WO2003074565A2 - Peptides utilisables en immunotherapie antitumorale. - Google Patents

Peptides utilisables en immunotherapie antitumorale. Download PDF

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WO2003074565A2
WO2003074565A2 PCT/FR2003/000698 FR0300698W WO03074565A2 WO 2003074565 A2 WO2003074565 A2 WO 2003074565A2 FR 0300698 W FR0300698 W FR 0300698W WO 03074565 A2 WO03074565 A2 WO 03074565A2
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Boris Linard
Francine Jotereau
Houssem Benlalam
Elizabeth Diez
Yannick Guilloux
Nathalie Labarriere
Nadine Gervois
Laurent Derre
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Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Nantes Université
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Universite de Nantes
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to peptides representing epitopes shared by tumor antigens, and to their use in immunotherapy.
  • Vaccination or peptide immunotherapy is a therapeutic approach which is currently the subject of great interest in the context of the prevention or treatment of cancers. Its principle is based on immunization with peptides reproducing T epitopes of tumor-associated antigens (TAA) recognized by cytotoxic T lymphocytes (CTL), which play a major role in the elimination of cancer cells expressing these antigens at their area.
  • TAA tumor-associated antigens
  • CTL cytotoxic T lymphocytes
  • the CTLs do not recognize the entire protein antigens, but peptide fragments thereof, presented by the molecules of the major histocompatibility complex (MHC) expressed on the surface of different cells. It is these peptide fragments which constitute the T epitopes.
  • MHC major histocompatibility complex
  • the peptides presented by the major histocompatibility class I complex (MHC I) generally have 8 to 11 amino acids, and are recognized by the CD8 + T cells, which represent the major component. of the cytotoxic response.
  • the peptides presented by the major class II histocompatibility complex (MHC II) generally have 13 to 18 amino acids and are recognized by CD4 + T cells.
  • melanoma-associated antigens two main classes of melanoma-associated antigens (MAA) have been identified: melanoma-specific antigens, little or not expressed in normal tissues, and melanocyte differentiation antigens, which are also expressed by melanocytes (for review, see CASTELLI et al., 2000, J Cell Physiol, 182, 323-31; KIRKIN et al, 2002, Cancer Invest, 20, 222-36).
  • Melanocyte differentiation antigens such as Melan-A / MART-1, gp-100 and tyrosinase, are expressed by a significant proportion of melanoma-type tumors.
  • these antigens are effectively recognized both by the CTLs of healthy subjects and by those of melanoma patients (BENLALAM et al, 2001, Ewr JImrnunol, 31, 2007-15; KAWAKAMI et al., 2000, J Immunother, 23, 17-27; LABARRI ⁇ R ⁇ et al., 1998, Int J Cancer, 78, 209-15; PITT ⁇ T et al, 1999, J Exp Med, 190, 705-15; VALMORI et al., 2002, Cancer Res, 62 , 1743-50).
  • Melanoma-specific antigens include families of antigens known as “shared by cancer and testes”: MAGE, GAGE, BAGE and LAGE. These antigens, which are expressed by different tumors, generate CTL epitopes presented in a wide variety of HLA contexts, including HLA-B and C (KIRKIN et al, 2002). With the exception of NY-ESO-1 (JAGER et al, 1998, JExp Med, 187, 265-70), and unlike melanocyte differentiation antigens, antigens shared by cancer and testes are rarely recognized by tumor infiltrating lymphocytes (TILs).
  • TILs tumor infiltrating lymphocytes
  • the identification of peptides presented in different HLA contexts also makes it possible to develop tools making it possible to measure the T cell response in immunized patients. Indeed, if the identification of new antigenic peptides is essential to increase the availability and effectiveness of vaccines, it is also essential to improve the monitoring of the CTL response of patients who have been immunized with peptides or other forms of antigens, such as complete recombinant proteins or recombinant viruses.
  • HLA-B35 is one of the most frequent HLA-B alleles, present in approximately 20% of the Caucasian population (60% of which corresponds to allele B * 3501; MORI et al, 1997, Transplantation, 64, 1017-27), the identification of new peptides antigens presented in the context HLA-B35 is very desirable for the development of cancer immunotherapy.
  • the inventors have identified new epitopes, which are derived from melanocytic antigens or from antigens shared by cancers and testes, and which are presented in the HLA-B35 context.
  • the peptides reproducing these epitopes can be used for diagnostic or therapeutic purposes, in the context of the prevention or treatment of melanomas in patients expressing an HLA-B35 allele, in particular HLA-B * 3501 or HLA-B * 3503.
  • the subject of the present invention is the use of at least one immunogenic peptide representing a T epitope presented by the MHC I, chosen from: a) a peptide comprising the sequence EX ⁇ AGIGILX 2 (SEQ ID NO: 1) in which Xj represents A or P, and X 2 represents T or Y, capable of inducing a cytotoxic response directed against the Melan-A antigen; b) a peptide comprising the sequence ENDPIGHNY (SEQ ID ⁇ O: 2), capable of inducing a cytotoxic T response directed against the MAGE-A6 antigen; c) a peptide comprising the sequence NPLDCNLYR (SEQ ID ⁇ O: 3), capable of inducing a cytotoxic response directed against the gplOO antigen; d) a peptide comprising the sequence TPRLPSSADNEF (SEQ ID ⁇ O: 4) capable of inducing a cytotoxic response directed against the tyrosinase anti
  • NPLDCNLYR SEQ ID ⁇ O: 3
  • NPLDCNLYRY SEQ ID ⁇ O: 13
  • a combination comprising at least two peptides of two different categories among the categories a), b), c), d) or e) defined above, in order to d '' be able to induce a cytotoxic response against at least two tumor antigens.
  • the present invention also relates to a multi-epitopic composition associating at least two peptides of two different categories among the categories a) b) c) d) or e) above.
  • these compositions comprise at least one peptide from each of these categories a) b) c) d) or e).
  • Multi-epitopic compositions in accordance with the invention may also comprise one or more other immunogenic peptides, derived from the antigens mentioned above, or from different antigens. These peptides can represent epitopes derived from the same antigen, or from two or more different antigens.
  • the peptide ENDPIGHLY SEQ ID ⁇ O: 19
  • the peptide ENDPIGHLY SEQ ID ⁇ O: 19
  • compositions can also comprise, to be more widely usable in a population whose individuals carry different HLA alleles, one or more peptides presented by MHC I molecules other than HLA-B35.
  • peptide PLDCNLYRY SEQ ID ⁇ O: 20
  • Multi-epitopic compositions in accordance with the invention may in particular be in the form of a chimeric polypeptide comprising one or more copies of each of the epitopes chosen.
  • Chimeric polypeptides in accordance with the invention can be easily obtained by methods known in themselves, and in particular by conventional techniques of recombinant DNA.
  • the present invention also relates to a polynucleotide coding for a chimeric polypeptide according to the invention, as well as a nucleic acid vector containing said polynucleotide.
  • the present invention also encompasses the use of said polynucleotide or said nucleic acid vector in tumor immunotherapy.
  • the HLA-B35 antigen presenting cells charged in this way are also part of the object of the present invention.
  • the polynucleotides according to the invention preferably integrated into nucleic acid vectors, in particular viral vectors such as adenoviruses, can also be administered by injection to the patient to be treated.
  • a polynucleotide comprising a sequence coding for a peptide defined by one of the sequences SEQ ID NO: 1 to 18 above, and in particular a polynucleotide coding for a chimeric polypeptide according to the invention, can also be used to transfect in vitro professional HLA-B35 antigen presenting cells, in particular dendritic cells, which are then injected into the patient, as described for example by KAPLAN et al (J. Immunol., 163 (2), 699-707, 1999) or KIM et al. (Armais of Surgical Oncology, 5 (1), 64-76, 1998). These transfected antigen presenting cells are also part of the object of the present invention.
  • the present invention also encompasses the use of the peptides defined above, for the in vitro detection of CTLs directed against one or more of the antigens Melan-A, MAGE-A6, gplOO, tyrosinase, and NY-ESO-1, in a biological sample obtained from an HLA-B35 subject. These peptides can also be used to carry out the specific sorting of these CTLs.
  • the CTLs thus isolated can then be amplified in vitro and reinjected in large numbers (of the order of a billion) to the patient.
  • the present invention also relates to therapeutic compositions comprising, as active principle, a mutated ras peptide, a multi-epitopic composition, a chimeric polypeptide, a polynucleotide, or an antigen presenting cell according to the invention.
  • compositions in accordance with the invention may also comprise the usual excipients, as well as adjuvants usually used in immunotherapy, and making it possible, for example, to favor the administration of the active principle, to stabilize it, to increase its immunogenicity, etc.
  • EAAGIGILTY SEQ ID NO: 9
  • EAAGIGILY SEQ ID NO: 10
  • EPAGIGILTY SEQ ID NO: 11
  • EPAGIGILTV SEQ ID NO: 12
  • the present invention also encompasses these particular peptides, as well as any multi-epitopic composition comprising at least one of these peptides.
  • This notably includes chimeric polypeptides containing at least one of these peptides.
  • the polynucleotides encoding these chimeric polypeptides, and the nucleic acid vectors containing these polynucleotides are also part of the subject of the present invention.
  • the inventors have also found that the peptide NPLDCVLYRY (SEQ ID ⁇ O: 13) derived from the gplOO antigen, was also recognized, in the HLA * A0101 context, by a CD8 T clone (M199.6.12) from a population TILs of melanoma.
  • PLDCNLYRY SEQ ID ⁇ O: 20
  • the peptide SEQ ID ⁇ O: 20 also forms part of the subject of the present invention, as well as the chimeric polypeptides containing at least this peptide.
  • the polynucleotides encoding these chimeric polypeptides, and the nucleic acid vectors containing these polynucleotides are also part of the subject of the present invention.
  • This peptide, the chimeric polypeptides containing it, as well as the polynucleotides coding for these chimeric polypeptides can be used in the context of the detection or treatment of melanomas in HLA-A1 subjects, and in particular HLA * A0101, according to the same techniques as those indicated above for the peptides recognized in the HLA-B35 context.
  • PCT application WO 92/14756 proposes the use of peptides reproducing ras epitopes mutated at codon 12 or codon 61.
  • these epitopes are presented by MHC II (DQ and DR), and therefore induce a CD4 + response.
  • CD4 + helper lymphocytes make it possible to increase the cytotoxic response (WALTER et al, N. Engl. J. Medicine, 333, 1038, 1995 ), the CD8 + response remains the essential player in cytotoxicity.
  • the peptides thus selected can stimulate the growth of specific CTLs from PBL in vitro.
  • these CTLs weakly recognize mutated tumor cells, suggesting that the endogenous expression of these epitopes is limited (VAN ELSAS et al, Int. J. Cancer, 61, 389, 1995; ABRAMS et al, Cell Immunol, 182, 137, 1997; BERGMANN et al, Cell Immunol, 187, 103, 1998), and therefore do not allow efficient elimination of tumor cells by specific CTLs, which considerably limits their interest in immunotherapy.
  • ras epitopes restricted to MHC I and presented effectively by a significant fraction of human tumors.
  • the inventors have now identified a ras epitope mutated in position 61 by substitution of a glutamine by an arginine (Q61R), and restricted to MHC I.
  • This epitope hereinafter called 55-64 Q 1R is presented effectively by several lines of HLA-A * 0101 + melanoma expressing a ras oncogene carrying the Q61R mutation. It is capable of specifically inducing the expansion of clones of tumor infiltrating lymphocytes (TIL) obtained from these melanomas.
  • TIL tumor infiltrating lymphocytes
  • the dendritic cells loaded with this peptide efficiently stimulate specific CTLs from peripheral blood lymphocytes (PBL) from healthy donors HLA-A * 0101, and these CTLs recognize all of the HLA-A * 0101 melanoma lines. expressing the ras Q61R oncogene, and do not recognize cells expressing the non-mutated ras protein.
  • the peptide 55-64 Q61R does not have a higher anchoring capacity than that of the corresponding wild-type peptide.
  • the HLA-A * 0101 binding affinity of the wild type peptide is similar to that of peptide 55-64 Q61R .
  • the present invention also relates to the use of an immunogenic ras mutated peptide of sequence ILDTAGREEY (SEQ ID NO: 35) for obtaining a medicament intended for the immunotherapeutic treatment of tumors in a HLA-A * 0101 or HLA-B * 1501 patient,:
  • said medicament can be used for the treatment of tumors expressing a K-ras, H-ras or N protein -r ⁇ s mutated by substitution of glutamine in position 61 with an arginine.
  • Said peptide can be used in particular in the context of multi-epitopic compositions, and in particular of chimeric polypeptides, as mentioned above.
  • a polynucleotide encoding such a chimeric polypeptide, as well as a nucleic acid vector containing said polynucleotide can also be used as mentioned above.
  • Said peptide or said polynucleotide can also be used respectively to load or transfect in vitro cells presenting the professional HLA-A * 0101 or HLA-B * 1501 antigen, in order to induce the proliferation of anti-tumor CTLs.
  • the antigen presenting cells, HLA-A * 0101 or HLA-B * 1501 loaded or transfected in this way are also part of the object of the present invention.
  • Said mutated ras peptide can also be used to detect in vitro CTLs directed against the mutated ras antigen from which it is derived, in a biological sample obtained from a subject HLA-A * 0101 or HLA-B * 1501. It can also be used to perform the specific sorting of these CTLs.
  • EXAMPLE 1 EVIDENCE OF ANTIGENIC EPITOPES PRESENT IN THE HLA-B35 CONTEXT AND RECOGNIZED BY CTLS CLONES:
  • COS-7 cells cultured in DMEM medium (Sigma) containing 10% fetal calf serum, antibiotics and L-glutamine, were transfected with cDNA coding for one of the HLA-B * alleles 3501, HLA-B * 3503, HLA-B * 3508, alone or in combination with a cDNA encoding one of the antigens MAGE-A3, MAGE-A6, tyrosinase, Melan- A / MART-1, gp-100, and NY-ESO1 / LAGE-2.
  • the transfection was carried out according to the protocol described by DE PLAEN et al. (Methods, 12, 125-42, 1997). 16.5 10 3 COS cells-
  • COS-7 cells were used 48 hours after transfection to stimulate the various TILs clones (2x10 3 to 10 4 ).
  • the culture supernatants were removed 6 hours later and their TNF concentration was determined by measuring the cytotoxicity of these culture supernatants for the clone 13 WEHI 164, as described by DE PLAEN et al.
  • TNF Secretion of TNF by the TIL clones in the presence of COS-7 cells transfected only with a cDNA coding for a HLA-B35 molecule.
  • TNF Secretion of TNF by the TILs clones in the presence of COS-7 cells co-transfected with a cDNA coding for a HLA-B35 molecule and a cDNA coding for an MAA.
  • EXAMPLE 2 IDENTIFICATION OF THE ANTIGENIC EPITOPES PRESENT IN THE HLA-B35 CONTEXT.
  • the inventors constructed a series of fragments of the cDNAs of the various MAAs.
  • the Melan-A / MART-1 and NY-ESO-1 cDNA fragments were obtained by exonuclease III digestion: the plasmids comprising the cDNA coding for Melan-A / MART-1 or NY-ESO-1 were opened by Xbal and Apal, or SpHI and Notl respectively.
  • the fragments obtained were then digested with exonuclease III using the Erasea-base system (Promega, Madison, WI).
  • the cDNA fragments corresponding to the fragments of the tyrosinase and gplOO antigens were obtained by PCR from the plasmids containing the complete sequence coding for each of these two antigens.
  • the expression of these different fragments by the COS-7 cells is carried out as in Example 1.
  • the responses of the different TIL clones towards these COS-7 cells co-transfected with the antigen fragments and the relevant HLA-B35 allele are measured as in Example 1.
  • the results are illustrated in FIG. 2: The positions of the regions of the cDNAs coding for the potential epitopes are indicated in base pairs.
  • TIL populations recognize epitopes which are encoded respectively by the Melan-A cDNA fragment extending from nucleotides 95 to 119
  • amino acids 32 to 39 amino acids 32 to 39
  • the cDNA fragment gplOO 1200 to 1601 amino acids 400 to 533
  • the cDNA fragment tyrosinase 937 to 975 amino acids 313 to 325
  • the cDNA fragment NY-ESO -1 259 to 339 amino acids 87 to 113
  • EXAMPLE 3 IDENTIFICATION OF THE ANTIGENIC PEPTIDES PRESENT IN THE HLA-B35 CONTEXT.
  • the wild type and modified peptides whose sequences are indicated in Table I below were obtained from EPYTOP (Nîmes, France). Purity (> 70%) is controlled by high yield reverse phase liquid chromatography (HPLC). The peptides are lyophilized, then dissolved in DMSO at 10 mg / ml and stored at -80 ° C.
  • the response of the various TIL clones was evaluated, by a TNF release test, after
  • BM36.1 cells KELLY et al, 1992, Nature, 355, 641-4
  • BM36.1 cells are labeled for 1 h at 37 ° C. with 100 Ci of 51 Cr (Na2 51 CrO4, ORIS, Gif-sur-Yvette, France).
  • the cells are then pulsed for 20 minutes with the various synthetic peptides.
  • 10 3 BM36.1 cells thus treated are incubated with 10 4 T cells of the clone (Effector: Target ratio of 10: 1) for 4 hours.
  • the culture supernatants are recovered and the amount of 51 Cr released is evaluated using a ⁇ plate counter (EG&G Wallac, Evry, France).
  • a negative control is carried out with an irrelevant peptide.
  • the amount of peptide necessary to obtain 50% of the maximum lysis (EC50) has been determined.
  • the affinity and the stability of the peptides for HLA-B35 were measured as described by TOURDOT et al, Eur. J. Immunol., 30: 3411-3421, 2000).
  • the BM36.1 cells are incubated for 18 h with a range of concentrations of each peptide.
  • BM36.1 cells are simultaneously incubated with a range of a reference peptide, which binds to HLA-B35 (peptide 37F, TAKAMIYA et al, Int. Immunol, 6: 255-261, 1994; SCH ⁇ NBACH et al, J. Immunol, 154: 5951-5958, 1995).
  • the relative amount of fixed peptide is then estimated at each concentration, for each of the peptides, by measuring the stabilization of HLA-B35 on the cell surface. This measurement is carried out by flow cytometry using an anti HLA-B / C antibody (which in the case of BM36.1 cells recognizes only HLA-B * 3501, these cells spontaneously expressing no molecule HLA-C).
  • The% of binding to B * 35 is then calculated for each concentration, by fixing the 100% of binding for 100 ⁇ M of each peptide.
  • the BM36.1 cells are incubated for 18 h with 100 ⁇ M of each of the peptides. They are then incubated in the presence of BFA (10 ⁇ g / ml) for one hour in order to block the transport of newly synthesized HLA molecules on the cell surface.
  • BFA 10 ⁇ g / ml
  • BM36.1 cells are washed in PBS and taken up in culture medium containing 5% SNF and 0.5 ⁇ g / ml of BFA, which constitutes time 0. Cells are then removed, after 30 minutes, 1 h, 2 h, 4 h and 6 hours of incubation.
  • the relative amount of fixed peptide is then estimated at each time, for each of the peptides, by the measurement of stabilization of HLA-B35 on the cell surface. This measurement is carried out in flow cytometry using an anti-HLA-B / C antibody.
  • the time indicated in Table II corresponds to the time of 1/2 life of the peptide on HLA-B * 35. The results are illustrated in Figure 3, and Table II below. Table II
  • FIG. 3 legend: On the ordinate, the percentage of cell lysis obtained. On the abscissa the peptide concentration (in nM).
  • Tables I and II and of Figure 3 show that: * Three overlapping Melan-A peptides are recognized by the clone M28.10B. The most effectively recognized peptide is decapeptide 26-35 (EAAGIGILTV, SEQ ID NO: 8,). This Melan-A 26-35 peptide probably corresponds to the peptide naturally presented, in the context B * 3501, by the melanoma cells and recognized by the TILs of the M28 patient.
  • the peptide 312-320 which has been shown to be recognized by a CTL clone in the context of HLA-B * 3501 (MOREL et al, 1999, Int J Cancer, 83, 755-9), is not recognized by the clone TIL M171.100B.
  • epitopes of type 11-mer cells AARNOUDSE et al, 1999, Int.
  • the inventors analyzed their presentation by a panel of melanoma cell lines expressing the different antigens, from which are derived. these peptides, and the HLA-B * 3501 molecules. To increase the expression on the surface of cells of HLA molecules, the melanoma cells were preincubated, for certain experiments, 48 hours in medium containing 500 U / ml of IFN- ⁇ (Tebu, Paris, France).
  • the melanoma cell lines were established from fragments of metastatic tumors or of tumors having invaded the lymph nodes, and cultured in RPMI 1640 medium (Sigma, St Loins, USA) containing 10% fetal calf serum (Gibco-BRL, Cergy-Pontoise, France), penicillin (10 mg / ml), streptomycin (1 OU / ml) (Sigma) and L-glutamine (2nM) (Sigma, St Louis, USA) . The results are illustrated in FIG.
  • the specific clone of gplOO recognizes a melanoma line independently of treatment with IFN- ⁇ (M147). This clone also recognizes the lines M125 and M140 after treatment with IFN- ⁇ (weakly for Ml 25). The specific clone of NY-ESO-1 recognizes one of these lines spontaneously expressing this antigen (M47) and the other two lines after treatment with IFN- ⁇ (M131 and M140, FIG. 4).
  • the spontaneous recognition of the melanoma lines by the different CD8 T clones shows that the epitopes identified are naturally presented by these tumors.
  • the wild type ras peptides 55-64 w ⁇ (ILDTAGQEEY; SEQ ID NO: 34), the mutated decamer 55-64 Q61R , and the peptide MAGE-A3 (ENDPIGHLN; SEQ ID ⁇ O: 20) were obtained from SY ⁇ T: EM (Nîmes, France). The purity (> 85%) is checked by high yield liquid chromatography in reverse phase. The peptides are lyophilized, then dissolved in DMSO at 10 mg / ml and stored at -80 ° C.
  • the antigenicity of the peptide 55-64 Q61R and that of its wild type analogue (55-64 w ⁇ ), are evaluated by testing the capacity of these peptides to induce the growth of specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) by in vitro stimulation of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by dendritic cells (DC) pulsed with these peptides.
  • CTL cytotoxic T lymphocytes
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • DC dendritic cells
  • CD8 + lymphocytes are obtained from the PBMCs of an HLA-A * 0101 donor by negative sorting of CD4 + T cells on magnetic beads (MILTENY BIOTECH, France).
  • the dendritic cells are prepared from adherent PBMCs cultured for 7 days in 6-well culture plates containing RPMI culture medium supplemented with 10% fetal calf serum, 50 ng / ml of GM-CSF (SIGMA) and 50 ng / ml of IL-4 (SIGMA).
  • SIGMA GM-CSF
  • SIGMA GM-CSF
  • SIGMA IL-4
  • the maturation of the dendritic cells is induced for 2 days in an RPMI culture medium supplemented with 10% fetal calf serum, 10 ng / ml of TNF- ⁇ (SIGMA) and 100 ⁇ g / ml of Poly-IC (SIGMA).
  • the mature dendritic cells are incubated for 2 hours with 5 ⁇ g / ml of peptide ras 55-64 Q61R or of peptide ras 55-64 ⁇ ; they are then washed to remove the free peptides.
  • the dendritic cells pulsed with the peptide ras 55-64 Q61R or the peptide ras 55-64 w ⁇ are used to stimulate CD8 + lymphocytes (3.10 7 cells). 3 stimulations are performed one week apart.
  • Each culture well is tested for the presence of CTLs specific for the peptide.
  • 7 days after the last stimulation 2.10 6 BM36.1 cells and expressing HLA-A * 0101 (KELLY et al. Nature. 355. 641. 1992) previously incubated at 37 ° C for 12 hours in RPMI supplemented with 100 ⁇ M of peptide N-r ⁇ s 55-64 w ⁇ or 55-64 Q61R , 1 ⁇ M of ⁇ 2 microglobulin, and washed in PBS, are added to each well.
  • the specific CTL response to stimulation by the wild-type or mutated peptide Nr ⁇ zs is measured by assaying for interferon ⁇ (IFN- ⁇ ), as described by LAB ARRIERE et al. (Int. J. Cancer, 78, 209, 1998).
  • IFN- ⁇ interferon ⁇
  • Two of the five culture wells stimulated with the peptide ras show a proliferation of CTL specific for the peptide (0.3 and 0.5% of reactive cells per well), while no proliferation is observed in the wells stimulated with the peptide 55-64 w ⁇ .
  • EXAMPLE 7 PROPERTIES OF A PEPTIDE-INDUCED T-LYMPHOCYTE CLONE 55-64 Q61R Lymphocyte clones were obtained by limiting dilution from the cells of the culture well containing 0.5% of reactive T cells.
  • the capacity of the T cells from one of these clones to lyse BM36.1 cells presenting the peptide 55-64 Q IR or the peptide 55-64 ⁇ is evaluated according to a standard assay for the release of 51 Cr (HERIN et al. , Int. J. Cancer, 39, 390-396, 1987).
  • BM36.1 cells labeled with 51 Cr (Na2 51 CrO4, ORIS, Gif-sur-Yvette, France). The cells are then pulsed for 1 hour at 37 ° C. with 10 ⁇ M of peptide 55-64 ⁇ or peptide 55-64 Q61R , and washed.
  • the specificity of this clone with respect to cells expressing HLA-A * 0101 and the wild-type protein or the N-ras protein carrying the Q61R mutation is evaluated on transfected COS cells, or on HLA-A * melanoma cells. 0101, expressing or not the Q61R mutation.
  • a 334 bp cDNA coding for a fragment of the wild-type N-ras protein is obtained by PCR amplification, from complete cDNA of the wild-type N-ras protein.
  • a cDNA coding for a fragment of the protein Nr s mutated at position 61 by substitution of glutamine with an arginine is obtained by site-directed mutagenesis.
  • the wild-type or mutated cDNA is inserted into the vector pcDNA3 and amplified in the bacterial strain E. coli TOP 10 F '(INVITROG ⁇ N, reference C2020-03).
  • a cDNA coding for the molecule HLA-A * 0101 is introduced into the vector pcDNA 3.1 (INVITROG ⁇ N, reference CV790-20).
  • COS-7 cells are co-transfected with these constructs as described below:
  • COS-7 cells (BRICHARD et al, J. ⁇ xp. Med., 178, 489, 1993) are cultured in DM ⁇ M medium (BIOWHITTAK ⁇ R) containing 10% fetal calf serum, 100 U / ml of penicillin, 100 ⁇ g / ml of streptomycin (SIGMA, St Louis, USA) and 2 mM of glutamine-L (SIGMA, St Louis, USA).
  • DM ⁇ M medium containing 10% fetal calf serum, 100 U / ml of penicillin, 100 ⁇ g / ml of streptomycin (SIGMA, St Louis, USA) and 2 mM of glutamine-L (SIGMA, St Louis, USA).
  • COS cells are co-transfected with 100 ng of a mixture of the pcDNA 3.1 vector expressing HLA-A * 0101 and a pcDNA3 vector expressing the wild-type or mutated N-r ⁇ s protein, by the chloroquine-dextran process D ⁇ A ⁇ (BRICHARD et al, J. ⁇ xp. Med., 178, 489, 1993; S ⁇ D et al, PNAS, 84, 3365, 1987,). The details of this method are described by DE PLAEN et al. (Methods, 12, 125, 1997).
  • TNF The stimulation of T cells is measured by assaying TNF (DE PLAEN et al, Methods, 12, 125, 1997; LABARRIERE et al, Int. J. Cancer, 78, 209, 1998). 2.10 3 to 10 4 cells of the tested T clone are added to 3.10 4 COS cells, 48 hours after transfection, or to 3.10 4 melanoma cells. The culture supernatants are recovered 6 hours later and their TNF content is determined by measuring their cytotoxic effect on clone 13 of the WEHI 164 murine fibrosarcoma (BRICHARD et al, J. Exp. Med., 178, 489, 1993) by MTT colorimetric assay.
  • FIG. 5a The results obtained with the transfected COS cells are presented in FIG. 5a: on the abscissa, peptides ras of wild type or mutated at position 61 by substitution of glutamine with an arginine; ordinate, concentration of TNF in pg / ml
  • the results show that the T cells of the clone are strongly stimulated by the cells expressing the protein Nr -s Q61R, whereas only a weak stimulation with the protein N- is observed wild ras.
  • a CD8 + T clone from a TIL population of melanoma recognizes an undescribed peptide derived from the gplOO antigen, in the context A * 0101 (PLDCVLYRY, SEQ ID NO: 20).
  • the antigenicity of this peptide was tested by evaluating the ability of the clone to lyse BM36.1 cells presenting the peptide of interest in the context of HLA-A * 0101.
  • BM36.1 cells are labeled for 1 h at 37 ° C. with 100 Ci of 51 Cr (Na2 51 CrO4, ORIS, Gif-sur-Yvette, France). The cells are then pulsed for 20 minutes with the various synthetic peptides.
  • 10 3 BM36.1 cells thus treated are incubated with 10 4 T cells of the clone (Effector: Target ratio of 10: 1) for 4 hours.
  • the culture supernatants are recovered and the amount of 51 Cr released is evaluated using a ⁇ plate counter (EG&G Wallac, Evry, France).
  • a negative control is carried out with an irrelevant peptide.
  • this peptide is included in the sequence of the decamer recognized in the context B * 3501, but this peptide is not recognized by the clone M28.9B.
  • the peptide VPLDCVLYRY (SEQ ID NO: 13) is also recognized in the context A * 0101 by the clone M199.6.12 (Table I and Figure 6).
  • the spontaneous recognition by the clone Ml 99.6.12, of melanoma lines sharing HLA-A * 0101 shows that this epitope is effectively presented by these tumors.

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Abstract

L'invention concerne l'utilisation de peptides immunogènes représentant des épitopes T présentés par le CMH I, dérivés des antigènes Melan-A, MAGE-A6, gp100, tyrosinase et NY-ESO-1 dans le cadre du diagnostic ou du traitement des mélanomes chez des sujets HLA-B35.

Description

PEPTIDES UTILISABLES EN IMMUNOTHERAPIE ANTITUMORALE
La présente invention est relative à des peptides représentant des épitopes partagés d'antigènes tumoraux, et à leur utilisation en immunothérapie. La vaccination ou immunothérapie peptidique est une approche thérapeutique qui fait actuellement l'objet d'un grand intérêt dans le cadre de la prévention ou du traitement des cancers. Son principe repose sur l'immunisation par des peptides reproduisant des épitopes T d'antigènes associés aux tumeurs (TAA) reconnus par les lymphocytes T cytotoxiques (CTL), qui jouent un rôle majeur dans l'élimination des cellules cancéreuses exprimant ces antigènes à leur surface.
On rappellera que les CTLs ne reconnaissent pas les antigènes protéiques entiers, mais des fragments peptidiques de ceux-ci, présentés par les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) exprimées à la surface de différentes cellules. Ce sont ces fragments peptidiques qui constituent les épitopes T. Les peptides présentés par le complexe majeur d'histocompatibilité de classe I (CMH I) ont généralement 8 à 11 acides aminés, et sont reconnus par les cellules T CD8+, qui représentent la composante majeure de la réponse cytotoxique. Les peptides présentés par le complexe majeur d'histocompatibilité de classe II (CMH II) ont généralement 13 à 18 acides aminés et sont reconnus par les cellules T CD4+. L'identification de ces épitopes, et notamment de ceux présentés par le CMH I (compte tenu du rôle essentiel de la réponse CD8+ dans la cytotoxicité), constitue donc une étape essentielle pour le développement de compositions d'immunothérapie anti-tumorale. Dans le cas des mélanomes, on a identifié deux classes principales d'antigènes associés aux mélanomes (MAA) : les antigènes spécifiques des mélanomes, peu ou pas exprimés dans les tissus normaux, et les antigènes de différenciation mélanocytaire qui sont également exprimés par les mélanocytes (pour revue, voir CASTELLI et al., 2000, J Cell Physiol, 182, 323-31 ; KIRKIN ét al, 2002, Cancer Invest, 20, 222-36). Les antigènes de différenciation mélanocytaire, comme Melan-A/MART-1, gp-100 et la tyrosinase, sont exprimés par une proportion importante des tumeurs de type mélanome. En outre, ces antigènes sont reconnus efficacement aussi bien par les CTLs de sujets sains que par ceux des patients atteints de mélanome (BENLALAM et al, 2001, Ewr JImrnunol, 31, 2007-15 ; KAWAKAMI et al., 2000, J Immunother, 23, 17-27 ; LABARRIΕRΕ et al., 1998, Int J Cancer, 78, 209-15 ; PITTΕT et al, 1999, J Exp Med, 190, 705-15 ; VALMORI et al., 2002, Cancer Res, 62, 1743-50). On connaît à l'heure actuelle, plus de trente épitopes de ces antigènes reconnu par les CTLs, dont près des deux tiers sont présentés dans le contexte HLA-A*0201.
Les antigènes spécifiques des mélanomes incluent des familles d'antigènes dits « partagés par les cancers et les testicules » : MAGE, GAGE, BAGE et LAGE. Ces antigènes, qui sont exprimés par différentes tumeurs, génèrent des épitopes CTL présentés dans une grande variété de contextes HLA, y compris HLA-B et C (KIRKIN et al, 2002). A l'exception de NY-ESO-1 (JAGER et al, 1998, JExp Med, 187, 265-70), et à la différence des antigènes de différenciation mélanocytaire, les antigènes partagés par les cancers et les testicules sont rarement reconnus par les lymphocytes infiltrant les tumeurs (TILs). L'identification de la plupart des épitopes présents chez ces antigènes s'est effectuée à l'aide de CTLs générés ex-vivo par stimulation répétée de lymphocytes du sang périphérique (PBL) par des cellules présentatrices (CPA) chargées avec des antigènes (SCHULTZ et al, 2001, Tissue Antigens, 57, 103-9), à l'exception des épitopes de MAGE-A6 et MAGE-A12, puisqu'ils ont été identifiés avec des clones CTLs dérivés de TILs (PANELLI et al, 2000, J Immunol, 164, 4382-92; ZOON & HERCEND, 1999, EwrJ Immunol, 29, 602-7).
Jusqu'à présent, la plupart des essais d'immunothérapies peptidiques sur les mélanomes ont été effectuées dans le contexte HLA-A*0201 ou HLA-A*0101 et en n'utilisant qu'un nombre limité d'épitopes de TAA (LAU et al, 2001, J Immunother, 24, 66-78 ; MACKΕNSΕN et al, 2000, Int J Cancer, 86, 385-92 ; MARCHAND et al, 1999, Int J Cancer, 80, 219-30 ; PANΕLLI et al, 2000, J Immunother, 23, 487-98 ; ROSΕNBΕRG et al, 1998, JNatl Cancer Inst, 90, 1894-900 ; SALGALLΕR et al, 1996, Cancer Res, 56, 4749-57). Or, la sous-expression d'allèles HLA, et l'apparition de variants de TAA ayant perdu les épitopes reconnus par les CTLs pourraient constituer des mécanismes permettant l'échappement des cellules tumorales, vis à vis du système immunitaire (FΕRRONΕ & MARINCOLA, 1995, Immunol Today, 16, 487-94 ; MAΕURΕR ét al, 1996, Clin Cancer Res, 2, 641-52), ce qui pourrait expliquer la faible efficacité des vaccins utilisant des peptides. Pour pallier cet inconvénient, il a été proposé d'utiliser des vaccins polyvalents composés d'une multitude de peptides issus de différents TAA et présentés dans des contextes HLA variés. Toutefois, ceci nécessite l'identification de nouveaux complexes peptides/HLA qui soient efficacement présentés par les cellules tumorales. En outre, l'identification de peptides présentés dans différents contextes HLA permet également de développer des outils permettant de mesurer la réponse des cellules T chez les patients immunisés. En effet, si l'identification de nouveaux peptides antigéniques est essentielle pour augmenter la disponibilité et l'efficacité des vaccins, elle l'est aussi pour améliorer le suivi de la réponse CTL des patients qui ont été immunisés avec des peptides ou d'autres formes d'antigènes, comme des protéines recombinantes complètes ou des virus recombinants.
Dans la mesure où HLA-B35 constitue l'un des allèles HLA-B les plus fréquents, présent chez environ 20% de la population caucasienne (dont 60% correspond à l'allèle B*3501 ; MORI et al, 1997, Transplantation, 64, 1017-27), l'identification de nouveaux peptides antigéniques présentés dans le contexte HLA-B35 est très souhaitable pour le développement de l'immunothérapie cancéreuse.
Les Inventeurs ont identifié de nouveaux épitopes, qui sont dérivés d'antigènes mélanocytaires ou d'antigènes partagés par les cancers et les testicules, et qui sont présentés dans le contexte HLA-B35.
Les peptides reproduisant ces épitopes peuvent être utilisés dans un but diagnostique ou thérapeutique, dans le cadre de la prévention ou du traitement de mélanomes chez des patients exprimant un allèle HLA-B35, en particulier HLA-B*3501 ou HLA-B*3503. La présente invention a pour objet l'utilisation d'au moins un peptide immunogène représentant un épitope T présenté par le CMH I, choisi parmi : a) un peptide comprenant la séquence EXιAGIGILX2 (SEQ ID NO : 1) dans laquelle Xj représente A ou P, et X2 représente T ou Y, capable d'induire une réponse cytotoxique dirigée contre l'antigène Melan-A ; b) un peptide comprenant la séquence ENDPIGHNY (SEQ ID ΝO : 2), capable d'induire une réponse T cytotoxique dirigée contre l'antigène MAGE-A6 ; c) un peptide comprenant la séquence NPLDCNLYR (SEQ ID ΝO : 3), capable d'induire une réponse cytotoxique dirigée contre l'antigène gplOO ; d) un peptide comprenant la séquence TPRLPSSADNEF (SEQ ID ΝO : 4) capable d'induire une réponse cytotoxique dirigée contre l'antigène tyrosinase ; e) un peptide comprenant la séquence MPFATPMEA (SEQ ID ΝO : 5), capable d'induire une réponse cytotoxique dirigée contre l'antigène ΝY-ESO-1; pour l'obtention d'un médicament destiné à l'immunothérapie anti-tumorale chez un patient HLA-B35. Avantageusement, ledit médicament est destiné au traitement des mélanomes. Avantageusement, on pourra utiliser :
- au moins un peptide a) répondant à une séquence choisie parmi : TAEEAAGIGILTV (SEQ ID NO : 6), EAAGIGILTVIL (SEQ ID NO : 7), EAAGIGILTV (SEQ ID NO : 8), EAAGIGILTY (SEQ ID NO : 9), EAAGIGILY (SEQ ID NO : 10), EPAGIGILTY (SEQ ID NO : 1 1), EPAGIGILTV (SEQ ID NO : 12) ; - un peptide b) répondant à la séquence ENDPIGHNY (SEQ ID ΝO : 2) ;
- au moins un peptide c) répondant à une séquence choisie parmi NPLDCNLYR (SEQ ID ΝO : 3) et NPLDCNLYRY (SEQ ID ΝO : 13) ;
- au moins un peptide d) répondant à une séquence choisie parmi TPRLPSSADNEFCL (SEQ ID ΝO : 14) et TPRLPSSADNEF (SEQ ID ΝO : 4) ; - au moins un peptide e) répondant à une séquence choisie parmi : LAMPFATPMEAEL (SEQ ID ΝO : 15), LAMPFATPMEAE (SEQ ID ΝO : 16), MPFATPMEAEL (SEQ ID ΝO : 17), MPFATPMEAE (SEQ ID ΝO : 18), et MPFATPMEA (SEQ ID ΝO : 5). Selon un mode de mise en œuvre préféré de la présente invention, on utilise une combinaison comprenant au moins deux peptides de deux catégories différentes parmi les catégories a), b), c), d) ou e) définies ci-dessus, afin d'être en mesure d'induire une réponse cytotoxique contre au moins deux antigènes tumoraux. La présente invention a également pour objet une composition multi-épitopique associant au moins deux peptides de deux catégories différentes parmi les catégories a) b) c) d) ou e) ci-dessus. Avantageusement, ces compositions comprennent au moins un peptide de chacune de ces catégories a) b) c) d) ou e). Des compositions multi-épitopiques conformes à l'invention peuvent également comprendre un ou plusieurs autre(s) peptides immunogène(s), issus des antigènes mentionnés ci-dessus, ou d'antigènes différents. Ces peptides peuvent représenter des épitopes issus du même antigène, ou de deux ou plusieurs antigènes différents. A titre d'exemple, on citera le peptide ENDPIGHLY (SEQ ID ΝO : 19), qui représente un épitope de MAGE-A3, déjà connu comme pouvant être présenté dans un contexte HLA-B35 (Demande PCT WO 01/53833).
Ces compositions peuvent également comprendre, pour être plus largement utilisables sur une population dont les individus portent des allèles HLA différents, un ou plusieurs peptides présentés par des molécules du CMH I autres que HLA-B35. A titre d'exemple, on citera le peptide PLDCNLYRY (SEQ ID ΝO : 20), décrit ci-après. Des compositions multi-épitopiques conformes à l'invention peuvent notamment se présenter sous forme d'un polypeptide chimérique comprenant une ou plusieurs copies de chacun des épitopes choisis.
Des polypeptides chimériques conformes à l'invention peuvent être facilement obtenus par des méthodes connues en elles-mêmes, et notamment par les techniques classiques de l 'ADN recombinant.
La présente invention a également pour objet un polynucléotide codant pour un polypeptide chimérique conforme à l'invention, ainsi qu'un vecteur d'acide nucléique contenant ledit polynucléotide. La présente invention englobe également l'utilisation dudit polynucléotide ou dudit vecteur d'acide nucléique en immunothérapie antitumorale.
Des exemples non limitatifs de mise en œuvre de la présente invention sont indiqués ci- après.
On peut par exemple injecter au patient à traiter un peptide, un polypeptide chimérique, ou une composition multi-épitopique tels que définis ci-dessus, éventuellement associés à un adjuvant approprié.
On peut également utiliser l'un des peptides définis ci-dessus pour charger in vitro des cellules présentatrices de l'antigène professionnelles HLA-B35, notamment des cellules dendritiques, afin d'induire la prolifération de CTLs anti-tumeurs, comme décrit par exemple par BAKKER et al. (Cancer Res., 55, 5330-5334, 1995) ou NAN ELSAS et al. (Eur. J. Immunol, 26, 1683-1689, 1996).
Les cellules présentatrices de l'antigène HLA-B35 chargées de la sorte font également partie de l'objet de la présente invention. Les polynucléotides conformes à l'invention de préférence intégrés dans des vecteurs d'acide nucléique, notamment des vecteurs viraux tels que des adénovirus, peuvent également être administrés par injection au patient à traiter.
Un polynucléotide comprenant une séquence codant pour un peptide défini par l'une des séquences SEQ ID NO: 1 à 18 ci-dessus, et notamment un polynucléotide codant pour un polypeptide chimérique conforme à l'invention, peut également être utilisé pour transfecter in vitro des cellules présentatrices de l'antigène professionnelles HLA-B35, notamment des cellules dendritiques, qui sont ensuite injectées au patient, comme décrit par exemple par KAPLAN et al (J. Immunol., 163(2), 699-707, 1999) ou KIM et al. (Armais of Surgical Oncology, 5(1), 64-76, 1998). Ces cellules présentatrices de l'antigène transfectées font également partie de l'objet de la présente invention.
La présente invention englobe aussi l'utilisation des peptides définis ci-dessus, pour la détection in vitro de CTLs dirigés contre un ou plusieurs des antigènes Melan-A, MAGE- A6, gplOO, tyrosinase, et NY-ESO-1, dans un prélèvement biologique obtenu à partir d'un sujet HLA-B35. Ces peptides peuvent également être utilisés pour réaliser le tri spécifique de ces CTLs.
Les CTLs ainsi isolés peuvent ensuite être amplifiés in vitro et réinjectés en grand nombre (de l'ordre du milliard) au patient.
La présente invention a également pour objet des compositions thérapeutiques comprenant, en tant que principe actif, un peptide ras muté, une composition multi-épitopique, un polypeptide chimérique, un polynucléotide, ou une cellule présentatrice de l'antigène conforme à l'invention.
Les compositions thérapeutiques conformes à l'invention peuvent comprendre en outre les excipients usuels, ainsi que des adjuvants habituellement utilisés en immunothérapie, et permettant par exemple de favoriser l'administration du principe actif, de le stabiliser, d'augmenter son immunogénicité, etc.
Parmi les peptides des catégories a), b), c), d), et e) mentionnées ci-dessus, certains étaient déjà connus comme capable d'induire une réponse CTL, mais dans d'autres contextes que HLA-B35.
D'autres n'avaient jamais été décrits comme des épitopes capables d'induire une réponse T cytotoxique et n'avaient donc pas été isolés. Il s'agit des peptides suivants:
- les peptides EAAGIGILTY (SEQ ID NO : 9), EAAGIGILY (SEQ ID NO : 10), EPAGIGILTY (SEQ ID NO : 11), EPAGIGILTV (SEQ ID NO : 12) ;
- les peptides NPLDCNLYR (SEQ ID ΝO : 3) et NPLDCNLYRY (SEQ ID ΝO : 13) ; - les peptides TPRLPSSADNEFCL (SEQ ID ΝO : 14)et TPRLPSSADNEF (SEQ ID ΝO : 4).
La présente invention englobe également ces peptides particuliers, ainsi que toute composition multi-épitopique comprenant au moins un de ces peptides. Ceci inclut notamment des polypeptides chimériques contenant au moins un de ces peptides. Les polynucléotides codant pour ces polypeptides chimériques, et les vecteurs d'acide nucléique contenant ces polynucléotides font aussi partie de l'objet de la présente invention. Les inventeurs ont en outre constaté que le peptide NPLDCVLYRY (SEQ ID ΝO : 13) issu de l'antigène gplOO, était aussi reconnu, dans le contexte HLA*A0101, par un clone T CD8 (M199.6.12) issu d'une population de TILs de mélanome. A partir de ce peptide, ils ont identifié un peptide plus court, (PLDCNLYRY, SEQ ID ΝO : 20), qui n'est pas reconnu dans le contexte HLA-B35, mais est très efficacement reconnu dans le contexte A*0101. Le peptide SEQ ID ΝO : 20 fait également partie de l'objet de la présente invention, ainsi que les polypeptides chimériques contenant au moins ce peptides. Les polynucléotides codant pour ces polypeptides chimériques, et les vecteurs d'acide nucléique contenant ces polynucléotides font aussi partie de l'objet de la présente invention. Ce peptide, les polypeptides chimériques le contenant, ainsi que les polynucléotides codant pour ces polypeptides chimériques peuvent être employés dans le cadre de la détection ou du traitement de mélanomes chez des sujets HLA-A1, et notamment HLA*A0101, selon les mêmes techniques que celles indiquées ci-dessus pour les peptides reconnus dans le contexte HLA-B35.
D'autre part, des études effectuées sur des modèles animaux ont permis d'identifier d'autres antigènes de rejet tumoral, dont un grand nombre sont des protéines mutées oncogènes (PREHN et al, J. Natl. Cancer Inst, 18, 769, 1998 ; DE PLAEN et al, PNAS, 85, 2274, 1988 ; DUBEY et al, J. Exp. Med., 185, 695, 1997). La présentation par des molécules du CMH des fragments mutés de ces protéines à la surface des cellules tumorales induit la destruction spécifique de celles-ci par les CTLs et le rejet de la tumeur. Chez l'homme, les protéines mutées oncogènes apparaissent également comme des cibles particulièrement intéressantes pour l'immunothérapie anti-tumorale. Toutefois, ceci implique d'identifier les épitopes présentés à la surface des cellules tumorales et capables d'induire une réponse T cytotoxique.
Parmi les oncogènes les plus fréquemment impliqués dans différents types de tumeurs, on citera les oncogènes ras (K-ras, H-ras et N-ras) qui résultent de mutations ponctuelles (substitution d'un seul acide aminé) des proto-oncogènes ras p21. Ces mutations interviennent essentiellement au codon 12, au codon 13, ou au codon 61 (BOS, Cancer Res., 49, 4682, 1989 ; WEIJZEN et al, Leukemia, 13, 502, 1999). Du fait du nombre limité de substitutions oncogéniques pouvant intervenir, des mutations ras présentes dans de nombreuses tumeurs identiques peuvent ainsi générer des épitopes tumoraux partagés, présentés par une fraction significative de tumeurs humaines (WEIJZEN et al, Leukemia, 13, 502, 1999).
Il a ainsi été proposé d'utiliser en immunothérapie anti-tumorale des peptides synthétiques reproduisant des épitopes ras mutés. Ainsi, la demande PCT WO 92/14756 propose l'utilisation de peptides reproduisant des épitopes ras mutés au codon 12 ou au codon 61. Toutefois ces épitopes sont présentés par le CMH II (DQ et DR), et induisent donc une réponse CD4+. Or, bien qu'il puisse être avantageux d'induire ce type de réponse, dans la mesure où les lymphocytes auxiliaires CD4+ permettent d'augmenter la réponse cytotoxique (WALTER et al, N. Engl. J. Medicine, 333, 1038, 1995), la réponse CD8+ demeure l'acteur essentiel de la cytotoxicité. En outre, des études récentes effectuées chez la souris suggèrent que l'immunisation avec des peptides présentés par le CMH II pourrait induire une stimulation de la croissance tumorale au lieu de la protection espérée (SIEGEL ét al, J. Exp. Med., 191, 1945, 2000). Plusieurs épitopes ras mutés aux positions 12, 13 ou 61 ont sélectionnés sur la base de leur capacité d'ancrage à des molécules du CMH de classe I (NAN ELSAS et al, Int. J. Cancer, 61, 389, 1995 ; BERGMANN et al, Cell Immunol., 187, 103, 1998 ; GOUTTEFANGEAS et al, Human Immunol, 55, 117, 1997). Les peptides ainsi sélectionnés peuvent stimuler la croissance de CTLs spécifiques à partir de PBL in vitro. Mais ces CTLs reconnaissent faiblement les cellules tumorales mutées, suggérant que l'expression endogène de ces épitopes est limitée (VAN ELSAS et al, Int. J. Cancer, 61, 389, 1995 ; ABRAMS et al, Cell Immunol, 182, 137, 1997 ; BERGMANN et al, Cell Immunol, 187, 103, 1998), et qu'ils ne permettent donc pas l'élimination efficace des cellules tumorales par des CTLs spécifiques, ce qui limite considérablement leur intérêt en immunothérapie.
Il apparaît donc nécessaire de disposer d'autres épitopes ras mutés restreints au CMH I et présentés efficacement par une fraction significative de tumeurs humaines. Les Inventeurs ont maintenant identifié un épitope ras muté en position 61 par substitution d'une glutamine par une arginine (Q61R), et restreint au CMH I. Cet épitope, dénommé ci- après 55-64Q 1R est présenté efficacement par plusieurs lignées de mélanome HLA- A*0101+ exprimant un oncogène ras portant la mutation Q61R. Il est capable d'induire spécifiquement l'expansion de clones de lymphocytes infiltrant les tumeurs (TIL) obtenus à partir de ces mélanomes. De plus, les cellules dendritiques chargées avec ce peptide stimulent de façon efficace des CTLs spécifiques à partir de lymphocytes du sang périphérique (PBL) de donneurs sains HLA-A*0101, et ces CTLs reconnaissent toutes les lignées de mélanomes HLA-A*0101 exprimant l 'oncogène ras Q61R, et ne reconnaissent pas les cellules exprimant la protéine ras non-mutée. Le peptide 55-64Q61R ne possède pas une capacité d'ancrage supérieure à celle du peptide de type sauvage correspondant. L'affinité de liaison à HLA-A*0101 du peptide de type sauvage est similaire à celle du peptide 55-64Q61R. Cependant, même à concentrations élevées, ce peptide de type sauvage ne peut induire ni l'expansion de TIL spécifiques, ni celle de CTLs spécifiques. Il apparaît donc que la substitution d'une glutamine par une arginine en position 61 crée un nouvel épitope présenté par HLA-A*0101. En outre, une analyse effectuée sur la banque de données BIMAS (http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind ; PARKER et al, J. Immunol. 152, 163, 1994;, montre que ce peptide a un score de liaison identique pour HLA-A*0101 et HLA-B*1501. En conséquence, la présente invention a également pour objet l'utilisation d'un peptide ras muté immunogène de séquence ILDTAGREEY (SEQ ID NO : 35) pour l'obtention d'un médicament destiné au traitement immunothérapique de tumeurs chez un patient HLA- A*0101 ou HLA-B* 1501, : Avantageusement, ledit médicament est utilisable pour le traitement de tumeurs exprimant une protéine K-ras, H-ras ou N-rαs mutée par substitution de la glutamine en position 61 par une arginine.
On citera notamment les mélanomes, ainsi que d'autres tumeurs dans lesquelles les mutations ras affectant le résidu 61 sont détectées avec une fréquence élevée, telles que les nεevi mélanocytiques congénitaux (PAPP et al, Journal of Médical Genetics, 36, 610, 1999), les myélomes multiples (BEZIEAU et al, Hum. Mutât., 18, 281, 2001), et les tumeurs de la thyroïde (ESAPA et al, Cinical Endocrinology, 50, 529, 1999). Ledit peptide est utilisable notamment dans le cadre de compositions multi-épitopiques, et en particulier de polypeptides chimériques, comme mentionné ci-dessus. Un polynucléotide codant pour un tel polypeptide chimérique, ainsi qu'un vecteur d'acide nucléique contenant ledit polynucléotide peuvent également être utilisés comme mentionné ci-dessus.
Ledit peptide ou ledit polynucléotide peuvent aussi être utilisés respectivement pour charger ou transfecter in vitro des cellules présentatrices de l'antigène HLA-A*0101 ou HLA-B* 1501 professionnelles, afin d'induire la prolifération de CTLs anti-tumeurs. Les cellules présentatrices de l'antigène, HLA-A*0101 ou HLA-B*1501 chargées ou transfectées de la sorte font également partie de l'objet de la présente invention. Ledit peptide ras muté peut également être utilisé pour détecter in vitro des CTLs dirigés contre l'antigène ras muté dont il est issu, dans un prélèvement biologique obtenu à partir d'un sujet HLA-A*0101 ou HLA-B*1501. Il peut également être utilisé pour réaliser le tri spécifique de ces CTLs.
La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant les propriétés de peptides ras mutés conformes à l'invention utilisables en immunothérapie, par la mise en œuvre du procédé conforme à l'invention.
EXEMPLE 1 : MISE EN EVIDENCE D'EPITOPES ANTIGENIQUES PRESENTES DANS LE CONTEXTE HLA-B35 ET RECONNUS PAR DES CLONES CTLS :
Lors d'une étude précédente (BENLALAM et al, 2001), les inventeurs ont obtenu des clones de TILs CD8+ restreints à HLA-B35, et reconnaissant respectivement les antigènes Tyrosinase (TIL M171), Melan-A (TIL M171 and M28), et gplOO (TIL M171, M28 et Ml 10). Ils ont complété cette collection de clones par un clone reconnaissant MAGE-A3/MAGE- A6 (TIL-M171) et un clone reconnaissant NY-ESO-1 (TIL Ml 18). La réponse de ces différents clones TIL vis-à-vis de cellules COS-7 co-transfectées avec l'antigène et l'allèle HLA-B35 pertinents est détectée par mesure de leur production de TNF. Les cellules COS-7, cultivées dans du milieu DMEM (Sigma) contenant 10% de sérum de veau fœtal, des antibiotiques et de la L-glutamine, ont été transfectées par l'ADNc codant pour l'un des allèles HLA-B*3501, HLA-B*3503, HLA-B*3508, seul ou en association avec un ADNc codant pour l'un des antigènes MAGE-A3, MAGE-A6, tyrosinase, Melan- A/MART-1, gp-100, et NY-ESO1/LAGE-2. La transfection a été effectuée selon le protocole décrit par DE PLAEN et al. (Methods, 12, 125-42, 1997). 16,5 103 cellules COS-
7 ont été transfectées avec 100 ng de plasmide pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA), contenant l'ADNc de l'allèle HLA-B*35 concerné, et, pour la co-transfection, 100 ng de plasmide contenant l'ADNc codant pour l'antigène choisi.
Ces cellules COS-7 ont été utilisées 48h après transfection pour stimuler les différents clones TILs (2x103 à 104). Les surnageants de culture ont été prélevés 6 heures plus tard et leur concentration en TNF a été déterminée par mesure de la cytotoxicité de ces surnageants de culture pour le clone 13 WEHI 164, comme décrit par DE PLAEN et al.
(1997, précité).
Les résultats sont illustrés par la Figure 1. En ordonnée, la concentration de TNF en pg/ml
En abscisse les différentes populations de TIL
D: Sécrétion de TNF par les clones TIL en présence des cellules COS-7 transfectées uniquement par un ADNc codant pour une molécule HLA-B35.
H: Sécrétion de TNF par les clones TILs en présence des cellules COS-7 co-transfectées avec un ADNc codant pour une molécule HLA-B35 et un ADNc codant pour un MAA.
Deux clones (M171.95B and M28.10B), reconnaissent un complexe Melan-A/B*3501, un clone (M28.9B) reconnaît un complexe gpl00/B*3501, un clone (M171.100B) reconnaît un complexe tyrosinase/B*3501, un clone (M171.8C) reconnaît un épitope MAGE-A3 et MAGE-A6 dans le contexte B*3501 et un clone (Ml 18.45) reconnaît un épitope NY-ESO-
I dans les contextes B*3501 et B*3503.
EXEMPLE 2 : IDENTIFICATION DES EPITOPES ANTIGENIQUES PRESENTES DANS LE CONTEXTE HLA-B35.
Pour identifier les régions codant pour les épitopes reconnus par les clones TILs, les inventeurs ont construit une série de fragments des ADNc des différents MAAs. Les fragments d'ADNc Melan-A/MART-1 et NY-ESO-1 ont été obtenus par digestion à l'exonucléase III : les plasmides comprenant l'ADNc codant pour Melan-A/MART-1 ou NY-ESO-1 ont été ouverts par Xbal et Apal, ou SpHI et Notl respectivment. Les fragments obtenus ont ensuite été digérés par l'exonucléase III à l'aide du système Erasea-base (Promega, Madison, WI).
Un fragment de restriction de gp-100 (1156-1986) contenant les nucléotides situés entre le site Kpnl 1156 pb en aval du codon d'initiation, et la fin de la séquence codante, a été généré par digestion enzymatique par Kpnl.
Les fragments d'ADNc correspondant aux fragments des antigènes tyrosinase et gplOO ont été obtenus par PCR à partir des plasmides contenant la séquence complète codant pour chacun de ces deux antigènes. L'expression de ces différents fragments par les cellules COS-7 s'effectue comme dans l'exemple 1. Les réponses des différents clones TILs vis-à-vis de ces cellules COS-7 co- transfectées avec les fragments d'antigène et l'allèle HLA-B35 pertinents sont mesurées comme dans l'exemple 1. Les résultats sont illustrés dans la figure 2 : Les positions des régions des ADNc codant pour les épitopes potentiels sont indiquées en paires de bases.
D: Fragment reconnu par des clones CTLs spécifiques (sécrétion de TNF significative). 0: Fragment non reconnu par des clones CTLs spécifiques (sécrétion de TNF non- significative).
II apparaît que les différentes populations TILs reconnaissent des épitopes qui sont codés respectivement par le fragment d'ADNc Melan-A s 'étendant des nucléotides 95 à 119
(acides aminés 32 à 39), le fragment d'ADNc gplOO 1200 à 1601 (acides aminés 400 à 533), le fragment d'ADNc tyrosinase 937 à 975 (acides aminés 313 à 325) et le fragment d'ADNc NY-ESO-1 259 à 339 (acides aminés 87 à 113).
EXEMPLE 3 : IDENTIFICATION DES PEPTIDES ANTIGENIQUES PRESENTES DANS LE CONTEXTE HLA-B35.
Les peptides de type sauvage et modifié dont les séquences sont indiquées dans le Tableau I ci-dessous ont été obtenus auprès de EPYTOP (Nîmes, France). La pureté (> 70%) est contrôlée par chromatographie liquide à haut rendement en phase inverse (HPLC). Les peptides sont lyophilisés, puis dissous dans du DMSO à 10 mg/ml et stockés à -80°C.
La réponse des différents clones TIL a été évaluée, par un test de relargage de TNF, après
6 heures de co-culture avec des cellules EBN exprimant une molécule HLA-B*3501 chargée avec lOμM du peptide d'intérêt. Les résultats sont réunis dans le tableau I.
Tableau I
Figure imgf000012_0001
D'autre part, Pantigénicité des peptides a été testée en évaluant la capacité des clones TILs à lyser des cellules BM36.1 (KELLY et al, 1992, Nature, 355, 641-4), qui sont déficientes en transporteur TAP, et qui expriment naturellement HLA-B*3501 et HLA-A*0101. Les cellules BM36.1 sont marquées pendant lh à 37°C avec 100 Ci de 51Cr (Na251CrO4, ORIS, Gif-sur- Yvette, France). Les cellules sont ensuite puisées pendant 20 minutes avec les différents peptides synthétiques. 103 cellules BM36.1 ainsi traitées sont incubées avec 104 cellules T du clone (rapport Effecteur :Cible de 10 :1) pendant 4 heures. Les surnageants de culture sont récupérés et la quantité de 51Cr libéré est évalué à l'aide d'un compteur de plaque β (EG&G Wallac, Evry, France). Pour chaque clone TIL, un contrôle négatif est effectué avec un peptide non-pertinent. La quantité de peptide nécessaire pour obtenir 50% de la lyse maximale (EC50) a été déterminée. D'autre part, l'affinité et la stabilité des peptides pour le HLA-B35 ont été mesurées comme décrit par TOURDOT et al, Eur. J. Immunol., 30 :3411-3421, 2000). Pour mesurer l'affinité des peptides, les cellules BM36.1 sont incubées pendant 18h avec une gamme de concentrations de chaque peptide. Les cellules BM36.1 sont parallèlement incubées avec une gamme d'un peptide de référence, se fixant au HLA-B35 (peptide 37F, TAKAMIYA et al, Int. Immunol, 6 : 255-261, 1994 ; SCHÔNBACH et al, J. Immunol, 154 : 5951-5958, 1995). La quantité relative de peptide fixée est ensuite estimée à chaque concentration, pour chacun des peptides, par la mesure de stabilisation du HLA-B35 à la surface cellulaire. Cette mesure est effectuée en cytométrie de flux à l'aide d'un anticorps anti HLA-B/C (qui ne reconnaît dans le cas des cellules BM36.1 que le HLA-B*3501, ces cellules n'exprimant spontanément aucune molécule HLA-C). On calcule ensuite le % de liaison au B*35 pour chaque concentration, en fixant le 100% de liaison pour 100 μM de chaque peptide. L'affinité relative (RA) est ensuite déterminée de la façon suivante : RA = [concentration de peptide] pour 20% de liaison/ [concentration du peptide 37F] pour 20%o de liaison.
Pour mesurer la stabilité des peptides, les cellules BM36.1 sont incubées 18h avec 100 μM de chacun des peptides. Elles sont ensuite incubées en présence de BFA (10 μg/ml) pendant une heure afin de bloquer le transport de molécules HLA nouvellement synthétisées à la surface cellulaire. Les cellules BM36.1 sont lavées en PBS et reprises dans du milieu de culture contenant 5% SNF et 0.5 μg/ml de BFA, ce qui constitue le temps 0. Des cellules sont ensuite prélevées, après 30 minutes, lh, 2h, 4h et 6h d'incubation. La quantité relative de peptide fixée est ensuite estimée à chaque temps, pour chacun des peptides, par la mesure de stabilisation du HLA-B35 à la surface cellulaire. Cette mesure est effectuée en cytométrie de flux à l'aide d'un anticorps anti HLA-B/C. Le temps indiqué dans le tableau II correspond au temps de 1/2 vie du peptide sur le HLA- B*35. Les résultats sont illustrés par la Figure 3, et le Tableau II ci après. Tableau II
Figure imgf000014_0001
Légende de la Figure 3 : En ordonnée, le pourcentage de lyse cellulaire obtenue. En abscisse la concentration en peptide (en nM). Les résultats des Tableaux I et II et de la Figure 3 montrent que: * Trois peptides Melan-A chevauchants sont reconnus par le clone M28.10B. Le peptide le plus efficacement reconnu est le décapeptide 26-35 (EAAGIGILTV, SEQ ID NO : 8,). Ce peptide Melan-A 26-35 correspond probablement au peptide naturellement présenté, dans le contexte B*3501, par les cellules de mélanome et reconnu par les TIL du patient M28. Il est connu que ce même peptide Melan-A 26-35 est présenté par des molécules HLA, mais uniquement dans le contexte HLA-A*0201 (KAWAKAMI et al, 1994, J Exp. Med, 180, 347-52 ; VALMORI et al, 1998, J Immunol, 160, 1750-8). Une présentation croisée d'un même épitope par différents isotypes de molécules HLA de classe I est relativement peu commune. * Le clone spécifique de gplOO (M28.9B) reconnaît, dans le contexte HLA-B*3501, trois peptides chevauchants (deux décamères et un nonamère) localisés entre les acides aminés 470 et 480. Cependant, des concentrations importantes du peptide QVPLDCVLYR (SEQ ID NO : 24) sont nécessaires pour induire une réponse du clone T spécifique (EC50 à 20 μM). Les résultats de mesure d'affinité et de stabilité pour ce peptide montrent qu'il n'est pas capable de se fixer au HLA B*35. La faible réponse obtenue par le clone peut s'expliquer par une contamination de ce peptide (préparé à 70% de pureté) avec d'autres peptides reconnus par ce clone T.
Plusieurs épitopes dérivés de gplOO présentés dans les contextes HLA-A ou C sont connus (CASTELLI et al, 1999, J Immunol, 162, 1739-48 ; KAWAKAMI et al, 1998; TSAI et al, 1997, J Immunol, 158, 1796-802). En revanche, on ne connaissait pas jusqu'à présent d'épitopes de gplOO présentés dans le contexte HLA-B.
* Le clone spécifique de la tyrosinase (M171.100B) reconnaît efficacement trois peptides chevauchants : le 14-mer 309-322, le 13-mer 309-321, et le 12-mer 309-320. Le 12-mer est le peptide reconnu le plus efficacement, avec 50% de la lyse maximale obtenue à 0,2 nM, contre 2 nM et 12 nM pour le 14-mer et le 13-mer respectivement (figure 3). La délétion de la phénylalanine à l'extrémité C-terminale du 12-mer réduit fortement la reconnaissance par les CTLs. Le peptide 312-320, dont il a été montré qu'il est reconnu par un clone CTL dans le contexte HLA-B*3501 (MOREL et al, 1999, Int J Cancer, 83, 755-9), n'est pas reconnu par le clone TIL M171.100B. En outre, si des exemples d'épitopes de cellules de type 11 -mer (AARNOUDSE et al, 1999, Int. J Cancer, 82, 442-8; CHIARI et al, 1999, Cancer Res, 59, 5785-92; KAWAKAMI et al, 2001, J Immunol, 166, 2871-7) et 14-mer existe (PROBST-KEPPER et al, 2001; J Exp Med, 193, 1189-98), il s'agit d'épitopes de taille significativement supérieure à celle des épitopes habituellement présentés par les cellules T.
* Le clone M171.8C spécifique de MAGE-A3/A6 reconnaît l'épitope EVDPIGHLY MAGE-A3/B*3501 précédemment décrit par SCHULTZ et al, (2001, précité). Comme ce clone TIL réagit également avec MAGE-A6, ceci indique que le peptide MAGE-A6 168- 176 (ENDPIGHNY), qui diffère de l'épitope MAGE- A3 par un seul acide aminé en position 8, constitue un autre épitope de mélanome restreint au contexte HLA-B*3501.
* Le clone spécifique d'un épitope ΝY-ESO-1 dans les contextes B*3501/B*3503 (Ml 18.45) reconnaît efficacement cinq peptides chevauchants : le 13-mer 92-104, le 12- mer 92-103, le 11 -mer 94-104, le décamère 94-103 et le nonamère 94-102. Le nonamère 94-102 est le peptide reconnu le plus efficacement, avec 50% de la lyse maximale obtenue à 1 pM, contre 0.05 nM pour le 11-mer, 0,1 nM pour le 13- mer, 1 nM pour le décamère et 5 nM pour le 12-mer.
Il est connu que les nonamères 94-102 et 92-100 sont présentés dans les contextes HLA- B51 (JAGER et al, Cancer Immunity, 2002, vol2, page 12) et HLA-Cw3 (GNJATIC et al, 2000, Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 10917-22) respectivement. Cependant, leur présentation dans un contexte HLA-B35 n'avait pas été décrite auparavant. EXEMPLE 4 : MODIFICATION DES PEPTIDES ANTIGENIQUES PRESENTES DANS LE CONTEXTE HLA-B35.
Certains des peptides antigéniques identifiés ne présentent pas les résidus d'ancrage appropriés pour les molécules HLA-B*3501, e. P, A or N en position 2, Y, F, M, L or I en position 9, pour les nonamères, et en position 10 pour les décamères (FALK et al, 1993,. Immunogenetics, 38, 161-2 [erratum dans Immunogenetics 1994;39(5):379]). Pour essayer d'augmenter l'affinité de ce peptide pour le contexte HLA-B*3501 et la réponse des cellules T, les inventeurs ont introduit des résidus modifiés aux positions 2 et/ou 9, ou 10, des peptides Melan-A/MARTl 26-34 et 26-35 respectivement. Les résultats obtenus avec ces peptides modifiés sont présentés dans la figure 3 (Melan A). On observe que les décapeptides modifiés EAAGIGILTY (SEQ ID ΝO : 9) et EPAGIGILTY (SEQ ID ΝO : 11) induisent une lyse maximale par le clone M28.10B à des concentrations 10 à 50 fois inférieures au peptide sauvage (10 et 50pM au lieu de 500pM). En outre ces peptides présentent une stabilité améliorée (figure 3). Ces modifications permettent donc d'augmenter l'affinité de liaison de ces peptides pour HLA-B*3501, mais aussi d'induire une réactivité supérieure du clone TIL spécifique.
EXEMPLE 5 : PRESENTATION NATURELLE DES PEPTIDES ANTIGENIQUES DANS LE CONTEXTE HLA-B35 PAR LES CELLULES DE MELANOME.
Pour tester l'intérêt, en tant que cibles pour l'immunothérapie, des différents peptides antigéniques identifiés dans les exemples 3 et 4, les inventeurs ont analysés leur présentation par un panel de lignées de cellules de mélanome exprimant les différents antigènes, dont sont dérivés ces peptides, et les molécules HLA-B*3501. Pour augmenter l'expression à la surface des cellules des molécules HLA, les cellules de mélanome ont été préincubées, pour certaines expérimentations, 48 heures dans du milieu contenant 500 U/ml de IFN-γ (Tebu, Paris, France).
La réponse des différents clones TIL vis à vis de ces lignées est détectée par mesure de leur production de TNF comme dans l'exemple 1 (Rapport Effecteur :Cible de 1 :3). Des contrôles négatifs ont été effectués en utilisant des lignées cellulaires de mélanome n'exprimant pas les molécules HLA (Ml 13). Les lignées de cellules de mélanome ont été établies à partir de fragments de tumeurs métastatiques ou de tumeurs ayant envahi les ganglions lymphatiques, et mises en culture dans du milieu RPMI 1640 (Sigma, St Loins, USA) contenant 10% de sérum de veau fœtal (Gibco-BRL, Cergy-Pontoise, France), de la pénicilline (10 mg/ml) de la streptomycine (1 OU/ml) (Sigma) et de la L-glutamine (2nM) (Sigma, St Louis, USA). Les résultats sont illustrés par la figure 4 : en ordonnée, la concentration en TNF en pg/ml ; en abscisse, les lignées de mélanome exprimant HLA-B35 et les différents antigènes (M47, M125, M131, M140, et M147), ou n'exprimant pas l'allèle HLA-B35 (Ml 13). g : lignées cellulaires de mélanome pré-traitées avec 500U/ml d'INF-γ . D : lignées cellulaires de mélanome non pré-traitées avec l'INF-γ. Les clones spécifiques de Melan-A, de la tyrosinase et de MAGE-A3 reconnaissent les lignées cellulaires de mélanome M47, M131 et M147 indépendamment d'un traitement à l'IFN-γ. Toutefois, ces mêmes clones ne reconnaissent les lignées M125 et M140 qu'après l'induction de l'expression de HLA-B35 par un traitement à l' IFN— γ.
Le clone spécifique de gplOO reconnaît une lignée de mélanome indépendamment d'un traitement à l'IFN-γ (M147). Ce clone reconnaît également les lignées M125 et M140 après un traitement par l'IFN-γ (faiblement pour Ml 25). Le clone spécifique de NY-ESO-1 reconnaît l'une de ces lignées exprimant spontanément cet antigène (M47) et les deux autres lignées après traitement à l'IFN-γ (M131 et M140, figure 4).
Dans le cas des lignées M125 et M140, l'absence de reconnaissance de ces lignées, par les différents clones TIL, est probablement liée à un nombre limité de complexes CMH/peptides présents à la surface de ces cellules. En effet, ces deux lignées cellulaires expriment la molécule HLA-B35 uniquement après traitement à l'IFN-γ.
La reconnaissance spontanée des lignées de mélanome par les différents clones T CD8, montre que les épitopes identifiés sont naturellement présentés par ces tumeurs.
EXEMPLE 6 : ANTIGENICITE DU PEPTIDE RAS MUTE 55-64Q61R
Les peptides ras de type sauvage 55-64wτ (ILDTAGQEEY ; SEQ ID NO : 34), le décamère muté 55-64Q61R, et le peptide MAGE- A3 (ENDPIGHLN ; SEQ ID ΝO : 20) ont été obtenus auprès de SYΝT:EM (Nîmes, France). La pureté (>85%) est contrôlée par chromatographie liquide à haut rendement en phase inverse. Les peptides sont lyophilisés, puis dissous dans du DMSO à 10 mg/ml et stockés à -80°C. L'antigénicité du peptide 55-64Q61R et celle de son analogue de type sauvage (55-64wτ), sont évaluées en testant la capacité de ces peptides à induire la croissance de lymphocytes T cytotoxiques (CTL) spécifiques par stimulation in vitro de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) par des cellules dendritiques (DC) puisées avec ces peptides. Les lymphocytes CD8+ sont obtenus à partir des PBMC d'un donneur HLA-A*0101 par tri négatif des cellules T CD4+ sur billes magnétiques (MILTENY BIOTECH, France).
Les cellules dendritiques sont préparées à partir de PBMC adhérentes mises en culture pendant 7 jours dans des plaques de culture à 6 puits contenant du milieu de culture RPMI additionné de sérum de veau fœtal 10%, 50 ng/ml de GM-CSF (SIGMA) et 50 ng/ml d'IL- 4 (SIGMA). A J+7, la maturation des cellules dendritiques est induite pendant 2 jours dans un milieu de culture RPMI additionné de sérum de veau fœtal 10%, 10 ng/ml de TNF-α (SIGMA) et 100 μg/ml de Poly-IC (SIGMA). A J+9, les cellules dendritiques matures sont incubées pendant 2 heures avec 5 μg/ml de peptide ras 55-64Q61R ou de peptide ras 55- 64 τ ; elles sont ensuite lavées pour éliminer les peptides libres.
Les cellules dendritiques puisées avec le peptide ras 55-64Q61R ou le peptide ras 55-64wτ sont utilisées pour stimuler les lymphocytes CD8+ (3,107 cellules). 3 stimulations sont effectuées à une semaine d'intervalle.
Chaque puits de culture est testé pour la présence de CTLs spécifiques du peptide. Dans ce but, 7 jours après la dernière stimulation, des 2,106 cellules BM36.1 et exprimant HLA-A*0101 (KELLY et al. Nature. 355. 641. 1992) préalablement incubées à 37°C pendant 12 heures dans du RPMI additionné de 100 μM de peptide N-rαs 55-64wτ ou 55- 64Q61R, 1 μM de β2 microglobuline, et lavées dans du PBS, sont ajoutées dans chaque puits.
La réponse CTL spécifique à la stimulation par le peptide N-r<zs de type sauvage ou muté est mesurée par dosage de l'interféron γ (IFN-γ ), comme décrit par LAB ARRIERE et al. (Int. J. Cancer, 78, 209, 1998). Deux des cinq puits de culture stimulés avec le peptide ras présentent une prolifération de CTL spécifique du peptide (0,3 et 0,5% de cellules réactives par puits), alors qu'aucune prolifération n'est observée dans les puits stimulés avec le peptide 55-64wτ.
EXEMPLE 7 : PROPRIETES D'UN CLONE DE LYMPHOCYTES T INDUIT PAR LE PEPTIDE 55-64Q61R Des clones lymphocytaires ont été obtenus par dilution limite à partir des cellules du puits de culture contenant 0,5% de cellules T réactives.
La capacité des cellules T issues de l'un de ces clones à lyser des cellules BM36.1 présentant le peptide 55-64Q IR ou le peptide 55-64 τ est évaluée selon un dosage standard de libération du 51Cr (HERIN et al, Int. J. Cancer, 39, 390-396, 1987). Des cellules BM36.1 marquées avec du 51Cr (Na251CrO4, ORIS, Gif-sur- Yvette, France). Les cellules sont ensuite puisées pendant 1 heure à 37°C avec 10 μM de peptide 55-64^ ou de peptide 55-64Q61R, et lavées. 103 cellules BM36.1 ainsi traitées sont incubées avec 5,103 cellules T du clone à tester pendant 4 heures. Les surnageants de culture sont récupérés et le pourcentage de 51Cr libéré est évalué. On observe une lyse importante des cellules BM36.1 puisées avec le peptide ras muté 55- 64Q61R. En revanche, la lyse des cellules BM36.1 puisées avec le peptide ras de type sauvage est très faible.
La spécificité de ce clone vis-à-vis de cellules exprimant HLA-A*0101 et la protéine sauvage ou la protéine N-ras portant la mutation Q61R est évaluée sur des cellules COS transfectées, ou sur des cellules de mélanome HLA-A*0101, exprimant ou non la mutation Q61R. Pour la transfection des cellules COS, un ADNc de 334 pb codant pour un fragment de la protéine N-ras de type sauvage est obtenu par amplification PCR, à partir d'ADNc complet de la protéine N-ras sauvage. Un ADNc codant pour un fragment de la protéine N-r s muté à la position 61 par substitution de la glutamine par une arginine est obtenu par mutagenèse dirigée.
L'ADNc sauvage ou muté est inséré dans le vecteur pcDNA3 et amplifié dans la souche bactérienne E. coli TOP 10 F' (INVITROGΕN, référence C2020-03). Un ADNc codant pour la molécule HLA-A*0101 est introduit dans le vecteur pcDNA 3.1 (INVITROGΕN, référence CV790-20). Des cellules COS-7 sont co-transfectées avec ces constructions comme décrit ci-après :
Des cellules COS-7, (BRICHARD et al, J. Εxp. Med., 178, 489, 1993) sont cultivées dans le milieu DMΕM (BIOWHITTAKΕR) contenant du sérum de veau fœtal 10%, 100 U/ml de pénicilline, 100 μg/ml de streptomycine (SIGMA, St Louis, USA) et 2 mM de glutamine-L (SIGMA, St Louis, USA). 16,5.103 cellules COS sont co-transfectées avec 100 ng d'un mélange du vecteur pcDNA 3.1 exprimant HLA-A*0101 et d'un vecteur pcDNA3 exprimant la protéine N-rαs sauvage ou mutée, par le procédé chloroquine-dextrane-DΕAΕ (BRICHARD et al, J. Εxp. Med., 178, 489, 1993 ; SΕΕD et al, PNAS, 84, 3365, 1987,). Les détails de cette méthode sont décrits par DE PLAEN et al. (Methods, 12, 125, 1997). La stimulation des cellules T est mesurée par dosage du TNF (DE PLAEN et al, Methods, 12, 125, 1997 ; LABARRIERE et al, Int. J. Cancer, 78, 209, 1998). 2,103 à 104 cellules du clone T testé sont ajoutées à 3,104 cellules COS, 48 heures après transfection, ou à 3,104 cellules de mélanome. Les surnageants de culture sont récupérés 6 heures plus tard et leur contenu en TNF est déterminé en mesurant leur effet cytotoxique sur le clone 13 du fibrosarcome murin WEHI 164 (BRICHARD et al, J. Exp. Med., 178, 489, 1993) par dosage colorimétrique MTT. Les résultats obtenus avec les cellules COS transfectées sont présentés dans la Figure 5a : en abscisse, peptides ras de type sauvage ou mutés à la position 61 par substitution de la glutamine par une arginine ; en ordonnée, concentration de TNF en pg/ml Les résultats montrent que les cellules T du clone sont fortement stimulées par les cellules exprimant la protéine N-r -s Q61R, alors qu'on n'observe qu'une faible stimulation avec la protéine N-ras sauvage.
Les résultats obtenus avec les cellules de mélanome sont présentés dans la Figure 5b : en abscisse, lignées cellulaires de mélanome exprimant la mutation ras Q61R (M6, M90, MEL4) ou non (M36, M105, M106, M122, M138, MVl) ; en ordonnée, concentration de TNF en pg/ml Ces résultats montrent que parmi les lignées de mélanome HLA-A*0101, seules celles exprimant la mutation Q61R (lignées M6, M90 et MEL4) stimulent une réponse des cellules T du clone.
EXEMPLE 8 : IDENTIFICATION D'UN PEPTIDE ANTIGENIQUE PRESENTE DANS LE CONTEXTE HLA-A*0101.
Un clone T CD8+, issu d'une population de TIL de mélanome reconnaît un peptide non décrit issu de l'antigène gplOO, dans le contexte A*0101 (PLDCVLYRY, SEQ ID NO : 20). L'antigénicité de ce peptide a été testée en évaluant la capacité du clone à lyser des cellules BM36.1 présentant le peptide d'intérêt dans le contexte HLA-A*0101. Les cellules BM36.1 sont marquées pendant lh à 37°C avec 100 Ci de 51Cr (Na251CrO4, ORIS, Gif-sur- Yvette, France). Les cellules sont ensuite puisées pendant 20 minutes avec les différents peptides synthétiques. 103 cellules BM36.1 ainsi traitées sont incubées avec 104 cellules T du clone (rapport Effecteur :Cible de 10 :1) pendant 4 heures. Les surnageants de culture sont récupérés et la quantité de 51Cr libéré est évalué à l'aide d'un compteur de plaque β (EG&G Wallac, Evry, France). Un contrôle négatif est effectué avec un peptide non-pertinent.
Les résultats sont présentés dans la figure 6 : en ordonnée le pourcentage de lyse cellulaire obtenue, en abscisse la concentration en peptide PLDCVLYRY (D), ou VPLDCVLYRY (Φ). LΕC50 pour le peptide PLDCVLYRY est de 0,6 μM, alors que l' EC50 pour le peptide PLDCVLYRY est de 10 μM.
La séquence de ce peptide est comprise dans la séquence du décamère reconnu dans le contexte B*3501, mais ce peptide n'est pas reconnu par le clone M28.9B. En revanche, le peptide VPLDCVLYRY (SEQ ID NO : 13) est également reconnu dans le contexte A*0101 par le clone M199.6.12 (Tableau I et Figure 6). De plus, la reconnaissance spontanée par le clone Ml 99.6.12, de lignées de mélanome partageant le HLA-A*0101 montre que cet épitope est présenté efficacement par ces tumeurs.

Claims

REVENDICATIONS
1) Utilisation d'au moins un peptide immunogène représentant un épitope T présenté par le CMH I, choisi parmi : a) un peptide comprenant la séquence EX]AGIGILX2 (SEQ ID NO : 1) dans laquelle Xi représente A ou P, et X2 représente T ou Y, capable d'induire une réponse cytotoxique dirigée contre l'antigène Melan-A ; b) un peptide comprenant la séquence EVDPIGHVY
(SEQ ID NO : 2), capable d'induire une réponse T cytotoxique dirigée contre l'antigène MAGE-A6 ; c) un peptide comprenant la séquence VPLDCVLYR
(SEQ ID NO : 3), capable d'induire une réponse cytotoxique dirigée contre l'antigène gplOO ; d) un peptide comprenant la séquence TPRLPSSADVEF
(SEQ ID NO : 4), capable d'induire une réponse cytotoxique dirigée contre l'antigène tyrosinase ; e) un peptide comprenant la séquence MPFATPMEA
(SEQ ID NO : 5), capable d'induire une réponse cytotoxique dirigée contre l'antigène NY-ESO-1; pour l'obtention d'un médicament destiné à l'immunothérapie anti-tumorale chez un patient HLA-B35.
2) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit peptide est choisi parmi : a) un peptide de séquence choisie parmi : TAEEAAGIGILTV
(SEQ ID NO : 6), EAAGIGILTVIL
(SEQ ID NO : 7), EAAGIGILTV
(SEQ ID NO : 8), EAAGIGILTY
(SEQ ID NO : 9), EAAGIGILY (SEQ ID NO : 10), EPAGIGILTY (SEQ ID NO : 11), EPAGIGILTV (SEQ ID NO : 12) ; b) un peptide de séquence EVDPIGHVY (SEQ ID NO : 2) ; c) un peptide de séquence choisie parmi VPLDCVLYR (SEQ ID NO : 3) et VPLDCVLYRY(SEQ ID NO : 13) ; d) un peptide de séquence choisie parmi TPRLPSSADVEFCL (SEQ ID NO : 15) et TPRLPSSADVEF (SEQ ID NO : 4) ; e) un peptide de séquence choisie parmi : LAMPFATPMEAEL (SEQ ID NO : 16), LAMPFATPMEAE (SEQ ID NO : 17), MPFATPMEAEL (SEQ ID NO : 18), MPFATPMEAE (SEQ ID NO : 19) et MPFATPMEA (SEQ ID NO : 5).
3) Peptide immunogène représentant un épitope T présenté par le CMH I, choisi parmi :
- un peptide de séquence choisie parmi : EAAGIGILTY (SEQ ID NO : 9), EAAGIGILY (SEQ ID NO : 10), EPAGIGILTY (SEQ ID NO : 11), EPAGIGILTV (SEQ ID NO : 12) ;
- un peptide de séquence choisie parmi : VPLDCVLYR (SEQ ID NO : 3), VPLDCVLYRY (SEQ ID NO : 13) et PVPLDCVLYRY.(SEQ ID NO : 14) ;
- un peptide de séquence choisie parmi : TPRLPSSADVEFCL (SEQ ID NO : 15) et TPRLPSSADVEF (SEQ ID NO : 4). 4) Composition multi-épitopique comprenant au moins deux peptides de deux catégories différentes parmi les catégories a) b) c) d) ou e) telles que définies dans la revendication 1 ou 2.
5) Composition multiépitopique selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un peptide de chacune de ces catégories a) b) c) d) ou e) telles que définies dans la revendication 1 ou 2.
6) Composition multi-épitopique selon une quelconque des revendications 4 ou 5, caractérisée en ce qu'elle est constituée par un polypeptide chimérique comprenant une ou plusieurs copies de chacun desdits peptides. 7) Polynucléotide codant pour un polypeptide chimérique selon la revendication 6.
8) Cellule présentatrice de l'antigène exprimant un allèle HLA-B35 du CMH I, caractérisée en ce qu'elle est chargée par un peptide tel que défini dans une quelconque des revendications 1 ou 2.
9) Cellule présentatrice de l'antigène exprimant un allèle HLA-B35 du CMH I, caractérisée en ce qu'elle est transfectée par un polynucléotide selon la revendication 7.
10) Utilisation d'au moins un peptide tel que défini dans une quelconque des revendications 1 à 3, pour la détection in vitro de CTLs dirigés contre un ou plusieurs des antigènes Melan-A, MAGE-A6, gplOO, tyrosinase, et NY-ESO-1, dans un prélèvement biologique obtenu à partir d'un sujet HLA-B35.
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