WO2007126111A1 - アミロイドβ線維化阻害ペプチド - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to an amyloid j3 fibrosis-inhibiting peptide useful as a prophylactic / therapeutic agent for Alzheimer's disease.
  • Alzheimer's disease a typical disease of senile dementia, is a neurodegenerative disease characterized by brain atrophy, senile plaque deposition, and neurofibrillary tangles, and changes in the shape of amyloid peptide and associated fibrosis Molecule insolubilized by, deposits on nerve cells, and its toxicity induces death of nerve cells and develops.
  • Amyloid peptide (A jS) is a degradation product of neuronal amyloid precursor protein that is cleaved by secretase, etc., and two types of ⁇ 1-40 and A 1-42 are produced, but ⁇ ⁇ ⁇ -42 is more It has been reported to easily aggregate and correlate with disease and neurotoxicity.
  • the shape change and fibrosis of amyloid peptide can be inhibited, the onset of Alzheimer's disease can be prevented.
  • an agent having an action of suppressing the production of amyloid] 3 peptide such as rhodanine derivative (Japanese Patent Laid-Open No. Hei 6-192 091), benzimidazole Derivatives (US Pat. No. 5 5 5 2 4 2 6), Vinpocetine derivatives (International Publication No. 9 6/2 5 1 6 1 Pamphlet), Aromatic Amide derivatives (WO 2 04/0 1 4 8 4 3 pamphlet) are known. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide a peptide that functions as a mimic peptide of amyloid 0 peptide and can inhibit fibrosis of amyloid / 3 peptide.
  • the gist of the present invention is as follows.
  • X 1 represents a branched amino acid
  • X 2 , X 3 , X 4 , X 5 and X 6 represent the same or different ⁇ -amino acids.
  • a peptide having 8 to 30 amino acid residues comprising the amino acid sequence represented by
  • the peptide according to any of the X 4 is an aliphatic amino acid, arsenate Dorokishiamino acid or branched chain amino acid (1) to (3).
  • X 5 is a branched amino acid, imino acid, aliphatic amino acid, basic amino acid or hydroxyamino acid.
  • X 6 is a basic amino acid, an aliphatic amino acid, or a branched amino acid.
  • X 1 , X 2 , X 3 , X 4 , X 5 and X 6 are the same as defined in formula (I) described in (1) above, and X 7 , X 8 , X 9 , X 1 , X 11 and X 12 are the same or different and each represents an ⁇ -amino acid or a single bond, and Y 1 represents OH or NH 2.
  • Peptide indicated by (8) The peptide according to (7), wherein, in the formula (II), X 7 is a hydroxyamino acid or an aliphatic amino acid.
  • X 13 , X 14 and X 15 are the same or different and represent ⁇ -amino acids, ⁇ 1 and ⁇ 2 represent the same or different cysteine or serine, and ⁇ 1 and 2 2 represent system When it represents in, it may be cross-linked between them.
  • a peptide having 9 to 30 amino acid residues comprising the amino acid sequence represented by
  • a pharmaceutical composition comprising the peptide according to any one of (1) to (19).
  • amyloid j3 fibrosis inhibitor according to the above (21), which is a prophylactic or therapeutic agent for Alzheimer's disease.
  • a screening method for an amyloid j3 fibrosis-inhibiting peptide which comprises searching for a peptide that binds to an antibody and has amyloid; 8 fibrosis-inhibiting activity.
  • the peptide of the present invention is a peptide having 30 or less amino acid residues, including the amino acid sequence represented by the above formula (I) or (: [ ⁇ ), preferably the amino acid sequence represented by the above formula (I) A peptide having 8 to 20 amino acid residues and a peptide having 9 to 20 amino acid residues, including a peptide having the amino acid sequence represented by the formula (III).
  • examples of the branched amino acid represented by X 1 include parin, leucine, and isoloicin.
  • X 2 , X 3 , X 4 , X 5 , X 6 , X 7 , X 8 , X 9 , X 10 , X 11 , X 12 , X 13 is a flying single amino acid represented by X 14 or X 15, for example, glycine, aliphatic amino acids such as Aranin; arsenate Dorokishiamino acids serine, threonine and the like; valine, leucine, branched amino acids, such as Isoroishin; Acidic amino acids such as aspartic acid and glutamic acid; asparagine and glutamine Amino acids such as lysine, hydroxylysine and arginine; sulfur-containing amino acids such as cysteine, cystine and methyoyun; aromatic amino acids such as phenylalanine and thycin; and heterocyclic amino acids such as triftophan and histidine
  • Imino acids such as proline and 4-hydroxyproline
  • the single amino acid represented by X 2 is preferably a branched amino acid, a hydroxy amino acid, an aromatic amino acid, an aliphatic amino acid, more preferably valine, leucine.
  • Isoroishin, threonine, phenylene Ruara two emissions can be mentioned;
  • the flying single amino acid represented by X 3 preferably an aromatic amino acid, branched chain amino acids, more preferably phenylene Ruaranin, leucine, tyrosine elevation up It is;
  • an amino acid represented by X 4 preferably an aliphatic amino acid, arsenate Dorokishiamino acid, branched chain amino acids, more preferably Aranin, threonine, leucine, serine, valine like; represented by X 5
  • Preferred a-amino acids include branched amino acids, imino acids, aliphatic amino acids, basic amino acids, and hydroxya Amino Acids, more preferably leucine,
  • the ⁇ -amino acid represented by X 7 is preferably a hydroxyamino acid, an aliphatic amino acid, more preferably threonine or glycine; an ⁇ -amino acid represented by X 8 Preferred examples include hydroxyamino acids, amidamino acids, more preferably serine and asparagine; and the preferred amino acids represented by X 9 are preferably aliphatic amino acids, imino acids, hydroxyamino acids, amino acids. Amino acids, more preferably glycine, proline, serine, threonine, and asparagine; X 1 .
  • the ⁇ -amino acid represented by the formula is preferably a sulfur-containing amino acid, a branched amino acid, an aromatic amino acid, an imino acid, and more preferably methionine, leucine, isoloicin, phenylalanine, and proline;
  • the ⁇ -amino acid represented by X 13 is preferably an aromatic amino acid, an amino acid, more preferably tyrosine, ferrolanine, glutamine, most preferably tyrosine;
  • the ⁇ -amino acid represented by 14 is preferably a hydroxyamino acid, a heterocyclic amino acid, a basic amino acid, more preferably serine, threonine, histidine, arginine, most preferably threonine;
  • the ⁇ -amino acid represented by the formula is preferably a basic amino acid, an acidic amino acid, a branched amino acid, more preferably lysine, glutamic acid, leucine, and most preferably lysine.
  • the peptide of the present invention can also be chemically synthesized by a known method, for example, by an automatic peptide synthesizer. This basic synthesis process
  • the condensation of each amino acid and the removal of the protecting group of ⁇ -amino group are performed under almost the same conditions using the Boc and Fmoc methods, and the intermediate is not purified. Not required. Moreover, this method is quick and very convenient for synthesizing various peptides.
  • the protected peptide resin thus obtained is allowed to react with, for example, anhydrous hydrogen fluoride, trifluoromethanesulfonic acid or trifluoroacetic acid in the presence of various additives, thereby releasing the peptide from the resin and providing total protection.
  • the removal of the group can be carried out in one step.
  • a carboxyl-terminated carboxylic acid-type peptide synthesis resin is used as a resin carrier, a peptide having a carboxyl group at the carboxyl end, for example, a peptide in which Y 1 is OH in the above formula (II) can be obtained.
  • a peptide in which a strong lpoxyl-terminated carboxylic acid is amidated for example, Y 1 in the formula (II) is NH. To obtain a peptide that is it can.
  • the obtained crude peptide can be purified by a known means for purifying peptides.
  • a known means for purifying peptides for example, gel chromatography, ion exchange chromatography using cation exchange resin or anion exchange resin, and further, column chromatography and high performance liquid chromatography based on various principles such as hydrophobic chromatography and partition adsorption chromatography. It is done.
  • the peptide of the present invention contains a plurality of cysteine residues, it may be cross-linked between these cysteine residues.
  • X 1 3 , X 14 and X 15 are the same or different and represent one amino acid, and may be bridged between Cys 1 and Cys 2 )
  • a peptide having 9 to 30 amino acid residues, preferably 9 to 20 amino acids, including the amino acid sequence represented by the above formula, may be cross-linked between Cys 1 and Cys 2 .
  • disulfide bridges may be directly formed between cysteine residues, or disulfide bridges may be formed via a spacer using a disulfide compound as a spacer.
  • the disulfide bridge can be formed, for example, by oxidizing a dilute aqueous solution of the peptide with K 3 [F e (CN) 6 ] or with iodine under acidic conditions.
  • the peptides of the present invention can be obtained in various salt forms.
  • the salts include inorganic acids, salts with organic acids such as formic acid, acetic acid, tartaric acid, and quenoic acid, or inorganic bases such as sodium ammonia and organic bases such as triethylamine, ethylamine, and methylamine. Salt.
  • Biotinylation of the amino group of the peptide is possible by the usual HOBt-DCC, HBTu-HOBt method, etc., in which an amino acid derivative is condensed on a resin.
  • the screening method of the present invention is a method for converting a peptide that has not been confirmed to have amyloid fibrosis inhibitory activity into a single-chain antibody that specifically binds to Aj3 1-42 and has an activity to inhibit the fibrosis reaction. It is characterized by searching for a peptide that binds and has amyloid] 3 fibrosis inhibitory activity.
  • Preferred examples of the body include human double chain variable region fragment sc F v (B 6, B 7, D l, F 10) described in WO 200 5/10 59 998. It is done. In the present specification, these antibodies are referred to as saddle type.
  • amino acid sequence of the VH chain of B 6 sc F V (clone B 6 of WO 2005Z 1 05 9 98) is shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence of the VL chain is shown in SEQ ID NO: 2.
  • amino acid sequence of the VH chain of B 7 scF V (clone B 7 of WO 20055 105998) is shown in SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence of the VL chain is shown in SEQ ID NO: 4.
  • the amino acid sequence of the VH chain of D ls c F v (clone D 1 of WO 2005Z 1 05 998) is shown in SEQ ID NO: 5, and the amino acid sequence of the VL chain is shown in SEQ ID NO: 6.
  • the amino acid sequence of the VH chain of F 10 s c F V (clone F 10 of WO 2005Z1 05998) is shown in SEQ ID NO: 7, and the amino acid sequence of the VL chain is shown in SEQ ID NO: 8.
  • Examples of the method for obtaining the peptide of the present invention include the peptide library method described below. Furthermore, the peptide library method can be divided into a method using pacteriophage and a method of preparing the library by chemical synthesis.
  • a method for constructing a phage random peptide library may be prepared, for example, by linking a synthetic gene having a random sequence to a gene of a co-protein (for example, genelll protein or VIII protein) of the M13 family.
  • a co-protein for example, genelll protein or VIII protein
  • methods described in Science, 249, 386 (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 6378 (1990), etc. can be used.
  • the size of the gene to be inserted is not particularly limited as long as the expressed peptide is stable.
  • E. coli is again infected with phages, and Cindarco mouthni is formed on an agar medium containing antibiotics. Individual colonies cultured in liquid medium Then, the phage in the supernatant is precipitated and concentrated with polyethylene glycol or the like, and the base sequence is determined, whereby the structure of the peptide can be known.
  • a peptide library having a random amino acid sequence can be prepared by chemical synthesis in addition to the method using the phage described above.
  • a method using beads (Nature, 354, 82 (1991)), a liquid phase focusing method (Nature, 354, 84 (1991)), a microplate method (Science, 251, 767 (1991)), etc.
  • E. coli, yeast, insect cells, animal cells using artificial synthesis methods or gene recombination techniques And the like.
  • the method of artificially synthesizing a peptide can be easily performed by a general peptide synthesis method, for example, it is easy to carry out by a solid phase synthesis method, and deletion, substitution, It is also easy to produce mutants with insertions or additions (Cell Engineering Separate Volume, Anti-Peptide Antibody Experimental Protocol, p. 26-46, Shujunsha).
  • modifications such as introduction of unnatural amino acids, chemical modification of each amino acid residue, or introduction of a cysteine residue to cyclize the molecule to stabilize the structure may be performed.
  • a DNA sequence is set from the obtained amino acid sequence according to codon usage (see Molecular Cloning, Appendix D1, Maniatis et al .; Cold Spring Habor Laboratory, 1989). The introduction is technically established. Furthermore, amino acids can be converted to other residues by introducing mutations into the base sequence. For example, when expressed in Escherichia coli, the obtained DNA sequence is bound to a promoter sequence, for example, tryptophan synthase operon (Trp), lactose operon (lac) promoter, ribosome binding sequence, It is desirable to add a (SD) sequence or a transcription termination factor recognition site.
  • Trp tryptophan synthase operon
  • lac lactose operon
  • ribosome binding sequence It is desirable to add a (SD) sequence or a transcription termination factor recognition site.
  • T h T thioflavin T
  • a peptide that has been confirmed to have amyloid / 3 fibrosis inhibitory activity according to the screening method of the present invention has the peptide as a lead compound, to which one or more amino acid residues are deleted, substituted, inserted or added, Alternatively, a peptide having amyloid fibrosis inhibitory activity can be obtained by modification to produce an analogous amyloid i3 fibrosis inhibiting peptide. Whether this peptide has amyloid] 3 fibrosis inhibitory activity can be examined in the same manner as described above.
  • the present invention also provides an amyloid i3 fibrosis-inhibiting peptide obtained by the screening method.
  • “obtained by the screening method” refers to a peptide whose amyloid 3 fibrosis inhibitory activity was actually confirmed by the screening method.
  • the number of amino acid residues of the peptide is usually 6 to 40, preferably 8 to 20 and more preferably 8 to 15.
  • the peptide of the present invention has amyloid; 3 fibrosis inhibitory activity, and is useful as a prophylactic / therapeutic agent for Alzheimer's disease.
  • amyloid) 3 fibrosis-inhibiting peptide of the present invention can be administered orally or parenterally as it is or as a pharmaceutical composition mixed with a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or the like known per se.
  • the dosage form for oral administration include tablets, pills, capsules, granules, fine granules, powders, syrups, emulsions, suspensions and the like.
  • Such a dosage form is produced by a method known per se, and contains a carrier or an excipient generally used in the pharmaceutical field.
  • carriers and excipients for tablets include ratatoose, maltose, sucrose, starch, and magnesium stearate.
  • Examples of the dosage form for parenteral administration include eye drops, ointments, injections, poultices, suppositories, nasal absorption agents, pulmonary absorption agents, transdermal absorption agents, topical sustained release agents, and the like.
  • the solution preparation can be prepared by a method known per se, for example, amyloid) 3 fibrosis-inhibiting peptide, which is usually dissolved or emulsified in a sterile aqueous solution used for injections and embedded in ribosomes.
  • Peptides are susceptible to degradation by peptidases, etc. in vivo, and there are problems with reachability to the target location.
  • Use of an appropriate delivery method including W is one of the preferred modes of use.
  • the use of the peptide delipari method is one of the methods using the ribosome, but is not limited thereto.
  • the solid preparation can be prepared by a method known per se, for example, by adding mannitol, trehalose, sorbitol, lactose, glucose or the like as an excipient to amyloid fibrosis inhibiting peptide and lyophilizing it as it is. Further, it can be used in the form of powder. Further, these powders can be mixed with polylactic acid glycolic acid or the like and solidified for use.
  • the gelling agent is a method known per se, such as amyloid] 3 fibrosis inhibitor peptide such as glycerin, polyethylene glycolate, methenoresenorelose, canoleoxymethyl senolate ⁇ , hyano-oleic acid, chondroitin sulfate, etc. It can be prepared in a state dissolved in a thickener or polysaccharide.
  • human serum albumin as a stabilizer, human immune Gros purine, shed 2 macroglobulin can be added such as amino acids, also amyloid i3 fibrosis inhibitor as a dispersant or absorption promoter Alcohols, sugar alcohols, ionic surfactants, nonionic surfactants, etc. can be added as long as the activity of the peptide is not impaired. Trace metals and organic acid salts can be added as needed.
  • the dose as a peptide that is an active ingredient varies depending on the activity of the peptide, the age of the patient, the body weight, the type or degree of the disease, but in general, in oral administration, Usually 1 day 0: 00 1-: L 0 0 0 mg / kg body weight, and intravenous, intramuscular or subcutaneous administration, usually 1 day 0. 0 0 1 to 1 00 0 mg Z kg body weight is there.
  • the number of doses is usually 1 to 3 times a day for oral administration and 1 to 2 times a day for injections.
  • FIG. 1 shows the results of ELISA of peptide phage clones bound to B6 scFv.
  • FIG. 2 shows the ELISA results of 12mer peptide phage clones bound to Dl scFv.
  • Figure 3 shows the ELISA results for C7C peptide phage clones bound to Dl scFv.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of an experiment for inhibiting fibrosis of A 1-42 peptide by peptide phage.
  • FIG. 5 is a diagram showing a list of peptide sequences presented by phage clones isolated using ⁇ 6 scFv, B7 scFv, or Dl scFv that inhibit A ⁇ 1-42 fibrosis as a cocoon.
  • FIG. 6 shows a fusion molecule of a biotinylated B6 or B7 scFv binding sequence and a TAT sequence.
  • Figure 7 shows that the fusion peptide of TAT and B6-L1 is recognized by B6 scFv.
  • FIG. 8 is a graph showing the measurement results of the A ⁇ 1-42 fibrillation inhibitory activity of fusion peptides of TAT and B6-L1, B7-C15 and B7-S15, respectively.
  • FIG. 9 is a diagram showing the results of precipitation experiments of ⁇ conformers (A3 oligomers and Aj3 fibrils) using fusion peptides of ⁇ , ⁇ 6-L1 and B7-C15.
  • This specification includes the contents described in the specification and / or drawings of Japanese Patent Application No. 2 0 6-1 2 5 7 6 9 which is the basis of the priority of the present application.
  • the scFv phage clone was infected with E. coli strain HB2151 by the method of Hashiguchi et al. (J. Biochem. 133: 43-49 (2003)).
  • the amyloid-specific scFv (B6, B7, D1, F10) was purified from the obtained culture supernatant using an E-tag column (Amersham Biosciences).
  • Ph.D.-12 library (New England Biolabs, MA) displaying 12 random amino acid sequences at the amino terminal of phage genelll protein and 7 amino acids between cysteine and cysteine at the amino terminal of phage genelll protein
  • Ph.D.-C7C library (New England Biolabs, MA) that presents peptides containing amino acid sequences was used.
  • a human single-chain antibody (scFv: B6, B7, D1 or F10) or a control scFv1 / g / ⁇ 1 / well (0.1 M NaHC0 3 pH 8.6)
  • the Maxisorp plate was coated at 4 ° C for 6 hours.
  • Each blocking well was blocked at 4 ° C for 14 hours using 0.5% gelatin for the 1st banning, 0.25% BSA for the 2nd paying, and 0.5% gelatin for the 3rd banning.
  • a 12mer or C7C peptide phage library was diluted with a blocking solution (1.5 ⁇ 10 12 pfu / 100 ⁇ 1), allowed to stand for 30 minutes, and then subjected to an absorption operation with a control scFv.
  • control coat scFv-coated tool was washed three times with 0.2% Tween 20 / PBS (PBST), added with a phage solution, and allowed to react at room temperature for 1 hour to recover a phage solution that did not bind to the control scFv.
  • This fuzz solution was added to a scFv-coated well using a bowl-shaped solution and allowed to react at room temperature for 1 hour. 0.
  • 1 mg / ml BSA / 0.1 M Glycine HCl pH 2.2 was added 100 ⁇ 1 and placed at room temperature for 5 minutes to recover the bound phage.
  • the recovered phages were infected with ER2738 and cultured on LB / Tet / X-gal plate. Plaques resulting from lysis were again infected with ER2738, and phage clones were isolated.
  • Bound phage was detected using the substrate para-trofelinyl phosphate after reacting with 401 piotinylated anti-M13 monoclonal antibody (1000-fold dilution) and streptavidin alkaline phosphatase (1000-fold dilution). did.
  • Phenolone clones with specific specificity were deproteinized by treatment with phenol-chloroform, and then DNA was purified by ethanol precipitation to obtain a base sequence determination type.
  • Primer 96gIII (l pg / ⁇ ⁇ ) 5,-CCC TCA TAG ⁇ GCG ⁇ CG-3 (New England Biolabs MA) is used to amplify the gene in the region where the random peptide sequence is inserted. DNA base sequencing was performed.
  • the peptide of the present invention was synthesized by a general solid phase peptide synthesis method, Fmoc / HBTu + HOBt method. Peptides of which the TAT sequence was linked to each of peptides B6-Ll, B7-C15 and B7-S15 of the present invention were synthesized.
  • B7-C15 a TAT sequence was ligated to glycine added to the terminal end of force lupoxyl.
  • TAT sequence is a peptide sequence that has the function of crossing the cerebrovascular barrier (P. Jarver and Ulo Langel, The use of cell-penetrating peptides as a tool for gene regulation, DDT, 9: 395-401, 2004). is there.
  • TAT-B6-L1, TAT-B7-C15, TAT-B7-S15 are fusions of the TAT sequence to the amino terminal side of each of B6-Ll, B7-C15, and B7-S15, and B6 -L1 sequence strength
  • B6-L1-TAT is a fusion of TAT sequence to the lupoxyl terminal. In order to detect the binding of this peptide, it was synthesized as a peptide sequence in which piotin was bound to the amino terminal of the peptide.
  • B6-L1 SEQ ID NO: 9;
  • TAT-B6-L1 SEQ ID NO: 2 4
  • TAT-B7-S15 SEQ ID NO: 2 7
  • Peptides ( ⁇ -B6_L1, B6-L1-TAT, ⁇ - ⁇ 7-C15, TAT-B7-SI5) synthesized in A ⁇ 1-42 peptide diluted to 40 with 20 mM phosphate buffer pH 7.0 Various concentrations (1.65 nM, 16.5 nM, 33 nM) were added. Collect 10 ⁇ l samples at 0, 6 and 24 hours, add 11 Thioflavin T (Sigma) / Phosphate Buffer 90 1 and use Multilabeno plate counter, Wallac 1420 ARVOsx (Perkin—Elmer; Wellesley, MA) The fluorescence intensity at 482 nm generated by 450 nm excitation light was measured.
  • Figure 4 shows the results of an experiment to inhibit fibrosis of A
  • a / 3-4 1-42 fibrosis inhibition experiment was performed as described in (8) Fibrosis inhibition experiment.
  • pepB6-L1 and pepB6-L10 are phage clones that bind to B6 scFv, which inhibits the fibrosis of A j3 1-42, and bind to it.
  • peplEl-Ll, 1-L2, 1-L4, 1- L12 is a phage isolated by using FvlEl scFv (described in WO 2 0 0 5 — 1 0 5 9 9 8 paragraphs 0 0 7 4 to 0 0 75) as a saddle type that does not inhibit the fibrillation of A ⁇ 1-42 It is a clone.
  • the concentration of the phage clone used here is 3.0 ⁇ 10 12 virions / ml.
  • FIG. 5 shows a list of amino acid sequences of peptides displayed by phage clones isolated from ⁇ 6 scFv, B7 scFv, or Dl scFv, which inhibit A ⁇ 1-42 fibrosis.
  • the Ph.D.-12 library (abbreviated as 12mer * in FIG. 5) or the Ph.D.-C7C library (abbreviated as C7C * in FIG. 5) was used as the phage library.
  • pe P B7- C15 and pepDl-C5, C7, C20 had the same sequence.
  • the L in front of the number indicates that the clone was isolated from the 12mer library, and C is the clone isolated from the C7C library.
  • pepB6-Ll SEQ ID NO: 9
  • pepB6-L10 SEQ ID NO: 10;
  • pepDl-L5, L9 SEQ ID NO: 1 1;
  • pepDl-L6 SEQ ID NO: 1 2;
  • pepDl-L7 SEQ ID NO: 1 3;
  • pepDl- L13 SEQ ID NO: 14;
  • pepDl-L20 SEQ ID NO: 15;
  • pepB7-C15 (pepDl-C5, C7, C20): SEQ ID NO: 16;
  • pepDl-C2, C13 SEQ ID NO: 17;
  • pepDl- C18 SEQ ID NO: 1 8;
  • pepDl-C3 SEQ ID NO: 1 9;
  • pepDl-Cll SEQ ID NO: 20;
  • pepDl-C8 SEQ ID NO: 2 1;
  • pepDl-C10 SEQ ID NO: 2 2
  • FIG. 6 shows a fusion molecule of biotinylated B6 scFv binding sequence and TAT sequence.
  • TAT-B6-Ll, TAT-B7-C15, TAT-B7-S15 are B6-L1, B7-C15, B7-S15, which are fused with the TAT sequence on the amino terminal side.
  • B6-LI-TAT is a fusion of the TAT sequence to the carboxyl terminal side of this sequence.
  • TAT sequence is a peptide sequence that has a function of crossing the cerebrovascular barrier (P. Jarver and Ulo Langel, The use of cell-penetrating peptides as a tool for gene regulation, DDT, 9: 395-402,
  • the fusion peptide of TAT and B6-L1 was recognized by B6 scFv (Fig. 7).
  • the synthetic peptide, TAT-B6-L1 or B6-L1-TAT was coated on an ELISA plate at 200 ng / well, and various concentrations of B6 scFv were added to examine its binding activity.
  • An irrelevant peptide GSGGGSCGYWRSEWGLCG
  • An amount-dependent binding reaction of B6 scFv was confirmed.
  • FIG. 8 shows the measurement results of the A ⁇ 1-42 fibrosis inhibitory activity of TAT and fusion peptides of B6-Ll, B7-C15, and B7-S15.
  • the fibrosis inhibition experiment was performed as described in the fibrosis inhibition experiment. ⁇ - ⁇ 6-Ll, B6-L1-TAT, TAT-B7-C15, and TAT-B7-S15 were found to have fibrosis inhibitory activity. The control peptide did not show any inhibitory activity.
  • the peptide of the present invention is useful as an agent for preventing / treating Alzheimer's disease.

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Abstract

本発明は、アミロイドβペプチドのミミックペプチドとして機能し、アミロイドβペプチドの線維化を阻害しうるペプチドを提供する。　本発明は、次式（Ｉ）：　Ｘ１-Asp-Ｘ２-Ｘ３-Ｘ４-Pro-Ｘ５-Ｘ６　　　（Ｉ）（式中、Ｘ１は分枝アミノ酸を表し、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５及びＸ６は同一、又は異なってα−アミノ酸を表す。）で示されるアミノ酸配列を含む、アミノ酸残基数８～３０のペプチド、次式（III）：　Ｚ１-Ｘ１３-Gly-Ｘ１４-Ｘ１５-Pro-Trp-Met-Ｚ２　　　（III）（式中、Ｘ１３、Ｘ１４及びＸ１５は同一、又は異なってα−アミノ酸を表し、Ｚ１及びＺ２は同一、又は異なってシステイン又はセリンを表し、Ｚ１及びＺ２がシステインを表す場合、これらの間で架橋されていてもよい。）で示されるアミノ酸配列を含む、アミノ酸残基数９～３０のペプチド、並びに前記ペプチドを含有する医薬組成物及びアミロイドβ線維化阻害剤に関する。

Description

アミロイド ø線維化阻害べプチド 技術分野
本発明は、 アルツハイマー病の予防 ·治療剤として有用なアミロイド j3線維化 阻害ペプチドに関する。 明
背景技術
近年、 老人人口の増加に伴い、 老人性田痴呆症の治療に有効な医薬品の開発が強 く望まれている。 老人性痴呆症の代表的疾患であるアルツハイマー病は、 脳の萎 縮、 老人斑の沈着及び神経原線維変化を特徴とする神経変性疾患で、 アミロイ ド ぺプチドの形状変化と、 それに伴う線維化による不溶化分子が神経細胞に沈着 し、 その毒性により神経細胞の死が誘導され、 発症する。
アミロイド ペプチド （A jS ) はニューロンアミロイド前駆体蛋白質から セ クレターゼなどによる切断で生じる分解物で、 Α 1-40と A 1-42の 2種が生成 するが、 Α β ΐ - 42の方がより凝集しやすく、 疾患及び神経毒性と相関することが 報告されている。
アミロイド ペプチドの形状変化及ぴ線維化を阻害できれば、 アルツハイマー 病の発症を阻止することができる。
国際公開第 2 0 0 5 / 1 0 5 9 9 8号パンフレツトには、 Α β 1-42と特異的に 結合し、 その線維化反応を阻害する活性を有する一本鎖抗体がアルツハイマー病 の予防 ·治療剤として有用であることが記載されている。
しかしながら、 抗体は高分子の蛋白質であるため高価であり、 生産、 精製工程 の煩雑化、 あるいは安定性の欠如といった問題を有する。
低分子のアルツハイマー病の予防 ·治療剤としては、 アミロイド ]3ペプチドの 生成を抑制する作用を有する薬剤、 例えば、 ロダニン誘導体 （特開平 6— 1 9 2 0 9 1号公報）、ベンズィミダゾール誘導体（米国特許第 5 5 5 2 4 2 6号明細書 )、 ビンポセチン誘導体 （国際公開第 9 6 / 2 5 1 6 1号パンフレッ ト）、 芳香族 アミ ド誘導体 （国際公開第 2 0 04/0 1 4 8 4 3号パンフレツ ト） が知られて いる。 発明の開示
本発明は、 アミロイ ド 0ペプチドのミミックペプチドとして機能し、 アミロイ ド /3ぺプチドの線維化を阻害しうるべプチドを提供することを目的とする。 本発明の要旨は以下のとおりである。
( 1 ) 次式 （ I ) :
Xし Asp-X 2-X 3-X -Pro-X 5- X 6 ( I )
(式中、 X1は分枝アミノ酸を表し、 X2、 X3、 X4、 X5及ぴ X6は同一、 又は 異なって α—アミノ酸を表す。）
で示されるアミノ酸配列を含む、 アミノ酸残基数 8〜 3 0のぺプチド。
(2) 前記式 （ I ) において、 X2が分枝アミノ酸、 ヒ ドロキシアミノ酸、 芳香 族アミノ酸又は脂肪族アミノ酸である前記 （1) に記載のペプチド。
(3) 前記式 （ I ) において、 X3が芳香族アミノ酸又は分枝アミノ酸である前 記 （1) 又は （2) に記載のペプチド。
(4) 前記式 （ I ) において、 X4が脂肪族アミノ酸、 ヒ ドロキシアミノ酸又は 分枝アミノ酸である前記 （1 ) 〜 （3) のいずれかに記載のペプチド。
(5) 前記式 （ I ) において、 X 5が分枝アミノ酸、 イミノ酸、 脂肪族アミノ酸、 塩基性アミノ酸又はヒ ドロキシアミノ酸である前記 （1) 〜 （4) のいずれかに 記載のぺプチド。
(6) 前記式 （ I ) において、 X6が塩基性アミノ酸、 脂肪族アミノ酸又は分枝 アミノ酸である前記 （1) 〜 （5) のいずれかに記載のペプチド。
(7) 次式 (II) ：
X7-X8-X9-X10-X1-Asp-X2-X3-X-Pro-X5-X6-X11-X12-Y1 (II)
(式中、 X1、 X2、 X3、 X4、 X5及び X6は前記 （1 ) に記載の式 （ I ) 中の 定義と同一であり、 X7、 X8、 X9、 X1。、 X11及び X12は同一、 又は異なって α—アミノ酸又は単結合を表し、 Y1はOH又はNH2を表す。）
で示されるぺプチド。 (8) 前記式 （II) において、 X7がヒ ドロキシアミノ酸又は脂肪族アミノ酸で ある前記 （7) に記載のペプチド。
(9) 前記式 （II) において、 X 8がヒ ドロキシアミノ酸又はアミ ドアミノ酸で ある前記 （7) 又は （8) に記載のペプチド。
(1 0) 前記式 （II) .において、 X9が脂肪族アミノ酸、 イミノ酸、 ヒ ドロキシ アミノ酸又はアミ ドアミノ酸である前記 （7) 〜 （9) のいずれかに記載のぺプ チド。
(1 1) 前記式 （II) において、 X10が含硫アミノ酸、 分枝アミノ酸、 芳香族ァ ミノ酸又はイミノ酸である前記 （7) 〜 （1 0) のいずれかに記載のペプチド。 (1 2) 前記式 （II) において、 X 11が複素環式アミノ酸、 芳香族アミノ酸、 脂 肪族アミノ酸又は分枝アミノ酸である前記 （7) 〜 （1 1) のいずれかに記載の ぺプチド。
(1 3) 前記式 （II) において、 X 12が分枝アミノ酸、 酸性アミノ酸又はイミノ 酸である前記 （7) 〜 （1 2) のいずれかに記載のペプチド。
(14) 前記式 （I) で示されるアミノ酸配列と、 次式：
Tyr-ijly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg
で示される TAT配列とを含む、 アミノ酸残基数 19〜30のぺプチドである前 記 （1) 〜 （1 3) のいずれかに記載のペプチド。
(1 5) 次式 （III) ：
Zし X13- Gly- X14- X15- Pro- Trp- Met- Z 2 (III)
(式中、 X13、 X14及び X15は同一、 又は異なって α—アミノ酸を表し、 Ζ1及 び Ζ 2は同一、 又は異なってシスティン又はセリ ンを表し、 ∑ 1及び22がシステ インを表す場合、 これらの間で架橋されていてもよい。）
で示されるアミノ酸配列を含む、 アミノ酸残基数 9〜 30のぺプチド。
(1 6) 前記式 （III) において、 X13が芳香族アミノ酸である前記 （1 5) に 記載のぺプチド。
(1 7) 前記式 （III) において、 X14がヒ ドロキシアミノ酸である前記 （1 5 ) 又は （1 6) に記載のペプチド。
(1 8) 前記式 （III) において、 X15が塩基性アミノ酸である前記 （1 5) 〜 (1 7) のいずれかに記載のペプチド。
(1 9) 前記式 （III) で示されるアミノ酸配列と、 次式：
Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg
で示される TAT配列とを含む、 アミノ酸残基数 20〜30のぺプチドである前 記 （1 5) 〜 （1 8) のいずれかに記載のペプチド。
(20) 前記 （1) 〜 （1 9) のいずれかに記載のペプチドを含有する医薬組成 物。
(21) 前記 （1) 〜 （1 9) のいずれかに記載のペプチドを含有するアミロイ ド /3線維化阻害剤。
(22) アルツハイマー病の予防 .治療剤である前記 （21) に記載のアミロイ ド j3線維化阻害剤。 '
(23) アミロイ ド /3線維化阻害活性を有することが確認されていないペプチド から、アミロイ ド ;3ペプチド 1-42 と特異的に結合してその線維化反応を阻害する 活性を有する一本鎖抗体に結合し、 かつアミロイ ド; 8線維化阻害活性を有するぺ プチドを探索することを特徴とするアミロイ ド j3線維化阻害ペプチドのスクリー ニング方法。
(24) 前記 （23) に記載のスクリーニング方法により取得されるアミロイ ド β線維化阻害べプチド。
本発明のペプチドは、 前記式 （ I ) 又は （： [π) で示されるアミノ酸配列を含む 、 アミノ酸残基数 30以下のペプチドであり、 好ましくは前記式 （ I) で示され るアミノ酸配列を含む、 アミノ酸残基数 8〜 20のペプチド及び前記式 （III) で 示されるアミノ酸配列を含む、 アミノ酸残基数 9〜 20のぺプチドである。
前記式 （ I ) において、 X1で表される分枝アミノ酸としては、 パリン、 ロイ シン、 ィソロイシン等が挙げられる。
前記式 （ 1 )、 (II) 又は (III) において、 X2、 X3、 X4、 X5、 X6、 X7、 X8、 X9、 X10、 X11、 X12、 X13、 X14又は X15で表されるひ一アミノ酸と しては、 例えば、 グリシン、 ァラニン等の脂肪族アミノ酸；バリン、 ロイシン、 ィソロイシン等の分枝アミノ酸；セリン、 トレオニン等のヒ ドロキシアミノ酸； ァスパラギン酸、 グルタミン酸等の酸性アミノ酸；ァスパラギン、 グルタミン等 のアミ ドアミノ酸； リシン、 ヒ ドロキシリシン、 アルギニン等の塩基性アミノ酸 ； システィン、 シスチン、 メチォユン等の含硫アミノ酸； フエ二ルァラニン、 チ 口シン等の芳香族アミノ酸； トリブトファン、 ヒスチジン等の複素環式アミノ酸
；プロリン、 4ーヒ ドロキシプロリン等のィミノ酸が挙げられる。
前記式 （ I ) 及び （II) において、 X 2で表されるひ一アミノ酸としては、 好 ましくは分枝アミノ酸、 ヒ ドロキシアミノ酸、芳香族アミノ酸、脂肪族アミノ酸、 更に好ましくはバリン、 ロイシン、 ィソロイシン、 トレオニン、 フエ二ルァラ二 ンが挙げられ ； X 3で表されるひ一アミノ酸としては、 好ましくは芳香族アミノ 酸、 分枝アミノ酸、 更に好ましくはフエ二ルァラニン、 ロイシン、 チロシンが挙 げられ； X 4で表される 一アミノ酸としては、 好ましくは脂肪族アミノ酸、 ヒ ドロキシアミノ酸、 分枝アミノ酸、 更に好ましくはァラニン、 トレオニン、 ロイ シン、 セリン、 バリンが挙げられ； X 5で表される a—アミノ酸としては、 好ま しくは分枝アミノ酸、 イミノ酸、 脂肪族アミノ酸、 塩基性アミノ酸、 ヒ ドロキシ アミノ酸、 更に好ましくはロイシン、 イソロイシン、 プロリン、 ァラニン、 アル ギユン、 セリンが挙げられ； X 6で表される 一アミノ酸としては、 好ましくは 塩基性アミノ酸、 脂肪族アミノ酸、 分枝アミノ酸、 更に好ましくはアルギニン、 ァラニン、 ロイシン、 イソロイシンが挙げられる。
前記式 （II) において、 X 7で表される α—アミノ酸としては、 好ましくはヒ ドロキシアミノ酸、 脂肪族アミノ酸、 更に好ましくはトレオニン、 グリシンが挙 げられ； X 8で表される α—アミノ酸としては、好ましくはヒ ドロキシアミノ酸、 アミ ドアミノ酸、 更に好ましくはセリン、 ァスパラギンが挙げられ； X 9で表さ れるひ一アミノ酸としては、 好ましくは脂肪族アミノ酸、 イミノ酸、 ヒ ドロキシ アミノ酸、 アミ ドアミノ酸、 更に好ましくはグリシン、 プロリン、 セリン、 トレ ォニン、 ァスパラギンが挙げられ； X 1。で表される α—アミノ酸としては、 好ま しくは含硫アミノ酸、 分枝アミノ酸、 芳香族アミノ酸、 イミノ酸、 更に好ましく はメチォニン、 ロイシン、 ィソロイシン、 フエ二ルァラニン、 プロリンが挙げら れ； X 1 1で表される α—アミノ酸としては、 好ましくは複素環式アミノ酸、 芳香 族アミノ酸、 脂肪族アミノ酸又は分枝アミノ酸、 更に好ましくはヒスチジン、 チ 口シン、 ァラニン、 ロイシンが挙げられ； X 1 2で表される 一アミノ酸としては 、 好ましくは分枝アミノ酸、 酸性アミノ酸、 イミノ酸、 更に好ましくはパリン、 グルタミン酸、 プロリンが挙げられる。
前記式 （III) において、 X 1 3で表される《—アミノ酸としては、 好ましくは 芳香族アミノ酸、アミ ドアミノ酸、更に好ましくはチロシン、フエ-ルァラニン、 グルタミン、 最も好ましくはチロシンが挙げられ； X 1 4で表される α—アミノ酸 としては、好ましくはヒ ドロキシアミノ酸、複素環式アミノ酸、塩基性アミノ酸、 更に好ましくはセリン、 トレオニン、 ヒスチジン、 アルギニン、 最も好ましくは トレオニンが挙げられ； X 1 5で表される α—アミノ酸としては、 好ましくは塩基 性アミノ酸、 酸性アミノ酸、 分枝アミノ酸、 更に好ましくはリシン、 グルタミン 酸、 ロイシン、 最も好ましくはリシンが挙げられる。
本発明のペプチドは、 公知の方法によって化学合成することもでき、 例えばべ プチド自動合成装置によって合成することができる。 この基本的な合成過程は
R. B. Merifield, Advance in Enzymology 32： 221-296 (1969)に記載の方法を適用 できる。 この方法は、 カルボキシル末端のアミノ酸を樹脂担体.に共有結合させて おき、 a—アミノ基の保護基の除去、 保護アミノ酸の縮合を順次繰返して、 アミ ノ末端に向けてぺプチド鎖を延長させ目的のアミノ酸配列を有するぺプチド樹脂 を得ることを原理とするものである。
各アミノ酸の縮合や α—ァミノ基の保護基の除去等は、 Boc, Fmoc 法を利用し てほぼ同一の条件でなされ、 中間体の精製も行わないため、 合成に際しては一般 に高度な熟練は要求されない。 しかもこの方法は迅速であり、 種々のペプチドを 合成するに際し、 非常に便利な方法である。 こうして得られた保護ペプチド樹脂 を、 例えば無水フッ化水素、 トリフルォロメタンスルホン酸もしくはトリフルォ 口酢酸と種々の添加物の共存下に反応させることにより、 ぺプチドを樹脂から脱 離させることと全保護基の除去を一段階で行うことができる。
樹脂担体としてカルボキシル末端カルボン酸型ぺプチド合成用樹脂を用いれば、 カルボキシル末端がカルボキシル基であるペプチド、 例えば前記式 （II) におい て、 Y 1が O Hであるペプチドを得ることができ、 カルボキシル末端アミ ド型ぺ プチド合成用樹脂を用いれば、 力ルポキシル末端カルボン酸がアミ ド化されたぺ プチド、 例えば前記式 （II) において、 Y 1が N H。であるペプチドを得ることが できる。
得られたぺプチド粗製物は、 ぺプチドを精製する公知の手段で精製することが できる。 例えば、 ゲル濾過、 陽イオン交換樹脂もしくは陰イオン交換樹脂を用い るイオン交換クロマトグラフィー、 更には疎水クロマトグラフィー、 分配吸着ク 口マトグラフィーなど、 種々の原理によるカラムクロマトグラフィーや高速液体 クロマトグラフィーが挙げられる。
本発明のペプチドは、 複数のシスティン残基を含む場合には、 それらのシステ イン残基の間で架橋されていてもよい。 例えば、 次式 （Ili a ) ：
Cysし X 1 3-Gly-X 1 4- X 1 5- Pro- Trp-Met- Cys2 (III a )
(式中、 X 1 3、 X 1 4及び X 1 5は同一、 又は異なって 一アミノ酸を表し、 Cys1 と Cys2の間で架橋されていてもよい。）
で示されるアミノ酸配列を含む、 アミノ酸残基数 9 〜 3 0、 好ましくは 9〜 2 0 のペプチドは、 Cys1と Cys2の間で架橋されていてもよい。
これらの架橋としては、システィン残基間を直接ジスルフィ ド架橋してもよく、 またスぺーサ一としてジスルフイ ド化合物を用いて、 スぺーサーを介してジスノレ フイ ド架橋してもよい。 ジスルフイド架橋は、 例えばペプチドの希釈水溶液を K 3 [ F e ( C N) 6 ] で酸化、 又は酸性条件下のヨウ素で酸化することにより形成 することができる。
本発明のペプチドは種々の塩の形で得ることできる。 その塩としては、 例えば 無機酸や、 蟻酸、 酢酸、 酒石酸、 クェン酸などの有機酸との塩、 もしくはナトリ ゥムゃアンモニアなどの無機塩基や、 トリェチルァミン、 ェチルァミン、 メチル ァミンなどの有機塩基との塩が挙げられる。
ぺプチドのァミノ基のビォチン化はアミノ酸誘導体を樹脂上で縮合する通常の HOBt-DCC, HBTu— HOBt方法などで可能である。
本発明のスクリーニング方法は、 アミロイド 線維化阻害活性を有することが 確認されていないペプチドから、 A j3 1-42と特異的に結合してその線維化反応を 阻害する活性を有する一本鎖抗体に結合し、 かつアミロイド ]3線維化阻害活性を 有するぺプチドを探索することを特徴とするものである。
A β 1-42と特異的に結合し、その線維化反応を阻害する活性を有する一本鎖抗 体 （ s c F V ) としては、 好ましくは、 WO 200 5/1 0 59 98に記載され ているヒ トー本鎖可変領域フラグメント s c F v (B 6、 B 7、 D l、 F 1 0) が挙げられる。 本明細書において、 これらの抗体を鎵型と称する。
B 6 s c F V (WO 2005Z 1 05 9 98のクローン B 6) の VH鎖のアミ ノ酸配列を配列番号 1に、 V L鎖のアミノ酸配列を配列番号 2に示す。
B 7 s c F V (WO 200 5ダ 105998のクローン B 7) の VH鎖のアミ ノ酸配列を配列番号 3に、 VL鎖のアミノ酸配列を配列番号 4に示す。
D l s c F v (WO 2005Z 1 05 998のクローン D 1 ) の VH鎖のアミ ノ酸配列を配列番号 5に、 V L鎖のアミノ酸配列を配列番号 6に示す。
F 1 0 s c F V (WO 2005Z1 05998のクローン F 1 0) の VH鎖の アミノ酸配列を配列番号 7に、 VL鎖のアミノ酸配列を配列番号 8に示す。
本発明のぺプチドを得るための方法としては、 例えば以下に述べるぺプチドラ イブラリー法が挙げられる。 更に、 ペプチドライブラリ一法は、 パクテリオファ ージを用いる方法と、 化学合成でライブラリ一を作製する方法に分けられる。 ファージランダムぺプチドライブラリーを構築する方法は、 例えば M13系ファ 一ジのコ一トプロティン（例えば genelll蛋白や VIII蛋白）の遺伝子にランダム な配列を有する合成遺伝子を連結し、作製すればよい。その方法としては、 Sc i ence, 249, 386 (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 6378 (1990) 等に記載され た方法を用いることができる。 挿入する遺伝子の大きさは、 発現されるペプチド が安定であれば特に制限はないが、 作製したライブラリーがより多くのランダム な配列を網羅し、 更に標的分子に結合能を有するためには 6から 1 5アミノ酸が 好ましレ、。鎳型とする s c F Vに結合するぺプチドファージを選択するためには、 カラムやマイクロタイタープレート上に精製した前記 s c F vを直接あるいは抗 I g G抗体等を介して固定化し、 前記ライブラリーを接触させる。 その後、 非結 合ファージは洗浄操作で洗い流す。洗浄後、結合しているファージを酸で溶出し、 中和した後、 大腸菌に感染させ増幅させる。 この操作 （バニング） を 3回か 4回 繰り返すと、 前記 s c F Vに親和性のあるファージが濃縮される。 ここで単一な クローンを得るためには、 再度大腸菌にファージを感染させ、 抗生物質を含んだ 寒天培地上でシンダルコ口ニーを形成させる。 個々のコロニーを液体培地で培養 した後、 上清中のファージをポリエチレングリコール等で沈殿濃縮し、 その塩基 配列を決定すれば、 ぺプチドの構造を知ることができる。
ランダムなアミノ酸配列を有するぺプチドライブラリ一は、 前記のファージを 用いる方法のほか、 化学合成で作製することも可能である。 その方法としては、 ビーズを用いる方法（Nature, 354, 82 (1991) )、 液相フォーカシング法（Nature, 354, 84 (1991) )、 マイクロプレート法（Science, 251, 767 (1991) )等が挙げられ ライブラリーより得られた配列を有するぺプチドを大量に調製するためには、 人工的にぺプチドを合成する方法や、遺伝子組換え技術を利用して大腸菌、酵母、 昆虫細胞、 動物細胞等で発現させる方法が挙げられる。
人工的にぺプチドを合成する方法は、 一般的なぺプチド合成法により容易に行 うことができ、例えば固相合成法で行うことが簡便であり、目的の配列に、欠失、 置換、挿入又は付加を施した変異体を作製することも容易である（細胞工学別冊、 抗ペプチド抗体実験プロトコール、 p. 26-46、 秀潤社）。 また、 非天然型アミノ酸 の導入、 各アミノ酸残基の化学修飾やシスティン残基を導入することにより分子 内を環化させて構造を安定化させる等の修飾を施してもよい。
遺伝子組換え技術を利用する場合、 得られたアミノ酸配列から、 codon usage に従って DNA配列を設定し（Molecular Cloning, Appendix D1参照， マニアティ スら ； Cold Spring Habor Laboratory社、 1989)、 宿主の細胞に導入することは、 技術的に確立されている。 更に、 塩基配列に変異を導入することにより、 ァミノ 酸を他の残基に変換することも可能である。 例えば大腸菌で発現させる場合は、 得られた DNA配列をプロモーター配列、 例えばトリプトファン合成酵素オペ口ン (Trp)、 ラクトースォペロン（lac)プロモーターに結合し、 リボゾーム結合配列、
Figure imgf000011_0001
(SD)配列や転写終結因子認識部位を付加することが望 ましい。作製した発現ベクターを大腸菌に導入する方法等は Molecular Cloning ( マニアテイスら ； Cold Spring Habor Laboratory社、 1989)記載の方法が使用で きる。 発現産物を精製する方法は、 例えば各種クロマトグラフィーを用いること ができる。
得られたぺプチドがアミロイド /3線維化阻害活性を有するか否かを調べる方法 としては、例えば、チオフラビン T ( T h T )法（H. Levine, III, Protein Science 21： 404-410 (1993) ) が挙げられる。
本発明のスクリーニング方法に従ってアミロイド /3線維化阻害活性が確認され たペプチドは、 該ペプチドをリード化合物とし、 これに、 1もしくは 2以上のァ ミノ酸残基の欠失、 置換、 挿入もしくは付加、 又は修飾を施し、 アミロイド 線 維化阻害活性を有するペプチドを得ることにより、 類縁のアミロイド i3線維化阻 害ぺプチドを製造することができる。 このぺプチドがアミロイド ]3線維化阻害活 性を有するか否かは、 前記の方法と同様にして調べることができる。
本発明は、 また、 前記スクリーニング方法により取得されるアミロイド i3線維 化阻害ペプチドを提供する。ここで、 「前記スク リーニング方法により取得される 」 とは、 前記スクリーニング方法により実際にアミロイ ド 3線維化阻害活性が確 認されたペプチドをいう。 前記ペプチドのアミノ酸残基数は、 通常 6〜4 0、 好 ましくは 8〜 2 0、 更に好ましくは 8〜1 5である。
本発明のペプチドは、 アミロイド ;3線維化阻害活性を有し、 アルツハイマー病 の予防 ·治療剤として有用である。
本発明のアミロイド) 3線維化阻害べプチドは、 そのままもしくは自体公知の薬 学的に許容される担体、 賦形剤等と混合した医薬組成物として経口又は非経口的 に投与することができる。
経口投与のための剤形としては、具体的には錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、 細粒剤、 散剤、 シロップ剤、 乳剤、 懸濁剤等が挙げられる。 かかる剤形は、 自体 公知の方法によって製造され、 製剤分野において通常用いられる担体もしくは賦 形剤を含有するものである。例えば錠剤用の担体、賦形剤としては、ラタトース、 マルトース、 ショ糖、 澱粉、 ステアリン酸マグネシウム等が挙げられる。
非経口投与のための剤形としては、例えば、点眼剤、軟膏剤、注射剤、湿布剤、 坐薬、 経鼻吸収剤、 経肺吸収剤、 経皮吸収剤、 局所徐放剤等が挙げられる。 溶液 製剤は自体公知の方法、 例えば、 アミロイド )3線維化阻害ペプチドを通常、 注射 剤に用いられる無菌の水溶液に溶解、 更には乳化して、 リボソームに包埋させた 状態で調製されうる。ぺプチドは生体内でぺプチダーゼ等による分解を受け易く、 また目的の場所への到達性の問題等があることから、 ここに述べたリボソームを W 含む適切なデリバリー法の活用は好ましい使用形態の一つである。 ぺプチドのデ リパリ一法の活用については前記リボソームを用いる方法はその一つであるが、 これに限られたものではない。 固体製剤は、 自体公知の方法、 例えば、 アミロイ ド 線維化阻害ペプチドにマンニトール、 トレハロース、 ソルビトール、 ラクト ース、 グルコース等を賦形剤として加え、 そのまま凍結乾燥することにより調製 されうる。 更にこれを粉体化して用いることもできる。 また、 これら粉体をポリ 乳酸ゃグリコール酸等と混合し固体化して用いることもできる。 ゲル化剤は、 自 体公知の方法、 例えば、 アミロイド ]3線維化阻害べプチドをグリセリン、 ポリェ チレングリ コーノレ、 メチノレセノレロース、 カノレボキシメチルセノレ π ス、 ヒアノレ口 ン酸、 コンドロイチン硫酸等の増粘剤や多糖に溶解した状態で調製されうる。 いずれの製剤においても、 安定化剤としてヒ ト血清アルブミン、 ヒ ト免疫グロ プリ ン、 ひ 2マクログロブリン、 アミノ酸等を添加することができ、 また分散剤 あるいは吸収促進剤としてアミロイド i3線維化阻害べプチドの活性を損なわない 範囲でアルコール、 糖アルコール、 イオン性界面活性剤、 非イオン性界面活性剤 等を添加することができる。 また、 微量金属や有機酸塩も必要に応じて加えるこ とができる。
本発明の医薬組成物において、 有効成分であるペプチドとしての投与量は、 当 該ペプチドの活性、 患者の年令、 体重、 疾患の種類又は程度により異なるが、 一 般には、 経口投与では、 通常 1日 0 . 0 0 1〜： L 0 0 0 m g / k g体重であり、 静脈内、 筋肉内又は皮下投与では、 通常 1 日 0 . 0 0 1〜 1 0 0 0 m g Z k g体 重である。 投与回数は、 通常経口投与では 1日 1〜3回、 注射剤では 1日 1〜2 回である 図面の簡単な説明
図 1は、 B6 scFvに結合したペプチドファージクローンの ELISAの結果を示す 図である。
図 2は、 Dl scFvに結合した 12merペプチドファージクローンの ELISAの結果 を示す図である。
図 3は、 Dl scFvに結合した C7Cペプチドファージクローンの ELISAの結果を 示す図である。
図 4は、ぺプチドファージによる A 1-42ぺプチドの線維化阻害実験の結果を 示す図である。
図 5は、 A β 1-42の線維化を阻害する Β6 scFv、 B7 scFv又は Dl scFvを铸型 として単離したファージクローンの提示するべプチド配列一覧を示す図である。 図 6は、 ビォチン化した B6又は B7 scFv結合性配列と TAT配列との融合分子を 示す図である。
図 7は、 TATと B6-L1の融合べプチドが B6 scFvに認識されることを示す図で あな。
図 8は、 TATと B6- L1、B7 - C15及び B7- S15それぞれとの融合べプチドの A β 1-42 線維化阻害活性の測定結果を示す図である。
図 9は、 ΤΑΤと Β6- L1及ぴ B7-C15それぞれとの融合ペプチドによる Α コンホ 一マー （A 3オリゴマー及び A j3線維） の沈降実験の結果を示す図である。 本明細書は、 本願の優先権の基礎である特願 2 0 0 6 - 1 2 5 7 6 9の明細書 及び/又は図面に記載される内容を包含する。 発明を実施するための最良の形態
以下、 製造例及び実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、 本発明はこ れらに限定されるものではない。
(実施例 1 )
Kaji et al. , J. Biochem. 129： 577-583 (2001)及び S. Hashiguchi et al. , J. Biochera. 133 : 43-49 (2003)に従って以下の実験を行った。
1 . 材料及び方法
( 1 ) E - tagカラムによる scFvの精製
に結合する scFvを発現させるために、 Hashiguchiらの方法 （J. Biochem. 133： 43-49 (2003) ) により scFvファージクローンを大腸菌株 HB2151に感染させ た。 得られた培地上清から E- tagカラム Amersham Biosciences) を用いてアミ口 イド特異的 scFv ( B 6、 B 7、 D l、 F 10) を精製した。 W
( 2 ) ペプチドファージライブラリー
ファージの genelll蛋白のァミノ末端に 12個のランダムなアミノ酸配列を提示 した Ph. D. - 12ライブラリー（New England Biolabs, MA)及びファージの genelll 蛋白のァミノ末端にシスティンとシスティンの間に 7つのアミノ酸配列を含むぺ プチドを提示する Ph. D. - C7Cライブラリー（New England Biolabs、 MA)を用いた。
( 3 ) バイオバニング
铸型となるヒ ト一本鎖抗体（scFv： B 6、 B 7、 D 1 又は F 10)又はコントロール scFv 1 / g/ΙΟΟ μ 1/well (0. 1 M NaHC03 pH 8. 6)を Maxisorp plateに 4°Cで 6時 間コートした。 ブロッキング溶液としてそれぞれのゥエルを 1st バニングでは 0. 5%ゼラチン， 2ndパユングでは 0. 25% BSA， 3rdバニングでは 0. 5%ゼラチンを用 レヽて 4°Cで 14時間ブロックした。 12mer又は C7Cぺプチドファージライブラリ一 をブロッキング溶液で希釈後（1. 5 X 1012 pfu/100 μ 1) 30分静置後、 コントロー ノレ scFvで吸収操作を行った。 すなわち、 コントローノレ scFvをコートしたゥヱル を 0. 2% Tween 20/PBS (PBST)で 3回洗浄しファージ溶液を加え室温で 1時間反応 させ、 コントロール scFvと結合しなかったファージ溶液を回収した。 このファー ジ溶液を铸型とする scFvをコートしたゥエルに加え室温で 1時間反応させた。 0. 2% PBSTを用いて 10回洗浄後 1 mg/ml BSA / 0. 1 M グリシン塩酸 pH 2. 2を 100 μ 1加え室温で 5分置くことにより結合したファージを回収し、 ただちに 1 M ト リス塩酸 ρΗ 9· 1を 15 μ 1加え中和した。 回収したファージを大腸菌 ER2738に感 染させ増幅させ、 2, 3ラウンドのバニングに用いた（1. 5 X 1012 pfu/100 1)。
( 4 ) ファージクローンの単離
パニングを 2回行った後、回収したファージを ER2738に感染させ LB/Tet/X- gal plateで培養した。 溶菌してできたプラークを再度 ER2738に感染させ、 ファージ クローンを単離した。
( 5 ) ELISA
バニングで铸型とした scFv又はコントロール scFv 50 ng/40 μ 1/ ell (0. 1 M NaHC03 pH 8. 6)を ELISAプレ トに 4°Cで 6時間コートした。 0. 5%ゼラチンを用 レヽて 4°Cで 13時間プロックした。 0. 2% PBSTを用いてゥエルを 3回洗浄後、 単離 したべプチドファージクローン溶液（約 1. 6 X 1011 virions/40 a 1)を加え室温で 1時間反応させた。 結合したファージは 40 1のピオチン化抗 M13モノクローナ ル抗体（1000倍希釈）、 ス トレプトアビジンアルカリフォスファターゼ（1000倍希 釈）を反応させた後、 基質パラ-トロフエ二ルリン酸を用いて検出した。
( 6 ) DNA塩基配列解析
特異性の認められたファージクローンをフヱノールノクロロホルム処理して除 蛋白した後、 エタノール沈殿で DNA を精製し、 塩基配列決定の铸型とした。 primer- 96gIII (l pg/ μ ΐ) 5， - CCC TCA TAG ΤΤΑ GCG ΤΑΑ CG - 3， (New England Biolabs MA)を用いて、ランダムなぺプチド配列が揷入されている領域の遺伝子増幅を行い 、 DNA塩基配列決定を行った。
( 7 ) ペプチド合成
本発明のペプチドは、 一般的な固相ペプチド合成法、 Fmoc/HBTu+HOBt法により 合成した。 本発明のペプチド B6- Ll， B7-C15, B7 - S15のそれぞれに TAT配列を連 結したペプチドを合成した。 なお、 B7- C15については、 力ルポキシル末端側にグ リシンを付加したものに TAT配列を連結した。 ちなみに TAT配列は脳血管関門を 通過する機能をもつペプチド配列である （P. Jarver and Ulo Langel, The use of cell-penetrating peptides as a tool for gene regulation, DDT, 9 : 395 - 401, 2004) である。
なお、 B6 - Ll， B7-C15, B7-S15のそれぞれの配列のァミノ末端側に TAT配列を 融合したものが TAT-B6-L1, TAT-B7-C15, TAT- B7- S15であり、 B6-L1の配列の力 ルポキシル末端側に TAT配列を融合したものが B6- L 1- TATである。 このペプチド の結合を検出するためにべプチドのァミノ末端にピオチンが結合しているべプチ ド配列として合成した。
B6-L1, B7-C15, B7 - S15、 及びこれらと TAT配列との融合分子のアミノ酸配列と 配列番号との関係は以下のとおりである。
B6-L1：配列番号 9 ；
B7-C15：配列番号 1 6
B7-S15：配列番号 2 3
TAT-B6-L1：配列番号 2 4
B6-L1-TAT：配列番号 2 5 TAT- B7 - CI 5：配列番号 26
TAT-B7-S15：配列番号 2 7
(8) アミロイ ド 線維化阻害実験
20 mMリン酸バッファー pH 7.0を用いて 40 に希釈した A β 1-42ぺプチド に合成したペプチド（ΤΑΤ - B6_L1， B6-L1-TAT, ΤΑΤ - Β7 - C15， TAT- B7- SI 5)を様々な 濃度（1.65 nM， 16.5 nM, 33 nM)で加えた。 0， 6， 24時間に 10 μ 1のサンプルを 回収し 11 のチオフラビン T (Sigma)/リン酸バッファー 90 1 を加えマルチ ラベノレプレートカウンター、 Wallac 1420 ARVOsx (Perkin— Elmer； Wellesley, MA) を用い、 450nmの励起光により発生する 482nmの蛍光強度を測定した。
(9) A jS線維化阻害ペプチドによる A ]3コンホーマー （Α オリゴマー及び A )3線維） の沈降実験
A β 1-42 を 20 mM リン酸バッファー pH 7.0に 40 μΜの濃度で溶解し、 その 1.5時間目に、 40 Μに調製した ΤΑΤ-Β6- L1又は ΤΑΤ-Β7- C15ぺプチドを液量比 （ 1:1) で加え 37°Cで 1時間反応させた （最終濃度： A [20 M] /合成べプチド [20 μ Μ])0 反応後、 免疫沈降前のサンプルを 「沈降前」 として一部サンプリングし、 残りのサンプルを 20 g/μ ΐに調製した Μ- 280ストレブロアビジン-マグネット ビーズ （Dynal Biotech, Oslo, Norway) と液量比 （1:1) で氷上で 1時間反応さ せた （最終濃度： Aj3 [10 M]/合成ペプチド [10 μΜ]/ビーズ [10
Figure imgf000017_0001
。 反 応後、 マグネットによりビーズを沈降させ上清を 「上清」 とした。 沈降したビー ズに回収した上清と等液量の PBSを加え 「沈殿物」 とした。 得られた各サンプル を電気泳動し、 抗 A ;3抗体による Western blot解析を行った。
2. 結果
( 1 ) Aj8特異的 scFvに結合するぺプチドファージクローン
(a) B6 scFvに結合したペプチドファージクローンの ELISAの結果を図 1に示 す。 無関係の scFv (コントロール scFv) として FvlEl とレヽぅ A の線維化を阻害 しない抗体を用いた。 ファージライブラリ一は 12merのアミノ酸配列を提示する Ph.D.- 12 ライブラリー（New England Biolabs、 MA)を用いた。 実験は前記 （5) ELISAで記したとおりに行った。
(b) Dl scFvに結合した 12merペプチドファージクローンの ELISAの結果を図 2に示す。 無関係の scFv (コント口ール scFv) どして MY5Rという A の線維化 を阻害しない抗体を用いた。 ファージライブラリーは 12merのアミノ酸配列を提 示する Ph. D. -12ライブラリー（New England Biolabs、 MA)を用いた。 実験は前記 ( 5 ) ELISAで記したとおりに行つた。
( c ) Dl scFvに結合した C7Cペプチドファージクローンの ELISAの結果を図 3 に示す。 無関係の scFv (コントロール scFv) として MY5Rとレヽぅ A jSの線維化を 阻害しない抗体を用レ、た。 ファージライブラリ一はシスティンとシスティンの間 に 7つのアミノ酸配列を含むペプチドを提示する Ph. D. - C7C ライブラリー（New England Biolabs, MA)を用いた。 実験は前記 （5 ) ELISA で記したとおりに行つ た。
( 2 ) B6結合性ぺプチドファージの A 1-42線維化阻害活性
B6 結合性ぺプチドファージによる A |3 1-42 ぺプチドの線維化阻害実験の結果 を図 4に示す。 A /3 1-42線維化阻害実験は前記 （8 ) 線維化阻害実験で記したと おりに行った。 pepB6- L1及ぴ pepB6- L10は、 A j3 1-42の線維化を阻害する B6 scFv を铸型として、それに結合するファージクローンであり、 peplEl - Ll， 1 - L2， 1- L4， 1-L12は、 A β 1-42の線維化を阻害しない FvlEl scFv (WO 2 0 0 5— 1 0 5 9 9 8段落 0 0 7 4〜 0 0 7 5に記載） を鎵型として単離したファージクローンで ある。 ここで用いたファージクローンの濃度は 3. 0 X 1012 virions/mlである。
( 3 ) 特異的 scFvのェピトープ （結合性配列）
A β 1-42の線維化を阻害する Β6 scFv、 B7 scFv又は Dl scFvを鎳型として単 離したファージクローンの提示するぺプチドのアミノ酸配列一覧を図 5に示す。 ファージライブラリ一として Ph. D. - 12ライブラリー （図 5中 12mer*と略） 又は Ph. D. -C7C ライブラ リ ー（図 5 中 C7C*と略）を使用した。 pePB7- C15 と pepDl-C5, C7, C20は同一の配列であった。 番号の前についている Lは 12merのラ イブラリーから、 Cは C7Cのライブラリーから単離されたクローンであることを 示している。
各ファージクローンの提示するぺプチドのアミノ酸配列と配列番号との関係は 以下のとおりである。
pepB6-Ll：配列番号 9 ； ; pepB6-L10：配列番号 1 0 ；
pepDl - L5, L9：配列番号 1 1 ；
pepDl-L6：配列番号 1 2 ；
pepDl-L7：配列番号 1 3 ;
pepDl- L13：配列番号 1 4 ；
pepDl-L20：配列番号 1 5 ；
pepB7-C15 (pepDl- C5, C7, C20) ：配列番号 1 6 ；
pepDl - C2， C13：配列番号 1 7 ；
pepDl- C18：配列番号 1 8 ；
pepDl-C3：配列番号 1 9 ；
pepDl-Cll：配列番号 2 0 ；
pepDl-C8：配列番号 2 1 ；
pepDl-C10：配列番号 2 2
( 4 ) ビォチン化した B6又は B7 scFv結合性配列と TAT配列との融合分子 ビォチン化した B6 scFv 結合性配列と TAT 配列との融合分子を図 6に示す。
B6-L1, B7-C15, B7- S15のそれぞれの配列のァミノ末端側に TAT配列を融合した ものが TAT- B6- Ll， TAT-B7-C15, TAT- B7- S15であり、 B6- L1 の配列のカルボキシ ル末端側に TAT配列を融合したものが B6- LI- TATである。 TAT配列は脳血管関門 を通過する機能をもつペプチド配列である （P. Jarver and Ulo Langel, The use of cell-penetrating peptides as a tool for gene regulation, DDT, 9 : 395-402,
2004)。 これらのペプチドのァミノ末端をピオチンで標識し、 このペプチドの結合 を酵素標識したアビジンを用いて定量を行った。
( 5 ) TATと B6- L1の融合ペプチドは B6 scFvに認識された （図 7 )。 合成べプチ ド、 TAT- B6- L1あるいは B6- L1 - TATを 200 ng/ wellの条件で ELISAプレートにコ ートし、 種々の濃度の B6 scFvを添加しその結合活性を検討した。 コントロール ペプチドとして無関係のペプチド（GSGGGSCGYWRSEWGLCG)を用いた。 B6 scFv の量 依存的な結合反応が確認された。
( 6 ) TATと B6- Ll， B7-C15, B7-S15それぞれとの融合ぺプチドの A j3 1-42線維 化阻害活性 TATと B6 - Ll， B7-C15, B7-S15それぞれとの融合べプチドの A β 1 - 42線維化阻 害活性の測定結果を図 8に示す。 線維化阻害実験は前記線維化阻害実験で記した とおりに行った。 ΤΑΤ - Β6 - Ll， B6-L1 - TAT， TAT - B7 - C15， TAT - B7 - S15は線維化阻害 活性があることが明らかとなった。 前記のコント口ールぺプチドは全く阻害活性 を示さなかった。
( 7 ) TAT-B6-L1, TAT-B7-C15 ペプチドによる A ;3コンホーマー （Α βオリゴマ 一及び A 線維） の沈降実験
TAT-B6-L1, TAT-B7-C15ぺプチドの沈降実験の結果を図 9に示す。 A β 1-42を 20 mMリン酸バッファー pH 7. 0に 40 μ Μの濃度で溶解し、 その 1. 5時間目にビ ォチン化 ΤΑΤ-Β6- L1又はビォチン化 TAT- Β7- C15ぺプチドを加え結合物をストレプ トァビジン-マグネットビーズで沈降させた。沈降前は Α βオリゴマーや Α β線維 などのバンドが確認できるが、 TAT- Β6- Ll， TAT-B7-C15 ペプチドで沈降を行った 上清には Α オリゴマーや A j8線維は確認されず、 沈殿物の方で確認できた。 こ の結果から A ]3 1-42溶解後 1. 5時間目に形成される A /3オリゴマーや A β線維と TAT-B6-L1, ΤΑΤ - Β7 - C15 ぺプチドが結合することが明らかとなった。 無関係なコ ントロールぺプチドでは沈降反応は認められなかった （図 9には示されていない
)。 本明細書中で引用した全ての刊行物、 特許及び特許出願をそのまま参考として 本明細書中にとり入れるものとする。 産業上の利用可能性
本発明のぺプチドは、 アルツハイマー病の予防 ·治療剤として有用である。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 次式 （ I ) ：
X X-Asp-X 2-X 3-X 4-Pro-X 5-X 6 (I )
(式中、 X1は分枝アミノ酸を表し、 X2、 X3、 X4、 X5及ぴ X6は同一、 又は 異なって α—アミノ酸を表す。）
で示されるアミノ酸配列を含む、 アミノ酸残基数 8〜 30のペプチド。
2. 前記式 （ I ) において、 X 2が分枝アミノ酸、 ヒ ドロキシアミノ酸、 芳香 族アミノ酸又は脂肪族アミノ酸である請求項 1記載のぺプチド。
3. 前記式 （I ) において、 X 3が芳香族アミノ酸又は分枝アミノ酸である請 求項 1又は 2記載のぺプチド。
4. 前記式 （ I ) において、 X 4が脂肪族アミノ酸、 ヒ ドロキシアミノ酸又は 分枝アミノ酸である請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載のぺプチド。
5. 前記式 （ I) において、 X 5が分枝アミノ酸、 イミノ酸、 脂肪族アミノ酸、 塩基性アミノ酸又はヒ ドロキシアミノ酸である請求項 1〜4のいずれか 1項に記 載のぺプチド。
6. 前記式 （ I ) において、 X6が塩基性アミノ酸、 脂肪族アミノ酸又は分枝 ァミノ酸である請求項 1〜 5のいずれか 1項に記載のぺプチド。
7. 次式 （II) ：
X7- X8- X9- X10- X1- Asp-X2 - X3_X4- Pro-X5- X6- Xu-X12- Υ1 (II)
(式中、 X1、 X2、 X3、 X4、 X5及び X6は請求項 1に記載の式 （ I ) 中の定 義と同一であり、 X7、 X8、 X9、 X1。、 X11及ぴ X12は同一、 又は異なってひ
—アミノ酸又は単結合を表し、 Y1は OH又は NH2を表す。）
で示される請求項 1記載のぺプチド。
8. 前記式 （II) において、 X7がヒ ドロキシアミノ酸又は脂肪族アミノ酸で ある請求項 7記載のぺプチド。
9. 前記式 （Π) において、 X8がヒ ドロキシアミノ酸又はアミ ドアミノ酸で ある請求項 7又は 8記載のぺプチド。
10. 前記式 （II) において、 X9が脂肪族アミノ酸、 イミノ酸、 ヒ ドロキシ アミノ酸又はアミ ドアミノ酸である請求項 7〜9のいずれか 1項に記載のぺプチ ド、。
1 1. 前記式 （Π) において、 X1 Qが含硫アミノ酸、 分枝アミノ酸、 芳香族ァ ミノ酸又はィミノ酸である請求項 7〜 1 0のいずれか 1項に記載のぺプチド。
1 2. 前記式 （II) において、 X 11が複素環式アミノ酸、 芳香族アミノ酸、 脂 肪族アミノ酸又は分枝アミノ酸である請求項 7〜 1 1のいずれか 1項に記載のぺ プチド。
1 3. 前記式 （II) において、 X 12が分枝アミノ酸、 酸性アミノ酸又はイミノ 酸である請求項 7〜 1 2のいずれか 1項に記載のペプチド。
14. 前記式 （I) で示されるアミノ酸配列と、 次式：
Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg
で示される TAT配列とを含む、 アミノ酸残基数 1 9〜30のペプチドである請 求項 1〜 1 3のいずれか 1項に記載のぺプチド。
1 5. 次式 （III) ：
Zし X 13- Gly- X 14- X 15- Pro- Trp-Met- Z 2 (III)
(式中、 X13、 X14及び X15は同一、 又は異なって a—アミノ酸を表し、 Z1及 び Z 2は同一、 又は異なってシスティン又はセリンを表し、 1及び22がシステ インを表す場合、 これらの間で架橋されていてもよい。）
で示されるアミノ酸配列を含む、 アミノ酸残基数 9〜 30のペプチド。
1 6. 前記式 （III) において、 X13が芳香族アミノ酸である請求項 1 5記載 のぺプチド。
1 7. 前記式 （III) において、 X14がヒ ドロキシアミノ酸である請求項 1 5 又は 1 6記載のぺプチド。
1 8. 前記式 （ΙΠ) において、 X15が塩基性アミノ酸である請求項 1 5〜 1 7のいずれか 1項に記載のペプチド。
1 9. 前記式 （III) で示されるアミノ酸配列と、 次式：
Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg
で示される TAT配列とを含む、 アミノ酸残基数 20〜30のペプチドである請 求項 1 5〜 1 8のいずれか 1項に記載のぺプチド。
2 0 . 請求項 1〜1 9のいずれか 1項に記載のペプチドを含有する医薬組成物。
2 1 . 請求項 1〜1 9のいずれか 1項に記載のペプチドを含有するアミロイド /3線維化阻害剤。
2 2 . アルツハイマー病の予防 '治療剤である請求項 2 1記載のアミロイ ド 13 線維化阻害剤。
2 3 . アミロイド 線維化阻害活性を有することが確認されていないペプチド から、アミロイド ペプチド 1 - 42と特異的に結合してその線維化反応を阻害する 活性を有する一本鎖抗体に結合し、 かつアミロイド 線維化阻害活性を有するぺ プチドを探索することを特徴とするアミロイド j3線維化阻害ペプチドのスクリー ニング方法。
2 4 . 請求項 2 3記載のスクリーニング方法により取得されるアミロイ ド j3線 維化阻害べプチド。
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