WO2004000307A1 - アンサマイシン系抗生物質の新規用途及び新規血管新生抑制物質のスクリーニング方法 - Google Patents

アンサマイシン系抗生物質の新規用途及び新規血管新生抑制物質のスクリーニング方法 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to an angiogenesis inhibitor, more specifically, a novel angiogenesis effective for inhibiting angiogenesis in malignant tumors, diabetic retinopathy, retinal angiogenesis, inflammatory diseases, cardiovascular diseases due to cardiovascular remodeling, and the like.
  • the present invention relates to a method for screening an inhibitor and an angiogenesis inhibitor.
  • Angiogenesis is a phenomenon in which new blood vessels are formed from existing blood vessels.
  • malignant (solid) tumors, diabetic retinopathy, or retinal angiogenesis or inflammatory diseases (rheumatism, etc.) It is known that angiogenesis is deeply involved in progress. For example, for solid tumors to grow, it is imperative that angiogenesis provide a way to supply nutrients and oxygen and remove waste products, and in metastasis, which is an important issue in cancer treatment.
  • Angiogenesis is an important step in securing that path.
  • angiogenesis itself is a pathological condition, which leads to blindness if left unchecked. Therefore, suppressing angiogenesis is thought to lead to the prevention and treatment of this disease, and preventive and therapeutic drugs are being developed.
  • angiogenesis is observed in various lesions as described above, and promotes the progress of each pathological condition. Therefore, the suppression of this angiogenesis is attracting attention from the viewpoint of prevention and treatment of these pathological conditions.
  • angiogenesis inhibitors such as endostatin and angiostin
  • endostatin and angiostin are positioned as the most useful therapeutic agents for tumor dormancy and significantly regress solid tumors in experimental animals (Cell, 88, 277-285, 1997).
  • drug resistance like conventional anticancer drugs (Nature, 390, 404-407, 1997), and may be an ideal anticancer drug with few side effects.
  • angiostin to a molecular weight of 500,000
  • Endoscitin (approximately 20000), which has a lower molecular weight than Angiostin, has attracted much attention. Recently, clinical trials have been started in the United States for patients with end-stage malignant tumors. Was also unknown.
  • Endosutin inhibits endothelial cell proliferation in low serum culture and causes apoptosis (J. Biol. Chem., 274, 11721-11726, 1999). It was minor and it was difficult to explain the effects of regression of primary and metastatic lesions of cancer alone. Because tumor cells increase their proliferative capacity not only due to gene mutations but also due to abnormal gene expression regulation, they also actively produce and secrete many growth factors and angiogenesis promoting factors, and self-proliferate as autocrine / paracrine. In addition to promoting blood flow, the new blood vessels also provide abundant blood flow. Even in this environment, endostin must produce strong intracellular signals that specifically act on endothelial cells in order to suppress tumor angiogenesis as reported today. .
  • Rifamycin B and rifamycin O are induced by rifamycin S, and rifamycin S becomes rifamycin SV when reduced with ascorbic acid.
  • 3-Formylrifamycin is a 3-formylated version of rifamycin.
  • Rifampicin is derived from the 3-formylation of rifamycin SV.
  • Rifamycin is generally called an ansamycin antibiotic because it has an aromatic ring system and an aliphatic bridge called an ansa ring.
  • rifampicin is an ansamycin antibiotic developed by joint research of Ciba-Geigy (Switzerland) and Lepetit (Italy), and 3-formyl (3-formyl) of rifamycin SV. It is derived from what has been transformed.
  • rifampicin is 3-[[(4-methyl-1-piperazinyl) imino] methyl] rifamycin (3-C [(4-methyl-l-pierazinyl) imino] met yl] rif arayc in) It is a semi-synthetic ansamycin antibiotic with the following structure: It has excellent antitubercular activity and has been widely used as a therapeutic agent for tuberculosis. Rifampicin has antibacterial activity not only against Gram-positive bacteria but also against Gram-negative bacilli, and has been used for tuberculosis, brucellosis, Chlamydia infection, and especially Gram-positive infections such as staphylococci. .
  • Rifampicin converts 3-formylrifamycin SV to tetrahydro It is synthesized by reacting with 1-amino-4-methylpiperazine in furan, but a number of synthesis methods including an industrial synthesis method have been disclosed (Japanese Patent Publication No. Sho 225-2680). Japanese Patent Publication No. Sho 47-23033, Japanese Patent Publication No. 53-39040, Japanese Patent Publication No. 57-401 55, Japanese Patent Publication No. 62-4 41 671 No., Japanese Patent Publication No. 62-41,672, Japanese Patent Publication No. 62-41673).
  • the present inventors have conducted intensive searches to solve the above-mentioned problems, and as a result, have a superior antitubercular activity and have been widely used as a therapeutic agent for tuberculosis. It also has antibacterial activity against negative bacilli, etc.
  • rifampicin which has been used for brucellosis
  • chlamydial infection especially infection with Gram-positive bacteria such as staphylococcus
  • an ansamycin antibiotic such as rifamycin-SV or 3-formylrifamycin has an angiogenesis inhibitory action, and the present invention was made.
  • an ansamycin antibiotic such as rifampicin has an excellent angiogenesis-inhibiting action
  • the present inventor recently discovered a molecular mechanism involved in the suppression of angiogenesis by endostin (FASEB Journal, 15, 1044-1053, 2001). Tumor regression in experimental animals When endosuctin is administered at a concentration that indicates the results, various early response genes expressed in serum, growth factors, and cultured vascular endothelial cells stimulated by angiogenic factors, apoptosis, cell cycle, and cell migration-related genes It is markedly suppressed.
  • angiogenesis inhibitors such as endostin and angiostin, which have high molecular weights, have not been easily synthesized to obtain a dose of angiogenesis inhibitor having an antitumor effect.
  • angiogenesis-inhibiting substances that detect "angiogenesis-inhibiting signals" constructed by the present inventors, it is possible to detect factors that show endosuthin-type signals from many substances with unknown effects. From these studies, it was possible to discover new angiogenesis inhibitory factors by examining the tumor regression and neovascular inhibitory effects. With this screening method, the conventional process is greatly shortened, and the administration of peptides, proteins, and drugs necessary to achieve the same effect as endostatin is achieved. It became possible to estimate the amount in advance.
  • an ansamycin-based antibacterial substance such as rifampicin was found to have a strong angiogenesis inhibitory action from many candidate substances by the above-described screening method approach. Since ansamycin antibiotics such as rifampicin have been used as antibacterial drugs, their safety has been confirmed, and their production and administration methods have been established. Therefore, it can be expected to be used as a highly practical angiogenesis inhibitor. Disclosure of the invention
  • an angiogenesis inhibitor comprising an ansamycin antibiotic or a pharmacologically acceptable derivative thereof as an active ingredient (claim 1), and an ansamycin antibiotic comprising rifampicin, rifamycin.
  • the angiogenesis inhibitor according to claim 1 which is SV or 3-formylrifamycin, or a pharmaceutically acceptable derivative, 3.
  • the angiogenesis inhibitor according to claim 1 or claim 2, which is a pharmacologically acceptable salt or a hydrate thereof, or the angiogenesis inhibitor is an angiogenesis inhibitor in malignant tumors.
  • the present invention also provides a screening method for an angiogenesis inhibitor, which comprises adding a test substance to cultured vascular endothelial cells and detecting an angiogenesis inhibitory signal based on gene expression.
  • Item 10 The method for screening an angiogenesis inhibitor according to Item 9 (Claim 10), and an early response gene expressed in a vascular endothelial cell, wherein an angiogenesis inhibitory signal based on a change in the gene expression level in a cultured cell line is provided.
  • FIG. 1 is a view showing signals for suppressing angiogenesis by rifampicin, which were generated as a result of adding rifampicin at various concentrations to human adult skin capillary endothelial cells.
  • H F1t gene.
  • FIG. 2 is a graph showing the inhibitory effect of rifampicin on the growth of human adult capillary endothelial cells using a modified 72-hour growth assay (in a culture medium containing 10% fetal bovine serum).
  • FIG. 3 is a graph showing the time course of the advancing distance of the wounding edge after denudement of cultured human adult skin microvascular endothelial cells that have reached confluence. Cell migration was significantly suppressed by the addition of rifampicin to the culture medium.
  • Fig. 4 shows whether rifampicin was orally ingested into a solid tumor produced by transplanting a human colon cancer-derived cell line (CW-2) into a nude mouse, and examined whether it has an inhibitory effect on tumor growth. It is a figure showing a result. Tumor volume was significantly suppressed by ingestion of rifampicin.
  • Fig. 5 shows the data obtained from long-term administration of rifampicin to patients with C-type cirrhosis who developed pulmonary tuberculosis, that is, the relationship between changes in the blood-fetoprotin level and rifampicin administration in two patients.
  • FIG. 6 is a graph showing angiogenesis-inhibitory signals induced as a result of adding rifampicin, rifamycin-SV and 3-formylrifamycin at various concentrations to human retinal vascular endothelial cells. . This shows that each of c_myc, integrin- ⁇ V, and integrin-13 mRNA levels is suppressed in a concentration-dependent manner.
  • the present invention comprises an angiogenesis inhibitor comprising an ansamycin antibiotic or a pharmaceutically acceptable derivative thereof as an active ingredient.
  • the target of application of the angiogenesis inhibitor of the present invention is not particularly limited, but is angiogenesis inhibition in malignant tumors, angiogenesis inhibition in diabetic retinopathy, angiogenesis inhibition in retinal angiogenesis, and inflammatory disease. Used to suppress angiogenesis, angiogenesis associated with cardiovascular remodeling, etc. It can be used as a therapeutic agent and the like.
  • the active ingredient of the present invention comprises an ansamycin antibiotic such as rifampicin, rifamycin-SV, and 3-formylrifamycin.
  • the active ingredient of the present invention can be appropriately converted into a pharmacologically acceptable derivative for its administration, for example, to increase the solubility in water (Japanese Patent Publication No. 5-444467). ).
  • As one of its pharmacologically acceptable derivatives it can be converted into the form of a pharmacologically acceptable salt or a hydrate thereof, which is usually used in pharmaceutical formulation.
  • the effective component of the present invention such as rifampicin, any of the known production methods can be used as described above.
  • an appropriate administration method such as oral administration or parenteral administration (intravenous, intramuscular, subcutaneous, or ophthalmic) can be used depending on the subject.
  • oral administration the active ingredient of the present invention is prepared as a solid or liquid preparation, for example, in the form of tablets, granules, capsules, powders, troches, solutions, suspensions or emulsions.
  • parenteral administration the active ingredient of the present invention can be prepared, for example, into an injectable preparation using an appropriate solvent.
  • Such solvents include, for example, water, aqueous solvents (sodium chloride solution, glucose solution) ), Water-miscible solvents (such as ethyl alcohol, polyethylene glycol, propylene glycol), and non-aqueous solvents (such as corn oil, cottonseed oil, peanut oil, sesame oil, etc.).
  • aqueous solvents sodium chloride solution, glucose solution
  • Water-miscible solvents such as ethyl alcohol, polyethylene glycol, propylene glycol
  • non-aqueous solvents such as corn oil, cottonseed oil, peanut oil, sesame oil, etc.
  • the dosage of the active ingredient of the present invention is appropriately determined depending on the administration subject and the administration form, and the unit dosage for oral administration is, for example, about 50 to 100 mg of the active ingredient, preferably Approximately 150 to 500 mg of active ingredient may be included.
  • Rifampicin an active ingredient of the present invention, is a drug that has already been used in a very large number of patients, such as patients with tuberculosis, and is well-known for its usage and side effects. Dosage forms and methods can be used based on the experience of
  • the present invention also includes a method for screening a novel angiogenesis inhibitor.
  • the screening of the angiogenesis inhibitor of the present invention is carried out by adding a substance to be tested using cultured vascular endothelial cells and detecting an angiogenesis inhibitory signal based on gene expression.
  • angiogenesis-suppressing signal based on the expression of the gene an expression signal of the gene when endostin is administered at a concentration showing a tumor regression effect can be used.
  • angiogenesis inhibitory signal based on the expression of such a gene include an early response gene expressed in a vascular endothelial cell and an associated gene, a proliferative / cell cycle related gene, an adhesion factor, And the expression of one or more genes of an agonizing factor and a vasoactive factor receptor gene.
  • angiogenesis inhibitory signal gene examples include c-myc and c_fos as early response genes expressed in vascular endothelial cells.
  • Related genes include max, mad, and mxi1, proliferating cell cycle-related genes, mitogen activated protein kinase-1 and mitogen activated protein kinase-2, and integrin- ⁇ (integrin alpha v), inteclin_jS3 (integrin beta 3), endothelin-1 (endothelin-1) gene as a vasoactive factor, and ET-A as vasoactive factor receptor gene , AT1, AT2.
  • Detection of an angiogenesis inhibitory signal based on the expression of a gene by the novel angiogenesis inhibitor screening method of the present invention can be carried out by using a vascular endothelial cell by a known detection method.
  • vascular endothelial cells in particular, human adult skin capillary endothelial cells and human retinal vascular-derived endothelial cells can be used.
  • Gene expression can also be detected by a gene expression detecting means known per se.
  • a gene expression detecting means known per se.
  • an angiogenesis inhibitory signal based on gene expression can be detected.
  • A is the focal adhesion kinase gene
  • B is the platelet endothelial cell adhesion molecule-1 (PEC AM-1) gene
  • C is the integrin ⁇ v gene
  • D is the integrin one-third gene that is an adhesion factor
  • E is the endothelin_1 gene that is a vasoconstrictive peptide
  • F is the endoselin receptor subtype B (ETB) gene
  • G is H represents the result of quantifying the c-myc gene, which is an early response gene
  • H represents the result of quantifying the F1t gene, which is a subtype of the vascular endothelial growth factor (VEGF) receptor.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • rifampicin suppressed chemotactic migration of human adult skin capillary endothelial cells.
  • Example 5 Use experience in patients with primary liver cancer due to type C cirrhosis
  • FIG. 5 shows the relationship between changes in blood ⁇ -fetoprotein levels and administration of rifampicin in two patients.
  • Angiogenesis inhibitory signal (change of gene expression level) by addition of rifampicin, rifamycin SV, and 3-formyl rifamycin
  • Human retinal vascular endothelial cells are brought into an exponential growth state in the presence of serum, growth factors, and angiogenesis promoting factors, and rifampicin, rifamycin-SV and 3-formylrifamycin at various concentrations are added, and after 4 hours, Extract RNA and perform high-sensitivity real-time quantitative PCR using LightCycler as described above.
  • FIG. 6 shows the results.
  • A, B and C show the results of quantification of the c-myc gene
  • D, E and F show the results of quantification of the integrin- ⁇ V gene
  • G, H and I show the results of quantification of the integrin-1] 33 gene.
  • A, D, and G indicate the changes in the mRNA levels after the addition of rifampicin
  • B, E, and H indicate the changes in the mRNA levels after the addition of rifamycin-SV
  • C, F, and I after the addition of 3-formylrifamycin It is.
  • angiogenesis inhibitor which can be used as an antitumor agent, a therapeutic agent for diabetic retinopathy, a therapeutic agent for retinal angiogenesis, a therapeutic agent for inflammatory disease, a therapeutic agent for cardiovascular disease, or the like.
  • rifampicin which is an active ingredient of the present invention, has been used as an antibacterial drug, its safety has been confirmed, and its production method and administration method have been established.
  • the angiogenesis inhibitor of the present invention can be expected as a highly practical angiogenesis inhibitor.
  • the present invention provides a method for screening a novel angiogenesis inhibitor, which is a useful component of an angiogenesis inhibitor.
  • a screening method for an angiogenesis inhibitor that detects an "angiogenesis inhibitory signal" based on the expression of the gene of the present invention enables angiogenesis inhibitory agent to be selected from many substances with unknown effects. It is possible to effectively detect substances for production, and this screening method greatly shortens the conventional process, and also has the same effect as the existing drug endosutin. For this reason, it became possible to estimate in advance how much peptide-protein-drug dose is required.

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Abstract

　種々の疾病における血管新生抑制に有効で、かつ安全で実用性の高い新規血管新生抑制剤、及びそのスクリーニング方法を提供するものである。本発明の血管新生抑制剤の有効成分は、従来より結核治療やグラム陽性菌感染などの抗菌剤として広く使用されてきたリファンピシンやリファマイシンＳＶ、或いは３−フォルミルリファマイシンのようなアンサマイシン系の抗生物質からなる。本発明の有功成分は、優れた血管新生抑制作用を有する。本発明の血管新生抑制剤は、悪性腫瘍、糖尿病性網膜症、網膜血管新生症、炎症性疾患における血管新生抑制、及び心血管リモデリングに伴う血管新生抑制等に有効で、それぞれの疾病の治療剤等として用いることができる。また、本発明のスクリーニング方法は、遺伝子発現に基づく血管新生抑制シグナルの検出により、血管新生抑制物質の効果的なスクリーニングを可能とする。

Description

明 細 書 アンサマイシン系抗生物質の新規用途及び新規血管新生抑制物質の スクリ一二ング方法 技術分野
本発明は、 血管新生抑制剤、 更に詳しくは、 悪性腫瘍、 糖尿病性網膜 症、 網膜血管新生症、 炎症性疾患、 心血管リモデリングによる心血管疾 患等における血管新生抑制に有効な新規血管新生抑制剤、 及び血管新生 抑制物質のスクリーニング方法に関する。 背景技術
血管新生とは、 既存の血管から新しい血管が形成される現象であり、 悪性 （固形） 腫瘍や糖尿病性網膜症、 或いは網膜血管新生症や炎症性疾 患 （リュウマチ等） においては、 その発症や進展に血管新生が深く関わ つていることが知られている。 例えば、 固形腫瘍が増殖するには、 血管 新生によって栄養や酸素の供給と老廃物の除去の道を確保することが必 須であり、 また、 癌治療上、 重要な問題となっている転移において、 そ の道を確保するという意味で血管新生が重要なステップとなっている。 糖尿病性網膜症は、 血管新生そのものが病態であり、 放置すると失明に 至る。 したがって、 血管新生を抑制することがこの疾患の予防， 治療に 結びつくと考えられ、 その予防 · 治療薬の開発が行われている。
このように、血管新生は、 上記のような種々の病変において観察され、 それぞれの病態の進展を助長するので、 この血管新生の抑制がこれらの 病態の予防'治療の観点から注目されている。血管新生に関わる疾患の予 防または治療に向けて、 血管新生を阻害する物質を探索すべく鋭意研究 が推進されている。 その結果、 現在では、 多くの血管新生抑制物質が開 発され、 その中のいくつかの物質については、 臨床上での有効性が検討 されている。
例えば、 エンドスタチンやアンジォス夕チンなどの血管新生抑制因子 は最も有用な腫瘍休眠療法薬と位置づけられ、 実験動物の固形腫瘍を顕 著に退縮させ （Ce l l , 88, 277-285 , 1 997)、 反復投与を行っても従来の 抗癌剤のような薬剤耐性を示さないため （Na t u r e, 390 , 404-407, 1 997)， 副作用の少ない理想的な抗癌剤となる可能性が指摘されていた。しかし、 これらの因子は実用化されても抗腫瘍効果を示す有効な投与量の合成は 容易ではなく、 かつ製造コストも高くなることから、 分子量 5 0 0 0 0 に及ぶアンジォス夕チンの臨床応用を既に断念した企業もある。
そこで、 アンジォス夕チンより低分子量のエンドス夕チン （約 2 0 0 0 0 ) が期待を集め、 最近、 末期悪性腫瘍患者に対する臨床治験が米国 で開始されたが、 その受容体はもちろん、 そのメカニズムも不明であつ た。
ェンドス夕チンは、 低血清培養下において内皮細胞の増殖を抑制し、 アポト一シスを生ずる （J . B i o l . Chem. , 274, 1 1 721 - 1 1 726 , 1 999) が、 その程度は軽微であり、 それだけで癌の原発巣 ·転移巣を退縮させる効 果を説明するのは困難であった。 なぜなら腫瘍細胞は、 遺伝子変異のみ らず遺伝子発現調節異常によっても増殖能が亢進するうえ、 多くの増殖 因子や血管新生促進因子を盛んに産生 ·分泌し、 ォ一トクリン Ζパラク リンとして自己の増殖を促進させることに加え、 更に、 新生された血管 が豊富な血流を供給するからである。 エンドス夕チンがこうした環境下 にあっても、 現在報告されているような腫瘍血管新生を抑制するために は、 内皮細胞に特異的に作用する、 強力な細胞内シグナルを惹起しなけ ればならない。 これらの作用メカニズムは長く不明であった。 一方、 1 9 5 7年イタリア Lepetit社研究所の P. Sensi らは、 地中海 沿岸で採集した土壌より Streptomyces mediterranei (後に、 Nocardio lediterranei と分類された） を分離し、 その培養液よりグラム陽性菌、 抗酸性菌に抗菌力を示す抗生物質、 リファマイシンを得た。 培養液中の リファマイシンは、 リファマイシン A, B, C, D, Eなどからなる混 合物で、 リファマイシン〇はリファマイシン Bのの酸化型である。 リフ アマイシン B及びリファマイシン Oは、 リファマイシン Sに誘導され、 リファマイシン Sはァスコルビン酸で還元するとリファマイシン S Vと なる。 3—フオルミルリファマイシンは、 リファマイシンを 3—フオル ミル化したものである。 リファンピシンは、 リファマイシン S Vを 3— フオルミル （3- formyl) 化したものから誘導されたものである。 リファ マイシンは、 芳香環系をもち、 これにアンサ環 （ansa ring) と呼ばれる 脂肪族架橋が張られているので、 アンサマイシン系抗生物質と総称され る。
また、 上記リファンピシン（Rifampicin)は、 Ciba-Geigy 社 （スイス） と Lepetit社 （イタリア） の共^研究によって開発されたアンサマイシ ン系抗生物質であり、 リファマイシン S Vの 3—フオルミル（3- formyl) 化したものから誘導されたものである。 即ち、 リファンピシンは、 3— 〔[(4 _メチル一 1ーピペラジニル） ィミノ] メチル〕 リファマイシン (3- C [ (4-methyl-l-pi eraz inyl) i mi no] met yl] r i f arayc in) の構造を 持つ、 アンサマイシン系の半合成抗生物質であり、 優れた抗結核作用を 有し、 結核治療剤として広く使用されてきた物質である。 リファンピシ ンは、 グラム陽性菌群のみならず、 グラム陰性桿菌などにも抗菌活性を 有し、 結核以外にも、 ブルセラ症、 クラミジァ感染、 特にブドウ球菌な どのグラム陽性菌感染などに使用されてきた。
リファンピシンは、 3—ホルミルリファマイシン S Vをテトラヒドロ フラン中で、 1一アミノー 4ーメチルピペラジンと反応させて合成され るが、 工業的合成法を含めて、 多くの合成法が開示されている （特公昭 4 2 - 2 6 8 0 0号公報、 特公昭 4 7— 2 3 3 0 3号公報、 特公昭 5 3 - 3 9 4 0 0号公報、 特公昭 5 7 — 4 0 1 5 5号公報、 特公昭 6 2— 4 1 6 7 1号公報、 特公昭 6 2— 4 1 6 7 2号公報、 特公昭 6 2— 4 1 6 7 3号公報）。
本発明の課題は、 安全で実用性の高い新規血管新生抑制剤、 更に詳し くは、 悪性腫瘍、 糖尿病性網膜症、 網膜血管新生症及び炎症性疾患等、 種々の疾病における血管新生抑制に有効で、 かつ安全で実用性の高い新 規血管新生抑制剤を提供することにある。 また、 本発明は血管新生抑制 剤の有功成分となる新規血管新生抑制物質のスクリ一二ング方法を提供 することにある。
本発明者は、 上記課題を解決すべく、 鋭意探索の結果、 従来より優れ た抗結核作用を有し、結核治療剤として広く使用されてきた物質であり、 グラム陽性菌群のみならず、 グラム陰性桿菌などにも抗菌活性を有し、 結核以外にも、 ブルセラ症、 クラミジァ感染、 特にブドウ球菌などのグ ラム陽性菌感染などに使用されてきたリファンピシンが、 優れた血管新 生抑制作用を有することを見い出し、本発明を完成するに至った。 また、 本発明においては、 リファマイシン一 S V又は 3—フオルミルリファマ イシンなどのアンサマイシン系抗生物質が、 血管新生抑制作用を有する ことを確認し、 本発明をなした。
本発明において、 リファンピシン等のアンサマイシン系抗生物質が、 優れた血管新生抑制作用を有することを見い出したのは、 本発明者がェ ンドスタチンの分子シグナルを明らかにしたことに始まる。本発明者は、 最近、 エンドス夕チンによる血管新生抑制に関わる分子機構を発見した (FASEB Journal, 15, 1044-1053, 2001)。 実験動物において腫瘍退縮効 果を示す濃度のェンドス夕チンを投与すると、 血清 · 増殖因子 ·血管新 生因子刺激下の培養血管内皮細胞に発現する種々の初期応答遺伝子、 ァ ポト一シス ·細胞周期 ·細胞遊走関連遺伝子は著明に抑制される。
こうした遺伝子発現量の低下の結果、 内皮細胞増殖抑制作用は軽微だ が、 顕著な内皮遊走阻止作用をきたす。 このようなエンドスタチンによ る強力かつ広範囲にわたる遺伝子発現の抑制という細胞内応答を本発明 者は 「血管新生抑制シグナル」 と命名したが、 rea l - t ime 定量的 P C R 法にて m R N A量の変化を検出することにより、 短期間に数多くの因子 の中からェンドス夕チンと類似で、 かつ作用が強力なシグナルを示すも のを捜し出し、 内皮細胞遊走阻止作用 · 増殖抑制作用をあわせて検討す ることが可能となった。
従来、 これらの血管新生抑制因子を発見、取得するまでのプロセスは、 悪性腫瘍自身が血管新生抑制因子を産生しているであろうとのデータを もとに、 腫瘍に対する退縮効果を指標として、 目的とする物質が含まれ る大量の体液 ·細胞培養上清などの濃縮を繰り返して蛋白を精製したた め、 遺伝子クローニングに至るまでには長い経過を要した。 更に、 例え ば、 分子量の大きいエンドス夕チンやアンジォス夕チンなどの血管新生 抑制因子は、 抗腫瘍作用を示す投与量の血管新生抑制因子を得るための 合成は容易ではなかった。
本発明者の構築した 「血管新生抑制シグナル」 を検出する血管新生抑 制物質のスクリーニング方法により、 多くの作用未知の物質の中からェ ンドス夕チン型のシグナルを示す因子を検出することが可能となり、 そ の中から、 腫瘍退縮作用、 新生血管抑制作用を検討することにより、 新 規の血管新生抑制因子を発見することが可能となった。 このスクリ一二 ング方法により、 従来のプロセスは大幅に短縮され、 また、 エンドスタ チンと同等の効果を発現するために必要なぺプチド · 蛋白 ·薬剤の投与 量はどの程度かもあらかじめ推測することが可能となった。
本法は腫瘍新生血管標的療法などの目的で臨床的に応用可能な新規因 子の発見をめざすことを可能とし、 更に、 エンドスタチンの作用に基づ く、 血管新生抑制シグナルが普逼的に腫瘍退縮効果に相関することが確 認されれば、 これを指標に多くの合成ペプチドや化合物の生理活性を効 率的にスクリーニングできる。 すなわち、 培養血管内皮細胞を用いて被 検物質を添加し、 遺伝子の発現に基づく血管新生抑制シグナルを検出す れば、 多くの新規な血管新生抑制物質の効率的なスクリ一ニングが可能 となる。 そして、 ペプチド ·蛋白については分子量が比較的小さく、 容 易に臨床応用しゃすい物にターゲッ トを絞って開発することが可能であ り、 また、 薬剤や食品の成分についてもヒトに対する副作用などをスク リ一ニングの段階であらかじめ推測することも可能となる。
本発明においては、上記スクリ一ニング方法によるアプローチにより、 多くの候補物質の中から、 リファンピシンのようなアンサマイシン系抗 生物質が、 強力な血管新生抑制作用を有することを見い出した。 リファ ンピシンのようなアンサマイシン系抗生物質は、 抗菌性の医薬として利 用されていたものであるから、その安全性は確認されているものであり、 その製造方法や投与方法も確立されているものであるから、 実用性の高 い血管新生抑制剤としての利用が期待できるものである。 発明の開示
すなわち本発明は、 アンサマイシン系抗生物質又はその薬理的に許容 し得る誘導体を有効成分として含有してなる血管新生抑制剤（請求項 1 ) や、 アンサマイシン系抗生物質が、 リファンピシン、 リファマイシン一 S V又は 3—フオルミルリファマィシンであることを特徴とする請求項 1記載の血管新生抑制剤 （請求項 2 ) や、 薬理的に許容し得る誘導体が、 薬理的に許容し得る塩又はその水和物であることを特徴とする請求項 1 又は 2記載の血管新生抑制剤 （請求項 3 ) や、 血管新生抑制が、 悪性腫 瘍における血管新生抑制であることを特徴とする請求項 1〜 3のいずれ か記載の血管新生抑制剤 （請求項 4 ) や、 血管新生抑制が、 糖尿病性網 膜症における血管新生抑制であることを特徴とする請求項 1〜 3のいず れか記載の血管新生抑制剤 （請求項 5 ) や、 血管新生抑制が、 網膜血管 新生症における血管新生抑制であることを特徴とする請求項 1〜 3のい ずれか記載の血管新生抑制剤 （請求項 6 ) や、 血管新生抑制が、 炎症性 疾患における血管新生抑制であることを特徴とする請求項 1〜 3のいず れか記載の血管新生抑制剤 （請求項 7 ) や、 血管新生抑制が、 心血管リ モデリングに伴う血管新生抑制であることを特徴とする請求項 1〜 3の いずれか記載の血管新生抑制剤 （請求項 8 ) からなる。
また本発明は、 培養血管内皮細胞に被検物質を添加し、 遺伝子の発現 に基づく血管新生抑制シグナルを検出することを特徴とする血管新生抑 制物質のスクリーニング方法 （請求項 9 ) や、 培養細胞系における遺伝 子発現量の変化に基づく血管新生抑制シグナルが、 腫 '表退縮効果を示す 濃度のエンドスタチンを投与した場合に惹起される遺伝子発現変化と類 似であることを特徴とする請求項 9記載の血管新生抑制物質のスクリ一 ニング方法 （請求項 1 0 ) や、 培養細胞系における遺伝子発現量の変化 に基づく血管新生抑制シグナルが、 血管内皮細胞に発現する初期応答遺 伝子及びその関連遺伝子、 増殖 ·細胞周期関連遺伝子、 接着因子、 血管 作動性因子、 及び血管作動性因子受容体遺伝子の 1又は 2以上の遺伝子 の発現であることを特徴とする請求項 9又は 1 0記載の血管新生抑制物 質のスクリーニング方法 （請求項 1 1 ) からなる。 図面の簡単な説明
第 1図は、 ヒト成人皮膚毛細血管内皮細胞に対して、 各濃度のリファ ンピシンを添加した結果惹起された、 リファンピシンによる血管新生抑 制シグナルを示す図である。 A ： F AK遺伝子、 B ： P E CAM— 1遺 伝子、 C ：ィンテグリン一 V遺伝子、 D ：ィンテグリン— β 3遺伝子、 Ε ： エンドセリン一 1遺伝子、 F ： Ε Τ Β遺伝子、 G ： c -my c遺伝 子、 H ： F 1 t遺伝子。
第 2図は、 7 2時間増殖アツセィ変法 （ 1 0 %牛胎児血清含有増殖培 地培養下） を用いて、 リファンピシンによるヒト成人毛細血管内皮細胞 に対する増殖抑制作用を示す図である。
第 3図は、 コンフルェン卜に達した培養ヒト成人皮膚微小血管内皮細 胞の denudement後の wounding edgeの前進距離の時間経過を示す図であ る。 細胞遊走は培養培地へのリフアンピシン添加によって有意に抑制さ れている。
第 4図は、 ヌードマウスにヒト大腸癌由来細胞株 （CW— 2) を移植 して作製した固 腫瘍に対し、 リファンピシンを経口的に摂取させ、 腫 瘍増大抑制作用を示すかどうかを検討した結果を示す図である。 腫瘍体 積はリフアンピシン経口摂取によって、 有意に抑制されている。
第 5図は、 肺結核を発症した C型肝硬変患者に、 リファンピシンを長 期投与した際に得られたデータ、 即ち、 2例の患者の血中 —フエトプ ロティン値の推移とリファンピシン投与との関係を示す図である。
第 6図は、 ヒト網膜血管内皮細胞に対して、 各濃度のリファンピシン、 リファマイシン一 S V及び 3—フオルミルリファマィシンを添加した結 果惹起された、 血管新生抑制シグナルを示す図である。 c _my c、 ィ ンテグリン— α V、 インテグリン一 3の各 mRN Α量が、 いずれも濃 度依存的に抑制されていることを示す。 発明を実施するための最良の形態
本発明は、 アンサマイシン系抗生物質又はその薬理的に許容し得る誘 導体を有効成分として含有してなる血管新生抑制剤からなる。 本発明に おける血管新生抑制剤の適用対象としては、 特に制限はないが、 悪性腫 瘍における血管新生抑制、 糖尿病性網膜症における血管新生抑制、 網膜 血管新生症における血管新生抑制、 炎症性疾患における血管新生抑制、 心血管リモデリングに伴う血管新生抑制等に用いて、それぞれ抗腫瘍剤、 糖尿病性網膜症治療剤、 網膜血管新生症治療剤、 炎症性疾患治療剤、 又 は動脈硬化、 血管障害治療剤等として用いることが出来る。
本発明の有効成分は、 リファンピシン、 リファマイシン一 S V、 3— フオルミルリファマイシン等のアンサマイシン系抗生物質からなる。 本 発明の有功成分は、 その投与のために、 例えば、 水に対する溶解度を増 すために適宜、 薬理的に許容し得る誘導体に変換することができる （特 公平 5 _ 4 4 4 6 7号公報）。その薬理的に許容し得る誘導体の一つとし て、 通常医薬の製剤化において用いられている薬理的に許容し得る塩又 はその水和物等の形に変換することが出来る。 リファンピシン等の.本発 明の有功成分の調製には、 前記したように、 既に公知のいずれの製造方 法をも用いることが出来る。
本発明の血管新生抑制剤の投与に当たっては、 その対象に応じて、 経 口投与又は非経口投与 （静脈内、 筋肉内、 皮下或いは点眼など） の適宜 の投与方法を用いることが出来る。 経口投与の場合は、 本発明の有効成 分を、 固体又は液体の調剤として、 例えば錠剤、 顆粒剤、 カプセル、 粉 末、 トロ一チ、 溶液、 懸濁液或いは乳液のような形態で、 製剤化するこ とができる。 非経口投与の楊合は、 本発明の有効成分を適当な溶媒を用 いた、 例えば注射可能な調剤に調製することが出来る。 そのような溶媒 としては、 例えば、 水、 水性溶媒 （塩化ナトリウム溶液、 ブドウ糖溶液 など）、 水混和性溶媒 （エチルアルコール、 ポリエチレンダルコール、 プ ロピレングリコ一ルなど）、 及び非一水性溶媒 （トウモロコシ油、 綿実油, 落花生油、 ゴマ油など） が挙げられる。 糖尿病性網膜症のような疾病へ の適用に際しては、 本発明の有効成分を、 点眼薬の製剤形態として投与 することが出来る。
本発明有効成分の投与量は、 投与対象、 投与形態によって、 適宜定め られるものであるが、 経口投与のための単位投薬量は、 例えば約 5 0〜 1 0 0 0 m gの活性成分、 好ましくは約 1 5 0〜 5 0 0 m gの活性成分 が含まれる量を挙げることができる。
本発明の有効成分であるリファンピシンは、 既に結核患者等、 極めて 多くの患者に使用されてきた薬剤であり、 その用法や副作用も熟知され ているところから、 本発明の薬剤の使用に当たっては、 それらの経験に 基づいた、 投薬形態、 投薬方法を用いることが出来る。
また、 本発明は、 新規血管新生抑制物質のスクリーニング方法を包含 する。 該本発明の血管新生抑制物質のスクリーニングを実施するには、 培養血管内皮細胞を用いて被搀物質を添加し、 遺伝子の発現に基づく血 管新生抑制シグナルを検出することにより行う。 該遺伝子の発現に基づ く血管新生抑制シグナルとしては、 腫瘍退縮効果を示す濃度のエンドス 夕チンを投与した場合の遺伝子の発現シグナルを用いることができる。 かかる遺伝子の発現に基づく血管新生抑制シグナルとしては、 遺伝子の 発現に基づく血管新生抑制シグナルが、 血管内皮細胞に発現する初期応 答遺伝子及びその関連遺伝子、 増殖 ·細胞周期関連遺伝子、 接着因子、 血管作動性因子、 及び血管作動性因子受容体遺伝子の 1又は 2以上の遺 伝子の発現を挙げることができる。
該血管新生抑制シグナル遺伝子を具体的に例示すると、 血管内皮細胞 に発現する初期応答遺伝子としては、 c 一 m y c 、 c _ f o sが、 その 関連遺伝子としては、 m a x、 m a d , m x i 1が、 増殖 '細胞周期関 連遺伝子こして ま、 mitogen activated protein kinase-1, mitogen activated protein kinase-2が、 接着因子としては、 インテグリン— α ν (integrin alpha v)、 インテクリン _ jS 3 (integrin beta 3) が、 血 管作動性因子としては、 エンドセリン— 1 (endothelin-1) の遺伝子が、 及び血管作動性因子受容体の遺伝子としては、 E T— A、 AT 1、 AT 2の各遺伝子が挙げられる。
本発明の新規血管新生抑制物質のスクリーニング方法により、 遺伝子 の発現に基づく血管新生抑制シグナルを検出するには、 血管内皮細胞を 用いて、 それ自体公知の検出方法により実施することができる。例えば、 スクリーニングに用いる細胞としては、 血管内皮細胞、 特にヒト成人皮 膚毛細血管内皮細胞や、 ヒト網膜血管由来内皮細胞を用いることができ る。 遺伝子の発現の検出も、 それ自体公知の遺伝子の発現検出手段によ つて行うことができる。 その手段の 1つとして、 real-time 定量的 P C R法を用いて、 mRN Aの変化を検出することにより、 遺伝子の発現に 基づく血管新生抑制シグナルを検出することができる。
以下、 実施例により本発明をより具体的に説明するが、 本発明の技術 的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例 1. リファンピシンによる血管新生抑制シグナル
ヒト成人皮膚毛細血管内皮細胞を、 血清 ·増殖因子 ·血管新生促進因 子の存在下で指数関数的増殖状態にし、 各濃度のリフアンピシンを添加 し 4時間後に RN Aを抽出し、 Light Cycler による高感度 realtime定 量的 P C R法 （FASEB J., 15, 1044-1053, 2001) にて種々の遺伝子の m RN A量を定量した。 結果を、 第 1図に示す。 図中 Aは、 focal adhesion kinase遺伝子を、 B ¾ platelet endothelial cell adhesion molecule - 1 (P E C AM- 1 ) 遺伝子を、 Cは接着因子であるインテグリン— α v遺伝子を、 Dは接着因子であるインテグリン一 /3 3遺伝子を、 Eは血 管収縮性べプチドであるエンドセリン _ 1遺伝子を、 Fはェンドセリン 受容体サブタイプ B (ETB) 遺伝子を、 Gは初期応答遺伝子である c 一 my c遺伝子を、 Hは vascular endothelial growth factor ( V E G F) 受容体のサブタイプである F 1 t遺伝子をそれぞれ定量した結果を あらわす。
第 1図に示されるように、 各濃度のリファンピシンの添加は、 エンド ス夕チン類似のスぺク トルを示す血管新生抑制シグナルを惹起した。 実施例 2. リファンピシンによる血管内皮細胞増殖抑制作用
7 2時間増殖アツセィ （Cell, 88, 277-85, 1997) 変法にてリファン ピシンの内皮細胞の増殖に対する作用を検討した。
即ち、 1 0 %牛胎児血清含有増殖培地培養下において指数関数的増殖 状態にあるヒト成人皮膚毛細血管内皮細胞に対して、 各濃度のリファン ピシンを添加 48〜 7 2時間後に細胞数を自動血球計測装置にて測定し た。
結果を、 第 2図に示す。 リファンピシンは濃度依存性にヒト成人皮膚 毛細血管内皮細胞の増殖を抑制した。
実施例 3. リフアンピシンによる血管内皮細胞遊走抑制作用
Monolayer wounding 法 （FASEB J. , 15, 1044-1053, 2001) により、 リフアンピシンの細胞遊走抑制作用を検討した。
即ち、 1 0 %牛胎児血清含有増殖培地培養下でコンフルェントに達し たヒト成人皮膚毛細血管内皮細胞に対して、 あらかじめ 40 gZm l のリファンピシンを添加し、 2 4時間後に mono 1 ayer wound i ng 法で denudingを行い、 顕微鏡写真を経時的に撮影して、 wounding edgeの前 進距離を計測した。
結果を、 第 3図に示す。 リファンピシン 4 0 gZm 1添加によって
2 血管内皮細胞の前進距離は著明に減少した。
第 3図に示されるように、 リファンピシンはヒト成人皮膚毛細血管内 皮細胞の chemotacticな遊走を抑制した。
実施例 4. 実験動物移植腫瘍における钪腫瘍効果
ヌードマウスにヒト大腸癌由来細胞株 （CW— 2 ) を移植して作製し た固形腫瘍に対し、リフアンピシンを経口的に摂取させ、腫瘍退縮効果 · 転移巣退縮効果を示すかどうかを 0' Railly らの原法 （Cell, 79, 315- 28, 1994、 Cell, 88, 277-85, 1997) に従って検討した。 結果を、 第 4 図に示す。
固形腫瘍のサイズが 2 0 0 mm3に達した段階でリファンピシンを経 口摂取させると、 第 4図に示されるように、 リファンピシン非摂取群に 比較して有意に腫瘍増大は抑制された。
実施例 5. C型肝硬変による原発性肝癌患者における使用経験
肝臓病を専門とする本発明者は、 偶然、 肺結核を発症した C型肝硬変 患者にリファンピシンを投与したところ、 ひーフエトプロテイン値が急 激に低下することに気づいた。 また、 従来は頻.回に肝癌を発症していた にもかかわらず、 長期にわたって原発性肝癌の発症が見られなくなった ことに気づいた。 2例の患者の血中《—フエトプロティン値の推移とリ フアンピシン投与との関係を第 5図に示す。
実施例 6. リファンピシン、 リファマイシン S V、 及び 3 —フオルミル リファマィシンの添加による血管新生抑制シグナル （遺伝子発現量の変 化）
ヒト網膜血管内皮細胞を、 血清 ·増殖因子 ·血管新生促進因子の存在 下で指数関数的増殖状態にし、 各濃度のリファンピシン、 リファマイシ ンー S V及び 3—フオルミルリファマイシンを添加し、 4時間後に R N Aを抽出し、 前述の LightCyclerによる高感度 real-time定量的 P C R
3 法にて種々の遺伝子の m R N A量を定量した。その結果を第 6図に示す。 A、 B及ぴ Cは c 一 m y c遺伝子を、 D、 E及び Fはインテグリン一 α V遺伝子を、 G、 H及び Iはインテグリン一 ]3 3遺伝子を定量した結果 を示す。 また、 A、 D及び Gはリファンピシン添加後の、 B、 E及び H はリファマイシン— S V添加後の、 C、 F及び Iは 3—フオルミルリフ ァマイシン添加後の各 m R N A量の変化を示したものである。 第 6図に 示されるように、 リフアンピシンによる血管新生抑制シグナル惹起作用 は、 糖尿病性網膜症の病態を形成するヒト網膜血管由来内皮細胞におい ても顕著に見られると同時に、 リファンピシンの誘導体であるリファマ イシン— S V及び 3—フオルミルリファマィシンのいずれも強力な同様 の作用を示すことが明らかとなつた。 産業上の利用可能性
本発明により、 強力な血管新生抑制作用を有し、 悪性腫瘍、 糖尿病性 網膜症、 網膜血管新生症、 炎症性疾患、 及び心血管疾患等、 広い範囲の 疾病における血管新生抑制に使用して、 それぞれ抗腫瘍剤、 糖尿病性網 膜症治療剤、 網膜血管新生症治療剤、 炎症性疾患治療剤、 又は心血管疾 患治療剤等として用いることが可能な血管新生抑制剤を提供することが できる。 本発明の有効成分であるリファンピシンは、 抗菌性の医薬とし て利用されていたものであるから、 その安全性は確認されているもので あり、 その製造方法や投与方法も確立されているものであるから、 本発 明の血管新生抑制剤は、 実用性の高い血管新生抑制剤として期待できる ものである。 また、 本発明は、 血管新生抑制剤の有功成分となる新規血 管新生抑制物質のスクリーニング方法を提供する。 本発明の遺伝子の発 現に基づく 「血管新生抑制シグナル」 を検出する血管新生抑制物質のス クリーニング方法により、 多くの作用未知の物質の中から、 血管新生抑 制作用を有する物質を効果的に検出することが可能となり、 このスクリ 一二ング方法により、 従来のプロセスは大幅に短縮され、 また、 既存の 薬剤であるェンドス夕チンと同等の効果を発現するために必要なぺプチ ド -蛋白 ·薬剤の投与量はどの程度かを予め推測するようなことも可能 となった。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . アンサマイシン系抗生物質又はその薬理的に許容し得る誘導体を有 効成分として含有してなる血管新生抑制剤。
2 . 7ンサマイシン系抗生物質が、 リファンピシン、 リファマイシン一 S V又は 3—フオルミルリファマィシンであることを特徴とする請求項 1記載の血管新生抑制剤。
3 . 薬理的に許容し得る誘導体が、 薬理的に許容し得る塩又はその水和 物であることを特徴とする請求項 1又は 2記載の血管新生抑制剤。
4 . 血管新生抑制が、 悪性腫瘍における血管新生抑制であることを特徴 とする請求項 1〜 3のいずれか記載の血管新生抑制剤。
5 . 血管新生抑制が、 糖尿病性網膜症における血管新生抑制であること を特徴とする請求項 1〜 3のいずれか記載の血管新生抑制剤。
6 . 血管新生抑制が、 網膜血管新生症における血管新生抑制であること を特徴とする請求項 1〜 3のいずれか記載の血管新生抑制剤。
7 . 血管新生抑制が、 炎症性疾患における血管新生抑制であることを特 徵とする請求項 1〜 3のいずれか記載の血管新生抑制剤。
8 . 血管新生抑制が、 心血管リモデリングに伴う血管新生抑制であるこ とを特徴とする請求項 1〜 3のいずれか記載の血管新生抑制剤。
9 . 培養血管内皮細胞に被検物質を添加し、 遺伝子の発現に基づく血管 新生抑制シグナルを検出することを特徴とする血管新生抑制物質のスク リーニング方法。
1 0 . 培養細胞系における遺伝子発現量の変化に基づく血管新生抑制シ グナルが、 腫瘍退縮効果を示す濃度のェンドス夕チンを投与した場合に 惹起される遺伝子発現変化と類似であることを特徴とする請求項 9記載 の血管新生抑制物質のスクリ一二ング方法。
1 1 . 培養細胞系における遺伝子発現量の変化に基づく血管新生抑制シ グナルが、血管内皮細胞に発現する初期応答遺伝子及びその関連遺伝子、 増殖 ·細胞周期関連遺伝子、 接着因子、 血管作動性因子、 及び血管作動 性因子受容体遺伝子の 1又は 2以上の遺伝子の発現であることを特徴と する請求項 9又は 1 0記載の血管新生抑制物質のスクリ一ニング方法。
7
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