WO2004001031A1

WO2004001031A1 - ナマコ由来硫酸化フカン分解酵素

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Publication number: WO2004001031A1
Application number: PCT/JP2003/007838
Authority: WO
Inventors: Takeshi Sakai; Kumiko Ishizuka; Ikunoshin Kato
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 2002-06-20
Filing date: 2003-06-20
Publication date: 2003-12-31
Anticipated expiration: 2004-12-20
Also published as: EP1514923A1; EP1514923A4; CN1662648A; AU2003242486A1; JP4119890B2; JPWO2004001031A1; US20070122875A1

Abstract

ナマコ由来硫酸化フカンを分解する硫酸化フカン分解酵素、該酵素の製造方法、及び硫酸化フカンに該酵素を作用させて得られる低分子化物及びその製造方法、ならびに硫酸化フカン分解酵素の活性化因子。

Description

明細書ナマコ由来硫酸化フ力ン分解酵素技術分野

本発明は糖鎖工学分野において有用な硫酸化フカンを分解する酵素、該酵素の製造方法、該酵素を活性化させる様々な因子、並びに糖鎖工学用試薬として有用な硫酸化フカンオリゴ糖、及びそれらの製造方法に関する。背景技術

ナマコには数種の硫酸化多糖が含まれている。これらの中には、硫酸化フコースを主要構成成分とする多糖、すなわち、硫酸化フカンが存在する。ナマコ由来硫酸化フカンのエイズウイルス感染抑制作用ゃ抗凝血作用等が報告されているが、ナマコ由来硫酸化フカンを医薬品として開発する場合、その構造を決定する必要が生じる。ナマコ由来硫酸化フカンの構造は研究されている力現時点ではその平均的構造が判明しているに過ぎない。硫酸化フカンの構造決定の際、硫酸化フ力ンを分解する酵素を用いれば非常に有利であるが、ナマコ由来硫酸化フカンを分解する酵素は市販されていない。一方、硫酸化フカンは種々の褐藻類にも含まれており、その構造は由来となる海藻により異なることが多い。例えば、ヒバマタ、マコンブ、モズクそれぞれから抽出される硫酸化フカンは異なる構造を持つ。そして、これまで褐藻類由来の硫酸化フカンを分解する酵素がいくつ力報告されているが（国際公開第 9 6 Z 3 4 0 0 4号パンフレット、国際公開第 9 7 2 6 8 9 6号パンフレット、国際公開第 9 9 / 1 1 7 9 7号パンフレット、国際公開第 9 9 Z 4 1 2 8 8号パンフレツト、欧州特許出願公開第 1 3 0 6 3 8 9号明細書）、いずれも、ナマコ由来硫酸化フカンを分解することはできない。すなわち、ナマコ由来硫酸ィ匕フカンと褐藻類由来硫酸化フカンの構造は異なると考えられる。 ' 以上のことから、ナマコ由来硫酸化フカンを分解する酵素、及び酵素的に製造した構造が均一な硫酸化フカンオリゴ糖が求められていた。発明の目的

すなわち、本発明の目的は、ナマコ由来硫酸化フカンを分解する硫酸化フカン分解酵素、該酵素の製造方法、及び硫酸化フカンに該酵素を作用させて得られる低分子化物及びその製造方法を提供することにある。また、本発明の目的は、硫酸化フカン分解酵素の活性化因子を提供することにもある。発明の概要

本発明者らは、フコイダノバクター属に属する細菌の 1菌株、フコイダノバクターマリナス（Fucoidanobacter marinus) SI- 0098が新規な硫酸化フカン分解酵素を生産することを見出し、該酵素の製造方法を見出した。また、該酵素を利用してナマコ由来硫酸化フカンから、新規な硫酸化フカンオリゴ糖を製造できることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明の第 1の発明は、フコイダノパクター属細菌の培養物から得られたエンド型 a— L _フコシダーゼに関する。

本発明の第 1の発明において、該酵素は、エンド型 a— L一フコシダーゼ生産能を有するフコイダノパクター属細菌を培養し、その培養物から採取することができる。

本発明の第 2の発明は、フコイダノパクター属細菌の培養物から得られた硫酸化フカンスルファターゼに関する。

本発明の第 2の発明において、該酵素は硫酸化フカンスルファターゼ生産能を有するフコイダノバクター属細菌を培養し、その培養物から採取することができる。

本明の第 3の発明は、ナマコ由来硫酸化フカン画分に、本発明の第 1の発明のエンド型ひ一 Lーフコシダーゼを作用させて得られる硫酸化フカンォリゴ糖に関する。

本発明の第 3の発明の硫酸化フカンオリゴ糖は、ナマコ由来硫酸化フカン画分に本発明の第 1の発明のェンド型 _α— L—フコシダーゼを作用させて得られる硫酸化フカンオリゴ糖の製造方法によって製造することができ、塩化ナトリゥムの共存下で行っても良い。本発明の第 4の発明は、ナマコ由来硫酸化フカン画分に、本発明の第 1の発明のエンド型一 Lーフコシダーゼ及ぴ本発明の第 2の発明の硫酸化フカンスルファターゼを作用させて得られる硫酸化フカンオリゴ糖に関する。

本発明の第 4の発明の硫酸化フカンオリゴ糖は、ナマコ由来硫酸化フカン画分に本発明の第 1の発明のェンド型 α— L—フコシダーゼ及び本発明の第 2の発明の硫酸化フカンスルファターゼを作用させて得られる硫酸化フカンォリゴ糖の製造方法によって製造することができ、塩化ナトリゥム及び Ζ又は塩化カルシウムの共存下で行つても良い。図面の簡単な説明

図 1 本発明により得られるエンド型 α— L—フコシダーゼの ρ Ηと相対活性 (%) の関係を表すグラフである。

図 2 本発明により得られるエンド型ひ一 L一フコシダーゼの温度 (°C) と相対活性 (%) の関係を表すグラフである。

図 3 本発明により得られるエンド型 α— L—フコシダーゼの塩濃度（mM) と相対活性 (%) の関係を表すグラフである。

図 4 本発明により得られる硫酸化フカンスルファターゼの p Hと相対活性 (%) の関係を表すグラフである。

図 5 本発明により得られる硫酸化フカンスルファターゼの温度 (°C) と相対活性 (%) の関係を表すグラフである。

図 6 本発明により得られる硫酸化フカンスルファターゼの塩濃度（mM) と相対活性 (%) の関係を表すグラフである。

図 7 本発明により得られるエンド型一 L—フコシダーゼにより硫酸化フ力ンを分解して得られる硫酸ィ匕フカンオリゴ糖をゲルろ過した際の溶出パターンを表す図である。

図 8 本発明により得られるエンド型ひ一 L—フコシダーゼと硫酸化フカンスルファターゼにより硫酸化フカンを分解して得られる硫酸化フカンオリゴ糖の H P L C分析の結果を示す図である。発明の詳細な説明

以下本発明に関して具体的に説明する。

本発明において、ナマコ由来硫酸化フカンとしては、特に限定されるものではないが、例えば、マナマコ（Apostichopus japonicus) 由来硫酸化フカンを使用できる。マナマコは、本発明の硫酸化フカンォリゴ糖の生産効率が高く、原料として好適である。

本発明のェンド型 α— L—フコシダーゼとは、ナマコ由来硫酸化フカンに作用して還元性末端にフコースを持つオリゴ糖を生成させる酵素である。

本発明の硫酸化フカンスルファターゼとは、ナマコ由来硫酸化フカン及ぴナマコ由来硫酸化フカンに本発明のエンド型 a;— Lーフコシダーゼを作用させて生成されるオリゴ糖に作用して硫酸を遊離させる酵素である。

本発明の硫酸化フカンオリゴ糖は、ナマコ由来硫酸化フカンに本発明のエンド型ひ一 Lーフコシダーゼ単独、又は本発明の硫酸化フカンスルファターゼと一緒に作用させて得られるオリゴ糖で、還元性末端糖がフコースである。

本発明で使用するナマコ由来硫酸化フカンを製造する際にはまず、ナマコを水性溶媒中に浸し、硫酸化多糖画分を抽出する。その際硫酸化フカンの低分子化を防ぐためには、 ^：は4〜9、温度は 1 0 0 °C以下が好ましい。また、上記硫酸化多糖画分中のァミノ酸や低分子性の色素等は限外ろ過等により効率良く除去できる。疎水性物質の除去には活性炭処理等も有効である。

このようにしてナマコの硫酸化多糖画分を得ることができる。該画分を硫酸ィ匕フカン画分として、例えば本発明のエンド型 α— L—フコシダーゼや硫酸化フカンスノレファターゼの活性測定用基質及び本発明の硫酸化フカンォリゴ糖製造用の基質として使用できる。該画分を陰イオン交換カラムで分離すればより純度の高レ、硫酸化フカンを得られる。上記の硫酸化多糖画分も陰ィォン交換力ラムで精製した硫酸化フカンもともに本発明のェンド型 <¾一 Lーフコシダーゼゃ硫酸化フカンスノレファターゼの活性測定用基質及び本発明の硫酸化フカンォリゴ糖製造用の基質として使用できる。

本発明の、エンド型 Q!— L—フコシダーゼ及び硫酸化フカンスノレファターゼの製造に使用される細菌としては、該酵素を生産する細菌であれば特に限定はないが例えば、フコイダノノクタ一マリナス（Fucoidanobacter marinus) S I— 0098株が挙げられる。当該細菌株は本発明者らが単離した細菌である。なお、上 d菌株 ίま Fu c o i d a n o b a c t e r ma r i nu s S I— 0098 と表示され、〒 305— 8566日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに FERM P-1

4873として平成 7年 3月 29日（原寄託日）より寄託され、ブダペスト条約に基づき上記独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに FERM BP— 5403として平成 8年 2月 15日（移管日）より寄託されている。

本発明者らは、本菌株の 16 S r RNAをコードする D N Aの塩基配列を決定し、既知の細菌との相同性を調べ、本菌株が Verrucotnicrobiaに最も近い新属の細菌であると確認した。

本菌株の 16 S rRNAをコードする DNAの配列を配列表の配列番号 1に記載する。従って、 16 S r RNAをコードする DNAの配列より、フコイダノバクタ一マリナス SI - 0098と同属と判断される細菌から得られたエンド型ひ一 Lーフコシダーゼ及び硫酸化フカンスルファターゼも、本発明のェンド型 _α — Lーフコシダーゼ及び硫酸化フカンスノレファターゼに含まれる。

本発明のェンド型 α— L—フコシダーゼ及び硫酸化フカンスルファタ一ゼを生産する細菌を培養するにあたり、培地に加える栄養源は使用する微生物が利用し、該酵素を生産するものであればよく、炭素源としては、例えば、硫酸化フカン、ナマコ、干しナマコ、海藻、アルギン酸、ラミナラン、フコース、グルコース、マンニトール、グリセローノレ、サッカロース、マノレトース、デンプン等が利用でき、窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカー、肉エキス、脱脂大豆、硫安、塩化アンモニゥム、尿素、尿酸等が適当である。その他にナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、亜等の塩化物、リン酸塩、硫酸塩等を加えてもよい。なお、一般に海水から採取した微生物は、海水あるいは市販の人工海水を用いれば極めて生育しゃすレ、。

また、培養条件は使用する微生物、培地組成等に応じ、本発明のエンド型ひ一 Lーフコシダーゼ及び硫酸化フカンスルファターゼの生産量が最大になるように設定するが、一般に培養温度は 15〜 30 °C、培地の p Hは 5〜 9がよく、 5〜 7 2時間の通気攪拌培養で本発明のェンド型 α— L—フコシダーゼ及ぴ硫酸化フ力ンスルファターゼの生産量は最高に達する。培養終了後、遠心分離により菌体と培養上清に分画し、それぞれから本発明のェンド型 _α— Lーフコシダーゼ及び硫酸化フカンスルファターゼを得ることができる。

上記のフコイダノバクタ一マリナス S I— 0 0 9 8を適当な培地で培養し、その菌体を集め、通常の細胞破碎手段、例えば超音波処理で菌体を石皮砕すると無細胞抽出液が得られる。次いでこの抽出液から通常の精製手段により本発明のェンド型 α— L—フコシダーゼ及び硫酸化フカンスルファターゼを精製することもできる。例えば、塩析、イオン交換カラムクロマト、疎水カラムクロマト、ゲルろ過等により精製した本発明のェンド型 α _ L—フコシダーゼ及び硫酸化フカンスルファターゼを得ることができる。また、上述の培養上清中にも本発明のェンド型ひ一 Lーフコシダーゼ及び硫酸化フカンスルファターゼが存在するので、菌体内酵素と同様の手段で精製できる。

本発明のェンド型 o; _ L—フコシダーゼの理化学的性質は以下の通りである。 ( I ) 作用：ナマコ由来硫酸化フカンに作用して、ひ _ L—フコシル結合を加水分解する。

( I I ) 至適 ρ Η：本酵素の至適 ρ Ηは 7〜9付近にある（図 1 ) 。

すなわち図 1は本酵素の反応時の ρ Ηと相対活性の関係を表すグラフであり、 . 縦軸は相対活性 (%) 、横軸は ρ Ηを示す。

( I I I ) 至適温度：本酵素の至適温度は約 2 5 - 4 5 °C付近にある（図 2 ) 。すなわち、図 2は本酵素の反応時の温度と相対活性の関係を表すダラフであり、縦軸は相対活性 (%) 、横軸は温度 (°C) を示す。

本発明のェンド型ひ一 L一フコシダーゼは、硫酸化フカン分解活性を測定して確認でき、生産菌の培養液を遠心分離した上清、無細胞抽出液、各種カラムクロマトによる精製後の酵素液でも確認できる。

本発明のェンド型 α— L一フコシダーゼは塩化ナトリゥムの存在下で活性化される。

塩化ナトリゥムは、試薬の塩化ナトリゥム、食塩、海水、人工海水等、塩化ナトリウムを含むものならばいかなる物質でも使用できる。本明の、エンド型 a 一 L_フコシダーゼの反応液に添加する塩化ナトリゥム濃度は ImMから 1M程度がよく、好ましくは 5 mMから 900 mM程度がよい。

本発明の硫酸ィヒフカンスルファターゼの理化学的性質は以下の通りである。 (I) 作用：ナマコ由来硫酸化フカンに作用して、硫酸を遊離させる。また、本発明のエンド型 α— L—フコシダーゼと共存して、ナマコ由来硫酸化フカンの低分子化を、本明のェンド型ひ一 Lーフコシダーゼを単独で作用させた場合よりも進行させる。

(I I) 至適 pH：本酵素の至適 pHは 6〜8付近にある（図 4) 。

すなわち図 4は本酵素の反応時の p Hと相対活性の関係を表すグラフであり、縦軸は相対活性 (%) 、横軸は pHを示す。

(I I I) 至適温度：本酵素の至適温度は約 20〜45°C付近にある（図 5) 。すなわち、図 5は本酵素の反応時の温度と相対活性の関係を表すグラフであり、縦軸は相対活性 (%) 、横軸は温度 (°C) を示す。

本発明の硫酸化フカンスルファターゼは、遊離した硫酸を測定して確認でき、生産菌の培養液を遠心分離した上清、無細胞抽出液、各種カラムクロマトによる精製後の酵素液でも確認できる。

本発明の硫酸化フカンスルファターゼは塩化ナトリゥム及び Z又はカルシウムィオンの存在下で活性化される。

塩化ナトリゥムは、試薬の塩化ナトリゥム、食塩、海水、人工海水等、塩化ナトリウムを含むものならばいかなる物質でも使用できる。本究明の、硫酸化フカンスルファターゼの反応液に添加する塩化ナトリゥム濃度は ImMから 2M程度がよく、好ましくは 5 mMから 1M程度がよい。

カルシウムイオンは、試薬の塩化カルシウム、酢酸カルシウム等、カルシウムイオンを含むものならばいかなる物質でも使用できる。本発明の、硫酸化フカンスルファターゼの反応液に添加するカルシウムイオン濃度は 0. ImMから 1M 程度がよく、好ましくは 1 mMから 500 mM程度がよヽ。

フコイダノパクターマリナス S I— 0098株は硫酸化フカンを資化する微生物であり、硫酸化フカンを分解するために菌体内及び菌体外に本発明の：ド型 α— Lーフコシダーゼ及び硫酸化フカンスルフ了ターゼを生産する。本発明の硫酸化フカンオリゴ糖とは、ナマコ由来硫酸化フカン、若しくは硫酸化フカン含有物に本発明のェンド型 _α _ L—フコシダーゼを単独で、または本発明のエンド型 _α— L—フコシダーゼ及び硫酸化フカンスルファターゼを一緒に作用させて得られるオリゴ糖であり、還元性末端糖がフコースである。硫酸化フカン含有物としては、例えば硫酸化フカンの部分精製品、ナマコ由来硫酸化多糖画分、ナマコの水性溶媒抽出物、干しナマコ、若しくは生ナマコが好適に使用できる。

本発明の硫酸化フカンォリゴ糖を調製する際、硫酸化フカン、若しくは硫酸化フカン含有物の溶解は定法で行えばよく、溶解液中の硫酸化フカン、若しくは硫酸化フカン含有物はその最高溶解濃度でもよいが、通常はその操作性、反応に使用する本発明のェンド型 α— Lーフコシダーゼ及び硫酸化フカンスルフ了ターゼの量を考慮して選定すればよい。硫酸ィ匕フカンの溶解液としては、水、緩衝液等より目的に応じて選択すればよい。反応の条件は、使用する酵素が活性を示す範囲であれば特に限定はないが、溶解液の ρ Ηは通常中性付近で、酵素反応は通常 3 0 °C付近で行う。反応に使用する本発明のエンド型 CK— L一フコシダーゼ及び硫酸化フカンスルファターゼの配合比率や使用量、反応液の組成、反応時間等の調整により、硫酸化フカンオリゴ糖の分子量を調整できる。この様にして得られた本発明の硫酸化フカンォリゴ糖を分子量分画あるいは陰ィオン交換力ラムにより分画すれば、更に均一な分子量あるいは均一な荷電密度分布の本発明の硫酸化フカンオリゴ糖を調製できる。分子量分画は定法、例えばゲルろ過法や限外ろ過法を使用すればよい。低分子化物は、必要に応じて更にイオン交換樹脂処理、活性炭処理等の精製操作を行ってもよく、必要に応じて脱塩処理、無菌処理、凍結乾燥処理もできる。

本発明の硫酸化フカンオリゴ糖は、硫酸基を分子中に有しており、該基は種々の塩基と塩を形成する。本発明の硫酸化フカンオリゴ糖は、塩になった状態が安定であり、通常ナトリゥム及び/又は力リゥム及び/又はカルシウム等の塩の形態で提供される。これらの物質の塩はダウエックス 5 O W等の陽イオン交換樹脂を利用して遊離の本発明の硫酸化フカンオリゴ糖に導ける。また、これらは、必要に応じ公知慣用の塩交換を行い所望の種々の塩に交換できる。本発明の硫酸化フカンオリゴ糖は、薬学的に許容される塩、例えばナトリウム、力リゥム等のアルカリ金属、カルシウム、マグネシウム、亜鉛等のアル力リ土類金属、アンモ-ゥム等の塩とすることができる。

本宪明のェンド型一 L—フコシダーゼ及び硫酸化フカンスルファタ一ゼは硫酸化フカンを低分子化するため硫酸化フカンの構劍旱析に使用できる。また、本発明の硫酸ィヒフカンオリゴ糖は糖鎖工学用試薬として使用できる。例えば、特公平 5— 6 5 1 0 8号公報記載の方法により 2—アミノビリジル化（ P A化）を行い、該オリゴ糖の P A—化物を調製すれば、硫酸化フカンオリゴ糖の蛍光標識標準物質として使用できるなど糖鎖工学用試薬として極めて有用な物質を提供できる。また、本発明の硫酸化フカンオリゴ糖は抗原として利用でき、公知の方法により、本発明の硫酸化フカンオリゴ糖を認識する抗体を作製することができる。本発明の硫酸化フカンオリゴ糖を認識する抗体は、硫酸化多糖の構军析に利用でき、極めて有用である。

実施例

以下に本発明を実施例をもって具体的に示すが、本発明は以下の実施例の範囲のみに限定されるものではない。

参考例 1 ナマコ由来硫酸化多糖画分の調製

市販のマナマコ 3 5 k gの体壁部分を細断し、 4倍量のアセトンとともにホモジナイザーで 8000回転、 5分処理後、ろ紙でろ過し残さを得た。得られた残さを 4倍量のァセトンとともにホモジナイザ一で 8000回転、 5分処理後、ろ紙でろ過し残さを得た。得られた残さを吸引乾燥させ、 1 1 3 2 gのナマコ体壁アセトン処理物を得た。

4 0 0 gのナマコ体壁ァセトン処理物を、 1 0リットノレの 1 0 0 mM塩化ナトリゥム及び 1 O mM塩化カルシウムを含む 3 O mMイミダゾールー塩酸緩衝液 ( p H 6 . 5 ) に懸濁し、ァクチナーゼ Eを 2 g添加し、 4 5 °Cで 3時間処理後、さらに、 9 5 °Cで 2時間処理した。処理液を穴径 1 0 6 At mのステンレス製ふるいでろ過し、得られたろ液に 2 0 gの活性炭を添加し、室温で 3 0分間攪拌後、遠心分離した。得られた上清に 1 0 %となるようにェタノールを加え、排除分子量 1 0万のホロファイバーを装着させた限外ろ過器で 2リットルに濃縮後、遠心分離により不溶物を除去した。得られた上清を限外ろ過器により 10%エタノールを含む 100 mM塩化ナトリウムに溶媒置換した。この溶液を 4 °C以下に冷却後、塩酸により pHを 2. 0とし、生じた沈殿を遠心分離により除去した。得られた上清の p Hを水酸化ナトリウムにより 8. 0とし、 P艮外ろ過器により 20 m M塩化ナトリウムに溶媒置換した。この溶液中の不溶物を遠心分離により除去後、凍結乾燥し、ナマコ由来硫酸化多糖画分の乾燥物 37 gを得た。

参考例 2 硫酸化フカン画分の調製

参考例 1記載のナマコ由来硫酸化多糖画分の乾燥物 7 gを、 50 mM塩化ナトリウムと 10 %ェタノールを含む 20 mMィミダゾール塩酸緩衝液 (pH7. 0) 700mlに溶解し、遠心分離により不溶物を除去した。得られた上清を、同緩衝液で平衡ィ匕した 5リツトルの D E A E—セノレ口ファイン A—800カラムにかけ、同緩衝液で洗浄後、 5 OmMから 2. 05 Mの塩化ナトリゥム濃度勾配により溶出させた。溶出液は 500mlずつ分取した。各フラクションの総糖量をフエノーノレ硫酸法により、ゥロン酸量を力ルバゾール硫酸法により測定した。塩化ナトリウム濃度 0. 8〜1. 5Mで溶出された画分（フラクションナンバー 45〜57) を硫酸化フカン画分とした。

参考例 3 エンド型ひ一L—フコシダーゼ活性測定方法

15 μ 1の 1 %の硫酸化フカン画分溶液と、 75 μ 1の 5 OmMリン酸ナトリゥム緩衝液（ρΗ 8. 5) と、 9 μ 1の 4M塩化ナトリウムと、 41 μ 1の水と、 10 μ 1の本発明のェンド型ひ一 Lーフコシダーゼ溶液とを混合し、 37 °Cで 1 時間反応させた後、反応液を 100°Cで 10分間処理し、遠心分離後 100 1 を HP LCにより分析し、低分子化の程度を測定した。対照として、本発明のェンド型 _α— L—フコシダーゼ溶液の代わりに、その酵素溶液を溶解している緩衝液を用いて反応させたもの及び硫酸化フカン画分の代わりに水を用いて反応させたものを同様に H PLCで分析した。

1単位のェンド型 _α— L一フコシダーゼ活性は上記反応系において 1分間に 1 μπιο 1の硫酸化フカンのフコシル結合を切断する酵素量とした。エンド型 a— Lーフコシダーゼ活性は下記式により求めた。 { (1 5 X 1000 X 1,100) /MG} X { (MG/M) 一 1 } X { 1/ (60 X 0. 01) } =U/m 1

15X1000X1/100：反応系中に添加した硫酸化フカン画分 (μ g)

MG：基質硫酸化フカンの平均分子量

M：反応生成物の平均分子量

(MG/M)- 1： 1分子の硫酸化フカンが酵素により切断された部位の数

60 ：反応時間（分）

0. 0 1 :酵素液量（m 1 )

なお、 HP LC条件は下記によった。

装置： L— 6200型（日立製作所製）

カラム： OHp a k SB— 806HQ (8 X 300 mm、昭和電工社製）溶離液： 5 mMのアジ化ナトリゥムを含む 50 mMの塩化ナトリウム検出：視差屈折率検出器 (Sh o d e x R I— 7 1、昭和電工社製）流速 : 1m l /分

カラム温度： 25°C

反応生成物の平均分子量の測定のために、市販の分子量既知のプルラン（ST ANDARD P— 82、昭和電工社製）を上記の H P L C分析と同条件で分析し、プルランの分子量と保持時間との関係を曲線に表し、上記反応生成物の分子量測定のための標準曲線とした。また、タンパク質の定量は、酵素液の 280 n mの吸光度を測定することにより行つた。その際 1 m g Zm 1のタンパク質溶液の吸光度を 1. 0として計算した。

参考例 4 硫酸化フカンスルファターゼ活性測定方法

1 5 μ 1の 1 %の硫酸ィ匕フカン画分溶液と、 75 /i 1の 50 mMィミダゾーノレ一塩酸緩衝液（pH 7. 0) と、 6 μ 1の 4M塩化ナトリウムと、 3 / lの 1M 塩化カルシウムと、 3 1 / 1の水と、 20 1の本発明の硫酸化フカンスルファターゼ溶液とを混合し、 3 7 °Cで 1時間反応させた後、反応液を 100 °Cで 10 分間処理し、遠心分離後 1 00 μ 1を H P L Cにより分析し、生成する硫酸量を測定した。対照として、本努明の硫酸化フカンスルファターゼ溶液の代わりに、その酵素溶液を溶解している緩衝液を用いて反応させたもの及び硫酸化フカン画分の代わりに水を用いて反応させたものを同様に HP L Cで分析した。

1単位の硫酸ィ匕フカンスルファターゼ活性は上記反応系において 1分間に 1 μ mo 1の硫酸を生成させる酵素量とした。硫酸ィ匕フカンスルファターゼ活性は下記式により求めた。

SZ (60 X0. 02) =U/m 1

S:反応により生成した硫酸（μιηο 1 e)

60 :反応時間（分）

0. 02 :酵素液量（m 1 )

なお、 HP LC条件は下記によった。

装置： L— 6200型（日立製作所製）

カラム： OHp a k S B-804HQ (8 X 300mm 昭和電工社製）溶離液： 5 mMのアジ化ナトリウムを含む 50 mMの塩化ナトリウム検出：示差屈折率検出器（Sh o d e x R I— 71、昭和電工社製）流速 : 1ml Z分

カラム温度： 35°C

反応により遊離した硫酸量の測定のために、 1 mM及び 0. 5 mMの硫酸ナトリウムを上記の H PLC分析と同条件で分析し、硫酸ナトリウム濃度とそのピークの高さとの関係を曲線に表し、遊離硫酸量測定のための標準曲線とした。実施例 1 エンド型 a— L—フコシダーゼの調製（1)

フコイダノバクタ一マリナス S I— 0098を参考例 1の方法で調製したナマコ由来硫酸化多糖画分 0. 3%とペプトン 1%を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー社製） Η8. 2からなる培地 5m 1を 120°C、 20分間オートクレーブ処理した培地に接種し、 25でで 2日培養した。得られた培養物のうち 150 μ 1を、上記と同じ成分を含む 100mlの培地に植え継ぎ、 25°Cで 3 日培養した。上記と同じ成分及び 0. 01%消泡剤（KM70、信越化学工業社製）を含む培地 600m 1を 2リツトルの三角フラスコに入れたものを 7本用意し、 120。C、 20分間ォートクレーブ処理後、各培地に上記の培養物を 1 m 1 ずつ接種し、 25 °Cで 3日培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体及ぴ培養上清を得た。同じ培養を繰り返し、培養液 12. 6リツトルから約 15 g の湿菌体を得た。

得られた菌体を 200m 1の 100 mM塩化ナトリゥム及び 5mMj8—メルカプトェタノールを含む 10 mMィミダゾールー塩酸緩衝液 (pH7. 5) に懸濁させ、超音波処理により菌体を破碎し、遠心分離して上清を得た。得られた上清を上記の緩衝液で充分透析し、遠心分離して上清を得た。

得られた上清を同じ緩衝液で平衡化した 500 m 1の D E A E—セル口フアイン A— 800の力ラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、 100 mMから 500 mM 塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させ、溶出液を 45m lずつに分画し、各フラクションの本発明のェンド型一 L—フコシダーゼ活性を測定し、活性画分を集めた。

得られた活性画分を 5 OmM塩化ナトリゥム及び 5mMi3—メルカプトエタノールを含む 10 mMィミダゾール一塩酸緩衝液 (pH7. 5) で充分透析し溶媒置換した。この酵素溶液を同じ緩衝液で平衡化した 150m lの DEAE—セル口ファイン A— 800のカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、 5 OmMから 40 OmM塩化ナトリゥムの濃度勾配により溶出させ、溶出液を 20mlずつに分画し、各フラクションの本発明のェンド型 α— L—フコシダーゼ活性を測定し、活性画分を集めた。

得られた活性画分を 50 mM塩化ナトリウム及び 5 mM ]3—メルカプトエタノールを含む 10 mMィミダゾールー塩酸緩衝液 (pH7. 5) で充分透析し溶媒置換した。この酵素溶液を同じ緩衝液で平衡化した 80 m 1の硫酸化セル口ファィンのカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、 50 mMから 1500 mM塩化ナトリゥムの濃度勾配により溶出させ、溶出液を 5 m 1ずつに分画し、各フラクションの本発明のェンド型 α— L—フコシダーゼ活性を測定し、活性画分を集めた。得られた活性画分を 100 mM塩化ナトリウム及び 5 mM ]3—メルカプトエタノールを含む 10 _mMィミダゾール—塩酸緩衝液 (pH7. 5) で充分透析し溶媒置換した。次に、 15 OmM塩化ナトリウム及び 5mM ]3—メルカプトエタノールを含む 40 mMリン酸カリゥム緩衝液で充分透析し溶媒置換した。この酵素溶液を同じ緩衝液で平衡化した 40 m 1のヒドロキシノレアパタイト（和光純薬製）のカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、 4 OmMから 25 OmMリン酸カリゥムの濃度勾配により溶出させ、溶出液を 6m 1ずつに分画し、各フラクションの本発明のェンド型 _α _ L—フコシダーゼ活性を測定し、活性画分を集めた。得られた活性画分を 100 mM塩化ナトリウム及び 5 mM 一メルカプトエタノールを含む 10 mMィミダゾールー塩酸緩衝液 (pH7. 5) で充分透析し溶媒置換した。この酵素溶液を同じ緩衝液で平衡化した 1520 m 1のセフアタリル S— 200 (4. 4x 100 cm, フアルマシア社製）のカラムにかけ、同じ緩衝液で溶出させ、溶出液を 13. 5 m 1ずつに分画し、各フラクションの本発明のエンド型 α— L—フコシダーゼ活性を測定した。

こうして本発明のェンド型 α— L—フコシダーゼの精製物を得た。なお、本発明のエンド型 _a_L—フコシダーゼのセフアクリル S— 200によるゲルろ過の際の溶出位置及び電気泳動の際の泳動距離から求めた該酵素の分子量はそれぞれ、およそ 3万 2000 (2万〜 4万の分布）及び 4万 2000 (3万〜 5万の分布）であった。

以上の精製工程を表 1にまとめる。

工程総タンパク質総活性比活性収率

(mg) (mU) (mU/rag) ( ) 抽出液 5， 520 20, 400 3.700 100

DEAE-セル口ファイン 193 10, 800 56.0 52.9

DEAE-セル口ファイン 140 6, 700 47.9 32.8 硫酸化セル口ファイン 4.58 1,860 406 9.12 ヒドロキシノレアパタイト 2.12 2, 440 1, 150 12.0 セフアクリル S- 200 1.40 1,220 871 5.98 実施例 2 エンド型 α— L—フコシダーゼの調製（2)

フコイダノバクタ一マリナス S I— 0098を実施例 1に記載の方法で培養し、培養液 4. 2リットルから約 6 gの湿菌体を得た。

得られた菌体を 5 Om 1の 5 OmM塩化ナトリゥムを含む 1 OmMリン酸ナトリウム緩衝液 (pH7. 5) に懸濁させ、超音波処理により菌体を破碎し、遠心分離して上清を得た。得られた上清を上記の緩衝液で充分透析し、遠心分離して上清を得た。

得られた上清を同じ緩衝液で平衡化した 300 m 1の D E A E—セノレ口フアイン A— 800のカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、 50 mMから 500 mM塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させ、溶出液を 25mlずつに分画し、各フラタションの本発明のェンド型 _α— L—フコシダーゼ活性を測定し、活性画分を集めた。

得られた活性画分を 100 mM 塩化ナトリウムを含む 10 mM リン酸ナトリウム緩衝液 (pH7. 5) で充分透析し溶媒置換した。この酵素溶液を同じ緩衝液で平衡ィ匕した 5 Omlの DEAE—セノレ口ファイン A— 800のカラムにかけ、同じ緩衝液で洗浄後、 100 mMから 400 mM 塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させ、溶出液を 1 Om 1ずつに分画し、各フラクションの本発明のエンド型 α— Lーフコシダーゼ活性を測定し、活性画分を集めた。

得られた活性画分を 50 mM塩化ナトリウムを含む 50 mMリン酸カリゥム緩衝液 (pH7. 5) で充分透析し溶媒置換した。この酵素溶液を同じ緩衝液で平衡化した 20 m 1のヒドロキシルァパタイトの力ラムにかけ、同じ緩衝液で洗净後、 50 mMから 200 mMのリン酸カリウムの濃度勾配により溶出させ、溶出液を 10mlずつに分画し、各フラクションの本発明のェンド型一 L一フコシダーゼ活性を測定し、活性画分を集めた。

得られた活性画分を、 100 mM 塩化ナトリウム及ぴ 5 mMアジ化ナトリウムを含む 10 mM イミダゾールー塩酸緩衝液 (pH7. 5) で平衡化した 15 20m lのセファタリノレ S— 200 (4. 4 X 100 c m、ファノレマシア社製）のカラムにかけ、同じ緩衝液で溶出させ、溶出液を 13. 5mlずつに分画し、各フラクションの本発明のェンド型ひ一 L—フコシダーゼ活性を測定した。こうして本発明のェンド型ひ一 L—フコシダーゼの精製物を得た。

以上の精製工程を表 2にまとめる。表 2

丁 ¾a ク、ノパ力

,ヽソ収华

(mg) 1丁ヽ (mU/mgJ

抽出液 2, 067 8,010 3.88 100 透析 1,923 6， 980 3.63 87.1

DEAE-セル口ファイン 53.3 6， 590 124 82.3

DEAE -セノレ口ファイン 29.2 6， 500 223 81.1 ヒドロキシノレアパタイト 3.91 3， 220 824 40.2 セファタリル S— 200 1.19 2， 280 1， 920 28.4 本発明のエンド型 _a— L—フコシダーゼの精製物の至適 pH、温度、塩濃度を調べた。その結果をそれぞれ図 1、図 2およぴ図 3に示す。

実施例 3 エンド型 _a_L—フコシダーゼを用いた硫酸化フカンオリゴ糖の調参考例 2に記載の硫酸化フカン画分 1. 5 gを 135mlの 25 OmM 塩化ナトリウムを含む 50 mMのィミダゾール塩酸緩衝液 (pH8. 2) に溶解させ、本発明のエンド型 CK— L—フコシダーゼを 144mU (15ml) 添加し 30°C で 4日間攪拌後、 110 Om 1のセノレ口ファイン GCL— 1000 (4X87 c m、生化学工業社製）で 50 m 1ずつ 3回に分けてゲルろ過し分子量分画した。溶出させたフラクションは総て、総糖量をフエノール一硫酸法で測定した。その結果、図 7に示すような分布を示した。図 7の縦軸はフエノール硫酸法により発色させた際の 480 nmにおける吸光度、横軸はフラクション番号を示す。すなわち、フラクション番号 50〜75の付近を中心に、分子量 4万を中心に分布する本発明の硫酸化フカンオリゴ糖が溶出された。これらのオリゴ糠の糖組成、還元性末端糖分析を行ったところ、実質的に総てフコースであった。

すなわち、ナマコ由来硫酸化フカン画分に本発明のェンド型ひ一 Lーフコシダーゼを作用させることにより種々の分子量の本発明の硫酸化フカンオリゴ糖が調製できた。

実施例 4 硫酸化フカンスルファターゼ

実施例 1及ぴ 2の方法により精製した本発明のェンド型 α— L—フコシダーゼ単独では、ナマコ由来硫酸化フカンを実施例 3に示した分子量分布より低分子化させることができなかった。そこで、本発明のエンド型 0!— L—フコシダーゼと共存してナマコ由来硫酸化フ力ン画分を低分子化させる画分を探した。その結果実施例 1に記載した硫酸化セル口フアインの溶出画分のうち、 6 0 0 mM付近の塩化ナトリウムで溶出される画分に、本発明のエンド型 a— L—フコシダーゼによる硫酸化フカンの低分子化を活性化させる活性が検出された。そこで、該画分をナマコ由来硫酸化フカンに作用させ、反応液中に生成した物質を調べた。まず、反応液を参考例 4に記載の方法で H P L Cにより分析したところ、硫酸の生成が確認できた。次に、糖を含む低分子成分が生成していないかどうかを調べるため、反応液をセル口ファイン G C L— 2 5のカラム ( 4 X 9 0 c m) でゲルろ過し、溶出させた各フラタションの総糖量をフエノール一硫酸法により分析した。その結果、糖を含む低分子成分は生成していなかった。このようにして、本発明のェンド型ひ一 Lーフコシダーゼによる硫酸化フカンの低分子化を活性化させる酵素は硫酸化フカンスルファターゼであることが強く示唆されたので、参考例 4に記載の方法で活性が検出される硫酸化フカンスルファターゼの精製を行つた。

すなわち、実施例 1に記載した硫酸化セル口ファインの溶出画分のうち、 6 0 O mM付近の塩化ナトリゥムで溶出される本発明の硫酸化フカンスルファターゼの活性画分を集め、 1 0 0 mM塩化ナトリウムと 5 mMアジ化ナトリウムと 5 m Μ —メルカプトエタノールを含む 1 0 mMィミダゾールー塩酸緩衝液で平衡化させた 1 5 2 O m 1のセフアクリル S— 2 0 0のカラムにかけ、同緩衝液で溶出させた。分取は 1本あたり 1 3 . 5 m lで行った。本発明の硫酸化フカンスルファターゼの分子量を溶出位置から計算すると約 8万 4 0 0 0 ( 7万〜 1 0万の分布）であった。

本発明の硫酸化フカンスルファターゼの精製物の至適 p H、温度、塩濃度を調ベた。その結果をそれぞれ図 4、図.5および図 6に示す。

実施例 5 ナトリウム塩濃度の影響

本発明のェンド型 α— L—フコシダーゼ及び本発明の硫酸化フカンスルファターゼの反応系に含まれる塩化ナトリゥムの濃度と相対活性の関係を調べた。その結果、本発明のェンド型 a— L—フコシダーゼ及ぴ本発明の硫酸化フカンスルファターゼは塩化ナトリウムにより賦活化されることが判明した。

実施例 6 力ルシゥム塩濃度の影響 2003/007838

18

本発明の硫酸化フカンスルファターゼ反応系に含まれる塩化カルシゥムの濃度と相対活性の関係を調べた。その結果、本発明の硫酸化フカンスルファタゼは塩ィ匕カルシウムにより賦活化されることが判明した。なお、酢酸カルシウムによつても同様の賦活ィヒがみられた。

実施例 7 エンド型ひ一 Lーフコシダーゼ及ぴ硫酸化フカンスルファターゼを用いた硫酸化フカンオリゴ糖の調製

参考例 2に記載のナマコ由来硫酸化フカン画分の 1 %7j溶液 3 0 μ 1に、 1 5 0 μ 1の 5 O mMイミダゾール一塩酸緩衝液 ( p H 7 . 0 ) 、 1 4 μ 1の 4 Μ塩化ナトリゥム、 6 μ 1の 1 M塩化カルシウム、 6 4 μ 1の水を混合し、本宪明のエンド型一 Lーフコシダーゼを 4 2 4 μ υ ( 1 6 μ 1 ) 及び本発明の硫酸化フカンスルファターゼを 2 2 6 μ υ ( 2 0 μ 1 ) 添加し 3 0 °Cで 2日間反応後、反応液 1 0 0 1を参考例 4に記載の方法で H P L Cにより分析した。その結果を図 8に示す。図 8の縦軸は差示屈折率の相対強度、横軸は保持時間を示す。生成した本発明の硫酸化フカンォリゴ糖は、 7分〜 1 0分の位置に分子量 9千を中心値として分布しており、明らかに実施例 3に記載のォリゴ糖よりも低分子のォリゴ糖を得ることができた。これらのオリゴ糖の糖組成、還元性末端糖分析を行つたところ、実質的に総てフコースであった。

すなわち、ナマコ由来硫酸化フ力ン画分に本発明のェンド型 α— L—フコシダーゼ及び本明の硫酸化フカンスルファターゼを作用させることにより種々の分子量の本発明の硫酸化フカンオリゴ糖が調製できることがわかった。産業上の利用の可能性

本発明によりナマコ由来硫酸化フカンの構^析ゃナマコ由来硫酸化フカンの低分子化物の再現性よい製造に用いることができる新規のェンド型ひ一 Lーフコシダーゼ及び硫酸化フカンスルファターゼが提供される。また、該酵素の製造方法についても提供される。また、該酵素を使用することにより糖鎖工学用試薬として有用な様々な分子量の、ナマコ由来硫酸化フカンオリゴ糖が提供される。また、該酵素を効率良く使用するための添加物が提供される。

Claims

請求の範囲

1 . 下記の理ィ匕学的性質を有することを特徴とするエンド型ひ一 Lーフコシダーゼ：

( I ) 作用：ナマコ由来硫酸化フカンに作用して、ひ _ L—フコシル結合を加水分解し、硫酸化フカンを低分子化させる；

( I I ) 至適 p H：本酵素の至適 p Hは 7〜 9付近である；および

( I I I ) 至適温度：本酵素の至適温度は約 2 5〜 4 5 °Cである。

2 . 請求項 1記載のェンド型ひ _ L—フコシダーゼ生産能を有するフコイダノパクター属細菌を培養する工程、およびその培養物から該酵素を採取する工程を

• 包含することを特徴とする請求項 1記載のェンド型ひ一 Lーフコシダーゼの製造方法。

3 . 下記の理化学的性質を有することを特徴とする硫酸化フカンスルフ了ターゼ：

( I ) 作用：ナマコ由来硫酸化フカンに作用して、硫酸エステル結合を加水分解し、硫酸を遊離させ、そして請求項 1記載のエンド型 α— Lーフコシダーゼと共存して、ナマコ由来硫酸化フカンの低分子化を、請求項 1記載のエンド型一 L—フコシダーゼを単独で作用させた場合よりも進行させる；

( I I ) 至適 ρ Η：本酵素の至適 ρ Ηは 6〜 8付近である；および

( I I I ) 至適温度：本酵素の至適温度は約 2 0〜 4 5 °Cである。

4. 請求項 3記載の硫酸化フカンスルファターゼ生産能を有するフコィダノバクター属細菌を培養する工程、およびその培養物から該酵素を採取する工程を包含することを特徴とする請求項 3記載の硫酸化フカンスルファターゼの製造方法。

5 . 硫酸化フカンに請求項 1記載のェンド型 _ L—フコシダーゼを作用させる工程、およぴ反応物から硫酸化フカンォリゴ糖を取得する工程を包含することを特徴とする硫酸ィ匕フカンォリゴ糖の製造方法。

6 . 塩ィヒナトリゥムの共存下でエンド型 a— L—フコシダーゼを作用させることを特徴とする請求項 5記載の硫酸化フカンオリゴ糖の製造方法。

7. 請求項 5記載の方法で得られる硫酸化フカンオリゴ糖。

8 . 硫酸化フカンに請求項 1記載のェンド型 a— Lーフコシダーゼ及び請求項 3記載の硫酸化フカンスノレフ了ターゼを作用させる工程、およぴ反応物から硫酸化フカンオリゴ糖を取得する工程を包含することを特徴とする硫酸化フカンオリゴ糖の製造方法。フコシダーゼ及び硫酸化フ力ンスルファターゼを作用させることを特徴とする請求項 8記載の硫酸ィ匕フカンオリゴ糖の製造方法。

1 0. 請求項 8記載の方法で得られる硫酸化フカンオリゴ糖。