｇオリゴ（ｄＴ）＋２〜＋８． ｇｏ単位ト
リ骨髄性白血病ウィルス由来逆転写酵素。 ４３°Ｃて９０分間反応させた後、ＥＤＴＡ水溶液で反
応を停止させた。フェノール−クロロホルム混液（１：
１）によりｃＤＮＡ−ｍＲＮＡ複合体を抽出し、エタ
ノールにより沈殿させ回収した。更に、アルカリ加温処
理することによりｍＲＮＡを分解除去した後、合成され
た単鎖ｃ ＤＮＡをエタノールにより沈殿させ回収した
。 この単鎖ｃ ＤＮＡの沈殿を下記組成の反応緩衝液４０
μｌに溶解した。 反応緩衝液； ０．５ｍＭ ｄＡＴＰ、 ｄＴＴＰ、 ｄＧＴＰ、 ｄ
ＣＴＰ； ５ ｍＭＭｇＣＩｚ： ７０ｍＭＫＣｌ：
１．５ｍＭβ−メルカプトエタノール；８単位大腸菌Ｄ
Ｎ’ＡポリメラーゼＩ（ラージフラグメント）を含有す
る０、１Ｍヘペス（Ｈｅｐｅｓ）緩衝液（ｐＨ６，９）
。 １５℃で２００時間反応せ二重鎖ｃ ＤＮＡを合成した
。 反応液にドデシル硫酸ナトリウム水溶液を加えて反応を
停止させ、二重鎖ｃ ＤＮＡをフェノール−クロロホル
ム混液で抽出し、エタノールにより沈殿させ回収した。 得られた二重鎖ｃ ＤＮＡの沈殿を、５（１ｍＭ酢酸ナ
トリウム（ｐＨ４，５）、 １ ｍＭ ＺｎＳＯ４，２
００ｍＭ ＮａＣ＋、 ０．５％グリセロール及びＳ１
ヌクレアーゼ０．５単位を含有する水溶液１００μ７１
．：溶解し、３７°Ｃで２０分間反応させてヘアピン構
造を開裂させた。反応はＥＤＴＡ水溶液を添加して停止
させ、フェノール−クロロホルム混液で抽出し、更にエ
ーテルで再抽出した後、エタノールにより沈殿させｃ
ＤＮＡを回収した。 （３）オリゴ（ｄＣ）テール付加ｃＤＮＡの調製上記に
より得られた二重鎖ｃ ＤＮＡに次の組成の反応緩衝液
１００μ！を加え３７℃で２０′分間反応させ、二重鎖
ｃ ＤＮＡにオリゴ（ｄＣ）テールを付加させた。 反応緩衝液： １ ｍＭ ＣＯＣｌ２． Ｏ，１ｍＭジチオスレイトー
ル、０．２μｇポリ（＾）、 Ｏ，ＩｍＭ ’Ｈ−ｄＣ
ＴＰ （比活性５４００ｃｐｗ／ｐｍｏ ｌ ＞及びｌ
Ｏ単位ターミナルデオキシヌクレオチンルトラ／スフェ
ラーゼを含有する１３０ｍＭカフジル酸ナトリウＡ −
３０ｍＭ Ｔｒｊｓ−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ６８ン。 反応はＥＤＴＡ水溶液を添加して停止させ、フェノール
ークロロホルム混液で抽出し、更にエーテルで再抽出し
た後、オリゴ（ｄＣ）テール付加ｃＤＮＡをエタノール
により沈殿させ回収した。これを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
１−ＩＣＩ緩衝液（ｐＨ７，４＞、 １ ｍＭ ＥＤＴ
Ａ及び１００ｍＭ ＮａＣ＋を含む水溶液に１−１当り
０．２μｇのオリゴ（ｄＣ）テール付加ｃＤＮＡを含む
ように溶解した。 （４）オリゴ（ｄａ）テール付加プラスミドＰＢＲ３２
２ＤＮＡの調製 ２０ｍＭ Ｔｒ １ｓ−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ７，４）、
ｌ０ｍＭ Ｍ、ｇＣｌｚ。 ５０ｍＭ （ＮＨ４） ２５０４及び１１１当りＯ，Ｉ
ｇのウシ血清アルブミンを含む水溶液１００μｌにＰＢ
Ｒ３２２を１０μｇ溶解し、制限酵素Ｐｓｔ Ｉ工／ド
ヌクレアーゼ１５単位を加え、３７℃で１時間反応させ
た。反応終了後、反応液をフェノール抽出し、水層から
エタノール沈殿によってＤＮＡを回収した。得られたＤ
ＮＡを前述のオリゴ（ａＣ）テール付加に用いた水溶液
（但し’Ｈ−ｄｃＴＰ）代すｅ’Ｈ−ｄＧＴＰヲ含ム）
２００／ｚ／に：ｊｉｆｆ解し、ターミナルデオキシ
ヌクレオチジルトラ／ス込エラーゼ８０単位を用いて３
７℃で２０分間反応させ、約１０〜１５個のｄＧ残基を
取り込ませた。反応液を水飽和フェノール−クロロホル
ム混液で抽出し、水層からエタノール沈殿によってオリ
ゴ（ｄＣ）テール付加プラスミドｐＨＲ３２２ＤＮＡを
回収した。 これをオリゴ（ｄＣ）テール付加ｃ ＤＮＡの場合と同
様の緩衝液に１■１当り２μｇのオリゴ（ｄＣ）テール
付加プラスミドＩ） Ｂ Ｒ３２２ＤＮＡを含むように
溶解した。 ６）組み換え体プラスミドの作製 オリゴ（ｄｃ）テール付加ｃ ＤＮＡ溶液５０μｌをオ
リゴ（ｄｃ）テール付加ｐＢＲ３２２ＤＮＡ溶液５０μ
！と混合し、６５℃で１０分間、５７℃で１２０分間、
４５℃で６０分間、３５℃で６０分間及び室温で６０分
間インキュベートしてアニーりングを行い、組み換え体
プラスミド溶液を調製した。 （６）形質転換体の選択 上記で得られた組み換え体プラスミド溶液を用い、Ｅ、
ｃｏｌｉχ１７７６株を形質転換させた。即ち、Ｅ、ｃ
ｏｌｉ χ１７７６株を、ジアミノピメリン＠１００μ
ｇ／ｌ及びデミジノ４０μｇ／■１を補ったＬ−ブロス
２０１中、３７°Ｃで吸光度（１３００ｒｖ）が０，５
となるまで培養し、菌体を冷却器付遠心分離機で集め、
５０ｍＭ ＣａＣｌ２含有１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
緩衝液（ｐｌ（７，３）１０ｍ ｌに分散し、０°Ｃで
再度遠心して沈殿させた。集めた菌体を同じ緩衝液２園
１に分散し、０℃で５分間静置した。 この分散液０２−１に上記組み換え体プラスミド溶液０
．ＩＮを添加混合し、０℃で１５分間静置し、更に４２
°Ｃで２分間保持した後、前の培養で用いたのと同一組
成のＬ−ブロス０．５ ｍｌを加えて１時間振盪培養を
行った。この培養液の一部を取り、前述の成分の他にテ
トラサイクリン１５μｇ／■１を含むＬ−プロス寒天平
板に広げ３７℃で約１２時間培養し、テトラサイクリン
耐性菌を選択してｃ ＤＮＡライブラリーを作製した。 （７１ハイプリダイゼーンヨン試験 前記のｃ ＤＮＡライブラリーについて、ウサギ癌壊死
因子をコードするｃ ＤＮＡを含むプラスミドを持つ形
質転換体をスクリーニングするため３２ ｐ標１ｃＤＮ
Ａプローブを用いるコロニー・ハイブリダイゼーシ９）
試験をハナハン（）ｆａｎλｈａｎ）らの方法（Ｇｅｎ
ｅ、１０．６３（１９８０）］に従って行った。３２
ｐ標識ｃ ＤＮＡプローブは、誘導プラス及びマイナス
肺胞マクロファージより上記（１）項の方法で得たｍＲ
ＮＡを鋳型として、し）項の方法で合成した。但し、３
２Ｐ−ｄＣＴＰは高放射能比活性のものを用い、高ａ度
に標識した。この試験により誘導プラスのプローブと強
く結合し、誘導マイナスのプローブとはハイブリダイズ
しない塩基配列を含む組み換え体プラスミドを有する形
質転換体を選別した。約２万個のコロニーから５０個の
コロニーが選び出された。 次いで、これらの選択された菌株についてハイブリダイ
ゼーシヨン・トランスレージタンｉ［を“モレキュラー
クローニング（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、。 ｅｔ ａｌ、、（ｅｄ） ”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ” 、３２９（＋９８０）。 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ）Ｉａｒｂｏｒ Ｌａｂ、）
に記載の方法に従って行った。それぞれの形質転換体
よりプラスミドＤＮＡを抽出し、ニトロセルロースフィ
ルター上に加熱変性させたのち固定し、これに上記（１
）項で得たウサギ癌壊死因子ｍＲＮＡを含むｐｏｌｙ（
＾）ｍＲＮＡ画分を加え、５０°Ｃで１８０分間反応さ
せ、ハイブリダイゼーン、Ｊノを行った。結合したｍＲ
ＮＡを溶出回収した後アフリカッメガエルの卵母細胞に
注入し、回収されたｍＲＮＡかウサギ癌壊死因子ｍＲＮ
Ａであるか否かを検定した。この試験により、上記で選
択された２０個の形質転換体よりウサギ癌壊死因子ｍＲ
ＮＡと強くハイブリダイズするｃＤＮＡを含むプラスミ
ドを持つ菌株３個を見いたした。そのうち最も長いｃＤ
ＮＡ（約７５０ｂｐ）を存するプラスミドより、制限酵
素Ｄｄｅ ＩでＤＮＡ断片を切り出し、二次スクリーニ
ング用のプローブとした。このＤＮＡ断片を３２ ｐで
標識し、上記（６）項で得たｃ ＤＮＡライブラリー
）について再度フａニーφハイプリダイゼーシクン試験
を行い、標識プローブと強く結合するｃ ＤＮＡを含む
プラスミドを持つ形質転換体を選んたａＣＤＮＡライブ
ラリーの約６万個のコロニーのうち９８個が陽性コロニ
ーであった。これらからｃＤＮＡを制限酵素Ｐｓｔ Ｉ
で切り出し、そのサイズをボーノアクリルアミドゲル電
気泳動で調べ、１ｋｂｐ以」二のサイズを有する１７個
のりＶ−ノを選び出した。 これらのうち最も大きなｃ ＤＮＡを含む形質転換体（
菌体番号： ＲＴＮＦ８０２．クローン化ＤＮＡ番号：
ｐＲＴＮＦ８０２）につい“Ｃ、クローン化ＤＮＡを単
離し、後述の方法で塩基配列を決定した。 （８）クローン化ＤＮＡの塩基配列の決定ｑ）項で選択
された菌株（ＲＴＮＦ８０２）をジアミノピメリン酸及
びチミジンを添加したし一プロスで培養して菌体を得た
。この菌体をウィルキー（−Ｗｉｌｋｉｅ）らの方法［
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、、７，８５９（
１９７９）］に従って処理し、プラスミドＤＮＡを得た
。 このプラスミドＤＮＡを制限酵素Ｐｓｔ Ｉで分解し、
精製分離してクローン化ＤＮＡを得た。このクローン化
ＤＮＡ断片を種々の制限酵素で分解し、適当な制限酵素
断片についてそれぞれの塩基配列をマキサム−ギルバー
） （Ｍａｘａｍ−Ｇ＋１ｂｅｒｔ）法により脱リン
酸化、３７Ｐによる末端Ｗ識、塩基特異的イヒ学分解反
応、ゲル電気泳動及びオートラジオグラフィーから決定
した。 その塩基配列は第２表の通りである。 （以下余白） 参考例３ ウサギ癌壊死因子の単離精製 ウサギ（体重２．５〜３．０＋ｔｇ）にプロピオニバク
テリウム アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ａｃｎｅｓ）死菌体５０＠を耳静脈より注射した
。８日後に工／トドキシン（大腸菌由来のりポボリサブ
カライド）１００μｇを耳静脈より注射し、２時間後に
心臓より全採血した。採取した血液に１００１当り１０
０単位のヘパリンナトリウムを加えた後、５，０００ｒ
ｐ園で３０分間冷却遠心操作を行い、血球及び不溶固形
物を除去した。 ４００羽のウサギより３，０００単位
１１の力価を存する血漿２４１が得られた。 と１７１ 血’１１２４１ ニＥＤＴＡ２４ｇ 及ヒセ
５４ ） ２４０ｇ ヲ加え１時間撹拌した後、孔径３
μ、１μ及び０．２μのフィルターで順次濾過した。 濾液２４１に０．０４Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液（Ｐ
Ｈ１，８）１’２Ａ’を加えた後、０．１Ｍ ＮａＣｌ
を含む０．０４Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ７，
８）で十分に平衡化したＤＥＡＥ−セファ０−スＣＬ−
６Ｂ（ファルマシア社）のカラム（２７Ｘ４５ｃｍ）に
徐々に付した。次いでカラム−平衡化緩衝液１５１及び
０．１５Ｍ ＮａＣ１を含む０．０４Ｍ Ｔｒ ＋ ｓ
−ＨＣ１緩衝液（ｐＨ７，８）５０ Ｉｔで順次洗浄
後、０．１８Ｍ ＮａＣ１を含む０．０４Ｍ Ｔ ｒ
ｉ ｓ −ＨＣＩ緩衝液（ｐ４１７．２＞を用いて溶出
した。溶出液は８１ずつ分画して活性画分を集めた。こ
の活性画分に同容量の０．０４Ｍ Ｔｒ ｉ ｓ −Ｈ
Ｃ１緩衝液（ｐＨ７，８＞を加えて希釈した後、ＤＥＡ
Ｅ−セファ０−スＣＬ−６Ｂのカラム（１０ｘ １３ｃ
ｍ ）に付した。次いでＯ，ＩＭ ＮａＣＩを含む０．
０４Ｍ Ｔ ｒ ｉ ｓ −ＭＣＩ緩衝液（ｐＨ７，８
Ｈｌを用いて洗浄した後、０．１８Ｍ ＮａＣＩを含む
０．０４Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩｌｉ！衡液（ｐＨ７，２
）５ｊ！を用いて溶出した。溶出液は２５０１ずつ分画
して活性画分を集めた。 次にこの溶出液を容器に移し７０℃の湯浴中に浸し、撹
拌しながら溶出液の温度が６０℃になるまで加熱した。 その後６０℃の別の湯浴に移し、３０分間加熱処理した
後、速やかに４°Ｃに冷却した。加熱処理した溶液は、
限外自適により濃縮した。 ０、ＩＭ ＮａＣＩを含む０．００５Ｍリン酸緩衝液（
Ｐ１１７．４）で十分に平衡化したセファクリルＳ−２
００（ファルマシア社）のカラム（５Ｘ ８０ｃｍ ）
に上記濃縮液を付し、同緩衝液で溶出した。４０１ずつ
分画して活性画分を採取し、限外濾過により濃縮した。 ゲル濾過によって得られた活性画分の濃縮液をｚｎ２十
キレートセファ０−スカラムに付した。ポラス（Ｐｏｒ
ａｔｈ）らの方法（Ｎａｔｕｒｅ、２５８，５９８（＋
９７５））で得られたキレートセファ０−ス（イミノジ
酢酸固定化樹Ｍｒ１）を充填したカラム（１，６Ｘ ２
０ｃ１１ ＞に、１■／−１の塩化亜鉛水溶液１２０１
を流した。次いで０．１Ｍ ＮａＣＩを含む０．０５Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７，４＞で十分に平衡化した後、前
工程で得られたＩＯ縮液を付し、同緩衝液で溶出した非
吸着画分を採取した。活性はこの画分にほとんどが回収
された。 前精製工程で得られた活性画分を濃縮し、０．＋５ＭＮ
ａＣｌを含む０．００５ Ｍリン酸緩衝液（ｐｌ＋７．
４＞で十分に平衡化したトヨパールＨＷ−５５（東洋ソ
ーダ株式会社）のカラム（１，５Ｘ ９０ｃｍ ）に付
した。同緩衝液で溶出し活性画分を採取した。全精製工
程を通しての活性の回収率は６０％、精製度は７．５Ｘ
１０’倍であった。このようにして得られた精製ウサ
ギ癌壊死因子の比活性はｅ、ｏｘ ｔｏ’単位／ｗｇ蛋
白質であった（活性単位の定義は特開昭５８−１７４３
３０号のそれと同じである）。また、マウスに移植した
Ｍｅｔｈ Ａ肉腫を用いる生物評価において、１匹当り
３ 、０００〜５ 、０００単位を静脈内に投与した場
合の活性は（＋）以上であった。 参考例４ 抗つサギ癌壊死因子抗体の作製 参考例３で得られた精製ウサギ壊死死因子１．９×１０
５単位を含む溶液を等量の７０イ／ドの完全アジュバン
トで乳濁化し、それをモルモットの背部皮下数カ所に注
射した。その後、１．３及び６週後に同様の方法で免疫
した。更に８週後に、同量の精製ウサギ癌壊死因子を水
酸化アルミニウムゲルとともに腹腔内に注射した。最初
の免疫から９週後に心臓より全採血し、遠心分離により
血清を分離することによって抗つサギ癌壊死因子抗体を
含む抗血清を得た。 この抗血清を、正常ウサギ血清成分を吸着させたセフ１
ｏ−ス４Ｂ（ファルマシア社）カラムに３回繰返して通
過させることにより非特異的な抗体を除去し、ウサギ癌
壊死因子に対する特異抗体のみを含む精製抗血清を得た
。この抗血清は、免疫電気泳動法及びゲル内二重拡散法
により精製ウサギ癌壊死因子との間にのみ単一の沈降線
を形成した。」 以上 別紙 「特許請求の範囲 （区）ヒト癌壊死因子のアミノ酸配列もしくはその活性
中心部分を含むポリペプチド又はそれらと同様の生物活
性を有し、かつ免疫学的に交差するポリペプチド。 （２）ヒト癌壊死因子のアミノ酸配列がＳｅｒ Ｓｅｒ
Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｓｐ
Ｌｙｓ Ｐｒ。 Ｖａｌ Ａｌａ １ｌｉｓ Ｖａｌ Ｖａｌ ＡｆＥＬ
Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｇｌｎ ＡｌａＧｌｕ Ｇｌｙ Ｇｉ
ｎ Ｌｅｕ Ｇｌｎ ＴｒＰ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｒｇ
ＡｒｇＡｌａ Ａｓｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｌ
ａ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ ＧｌｕＬｅｕＡｒｇＡｓ
ｐＡｓｎＧｌｎＬｅｕＶａｔＶａｌＰｒｏＳｅｒＧｌｕ
Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｌｅｕ ｌｌｅ Ｔｙｒ
Ｓｅｒ Ｇｌｎ ＶａｔＬｅｕ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｇｌ
ｙ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｓｅｒ、Ｔｈｒ
Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｌｃｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｔ
ｈｒ ｌｉｅ Ｓｅｒ Ａｒｇｌｌｅ Ａｌａ Ｖａｌ
Ｓｅｒ 丁ｙｒ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ
ＡｓｎＬｅｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｙ
ｓ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｃｙｓ ＧｉｎＡｒｇ Ｇｌｕ
Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａ
ｌａ ＬｙｓＰｒｏ ＴｒＰ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ
Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｇｌｙ ＧｌｙＶａｌ Ｐ
ｈｅ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｓ
Ｐ Ａｒｇ ＬｅｕＳｅｒ Ａｌａ Ｇ、Ｉｕ ｌｉｅ
Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ ＬｅｕＡ
ｓｐ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌ
ｎ Ｖａｔ Ｔｙｒ ＰｈｅＧＩＳＴ ｌｌｅ ｌｌｅ
Ａｌａ Ｌｅｕである特許請求の範囲第１項記載のポ
リペプチド。 （３）特許請求の範囲第２項記載のポリペプチドのＮ末
端に他のポリペプチドが結合している特許請求の範囲第
１項記載のポリペプチド。 （４）特許請求の範囲第２項記載のポリペプチドのＮ末
端にＮｅｔが結合している特許請求の範囲第１項記載の
ポリペプチド。 （５）次のアミノ酸配列 Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｉ
ｒｅ Ａｒｇ Ａ４ｐ ＶａｔＧｌｕ Ｌｅｕ Ａｌａ
Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ
ＬｙｓＴｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｇｌ
ｙ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ａｒｇ ＣｙｓＬｅｕ Ｐｈｅ
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｌ
ｅｕ ｌ１ｅＶａｔ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｔｈｒ
” Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｃｙｓ ＬｅｕＬｅｕ
Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｖａｔ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｐ
ｒｏ Ｇｌｎ ＡｒｇＧｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｐｒｏ
Ａｒｇ ＡｓＰ Ｌｅａ Ｓｅｒ Ｌｅｕ ＩＩｅＳ
ｅｒ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｖａ
ｔ ＾ＦＩＺ Ｓｅｒ ５ｅｒＳｅｒ Ａｒｇ Ｔｈｒ
Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｓ１）Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｖａｔ
ＡｌａＨｉｓ Ｖａｔ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｓｎ Ｐｒ
ｏ Ｇｉｎ Ａｌａ Ｇｌｕ ＧｌｙＧｌｎ Ｌｅｕ
Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａ
ｌａ ＡｓｎＡｌａ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｓｎ
Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｌｅｕ ＡｒｇＡｓｐ Ａ
ｓｎ Ｇｉｎ Ｌｅｕ Ｖ、ａｌ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓ
ｅｒ Ｇｌｕ ＧｌｙＬｅｕ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｉｌｅ
丁ｙｒ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｌｅｕ ＰｈｅＬ
ｙＩＩ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｃｙａ Ｐｒｏ Ｓ
ｅｒ Ｔｈｒ Ｈｉｓ ＶａｌＬｅｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ
Ｈｉｓ、Ｔｈｒ ｌｉｅ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｉｌｅ
ＡｌａＶａｌ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｉｎ Ｔｈｒ Ｌｙ
ｓ Ｖａｌ Ａｇｎ Ｌｅｕ ＬｅｕＳｅｒ Ａｌａ
Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｓｅｔ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ａ
ｒｇ ＧｌｕＴｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｌａ
Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｐｒｏ ＴｒｐＴｙｒ Ｇ
ｌｕ Ｐｒｏ ｌｌｅ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌ
ｙ Ｖｉｌ ＰｈｅＧｉｎ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｙｓ
Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｓｅｒ ＡｌａＧｌ
ｕ ＩＩＣＡｓｎ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ
Ｌｅｕ ＡｓＰ、ＰｈｅＡｌａ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌ
ｙ Ｇｌｎ Ｖａｔ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｇｌｙ １ｉｅ
ｌｉｅ Ａｌａ Ｌｅｕ を有する特許請求の範囲第１項又は第３項記載のポリペ
プチド。 （６）微生物又は培養細胞により産生される特許請求の
範囲第１項〜第５項のいずれかに記載あポリペプチド。 ■ ヒト癌壊死因子のアミノ酸配列もしくはその活性中
心部分を含むポリペプチドをコードする塩基配列を有す
るＤＮＡ又は対立遺伝子変異、ａ伝子コードの縮重もし
くは一部の修飾を含む該ＤＮＡの変異体。 Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａ
ｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ ＬｙｓＰｒｏ Ｔｒｐ Ｔｙｒ
Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｇｌｙ
ＧｌｙＡｓｌ）’Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｖ
ａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｇｌｕ ＧｌｙＬｅｕＴｙｒＬ
ｅｕＩｌｅＴｙｒＳｅｒＧｌｎＶａｌＬｅｕＰｈｅ＋ｌ
ｅ Ａｌａ Ｌｅｕ （ＩＩ ヒト癌壊死因子のアミノ酸配列をコードする塩
基配列が （５′）−ＴＣＡ ＴＣＴ ＴＣＴ ＣＧＡ ＡＣＣＣ
ＣＧ ＡＧＴ ＧＡＣＡＡＧＣＣＴ ＧＴＡ ＧＣＣＣ
ＡＴ ＧＴＴ ＧＴＡ ＧＣＡ ＡＡＣＣＣＴ ＣＡＡ
ＧＣＴ ＧＡＧ ＧＧＧ 、ＣＡＧ ＣＴＣＣＡＧ Ｔ
ＧＧ ＣＴＧ ＡＡＣＣＧＣＣＧＧ ＧＣＣＡＡＴ Ｇ
ＣＣＣＴＣＣＴＧ ＧＣＣＡＡＴ ＧＧＣＧＴＧＧＡＧ
ＣＴＧ ＡＧＡ ＧＡＴ ＡＡＣＣＡＧ ＣＴＧ Ｇ
ＴＧ ＧＴＧ ＣＣＡＴＣＡ ＧＡＧ ＧＧＣＣＴＧ
ＴＡＣＣＴＣＡＴＣＴＡＣＴＣＣＣＡＧＧＴＣＣＴＣＴ
ＴＣＡＡＧ ＧＧＣＣＡＡ ＧＧＣＴＧＣＣＣＣＴＣＣ
ＡＣＣＣＡＴ ＧＴＧ ＣＴＣＣＴＣＡＣＣＣＡＣＡＣ
ＣＡＴＣＡＧＣＣＧＣＡＴＣＧＣＣＧＴＣＴＣＣＴＡＣ
ＣＡＧ ＡＣＣＡＡＧ ＧＴＣＡＡＣＣＴＣＣＴＣＴＣ
Ｔ ＧＣＣＡＴＣＡＡＧ ＡＧＣＣＣＣＴＧＣＣＡＧ
ＡＧＧ ＧＡＧ ＡＣＣＣＣＡ ＧＡＧ ＧＧＧ ＧＣ
Ｔ ＧＡＧ ＧＣＣＡＡＧ ＣＣＣＴＧＧ ＴＡＴ Ｇ
ＡＧ ＣＣＣＡＴＣＴＡＴ ＣＴＧ ＧＧＡＧＧＧ Ｇ
ＴＣＴＴＣＣＡＧ ＣＴＧ ＧＡＧ ＡＡＧ ＧＧＴ
ＧＡＣＣＧＡＣＴＣＡＧＣＧＣＴ ＧＡＧ ＡＴＣＡＡ
Ｔ ＣＧＧ ＣＣＣＧＡＣＴＡ丁ＣＴＣＧＡＣＴＴＴ
ＧＣＣＧＡＧ ＴＣＴ ＧＧＧ ＣＡＧ ＧＴＣＴＡＣ
ＴＴＴ ＧＧＧ ＡＴＣＡＴＴ ＧＣＣＣＴＧ−（３′
）である特許請求の範囲第７項又は第８項記載のＤＮＡ
。 の５′末端に開始コドンＡＴＧを存する特許請求の範囲
第７項記載のＤＮＡ ０ ａ２１次の塩基配列 （ｓ′＋−ＡＴｃ ＡＧＣＡＣＴ ＧＡＡ ＡＧＣＡＴ
Ｇ ＡＴＣｃａＧ′ＧＡＣＧＴＧ ＧＡＧ ＣＴＧ Ｇ
ＣＣＧＡＧ ＧＡＧ ＧＣＧ ＣＴＣＣＣＣＡＡＧＡＡ
Ｇ ＡＣＡ ＧＧＧ ＧＧＧ ＣＣＣＣＡＧ ＧＧＣＴ
ＣＣＡＧＧ ＣＧＧＴＧＣＴＴＧ ＴＴＣＣＴＣＡＧＣ
ＣＴＣＴＴＣＴＣＣＴＴＣＣＴＧＡＴＣＧＴＧ ＧＣＡ
ＧＧＣＧＣＣＡＣＣＡＣＧ ＣＴＣＴＴＣＴＧＣＣＴ
Ｇ ＣＴＧ ＣＡＣＴＴＴ ＧＧＡ ＧＴＧ ＡＴＣＧ
ＧＣＣＣＣＣＡＧＡＧＧ ＧＡＡ ＧＡＧ ＴＴＣＣＣ
Ｃ’ＡＧＧ ＧＡＣＣＴＣＴＣＴ ＣＴＡＡＴＣＡＧＣ
ＣＣＴ ＣＴＧ ＧＣＣＣＡＧ ＧＣＡ ＧＴＣＡＧＡ
ＴＣＡＴＣＴ ＴＣＴ ＣＧＡ ＡＣＣＣＣＧ ＡＧ
Ｔ ＧＡＣＡＡＧ ＣＣＴ ＧＴＡＧＣＣＣＡＴ ＧＴ
Ｔ ＧＴＡ ＧＣＡ ＡＡＣＣＣＴ ＣＡＡ ＧＣＴ
ＧＡＧＧＧＧ ＣＡＧ ＣＴＣＣＡＧ ＴＧＧ ＣＴＧ
ＡＡＣＣＧＣＣＧＧ ＧＣＣＡＡＴ ＧＣＣＣＴＣＣ
ＴＧ ＧＣＣＡＡＴ ＧＧＣＧＴＧ ＧＡＧ ＣＴＧＡ
ＧＡ ＧＡＴ ＡＡＣＣＡＧ ＣＴＧ ＧＴＧ ＧＴＧ
ＣＣＡ ＴＣＡ ＧＡＧＧＧＣＣＴＧ ＴＡＣＣＴＣ
ＡＴＣＴＡＣＴＣＣＣＡＧ ＧＴＣＣＴＣＴＴＣＡＡＧ
ＧＧＣＣＡＡ ＧＧＣＴＧＣＣＣＣＴＣＣＡＣＣＣＡ
ＴＧＴＧ ＣＴＣＣＴＣＡＣＣＣＡＣＡＣＣＡＴＣＡＧ
ＣＣＧＣＡＴＣＧＣＣＧＴＣＴＣＣＴＡＣＣＡＧ ＡＣ
ＣＡＡＧ ＣＴＣＡＡＣＣＴＣＣＴＣＴＣＴ ＧＣＣＡ
ＴＣＡＡＧ ＡＧＣＣＣＣＴＧＣＣＡＧ ＡＧＧＧＡＧ
ＡＣＣＣＣＡ ＧＡＧ ＧＧＧ ＧＣＴ ＧＡＧ Ｇ
ＣＣＡＡＧ ＣＣＣＴＧＧ ＴＡＴ ＧＡＧ ＣＣＣＡ
ＴＣＴＡＴ ＣＴＧ ＧＧＡ ＧＧＧ ＧＴＣＴＴＣＣ
ＡＧ ＣＴＧ ＧＡＧ ＡＡＧ ＧＧＴ ＧＡＣＣＧＡ
ＣＴＣＡＧＣＧＣＴ ＧＡＧ ＡＴＣＡＡＴ ＣＧＧ
ＣＣＣＧＡＣＴＡＴ ＣＴＣＧＡＣＴＴＴ ＧＣＣＧ
ＡＧ ＴＣＴ ＧＧＧ ＣＡＧ ＧＴＣＴＡＣＴＴＴ
ＧＧＧＡＴＣＡＴＴ ＧＣＣＣＴＧ−（３′）ををする
特許請求の範囲第７項又は第９項記載のＤＮＡ 。 ａ３特許請求の範囲第７項〜第１２項のいずれかに記載
のＤＮＡを組込んたベクター。 Ｇ＠ベクターが形質発現ベクターである特許請求の範囲
第１３項記載のベクター。 ０９ 特許請求の範囲第１３項又は第１４項記載のベク
ターで形質転換された宿主。 ＣＯ形質転換された宿主が微生物又は培養細胞である特
許請求の範囲第１５項記載の宿主。 以上
Claims (1)
- （１）ヒト癌壊死因子のアミノ酸配列又はその活性中心
部分を含むポリペプチドをコードする塩基配列を有する
ＤＮＡを組み込んだ形質発現ベクターによる形質転換体
を培養し、培養物中にヒト癌壊死因子のアミノ酸配列又
はその活性中心部分を含むポリペプチドを産生させるこ
とを特徴とするヒト癌壊死因子ポリペプチドの製造法。 ■ヒト癌壊死因子のアミノ酸配列が Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｓ
ｅｒ ＡｓｐＬｙｓ、Ｐｒ。 Ｖａｌ Ａｌａ Ｈｌｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｌａ Ａ
ｓｎ Ｐｒｏ Ｇｌｎ ＡｌａＧｌｕ Ｇｌｙ Ｇｌｎ
Ｌｅｕ Ｇｉｎ ＴｒｐＬｅｕ Ａｓｎ Ａｒｇ Ａ
ｒｇＡｌａ Ａｓｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｌａ
Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ ＧｌｕＬｅｕ Ａｒｇ Ａ
ｓＰ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｖａｌ、 Ｐ
ｒｏ ５ｅｒＧｌｕ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｌｅｕ
Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｖ＋ｘｌＬｅｕ
Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｉｎ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｐ
ｒｏ Ｓｅｒ ＴｈｒＨｌｓ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｌｅｕ
Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｒｇｌ
ｌｅ Ａｌａ Ｖａｔ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｉｎ Ｔｈ
ｒ Ｌｙｓ Ｖａｔ ＡｓｎＬｅｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ
Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｇ
ｌｎＡｒｇ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｙ
Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ ＬｙｓＰｒｏ Ｔｒｐ Ｔ
ｙｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ ｌｌｅ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｇｌ
ｙ ＧｌｙＶａｔ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｇｌｕ
Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｒｇ ＬｅｕＳｅｒ Ａｌ
ａ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｓｐ
Ｔｙｒ ＬｅｕＡｓｌ） Ｐｈｅ Ａｌａ Ｇｌｕ
Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｔｙｒ ＰｈｅＧｌ
ｙｌｌｅｌｌｅＡｌａＬｅｕ である特許請求の範囲第１項記載の製造法。
Priority Applications (16)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59082653A JPS60232097A (ja) | 1984-04-23 | 1984-04-23 | ヒト癌壊死因子ポリペプチドの製造法 |
| DE8585102093T DE3582183D1 (de) | 1984-03-06 | 1985-02-26 | Dns den menschlichen tumornekrosisfaktor kodierend und das menschliche tumornekronisfaktor-polypeptid. |
| DE1999175063 DE19975063I2 (de) | 1984-03-06 | 1985-02-26 | DNS den menschlichen Tumornekrosisfaktor kodierendund das menschliche Tumornekronisfaktor-Polypepti d. |
| EP85102093A EP0155549B1 (en) | 1984-03-06 | 1985-02-26 | Dna encoding human tumor necrosis factor and human tumor necrosis factor polypeptide |
| AT85102093T ATE61817T1 (de) | 1984-03-06 | 1985-02-26 | Dns den menschlichen tumornekrosisfaktor kodierend und das menschliche tumornekronisfaktor-polypeptid. |
| AU39448/85A AU584608B2 (en) | 1984-03-06 | 1985-03-01 | DNA encoding human tumor necrosis factor and human tumor necrosis factor polypeptide |
| CA000475653A CA1341240C (en) | 1984-03-06 | 1985-03-04 | Dna encoding human tumor necrosis factor and human tumor necrosis factor polypeptide |
| PH31937A PH22108A (en) | 1984-03-06 | 1985-03-04 | Dna encoding human tumor necrosis factor and human tumor necrosis factor polypeptide |
| DK100985A DK172013B1 (da) | 1984-03-06 | 1985-03-05 | DNA, vektor indeholdende dette DNA, vært transformeret med vektoren,polypeptid indeholdt i DNA'et og salt deraf, aggregat indeholdende polypeptidet samt pharmaceutisk sammensætning indeholdende polypeptidet eller aggregatet. |
| KR1019850001374A KR920010225B1 (ko) | 1984-03-06 | 1985-03-05 | 인간암괴사인자 및 그를 코우드하는 dna의 제법 |
| HU85828A HU202921B (en) | 1984-03-06 | 1985-03-05 | Process for producing coding dns for human tumor necrosis factor the corresponding polypeptide with utilizing them and pharmaceutical compositions containing this polypeptide as active component |
| ES540939A ES8802159A1 (es) | 1984-03-06 | 1985-03-05 | Un procedimiento de producir un acido desoxirribonucleico (adn)que tiene o contiene una secuencia de base que codificaun polipeptido de factor de necrosis tumoral de humano |
| ES550939A ES8703490A1 (es) | 1984-03-06 | 1986-01-16 | Un procedimiento para producir un polipeptido que tiene o contiene un polipeptido de factor de necrosis de tumor humano |
| US08/084,445 US5288852A (en) | 1984-03-06 | 1993-07-01 | Human tumor necrosis factor polypeptides |
| FR99C0037C FR99C0037I2 (ja) | 1984-03-06 | 1999-10-12 | |
| NL990034C NL990034I2 (nl) | 1984-03-06 | 1999-10-12 | DNA dat codeert voor humane tumor necrosis faktor en humane tumor necrosis faktor polypeptide. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59082653A JPS60232097A (ja) | 1984-04-23 | 1984-04-23 | ヒト癌壊死因子ポリペプチドの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60232097A true JPS60232097A (ja) | 1985-11-18 |
Family
ID=13780384
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59082653A Pending JPS60232097A (ja) | 1984-03-06 | 1984-04-23 | ヒト癌壊死因子ポリペプチドの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60232097A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6140221A (ja) * | 1984-07-05 | 1986-02-26 | ジエネンテク，インコ−ポレイテツド | 腫瘍壊死因子 |
| JPS6150923A (ja) * | 1984-08-17 | 1986-03-13 | Dainippon Pharmaceut Co Ltd | ヒト癌壊死因子 |
| JPS6248634A (ja) * | 1985-07-23 | 1987-03-03 | Mochida Pharmaceut Co Ltd | 新規アミノ酸組成物、その製造方法及び該アミノ酸組成物を含有する医療組成物 |
| JPS62500631A (ja) * | 1984-10-15 | 1987-03-19 | カイロン コーポレイション | ヒト腫瘍壊死因子 |
-
1984
- 1984-04-23 JP JP59082653A patent/JPS60232097A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6140221A (ja) * | 1984-07-05 | 1986-02-26 | ジエネンテク，インコ−ポレイテツド | 腫瘍壊死因子 |
| JPH07291997A (ja) * | 1984-07-05 | 1995-11-07 | Genentech Inc | 腫瘍壊死因子の突然変異体 |
| JPH0928387A (ja) * | 1984-07-05 | 1997-02-04 | Genentech Inc | 腫瘍壊死因子の突然変異体をコードするｄｎａ |
| JPS6150923A (ja) * | 1984-08-17 | 1986-03-13 | Dainippon Pharmaceut Co Ltd | ヒト癌壊死因子 |
| JPS62500631A (ja) * | 1984-10-15 | 1987-03-19 | カイロン コーポレイション | ヒト腫瘍壊死因子 |
| JPS6248634A (ja) * | 1985-07-23 | 1987-03-03 | Mochida Pharmaceut Co Ltd | 新規アミノ酸組成物、その製造方法及び該アミノ酸組成物を含有する医療組成物 |
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