WO2003082906A2 - Neurotrophe und neuroprotektive peptide - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to peptides of 4 to 14 amino acids in length.
  • the peptides according to the invention can be used as active ingredients in medicaments for the treatment of degenerative diseases of the central nervous system, such as Alzheimer's disease, Lewy body dementia, Parkinson's disease, Huntington's disease (chorea), multisystem atrophy and other similar diseases.
  • degenerative diseases of the central nervous system such as Alzheimer's disease, Lewy body dementia, Parkinson's disease, Huntington's disease (chorea), multisystem atrophy and other similar diseases.
  • Alzheimer's disease In neurodegenerative diseases, aggregates of proteins in the brain generally appear as a common feature. In the case of Alzheimer's disease, it is the so-called senile plaques, extracellular protein deposits, which consist primarily of amyloid beta peptides, and the so-called neurofibrillary tangles, intracellular protein knuckles made of hyperphosphorylated tau protein. In Parkinson's disease there are intracellular emptying bodies consisting of aggregated alpha-synuclein. According to the latest scientific findings, such bodies, namely Lewy Bodies, were also found in more than 70% of familial and sporadic Alzheimer's sufferers, and they can also be found in patients suffering from Down syndrome.
  • Some of the sufferers have mutated proteins that have a particularly pronounced aggregation behavior. In the majority of patients, however, the aggregates consist of normal wild-type proteins. Various causes are assumed which suddenly change the solubility behavior of the proteins, whereby, for example, increased oxidative stress could play an important role during the aging process. Changes in the capacity of various protein-degrading enzymes can also be considered as a cause, since malfunctions can result in incorrectly modified proteins, which are then deposited and can no longer be processed by different disposal enzymes.
  • Another triggering pathophysiological mechanism consists in a disturbed balance between aggregatic and anti-aggregate proteins.
  • other representatives of this protein family include gamma-synuclem and beta-synuclem, as well as the recently discovered synoretin (Surgurchov et al., Mol. Cell. Neurosci. 13 (2): 95-103 [1999]).
  • beta-synuclein a very close relative of alpha-synuclein, is able to inhibit the aggregation of alpha-synuclein in a dose-dependent manner (Hashimoto et al., Neuron 32 (2): 213- 23 [2001]).
  • Experiments in cell cultures in which a disturbance in normal cell proliferation and differentiation was triggered by overexpression of alpha-synuclem also showed a therapeutic effect of beta-synuclein, which normalized the attachment, survival and outgrowth of neurites in these cultures.
  • mice that are transgenic for alpha-synuclem show an increased production of this protein and therefore have a disturbed ratio in the amounts between alpha and beta-synuclein. Over the course of their age, they form intraneuronal embryos similar to the Lewy Bodies and also show progressive motor disorders that are comparable to the functional disorder in Parkinson's disease. If these animals are crossed with beta-synuclein transgenic animals which show an increased expression of this protein, homeostasis can be restored at a much higher level in the total expression of the synucleins. As a result, the number of emptying bodies is reduced significantly and the characteristic loss of neuronal function is completely prevented.
  • Alpha-Synuclem was also allowed to play a particularly important role in the pathology of Alzheimer's disease. This is supported by the fact that a part of this protein, the NACP (non-amyloid component protein) domain, could be detected as part of the senile plaques (Yoshimoto et al., Proc. Natl. Acad. Sei 92, 9141-5 [1995 ] and WO-9506407), and also the fact that - as mentioned above - about 70% of Alzheimer's sufferers have Lewy Bodies in various areas of the brain, which also contain alpha-synuclein (Eizo et al., Neurosci. Lett. 290 (1), 41-4 [2000]).
  • beta-amyloid increases the accumulation and neurotoxicity of alpha-synuclein (Masliah et al., Proc. Natl. Acad. Sci 98 (21): 12245-50 [2001]).
  • alpha-synuclein as a synaptic protein could play an important role in the initial synaptic degeneration and thus play a key role in the pathogenesis.
  • beta-synuclein and in particular peptides derived therefrom in connection with alpha-synuclein is known, see, for example, octapeptides according to WO-A-02/04482 and three others
  • WO-A-002/0020 and WO-A-01/60794 describe the use of beta-synuclein as a whole molecule or of methods which increase its expression in vivo for the therapy of neurological diseases associated with alpha-synuclein
  • WO-A-01/60794 does not provide any Evidence of an actual protective effect of this peptide on living, neuronal cells and contains no evidence of other effective peptides in this sequence region.
  • shorter peptides were very advantageous for use as pharmaceuticals, since the problems of chemical and biological stability and bioavailability generally decrease significantly with decreasing chain length.
  • the object of the present invention is to avoid the disadvantages known from the prior art.
  • peptides are proposed which are from the group
  • peptides according to the invention are derived from the N-terminal sequence of the beta synuclein and antagonize the influence of toxic or vitality-damaging noxae, such as are present in neurodegenerative diseases.
  • peptides whose individual components are L-amino acids, but also peptides whose individual components are D-amino acids are within the scope of the invention. Also considered in the context of the invention are N- or C-terminally modified peptides.
  • the invention further relates to medicaments which contain the peptides according to the invention as active pharmaceutical ingredients.
  • the peptides of the invention can be synthesized in a variety of ways.
  • Chemical synthesis of a peptide is a conventional process and can be achieved, for example, by the Memfield solid phase synthesis technique (Memfield, J., Am. Ch ⁇ m. Soc, 85: 2149-2154 [1963]; Kent et al., Syntheti c Pepti des n Bi ology and Medi ane, 29 ff eds.Alitalo et al., Elsevier Science Publishers 1985; Haug, JD Peptide Synthesis and the protecting group strategy, Ameri can Bi otechnology Laboratory, 5 (1): 40-47 [1987 ]).
  • Chemical peptide synthesis methods also include the use of automated peptide synthesizers using commercially available protected amino acids such as Biosearch (Model 9500 and 9600), Applied Biosystems Inc. (Model 430; Miligen (Model 9050) and others.
  • these can Peptides are produced in cells of bacteria, fungi or mammals using recombinant technology and purified using conventional methods.
  • Cysteinyl residues can also be obtained by reaction with bromot ⁇ fluoroacetone, alpha-bromo-beta (5-imidozoyl) propionic acid, chloroacetyl-phosphate, N-alkylmalemides, 3-nitro2-pyridyldisulfide, methyl-2-pyridyldi-sulfide, p-chloromerkuribenzo Chloromeric 4-nitrophenol or chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole are de-vatized.
  • amino acid histidm can also be easily derivatized by reaction with diethylprocarbonate at a pH of 5.5 - 7, as this substance is relatively specific for the histidyl side chain.
  • Parabromophenacyl bromide is also an option, the reaction preferably being carried out in 0.1 molar sodium cacodylate at pH 6.0.
  • Lys and amino terminal residues can also be derivatized with succinate or other carboxylic acid anhydrides.
  • the reaction with these agents has the effect of reversing the charge on the lysinyl residue.
  • suitable reagents for the derivatization of residues containing alphaammo include imido esters such as methyl bicolinimidate, py ⁇ doxal phosphate, py ⁇ doxal, chloroborohyd ⁇ d, trinitrobenzenesulfonic acid, O-methyl isourea, 2, 4 pentanedione and transaminase-catalyzed reactions with glyoxylate.
  • the arginyl residues can be modified by the reaction with one or more conventional reagents such as phenylglyoxal, 2,3-butanedione, 1,2-cyclohexanedione and ninhydrin.
  • the derivatization of the arginyl residues requires that the reaction be carried out under alkaline conditions because of the high PK value of the guanidine group.
  • these reagents can also react with groups of the Lysm, as well as with the Arginine-Epsilon Ammo group.
  • Tyrosyl residues are known targets for the introduction of spectral labels by the reaction with aromatic diazonium substances or tetranitromethane.
  • aromatic diazonium substances or tetranitromethane Most commonly, N-acetylimidizole and tetranitromethane are used to make O-acetyltyrosil and 3- To produce nitroderivatives.
  • Such derivatizations can serve to improve solubility, absorption, biological half-life and the like. Alternatively, the derivatizations could also serve to minimize any undesired side effects of the proteins.
  • one day old, fertilized chicken eggs are incubated at +12 +/- 0.1 ° C and 80 +/- 5% humidity for eight days.
  • the eggs are transferred to an incubation incubator and incubated until embryonic day 8 at 38 +/- 0, 5 ° C and 55 +/- 5%.
  • the cortices are isolated, homogenized and neurons taken into primary culture (culture conditions: Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 20% v / v fetal calf serum, 0.01% gentamycin, 1 g / 1 glucose, 2 mM L-glutamate, + 37 ° C, 5% C0 2 and 95% humidity).
  • the peptide to be tested is added (final concentrations from 1.56 to 200 ⁇ M) and the specified noxa is carried out. A damaged control and a vehicle control are carried out with each attempt. After the specified stress period has elapsed, the proportion of neurons still alive is determined using a metabolic colorimetric assay (the yellow chromophore MTT is only converted to a blue formazan product by living cells).
  • Example 2 Chronic calcium metabolism disorder caused by ionomycin It is believed that various neurodegenerative diseases result in chronic calcium overload due to metabolic malfunctions, which ultimately causes cell death through the activation of various enzyme systems. In the present model, this damage is induced by adding ionomycin in a methanolic solution (final concentration: 10 ⁇ M) over a period of 24 hours. Methanol, diluted in medium, serves as a vehicle control.
  • Beta-amyloid - peptides in aggregate form represent a potent neurotoxin, the addition of which to nerve cell cultures leads to rapid and progressive cell death. Since beta-amyloid peptides play an essential role in the pathogenesis of Alzheimer's disease, this model is to be regarded as particularly relevant.
  • the present biological test is a method for testing anti-aggregatory substance potential specially developed for this project.
  • the newly synthesized peptides are added directly to a fresh solution of amyloid beta peptides to prevent the formation of neurotoxic aggregates.
  • the effect of aggregates that still arise on the growth and survival of nerve cell cultures is the measurement parameter.
  • ß-A beta-amyloid peptide
  • phosphate-buffered cooking acid 1 mM
  • this solution is pipetted into the cultures at a final concentration of 20 ⁇ M and, after 24 hours of exposure, the proportion of living cells is determined as usual.
  • the compounds of the invention m therapeutically effective amounts administered in pharmaceutically acceptable carriers or solvents.
  • Such carriers include (but are not limited to) physiological saline, buffered saline, dextrose, water, glycine, ethanol, and combinations thereof.
  • the respective formulation should be adapted to the type of administration.
  • the composition can also contain different amounts of moisturizers or emulsifiers or pH-buffering substances.
  • the pharmaceutical composition can be a liquid solution, a suspension, an emulsion, a tablet, a pill, a capsule, a sustained-release formulation or a powder.
  • the preparation can also be produced as a supplement with traditional binders and carriers such as triglycerides.
  • Oral formulations can contain standard carriers such as mannitol, lactose, starch, magnesium sterate, sodium sacarin, cellulose, magnesium carbonate and others of pharmaceutical grade.
  • Various administration systems are known and can be used to ensure the therapeutic use of the substances according to the invention, e.g. encapsulation in liposomes, microparticles, microcapsules etc.
  • the dosage form is prepared in accordance with routine procedures as a pharmaceutical dosage form adapted for intravenous administration to humans or other mammals.
  • the compositions for intravenous administration are solutions in sterile isotonic aqueous buffer solution. If necessary, the preparation can also contain solubilizers and locally effective anesthetics to relieve the pain at the injection site.
  • the ingredients are either provided separately or mixed in a unit dose.
  • a dry lyophilized powder or anhydrous concentrate in a hermetically sealed container such as an ampoule, on which the amount of the active pharmaceutical is noted.
  • the dosage form has to be administered as an infusion, it can be dissolved in an infusion bottle containing sterile water or saline solution of pharmaceutical grade. Whenever the preparation is given by injection, one can Ampoules with sterile water for injections or saline are made available in such a way that the individual components can be mixed correctly before administration.
  • the therapeutic substances described in the invention can be formulated both as a neutral form and as a salt.
  • Pharmaceutically acceptable salts include those formed with the free amino groups, e.g. those derived from hydrochloric acid or oxalic acid and those formed with free carboxyl groups such as those derived from sodium, potassium, ammonium, calcium, iron oxides, isopropylamine, triethylamm, 2-ethyloaminoethanol, histidine, procaine and others.
  • the amount of therapeutic agent described in the invention must be effective for the treatment of the particular disease or condition, will depend on the nature of the disease or condition, and will be determined by standardized clinical procedures.
  • the exact dose to be used in the invention also depends on the mode of administration and the severity of the disease or disorder, and this amount should be adjusted according to the experienced physician, taking into account the specific patient circumstances.
  • Suitable dosage ranges for intravenous administration are generally between 20-4,000 ⁇ g of the active ingredient per kg of body weight.
  • Suitable dosages for intranasal applications range from 0.01 pg per kg body weight to 1 mg per kg body weight.
  • Effective dosages for oral applications are in the range of 1 mg to 1,000 mg per kg body weight and day.
  • the effective doses are extrapolated from dose-response curves derived from in vitro models or animal model test systems.

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Abstract

Beschrieben werden neue Peptide, deren Einzelbestandteile L-Aminosäuren oder D-Aminosäuren sind. Diese Peptide kommen als Wirkstoffe in Arzneimitteln zur Anwendung bei der Therapie von Erkrankungen, bei denen das vermehrte Auftreten von freien Radikalen eine pathophysiologische Rolle spielt, oder bei der Therapie von Erkrankungen mit akuter Hypoxie oder Ischämie in einem Organsystem des Körpers, insbesondere im Zentralnervensystem, oder bei der Therapie von Eisenspeichererkrankungen, wie der Hallervorden-Spatz'schen Erkrankung, oder bei der Therapie neurodegenerativer Erkrankungen, insbesondere der Alzheimer'schen Erkrankung, der Lewy Body Variante der Alzheimer'schen Erkrankung, der Parkinson'schen Erkrankung, der Multisystem Atrophie, der Lewy Body Demenz oder der Huntington's Chorea, und allen diesen neurodegenerativen Erkrankungen ähnlichen Zustandsbildern.

Description

Neurotrophe und neuroprotektive Peptide
Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft Peptide von 4 bis 14 Aminosäuren Lange. Die erfindungsgemaßen Peptide können als Wirkstoff in Arzneimitteln zur Behandlung von degenerativen Erkrankungen des Zentralnervensystems, wie dem Morbus Alzheimer, der Lewy Body Demenz, der Parkinson' sehen Erkrankung, dem Morbus Huntington (Chorea) , der Multisystem-Atrophie und anderen ähnlichen Erkrankungen verwendet werden.
Stand der Technik
Bei neurodegenerativen Erkrankungen treten im Allgemeinen als gemeinsames Merkmal Aggregate von Proteinen im Gehirn auf. Im Falle der Alzheimer ' sehen Erkrankung handelt es sich um die sogenannten senilen Plaques, sind extrazellulare Eiweißablagerungen, die vornehmlich aus Amyloid-Beta-Peptiden bestehen und um die sogenannten neurofibrillaren Tangles, intrazellulare Protemknauel aus hyperphosphoryliertem Tau-Protein. Beim Morbus Parkinson finden sich intrazellulare Emschlusskorper, bestehend aus aggregiertem Alpha-Synuclein. Nach den neuesten wissenschaftlichen Befunden konnten solche Emschlusskorper, nämlich Lewy Bodies auch bei mehr als 70% der familiären und sporadischen Alzheimer-Erkrankten nachgewiesen werden, man findet sie auch bei Patienten, die am Down- Syndrom leiden. Aggregate von Alpha-Synuclem in Gliazellen treten bei der Multisystem Atrophie auf. Analog dazu finden sich Aggregate vom Prionprotein bei der Creutzfeld-Jakob Erkrankung und verwandten Erkrankungen, und letztendlich Ablagerungen von Huntingtin bei Huntington Chorea.
Bei manchen der Erkrankten liegen mutierte Proteine vor, die ein besonders ausgeprägtes Aggregationsverhalten besitzen. Bei der Mehrzahl der Patienten aber bestehen die Aggregate aus normalen Wildtyp-Proteinen. Es werden verschiedene Ursachen angenommen, die das Loslichkeitsverhalten der Proteine plötzlich verandern, wobei zum Beispiel erhöhter oxidativer Stress wahrend des Alterungsprozesses eine wesentliche Rolle spielen durfte. Auch Veränderungen in der Kapazität verschiedener proteinabbauender Enzyme kommen als Ursache in Frage, da durch Störungen falsch modifizierte Eiweiße entstehen können, die sich dann ablagern und von verschiedenen Entsorgungsenzymen nicht mehr weiter prozessiert werden können.
Ein anderer auslosender pathophysiologischer Mechanismus besteht in einem gestörten Gleichgewicht zwischen aggregatoπschen und anti- aggregatoπschen Proteinen. Die Entdeckung, dass das synaptische Protein Alpha-Synuclein den Hauptbestandteil der sogenannten Lewy Bodies darstellt, und dass Mutationen in diesem Protein zu familiärer Parkinson' scher Erkrankung fuhren, haben dieses Eiweiß in den Mittelpunkt des Interesses wissenschaftlicher Forschung geruckt. Neben Alpha-Synuclem existieren als weitere Vertreter dieser Proteinfamilie Gamma-Synuclem und Beta-Synuclem, sowie das kürzlich entdeckte Synoretin (Surgurchov et al., Mol. Cell. Neurosci . 13(2): 95-103 [1999]).
Bei verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen tritt eine Verschiebung des Mengenverhältnisses zwischen den einzelnen Synucle en dahingehend auf, dass der relative Anteil von Alpha- Synuclem erhöht wird. Es konnte in vi tro nachgewiesen werden, dass Beta-Synuclein, ein sehr naher Verwandter von Alpha-Synuclein, in der Lage ist, die Aggregation von Alpha-Synuclein dosisabhangig zu hemmen (Hashimoto et al., Neuron 32(2): 213-23 [2001]). Versuche in Zellkulturen, bei denen eine Störung der normalen Zellproliferation und Differenzierung durch Uberexpression von Alpha-Synuclem ausgelost wurde, zeigten ebenfalls eine im therapeutischen Sinn gunstige Wirkung von Beta-Synuclein, welches das Anhaften, Überleben und Auswachsen von Neuriten in diesen Kulturen wieder normalisierte. Mause, die für Alpha-Synuclem transgen sind, zeigen eine erhöhte Produktion dieses Eiweißes und weisen daher ein gestörtes Verhältnis in den Mengen zwischen Alpha- und Beta-Synuclein auf. Sie bilden im Laufe des Alters intraneuronale Emschlusskorper ähnlich den Lewy Bodies aus und zeigen auch fortschreitende motorische Störungen, die mit der Funktionsstörung beim Morbus Parkinson vergleichbar sind. Kreuzt man diese Tiere mit Beta-Synuclein transgenen Tieren, die eine erhöhte Expression dieses Eiweißes zeigen, so lasst sich auf wesentlich höherem Niveau in der Gesamtexpression der Synucleine eine Homöostase wiederherstellen. Als Folge wird die Anzahl der Emschlusskorper hoch signifikant reduziert und der charakteristische neuronale Funktionsverlust komplett verhindert. Alpha-Synuclem durfte aber auch eine besonders wichtige Rolle bei der Pathologie der Alzheimer' sehen Erkrankung spielen. Dafür spricht die Tatsache, dass ein Teil dieses Proteins, die NACP (Non-Amyloid Component Protein) Domäne, als Teil der senilen Plaques nachgewiesen werden konnte (Yoshimoto et al., Proc. Natl. Acad. Sei 92, 9141-5 [1995] und WO-9506407), und zudem die Tatsache, dass - wie oben erwähnt - etwa 70% der Alzheimer Erkrankten in verschiedenen Hirnarealen Lewy Bodies aufweisen, in denen sich ebenfalls Alpha- Synuclein findet (Eizo et al., Neurosci . Lett. 290(1), 41-4 [2000]). In einem transgenen Mausmodell erhöht Beta-Amyloid die Akkumulation und die Neurotoxizitat von Alpha-Synuclein (Masliah et al., Proc. Natl . Acad. Sei 98(21): 12245-50 [2001]). Zusätzlich konnte Alpha- Synuclein als synaptisches Protein eine wichtige Rolle bei der initialen synaptischen Degeneration spielen, und somit eine Schlusselrolle in der Pathogenese einnehmen.
Derzeit stehen keinerlei kausal wirksame Therapien der Alzheimer ' sehen Erkrankung, der Lewy Body Demenz, der Parkinson' sehen Erkrankung oder anderer neurodegenerativer Erkrankungen zur Verfugung. Eine Verhinderung der abnormen Proteinaggregation durch einen endogenen Faktor konnte somit einen ersten Schritt in diese Richtung darstellen. Da Alpha- und Beta- Synuclein zusätzlich mit verschiedenen endogenen Signaltransduk- tionskaskaden wie der Protemkmase C, oder der Phospholipase D2 und verschiedenen Transkriptionsfaktoren interagieren, waren über diese Wirkwege zusatzliche positive Einflüsse, die sich neuroprotektiv auswirken konnten, denkbar.
Die Verwendung von Beta-Synuclein und insbesondere davon abgeleiteten Peptiden in Zusammenhang mit Alpha-Synuclein ist bekannt, siehe etwa Oktapeptide gemäß WO-A-02/04482 und drei weitere
Peptide in WO-A-02/04625. Die WO-A-002/0020 und WO-A-01/60794 beschreiben die Verwendung von Beta-Synuclein als ganzes Molekül bzw. von Methoden, die dessen Expression in vivo steigern zur Therapie von neurologischen Erkrankungen, die mit Alpha-Synuclein in
Zusammenhang stehen. Die WO-A-01/60794 lehrt insbesondere auch die
Verwendung eines Peptides mit der Aminosäure-Sequenz
MDVFMKGLSMAKEGV, welches den N-terminalen Aminosäuren 1 bis 15 des
Beta-Synucleins entspricht, zur Behinderung der Bindung von Alpha- Synuclein und Beta-Amyloid. Die WO-A-01/60794 liefert jedoch keinen Nachweis für eine tatsächliche protektive Wirkung dieses Peptides auf lebende, neuronale Zellen und enthalt keine Hinweise auf andere wirksame Peptide in diesem Sequenzbereich. Kürzere Peptide waren edoch für den Einsatz als Arzneimittel sehr vorteilhaft, da sich im Allgemeinen mit abnehmender Kettenlange die Probleme der chemischen und biologischen Stabilität sowie der Bioverfugbarkeit stark vermindern .
Darstellung der Erfindung
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die aus dem Stand der Technik bekannten Nachteile zu vermeiden. Erfmdungsgemaß werden Peptide vorgeschlagen, welche aus der Gruppe
DVFMKGLSMAKEGV
VFMKGLSMAKEGV
FMKGLSMAKEGV
MKGLSMAKEGV
KGLSMAKEGV
GLSMAKEGV
LSMAKEGV
SMAKEGV
MAKEGV
AKEGV
KEGV
MDVFMKGLSMAKEG
MDVFMKGLSMAKE
MDVFMKGLSMAK
MDVFMKGLSMA
MDVFMKGLSM
MDVFMKGLS
MDVFMKGL
MDVFMKG
MDVFMK
MDVFM
MDVF
DVFMKGLSMAKEG
DVFMKGLSMAKE
DVFMKGLSMAK
DVFMKGLSMA
DVFMKGLSM DVFMKGLS
DVFMKGL
DVFMKG
DVFMK DVFM
DVF
GLSMAKEG
GLSMAKE
GLSMAK GLSMA
GLSM
GLS
GL
LSMAKEG LSMAKE
LSMAK
LSMA
LSM
LS
ausgewählt sind.
Diese erfindungsgemäßen Peptide sind von der N-terminalen Sequenz des Beta-Synucleins abgeleitet und antagonisieren den Einfluß toxischer oder vitalitätsschädigender Noxen, wie sie bei neurodegenerativen Erkrankungen vorliegen.
Überraschenderweise ergab sich die aus dem Stand der Wissenschaft und Technik nicht ableitbare Tatsache, dass bereits einzelne Peptide, die nur die Hälfte bzw. sogar nur ein Drittel der in WO- 0160794 beschriebenen Sequenz aus 15 Aminosäuren umfassen, in Modellen von pathologischen Vorgängen, wie sie bei neurodegenerativen Erkrankungen vorliegen oder vermutet werden, ausgezeichnete Wirkung entfalten; so etwa das Heptapeptid SMAKEGV und das Pentapeptid LSMAK.
Im Rahmen der Erfindung liegen nicht nur Peptide, deren Einzelbestandteile L-Aminosäuren sind, sondern auch Peptide, deren Einzelbestanteile D-Aminosäuren sind. Ebenso im Rahmen der Erfindung in Betracht gezogen sind N- oder C- terminal veränderte Peptide.
Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der erfindungsgemaßen Peptide sind in den Unteranspruchen offenbart.
Die Erfindung betrifft weiters Arzneimittel, welche die erfindungsgemaßen Peptide als pharmazeutische Wirkstoffe enthalten.
Die Peptide der Erfindung können auf verschiedene Weise synthetisch hergestellt werden.
Die chemische Synthese eines Peptids stellt ein konventionelles Verfahren dar und kann zum Beispiel durch die Memfield Solid Phasen Synthesetechnik erreicht werden (Memfield, J., Am. Chβm. Soc , 85:2149-2154 [1963]; Kent et al., Syntheti c Pepti des n Bi ology and Medi ane, 29 ff eds . Alitalo et al., Elsevier Science Publishers 1985; Haug, J.D. Peptide Synthesis and the protecting group strategy, Ameri can Bi otechnology Laboratory, 5 (1): 40-47 [1987]). Verfahren der chemischen Peptidsynthese beinhalten auch die Verwendung automatischer Peptidsynthetizer unter Verwendung kommerziell erhältlicher geschützter Aminosäuren wie zum Beispiel Biosearch (Modell 9500 und 9600), Applied Biosystems Inc. (Modell 430; Miligen (Modell 9050) und andere. Zusätzlich zu den chemischen Verfahren können diese Peptide mittels rekombinanter Technologie in Zellen von Bakterien, Pilzen oder von Saugetieren hergestellt und mittels herkömmlicher Verfahren gereinigt werden.
Unabhängig davon, ob die Synthese der erfindungsgemaßen Peptide über chemische Wege oder durch rekombmante Technologien durchgeführt wird, kann es insbesondere zur Erhöhung der Stabilität nach Einfuhrung in den zu therapierenden Organismus wünschenswert sein, die Peptide zu modifizieren. Dazu können beispielsweise folgende Methoden angewendet werden:
Vorteilhafte Weσe zur Ausführung der Erfindung
1) Kovalente Modifikationen, bei denen vorherbestimmte Ammosaure- Reste des Peptids mit organischen Derivatisierungs-substanzen an ausgewählten Seitenketten oder endstandigen Resten reagieren können. Zum Beispiel reagieren Cysteinyl Reste mit Alpha- Haloacetaten und korrespondierenden Aminen wie der Chloroessigsaure oder dem Chloroacetamid und ergeben dabei Carboxymethyl oder Carboxyamidomethyl Derivate. Cysteinyl Reste können auch durch die Reaktion mit Bromotπfluoroaceton, Alpha- Bromo-Beta (5-Imιdozoyl) Propionsaure, Chloroacetyl-phosphat, N-Alkylmalemiden, 3-Nιtro2-Pyrιdyldιsulfld, Methyl-2-Pyrιdyldι- sulfid, p-Chloromerkuribenzoat, 2-Chloromerkurι-4-Nιtrophenol oder Chloro-7-Nιtrobenzo-2-oxa-l, 3-Dιazol deπ-vatisiert werden. Auch die Aminosäure Histidm kann leicht durch die Reaktion mit Diethylprocarbonat bei einem pH Wert von 5,5 - 7 derivatisiert werden, da diese Substanz relativ spezifisch für die Histidyl Seitenkette ist. Parabromophena-zylbromid ist ebenfalls eine Möglichkeit, wobei die Reaktion vorzugsweise m 0,1 molaren Natriumcacodylate bei pH 6,0 ausgeführt wird.
2) Lys und aminoterminale Reste können auch mit Succinat oder anderen Carboxylsaure-Anhydπden derivatisiert werden. Die Reaktion mit diesen Agenzien hat den Effekt, die Ladung des Lysinyl Restes umzukehren. Andere geeignete Reagenzien zur Derivatisierung Alphaammo enthaltender Reste inkludieren Imido-Esther wie Methyl- Bicolinimidat, Pyπdoxal-Phosphat, Pyπdoxal, Chloroborohydπd, Trinitrobenzensulfonsaure, O-Methyl Isoharnstoff, 2, 4 Pentandion und Transaminase katalysierte Reaktionen mit Glyoxylat. Die Arginyl Reste können durch die Reaktion mit einer oder mehreren konventionellen Reagenzien wie Phenylglyoxal, 2,3 Butandion, 1, 2-Cyclohexandιon und Ninhydrin modifiziert werden. Die Derivatisierung der Arginyl Reste erfordert, dass die Reaktion unter alkalischen Bedingungen wegen des hohen PK Wertes der Guanidin Gruppe durchgeführt wird. Zusätzlich können diese Reagenzien auch mit Gruppen des Lysm, sowie mit der Arginin-Epsilon Ammogruppe reagieren.
3) Tyrosyl Reste sind bekannte Targets für die Einfuhrung von spektralen Markierungen durch die Reaktion m t aromatischen Diazonium Substanzen oder Tetranitromethan. Am häufigsten werden N-Acetylimidizol und Tetranitromethan verwendet, um O-Acetyltyrosil und 3- Nitroderivate zu produzieren.
4) Die Carboxyl Seitengruppe (Aspartyl oder Glutamyl) wird selektiv durch Reaktion mit Carbodimiden (R' -N-C-N-R' ) wie l-Cyclohexyl-3- (2-Morpholmyl (4-Ethyl) ) Carbodnmid oder l-Ethyl-3- (4-Azonιa-4, 4-Dιmethylpentyl) -Carbodnmid modifiziert. Aspartyl und Glutamyl Reste werden durch die Reaktion mit Ammonium Ionen in Asparaginyl und Glutaminyl Reste verwandelt. Glutaminyl und Asparaginyl Reste werden häufig zu den entsprechenden Glutamyl und
Aspartyl Resten deamidiert.
5) Andere Modifizierungen beinhalten die Hydroxylierung von Prolin und Lysm, die Phosphorylierung der Hydroxylgrup- pen von Seryl und Threonyl Resten, die Methylierung der
Alpha Ammogruppe von Lysm, Argenin und Histidin Seitenketten, sowie die Acetylierung der N-terminalen Ammogruppe und die Amidierung der C-termmalen
Carboxylgruppen .
Solche Derivatisierungen können dazu dienen, die Loslichkeit, Absorption, die biologische Halbwartszeit und ähnliches zu verbessern. Die Derivatisierungen konnten alternativ auch dazu dienen, etwaige ungewunschte Nebeneffekte der Proteine zu minimieren.
Bestimmung der biologischen Aktivität:
Da die Zielrichtung der Therapie mit den erfmdungsgemaß vorgestellten Peptiden verschiedene neurodegenerative Erkrankungen sind, wurden unterschiedliche Modellsysteme für den Nachweis der biologischen Wirksamkeit der erfindungsgemaßen Peptide bei neurodegenerativen Erkrankungen eingesetzt. In der Folge werden die einzelnen verwendeten Modellsysteme und die damit erzielten Ergebnisse beschrieben.
Gemeinsam ist diesen biologischen Testsystemen, daß aus
Huhnerembryonen gewonnene kortikale Neuronen acht Tage in
Kulturplatten kultiviert und sodann einer spezifischen Noxe ausgesetzt werden (Pettmann et al., Nature 281(5730): 378-80 [ 1979 ] ) .
Dazu werden einen Tag alte, befruchtete Hühnereier bei +12 +/- 0,1 °C und 80 +/- 5% Luftfeuchte acht Tage lang inkubiert. Am embryonalen Tag 0 werden die Eier in einen Bebrutungsmkubator transferiert und bis zum embryonalen Tag 8 bei 38 +/- 0, 5 °C und 55 +/- 5% inkubiert. Nach Entnahme der Gehirne werden die Kortices isoliert, homogenisiert und Neuronen in Primarkultur genommen (Kulturbedingungen: Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 20% v/v fötales Kalberserum, 0,01% Gentamycin, 1 g/1 Glukose, 2 mM L- Glutamm, +37°C, 5% C02 und 95% Luftfeuchte) . Nach 8 Tagen in Kultur wird das zu prüfende Peptid zugesetzt (Endkonzentrationen von 1,56 bis 200 μM) und die spezifizierte Noxe ausgeführt. Bei jedem Versuch wird eine geschadigte Kontrolle und eine Vehikel-Kontrolle mitgefuhrt. Nach Ablauf der spezifizierten Stressperiode wird der Anteil der noch lebenden Neuronen mit einem metabolischen kolorimetrischen Assay bestimmt (die Umsetzung des gelben Chromophors MTT zu einem blauen Formazan-Produkt erfolgt nur durch lebende Zellen) .
Zu den Aminosäure-Sequenzen der zitierten Peptide siehe Tabelle 1.
Beispiel 1: Serum-Entzugsassay
Durch den Entzug von Wachstumsfaktoren (Reduktion der Zumischung von fötalem Kalberserum auf 2% v/v) wird ein langsamer und progredienter Zelltod durch Apoptose und Neurodegeneration herbeigeführt. Dies simuliert die Störungen in der Stimulation der Neuronen mit Nervenwachstumsfaktoren, die als eine der möglichen Ursachen neurodegenerativer Erkrankungen angenommen werden. Die Wirksamkeit der neuen Peptide in der Verhinderung des Zelltods wurden gemessen.
Insgesamt hatten m diesem Test 31 von 45 getesteten Peptidfragmente neuroprotektives, anti-apoptotisches Potential. Besonders effizient waren dabei die Substanzen BH#16 und BH#37 deren Effekte 150% über den Effekten der Kontrolle (=100%) lagen. Beim Oktapeptid BH#7 (Sequenz LSMAKEGV) lagen die Effekte bei 450%.
Beispiel 2: Chronische Störung des Kalzium Stoffwechsels durch Ionomycin Es wird vermutet, dass es bei verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen aufgrund metabolischer Fehlfunktionen zu einer chronischen Kalziumuberladung kommt, die über die Aktivierung verschieneder Enzymsysteme letztendlich Zelltod bewirkt. Bei dem vorliegenden Modell wird diese Schädigung durch eine Zugabe von Ionomycin in methanolischer Losung (Endkonzentration: lOμM) über 24 Stunden hinweg induziert. Methanol, m Medium verdünnt, dient als Vehikel-Kontrolle .
In diesem ischämischen Schadigungsmodell waren 6 Substanzen neuroprotektiv wirksam. Interessant sind vor allem 3 Substanzen: BH#8, BH#13 und BH#34 führten zu einer Steigerung der Zellvitalitat auf ca. 150%.
Beispiel 3: Oxidativer Stress durch Eisenchlorid
Langdauernde Behandlung mit Eisenchlorid stellt einen chronischen oxidativen Stress dar, der Nervenzellen, aber auch andere Zellen, zum Absterben bringt. Da Störungen im Eisenhaushalt sowohl für den Morbus Alzheimer als auch für den Morbus Parkinson, insbesondere aber bei Eisenspeichererkrankungen wie der Hallervorden-Spatz Erkrankung, beschrieben werden, stellt dieses Modell ein relevantes Testsystem dar. Am 8. Kulturtag werden Nervenzellen durch Zugabe von 10μl FeCl2-Losung geschadigt (Endkonzentration: ImM) . Geschadigt wird für 24 Stunden.
In diesem Assay wiesen 23 Peptidfragmente eine eindeutige neuroprotektive Wirkung auf, davon lag bei mehr als der Hälfte der Substanzen eine Steigerung der Vitalität auf über 150% vor. Mehr Substanzen als in jedem anderen Schadigungsassay führten zu einer Zellvitalitatssteigerung auf über 200% (BH#8, BH#10, BH#11, BH#13) bzw. 250% (BH#15, BH#6, BH#27, BH#28) .
Beispiel 4: Oxidativer Stress durch Wasserstoffsuperoxyd
Durch die Zugabe von Wasserstoffsuperoxyd zum Kulturmedium werden freie Radikale erzeugt, die in Nervenzellkulturen massiven Zelltod bewirken. Da dies einen ubiquitaren Mechanismus der Zellschadigung darstellt, hat dieses Modell sowohl für akute als auch chronische Nervendegeneration Relevanz. Am 8. Kulturtag wird den Nervenzell kulturen H202 zu einer Endkonzentration von 100 μM zugesetzt.
Insgesamt 30 Peptide zeigten hier neuroprotektives Potential. Mit Effekten von über 200% verglichen mit der geschadigten Kontrolle (= 100%) waren die Substanzen BH#5, BH#8, BH#9 und BH#29 besonders auffallend. Eine neuronale Vitalitatssteigerung auf 145% und mehr zeigten auch die Peptide BH#13, BH#29, BH#37, BH#38 und BH#46.
Beispiel 5: Amyloid-Beta Aggregations Assay
Beta-Amyloid - Peptide stellen in aggregierter Form ein potentes Neurotoxin dar, dessen Zugabe zu Nervenzellkulturen zu einem raschen und fortschreitenden Zelltod fuhrt. Da Beta-Amyloid Peptide eine wesentliche Rolle in der Pathogenese des Morbus Alzheimer darstellen, ist dieses Modell als besonders relevant anzusehen.
Bei dem vorliegenden biologschen Test handelt es sich um ein speziell für dieses Projekt entwickeltes Verfahren zur Testung anti- aggregatorischen Substanzpotentials . Die neu synthetisierten Peptide werden direkt einer frischen Losung von Amyloid-Beta Peptiden zugegeben, um die Bildung neurotoxischer Aggregate zu verhindern. Die Auswirkung dennoch entstehender Aggregate auf das Wachstum und überleben von Nervenzellkulturen ist der Meßparameter.
Sechs der getesteten 45 Peptidfragmente konnten die neurotoxische Wirkung von ß-Amyloιd25-35 teilweise kompensieren. Auffallend sind die Peptide BH#24 und BH#26, die zu einer Steigerung der neuronalen Vitalität um 44 bzw. 74% fuhren. Allerdings konnten andere Peptide, deren Synthese schwierig war oder weil nur wenig Material verfugbar war, nur einmal getestet werden. Deshalb kann nicht ausgeschlossen werden, dass das eine oder andere Peptid ebenfalls wirkungsvoll sein konnte .
Beispiel 6: Zytotoxische Wirkung von pra-aggregiertem Beta-Amyloid Peptid
Im Gegensatz zum zuvor geschilderten Test arbeitet dieser mit praformierten neurotoxischen Amyloid-Aggregaten. Um diese zu erzeugen, wird ein aus den Aminosäuren 25 bis 35 bestehendes Beta- Amyloidpeptid (ß-A(25_35) ) in phosphatgepuffertem Kochsaz gelost (1 mM) und für mindestens 72 Stunden zur Komplexbildung bei Raumtemperatur gelagert. Am 8. Kulturtag wird diese Lösung in einer Endkonzentration von 20 μM in die Kulturen pipettiert und nach 24 Stunden Exposition wird wie üblich der Anteil der lebenden Zellen bestimmt.
21 von 45 untersuchten Peptiden zeigten neuroprotektives Potential. Die Effekte lagen zwischen 120 und 150% gegenüber der ungeschädigten Vehikel-Kontrolle, wobei teilweise Effekte bereits in sehr niedrigen Dosierungen erkennbar sind.
Bis auf den Aggregationsassay (Beispiel Nr. 5), für den nur ein Versuchsdurchgang stattfand, sind in allen Abbildungen der Mittelwert (MW) und die Standardabweichung (Stabw) von zumindest zwei unabhängigen Experimenten (n>6) dargestellt. D.h. die Durchführung der Versuche erfolgte an unterschiedlichen Tagen mit unterschiedlichen Zellpräparationen und von verschiedenen Personen. Für einige Peptide wurden zwei Nummern vergeben (#1=#23 oder #6=#35 oder #7=#43), die Ergebnisse mit diesen Peptiden wurden aber nur einmal dargestellt. Ein Peptid konnte nicht getestet werden, da es nicht in Lösung gebracht werden konnte (#49) . Mit einigen anderen Substanzen gab es Probleme bei der Herstellung, weshalb nur geringe Mengen verfügbar waren und die Substanzen nicht in allen Assays ausgetestet werden konnten (#12, 14, 17,35 und #48) . Generell waren nur wenige Peptide in keinem Assay wirksam (, 18, , 32, , 41, ) . In nur einem Screening Assay wirksam waren die Peptide mit der Nummer # 12, 20, 30, 33, 39 und 45,. Wie aus den Abbildungen ersichtlich, sind die Standardabweichungen, d.h. die Schwankungen zwischen den unabhängigen Experimenten, teilweise recht groß. Diese Schwankungen sind auf Stabilitätsprobleme zurückzuführen.
Tabel le 1 :
Aminosäure-Sequenzen der getesteten Beta-Synuclein - Peptide und ihre Resultate in den biologischen Testsystemen der Beispiele 1 bi s
6
Code AA-Sequenc # AA 2%Assay lonomyci FeCI2 (% H202 ß-Amyl AßP
(% n (% viability) (% (% reag viability) viability) viability) viability) g-
(diff vs
C)
BH#1 DVFMKGLSMAKEGV 14 132+28,6 125±51 ,3 23%
BH#2 VFMKGLSMAKEGV 13 133±6,2 184±119,5 140±33,2
BH#3 FMKGLSMAKEGV 12 146*59,2 144±77,7
BH#4 MKGLSMAKEGV 11 155±16,2 148±31,3 151±31 ,1
BH#5 KGLSMAKEGV 10 143±52,4 137±18,4 145±70,0
BH#6 GLSMAKEGV 9 153±71 ,5 130±30,0 120±11 ,2
BH#7 LSMAKEGV 8 183±113,7 122±22,9 124±12,3
BH#8 SMAKEGV 7 139±29,6 156±19,4 23%
BH#9 MAKEGV 6 123±81,0
BH#10 AKEGV 5 139±34,8
BH#11 KEGV 4 132±50,0 131±11 ,4
BH#12 MDVFMKGLSMAKEG 14 156±82,9 X
BH#13 MDVFMKGLSMAKE 13 166±11 ,1 151±54,2 129±14,0
BH#14 MDVFMKGLSMAK 12 122±26,9 X X X X
BH#15 MDVFMKGLSMA 11 149±49,8 126±28,0
BH#16 MDVFMKGLSM 10 144±20,4 132±44,6
BH#17 MDVFMKGLS 9 169±103,1 124±7,3 150±116,8 X 144±26,7
BH#18 MDVFMKGL 8
BH#19 MDVFMKG 7 131 ±33,6 127±32,1 132±14,9 20%
BH#20 MDVFMK 6 132±38,7
BH#21 MDVFM 5 151±68,8 126±10,3 137±33,0
BH#22 MDVF 4 169±103,1 140±36,0 120±10,8
BH#24 DVFMKGLSMAKEG 13 125±19,0 122±3,0
BH#25 DVFMKGLSMAKE 12 169±43,8 149±21 ,0
BH#26 DVFMKGLSMAK 11
BH#27 DVFMKGLSMA 10 147±7,9 128±14,6
BH#28 DVFMKGLSM 9 130±77,3 144±8,6
BH#29 DVFMKGLS 8 157±22,1 154±42,7
BH#30 DVFMKGL 7 126±32,0
BH#31 DVFMKG 6 138±47,5 124±37,6 143±55,9
BH#32 DVFMK 5
BH#33 DVFM 4 145±20,9
BH#34 DVF 3 136±13,4 19%
BH#36 GLSMAKEG 8 183±14,9 125±26,6 134±23,9
BH#37 GLSMAKE 7 144±32,5
BH#38 GLSMAK 6 172±74,4 152±72,8 147±14,3
BH#39 GLSMA 5
BH#40 GLSM 4 164±72,5 144±30,4
BH#41 GLS 3
BH#42 GL 2 120,0±16,4 128±18,4
BH#44 SMAKEG 7 183±97,1 121,0±28,0
BH#45 SMAKE 6 148±53,4
BH#46 LSMAK 5 147±22,0
BH#47 LSMA 4 135±7,5
BH#48 LSM 3 120±15,4 120±26,5 Die nachfolgende Tabelle 2 fasst die Charakteristiken der wichtigsten Substanzen aus diesem Screening zusammen. Bei diesen Peptiden handelt es sich um die im Rahmen der Erfindung bevorzugten Peptide.
Tabelle 2:
Zusammenfassende Darstellung der hinsichtlich ihrer neuroprotektiven Wirkung auffälligsten Beta-Synuclein - Peptide
Figure imgf000015_0001
In der Beschreibung, den Ansprüchen und in den Tabellen 1 und 2 steht
A für D- oder L-Alanin,
D für D- oder L-Asparaginsäure,
E für D- oder L-Glutaminsäure,
F für D- oder L-Phenylalanin,
G für D- oder L-Glycin,
K für D- oder L-Lysin,
L für D- oder L-Leucin,
M für D- oder L-Methonin,
S für D- oder L-Serin und
V für D- oder L-Valin.
Dosierungen und Verabreichungsformen:
Im Allgemeinen werden die erfindungsgemäßen Verbindungen m therapeutisch effektiven Mengen in pharmazeutisch akzeptablen Tragern oder Losungsmitteln verabreicht. Solche Trager inkludieren (sind aber nicht beschrankt auf) physiologische Kochsalzlosung, gepufferte Kochsalzlosung, Dextrose, Wasser, Glycenn, Ethanol und Kombinationen daraus. Die jeweilige Formulierung soll an die Art der Verabreichung angepasst sein.
Die Zusammensetzung kann wenn notig auch unterschiedliche Mengen von Feuchtespendern oder Emulgatoren oder pH-puffernden Substanzen enthalten. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann eine flussige Losung sein, eine Suspension, eine Emulsion, eine Tablette, eine Pille, eine Kapsel, eine Retard-Formulierung oder ein Pulver. Die Zubereitung kann auch als Suppositoπum mit traditionellen Bindemitteln und Tragersubstanzen wie Triglyzeriden hergestellt werden. Orale Formulierungen können Standardtrager wie Mannitol, Laktose, Starke, Magnesiumsterat, Natriumsacharin, Zellulose, Magnesiumcarbonat und andere in pharmazeutischem Reinheitsgrad enthalten. Verschiedene Verabreichungssysteme sind bekannt und können verwendet werden, um die therapeutische Anwendung der erfindungsgemaßen Substanzen zu gewährleisten, wie z.B. die Verkapselung in Liposomen, Mikropartikeln, Mikrokapseln u.a..
Die Verabreichungsform wird in Übereinstimmung mit routinemäßigen Verfahren als pharmazeutische Verabreichungsform adaptiert für intravenöse Administration an Menschen oder anderen Saugetieren zubereitet. Typischerweise sind die Zusammensetzungen für die intravenöse Verabreichung Losungen m steriler isotonischer wassriger Pufferlosung. Wenn notwendig, kann die Zubereitung auch Losungsvermittler und lokal wirksame Anasthetika enthalten, um den Schmerz an der Injektionsstelle zu lindern.
Im Allgemeinen werden die Bestandteile entweder separat oder vermischt in einer Dosierungseinheit zur Verfugung gestellt. Zum Beispiel als trockenes lyophilisiertes Pulver oder wasserfreies Konzentrat m einem hermetisch versiegelten Container wie einer Ampulle, an der die Menge des aktiven Pharmakons vermerkt ist.
Wenn die Darreichungsform als Infusion verabreicht werden muss, kann sie in einer Infusionsflasche, die steriles Wasser oder Salzlosung in pharmazeutischem Reinheitsgrad enthalt, aufgelost werden. Wenn immer die Zubereitung durch Injektion verabreicht wird, kann eine Ampulle mit sterilem Wasser für Injektionszwecke oder Kochsalzlosung so zur Verfugung gestellt werden, dass die Einzelbestandteile vor der Administration bestimmungsgerecht vermischt werden können.
Die therapeutischen Substanzen, die in der Erfindung beschrieben werden, können sowohl als neutrale Form, als auch als Salz formuliert werden. Pharmazeutisch akzeptierbare Salze inkludieren solche, die mit den freien Aminogruppen gebildet wurden, z.B. jene, die von der Salzsaure oder der Oxalsäure stammen und solche, die mit freien Carboxylgruppen, wie jene abgeleitet von Natrium, Kalium, Ammonium, Calcium, Eisenoxyden, Isopropylamin, Triethylamm, 2- Ethyloaminoethanol, Histidin, Procain und anderen gebildet werden.
Die Menge des Therapeutikums, das m der Erfindung beschrieben wird, muss für die Behandlung der speziellen Erkrankung oder des Zustands effektiv sein, wird von der Natur der Erkrankung bzw. des Zustands abhangen und durch standardisierte klinische Verfahren bestimmt. Die genaue Dosis, die in der Erfindung angewendet werden muss, hangt auch von der Art der Verabreichung und dem Schweregrad der Erkrankung oder der Störung ab, und diese Menge sollte nach Einschätzung des erfahrenen Arztes unter Berücksichtigung der spezifischen Patientenumstande angepasst werden. Geeignete Dosierungs-bereiche für die intravenöse Verabreichung liegen im Allgemeinen zwischen 20 - 4.000μg des aktiven Bestandteils pro kg Korpergewicht. Geeignete Dosierungen für intranasale Anwendungen liegen im Bereich zwischen 0,01 pg pro kg Korpergewicht bis zu 1mg pro kg Korpergewicht. Effektive Dosierungen für orale Anwendungen liegen im Bereich von 1mg bis 1.000mg pro kg Korpergewicht und Tag. D e effektiven Dosierungen werden von Dosiswirkungskurven, die aus in vi tro Modellen oder Tiermodelltestsystemen abgeleitet werden, extrapoliert .

Claims

Patentansprüche :
Neues Peptid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus
DVFMKGLSMAKEGV
VFMKGLSMAKEGV
FMKGLSMAKEGV
MKGLSMAKEGV
KGLSMAKEGV
GLSMAKEGV
LSMAKEGV
SMAKEGV
MAKEGV
AKEGV
KEGV
MDVFMKGLSMAKEG
MDVFMKGLSMAKE
MDVFMKGLSMAK
MDVFMKGLSMA
MDVFMKGLSM
MDVFMKGLS
MDVFMKGL
MDVFMKG
MDVFMK
MDVFM
MDVF
DVFMKGLSMAKEG
DVFMKGLSMAKE
DVFMKGLSMAK
DVFMKGLSMA
DVFMKGLSM
DVFMKGLS
DVFMKGL
DVFMKG
DVFMK
DVFM
DVF
GLSMAKEG
GLSMAKE
GLSMAK GLSMA GLSM GLS GL LSMAKEG
LSMAKE LSMAK LSMA LSM LS.
2. Peptide nach Anspruch 1, wobei die Emzelbestandteile L- Ammosauren sind.
3. Peptide nach Anspruch 1, wobei die Emzelaminosauren D- Aminosauren sind.
4. Peptide nach Anspruch 1 oder 2, bei denen N-termmal die Aminosäure Prol substituiert ist.
5. Peptide nach Anspruch 1 oder 2, bei denen C-termmal die Aminosäure Prolm substituiert ist.
6. Peptide nach Anspruch 1 oder 2, bei denen N-termmal und C-terminal Aminosäure Prolin substituiert ist.
7. Peptide nach einem der Ansprüche 1 bis 6, die N-terminal acetyliert sind.
8. Peptide nach einem der Ansprüche 1 bis 7, die C-termmal amidiert sind.
9. Peptide nach Anspruch 7 oder 8, die N-terminal acetyliert und C-termmal amidiert sind.
10. Peptide nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäure Valin (V) durch die Aminosäure Prol (P) ersetzt ist.
11. Arzneimittel zur Anwendung bei der Therapie von Erkrankungen, bei denen das vermehrte Auftreten von freien Radikalen eine pathophysiologische Rolle spielt, gekennzeichnet durch wenigstens ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 10.
12. Arzneimittel zur Anwendung bei der Therapie von Erkrankungen mit akuter Hypoxie oder Ischämie in einem Organsystem des Korpers, insbesondere im Zentralnervensystem, gekennzeichnet durch wenigstens ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 10.
13. Arzneimittel zur Anwendung bei der Therapie von Eisenspeichererkrankungen, wie der Hallervorden- Spatz' sehen Erkrankung, gekennzeichnet durch wenigstens ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 10.
14. Arzneimittel zur Anwendung bei der Therapie neurodegenerativer Erkrankungen, insbesondere der Alzheimer ' sehen Erkrankung, der Lewy Body Variante der Alzheimer ' sehen Erkrankung, der Parkinson ' sehen Erkrankung, der
MultiSystem Atrophie, der Lewy Body Demenz oder der Huntington' s Chorea, und allen diesen neurodegenerativen Erkrankungen ähnlichen Zustandsbildern, gekennzeichnet durch wenigstens ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 10 als Wirkstoff.
15. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 11 bis 14, das zur oralen Verabreichung zubereitet ist.
16. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 11 bis 14, das zur rektalen Verabreichung zubereitet ist.
17. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 11 bis 14, das zur inhalativen Verabreichung zubereitet ist.
18. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 11 bis 14, das zur transdermalen Verabreichung zubereitet ist.
19. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 11 bis 14, das zur transmukosalen Verabreichung zubereitet ist.
20. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 11 bis 14, das zur Verabreichung auf dem Weg von wirkstoffhaltigen Implantaten zubereitet ist.
21. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 11 bis 14, das zur intracerebroventrikularen Verabreichung zubereitet ist.
22. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 11 bis 14, das zur Verabreichung durch Injektion zubereitet ist.
23. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 11 bis 14, das zur transnasalen Verabreichung zubereitet ist.
24. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 11 bis 14, das zur Verabreichung durch Infusion zubereitet ist.
25. Verwendung wenigstens eines Peptides gemäß der Ansprüche 1 bis 9 zum Herstellen eines Arzneimittels gemäß einem der Ansprüche 11 bis 14.
26. Verwendung nach Anspruch 25 zum Herstellen eines Arzneimittels gemäß der Ansprüche 11 bis 24.
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