WO2003095635A2 - Für eine mannitol-2-dehydrogenase codierende nukleotidsequenz sowie verfahren zur herstellung von d-mannitol - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft eine für die Mannitol-2-Dehydro­genase codierende Nukleotidsequenz sowie ein Verfahren zur Herstellung von D-Mannitol. Bisher bekannte biokatalytische Verfahren zur Herstel­lung von D-Mannnitol weisen nur geringe Produktionsra­ten auf Grund geringer spezifischer Aktivitäten der Mannitol-2-Dehydrogenasen für die Umsetzung von D-Fructose zu D-Mannitol auf. Durch Bereitstellung einer Nukleotidsequenz, die für eine Mannitol-2-Dehydrogenase mit einer höheren spezi­fischen Aktivität codiert, kann eine verbesserte D-Mannitolproduktion erreicht werden. Durch Schaffung eines Regenerationssystems für Redukti­onsäquivalente durch Einbringen und/oder Verstärken einer Formiatdehydrogenase in einen Mikroorganismus, kann in besonderer Weise eine erhöhte Mannitol Produk­tion erreicht werden.

Description

Be s chre ibung

Für eine Mannitol -2 -Dehydrogenase codierende Nukleotidsequenz sowie Verfahren zur Herstellung von

D-Mannitol

Die Erfindung betrifft eine für die Mannitol -2 -Dehydrogenase codierende Nukleotidsequenz sowie ein Verfahren zur Herstellung von D-Mannitol .

Der weltweite Jahresbedarf am Zuckeralkohol D-Mannitol (D-Mannit) beläuft sich auf 30.000 Tonnen im Jahr. D-Mannitol findet Verwendung im Lebensmittelbereich als zahnschonender Süßstoff, in der Medizin als Plasmaexpander und Vasodilator (Hexanitroderivat ) , sowie in der pharmazeutischen Industrie zur Produktion von Tabletten.

Die großtechnische Produktion von D-Mannitol erfolgt bisher über die katalytische Hydrierung an Metallkata- lysatoren von Glucose/Fructose-Gemischen aus Saccharose als Ausgangsmaterialien. Aufgrund der fehlenden Stereo- spezifität der katalytischen Hydrierung beträgt die Ausbeute an D-Mannitol nur 25-30% mit einem dreifachen Überschuß an D-Sorbitol (42, 21, 43) . D-Mannitol und D-Sorbitol unterscheiden sich nur durch ihre Konfiguration am Kohlenstoffatom C-2. Eine Alternative bietet die Herstellung von D-Mannitol durch en- zymatische Hydrierung von D-Fructose in einem mikro- biellen Biotransformationsverfahren. Enzyme katalysie- ren ihre Reaktionen stereospezifisch. Bei Slatner et al . (47) wird beispielsweise ein enzymatisches Verfahren beschrieben, bei dem eine rekombinante Mannitol- Dehydrogenase aus Pseudo onas fluorescens isoliert wird und zusammen mit einer Formiat-Dehydrogenase aus Candi - da boidinii und NAD in einem Membranreaktor inkubiert wird. Durch den Einsatz der Formiat -Dehydrogenase wird ein Reduktions-Oxidationszyklus für NADH geschaffen, welches durch die Membran im Reaktionsgefäß zurückgehalten wird. Hier konnte 70-90% der Fructose in D-Mannitol umgewandelt werden. Von den Autoren wird jedoch die mangelnde Stabilität der Mannitol -Dehydro- genäse (50 h Halbwertszeit; nach Stabilisierung mit

Dithiothreitol : 100h), Empfindlichkeit gegenüber hohen Temperaturen >30°C sowie gegenüber Scherkräften, als ein Nachteil des Verfahrens angegeben. Ein weiterer großer Nachteil liegt jedoch darin, dass Membranreakto- ren auf Grund der hohen Kosten für isolierte Enzyme, benötigte Cofaktoren und Membranen für eine großtechnische Produktion ungeeignet sind.

Eine weitere Möglichkeit der D-Mannitol Produktion kann durch fermentative Verfahren erfolgen. Bereits 1991 er- zielten Soetaert et al . (36) durch fermentative

D-Mannitol Herstellung Ausbeuten von 85% unter Einsatz von D-Fructose/D-Glucose-Gemischen als Substrate. Dabei verwendeten sie das heterofermentative Milchsäurebakte- rium Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291 als ka- talysierenden Organismus in einer Fermentation mit wachsenden Zellen. Die für die Reduktion von Fructose zu D-Mannitol notwendigen Reduktionsäquivalente stammten hierbei aus der Oxidation von Glucose zu organischen Säuren (36) . Neben dem Problem der nur 85%igen Umsetzung des Substrates Fructose zu D-Mannitol ist der

Einsatz von D-Glucose als Elektronenlieferant kostenaufwendig. Weiterhin stellt die Kontamination des Ziel- produktes mit organischen Säuren während der Fermenta- tion einen weiteren Nachteil dar, da diese organischen Säuren durch aufwendige Prozeßschritte entfernt werden müssen. Soetaert et al . schlugen hierfür eine Elektro- dialyse vor (36, 37). Bei Fermentationen mit wachsenden Zellen kann keine 100%ige Umsetzung des Substrates zum Produkt erzielt werden, da ein Teil des Substrates zum Zellaufbau bzw. zur Neubildung von Biomasse verbraucht wird.

Das Schlüsselenzym für die enzymkatalysierte Reduktionsreaktion von D-Fructose zu D-Mannitol ist die Manni- tol -2 -Dehydrogenase . Aus der Literatur sind drei Manni- tol-2-Dehydrogenasen bekannt und auch hinsichtlich ihrer biochemischen Eigenschaften und Nukleotid-/Amino- säuresequenzen beschrieben. Hierzu gehört die Mannitol - 2 -Dehydrogenase aus Pseudomonas fluorescens DSM 50106 (4, 34), aus Rhodobacter sphaeroides Si4 (32) sowie aus Agaricus bisporus (11, 38,). Die beiden Erstgenannten gehören zur Gruppe der langkettigen Dehydrogenase/Re- duktase Protein Familie (LDR) , die letztgenannte zur

Gruppe der kurzkettigen Dehydrogenase/Reduktase Protein Familie (SDR) . Die spezifische Aktivität dieser Enzyme bei der Reduktion von D-Fructose zu D-Mannitol liegt jedoch nur bei rund 40 bis 90 U/mg.

Es ist daher Aufgabe der Erfindung, ein System zur Verfügung zu stellen, welches die zuvor genannten Nachteile nicht mehr aufweist sowie neue Maßnahmen zur verbesserten mikrobiellen Herstellung von D-Mannitol bereit- zustellen.

Unter der Bezeichnung D- Mannitol soll im folgenden auch D-Mannit verstanden werden. Im Rahmen dieser Erfindung werden im Folgenden alle Nukleotidsequenzen, die für eine Mannitol-2 -Dehydrogenase codieren unter der Bezeichnung "md -Gensequenz" zusammengefasst . Das Enzym Mannitol -2 -Dehydrogenase wird im Folgenden unter der Bezeichnung „MDH" zusammengefasst .

Es ist Aufgabe der Erfindung eine Nukleotidsequenz kodierend für eine MDH bereitzustellen, enthaltend

i) eine Nukleotidsequenz, dargestellt in SEQ ID No. 1, oder

ii) mindestens eine Nukleotidsequenz umfasst, die der Nukleotidsequenz (i) innerhalb des Bereichs der Degeneration des genetischen Codes ent- spricht; oder

iii) mindestens eine Nukleotidsequenz umfasst, die mit einer zur Nukleotidsequenz (i) oder (ii) komplemetären Nukleotidsequenz hybridisiert, und gegebenenfal1s

iiii) funktionsneutrale Sinnmutationen in (i) umfasst. Dabei bedeutet der Begriff funktionsneutrale Sinnmutationen den Austausch chemisch ähnlicher Aminosäuren, wie z. B. Glycin durch Alanin oder Serin durch Threonin.

Die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen zeichnen sich dadurch aus, dass sie aus der Familie der Lactobacteri - aceae, bevorzugt der Gattung Leuconostoc besonders bevorzugt aus Leuconostoc pseudomesenteroides, ganz be- sonders bevorzugt aus Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291 isoliert werden.

Bei der DSMZ wurde gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrages die erfindungsgemäße md- -Gensequenz am

20.02.2002 als Plasmid-DNA (pQE80L-md ) unter folgendem Aktenzeichen hinterlegt: DSM 14824

Unter einer Nukleotidsequenz, einer Nukleinsäure oder einem Nukleinsäurefragment ist erfindungsgemäß ein Polymer aus RNA oder DNA zu verstehen, das einzel- oder doppelsträngig sein kann und optional natürliche, chemisch synthetisierte, modifizierte oder artifizielle Nukleotide enthalten kann. Der Begriff DNA-Polymer schließt hierbei auch genomische DNA, cDNA oder Mischungen davon ein.

Erfindungsgemäß sind auch die den kodierenden Bereichen (Strukturgenen) vorausgehenden (5" -oder upstream) und/oder nachfolgenden (3"-oder downstream) Sequenzbereiche eingeschlossen. Insbesondere sind hierin Sequenzbereiche mit regulatorischer Funktion inbegriffen. Sie können die Transkription, die RNA-Stabilität oder das RNA Processing sowie die Translation beeinflussen. Beispiele für regulatorische Sequenzen sind u. a. Promotoren, Enhancer, Operatoren, Teminatoren oder Translationsverstärker .

Gegenstand der Erfindung ist ferner eine Genstruktur, enthaltend wenigstens eine der zuvor beschriebenen Nukleotidsequenzen codierend für eine MDH sowie mit diesen operativ verknüpfte regulatorische Sequenzen, welche die Expression der codierenden Sequenzen in der Wirtszelle steuern. Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequentielle Anordnung beispielsweise von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und ggf. weiterer regulatorischer Elemente derart, dass jedes der regulatorischen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Beispielhaft sei hier ein durch IPTG (Isopropyl-ß-thiogalactosid) induzierbarer Promotor genannt .

Die Herstellung einer Genstruktur erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit wenigstens einer erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz nach gängigen Rekombina- tions- und Klonierungstechniken wie beispielsweise in (24) beschrieben.

Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung einen Vektor enthaltend wenigstens eine Nukleotidsequenz der zuvor beschriebenen Art kodierend für eine MDH, mit diesen operativ verknüpfte regulative Nukleotidsequenzen sowie zusätzliche Nukleotidsequenzen zur Selektion transformierter Wirtszellen, für die Replikation innerhalb der Wirtszelle oder zur Integration in das entsprechende Wirtszell-Genom. Ferner kann der erfindungs- gemäße Vektor eine Genstruktur der vorgenannten Art enthalten.

Als Vektoren eignen sich solche, die in den Wirtszellen repliziert werden

Unter Ausnutzung der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen können entsprechende Sonden oder auch Primer synthetisiert und dazu verwendet werden, beispielsweise mit Hilfe der PCR-Technik analoge Gene aus anderen Mikroorganismen, bevorzugt aus der Gattung Leuconostoc zu amplifizieren und isolieren.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit auch eine Sonde zur Identifizierung und/oder Isolierung von Genen, kodierend für an der Biosynthese von D-Mannitol beteiligte Proteine, wobei diese Sonde ausgehend von den erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen der zuvor beschriebenen Art hergestellt wird und eine zur Detektion geeignete Markierung enthält . Bei der Sonde kann es sich um einen Teilausschnitt der erfindungsgemäßen Sequenz, beispielsweise aus einem konservierten Bereich handeln der unter stringenten Bedingungen spezifisch mit homologen Nukleotidsequenzen hybridisieren kann. Geeignete Markierungen sind aus der Literatur zahlreich bekannt. Anleitungen hierzu findet der Fachmann beispielsweise in folgenden Literaturstellen (8, 18, 28) .

Es ist Aufgabe der Erfindung eine MDH, kodiert durch eine erfindungsgemäße Nukleotidsequenz, gemäß SEQ ID No

1 oder deren Variationen der zuvor beschriebenen Art, mit einer gegenüber bisher bekannten MDHs verbesserten

Aktivität in der Fructose-Reduktion bereitzustellen.

Diese Aktivität wird in der vorliegenden Erfindung pho- tometrisch über die Abnahme der NADH-Konzentration für die Reduktionsreaktion: D-Fructose + NADH + H⁺ -

D-Mannitol + NAD⁺ bestimmt.

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso eine MDH mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Sequenz gemäß SEQ ID No 2 oder einer modifizierten Form dieser Polypeptidsequenz oder Isoform davon oder Mischungen daraus . Die erfindungsgemäßen Polypeptide zeichnen sich dadurch aus, dass sie aus der Familie der Lactobacteriaceae, bevorzugt aus der Gattung Leuconostoc, besonders bevor- zugt der Art Leuconostoc pseudomesenteroides, ganz besonders bevorzugt aus Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291, stammen.

Unter Isoformen sind Enzyme mit gleicher oder ver- gleichbarer Substrat- und Wirkungsspezifität zu verstehen, die jedoch eine unterschiedliche Primärstruktur aufweisen.

Unter modifizierten Formen sind erfindungsgemäß Enzyme zu verstehen, bei denen Änderungen in der Sequenz, beispielsweise am N- und/oder C-Teminus des Polypeptids oder im Bereich konservierter Aminosäuren vorliegen, ohne jedoch die Funktion des Enzyms zu beeinträchtigen. Diese Veränderungen können in Form von Aminosäureaus- tauschen nach bekannten Methoden vorgenommen werden.

Weiterhin ist es Aufgabe der Erfindung, Mikroorganismen, enthaltend in replizierbarer Form wenigstens eine erfindungsgemäße Nukleinsäure der zuvor beschriebenen Art, welche im Vergleich zu dem entsprechend nicht genetisch veränderten Mikroorganismus verstärkt expri- miert wird und/oder deren Kopienzahl erhöht ist, bereitzustellen. Ebenso umfasst die vorliegende Erfindung einen genetisch veränderten Mikroorganismus enthaltend in replizierbarer Form eine Genstruktur oder einen Vektor der zuvor beschriebenen Art. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist darüber hinaus, ein genetisch veränderter Mikroorganismus enthaltend wenigstens ein er- findungsgemäßes Polypeptid mit der Funktion einer MDH der zuvor beschriebenen Art, welche eine im Vergleich zu dem entsprechend nicht genetisch veränderten Mikroorganismus erhöhte Aktivität aufweist. Die erfindungs- gemäßen Mikroorganismen können aus der Gattung Bacil- lus, Lactobacillus, Leuconostoc, den Enterobakteriaceae oder methylotrophen Hefen, Pilzen sowie aus allen auch in der Lebensmittelindustrie verwendeten Mikroorganismen stammen. Beispielhaft seien folgende geeignete Mik- roorganismen genannt: Achromobacter parvolus, Methylo- bacterium organophilum, Mycobacterium formicum, Pseudomonas spec. 101, Pseudomonas oxalaticus, Moraxella sp., Agrobacterium sp . , Paracoccus sp . , Ancylobacter aquati- cus, Pseudomonas fluorescens, Rhodobacter sphaeroides, Rhodobacter capsulatus, Lactobacillus sp . , Lactobacillus brevis, Leuconostoc pseudomesenteroides, Glucono- bacter oxydans, Candida boidinii, Candida methylica oder auch Hansenula polymorpha, Aspergillus nidulans oder Neurospora crassa oder Escherichia coli.

Es besteht weiterhin die Aufgabe ein Verfahren zur Produktion von D-Mannitol zu schaffen, mit dem verbesserte Ausbeuten und höhere Produktivitäten erzielt werden können. Dies umfaßt sowohl das Einbringen der erfin- dungsgemäßen Nukleotidsequenzen oder eines Teils davon, kodierend für eine MDH, ein Allel, Homolog oder Derivat davon in ein Wirtssystem als auch die Verstärkung einer bereits in einem Mikroorganismus vorhandenen Nukleotidsequenz codierend für eine MDH, wobei die Genexpression und/oder die Aktivität des entsprechend kodierten Poly- peptids gegenüber dem entsprechend nicht genetisch veränderten Mikroorganismus erhöht ist, dieser genetisch veränderte Mikroorganismus zur mikrobiellen Herstellung von D-Mannitol eingesetzt wird und das entsprechend gebildete D-Mannitol aus dem Kulturmedium und/oder den Zellen isoliert wird.

Das Einbringen der Nukleotidsequenz in eine Wirtzelle erfolgt nach gentechnischen Methoden. Als bevorzugtes Verfahren sei hier die Transformation und besonders bevorzugt die Übertragung von DNA durch Elektroporation genannt . Zur Erzielung einer Verstärkung der mdh-Gensequenz bzw. einer erhöhten Genexpression (Überexpression) kann die Kopienzahl der entsprechenden Gene erhöht werden. Ferner kann die Promotor- und/oder Regulationsregion und/oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, entsprechend so verändert werden, daß die Expression mit erhöhter Rate erfolgt. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich die Expression im Verlaufe der mikrobiellen D-Mannitol Produktion zu steigern. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der mRNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Weiterhin kann auch die Aktivität des Enzyms selbst erhöht sein oder durch die Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins verstärkt werden. Alternativ kann ferner eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kultur- führung erreicht werden.

Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Martin et al . (25), bei Guerrero et al . (9), Tsu- chiya und Morinaga (41), bei Eikmanns et al . (7), bei Schwarzer und Pühler (33), bei Reinscheid et al . (27), bei LaBarre et al . (16), bei Malumbres et al . (23), bei Jensen und Hammer (13) , bei Makrides (22) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie.

Unter einem Wirtssystem sind Mikroorganismen zu verstehen, die alle mit fremder DNA transformierbar sind. Erfindungsgemäß sind hierunter Mikroorganismen zu verstehen, in die die erfindungsgemäße Nukleotidsequenz ein- gebracht wird und/oder verstärkt wird und entsprechend zur Ausprägung gebracht wird. Mikroorganismen, die bereits eine für eine MDH codierende Nukleotidsequenz oder die erfindungsgemäße Nukleotidsequenz aufweisen, wie z. B. Leuconostoc pseudomesenteroides, sind daher ebenfalls als Wirtssystem zu verstehen. Stellvertretend für ein geeignetes Wirtssystem, in das die erfindungsgemäße Nukleotidsequenz eingebracht wird, sei das Bak- terium Escherichia coli und bevorzugt der Stamm E. coli JM109(DE3) genannt, welcher unter Standardbedingungen kultiviert werden kann.

Als Kulturmedium ist je nach Anforderungen ein Komplexmedium wie z. B. LB-Medium (24) oder auch ein Mineral - salzmedium (15) geeignet. Nach entsprechender Kultivierung kann die Bakteriensuspension geerntet und zur wei- teren Untersuchung, beispielsweise zur Transformation oder zur Isolierung von Nukleinsäuren nach gängigen Methoden eingesetzt werden.

Diese Vorgehensweise kann analog auch auf andere Bakterienstämme angewendet werden. Dabei werden als Wirts- Systeme Bakterien der Gattungen Leuconostoc, Bacillus,

Lactobacillus, oder Enterobacteriacea und methylotrophe Hefe bevorzugt. Im folgenden werden beispielhaft einige bevorzugte Mikroorganismen aufgelistet: Achromobacter parvolus, Methylobacterium organophilum, Mycobacterium formicum, Pseudomonas spec . 101, Pseudomonas oxalati- cus, Moraxella sp., Agrobacterium sp . , Paracoccus sp., Ancylobacter aquaticus oder auch Pseudomonas fluores- cens, Rhodobacter sphaeroides, Rhodobacter capsulatus, Lactobacillus sp . , Lactobacillus brevis, Leuconostoc pseudomesenteroides, Gluconobacter oxydans oder methy- lotrophe Hefen wie Candida boidinii, Candida methylica oder auch Hansenula polymorpha, Pilze wie Aspergillus nidulans und Neurospora crassa sowie alle auch in der

Lebensmittelindustrie verwendeten Mikroorganismen. Darüber hinaus schließt die vorliegende Erfindung auch Bakterienstämme ein, die sich als D-Mannitol produzierende Mutanten oder Produktionsstamme auszeichnen. Die- se können z. B. ausgehend von Wildtypstämmen durch klassische (chemische oder physikalische) oder gentechnische Methoden hergestellt werden.

Die erfindungsgemäß hergestellten genetisch veränderten Mikroorganismen können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch - Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von D-Mannitol kultiviert werden. Eine Zu- sammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden sind im Lehrbuch von Chmiel (5) oder im Lehrbuch von Storhas (39) beschrieben.

Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedenener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacte- riology" (1) enthalten. Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlenhydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellu- lose verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als Stickstoffquelle können organische Stickstoff-haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammonium- nitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphos- phat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muß weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kul- turmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzu gegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden. In der vorliegenden Erfindung hat sich insbe- sondere der Zusatz von Zn²⁺ zum Medium als vorteilhaft erwiesen, da die Zellen besser mit dem für die MDH essentiellen Metallion versorgt werden.

Zur pH - Kontrolle der Kultur werden basische Verbin- düngen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Anti- schaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe z. B. Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten werden Sauerstoff oder Sauerstoff haltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 40°C und vorzugsweise bei 30 °C bis 37 °C. Die Kultur wird solange fortgesetzt bis sich ein Maximum an D- Mannitol gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 12 Stunden bis 50 Stunden erreicht.

Die Analyse der D-Mannitol -Konzentration kann enzyma- tisch/photometrisch nach der Methode von K. Horikoshi

(12) , oder durch Hochdruck-Flüssigkeits Chromatographie (HPLC) erfolgen so wie bei Lindroth et al . (19) beschrieben.

In einer vorteilhaften Ausführung des Verfahrens wird eine erhebliche Steigerung der Ausbeute bzw. der Umsatzrate des Substrates in Mannitol durch Schaffung eines Cofaktor-Regenerationssystems ermöglicht. Dabei wird nicht mehr das Substrat für die Bereitstellung der für die Reduktion von Fructose zu Mannitol notwendigen

Reduktionsäquivalente verbraucht, sondern durch ein zweites Enzymsystem bereitgestellt. Folglich steht das Substrat in erhöhtem Maße für die Umsetzung zu Mannitol zur Verfügung. Eines der am häufigsten eingesetzten Systeme ist die Regenerierung mit einer Formiatdehydro- genase, z. B. aus Candida boidinii (46) . Durch die Überexpression dieses Enzyms, zusammen mit einer beliebigen MDH, bevorzugt aus Leuconostoc pseudomesenteroi- des oder auch aus Rhodobacter sphaeroides, im Mikroorganismus, wird ein Oxidations-Reduktionszyklus geschaffen. Die Expression der Enzyme kann in den für den je^¬ weiligen Wirtsorganismus geeigenten Vektorsystemen er- folgen. In dem so geschaffenen Oxidations-Reduktionszyklus fungiert Formiat als Elektronendonator und D-Fructose als Elektronenakzeptor. Dabei katalysiert das Enzym Formiat-Dehydrogenase die Oxidation von Formiat zu C0₂ und das Enzym MDH die Reduktion von D-Fructose zu D-Mannitol (s. Fig. 1). Der intrazellure Nicotinsäureamid-Adenin-Dinucleotid (NAD) -Pool dient als Elektronen-Shuttle zwischen beiden Enzymen. Die Oxidation von Formiat zu C0₂ ist thermodynamisch günstig, da die freie Standardbildungsenergie ΔG°" für C0₂ deutlich negativ ist und das C0₂ durch Ausgasen aus dem Reaktionsgleichgewicht entfernt wird. Die erhöhte intrazelluläre NADH-Konzentration, resultierend aus der Formiatoxidation, steigert die Reduktionskraft für die Reduktion von D-Fructose zu D-Mannitol, katalysiert durch MDH. In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung des Verfahrens wird neben den bereits genannten Kohlenstoffquellen als Substrat für die mikrobielle Herstellung D-Glucose eingesetzt. D-Glucose kann durch intrazelluläre Umwandlung mit dem Enzym D-Glucose /Xylose-Isomerase (EC 5.3.1.5) zu D-Fructose umgewandelt werden (2) . Eine extrazelluläre Umwandlung ist ebenfalls möglich, wobei die intrazelluläre jedoch bevorzugt ist. Der Einsatz von D-Glucose als Substrat in einem mikrobiellen Verfahren zur Produktion von D-Mannitol bewirkt eine Verbesserung der Wirtschaftlichkeit des Verfahrens, da die Kosten für D-Glucose nur etwa ein Viertel des Preises für D-Fructose betragen. Für das beschriebene Verfahren eignen sich nicht nur Mikroorganismen, in die eine Formiatdehydrogenase und eine MDH eingebracht und/oder verstärkt wird, sondern auch Mikroorganismen, die bereits über eine Formiatde- hydrogenase verfügen, wie z. B. Achromobacter parvolus, Methylobacterium organophilum, Mycobacterium formicum, Pseudomonas spec . 101, Pseudomonas oxalaticus, Moraxel- la s . , Agrobacterium sp . , Paracoccus sp . , Ancylobacter aquaticus, oder auch über eine MDH verfügen. Dazu gehö- ren Mikroorganismen wie z.B. Pseudomonas fluorescens,

Rhodobacter sphaeroides, Rhodobacter capsulatus, Lactobacillus sp., Lactobacillus brevis, Gluconobacter oxy- dans sowie bevorzugt auch Leuconostoc pseudomesenteroides oder Mikrooganismen, die bereits über beide Enzyme verfügen und jeweils in ihrer Aktivität verstärkt werden. Weiterhin geeignet sind beispielsweise auch methy- lotrophe Hefen wie Candida boidinii, Candida methylica oder auch Hansenula polymorpha, Pilze wie Aspergillus nidulans und Neurospora crassa sowie alle auch in der Lebensmittelindustrie verwendeten Mikroorganismen.

Ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 1 wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst mit den im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 angegebenen Merkmalen. Weiterhin wird die Aufgabe ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 4 erfindungsgemäß gelöst mit den im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 4 angegebenen Merkmalen. Die Aufgabe wird weiterhin ausgehend von den Oberbegriffen der Ansprüche 5, 6, 7, 8, 9, 12, 17 und 20 erfindungs- gemäß gelöst mit den im kennzeichnenden Teil der Ansprüche 5, 6, 7, 8, 9, 12, 17 und 20 angegebenen Merkmalen. Mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäure und dem Verfahren ist es nunmehr möglich, eine verbesserte Umsetzung des Substrates in das Produkt D-Mannitol zu erreichen. Es wird gegenüber bisher bekannten Verfahren eine er- höhte Produktivität, insbesondere durch die Verstärkung der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz, sowie eine erhöhte Ausbeute an D-Mannitol erreicht . So wird eine großtechnisch rentable Herstellung von D-Mannitol ermöglicht. Durch die Schaffung des Regenerationssystems mit Hilfe der Formiat Dehydrogenase kann für die NADH verbrauchende MDH in erhöhtem Maße ohne eine nachteilige Bildung von stoffwechselbedingten Nebenprodukten mit ruhenden Zellen eine erhöhte Umsetzung des Substrates in das Produkt D-Mannitol ermöglicht werden. Da Formiat als Elektronendonor weitaus billiger ist als Glucose, ergibt sich für das erfindungsgemäße Verfahren eine vorteilhafte Kostensenkung.

Weitere vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unter- ansprüchen angegeben.

Die Zeichnungen zeigen beispielhaft Ergebnisse des erfindungsgemäßen Verfahrens sowie eine schematische Darstellung der wichtigsten Stoffwechselwege, die für das Verfahren eine Rolle spielen.

Es zeigt :

Fig. 1: Oxidoreduktionszyklus mit Formiat -Dehydrogenase und MDH Fig. 2: Ableitung einer degenerierten 24 Basen-Oligo- nukleotid-Sonde von der N-terminalen Amino- säuresequenz der MDH Untereinheit von Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291.

Fig. 3: Genkarte des 4,191 bp Eco RI Fragments isoliert aus der genomischen DNA-Plasmidbank von Leuco- nostoc pseudomesenteroides ATCC 12291 nach Immuno-Screeening des md -Gens. Die Pfeile zeigen die Richtung der Translation des mdh ORF sowie 4 ORFs an.

Im folgenden soll die Erfindung beispielhaft beschrie- ben werden.

Ausführungsbesipiele :

I) Mannitol-2 -Dehydrogenase aus Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291: Reinigung und Charakterisierung des Enzyms; Klonierung und funktionelle Expression des mdh-Gens in Escherichia coli

a) Bakterienstämme und Plasmide

Als Quelle für die Isolierung der MDH wurde Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291 eingesetzt. E. coli JM 109 (DE 3) (Promega) diente als Wirtsorganismus zur Herstellung einer Plasmidbank für die Isolierung der genomischen DNA aus Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291. Ein Teil der Plasmidbank wurde durch Liga- tion eines 4.0 - 4.5 kb Eco RI Fragments genomischer DNA aus Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291 in pUC18 hergestellt. b) Kultivierungsbedingungen

Zur Kultivierung von Leuconostoc pseudomensenteroides ATCC 12291 wurde folgendes Kultivierungsmedium verwendet:

Trypton 10 g/1, Hefeextrakt 10 g/1, K₂HP0₄ 10 g/1, D- Fructose 20 g/1, D-Glucose 10 g/1, Vitamin / Mineral- Lösung 10 ml/1, in destilliertem Wasser; pH-Wert auf 7,5 unter Verwendung von Ortho-Phosphorsäure .

Zur Subklonierung und Präparation der Plasmidbank der genomischen Leuconostoc DNA, wurde E. coli JM109(DE 3) mit 170 Upm bei 37°C in Luria-Bertani Medium unter Zusatz von Ampicillin (100 μg/ml) oder Carbenicillin (50 μg/ml) kultiviert.

c) Bestimmung der Aktivität von MDH aus Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291

Die Enzymaktivität wird in der vorliegenden Erfindung photometrisch über die Abnahme der NADH-Konzentration für die Reduktionsreaktion D-Fructose + NADH + H⁺ -> D-Mannitol + NAD⁺ bestimmt. Der Ansatz zur Messung der Aktivität der MDH enthielt 200 μM NADH und 200 mM D-Fructose in 100 mM Kaliumphosphat-Puffer bei pH 6,5. Die spezifischen Aktivitäten der Rohextrakte und der partiell gereinigten Enzymisolate werden als Units pro Milligramm Protein

(U/mg) angegeben, wobei 1 U als 1 μmol Substratabnahme pro Minute definiert wird (20) . d) Bestimmung der Proteinkonzentrationen

Alle Proteinkonzentrationsbestimmungen wurden nach der Methode von Bradford (3) durchgeführt.

e) Auftrennung von Proteinen mittels Polyacrylamidgele- lektrophorese

Reinheitsanalysen von Rohextrakten und partiell gereinigten Enzymisolaten, sowie Präparationen vorbereitend auf Western-Blots wurden elektrophoretisch in diskonti- nuierlichen 12 %igen SDS-Polyacrylamidgelen durchgeführt nach der Methode von Lämmli (17) .

f) Isolierung der Mannitol -2 -Dehydrogenase aus Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291 Zur Isolierung der Mannitol -2 -Dehydrogenase wurde nach einem dem Fachmann bekannten Zellaufschluß (20) folgende Verfahrensschritte durchgeführt: Ammoniumsulfat- Präzipitation, Hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) , Anionentauscherchromatographie I (IEC I) , Anio- nentauscherchromatographie II (IEC II) , Größenaus- Schlusschromatographie (SEC) , sowie ein Chromato- focusing pH 5 - 4. Diese Methoden sind dem Fachmann allgemein bekannt und können beispielsweise aus (20) entnommen werden. Die spezifische Aktivität der MDH betrug bei pH = 5,35 für die Reduktion von D-Fructose zu D-Mannitol 450 U/mg

Proben der Reinigungsschritte wurden zur Analyse einer SDS-PAGE unterzogen. Es zeigte sich eine homogene Bande bei 43 kDa nach dem letzten Schritt. g) Charakterisierung der Mannitol -2 -Dehydrogenase aus Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291

Das native Molekulargewicht der MDH wurde durch Size Exclusion Chromatographie zu 177 kDa bestimmt Der isoe- lektrischen Punkt des Enzyms ist bei pH 4,3-4,4. Diese Bestimmungen wurden nach dem Fachmann allgemein bekannten Methoden durchgeführt und können beispielsweise aus Lottspeich und Zorbas (20) entnommen werden.

Die Ergebnisse hinsichtlich des Molekulargewichts des nativen und des dissoziierten Enzyms lassen darauf schließen, dass die Mannitol -2 -Dehydrogenase aus L. pseudomesenteroides ATCC 12291 ein homotetrameres Enzym ist .

h) Molekulargenetische Methoden

Die Isolierung von genomischer DNA aus Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291, die Isolierung von DNA- Fragmenten aus Agarosegelen, die Markierung von DNA- Sonden mit Digoxigenin modifiziertem dUTP und immunologische Detektion und DNA-DNA-Hybridisierung (Southern Blot) wurden nach dem Fachmann geläufigen Methoden durchgeführt (24) . Die aminoterminale Ansequenzierung der 43 kDa-Enzym- Untereinheit mittels Edman-Abbau und anschließender HPLC-Analyse ergab die oktamere Aminosäureabfolge MEALVLTG. Unter Verwendung einer Codon usage-Statistik für Leuconostoc pseudomesenteroides (14), wurde eine 2048fach degenerierte Oligonukleotid-Sonde zur Detekti- on des Mannitol -2 -Dehydrogenase-Gens an genomischer DNA von Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291 abgeleitet (siehe Fig. 2) . Die 24 bp-DNA-Sonde wurde mit einem Digoxigenin-11-dUTP-Schwanz am 3' -Ende versehen und diente zum Immuno-Screening von partiellen Plasmidban- ken genomischer DNA von L. pseudomesenteroides ATCC 12291. Auf diesem Wege wurde ein 4,2 kb-DNA-Fragment isoliert (Fig. 3) . Mit geeigneten Primern wurde das mdh-Gen von diesem Fragment amplifiziert , in den Vektor pET24a (+) ligiert und in E. coli BL21(DE3) transformiert und exprimiert . Zellextrakte von E. coli BL21 (DE3)pET24a (+) Lmdh zeigten nach Induktion in der SDS-Polyacrylelektrophorese eine starke Überexpressionsbande bei 55,2 kDa und eine spezifische Aktivität der Mannitol -2 -Dehydrogenase von 102,23 U/mg Protein, während die Kontrollen (Zellen ohne Plasmid, Zellen mit leerem Plasmid) keine Aktivität zeigten.

Die Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz des mdh Gens aus L. pseudomesenteroides ATCC 12291 ist in Sequenz ID No. 1 bzw. Nr. 2 gezeigt.

II) Biotransformation von D-Fructose zu D-Mannitol mit einem rekombinanten E. coli-Stamm

In einem rekombinanten E. coli-Stamm wurden die Enzyme Formiat-Dehydrogenase (EC 1.2.1.2) und Mannitol-2-

Dehydrogenase (EC 1.1.1.67) überexprimiert , um in den Zellen einen Oxidations-Reduktionszyklus zu etablieren. In diesem Oxidations-Reduktionszyklus wird Wasserstoff von Formiat über zelluläres NAD⁺ auf D-Fructose über- tragen, wobei D-Fructose zu D- Mannitol reduziert wird (s. Fig. 1) . (a) Stämme und Vektoren

Es wurden die Stämme E. coli BL21 (DE3) Gold (Stratage- ne) und E.coli JM109 (DE3) (Promega) verwendet. Als Vektoren wurden pET-28a ( +) Rsp/ndhNC (10) kodierend für den ORF der Mannitol -2 -Dehydrogenase aus Rhodobacter sphaeroides Si4 und pBTac2FDH kodierend für die Formiat -Dehydrogenase aus Candida boidinii (35) eingesetzt.

Für die Biotransformation wurden chemisch kompetente E. coli BL21 (DE 3) Gold mit pET28a (+) RspmdhNC und pBTac2FDH kotransformiert und auf LB-Agarplatten mit 50 μg/ml Carbenicillin und 30 μg/ml Kanamycin selektiert. Zum Vergleich des Expressionslevels der Enzyme wurden E. coli BL21 (DE 3) Gold desweiteren entweder mit pET-- 28a ( + )Rsp-md.NC oder pBTac2FDH allein transformiert. Die Selektion der Transformanten erfolgte auf LB-Agarplatten mit entweder 50 μg/ml Carbenicillin (pBTac2FDH) oder mit 30 μg/ml Kanamycin (pET-28a (+) Rspmd NC. LB- Agarplatten für E. coli BL21 (DE 3) Gold transformiert mit pET-28a (+) RspmdhNC enthielten zusätzlich 1% (v/v)

D-Glucose zur Verminderung der Basalexpression der Mannitol -2 -Dehydrogenase .

(b) Kultivierung und Expression Zur Expression der Enzyme wurde eine einzelne Kolonie der Transformanten in LB-Medium mit den entsprechenden Antibiotika über Nacht bei 30°C und 170 Upm Schuttlung vorkultiviert und in frisches LB-Medium mit 1% (v/v) D-Glucose und entsprechenden Antibiotika überimpft. Die Enzymexpression wurde mit 1 mM IPTG Endkonzentration induziert und die Kulturen für weitere 5 h bei 27°C gezogen. Die Zellmasse aus 2/5 des Kulturvolumens wurde für enzymatische Bestimmungen verwendet, die Zellmasse aus 3/5 des Kulturvolumens wurde für die Biotransformation verwendet. Die Zellernte erfolgte bei 4000g für 5 min (Beckmann JA- 10) .

(c) Biotransformation

Nach der Überexpression von Formiat-Dehydrogenase und MDH in E. coli, werden nichtwachsende Zellen in einer Biotransformation eingesetzt. Je 2,2 g induzierte Zel- len von E. coli BL21 (DE 3) Gold pET-28a (+) Rspmd-hNC / pBTac2FDH wurden mit 100 mM Kaliumphosphat-Puffer pH 6,5 gewaschen und in 200 ml Reaktionslösung mit 500 mM D-Fructose und 500 mM Natriumformiat in 100 mM Kaliumphosphat-Puffer pH 6,5 resuspendiert. Die Ansätze wur- den in 300 ml-Kolben ohne Schikane bei 100 - 120 Upm und 30°C für 48 h geschüttelt. Zu den Zeitpunkten 0, 3, 13, 20, 27, 38, 45 und 48 h nach Reaktionsstart wurden 5 ml -Proben des Überstandes genommen zur Messung der Konzentrationen von Formiat, D-Fructose und D-Mannitol. Die Proben wurden bei 5000g für 15 min zentrifugiert

(Heraeus 3360), der Überstand 0,2 μm-filtriert und bis zur Messung durch HPLC bei -20°C gelagert. Als Kontrolle wurden 5,5 g nichtinduzierte Zellen von E. coli BL21 (DE 3) Gold pET-28a(+)Rspmd NC/pBTac2FDH in gleicher Weise in der Biotransformation eingesetzt.

Die Konzentrationbestimmungen von Formiat, D-Fructose und D-Mannitol im Reaktionsüberstand und im zellfreien Rohextrakt wurden mit einer HPLC-Anlage (Merck/Hitachi) durchgeführt. Tabelle 1 zeigt beispielhaft Ergebnisse, die mit transformierten Mikroorganismen erreicht werden konnten.

Tabelle 1: Produktion von D-Mannitol und Verbrauch von D-Fructose und Natriumformiat während einer Biotransformation

Es konnte gezeigt werden, dass die parallele Überexpression der Formiat-Dehydrogenase und der Mannitol -2 -Dehydrogenase in E. coli zu einer Produktion von D-Mannitol durch diese Zellen in einem Reaktionsmedium mit D-Fructose und Formiat führt.

(d) Enzymatische Bestimmungen

Enzymatische Aktivitäten der Formiat-Dehydrogenase und MDH im zellfreien Extrakt wurden photometrisch bei 340 nm gemessen. Der Testansatz für die Formiat -Dehydro-genase enthielt 2 mM NAD+ und 200 mM Natri- umformiat in 100 mM Kaliumphosphat-Puffer mit pH 6,5. Diese hohen Coenzy - und Substratkonzentrationen waren aufgrund der hohen K_m-Werte der Formiat-Dehydrogenase zum Erreichen der Maximalgeschwindigkeit notwendig (35) . Der pH-Wert entsprach den Bedingungen der Biotransformation. Der Ansatz zur Messung der Aktivität der MDH war wie unter Ic) beschrieben. Beide Bestimmun- gen wurden bei 30°C durchgeführt. Nach 2 min Messung der Basalaktivität ohne Substrat wurde die enzymspezifische Aktivität nach Zugabe des Substrats für weitere 2 min gemessen. Zur Berechnung der Aktivität wurde der spezifische Absorbtions-Koeffizient von NAD bei 340 nm E = 6220 M^"1cm^"1, verwendet. Eine Unit wurde definiert als die Reduktion oder Oxidation von 1 μmol NAD pro min bei pH 6,5 und 30°C.

Die spezifische Aktivität der Formiat -Dehydrogenase im zellfreien Rohextrakt von E. coli BL21 (DE 3) Gold pET- 28a (+) RspmdhNC / pBTac2FDH lag bei 0,14 U/mg. Slusarc- zyk et al . maßen für die spezifische Aktivität der gereinigten Formiat-Dehydrogenase 6,5 U/mg (35). Unter Verwendung dieses Wertes berechnet sich der Anteil der Formiat-Dehydrogenase am löslichen Zellprotein im indu- zierten E. coli BL21 (DE 3) Gold pET-28a (+) RspmdhNC / pBTac2FDH auf 2,2%.

Hinsichtlich der Stabilität der MDH konnte auch 48 h nach Reaktionsstart keine Verminderung der spezifischen Aktivität im zellfreien Rohextrakt festgestellt werden (Tabelle 2) . Die spezifische Aktivität der MDH im zellfreien Rohextrakt erwies sich mit 10 - 12 U/mg als konstant hoch. Die parallele Expression der Formiat -Dehydrogenase in E. coli BL21 (DE 3) Gold pET28a (+) RspmdhNC / pBTac2FDH erbrachte keine Minderung der spezifischen Aktivität der MDH im zellfreien Rohextrakt.

Tabelle 2 : Spezifische Enzymaktivitäten der MDH und der Formiat Dehydrogenase

Die oben gezeigte Biotransformation von D-Fructose zu D-Mannitol mit einer Mannitol-2 -Dehydrogenase aus Rhodobacter spaeroides kann in vergleichbarer Weise auch für die Mannitol -2 -Dehydrogenase aus Leuconostoc pseudomesenteroides durchgeführt werden. Die erfindungsge- mäße Nukleotidsequenz kann mit für den Fachmann bekannten Methoden in den entsprechenden Wirtsorganismus z. B. E. coli transformiert und exprimiert werden und dieser dann zur mikrobiellen Herstellung von D-Mannitol eingesetzt werden. Literatur

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Claims

Pat ent ansprüche

1. Nukleotidsequenz kodierend für eine MDH, enthaltend (i) eine Nukleotidsequenz gezeigt in SEQ ID No. 1 (ii) mindestens eine Nukleotidsequenz, die der

Nukleotidsequenz (i) innerhalb des Bereichs der Degeneration des genetischen Codes entspricht, oder

(iii) mindestens eine Nukleotidsequenz, die mit der zur Nukleotidsequenz (i) oder (ii) komplementären Nukleotidsequenz hybridisiert, und gegebenenfalls

(iiii) funktionsneutrale Sinnmutationen in (i) .

2. Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus aus der Familie der Lactobacteriaceae isoliert wird.

3. Nukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus Leuconostoc pseudomensenteroides isoliert wird.

4. Plasmid pQE80Lmd , hinterlegt bei der DSMZ unter der Bezeichnung DSM 14824.

5. Genstruktur enthaltend wenigstens eine Nukleotidsequenz gemäß den Ansprüchen 1 bis 3 sowie mit diesen operativ verknüpfte regulatorische Sequenzen.

6. Vektor, enthaltend wenigstens eine Nukleotidsequenz gemäß den Ansprüchen 1 bis 3 oder eine Genstruktur gemäß Anspruch 5 sowie zusätzliche Nukleotidsequenzen zur Selektion, zur Replikation in der Wirtszel- le oder zur Integration in das Wirtszell-Genom.

7. Sonde zur Identifizierung und/oder Isolierung von Genen, kodierend für eine MDH gekennzeichnet dadurch, dass sie ausgehend von einer Nukleotidsequenz gemäß ei- nem der Ansprüche 1 bis 3 hergestellt wird und eine zur Detektion geeignete Markierung enthält.

8. MDH oder ein Teil davon, kodiert durch eine Nukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3.

9. MDH mit einer Aminosäuresequenz abgeleitet aus der Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 1, dargestellt in der Seq-ID-NO. 2 oder einer modifizierten Form dieser Polypeptidsequenz oder Isoform davon oder Mischungen daraus .

10. Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 8 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß es aus der Familie der Lactobacteriaceae stammt.

11. Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 8 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass es aus Leuconostoc pseudomesenteroides stammt.

12. Mikroorganismus enthaltend in replizierbarer Form eine Nukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, welcher im Vergleich zum entsprechend nicht genetisch veränderten Mikroorganismus verstärkt ist und/oder dessen Kopienzahl erhöht ist .

13. Mikroorganismus gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet , dass er eine Genstruktur gemäß Anspruch 5 oder einen

Vektor gemäß Anspruch 6 oder ein Plasmid gemäß Anspruch 4 enthält .

14. Mikroorganismus gemäß einem der Ansprüche 12 bis 13, enthaltend wenigstens ein Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 8 bis 11, welcher eine im Vergleich zu dem entsprechend nicht genetisch veränderten Mikroorganismus erhöhte Aktivität aufweist.

15. Mikroorganismus gemäß Anspruch 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass er aus der Gattung Bacillus, Lactobacillus, Leuconostoc, den Enterobakteriaceae oder methylotrophen Hefen, Pilzen sowie aus allen auch in der Lebensmittelindustrie verwendeten Mikroorganismen stammt.

16. Mikroorgansimus gemäß Anspruch 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass er aus der Gruppe Achromobacter parvolus, Methylo- bacterium organophilum, Mycobacterium formicum, Pseudomonas spec . 101, Pseudomonas oxalaticus, Mo- raxella sp., Agrobacterium sp., Paracoccus sp., An- cylobacter aquaticus, Pseudomonas fluorescens, Rhodobacter sphaeroides, Rhodobacter capsulatus, Lactobacillus sp., Lactobacillus brevis, Leuconostoc pseudomesenteroides, Gluconobacter oxydans, Candida boidinii, Candida methylica oder auch Hansenula po- lymorpha, Aspergillus nidulans oder Neurospora crassa oder Escherichia coli stammt.

17. Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von D-Mannitol, dadurch gekennzeichnet, dass man Mikroorganismen einsetzt, in denen man die für die MDH codierende Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 1 bis 3 einbringt und/oder verstärkt.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass man einen mit einem oder mehreren Plasmidvektoren transformierten Mikrorganismus einsetzt, der einen Plasmidvektor für die MDH codierende Nukleotidsequenz trägt .

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass mit dem Plasmidvektor pQEδOLmd , hinterlegt unter der Nummer DSM 14824, transformierte Mikroorganismen eingesetzt werden.

20. Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von D- Mannitol , dadurch gekennzeichnet, dass man Mikroorganismen einsetzt, in die eine für eine MDH sowie eine für eine Formiat-Dehydrogenase co- dierende Nukleotidsequenz eingebracht und/oder verstärkt wird.

21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass man Mikroorganismen einsetzt, in die eine für die MDH codierende Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 1 bis 3 eingebracht und/oder verstärkt wird.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass man Mikroorganismen einsetzt, in denen man eine für eine Formiat-Dehydrogenase codierende Nukleotidsequenz isoliert aus Candida boidinii einbringt und/oder verstärkt .

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass man einen mit einem oder mehreren Plasmidvektoren transformierten Mikrorganismus einsetzt, der einen Plasmidvektor für die MDH sowie für die Formiat- Dehydrogenase codierende Nukleotidsequenz trägt.

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass man Mikroorganismen der Gattung Bacillus, Lactobacillus, Leuconostoc, den Enterobakteriaceae oder methylotrophen Hefen, Pilze sowie Mikroorganismen, die in der Lebensmittelindustrie verwendeten werden, einsetzt.

25. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass Mikroorganismen aus der Gruppe Achromobacter parvo- lus, Methylobacterium organophilum, Mycobacterium formicum, Pseudomonas spec . 101, Pseudomonas oxala- ticus, Moraxella sp., Agrobacterium sp., Paracoccus sp . , Ancylobacter aquaticus, Pseudomonas fluores- cens, Rhodobacter sphaeroides, Rhodobacter capsula- tus, Lactobacillus sp . , Lactobacillus brevis, Leu- conostoc pseudomesenteroides, Gluconobacter oxydans, Candida boidinii, Candida methylica oder auch Hansenula polymorpha, Aspergillus nidulans oder Neurospora crassa oder Escherichia coli eingesetzt werden.

26. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass als Kohlenstoffquelle Fructose oder Glucose eingesetzt wird.

27. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass man folgende Schritte durchführt :

a) Mikrobielle Herstellung von D-Mannitol unter Verwendung von Mikroorganismen, in die die für eine MDH kodierende Nuleotidsequenz sowie eine für eine Formiat -Dehydrogenase kodierende Nukleotidsequenz eingebracht und/oder verstärkt wird

b) Anreicherung des D-Mannitol im Medium oder in den Zellen der Mikroorganismen und

c) Isolieren des D-Mannitol.

28. Verfahren nach Ansprüche 27, dadurch gekennzeichnet, dass man Mikroorganismen verwendet, in die die für die MDH kodierende Nuleotidsequenz gemäß Anspruch 1 bis 3 eingebracht und/oder verstärkt wird.