WO2004016810A2 - Verwendung von an mrp4 bindenden substanzen zur diagnose und behandlung von krebserkrankungen - Google Patents

Verwendung von an mrp4 bindenden substanzen zur diagnose und behandlung von krebserkrankungen Download PDF

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Bernd Hinzmann
Thomas Specht
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE

Definitions

  • the invention relates to new uses of Mrp4 or sequences derived therefrom for screening for substances which bind to it, and to the use of substances which bind to rp4 for the diagnosis and / or treatment of tumor diseases.
  • Mrp4 is part of the ATP binding cassette superfar ⁇ il of the transport proteins, which use the energy of the ⁇ TP hydrolysis for their activity. According to MA Barrand et al., Gen. Pharmacol. 28: 639-645 (1997), Mrp4 is associated with changes in drug accumulation and distribution.
  • the anti-viral agent PMEA the anti-cancer agents ⁇ -mecaptopurine, 6-thioguanine and estradiol 17- ⁇ -D-glucuronide
  • the transport of these agents through Efflux through the cell membrane by means of rp4 is known (K. Lee et al. , J Natl Cancer Inst 92: 1934-1940 (2000); ZS .
  • Mrp4 was detected in normal prostate tissue and in stably transfected NIH3T3 cells both in cytoplasm a and in the membrane (K. Lee et al., J Natl Cancer Inst 92: 1934-1940 (2000)). Mrp4 is predominantly expressed in normal prostate tissues and to a lesser extent in various other normal tissues. Expression is also to be observed in various tumor cell lines (P. Borst et al., J Natl Cancer Inst 92: 1295-1302 (2000)).
  • MDR Multi-Drug Resistance
  • the invention is based on the technical problem of specifying pharmaceutical compositions for diagnosing and / or treating prostate and / or bladder and / or ovarian cancer and means for identifying them.
  • the invention is based in particular on the technical problem of identifying and treating resistant tumors.
  • the invention teaches the use of a nucleic acid coding for Mrp4 and / or a Mrp4 peptide or protein for the detection of prostate and / or bladder and / or ovarian tumors or for the detection of a risk of Disease of prostate and / or bladder and / or ovary tumors, in particular tumors with increased resistance, with a prostate or bladder or ovary tissue sample, for example in vitro, for transcription of Mrp4 RNA or for overexpression of a Mrp4 protein is examined.
  • a nucleic acid coding for Mrp4 or a detector substance that binds to Mrp4 protein or peptide, preferably containing a reporter group, can be used for the detection, whereby binding of said nucleic acid and / or said protein or peptide to the detector substance is detected semi-quantitatively or quantitatively.
  • the invention further teaches the use of a Mrp4 RNA or a Mrp4 protein or peptide for screening for substances which bind to it, in particular prospective active substances for inhibiting said RNA or said protein or peptide or prospective detector substances, with a prospective substance or a mixture of such prospective substances with said RNA or said protein or peptide is contacted, binding events being ascertained using a binding assay, and a binding prospective substance being selected, if appropriate after deconvolution.
  • the invention teaches the use of a substance which inhibits or binds to Mrp4 for producing a pharmaceutical composition for the treatment of prostate and / or bladder and / or ovary tumors, in particular for the treatment of resistant tumors.
  • the substance can be an antibody which is obtained by immunizing a non-human mammal with a Mrp4 peptide or protein with cDNA coding therefor transfected cells, with tumor cells expressing such a peptide or protein endogenously, or with recombinantly produced Mrp4 peptides or proteins, or a phage display antibody.
  • the substance can also be a mimicry compound of an antibody against a Mrp4 peptide or protein.
  • the substance can be an aptamer, an antisense RNA, or a ribozyme.
  • the substance can additionally, in particular in the case of a bispecific antibody or a mimicry compound, carry a cytotoxic and / or immunostimulating component.
  • the pharmaceutical composition can be prepared for local application in tissue containing tumor cells.
  • the invention can be used in a process for
  • a detector substance in one embodiment being applied with a reporter group to the tissue to be examined, possibly in vitro after tissue removal, the tissue to be examined then being subjected to a detection method step is which is sensitive to the reporter group, and in the case of detection of a defined minimum value of the reporter group in the tissue the tissue is qualified as, possibly resistant, containing tumor cells, and one
  • a pharmaceutical composition according to the invention is administered to a patient in a physiologically effective dose, optionally with, before or after, a different, conventional anti-cancer Active ingredient is presented in the same or different dosage forms.
  • the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising at least two components A and B, component A being a substance according to one of claims 4 to 8, component B being a (customary) anti-cancer active ingredient, components A and B being prepared alternatively can be i) as spatially separate components of a multicomponent preparation, intended for simultaneous or successive administration and galenically prepared as identical or different administration forms, or ii) as a combination preparation in the form of a spatially connected and uniform administration form.
  • the invention is based on the knowledge that Mrp4 is overexpressed in prostate and bladder and / or ovary tumors, ie the expression in said tumor tissues is higher compared to normal cells of the same tissue, and the technical teaching that can be derived therefrom that Mrp4 can be used as a target molecule in the diagnosis and therapy of these diseases, in particular in the case of intrinsic resistance or acquired or acquired resistance. Mrp4 can thus serve as a marker for the identification of tumor cells, in particular resistant tumor cells, in the said tumor tissues.
  • the inhibition of Mrp4 offers the possibility of overcoming resistances or not even allowing them to occur, especially in conjunction with conventional chemotherapy agents. In this respect, the invention can also be used to prevent the development of resistance. Because by preventing the efflux of chemotherapeutic agents given due to Inhibition of Mrp4 ensures the long-term effect of these chemotherapeutic agents in all target cells.
  • Mrp4 has substrate specificity, for example to cyclic nucleotides, purine analogs and nucleoside-based antivirals; obtaining the expression pattern for Mrp4 can therefore facilitate the selection of potentially suitable active substances or the exclusion of potentially unsuitable active substances or chemotherapeutic agents.
  • a detector substance according to the invention can be used for diagnosis in vivo to test for Mrp4 phenotype. If an overexpression of Mrp4 compared to normal tissue of the same type is found, the use of the pharmaceutical composition according to the invention is indicated.
  • the invention can be used particularly advantageously in the case of androgen-sensitive tumors or tumor cells.
  • the substance which binds to Mrp4 additionally carries a cytotoxic and / or immunostimulating component. This ultimately leads to the fact that almost exclusively tumor cells are killed, either by the cytotoxicity or by the attack by the stimulates the immune system, while normal cells are practically completely preserved in the tissue. If a cytotoxic component is used, it will be particularly recommended if the pharmaceutical composition is prepared for local application in tissue containing tumor cells, for example for injection.
  • the invention further relates to a Mrp4 protein or peptide containing a partial sequence of at least 4 amino acids from SEQ ID 10, in particular from SEQ ID 11, or containing SEQ ID 10, in particular SEQ ID 11. or consisting of such a sequence, but not a protein or peptide according to or encoded by Genbank AccNo NM_005845, AY_081219 and XM_036453.
  • the invention relates to a nucleic acid coding for such a protein or peptide, in particular a sequence according to SEQ ID 9 or a partial sequence thereof.
  • a protein or peptide according to the invention or a nucleic acid coding therefor can be used in all the contexts described above and below.
  • Mrp4 Genbank AccNo NM_005845, AY__081219 and XM_036453.
  • Mrp4 is used for all human isoforms, known or new, based on nucleic acids or amino acids. These terms also include those in the context of these terms
  • nucleic acid sequences for example immunization sequences. Also included are homologs, the Homology is at least 80%, preferably more than 90%, most preferably more than 95%. In the case of the nucleic acid sequences, complementary or allelic variants are also included.
  • sequences are included which only represent partial sequences of the explicitly disclosed sequences, for example one exon or several exons, or sequences complementary thereto, with the proviso that, in the case of the nucleic acids, these partial sequences are of sufficient length for hybridization with a nucleic acid according to the invention, have at least 30 to 50 bases and, in the case of proteins or peptides, bind to a protein- or peptide-specific target molecule with at least the same affinity.
  • all nucleic acids hybridizing with nucleic acids according to the invention are included, namely those which are under stringent conditions (5 ° C. to 25 ° C.
  • the invention also includes expression cassettes, ie one or more of the nucleic acid sequences according to the invention with at least one control or regulatory sequence.
  • Such an expression cassette can also comprise a sequence for a known protein, a fusion protein being formed in the course of the translation from a known protein and a protein or peptide according to the invention. Antisense sequences to the above nucleic acid sequences are also included.
  • RNA and correlating DNA and vice versa are included, as are genomic DNA and correlated cDNA and vice versa and RNAi.
  • the terms of Mrp4 nucleic acids or protein or peptides also include partial sequences in addition to the full lengths of the sequences mentioned (see also the preceding paragraph), with a minimum length of 12 to 30 nucleotides, for example 30 to 90 nucleotides, in the case of nucleic acids and a minimum length of 4 to 10 amino acids, for example 10 to 30 amino acids, in the case of peptides or proteins.
  • treatment also includes prophylaxis.
  • An inhibitor is a compound or substance which either inhibits the formation of Mrp4 or reduces the activity of Mrp4 formed, based on the Mrp4 activity in the absence of the inhibitor.
  • an inhibitor can be a substance that interferes with the cascade of Mrp4.
  • an inhibitor can be a substance that binds with Mrp4 formed, in such a way that further physiological interactions with endogenous substances are at least reduced.
  • Mimicry molecules are compounds that simulate the variable region, in particular the binding region of an antibody, and bind to a target molecule in the same place as the underlying antibody.
  • antibody includes polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, non-human, human and humanized antibodies, anti-idiotypic antibodies and phage display antibodies, but also chimeric antibodies as well specific fragments of the light and / or the heavy chain of the variable region of the underlying antibodies of the above type.
  • the production or production of such antibodies with predetermined immunogens is well known to the average person skilled in the art and need not be explained in more detail.
  • the term antibody also includes bispecific antibodies. Bispecific antibodies combine a defined immune cell activity with a specific tumor cell recognition, whereby tumor cells are killed. A bispecific antibody binds on the one hand to a trigger molecule of the immune effector cell (eg CD3, CD16, CD64) and on the other hand to antigens of the tumor target cell.
  • a trigger molecule of the immune effector cell eg CD3, CD16, CD64
  • Counter ions for ionic compounds are, for example, Na + , K + , Li + or cyclohexylammonium.
  • Suitable solid or liquid pharmaceutical preparation forms are, for example, granules, powders, dragees, tablets, (micro) capsules, suppositories, syrups, juices, suspensions, emulsions, drops or injectable solutions (IV, IP, IM) as well as preparations with a protracted active ingredient -Release, in the production of which conventional auxiliaries such as carriers, explosives, binders, coatings, swelling agents, lubricants or lubricants, flavoring agents, sweeteners and solubilizers are used.
  • auxiliaries such as carriers, explosives, binders, coatings, swelling agents, lubricants or lubricants, flavoring agents, sweeteners and solubilizers are used.
  • a pharmaceutical composition according to the invention can be produced by mixing at least one Mrp4 inhibitor used according to the invention in a defined dose with a pharmaceutically suitable and physiologically compatible carrier and, if appropriate, other suitable active ingredients, additives or auxiliaries with a defined inhibitor dose and preparing the desired dosage form.
  • Tumor cells overexpress Mrp4 specifically or differentially if Mrp4 is expressed in at least 10% higher amounts than normal cells of the same tissue.
  • Cytotoxic components or groups are compounds which directly or indirectly induce apoptosis or lead to necrosis or at least inhibit growth. In addition to being coupled to a substance according to the invention, these can also be used as component B. In addition to radioisotopes (for example 188Re, 213Bi, 99mTc, 90Y, 131J, 177Lu), such groups or compounds can in particular be cytostatic agents which are used in tumor therapy.
  • radioisotopes for example 188Re, 213Bi, 99mTc, 90Y, 131J, 177Lu
  • such groups or compounds can in particular be cytostatic agents which are used in tumor therapy.
  • alkylating agents for example mechlorethamine, ifosfamide, chlorambucil, cyclophosphamide, melphalan, alkylsulfonates, busulphan, nitrosoureas, carmustine, lomustine, semustin, triazenes, dacarbazine
  • antitamabolites for example folic acid antagonists, methotrexate, fluorimidiloxane, fluorimidine
  • mitosis inhibitors e.g.
  • vinca alkaloids voncristine, vinblastine, paclitaxal, docetaxel, protaxel
  • epipodophyllotoxins e.g. etoposide, teniposide
  • antibiotics e.g. Dactinomycin, daunorubicin, idarubicin, anthracycline, bleomycin, L-asparaginase
  • platinum complex compounds e.g. cisplatin
  • hormones and related compounds e.g. adrenal cortex steroids, aminogluthetimide, gestagens, estrogens, androgens, anti-estrogens, tamoxifen, tamoxifen).
  • the coupling takes place in such a way that the affinity for Mrp4 is reduced by not more than 90%, preferably 50%, based on the substance without a cytostatic group, and the cytostatic effect of the group is not reduced by more than 90%, preferably 50%, based on the compound without substance.
  • An immunostimulating component is usually a protein or an effective component thereof, which stimulates cells of the immune system.
  • cytokines such as M-CSF, GM-CSF, G-CSF, interferons such as IFN-alpha, -beta, -gamma, interleukins such as IL-1 to -16 (except -8), human LIF, Che okines such as Rantes, MCAF, MIP-1-alpha, -beta, NAP-1 and IL-8.
  • This component can also be used as a component B.
  • a reporter group is an atom, molecule or a compound which, in conjunction with an assay placed thereon, enables the detection of the reporter group and the compound or substance thus connected to the reporter group.
  • reporter groups and associated detection methods are: 32P labeling and intensity measurement using phosphoimager. Many more. Examples are known to the person skilled in the art and do not need to be listed in detail.
  • a substance that binds to Mrp4 can be a substance that binds a Mrp4 protein or a Mrp4 RNA.
  • Resistance refers to the resistance of malignant cells to chemotherapy drugs.
  • a cell is in the
  • a cell is resistant if the time to cell death is prolonged or the proliferation rate is increased compared to a non-resistant reference cell of different cell types and the same dosage.
  • Definitions expanded in the context of the above definition in relation to the narrow sense of the word also include the specific terms in the narrow sense of the word.
  • Example 2 Overexpression in prostate tumor Paired prostate tumor and normal tissues were removed by laser microdissection from 54 patients. The RNA prepared from it was amplified, labeled with digoxygenin and hybridized on a DNA chip using Affymetrix technology. The results of the analysis of the chip are shown in FIG. 1. It can be seen that in 55% of the prostate tumors (28 out of 54 patients) the expression is increased by at least a factor of 2.
  • Example 3 Overexpression in prostate and ovarian tumor.
  • FIG. 2 shows results of the expression of Mrp4 on prostate and bladder tumors and the associated normal tissues, obtained as stated above, from a cancer profiling array.
  • the Mrp4 sequence was labeled with 32P-dCTP using random hexamer priming and hybridized to the cancer profiling array. This contains 225 cDNA pairs, each pair representing tumor and normal tissue from one patient. It can be seen that Mrp4 is overexpressed in several prostate and ovarian tumors.
  • Example 4 Overexpression in prostate tumor.
  • Mrp4-specific oligonucleotide primers were generated and used for quantitative PCR (TaqMan), the first strand of cDNA coming from different tissues and cell lines, as indicated in FIG. 3. Mann first recognizes that there is significant overexpression of Mrp4 (4-9-fold) in 5 out of 15 prostate tissue pairs. No expression takes place in other normal tissues of FIG. 3. The same applies to the cell lines examined, with the exception of the androgen-sensitive tumor cell line LNCaP.
  • FIG. 4 A detailed representation of the investigations on cell lines is given in FIG. 4, with the strong expression in the prostate tumor cell line LNCaP first becoming more apparent. However, it can also be seen that expression in non-androgen-sensitive cell lines, such as, for example, PC-3 and DU-145, is comparatively low.
  • an anti-Mrp4 antibody is labeled with a marker molecule (e.g. radioisotope).
  • a marker molecule e.g. radioisotope
  • 3 10 6 Mrp4-transfected human cells or tumor cells with high endogenous Mrp4 expression, for example LNCaP cells are transplanted. After a period of time sufficient to develop metastases to a secondary site in the body, for example 30 days after the transplant, the mice become infected with labeled antibodies.
  • the control animals are treated with an irrelevant antibody. A few hours after the antibody application, the animals are sacrificed and tissue sections are made from all organs. These sections are examined for the presence of labeled anti-Mrp4 antibody.
  • the anti-Mrp4 antibodies are polyclonal antibodies against human Mrp4 protein conjugated to a carrier protein, raised in rabbits and affinity-purified with the specific immobilized peptides.
  • immunization peptides are given in Figure 6 (SEQ ID 1 to 4).
  • Cells transfected with Mrp4 cDNA, or partial sequences thereof, such as, for example, COS cells or NIH3T3 cells, can also be used as immunogens.
  • Tumor cells expressing Mrp4 endogenously are also suitable.
  • recombinantly produced Mrp4 or partial sequences thereof, which are expressed in producer cells such as E. coli or insect cells can also be used for the immunization.
  • Example 6 Immunohistochemical detection of tumor cells.
  • FIG. 5 shows various hammerhead ribozymes which cut Mrp4 at the points shown and thus inhibit or at least reduce the activity of any translation products.
  • Suitable antisense RNA sequences are, for example, 5'-UCACCUCCUGGUACACGGGCAG-3 '(Seq. ID 7) and 5'-GCAGAUGUUCGCGUCCUGCAGC-3 "(Seq. ID 8). It is also possible to construct primers by means of which RNAi probes are generated to inhibit Mrp4 by gene silencing (RNA interaction).

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Abstract

Die Erfindung betrifft Verwendungen von Mrp4 zur Diagnose und Behandlung von Prostata- und/oder Blasen- und/oder Ovartumoren, sowie zum Screenen nach Substanzen für solche Zwecke.

Description

Verwendungen von an Mrp4 bindenden Substanzen zur Diagnose und Behandlung von Krebserkrankungen.
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft neue Verwendungen von Mrp4 oder daraus abgeleiteten Sequenzen zum Screenen nach daran bindenden Substanzen, sowie die Verwendung von an rp4 bin- denden Substanzen zur Diagnose und/oder Behandlung von Tumor-Erkrankungen .
Hintergrund der Erfindung und Stand der Technik
Mrp4 gehört zu ATP-Bindungskassetten Superfarαilie der Transportproteine, welche die Energie der ΑTP Hydrolyse für ihre Aktivität nutzen. Gemäß der Literaturstelle M.A. Barrand et al., Gen. Pharmacol. 28:639-645 (1997) ist Mrp4 mit Veränderungen der Akkumulation und Verteilung von Wirkstoffen assoziiert. Im Zusammenhang mit dem antivi- ralen Wirkstoff PMEA, den Antikrebs-Wirkstoffen β-Mecaptopurin, 6-Thioguanin sowie Estradiol 17-ß-D-glucuronid ist der Transport dieser Wirkstoffe durch Efflux durch die Zellmembran vermittels rp4 bekannt (K. Lee et al., J Natl Cancer Inst 92:1934-1940 (2000); Z.S.. Chen et al., JBC 276 (36) : 33747-33754 (2001)). Mrp4 wurde in Prostata-Normalgewebe , sowie in stabil transi- fizierten NIH3T3 Zellen sowohl im Zytoplas a als auch in der Membran detektiert (K. Lee et al., J Natl Cancer Inst 92:1934-1940 (2000)). Mrp4 wird vorwiegend in Prostata- Normalgeweben und in geringerem Maße in verschiedenen anderen Normalgeweben exprimiert. Weiterhin ist Expression in diversen Tumorzelllinien zu beobachten (P. Borst et al., J Natl Cancer Inst 92:1295-1302 (2000)).
Resistenz gegen Chemotherapeutika ist ein großes und an- dauerndes Problem in der Behandlung von Krebserkrankungen. Manche bösartigen Tumore reagieren von Anfang an schlecht auf Chemotherapie und sind insofern anscheinend intrisisch resistent. Andere Tumore reagieren anfänglich gut auf eine Chemotherapie, aber entwickeln im Verlauf der Chemothera- pie offenbar eine Resistenz, was entweder auf einen Selek- tionsprozess unter den malignen Zellen oder eine zelluläre Antwort auf den Wirkstoff zurückzuführen sein dürfte. Dieses weit verbreitete Phänomen wird MDR (Multi-Drug Resistance) genannt.
Technisches Problem der Erfindung
Der Erfindung liegt das technische Problem zugrunde, phar- mazeutische Zusammensetzungen zur Diagnose und/oder zur Behandlung von Prostata- und/oder Blasen- und/oder Ovar- krebs anzugeben sowie Mittel zu deren Identifizierung. Der Erfindung liegt insbesondere das technische Problem zu Grunde, resistente Tumore zu identifizieren und zu behandeln.
Grundzüge der Erfindung und bevorzugte Ausführungsformen.
Die Erfindung lehrt die Verwendung einer für Mrp4 codierenden Nukleinsäure und/oder eines Mrp4 Peptids oder Proteins zur Detektion von Prostata- und/oder Blasen- und/oder Ovartumoren oder zur Detektion eines Risikos der Erkrankung an Prostata- und/oder Blasen- und/oder Ovartu- moren, insbesondere von Tumoren mit einer erhöhten Resistenz, wobei eine Prostata- oder Blasen- oder Ovar-Gewebeprobe, beispielsweise in vitro, auf Übertran- skription von Mrp4 RNA oder auf Überexpression eines Mrp4 Proteins untersucht wird. Eine an für Mrp4 codierende Nukleinsäure oder eine an Mrp4 Protein oder Peptid bindende Detektorsubstanz, vorzugsweise enthaltend eine Reportergruppe, kann zur Detektion verwendet werden, wobei Bindung besagter Nukleinsäure und/oder besagten Proteins oder Pep- tids an die Detektorsubstanz halbquantitativ oder quantitativ detektiert wird.
Die Erfindung lehrt weiterhin die Verwendung einer Mrp4 RNA oder eines Mrp4 Proteins oder Peptids zum Screenen nach daran bindenden Substanzen, insbesondere prospektiven Wirkstoffen zur Inhibierung von besagter RNA oder besagtem Protein oder Peptid oder prospektiven Detektorsubstanzen, wobei eine prospektive Substanz oder eine Mischung solcher prospektiver Substanzen mit besagter RNA oder besagtem Protein oder Peptid kontaktiert wird, wobei mit einem Bindungsassay Bindungsereignisse festgestellt werden, und wobei eine bindende prospektive Substanz, ggf. nach Dekon- volutierung, selektiert wird.
Die Erfindung lehrt schließlich die Verwendung einer Mrp4 inhibierenden oder daran bindenden Substanz zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Prostata- und/oder Blasen- und/oder Ovartumoren, insbesondere zur Behandlung resistenter Tumore. Die Substanz kann ein Antikörper sein, welcher durch Immunisierung eines nicht-menschlichen Säugetiers mit einem Mrp4 Peptid oder Protein, mit hierfür codierender cDNA transfizierte Zellen, mit endogen ein solches Peptid oder Protein exprimierenden Tumorzellen, oder mit reko binant hergestellten Mrp4 Peptiden oder Proteinen, erhältlich ist, oder ein Phage-Display-Antikörper sein. Die Substanz kann aber auch eine Mimikry erbindung eines Antikörpers gegen ein Mrp4 Peptid oder Protein sein. Die Substanz kann schließlich ein Aptamer, eine antisense RNA, oder ein Ri- bozym sein. Die Substanz kann zusätzlich, insbesondere im Falle eines bispezifischen Antikörpers oder einer Mimikry- Verbindung hierzu, eine zytotoxische und/oder immunstimulierende Komponente tragen. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann zur lokalen Applikation in Tumorzellen enthaltendem Gewebe hergerichtet sein.
Die Erfindung läßt sich im Rahmen eines Verfahrens zur
Diagnose einer Prostata- und/oder Blasen- und/oder Ovartu- morerkrankung verwenden, wobei eine Detektorsubstanz in einer Ausführungsform mit einer Reportergruppe in zu untersuchendes Gewebe, ggf. in vitro nach Gewebeentnahme, appliziert wird, wobei das zu untersuchende Gewebe dann einer Detektionsverfahrenstufe unterworfen wird, welche sensitiv für die Reportergruppe ist, und wobei im Fall der Detektion eines definierten Mindestwertes der Reportergruppe im Gewebe das Gewebe als, ggf. resistente, Tu- morzellen enthaltend qualifiziert wird, sowie eines
Verfahrens zur Behandlung einer Prostata- und/oder Blasen- und/oder Ovartumorerkrankung, insbesondere resistenter Tumore, wobei eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung in einer physiologisch wirksamen Dosis einem Patienten dargereicht wird, wobei optional gleichzeitig, davor, oder danach ein hiervon verschiedener, üblicher Antikrebs-Wirkstoff in gleicher oder verschiedener Darreichungsform dargereicht wird. Die Erfindung betrifft schließlich eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend zumindest zwei Komponenten A und B, wobei Komponente A eine Substanz nach einem der Ansprüche 4 bis 8 ist, wobei die Komponente B ein (üblicher) Antikrebs-Wirkstoff ist, wobei die Komponenten A und B alternativ hergerichtet sein können i) als räumlich separate Komponenten eines Mehrkomponentenpräparates, bestimmt zur gleichzeitigen oder aufeinanderfolgenden Darreichung und galenisch hergerichtet als gleiche oder verschiedene Darreichungsformen, oder ii) als Kombinationspräparat in Form einer räumlich verbundenen und einheitlichen Darreichungsform.
Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß Mrp4 überex- primiert ist in Prostata- und Blasen- und/oder Ovartu- moren, i.e. in besagten Tumorgeweben ist die Expression höher, verglichen mit normalen Zellen gleichen Gewebes, und der daraus herleitbaren technische Lehre, daß Mrp4 als Zielmolekül bei der Diagnostik und Therapie dieser Erkrankungen, insbesondere im Falle intrinsischer Resistenzen oder erworbenen oder erwerbbaren Resistenzen, eingesetzt werden kann. Mrp4 kann also als Marker zur Identifizierung von Tumorzellen, insbesondere von resis- tenten Tumorzellen, in den besagten Tumorgeweben dienen. Auf der anderen Seite bietet die Inhibierung von Mrp4 die Möglichkeit, insbesondere auch in Verbindung mit üblichen Wirkstoffen der Chemotherapie, Resistenzen zu überwinden oder erst gar nicht auftreten zu lassen. Insofern kann die Erfindung auch zur Prävention einer Entwicklung einer Resistenz genutzt werden. Denn durch Verhinderung des Ef- fluxes verabreichter Chemotherapeutika aufgrund der Inhibierung des Mrp4 ist die anhaltende Wirkung dieser Chemotherapeutika in allen Zielzellen sichergestellt.
Im Rahmen der Erfindung kann es sich empfehlen, im Vorfeld einer Behandlung mit einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung eine Probe aus einem Gewebe, welches als Tumorgewebe mit anderen Methoden identifiziert ist,, zu entnehmen und die Gewebeprobe auf Expression bzw. Überexpression von Mrp4 zu untersuchen. In diesem Zusam- menhang ist von besonderer Bedeutung, daß Mrp4 Substrat- spezifität aufweist, beispielsweise zu zyklischen Nukleotiden, Purinanalogen und nukleosidbasierten antivi- rale Wirkstoffen; der Erhalt des Expressionsmusters zu Mrp4 kann also die Auswahl potentiell geeigneter Wirkstoffe bzw. den Ausschluss potentiell ungeeigneter Wirkstoffe bzw. Chemotherapeutika erleichtern. Alternativ kann mit einer erfindungsgemäßen Detektorsubstanz zur Diagnose in vivo auf Mrp4 Phänotyp getestet werden. Wird eine Überexpression von Mrp4 gegenüber Normalgewebe gleichen Typs festgestellt, so ist die Anwendung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung indiziert.
Von eigenständiger Bedeutung im Rahmen der Erfindung ist, daß die Erfindung besonders vorteilhaft im Falle androgen- sensitiver Tumore bzw. Tumorzellen einsetzbar ist.
Im Falle bispezifischer an Mrp4 bindender Substanzen ist es bevorzugt, wenn die an Mrp4 bindende Substanz zusätzlich eine zytotoxische und/oder immunstimulierende Komponente trägt. Dies führt dann letztendlich dazu, dass praktisch ausschließlich Tumorzellen getötet werden, sei es durch die Zytotoxizität, sei es durch Angriff durch das stimulierte Immunsystem, während Normalzellen in dem Gewebe praktisch vollständig erhalten bleiben. Im Falle des Einsatzes einer zytotoxischen Komponente wird es sich besonders empfehlen, wenn die pharmazeutische Zusammen- setzung zur lokalen Applikation in Tumorzellen enthaltendem Gewebe hergerichtet ist, beispielsweise zur Injektion.
Die Erfindung betrifft des weiteren ein Mrp4 Protein oder Peptid enthaltend eine Teilsequenz von zumindest 4 A i- nosäuren aus Seq.-ID 10, insbesondere aus Seq.-ID 11, oder enthaltend Seq.-ID 10, insbesondere Seq.-ID 11, oder bestehend aus einer solchen Sequenz, nicht jedoch ein Protein oder Peptid gemäß oder codiert durch Genbank AccNo NM_005845, AY_081219 und XM_036453. Die Erfindung betrifft schließlich eine für ein solches Protein oder Peptid codierende Nukleinsäure, insbesondere eine Sequenz gemäß Seq.-ID 9 oder eine Teilsequenz hieraus. Ein erfindungsgemäßes Protein bzw. Peptid bzw. eine hierfür codierende Nukleinsäure läßt sich in allen vorstehend und folgend beschriebenen Zusammenhängen einsetzen.
Definitionen.
Für Mrp4 sind die folgenden Sequenzen bekannt: Genbank AccNo NM_005845, AY__081219 und XM_036453.
Im Rahmen dieser Beschreibung wird die Bezeichnung Mrp4 für alle humanen Isoformen, bekannt oder neu, auf Nukleinsäuren- oder Aminosäurenbasis, verwendet. Mit diesen Be- griffen mit umfaßt sind auch die im Rahmen dieser
Beschreibung offenbarten kurzen Sequenzen, welche aus den Isoformen stammen, beispielsweise Immunisierungssequenzen. Weiterhin mit umfaßt sind auch Homologe, wobei die Homologie zumindest 80%, vorzugsweise mehr als 90%, höchstvorzugsweise mehr als 95%, beträgt. Im Falle der Nukleinsäuresequenzen sind auch komplementäre oder al- lelische Varianten mit umfaßt. Weiterhin sind Sequenzen umfaßt, welche lediglich Teilsequenzen der explizit offenbarten Sequenzen, beispielsweise ein Exon oder mehrere Exons, oder komplementärer Sequenzen hierzu darstellen, mit der Maßgabe, daß diese Teilsequenzen im Falle der Nukleinsäuren eine für eine Hybridisierung mit einer er- findungsgemäßen Nukleinsäure hinreichende Länge, zumindest 30 bis 50 Basen, aufweisen und im Falle der Proteine bzw. Peptide mit zumindest gleicher Affinität an ein protein- oder peptidspezifisches Zielmolekül binden. Weiterhin sind alle mit erfindungsgemäßen Nukleinsäuren hybridisierende Nukleinsäuren umfaßt, nämlich solche, die unter stringen- ten Bedingungen (5°C bis 25°C unterhalb der AufSchmelztemperatur; siehe ergänzend J.M. Sambrook et al., A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) und E.M. Southern, J Mol Biol, 98:503ff (1975)) hybridisieren. Es versteht sich, daß die Erfindung auch Expressionskassetten umfaßt, i.e. eine oder mehrere der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen mit mindestens einer Kontroll- oder regulatorischen Sequenz. Eine solche Expressionskassette kann auch eine Sequenz für ein bekanntes Protein umfassen, wobei im Zuge der Translation ein Fusionsprotein aus einem bekannten Protein und einem erfindungsgemäßen Protein oder Peptid entsteht. Ebenso sind auch antisense Sequenzen zu den vorstehenden Nukleinsäuresequenzen umfaßt. Schließlich sind RNA sowie damit korrelierende DNA und umgekehrt umfaßt, ebenso wie genomische DNA als auch korrelierte cDNA und umgekehrt und RNAi. Im Zusammenhang mit erfindungsgemäßen Verwendungen umfassen die Begriffe der Mrp4 Nukleinsäuren oder Protein bzw. Peptide neben den Volllängen der angesprochenen Sequenzen (siehe auch vorstehender Absatz) auch Teilsequenzen hi- eraus, und zwar mit einer Mindestlänge von 12 bis 30 Nuk- leotiden, beispielsweise 30 bis 90 Nukleotiden, im Falle der Nukleinsäuren und einer Mindestlänge von 4 bis 10 Aminosäuren, beispielsweise 10 bis 30 Aminosäuren, im Falle der Peptide oder Proteine.
Der Begriff der Behandlung umfaßt auch die Prophylaxe.
Als Inhibitor ist eine Verbindung oder Substanz bezeichnet, welche entweder die Bildung von Mrp4 inhibiert oder gebildetes Mrp4 in der Aktivität reduziert, bezogen auf die Mrp4 Aktivität in Abwesenheit des Inhibitors. Insofern kann ein Inhibitor einerseits eine Substanz sein, welche in der Entstehungskaskade von Mrp4 inhibierend eingreift. Auf der anderen Seite kann ein Inhibitor eine Substanz sein, welche mit gebildetem Mrp4 eine Bindung eingeht, und zwar dergestalt, dass weitere physiologische Wechselwirkungen mit endogenen Substanzen zumindest reduziert sind.
Mimikry-Moleküle sind Verbindungen, die den variablen Bereich, insbesondere den Bindungsbereich eines Antikörpers, nachbilden und an gleicher Stelle eines Zielmoleküls binden, wie der zu Grunde liegende Antikörper.
Der Begriff der Antikörper umfaßt polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper, nicht-humane, humane und humanisierte Antikörper, antiidiotypische Antikörper sowie Phage- Display-Antikörper, aber auch chimäre Antikörper sowie spezifische Fragmente der leichten und/oder der schweren Kette des variablen Bereiches zu Grunde liegender Antikörper vorstehender Art. Die Herstellung bzw. Gewinnung solcher Antikörper mit vorgegebenen Immunogenen ist dem Durchschnittsfachmann wohl vertraut und braucht nicht näher erläutert zu werden. Weiterhin umfaßt der Begriff der Antikörper bispezifische Antikörper. Bispezifische Antikörper kombinieren eine definierte Immunzellaktivität mit einer spezifischen Tumorzellerkennung, wodurch Tu- morzellen getötet werden. Ein bispezifischer Antikörper bindet einerseits an ein Auslösemolekül der Immun- Ef ektorzelle (z.B. CD3, CD16, CD64) und andererseits an Antigene der Tumorzielzelle.
Die galenische Herrichtung einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung kann in fachüblicher Weise erfolgen, und zwar sowohl zur systemischen als auch zur lokalen Verabreichung. Als Gegenionen für ionische Verbindungen kommen beispielsweise Na+, K+, Li+ oder Cyclohexylammonium infrage. Geeigente feste oder flüssige galenische Zubereitungsformen sind beispielsweise Granulate, Pulver, Dragees, Tabletten, (Mikro-) Kapseln, Sup- positorien, Sirupe, Säfte, Suspensionen, Emulsionen, Tropfen oder injizierbare Lösungen (i.V., i.p., i.m.) sowie Präparate mit protrahierter Wirkstoff-Freigabe, bei deren Herstellung übliche Hilfsmittel wie Trägerstoffe, Spreng-, Binde-, Überzugs-, Quellungs-, Gleit- oder Schmiermittel, Geschmacksstoffe, Süßungsmittel und Lösungsvermittler, Verwendung finden. Als Hilfsstoffe sei Magnesiumcarbonat, Titandioxyd, Lactose, Mannit und andere Zucker, Talcum, Milcheiweiß, Gelatine, Stärke, Zellulose und ihre Derivate, tierische und pflanzliche Öle wie Lebertran, Sonnenblumen-, Erdnuss- oder Sesamöl, Polyethylenglycole und Lösungsmittel, wie etwa steriles Wasser und ein- oder mehrwertige Alkohole, beispielsweise Glycerin, genannt. Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung ist dadurch herstellbar, dass mindestens ein erfindungsgemäß verwendeter Mrp4 Inhibitor in definierter Dosis mit einem pharmazeutisch geeigneten und physiologisch verträglichen Träger und ggf. weiteren geeigneten Wirk-, Zusatz- oder Hilfsstoffen mit definierter Inhibitordosis gemischt und zu der gewünschten Darreichungsform hergerichtet ist.
Tumorzellen überexprimieren Mrp4 spezifisch bzw. differen- ziell, wenn Mrp4 im Vergleich zu Normalzellen des gleichen Gewebes in zumindest 10% höherer Menge exprimiert wird.
Zytotoxische Komponenten bzw. Gruppen sind Verbindungen, welche direkt oder indirekt Apoptose einleiten bzw. zu Nekrose führen oder zumindest wachstumshemmend wirken. Diese können außer an eine erfindungsgemäße Substanz gekoppelt auch als Komponente B eingesetzt werden. Solche Gruppen bzw. Verbindungen können neben Radioisotopen (z.B. 188Re, 213Bi, 99mTc, 90Y, 131J, 177Lu) insbesondere Zyto- statika sein, welche in der Tumortherapie eingesetzt werden. Beispiele hierfür sind: Alkylantien (z.B. Mechlorethamin, Ifosfamid, Chlorambucil, Cyclophosphamid, Melphalan, Alkylsulfonate, Busulphan, Nitrosoharnstoffe, Carmustin, Lomustin, Semustin, Triazene, Dacarbazin) , An- timetaboliten (z.B. Folsäure-Antagonisten, Methotrexat, Pyrimidin-Analoga, Fluoruracil, Fluordesoxyuridin, Cyta- rabin, Gemcitabin, Purin-Analoga, Mercaptopurin) , Mitosehemmer (z.B. Vincaalkaloide, Voncristin, Vinblastin, Paclitaxal, Docetaxel, Protaxel) , Epipodophyllotoxine (z.B. Etoposid, Teniposid) , Antibiotika (z.B. Dactinomycin, Daunorubicin, Idarubicin, Anthracycline, Bleomycin, L-Asparaginase) , Platinkomplexverbindungen (z.B. Cisplatin) , Hormone und verwandte Verbindungen (z.B. Nebennierenrindensteroide, Aminogluthetimid, Gestagene, Östrogene, Androgene, Antiöstrogene, Tamoxifen, Sterio- danaloga, Flutamid) . Bei Bindung einer solchen Verbindung mit einer an Mrp4 bindenden Substanz erfolgt die Kopplung dergestalt, daß die Affinität zu Mrp4 um nicht mehr als 90%, vorzugsweise 50%, bezogen auf die Substanz ohne zyto- statische Gruppe, reduziert ist und die zytostatische Wirkung der Gruppe um nicht mehr als 90%, vorzugsweise 50%, bezogen auf die Verbindung ohne Substanz, reduziert ist.
Eine immunstimulierende Komponente ist meist ein Protein oder ein wirksamer Bestandteil hiervon, welches Zellen des Immunsystems stimuliert. Beispiele hierfür sind: Zytokine, wie M-CSF, GM-CSF, G-CSF, Interferone, wie IFN-alpha, -beta, -gamma, Interleukine wie IL-1 bis -16 (außer -8), human LIF, Che okine wie Rantes, MCAF, MIP-1-alpha, -beta, NAP-1 und IL-8. Diese Komponente kann auch als eine Komponente B eingesetzt werden.
Eine Reportergruppe ist ein Atom, Molekül oder eine Ver- bindung, welche in Verbindung mit einem hierauf abgestellten Assay den Nachweis der Reportergruppe und der somit mit der Reportergruppe verbundenen Verbindung oder Substanz ermöglicht. Beispiele für Reportergruppen und hiermit assoziierte Detektionsmethoden sind: 32P-Labeling und Intensitätsmessung mittels Phosphoimager. Viele weitere. Beispiele sind dem Durchschnittsfachmann bekannt und bedürfen nicht der detaillierten Aufzählung. Eine an Mrp4 bindende Substanz kann eine Substanz sein, welche ein Mrp4 Protein oder eine Mrp4 RNA bindet.
Resistenz bezeichnet die Widerstandsfähigkeit von malignen Zellen gegenüber Chemotherapeutika. Eine Zelle ist im
Falle einer erwerbbaren Resistenz resistent, wenn die Zeit bis zum Zelltod verlängert ist gegenüber einer Referenzzelle gleichen Zelltyps bzw. gleicher Zellline und gleicher Dosierung oder wenn die Proliferationsrate der resistenten Zelle unter gleichen Bedingungen erhöht ist gegenüber jener der Referenzzelle. Eine Zelle ist im Falle einer initialen Resistenz resistent, wenn die Zeit bis zum Zelltod verlängert oder die Proliferationsrate erhöht ist gegenüber einer nichtresistenten Referenzzelle ver- schiedenen Zelltyps und gleicher Dosierung.
Im Rahmen der vorstehenden Definition gegenüber dem engen Wortsinn erweiterte Begriffsbestimmungen umfassen auch die bestimmten Begriffe im engen Wortsinn.
Beispiele.
Im Folgenden wird die Erfindung anhand von lediglich bevorzugte Ausführungsformen darstellenden Beispielen und Figuren näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1: Chipanalyse zur differenziellen Expression von Mrp4 in Protatatumorgeweben aus Patienten, Fig. 2: Cancer Profiling Array zur differenziellen Expression von Mrp4 in Protata- und Ovartumorgeweben aus Patienten,
Fig. 3: Mrp4 TaqMan in Prostatatumor- und Protatanormal- geweben aus gleichen Patienten,
Fig. 4: Mrp4 TaqMan in verschiedenen humanen Tumorzelllinien,
Fig. 5: verschiedene Hammerhead Ribozyme, welche Mrp4 RNA schneiden,
Fig. 6: Immunisierungspeptide,
Fig. 7: eine Mrp4 codierende Nukleinsäure (Seq.-ID 9), und
Fig. 8: ein Mrp4 Protein bzw. Peptid (Seq.-ID 10), wobei die markierte Teilsequenz (Seq.-ID 11) von selbstständiger Bedeutung ist.
Beispiel 1:
Es wurden electronic Northern gemäß der Literaturstelle DE 198 11 194 AI angefertigt, wobei die in den Sequenzprotokollen angegebene assemblierte Sequenz aus ESTs bzw. Con- tigs eingesetzt wurde (ok_582) . Eine Überexpression in Tumorgewebe mit einer Signifikanz von > 0,90 wurde für Prostata- und Blasengewebe gefunden.
Beispiel 2: Überexpression in Prostatatumor Gepaartes Prostatatumor- und Normalgewebe wurde im Wege der Lasermikrodissektion von 54 Patienten entnommen. Die daraus präparierte RNA wurde amplifiziert, mit Digoxygenin gelabelt und auf einen DNA Chip mit Hilfe der Affymetrix Technologie hybridisiert. Die Ergebnisse der Analyse des Chips sind in der Figur 1 dargestellt. Man erkennt, daß in 55% der Prostatatumoren (28 aus 54 Patienten) die Expression um zumindest den Faktor 2 erhöht ist.
Beispiel 3: Überexpression in Prostata- und Ovartumor.
Figur 2 zeigt Ergebnisse der Expression von Mrp4 auf Prostata- und Blasentumoren und den dazugehörenden Normalgeweben, erhalten wie oben angegeben, aus einem Cancer Profiling Array. Hierfür wurde die Mrp4 Sequenz mit 32P-dCTP gelabelt mittels random hexamer priming und an das, Cancer Profiling Array hybridisiert. Dieses enthält 225 cDNA Paare, wobei jedes Paar Tumor- und Normalgewebe von einem Patienten repräsentiert. Man erkennt, daß in mehreren Prostata- und Ovartumoren Mrp4 überexprimiert wird.
Beispiel 4: Überexpression in Prostatatumor.
Mrp4-spezifische Oligonukleotidprimer wurden generiert und für eine quantitative PCR (TaqMan) verwendet, wobei die erster Strang cDNA aus verschiedenen Geweben und Zelllinien, wie in der Figur 3 angegeben, stammte. Mann erkennt zunächst, daß eine signifikante Überexpression von Mrp4 (4-9-fach) in 5 von 15 Prostatgewebepaaren erfolgt. In anderen Normalgeweben der Figur 3 erfolgt keine Expression. Gleiches gilt für die untersuchten Zelllinien, mit Ausnahme der Androgen-sensitiven Tumorzelllinie LNCaP.
Eine detaillierte Darstellung der Untersuchungen an Zelllinien ist in der Figur 4 gegeben, wobei zunächst die starke Expression in der Prostata-Tumorzelllinie LNCaP deutlicher hervortritt. Es ist aber auch erkennbar, daß eine Expression in nicht Androgen-sensitiven Zelllinien, wie beispielsweise PC-3 und DU-145 vergleichsweise niedrig ist.
Beispiel 5: Nachweis von Mrp4 mittels Antikörpern
In diesem Beispiel wird die Markierung eines Tumors bzw. seiner Metastasen durch einen anti-Mrp4-Antikörper in vivo (Mausmodell) beschrieben. Ein anti-Mrp4-Antikörper wird mit einem Markermolekül (z. B. Radioisotop) markiert. In NMRI-Nacktmäuse werden 3 106 Mrp4-transfizierte humane Zellen oder Tumorzellen mit hoher endogener Mrp4 Expression, beispielsweise LNCaP Zellen, transplantiert . Nach einem Zeitraum, der ausreicht, um Metastasen an einer sekundären Stelle des Körpers zu entwickeln, beispielsweise 30 Tage nach der Transplantation, wird den Mäusen markierter Antikörper infiziert. Die Kontrolltiere werden mit einem nicht relevanten Antikörper behandelt. Wenige Stunden nach der Antikörperapplikation werden die Tiere getötet und aus allen Organen Gewebeschnitte angefertigt. Diese Schnitte werden auf die Gegenwart von markiertem anti-Mrp4 Antikörper untersucht.
Bei den anti-Mrp4 Antikörpern handelt es sich um polyklonale Antikörper gegen humanes Mrp4 Protein, konjugiert mit einem Trägerprotein, in Kaninchen gezogen und mit den spezifischen immobilisierten Peptiden affinitätsgereinigt .
Beispiele für Immunisierungspeptide sind in Figur 6 (Seq.-ID 1 bis 4) angegeben. Als Immunogene können ebenso mit cDNA von Mrp4, oder Teilsequenzen hiervon trans- fizierte Zellen, wie beispielsweise COS-Zellen oder NIH3T3-Zellen, eingesetzt werden. Ebenso sind Tumorzellen, die endogen Mrp4 exprimieren, geeignet. Weiterhin kann auch rekombinant hergestelltes Mrp4 bzw. Teilsequenzen hieraus, die in Producerzellen, wie E. coli oder Insektenzellen exprimiert werden, zur Immunisierung eingesetzt werden.
Beispiel 6: Immunhistochemischer Nachweis von Tumorzellen.
Primäre Tumoren werden aus den Patienten mit Prostata-, Blasen- und/oder Ovartumoren isoliert und als Paraffin bzw. Gefrierschnitte präpariert. Diese Schnitte werden mit einem anti-Mrp4-Antikörper auf die Überexpression von Mrp4 in Tumorzellen untersucht. Die immunhistologische Untersuchung mit dem Mrp4-Antikörper zeigt höhere Expression von Mrp4 in den Tumorzellen im Vergleich zu umliegenden Normalgewebe. Die Untersuchung erfolgt im Einzelnen durch Inkubation mit dem anti-Mrp4 Antikörper als primärem Antikörper, einem biotinyliertem sekundären anti-Kaninchen Antikörper und einer Streptavidin-gekoppelten Meerret- tichperoxidase. Die Färbung erfolgt mit DAB als chromo- genen Substrat (braune Färbung) . Die Gegenfärbung erfolgt mit Hemalaun-Lösung (blaue Färbung) . Es sind maligne und nichtmaligne Zellen unterscheidbar, wobei die malignen Zellen eine starke Färbung, i.e. hohen Mrp4 Gehalt, aufweisen, während die nichtmalignen Zellen nur moderat gefärbt sind.
Beispiel 7: RNA-Inhibitoren
In der Figur 5 (Seq.-ID 5 und 6) sind verschiedene Hammerhead Ribozyme dargestellt, die Mrp4 an den dargestellten Stellen schneiden und so die Aktivität eventueller Trans- lationsprodukte inhibieren oder zumindest reduzieren. Geeignete antisense RNA Sequenzen sind beispielsweise 5'-UCACCUCCUGGUACACGGGCAG-3' (Seq.-ID 7) und 5'-GCAGAUGUUCGCGUCCUGCAGC-3" (Seq.-ID 8). Es ist auch möglich durch Konstruktion von Primern, mittels welcher RNAi Sonden generiert werden, Mrp4 zu inhibieren im Wege des Gen Silencing (RNA Wechselwirkung) .

Claims

Patentansprüche :
1. Verwendung einer für Mrp4 codierenden Nukleinsäure und/oder eines Mrp4 Peptids oder Proteins zur Detektion von Prostata- und/oder Blasen- und/oder Ovartumoren, oder zur Detektion eines Risikos der Erkrankung an Prostata- und/oder Blasen- und/oder Ovartumoren, insbesondere von Tumoren mit einer erhöhten Resistenz, wobei eine Prostata- oder Blasen- oder Ovar-Gewebeprobe auf Übertranskription von Mrp4 RNA oder auf Überexpression eines Mrp4 Proteins untersucht wird.
2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei eine an für Mrp4 codierende Nukleinsäure oder eine an Mrp4 Protein oder Peptid bindende Detektorsubstanz, vorzugsweise enthaltend eine Reportergruppe, verwendet wird, wobei Bindung besagter Nukleinsäure und/oder besagten Proteins oder Peptids an die Detektorsubstanz halbquantitativ oder quantitativ detektiert wird.
3. Verwendung einer Mrp4 RNA oder eines Mrp4 Proteins oder Peptids zum Screenen nach daran bindenden Substanzen, insbesondere prospektiven Wirkstoffen zur Inhibierung von besagter RNA oder besagtem Protein oder Peptid oder prospektiven Detektorsubstanzen, wobei eine prospektive Substanz oder eine Mischung solcher prospektiver Sub- stanzen mit besagter RNA oder besagtem Protein oder Peptid kontaktiert wird, wobei mit einem Bindungsassay Bindungsereignisse festgestellt werden, und wobei eine bindende prospektive Substanz, ggf. nach Dekonvolu- tierung, selektiert wird.
4. Verwendung einer Mrp4 inhibierenden oder daran bindenden Substanz zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Prostata- und/oder Blasen- und/oder Ovartumoren, insbesondere zur Behandlung resistenter Tumoren.
5. Verwendung nach Anspruch 4, wobei die Substanz ein Antikörper ist, welcher durch Immunisierung eines nichtmenschlichen Säugetiers mit einem Mrp4 Peptid oder Pro- tein, oder einer hierfür codierenden cDNA, erhältlich ist, oder ein Phage-Display Antikörper ist.
6. Verwendung nach Anspruch 4, wobei die Substanz eine Mimikriverbindung eines Antikörpers gegen ein Mrp4 Peptid oder Protein ist.
7. Verwendung nach Anspruch 4, wobei die Substanz, ein Aptamer, eine antisense RNA, oder ein Ribozym ist.
8. Verwendung nach einem der Ansprüche 4 bis 7, wobei die Substanz zusätzlich eine zytotoxische und/oder i mun- stimulierende Komponente trägt.
9. Verwendung nach einem der Ansprüche 4 bis 8, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung zur lokalen Applikation in Tumorzellen enthaltendem Gewebe hergerichtet ist.
10. Verfahren zur Diagnose einer Prostata- und/oder
Blasen- und/oder Ovartumorerkrankung, insbesondere zur Diagnose resistenter Tumoren, wobei eine Detektorsubstanz in einer Ausführungsform mit einer Reporter- gruppe in zu untersuchendes Gewebe appliziert wird, wobei das zu untersuchende Gewebe dann einer Detek- tionsverfahrenstufe unterworfen wird, welche sensitiv für die Reportergruppe ist, und wobei im Fall der Detektion eines definierten Mindestwertes der Reporter- gruppe im Gewebe das Gewebe als, ggf. resistente, Tumorzellen enthaltend qualifiziert wird.
11. Verfahren zur Behandlung einer Prostata- und/oder Blasen- und/oder Ovartumorerkrankung, insbesondere resistenter Tumoren, wobei eine pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 4 bis 9 in einer physiologisch wirksamen Dosis einem Patienten dargereicht wird, wobei optional gleichzeitig, davor, oder danach ein hiervon verschiedener Antikrebs- Wirkstoff in gleicher oder verschiedener Darreichungsform dargereicht wird.
12. Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend zumindest zwei Komponenten A und B, wobei Komponente A eine Substanz nach einem der Ansprüche 4 bis 8 ist, wobei die Komponente B eine Antikrebs-Wirkstoff ist, wobei die Komponenten A und B alternativ hergerichtet sein können i) als räumlich separate Komponenten eines Mehrkomponentenpräparates, bestimmt zur gleichzeitigen oder aufeinanderfolgenden Darreichung und galenisch hergerichtet als gleiche oder verschiedene Darreichungsformen, oder ii) als Kombinationspräparat in Form einer räumlich verbundenen und einheitlichen Darreichungsform.
13. Ein Mrp4 Protein oder Peptid enthaltend eine Teilsequenz von zumindest 4 Aminosäuren aus Seq.-ID 10, insbesondere aus Seq.-ID 11, oder enthaltend Seq.-ID 10, insbesondere Seq.-ID 11, oder bestehend aus einer sol- chen Sequenz, nicht jedoch ein Protein oder Peptid gemäß oder codiert durch Genbank AccNo NM_005845, AY_081219 und XM_036453 und nicht Seq.-ID 1 gemäß WO0058471.
14. Eine für ein Protein oder Peptid nach Anspruch 13 codierende Mrp4 Nukleinsäure, insbesondere enthaltend eine Teilsequenz von zumindest 12 Nukleotiden aus Seq.-ID 9.
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