WO2004024944A2 - Procede et sequences nucleotidiques pour la detection et l'identification de microorganismes dans un melange complexe ou dans l’eau - Google Patents

Procede et sequences nucleotidiques pour la detection et l'identification de microorganismes dans un melange complexe ou dans l’eau Download PDF

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Gabriel Festoc
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    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Definitions

  • the present invention relates to the field of the analysis of the contamination of samples of agro-food origin or from the environment for example.
  • the "analysis" of such samples means the detection, identification and, where appropriate, the quantification of the microorganisms which they contain.
  • the invention is part of the improvement of procedures and the development of effective means for the detection, identification and, where appropriate, quantification of microorganisms contained in complex samples.
  • the invention aims to provide a method implementing molecular biology techniques, as well as related tools, suitable for the qualitative and / or quantitative determination of the bacterial content of complex mixtures, in particular food samples.
  • a “complex mixture” designates, within the meaning of the present invention, any composition containing in particular bacteria cells, said composition possibly being of heterogeneous nature, such as a raw food sample, unmodified by drying for example, which brings together several different constituents including some are in the liquid state and others are solid, or more homogeneous in nature, such as a bacterial culture.
  • the present invention relates to a method for the detection, identification and, where appropriate, the quantification of bacteria contained in a complex mixture or in an aqueous medium, said method comprising a step of multiple amplifications, simultaneous but spatially separated , target nucleic acid sequences.
  • the invention further relates to pairs of primers for amplification useful for the implementation of said method, as well as nucleotide probes for the detection and, where appropriate, the quantification of nucleic acid sequences of bacteria contained in a complex mixture or in an aqueous medium.
  • the nucleotide probes can be associated with primer pairs for amplification, for the purposes of real-time amplification of target nucleic acid sequences.
  • the nucleotide probes can also be used for the detection of target sequences according to DNA-DNA hybridization techniques.
  • the present invention finally relates to molecular biology tools, namely an analysis kit and microarrays or nucleic acid chips for the detection and identification of bacteria contained in a complex mixture or in an aqueous medium.
  • Prokaryotic bacteria or microorganisms are remarkable for the heterogeneity of their characteristics, in particular in terms of form (bacilli, shells, etc.); habitat (soil, water, living hosts ...); structure of cell envelopes (possible presence of a wall, composition of said wall, possible presence of an external membrane); saprophytic, commensal or parasitic diet; host spectrum in the case of commensals and parasites; pathogenicity profile and possible antibiotic resistance characteristics characteristic of certain parasites; ability to transfer nucleic acid sequences within the species, the genus, or even to species belonging to other bacterial genera ...
  • these properties have specificity at the genus or bacterial species. However, they can also be subject to extreme variability between strains of the same species due to different environmental factors and stress conditions directing said strains towards distinct adaptive pathways. In view of such a level of heterogeneity in the properties of bacteria, it is easy to measure the difficulties posed by clear and formal typing and identification of said bacteria when they are contained in complex samples among other cellular components. .
  • genetic typing methods are of particular interest when the analysis relates to pathogens whose manipulation is difficult and non-reproducible, due in particular to low speed and versatility of growth, as well as absence of specific prerequisites in terms of culture conditions. Such circumstances render metabolic tests entirely inappropriate (Versalovic et al. 1993. Arch. Pathol. Lab. Med. 117: 1088-1098).
  • a number of molecular biology techniques implemented for the typing and characterization of bacteria are based on an electrophoretic separation of the products resulting from the digestion of the nucleic acids of said bacteria, these products hopefully having different molecular sizes so to obtain migration profiles that are as clear and usable as possible.
  • PFGE pulsed field electrophoresis
  • RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism
  • CFLP fragment size polymorphism from cleavage by Cleavase I endonuclease
  • CFLP fragment size polymorphism from cleavage by Cleavase I endonuclease
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • Amplification involves the use of nucleotide primers capable of hybridizing with complementary sequences present in the nucleic acid molecules serving as templates. This is a simple technique, easy to implement in routine, reliable and reproducible if the tools used, in particular the primers, DNA polymerase and, in the case of thermo-dependent amplifications, the temperature conditions , are themselves respectively specific, faithful and adapted.
  • the amplification in particular PCR, can be applied alone or, for finer differentiation of the species, coupled with other techniques, among which the determination of the sequence of the products of amplification, RFLP and size polymorphism of amplification products (Amplified Fragment Length Polymorphism; AFLP) (Olive and Bean, 1999, supra). The implementation of these latter combinations of techniques, obviously longer and heavier, is however not necessary for the establishment of a routine analysis.
  • the amplification technique may be sufficient in itself, provided that the means and tools used meet the requirements of specificity, reliability, reproducibility and discriminating power mentioned above.
  • Such a technique also has the advantage of being particularly sensitive and, consequently, of making it possible to process small volumes and / or quantities of nucleic acids.
  • the present invention therefore relates to a method for detecting, identifying and, if necessary, quantifying the bacteria contained in a complex mixture or in an aqueous medium, said method fulfilling all of the implementation requirements listed above.
  • This method involves carrying out at least two amplification reactions, simultaneous but spatially separated, of at least two specific and exclusive target nucleic acid sequences of at least two distinct species, genera or groups of bacteria.
  • said method comprises at least the following steps: a) bringing the nucleic acid sample into contact with at least two pairs of primers for amplification and, where appropriate, at least two associated probes, each pair and each probe associated with said pair being specific and exclusive of a target nucleotide sequence; b) amplification of the target nucleotide sequences, in particular by real-time PCR; and c) detection of the presence, identification and, if necessary, quantification of the bacteria contained in the complex mixture or in the starting water.
  • the different amplifications carried out have comparable sensitivities, in order to provide usable results concerning each of the microorganisms targeted.
  • sensitivity of an amplification reaction, here is meant the number of copies of genomic DNA equivalents of the targeted microorganism necessary in a PCR reaction to amplify a signal.
  • the amplifications of the target nucleotide sequences are a priori all carried out under the same conditions, in particular as regards the buffer in which the reaction takes place, the parameters d hybridization of the primers, the parameters of a possible thermocycling, etc. It is therefore preferable, in order to obtain reactions of comparable sensitivities, to use pairs of primers having comparable efficiencies, under given amplification conditions.
  • the conditions under which the sensitivity of each reaction will be determined can be, for example, those described in the first experimental part below. Alternatively, other experimental conditions can be used, the important point being that the same physicochemical conditions are used to determine the sensitivity of all the reactions which must take place simultaneously according to the process of the invention.
  • probes when associated probes are used, these probes must also exhibit hybridization efficiencies comparable, under given conditions.
  • two pairs of primers and, where appropriate, two probes associated with the pairs of primers
  • they have comparable efficiencies if they make it possible, under identical conditions, to detect their sequences targets with sensitivities not differing by more than a factor of 100 or better, not more than by a factor of 50.
  • sensitivities not differing by more than a factor of 100 or better, not more than by a factor of 50.
  • the different amplification reactions therefore preferably have the same sensitivity, that is to say sensitivities not differing by more than a factor of 100.
  • the primers for amplification and associated probes which are the subject of the present invention were chosen from target sequences from the literature in application of the following criterion, known as double specificity, namely sequence and size specificity.
  • sequence specificity is such that: (i) said primers and associated probes could be used in the context of amplification reactions of the multiplex type, that is to say multiple amplification reactions, simultaneous and taking place within one and the same reaction medium, and this, without risk of obtaining unwanted secondary amplification products, liable to distort the analysis; (ii) they cannot be hybridized with each other, which prevents false negative results being obtained; and (iii) they are specific for nucleotide sequences which are themselves specific for species or genera, or even for bacterial groups.
  • the size specificity of the amplification products generated makes it possible to attribute without ambiguity, by means of conventional analytical methods known to those skilled in the art, such as gel electrophoresis, each of said products to the bacteria of which he comes from.
  • the pairs of primers used are therefore specific for nucleotide sequences themselves specific for species, genera, or bacterial groups, and chosen so that the different primers do not hybridize with each other. They also have a specific size as described above. It should however be noted that this size specificity does not exclude that different pairs of primers, allowing the amplification of products of very similar, or even identical, sizes are used simultaneously in a process according to the invention, as is the case.
  • Said primers for amplification and associated probes are also exclusive under the conditions of use described in the context of the present invention.
  • This "exclusivity" means not only (i) with respect to the species, genera or even bacterial groups present, the primers and probes being chosen so as to avoid any hybridization with the nucleic acids of other species, genera or groups bacteria than that actually sought, but also (ii) with respect to the nucleotide sequences of the species, genus or target group, insofar as said primers and probes are not capable of hybridizing with other sequences than the desired sequence.
  • the exclusivity of the primers for amplification and associated probes according to the invention guarantees the obtaining of results devoid of false positives.
  • the primers for amplification and, where appropriate, the associated probes are therefore exclusive in the sense defined above.
  • bacterial species may refer, as the case may be, to bacterial species proper and in accordance with conventional taxonomic use, or with bacterial genera, level of taxonomic classification immediately higher than the species, or even with bacterial groups, said groups representing either bacterial families as classically listed in the field of microbial systematics and corresponding to the classification level located above the genus, ie groups of genera or families of bacteria having one or more common phenotypic or physiological characteristics.
  • such bacterial groups can bring together bacilli as opposed to cockles, or mesophilic organisms (Le., Organisms whose optimum growth temperature is between 20 and 37 ° C approximately) as opposed to psychrophilic or thermophilic organisms ( The., Organisms whose optimal growth temperature is respectively between 4 and 10 ° C approximately or between 45 and 60 ° C approximately), or saprophytic bacteria (e., Bacteria living in nature independently) in contrast to commensal, symbiotic or parasitic bacteria (e., bacteria living in close association with host cells, respectively without benefit or disadvantage for each other, or each benefiting from this association, or of which only bacteria benefit, the latter generally altering the metabolism of host cells).
  • mesophilic organisms Le., Organisms whose optimum growth temperature is between 20 and 37 ° C approximately
  • thermophilic organisms The., Organisms whose optimal growth temperature is respectively between 4 and 10 ° C approximately or between 45 and 60 ° C approximately
  • saprophytic bacteria e., Bact
  • a person skilled in the art of bacteriology is perfectly capable of defining bacterial groups, in addition to those listed above, on the basis of common morphological and / or phenotypic and / or physiological criteria.
  • the meaning to be given to the terms "species” or "bacterial species” will emerge clearly from the context.
  • a person skilled in the art may refer to Table I below to know whether the target nucleotide sequences of the amplification reactions, and the sequences of the primers for amplification and associated probes according to the invention, are specific and exclusive of species. , genera (Salmonella spp. for example) or groups bacteria (Escherichia coli, Shigella spp., Yersinia enterocolitica and Hafnia alvei for example).
  • a preferred embodiment of the process which is the subject of the invention consists in using as a matrix a sample consisting of nucleic acids previously extracted and purified from the cells of bacteria contained in a complex mixture, in particular food, or in water, using an extraction machine.
  • An example of such an automaton has been described in French patent application No. 0204424 relating to a process for extracting nucleic acids from microorganisms contained in a complex mixture, in particular food, said process comprising at least the following steps:
  • Application No. 0204424 also relates to an automaton capable of implementing such an extraction process.
  • the term “amplification” has a generic meaning, in that it refers to any molecular biology technique, the principle of which consists in amplifying or multiplying exponentially a sequence target nucleic acid.
  • the term “amplification” has a generic meaning, in that it refers to any molecular biology technique, the principle of which consists in amplifying or multiplying exponentially a sequence target nucleic acid.
  • TMA Nucleic Acid Sequence Based Amplification
  • NASBA Nucleic Acid Sequence Based Amplification
  • SDA Self-Sustained Sequence Replication
  • SDA Amplification by Strand Displacement Amplification
  • LCR Ligase Chain Reaction
  • PCR can be used in the context of the present invention to specifically designate the PCR reaction, or indifferently any amplification reaction such as those mentioned above.
  • the amplification reactions thus targeted may be isothermal or require cyclic exposure to different temperatures. According to this latter configuration, we advantageously speak of a “thermo-dependent” amplification reaction, although the latter term can sometimes be tacit, in which case the person skilled in the art is able to deduce it clearly and unambiguously from the context. .
  • the amplification is carried out for the purpose of purely qualitative detection of the bacteria contained in a complex mixture or in water.
  • the analysis carried out in accordance with the method which is the subject of the invention is quantitative, in that it makes it possible to determine the initial concentration of the target sequence within the sample of nucleic acids.
  • Amplification techniques called “quantitative”, “kinetic” or “in real time” known to those skilled in the art are then used.
  • probes have between 25 and 35 nucleotides approximately, and carry a fluorophore at their 5 'end and a fluorescence absorber (hereinafter “quencher”) at the 3' end.
  • the quencher placed at a short distance from the fluorophore, absorbs the fluorescence emitted by the latter and emits a fluorescence which is not detected by the PCR machine.
  • 5-TAMRA which re-emits at 568 nm can be inhibited.
  • Taq DNA polymerase (hereinafter “Taq polymerase”), by its exonuclease activity in the 5 ′ to 3 ′ direction, will degrade the probe hybridized to the region of the target sequence which is complementary thereto.
  • This degradation is carried out by the enzyme sequentially, starting from the 5 'end of the probe. It is precisely this process of degradation by hydrolysis of the probe which is at the origin of the fluorescence emitted, the fluorophore thus being physically separated from the quencher by a mechanism directly involving the sequence to be detected.
  • the primers for amplification and the “associated probe” recognize their complementary sequence.
  • the Taq polymerase then proceeds to extend the primers in the 5 ′ to 3 ′ direction until it meets the double strand structure formed by the region of the target sequence hybridized with the probe.
  • the 5 'to 3' exonuclease activity of the enzyme then sequentially cleaves the probe from its 5 'end. This progressive hydrolysis releases the fluorophore into the reaction medium, which leads to an increase in the fluorescence emitted.
  • the measurement of the fluorescence at the end of each step of extension of the PCR reaction makes it possible to follow the evolution of the reaction over time and to determine the initial concentration of target nucleic acids in the starting sample.
  • molecular beacons belonging to the group of probes. hybridization. These tags carry a fluorophore and a quencher, located respectively at the 5 'and 3' ends of the probes.
  • the sequences of the 5 ′ and 3 ′ ends of the probes are drawn independently of the target sequence and are mutually complementary, in order to form in solution a rod-loop structure, or hairpin structure, in which the fluorophore and the quencher are located in screw -a-vis.
  • the central region of the probes is complementary to an internal region of the target sequence, and forms the loop of this structure.
  • the probes hybridize to their complementary sequence by their central part, which causes the deployment of the folded structure of the probes.
  • the fluorophore is then separated from the quencher.
  • the fluorescence emitted must be measured during the hybridization step, when the probes emit a fluorescent signal by binding to the region of the target sequence which is complementary to them.
  • the term “analysis” as well as the expression “detection of bacteria” are capable of meaning both detection, identification and, where appropriate, quantification of said bacteria. Such a meaning emerges for the skilled person clearly and unequivocally from the context.
  • the present invention relates to an amplification process “multiple, simultaneous but separated in space” insofar as they take place, not an amplification reaction using a single “trio” comprising a pair of primers and an associated probe, but several concomitant reactions for amplification of several different target sequences present in the same sample, said reactions being such that: (i) they involve several distinct "trios" associating pairs of primers and probes; (ii) each pair of primers and associated probe is assigned a specific reaction space; and (iii) each amplification reaction is carried out within a specific reaction medium, contained in said space.
  • the different "trios" involved in a process according to the invention are preferably chosen so as to allow amplification and detection of their target with comparable sensitivities, under identical amplification conditions.
  • the space in which is carried out every reaction is a reaction chamber of a disposable cartridge described in US Patent Application No. 09 / 981,070 benefiting from the French priority patent application published on February 1, 2002 under the number 2812306.
  • a cartridge comprises in particular a plurality of reaction chambers, each containing a pair of primers and an associated probe for the amplification of target nucleotide sequences, to which is connected a sample supply reservoir nucleic acids serving as templates during multiple, simultaneous but spatially separated amplifications.
  • the number of reaction chambers can vary from 20 to 500 approximately, or from 30 to 100 approximately.
  • the Genedisc ® marketed by GeneSystems (Bruz, France), includes 36 reaction chambers.
  • This cartridge can be used in a device of the automated type for the amplification of nucleic acid sequences, said device comprising, in addition to the cartridge or cartridges themselves, at least one heating plate of which at least two distinct zones can be brought to at least two different temperatures and kept constant, each temperature thus corresponding to a given stage of an amplification cycle, namely the stage of denaturation, hybridization or elongation, as well as means of relative displacement between the or the cartridges and the plate (s), said displacement ensuring a cyclic exposure of the reaction chambers of a cartridge to the temperature of each of the zones of a plate, which makes it possible to automatically chain the cycles of the amplification reaction taking place inside said chambers.
  • the term "several” is understood to be synonymous with the expressions, which are themselves equivalent, "at least two" and "two or more”.
  • nucleic acids cover, according to the usual meaning, DNAs and RNAs, the former being for example genomic, plasmidic, recombinant, complementary (cDNA), and the latter, messengers (mRNA), ribosomal (rRNA), transfer (tRNA).
  • Amplification reactions are applicable to both DNA and RNA, in the second case, the introduction of a preliminary reverse transcription step, providing a copy of the RNA in the form of a cDNA and generating therein a matrix usable for the purposes of amplification using the pairs of nucleotide primers chosen and, where appropriate, probes associated with said pairs.
  • the amplification reaction is known to those skilled in the art under the acronym RT-PCR (Reverse Transcription - PCR). It appears among all the reactions grouped together, in accordance with the definition above, under the name “amplification” or “PCR”.
  • nucleic acid sequences to be amplified are called “targets” or “templates”.
  • targets or “templates”.
  • said sequences are coated with specificity and exclusivity properties as defined above.
  • the target nucleic acid sequences are amplified using pairs of specific and exclusive nucleotide primers, the expression “specific and exclusive primer” designating in this case any sequence nucleotide useful as a primer for amplification and capable of hybridizing under strict conditions with at least 80% of the target nucleic acid sequences.
  • the “strict hybridization conditions” obey the conventional definition and are known to those skilled in the art (Sambrook and Russel. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual, 3 rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) "Strict hybridization conditions” are, for example, conditions that allow specific hybridization of two single-stranded DNA sequences after at least one washing step.
  • the hybridization step can in particular be carried out at approximately 65 ° C., in a solution comprising SSC 6X, 0.5% SDS, Denhardt 5X solution and 100 ⁇ g of non-specific DNA (for example l 'Salmon sperm DNA), or any other solution of equivalent ionic strength.
  • the next step, comprising at least one washing, is for example carried out at approximately 65 ° C., in a solution comprising SSC at most 0.2 ⁇ and SDS at at most 0.1%, or in any other solution of equivalent ionic strength.
  • the parameters defining the hybridization conditions depend on the temperature Tm at which 50% of the paired strands separate.
  • the primers and the probes will be preferably defined by their percentage of identity with the sequences described.
  • BLAST software which can be used here.
  • version 2.06 can be used, as well as the standard version of nucleotide alignment available on the NCBI website or, for sequences between 7 and 20 nucleotides, the specific version for short sequences, available on this website. same site (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).
  • the similar sequences thus envisaged can be the same length as the sequences described in the present text and in Table I, or of a different length, then preferably between 15 and 35 bases.
  • primers are equivalent within the meaning of the present invention. It is understood that the primers thus designated are necessarily specific and exclusive, even if this is not always explicitly stated in the text.
  • the present application describes in particular pairs of primers specific to certain microorganisms, and usable under certain conditions. It is obvious that a pair of primers corresponding to the complementary reverse sequences of each of the primers of a pair of primers described in the present application can be used in place of said pair of primers. Such a pair of primers will be called “complementary reverse priming couple” of the first pair.
  • the method according to the present invention leads to the detection of pathogenic bacteria of mammals, humans and / or animals. In particular, said method makes it possible to detect the possible presence of several bacterial species among the following pathogenic infectious agents: Escherichia coli and or Shigella spp.
  • H. alvei this enterobacterium, although rare, can nevertheless be the cause of spoilage of certain foods, in particular meats packaged in an atmosphere poor in oxygen.
  • H. alvei is difficult to identify by conventional methods and frequently confused with Salmonella for example.
  • the present invention precisely makes it possible to discriminate in a simple and rapid manner H. alvei from Salmonella spp.
  • these bacteria are pathogenic and cause gastrointestinal disturbances (diarrhea, vomiting ...), sometimes severe and possibly accompanied by fevers. In this respect, they represent a particular danger for pregnant women, young children and the elderly in particular, a danger which should be avoided by drastic measures, as evidenced by the fact that in recent years multiply food withdrawal campaigns, in particular raw milk cheeses, in which the concentrations of Listeria monocytogenes or Salmonella spp. exceeded the tolerable normative thresholds.
  • Legionella spp. are rather present in water (drinking water, hot and cold sanitary water, cooling towers, surface water, groundwater), and have been responsible for nosocomial infections or in people frequenting certain thermal establishments, causing temporary closure of said establishments. It is therefore important to be able to easily and quickly detect any contamination of the water with legionella.
  • the pairs of primers and associated probes below have been chosen or drawn so as to fulfill the conditions of specificity and exclusivity required within the framework of the implementation of the process object of the invention and in particular of the step of multiple amplifications, simultaneous but separated in space.
  • they were chosen so as to allow the detection of their target sequences with identical or at least comparable sensitivity under given amplification conditions, that is to say that under such conditions, the sensitivities of the different reactions do differ no more than a factor of 100, preferably no more than a factor of 50.
  • nucleotide sequences drawn for E. coli also make it possible to identify H. alvei, and thereby to distinguish this bacterial species from Salmonella, with which it is generally confused.
  • the subsequent discrimination between E. coli and H. alvei can be carried out by determining the type of nitrate reductase, the majority of enterobacteria, including E. coli, having a nitrate reductase of type A, while H. alvei has a nitrate reductase type B (for the procedure to be followed for the purposes of this determination, see Marchai et al. 1982. In Culture media for the isolation and biochemical identification of bacteria. Doin Editeurs, Paris, France).
  • E. coli makes it possible, in addition to H. alvei, to also detect Shigella spp. and Y. enterocolitica.
  • E. coli E. coli
  • Shigella spp. and H. alvei E. coli
  • Y. enterocolitica Y. enterocolitica
  • the discrimination between E. coli, Shigella spp. and H. alvei can be performed on the basis of. biochemical criteria such as that mentioned above and, for example, using commercial tests of the API20E Gallery type (bioMérieux, supra).
  • the pair of primers (LmHlyAf; LmHlyAr) has been described by Nogva et al. (2000. Appl. Environ. Microb. 66: 4266-4271).
  • the primer pairs (Ye86f; Ye86r), (Ec97f; Ec97r), (Se98f; Se98r), (Sa193f; Sa193r), (Bc84f; Bc84r), (Cp97f; Cp97r) and (Cju76f; Cju76r) were drawn in purposes of the present invention based on the genomic sequences respectively published and deposited in GenBank by Ibrahim et al. (1997. J. Clin. Microbiol. 35: 1636-1638; Access No.
  • the primer pairs (Lg189f; Lg69r), (Lg69f; Lg69r), and (Lpn112f; Lpn112r) were drawn for the purposes of the present invention according to the genomic sequences respectively deposited in GenBank under the numbers AF122885 (for the two first couple) and Y12705.
  • GenBank accession number AAAA
  • Y12705 accession number AAAA
  • SEQ ID Nos. 17 to 24 the name of which carries the extension "TqFT”
  • any sequence hybridizable under strict conditions to at least 80% with the sequences of the probes appearing in Table I, or any sequence having at least 80% identity with such a probe or its complementary reverse sequence, and corresponding to the specificity and sequence exclusivity criteria given above, can be used, in the context of the present invention, as a probe.
  • any nucleotide sequence having at least 80% identity with one of the primers listed in Table I or its complementary reverse sequence is capable of being used as primer for amplification in accordance with the invention, as well that a primer selected according to the sequence of the same gene specific for the species considered, but offset, with respect to one of the primers listed in Table I or its complementary reverse sequence.
  • a primer selected according to the sequence of the same gene specific for the species considered, but offset, with respect to one of the primers listed in Table I or its complementary reverse sequence is easy for those skilled in the art having a sequence of a pair of primers meeting the criteria of double specificity, exclusivity, and compatibility with other pairs of primers listed above, and also having the sequence of the targeted gene, to choose another primer sequence derived from that mentioned in Table I by a shift of a few bases on the targeted sequence .
  • Sal93TqFT 5 'TCgTCAAggCTTggCTAAAgTTgC 3' 21
  • step b) relating to the multiple amplifications, simultaneous but spatially separated, of the target nucleotide sequences is of the thermo-dependent type, such as time PCR real.
  • an amplification cycle comprises at least the following substeps: b1) the denaturation step, during which the double-stranded DNA is separated into two molecules of single-stranded DNA, is carried out between 94 and 95 ° C, or between 94 and 98 ° C, preferably at about 94, 95 or 96 ° C, for 15 seconds to 1 minute, preferably for 30 seconds; b2) the hybridization step, making it possible to match the complementary single-stranded nucleic acids, which will serve as templates in the next step, the specific nucleotide primers and, if appropriate, the associated probe, is carried out between 55 and 62 ° C, preferably around 60 ° C, the temperature of this step being in any case dictated by the sequences of the pairs
  • the elongation step, leading to the replication of the matrix (s), is carried out between 55 or 60 ° C and 72 ° C, for 15 seconds to 2 minutes, preferably for approximately 30 seconds.
  • step b) of the process which is the subject of the invention comprises, in addition to the sub-steps b1) to b3) mentioned above, a preliminary sub-step b0) of activation of the Taq polymerase at a temperature of approximately 94 ° C. , for 3 to 15 minutes, preferably for 3 to 5 minutes.
  • This step bO) is optional, but becomes required if the Taq polymerase used is a so-called "hot start" enzyme, such as Platinum TM Taq DNA Polymerase (Invitrogen TM Life Technologies, Invitrogen, Cergy Pontoise, France).
  • sub-steps b1) to b3) above undergo at least 40 amplification cycles.
  • the present invention further relates to pairs of primers for amplification useful for the implementation of the method described above for the detection of specific and exclusive nucleic acid sequences of bacteria contained in a complex mixture.
  • Said pairs of primers allow the amplification of specific and exclusive nucleic acid fragments of Y. enterocolitica, E. coli and / or H. alvei and / or Shigella spp. and / or Y. enterocolitica, Salmonella spp., S. aureus, B. cereus, C. perfringens, C. jejuni, Legionella spp. and L. pneumophila and consist of sequences chosen from the following primers:
  • Ye86f (SEQ ID No. 3) and Ye86r (SEQ ID No. 4) for Y. enterocolitica;
  • Ec97f SEQ ID N ° 5
  • Ec97r SEQ ID N ° 6
  • E. coli and / or H. alvei and / or Shigella spp. and / or Y. enterocolitica - Se98f (SEQ ID N ° 7) and Se98r (SEQ ID N ° 8) for E. coli and / or H. alvei and / or Shigella spp. and / or Y. enterocolitica
  • - Se98f SEQ ID N ° 7
  • Se98r SEQ ID N ° 8
  • Salmonella spp. Salmonella spp. ;
  • Bc84f (SEQ ID No. 11) and Bc84r (SEQ ID No. 12) for B. cereus;
  • Lg69f SEQ ID N ° 35
  • Lg69r SEQ ID N ° 34
  • any sequence having at least 80% identity with one of the abovementioned nucleotide sequences, or with its complementary reverse sequence constitutes a specific and exclusive primer suitable for use in in the context of a simple, rapid and reliable method for detecting bacterial species, and in particular in the context of the method which is the subject of the invention. It is important to note that the pairs of primers mentioned above, advantageously usable in the context of the methods of the invention, are not in any way limited in their use, and are also usable in the context of other methods, in particular of any process involving amplification reactions.
  • nucleotide probes which can be, according to the embodiments, associated with primer pairs for amplification such as those described above, for the purposes of real-time amplification of d sequences. nucleic acids, or used for the detection of target sequences according to DNA-DNA hybridization techniques.
  • probes which are the subject of the invention, these are able to be used in the context of amplification reactions in real time, in accordance with the principles of TaqMan TM chemistry (supra) or tags previously mentioned and known to those skilled in the art.
  • said probes are oligonucleotides of the TaqMan TM type (supra), labeled 5 ′ by a fluorophore, such as 6-methylfluorescein (FAM), and 3 ′ by a quencher, such as tetramethylrhodamine (TAMRA), sequences, specific and exclusive of bacterial species, are chosen from:
  • Lm113TqFT (SEQ ID No. 17) for L monocytogenes
  • Ye86TqFT (SEQ ID No. 18) for Y. enterocolitica
  • Ec97TqFT (SEQ ID N ° 19) for E. coli and or H. alvei and / or Shigella spp. and / or Y. enterocolitica;
  • Se98TqFT (SEQ ID No. 20) for Salmonella spp. ; Sa193TqFT (SEQ ID No. 21) for S. aureus; Bc84TqFT (SEQ ID No. 22) for ⁇ . cereus; Cp97TqFT (SEQ ID No. 23) for C. perfringens; Cju76TqFT (SEQ ID N ° 24) for C. jejuni; - Lg189TqFT (SEQ ID N ° 38) for Legionella spp. ;
  • Lg69TqFT SEQ ID N ° 39 for Legionella spp.
  • Lpn112TqFT SEQ ID No. 40 for Legionella pneumophila
  • any sequence hybridizable under strict conditions to at least 80% with the above sequences, or any sequence having at least 80% identity with said sequences SEQ ID 17 to 24 and 38 to 40 or with their complementary reverse sequences.
  • the above-mentioned probes are used in combination with the pairs of primers for amplification described above.
  • Another object of the invention is, moreover, a set of nucleic acids comprising one or more pairs of primers and probe (s) associated therewith, such as pairs of specific primers of microorganisms. and the corresponding probes described above.
  • a pair of primers can be replaced by its complementary reverse priming pair, and the probe can be replaced by its complementary reverse sequence, replacing the pair of primers or the probe being independent of each other.
  • Primers or probes having at least 80% identity with the sequences described in the present application, or with their complementary reverse sequences, can also be used.
  • nucleotide probes which are the subject of the present invention, these are useful for the detection of specific and exclusive nucleic acid sequences of bacteria contained in a complex mixture or in water.
  • Said probes chemically (cold) or radioactively (hot) labeled, allow then the implementation of hybridization procedures such as Southern hybridization, hybridization on colonies and hybridization on dot deposits (Dot Blot) (Sambrook and Russel, 2001, supra).
  • Dot Blot Southern hybridization
  • dot Blot dot Blot
  • nucleotide probes which are the subject of the invention allow the detection of specific and exclusive nucleic acid fragments of Y. enterocolitica, E. coli and / or H. alvei and / or Shigella spp. and / or Y. enterocolitica, Salmonella spp., S. aureus, B. cereus, C. perfringens, C. jejuni, Legionella spp. and L. pneumophila.
  • said probes are constituted by the amplification products capable of being obtained using the pairs of primers chosen from:
  • Ye86f (SEQ ID No. 3) and Ye86r (SEQ ID No. 4) for Y. enterocolitica;
  • Ec97f SEQ ID N ° 5
  • Ec97r SEQ ID N ° 6
  • Se98f SEQ ID N ° 7
  • Se98r SEQ ID N ° 8
  • Salmonella spp. - Sa193f (SEQ ID N ° 9) and Sa193r (SEQ ID N ° 10) for S. aureus;
  • Bc84f (SEQ ID No. 11) and Bc84r (SEQ ID No. 12) for R cereus;
  • Lg189f SEQ ID N ° 33
  • Lg69r SEQ ID N ° 34
  • Legionella spp. - Lg69f (SEQ ID N ° 35) and Lg69r (SEQ ID N ° 34) for
  • Legionella spp. Lpn112f (SEQ ID No. 36) and Lpn112r (SEQ ID No. 37) for Legionella pneumophila; any pair of reverse primers complementary to the above pairs; and - any pair of primers comprising at least one primer of sequence hybridizable under strict conditions to at least 80% with the above sequences, or of sequence having at least 80% identity with them.
  • the probes which are the subject of the invention are oligonucleotides whose sequences are chosen from:
  • Lm113TqFT (SEQ ID No. 17) for L. monocytogenes
  • - Ye86TqFT (SEQ ID No. 18) for Y. enterocolitica
  • Ec97TqFT (SEQ ID N ° 19) for E. coli and / or H. alvei and / or Shigella spp. and / or Y. enterocolitica; Se98TqFT (SEQ ID No. 20) for Salmonella spp. ; Sa193TqFT (SEQ ID No. 21) for S. aureus; - Bc84TqFT (SEQ ID N ° 22) for ⁇ . cereus;
  • Cp97TqFT (SEQ ID No. 23) for C. perfringens; Cju76TqFT (SEQ ID N ° 24) for C. jejuni; Lg189TqFT (SEQ ID N ° 38) for Legionella spp. ; Lg69TqFT (SEQ ID N ° 39) for Legionella spp. ; Lpn112TqFT (SEQ ID No. 40) for Legionella pneumophila; and any sequence hybridizable under strict conditions to at least 80% with the above sequences, or any sequence having at least 80% identity with said sequences SEQ ID 17 to 24 and 38 to 40 or their complementary reverse sequences.
  • An advantage of the two groups of probes mentioned above is that the different probes mentioned in each of the groups can be used under identical conditions, because they have comparable hybridization efficiencies, which makes it possible to use them simultaneously, in a method of the invention.
  • the present invention therefore also relates to a set of probes (2, 3, 4 or more) selected from the group of oligonucleotide probes mentioned above (SEQ ID Nos 17 to 24 and 38 to 40), or selected from the group of probes consisting of the amplification products mentioned above, to which must be added the product of the amplification of the HlyA gene of L. monocytogenes by the pair of primers of SEQ ID No: 1 and SEQ ID No: 2, or by the pair of reverse primers complementary to the latter, or by any pair of primers comprising at least one primer of sequence hybridizable under strict conditions to at least 80% with the above sequences, or of sequence having at least 80% of identity with them.
  • sequences SEQ ID Nos. 17 to 24 and 38 to 40 useful for the detection of bacterial species by DNA-DNA hybridization techniques, lack markings using a 5 'fluorophore and a 3 'quencher, characteristics of TaqMan TM systems (supra) or molecular beacons, as described above.
  • the present invention finally relates to molecular biology tools, analysis kit and micro-networks or nucleic acid chips, for the detection of bacteria contained in a complex mixture or in an aqueous medium.
  • the present invention relates to a kit or system for the detection of the nucleic acids of at least two different bacterial species contained in a complex mixture or in water.
  • Said kit makes it possible in particular to implement the method according to the invention, in that it provides pairs of primers which can be used during the step of multiple amplifications of said method.
  • this kit includes:
  • nucleotide probes respectively labeled in 5 'and 3' with a fluorophore and a quencher, selected from the sequences SEQ ID N ° 17 to SEQ ID N ° 24 and SEQ ID N ° 38 to SEQ ID No. 40 of Table I, and any sequence hybridizable under strict conditions to at least 80% with the latter or having at least 80% identity with them or their complementary reverse sequences;
  • nucleotide probes chosen from the group comprising the probes of sequences SEQ ID N ° 17 to 24 and SEQ ID N ° 38 to SEQ ID N ° 40 (Table I, supra), devoid of labeling with a fluorophore in 5 'and a quencher in 3', amplification products obtained using the pairs of primers of sequences SEQ ID No. 1 to SEQ
  • a kit as defined above will preferably comprise the pair of primers constituted by the following sequences: LmHlyAf (SEQ ID No. 1) and LmHlyAr (SEQ ID No. 2), or the pair of reverse primers complementary to the pair ⁇ LmHlyAf, LmHlyAr ⁇ , or any sequence having at least
  • the invention relates to micro-arrays or nucleic acid chips for the detection of at least two different bacterial species contained in a complex mixture or in water.
  • a micro-array in accordance with the present invention is useful for the purposes of implementing multiple amplification reactions, simultaneous but spatially separated.
  • Said micro-network then comprises:
  • Table I any sequence similar to at least 80% to the latter, for the amplification of specific and exclusive fragments of microorganisms from the group consisting of Y enterocolitica, E. coli and / or H. alvei and / or Shigella spp. and / or Y. enterocolitica, S. aureus, L. monocytogenes, Salmonella spp., B. cereus, C. perfringens, C. jejuni,
  • Legionella spp. and L. pneumophila - and, if necessary, at least two nucleotide probes, respectively labeled 5 'and 3' with a fluorophore and a quencher, selected from the sequences SEQ ID N ° 17 to SEQ ID N ° 24 and SEQ ID N ° 33 to SEQ ID N ° 37 in Table I, and any sequence hybridizable under strict conditions to at least 80% with the latter or having at least 80% identity with them or their complementary reverse sequences.
  • a micro-array object of the invention can be used for the detection of at least two bacterial species among Y. enterocolitica, E. coli and / or H. alvei and / or Shigella spp. and / or Y. enterocolitica, S. aureus, L. monocytogenes, Salmonella spp., B. cereus, C. perfringens, and C. jejuni, said species being contained in a complex mixture, and among Legionella spp. and L. pneumophila, present in water, the detection being carried out by DNA-DNA hybridization techniques.
  • the micro-array comprises at least two nucleotide probes chosen from: - the sequences SEQ ID N ° 17 to 24 and 38 to 40 (Table I, supra), devoid of the fluorophore in 5 'and the quencher in 3' , and any sequence hybridizable under strict conditions to at least 80% with the latter or having at least 80% identity with them or their complementary reverse sequences; and the amplification products obtained using the pairs of primers of sequences SEQ ID Nos. 1 to 16 and 33 to 37 (Table I, supra) or the pairs of reverse primers complementary to said pairs, and any sequence having at least 80% identity with these amplification products.
  • the following figures are provided for illustrative purposes only and do not limit the subject of the present invention in any way.
  • FIG. 1 amplification curves obtained with the DNA of L. monocytogenes using the primers LmHlyAF (SEQ ID No. 1) and
  • RFU relative fluorescence unit.
  • Figure 2 amplification curves of the DNA of L. monocytogenes obtained by multiparametric detection by rotary PCR.
  • Figure 3 curves obtained by amplification of the DNA of Salmonella spp. using the primers Se98f (SEQ ID No. 7) and Se98r (SEQ ID No. 8) in the presence of the probe Se98TqFT (SEQ ID No. 20) and corresponding to initial amounts of genomic DNA equivalent of : ⁇ : 5.10 5 ; O: 5.10 4 ; *: 5.10 3 ; +: 5.10 2 ; O: 50; and D: 5 copies per reaction.
  • Figure 4 electrophoresis on 2% agarose gel.
  • Lanes 1 and 2 fragments obtained by amplification of the DNA of Salmonella spp. using the primers Se98f (SEQ ID No. 7) and Se98r (SEQ ID No. 8), respectively from 5.10 5 and 5 copies of genomic equivalents.
  • Lane 3 negative PCR control (the 5 ⁇ l of DNA has been replaced by 5 ⁇ l of water).
  • FIG. 5 curves obtained by amplification of the DNA of E. coli using the primers Ec97f (SEQ ID No. 5) and Ec97r (SEQ ID No. 6) and corresponding to initial quantities of genomic DNA equivalent of :
  • FIG. 6 DNA amplification curves of Y. enterocolitica obtained using the primers Ye86f (SEQ ID No. 3) and Ye86r (SEQ ID No. 4) associated with the Ye86TqFT probe (SEQ ID No. 18 ) and corresponding to initial quantities of genomic DNA equivalent of: *: 5.10 6 ; : 5.10 5 ; + .- 5.10 4 ; O: 5.10 3 ; D: 5.10 2 ; ": 50; and • : 5 copies per reaction.
  • Figure 7 amplification curves for ⁇ DNA. cereus using the primers Bc84f (SEQ ID No.
  • Figure 8 electrophoresis on 2% agarose gel. Tracks 1 and 2: fragments resulting from the amplification of ⁇ DNA. cereus using primers Bc84f (SEQ ID No. 11) and Bc84r (SEQ ID No. 12), respectively from 5.10 6 and 50 copies of genomic equivalents.
  • Lane 3 negative PCR control (the 5 ⁇ l of DNA has been replaced by 5 ⁇ l of water); the band which appears corresponds to primer dimers.
  • Figure 9 amplification curves for ⁇ DNA. cereus obtained by multiparametric detection in rotary PCR.
  • FIG. 10 curves obtained by amplification of the DNA of C. perfringens using the primers Cp97f (SEQ ID No. 13) and Cp97r (SEQ ID No. 14) as well as the associated probe Cp97TqFT (SEQ ID No. 23) and corresponding to initial amounts of genomic DNA equivalent of: O: 5.10 6 ; D: 5.10 5 ; •: 5.10 4 ; >,: 5.10 3 ; •: 5.10 2 ; bi: 50; and ⁇ : 5 copies per reaction.
  • FIG. 11 DNA amplification curves of C. jejuni obtained using the primers Cju76f (SEQ ID No. 15) and Cju76r (SEQ ID No. 16) associated with the Cju76TqFT probe (SEQ ID No. 24 ) and corresponding to initial quantities of genomic DNA equivalent of: *: 5.10 5 ; +: 5.10 4 ;
  • FIG. 12 DNA amplification curves of S. aureus obtained using the primers Sa193f (SEQ ID No. 9) and Sa193r (SEQ ID No. 10) as well as the Sa193TqFT probe (SEQ ID No. 21 ) and corresponding to initial quantities of genomic DNA equivalent of: •,: 5.10 6 ; : 5.10 5 ; ⁇ : 5.10 4 ;
  • FIG. 13 curves resulting from the amplification of the DNA of L. pneumophila with the primers Lg189f and Lg69r as well as the probe
  • Lg189TqFT corresponding to initial quantities of genomic DNA equivalent of L.: 2.10 6 , •: 2.10 5 , D: 2.10 4 , *: 2.10 3 and ⁇ : 2.10 2 copies / reaction.
  • Figure 14 curves from the amplification of the DNA of L. pneumophila with the primers Lg69f and Lg69r as well as the probe
  • Lg69TqFT corresponding to initial quantities of genomic DNA equivalent of: 2.10 5 , L: 2.10 4 ,: 2.10 3 , O: 2.10 2 and *: 20 copies / reaction.
  • Figure 15 curves from the amplification of the DNA of L. pneumophila with the primers Lpn112f and Lpn112r as well as the probe
  • Lpn112TqFT corresponding to initial quantities of genomic DNA equivalent of *: 2.10 6 , ⁇ : 2.10 5 , i: 2.10 4 , •: 2.10 3 and O: 2.10 2 copies / reaction.
  • Figure 16 electrophoresis on 2% agarose gel.
  • Lane 1 amplification product of the icms gene by the primers Lpn112f and Lpn112r
  • Lane 2 molecular weight marker with, from top to bottom, the bands corresponding to 2000, 1200, 800, 400, 200, and 100 bp.
  • Lane 3 amplification product of the gene coding for 16S RNA by the primers Lg69f and Lg69r
  • Lane 4 amplification product of the gene coding for 16S RNA by the primers Lg189f and Lg69r.
  • the standard reagents for the PCR reactions were added. According to the conditions of implementation, it has sometimes been found useful to add the Tween20 ®, in particular to remove residual inhibitors of Taq DNA polymerase may be present in the reaction mixture.
  • MgCI 2 between about 2 and 5 mmol / L, preferably about 4 mmol / L
  • BSA Bovine Albumin Serum
  • Taq DNA polymerase between approximately 0.5 and 0.75 units
  • PCR reactions were carried out under the following conditions.
  • PCR 10X buffer for example "Qiagen PCR Buffer 10X"
  • the dNTP mixture consisted of 10 mM of dATP, dCTP, dGTP and dTTP (Sigma-AIdrich, Lyon, France).
  • reaction mixture for an amplification reaction had the following composition: 5 ⁇ l of reaction “mix”, ie:
  • This mixture was incubated at 60-100 ° C for 10-20 minutes. If necessary, this mixture has undergone a second cell lysis treatment, mechanically.
  • the lysate was purified and concentrated using the "Nucleospin Plant L” system (Macherey Nagel, D ⁇ ren, Germany).
  • the nucleic acids were mixed volume to volume with binding buffer ("C4") and absolute ethanol. This mixture was vigorously stirred for 30 seconds, then deposited on a column of silica.
  • the column was washed successively with 1 and 2 ml of the "CQW” and "C5" buffers, respectively, before being dried for 10 minutes by centrifugation at 5500 x g, at room temperature.
  • lysate was not purified, 200 ⁇ L was removed and stored in ice for analysis by PCR.
  • the mixture was homogenized using a “stomacher” for 3 minutes.
  • the media thus obtained were incubated for 18 h at 37 ° C and 24 h at
  • This mixture was incubated between 60 and 100 ° C for the purpose of chemical lysis (see paragraph 1-2-1- above). As described above, the mixture could, as an alternative or subsequent to chemical lysis, be processed mechanically.
  • the lysate was purified and concentrated using the “Nucleospin Plant L” system (see paragraph 1-2-1-supra).
  • lysate was not purified, 200 ⁇ l were removed and stored in ice for analysis by PCR.
  • 1-2-3- Extraction of nucleic acids from water 250 to 1000 ml of water are filtered through a 0.45 ⁇ m polycarbonate membrane (Sartorius). 1 to 4 ml (preferably 2 ml) of TENS 2X - Chelex-100 15% buffer or of 25% aqueous Chelex-100 solution are added to the membrane which has retained the bacteria. This mixture is incubated between 60 and 100 ° C for the purpose of chemical lysis and can alternatively or subsequently be treated mechanically. The lysate is then purified and concentrated using the “Nucleospin Plant L” system.
  • the present invention is capable of being implemented by means of a disposable cartridge described in US patent application n ° 09/981070 benefiting from the priority of the published French patent application. February 1, 2002 under number 2812306.
  • the GeneDisc ® marketed by GeneSystems (Bruz, France) is an example of such a cartridge.
  • This cartridge and in particular the GeneDisc ®, is used in a PLC type of device for the amplification of nucleic acid sequences, also described in the above-cited patent applications.
  • the Genedisc ® is divided into identical sectors.
  • the designates "sector", part of the GeneDisc ® consists of a fraction of the total number of reaction chambers carried by said GeneDisc ®, for example 1/3 or 1/6 of the 36 rooms, associated with a compartment of the tank central, said compartment supplying the reaction chambers included in the abovementioned fraction.
  • the central tank of Genedisc ® is divided into three or six compartments in all identical points, each of these compartments thus ensuring the service of a third or a sixth of the total number of reaction chambers.
  • the Genedisc ® then comprises, according to this example, three or six sectors.
  • each "trio" pair of primers and probe associated has been deposited in one or more reaction chambers of GeneDisc ®.
  • Tween20 ® was distributed to all reaction chambers.
  • the volume of reaction mixture prepared as described in paragraph 1-1- supra correspond to the volume of reaction mixture for amplification (10 .mu.l) multiplied by the number of reaction chambers included in the sector, each of said chambers being the seat of an amplification.
  • a sector then being represented by a third of the 36 chambers, that is to say 12 chambers, the volume of reaction mixture to be prepared for a sector was 120 ⁇ l.
  • the 120 ⁇ l of reaction mixture were deposited in a compartment of the central tank.
  • the the mixture was then served in the reaction chambers containing the pre-deposits of "trios", pairs of primers and associated probes, and of Tween20 ® at respective concentrations of 200 nM and 0.01% for 10 ⁇ l final.
  • thermocycling conditions used on the GeneDisc Cycler ® are as follows: a denaturation step at 96 ° C for 30 seconds, a step of hybridization at 58 ° C for 30 seconds, and an elongation step at 58 ° C for 30 seconds, for each cycle.
  • I-3 of Tween20 ® to a final concentration of 0.01%, and the pairs of primers and probes specific for L. monocytogenes and B. cereus at a final concentration of 200 nM , had previously been deposited in the reaction chambers of the corresponding sector, on the basis of a distribution of 8 chambers by microorganism to be detected, for a total of 16 reaction chambers.
  • Rotary PCR made it possible to obtain amplification curves in the context of the two detections, with threshold cycles (cycles from which the fluorescence is significantly higher than the background noise; Ct) respective means of 25.2 ⁇ 0.84 cycles and 29.5 ⁇ 0.55 cycles for ⁇ . cereus ( Figure 11) and L. monocytogenes (Figure 3).
  • the average Ct calculated by the two devices were comparable, with values of 26.4 ⁇ 1.7 and 26.2 ⁇ 0.2 cycles for the iCycler ® , and 26.3 ⁇ 0.3 and 25.8 ⁇ 0 , 1 for the Genedisc Cycler ® .
  • the amplifications were carried out in a final reaction volume of 10 ⁇ l, on dilution ranges to the ⁇ o th of samples of nucleic acids extracted from pure cultures of different microorganisms.
  • the microorganisms studied with the pairs of primers and associated probes specific for Legionella spp. and Legionella pneumophila are: Acanthamoeba polyphaga, Acinetobacter baumanii, Acinetobacter junit ' , Acinetobacter Iwofii, Aerococcus viridans, Aeromonas hydrophila, Alcaligenes faecalis, Bacillus subtilis, Bulkhoderia cepacia, Campylobacter jejuni, Campylobacter colindrobi coliobrobia coliobacteria.
  • the amplification product (SEQ. ID No. 25 and 26 below) was purified and its sequence determined on both strands using the primers LmHlyAf (SEQ ID No. 1) and LmHlyAr (SEQ ID No. 2) .
  • the sequence SEQ ID No. 25 was obtained using the primer LmHlyAr (SEQ ID No. 2).
  • nucleotides located between positions 72 and 92, underlined in the sequence SEQ ID No. 25 below, represent the complementary sequence of the primer LmHlyAf (SEQ ID No. 1).
  • SEQ ID No. 26 was determined using the primer LmHlyAf (SEQ ID No. 1).
  • pairs of primers and associated probe designed for the amplification of a sequence of Salmonella spp. allowed to amplify a fragment of the expected size, and this, specifically, with a sensitivity of 1 to 10 copies of genomic DNA equivalents per reaction
  • the pair of primers and associated probe designed for E. coli made it possible to amplify a DNA fragment of the expected size for the 4 strains of E. coli studied ( Figure 5), as well as for Y. enterocolitica, S. flexneri and H. alvei.
  • the sensitivity for the 4 E. coli strains, as well as for Y. enterocolitica, S. flexneri and H. alvei is from 1 to 10 equivalent copies of genomic DNA per PCR reaction, for each of the microorganisms.
  • the pair of primers and associated probe designed for C. perfringens made it possible to obtain, specifically for this species, amplification curves in real time, with a sensitivity of 1 to 10 copies of genomic DNA equivalents.
  • PCR reaction Figure 10
  • No amplification product was obtained during the reactions carried out on the extracts coming from the bacterial genera studied other than Clostridium.
  • the amplification product was purified. Its sequence, SEQ ID No. 28, was determined using the primer Cp97f (SEQ ID No. 13).
  • the sequence SEQ ID No. 28 below was identical to the target sequence sought.
  • SEQ ID No. 28 5 'TATTTTGGAGTAATAGATACTCCATATCATCCTGCTAATGTTACTG
  • ATTCAGCCAAACCCTAACCTCAGCTCCAGCCCAAGACAGTCGACCGCTA 3 ' was obtained using the primer Cju76f (SEQ ID No. 15).
  • the underlined bases, located between positions 31 and 49 of the above sequence, represent the complementary sequence of the primer Cju76r (SEQ ID No. 16).
  • CTGGAGCTGAGGTTAGGGTTTGGCTGAATTTAATACCCAAAGAACGATTTGC AAG 3 ' was determined using the primer Cju76r (SEQ ID No. 16).
  • sequences SEQ ID No. 29 and 30 corresponded to those of the target sought.
  • No amplification product was obtained during the reactions carried out on the samples of nucleic acids extracted from species or bacterial genera analyzed, other than Campylobacter. 11-3-9- Sequences drawn for the detection of Staphylococcus aureus; The pair of primers and associated probe designed for S. aureus made it possible to obtain amplification curves in real time specific for this species, with a sensitivity of 50 copies of genomic DNA equivalents per PCR reaction ( Figure 12 ).
  • the amplification product was purified and its sequence determined on both strands.
  • sequence SEQ ID no. 32 5 'AAATATTTAATTTCTCTTTTTTTGCTTGTGCTTCACTTTTTCTTAAAA GTTGTTCATGTGTATTGTTAGGTTTATAAACATAAGCAACTTTAGCCAAGCCTT GACGAACTAAAGCTTCGTTTACCATTTTTCCATCAGCATAAATATGQTAATAC3 n ° aReaded
  • the nucleotides located between positions 146 and 165 and underlined in the above sequence represent the complementary sequence of the primer Sa193f (SEQ ID No. 9).
  • 1st couple The first couple, drawn from the sequence of the gene coding for the 16S RNA of L. pneumophila subsp. pascullei (Genbank Accession Number: AF122885), consists of the primers Lg189f (SEQ ID N ° 33), and Lg69r (SEQ ID N ° 34), and associated with the Lg189TqFT probe (SEQ ID N ° 38). These pairs of primers and associated probe, designed for the detection and quantification of the genus Legionella spp., Made it possible to obtain, with a sensitivity of 200 copies per reaction, specific real-time amplification curves of this genus on DNA extracts of L.
  • pneumophila serogroups 1 to 14 (14 collection strains and 9 strains of environmental origin), L. anisa, L. birminghamensis, L. bozemanii, L. brumensis, L. cherrii, L. multiplinatiensis , L. dumofii, L. feelei, L. gormanii, L. gratiana, L. hackeliae (2 strains), L. jamestowniensis, L. jordanis, L. longbeacheae serogroups 1 and 2, L. nagaro, L. oakridgensis, L parisiensis, L. santicrusis, L. sainthelensi, L. tucsonensis, L.
  • the size of the amplification product estimated by electrophoresis was in accordance with the expected size, namely 189 bp ( Figure 16, lane 4).
  • DNA from other microorganisms likely to be found in water such as Acanthamoeba polyphaga, Acinetobacter baumanii, Acinetobacter junii, Acinetobacter Iwofii, Aerococcus viridans, Alcaligenes faecalis, Bacillus subtilis, Bulkhoderia cepacia, Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Citrobacter freundii, Clostridium perfringens, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Enterococcus durans, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescus poccimusus Stocco
  • This second pair also drawn from the sequence of the gene coding for the 16S RNA of L. pneumophila subsp. pascullei (Genbank Accession Number: AF122885), includes the primers Lg69f (SEQ ID N ° 35) and Lg69r 5SEQ ID N ° 34, same as for the 1st couple), is associated with the Lg69TqFT probe (SEQ ID N ° 39) .
  • the size of the amplification product estimated by electrophoresis was in accordance with the expected size, namely 69 bp ( Figure 16, lane 3). Only the DNA of the species L. lansingensis, did not give rise to an amplification.
  • DNA from other genera likely to be found in water such as Acanthamoeba polyphaga, Acinetobacter baumanii, Acinetobacter junii, Acinetobacter Iwofii, Aerococcus viridans, Aeromonas hydrophila, Alcaligenes faecalis, Bacillus subtilis, Bulkhoderia cepacia, Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Citrobacter freundii, Clostridium perfringens, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Enterococcus durans, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas pscdomonas Psc Staphylococcus aureus, Staphylococcus gallina
  • the pair of primers includes the primers Lpn112f (SEQ ID N ° 36) and Lpn112r (SEQ ID N ° 37). It is associated with the Lpn112TqFT probe (SEQ ID No. 40).
  • the size of the amplification product estimated by electrophoresis was in accordance with the expected size, namely 112 bp ( Figure 16, lane 1).

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Abstract

L’invention concerne un procédé pour la détection, l’identification et, le cas échéant, la quantification des bactéries contenues dans un mélange complexe ou dans de l’eau, ledit procédé comprenant une étape d’amplifications multiples, simultanées mais séparées dans l’espace, de séquences d’acides nucléiques cibles spécifiques et exclusives. La présente invention a en outre pour objets des couples d’amorces pour amplification spécifiques et exclusifs, utiles à la mise en oeuvre dudit procédé, ainsi que des sondes nucléotidiques pour l’amplification en temps réel ou la détection de séquences d’acides nucléiques spécifiques et exclusives des bactéries contenues dans un mélange complexe ou dans de l’eau. L’invention concerne enfin des outis de biologie moléculaire, à savoir un kit d’analyse et des micro-réseaux ou puces à acides nucléiques pour la détection, l’identification et, le cas échéant, la quantification des bactéries contenues dans un mélange complexe ou dans de l’eau.

Description

PROCEDE ET SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES POUR LA DETECTION ET L'IDENTIFICATION DE MICROORGANISMES DANS UN MELANGE
COMPLEXE OU DANS L'EAU
La présente invention relève du domaine de l'analyse de la contamination d'échantillons d'origine agro-alimentaire ou issus de l'environnement par exemple.
Dans le contexte de l'invention, I' « analyse » de tels échantillons s'entend de la détection, l'identification et, le cas échéant, la quantification des microorganismes qu'ils contiennent.
En d'autres termes, l'invention s'inscrit dans le cadre de l'amélioration des procédures et l'élaboration de moyens efficaces aux fins de la détection, l'identification et, le cas échéant, la quantification des microorganismes contenus dans des échantillons complexes. Ainsi, l'invention vise à fournir une méthode mettant en œuvre des techniques de biologie moléculaire, ainsi que des outils connexes, adaptés à la détermination qualitative et/ou quantitative du contenu bactérien de mélanges complexes, notamment d'échantillons alimentaires. Un « mélange complexe » désigne, au sens de la présente invention, toute composition contenant notamment des cellules de bactéries, ladite composition pouvant être de nature hétérogène, tel un échantillon alimentaire brut, non modifié par dessiccation par exemple, qui rassemble plusieurs constituants différents dont certains se trouvent à l'état liquide et d'autres solide, ou de nature plus homogène, telle une culture bactérienne.
Dans le présent texte, on parlera indifféremment de bactéries présentes « dans de l'eau », « en milieu aqueux », ou « dans un milieu aqueux », étant entendu que cela désigne au sens large des bactéries présentes dans tout type de liquide aqueux. La présente invention concerne un procédé pour la détection, l'identification et, le cas échéant, la quantification de bactéries contenues dans un mélange complexe ou en milieu aqueux, ledit procédé comprenant une étape d'amplifications multiples, simultanées mais séparées dans l'espace, de séquences d'acides nucléiques cibles.
L'invention a en outre pour objets des couples d'amorces pour amplification utiles à la mise en œuvre dudit procédé, ainsi que des sondes nucléotidiques pour la détection et, le cas échéant, la quantification de séquences d'acides nucléiques de bactéries contenues dans un mélange complexe ou en milieu aqueux. Dans le cadre de l'invention, les sondes nucléotidiques peuvent être associées à des couples d'amorces pour amplification, aux fins de l'amplification en temps réel de séquences d'acides nucléiques cibles. Les sondes nucléotidiques peuvent également être utilisées pour la détection de séquences cibles selon des techniques d'hybridation ADN-ADN.
La présente invention concerne enfin des outils de biologie moléculaire, à savoir un kit d'analyse et des micro-réseaux ou puces à acides nucléiques pour la détection et l'identification de bactéries contenues dans un mélange complexe ou en milieu aqueux. Les bactéries ou microorganismes procaryotes sont remarquables pour l'hétérogénéité de leurs caractéristiques, en particulier en termes de forme (bacilles, coques...) ; habitat (sol, eau, hôtes vivants...) ; structure des enveloppes cellulaires (éventuelle présence d'une paroi, composition de ladite paroi, éventuelle présence d'une membrane externe) ; régime saprophyte, commensal ou parasite ; spectre d'hôtes dans le cas des commensaux et parasites ; profil de pathogénicité et éventuels caractères de résistance aux antibiotiques caractéristiques de certains parasites ; aptitude à transférer des séquences d'acides nucléiques au sein de l'espèce, du genre, voire vers des espèces appartenant à d'autres genres bactériens... Le plus souvent, ces propriétés présentent une spécificité au niveau du genre ou de l'espèce bactérienne. Cependant, elles peuvent également être soumises à une extrême variabilité entre souches d'une même espèce du fait de facteurs environnementaux et conditions de stress différents orientant lesdites souches vers des voies d'évolution adaptative distinctes. Au vu d'un tel niveau d'hétérogénéité des propriétés des bactéries, l'on mesure aisément les difficultés posées par le typage et l'identification clairs et formels desdites bactéries lorsqu'elles sont contenues dans des échantillons complexes parmi d'autres composants cellulaires.
Pourtant, il n'en demeure pas moins qu'une telle identification intéresse nombre d'activités. A ce titre, elle représente un défi aux enjeux considérables.
Dans le domaine médical, il est de première nécessité de disposer de procédures et moyens d'identification des bactéries optimaux en termes de fiabilité et pouvoir discriminant, ceci eu égard aux problèmes de santé publique générés par les infections bactériennes, notamment les infections par des bactéries multirésistantes aux antibiotiques, parfois très difficiles à enrayer. Aussi l'identification précise des bactéries jusqu'au niveau de l'espèce a-t-elle pour objectif de répondre à plusieurs attentes, non seulement du public mais également du personnel médical. Pour ce dernier, il s'agit en particulier de pouvoir : (i) diagnostiquer avec exactitude les pathologies des patients ; (ii) anticiper en matière de traitements, lesquels sont dès lors plus ciblés et mieux adaptés aux pathologies en cause ; (iii) prévenir et, le cas échéant, faire face à d'éventuelles rechutes ou récidives ; et (iv) approfondir les connaissances épidémiologiques relatives aux microorganismes pathogènes, notamment via la caractérisation des facteurs favorables au développement des infections.
Dans le domaine de la veille sanitaire, il convient de s'assurer de la qualité et l'innocuité des aliments disponibles sur le marché, en particulier afin d'écarter tout risque potentiel d'épidémie par contamination de masse. A cet égard, les consommateurs se sentent concernés par les questions relatives aux propriétés nutritionnelles des aliments, leurs saveurs, leur caractère inoffensif, et parfois même leurs éventuelles vertus prophylactiques ou thérapeutiques, avec le concept récent des « aliments- médicaments », dits « alicaments ». La tendance actuelle du public vise à exiger une parfaite transparence tout au long de la chaîne alimentaire, c'est-à-dire tant au niveau de la production des matières premières ou produits finis et la fabrication des produits intermédiaires, qu'au niveau de l'acheminement desdits matières premières ou produits finis et intermédiaires vers leur site de vente, et qu'au niveau de leur commercialisation ou leur utilisation dans le cadre de la préparation de produits plus complexes, tels les plats cuisinés. C'est pourquoi des normes de sécurité et qualité ont été édictées à l'attention des producteurs, fabricants, transporteurs, distributeurs et restaurateurs, normes dont le non- respect est sanctionné par des autorités spécialisées compétentes en matière de veille sanitaire, parmi lesquelles les experts vétérinaires et la Direction Générale de la Consommation, la Concurrence et la Répression des Fraudes. Ainsi, des contrôles sont effectués, de manière régulière ou sporadique, ponctuelle ou à plus grande échelle, afin de couvrir l'ensemble de la chaîne alimentaire, de la production jusqu'à la vente au particulier. A ce titre, il est fondamental de garantir qualité et fiabilité du contrôle microbiologique des aliments, s'agissant en particulier de la détermination du « niveau zéro » de contamination par des bactéries pathogènes pour l'homme et/ou les animaux.
Aux fins de la détection et l'identification des bactéries, l'on a longtemps fait appel à des procédés basés sur des réactions biochimiques permettant de mettre en évidence in vitro les caractéristiques phénotypiques et métaboliques propres aux souches testées. Cependant, ces méthodes conventionnelles montrent souvent une capacité limitée à identifier les bactéries jusqu'au niveau de l'espèce, en ce qu'elles reposent sur le résultat de réactions souvent aléatoires de métabolisation éventuellement fermentaire de diverses sources de nutriments, par exemple des sources de carbone et d'azote. En effet, l'identification phénotypique consiste à combiner et croiser les réponses des bactéries à une pluralité de tests biochimiques. En conséquence, lorsque certaines espèces ne répondent pas à un ou plusieurs desdits tests - ce qui est le cas de certaines espèces bactériennes qui, bien que pathogènes, sont rarement isolées en milieu hospitalier notamment - l'analyse devient hasardeuse et dépourvue d'objectivité. Aussi, pour en améliorer la spécificité et l'acuité, des tests complémentaires s'imposent, requérant alors temps, efforts et moyens parfois coûteux. En définitive, de tels procédés se révèlent longs et compliqués à mettre en œuvre, le résultat n'étant généralement obtenu qu'après 24 à 48 heures, et aléatoires en termes de spécificité et fiabilité. Certes, des systèmes commerciaux d'identification phénotypique, tels les galeries miniaturisées d'utilisation manuelle de la gamme API (bioMérieux, France) ou les cartes destinées à être ensemencées, incubées et lues au moyen d'un automate (VITEK®, bioMérieux, France), restent néanmoins utilisés en clinique et dans l'industrie. Cependant, les analyses en cause concernent des espèces bactériennes couramment isolées et faciles à cultiver. De plus, elles ne sont pas effectuées pour répondre à une urgence étant donné que les temps d'incubation requis par de tels systèmes atteignent souvent 24 heures.
Dans le but de développer des procédures conduisant à une discrimination rapide et correcte des bactéries, des approches alternatives aux traditionnels tests physiologiques ont été proposées.
Certaines de ces approches demeurent dans le domaine de la caractérisation phénotypique, par exemple les méthodes fondées sur des réactions avec des anticorps ou le typage bactériophagique en fonction du profil des récepteurs bactériens. Cependant, de telles méthodes sont d'une reproductibilité discutable eu égard à la variabilité d'expression des caractéristiques phénotypiques en question, telle l'expression des facteurs de virulence et des antigènes, sporadique car influencée dans une très large mesure par l'environnement et le stress. Quant aux autres procédures, elles ont été élaborées aux fins d'une discrimination non plus d'ordre phénotypique mais génotypique, c'est-à-dire au niveau des séquences d'acides nucléiques elles-mêmes et de leur organisation. Elles font à cet égard intervenir des techniques de biologie moléculaire (Gurtler et Mayall. 2001. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51(Pt 1) : 3-16).
En particulier, les méthodes de typage génétique revêtent un intérêt certain lorsque l'analyse concerne des pathogènes dont la manipulation est difficile et non-reproductible, du fait notamment d'une faible vitesse et d'une versatilité de croissance, ainsi que de l'absence de pré-requis spécifiques en termes de conditions de culture. De telles circonstances rendent les tests métaboliques tout à fait inappropriés (Versalovic et al. 1993. Arch. Pathol. Lab. Med. 117 : 1088-1098).
Nombre de techniques de biologie moléculaire mises en œuvre pour le typage et la caractérisation des bactéries reposent sur une séparation électrophorétique des produits issus de la digestion des acides nucléiques desdites bactéries, ces produits présentant, espère-t-on, des tailles moléculaires différentes de manière à obtenir des profils de migration aussi clairs et exploitables que possible. Parmi ces techniques, l'on distingue notamment l'électrophorèse en champ puisé (Pulse-Field Gel Electrophoresis ; PFGE), le polymorphisme de taille des fragments de restriction (Restriction Fragment Length Polymorphism ; RFLP) et le polymorphisme de taille des fragments issus du clivage par l'endonucléase Cleavase I (Cleavase l-Fragment Length Polymorphism ; CFLP) (Olive et Bean. 1999. J. Clin. Microbiol. 37 : 1661-1669).
Malgré le temps et les efforts nécessaires aux mise au point et mise en œuvre expérimentales, les profils de restriction ainsi générés s'avèrent souvent extrêmement complexes et ardus d'analyse et d'interprétation, requérant pour ce faire l'assistance de logiciels adaptés. Aussi les investissements imposés par la mise en œuvre de telles méthodes peuvent-ils être en définitive élevés, voire prohibitifs pour certaines structures, notamment les laboratoires et industries de petite envergure.
Plus simples et plus rapides, les réactions d'amplification, et notamment l'amplification par polymérisation en chaîne, plus communément appelée PCR (Polymerase Chain Reaction), permettent de caractériser des séquences d'acides nucléiques spécifiques d'espèces, en ciblant soit des gènes ubiquitaires tels ceux codant les ARN ribosomaux 16S ou les D-alanine:D-alanine ligases, enzymes pivots du métabolisme de la paroi bactérienne (Evers et al. 1996. J. Mol. Evol. 42 : 706-712), soit des espaces intergéniques telle la région située entre les ADN ribosomaux 16S et 23S (Gurtler et Stanisich. 1996. Microbiology 142 (Pt 1) : 3-16).
L'amplification passe par l'utilisation d'amorces nucléotidiques capables d'hybrider avec des séquences complémentaires présentes dans les molécules d'acides nucléiques servant de matrices. Il s'agit là d'une technique simple, facile à mettre en œuvre en routine, fiable et reproductible si les outils utilisés, notamment les amorces, l'ADN polymerase et, dans le cas des amplifications thermo-dépendantes, les conditions de température, sont eux-mêmes respectivement spécifiques, fidèle et adaptées. Dans le cadre de l'identification des bactéries, l'amplification, notamment la PCR, peut être appliquée seule ou, pour une différenciation plus fine des espèces, couplée à d'autres techniques, parmi lesquelles la détermination de la séquence des produits d'amplification, le RFLP et le polymorphisme de taille des produits d'amplification (Amplified Fragment Length Polymorphism ; AFLP) (Olive et Bean, 1999, supra). La mise en œuvre de ces dernières combinaisons de techniques, manifestement plus longue et plus lourde, n'est cependant pas nécessaire à l'établissement d'une analyse de routine.
En définitive, aux fins d'une telle analyse, qui doit être à la fois simple, rapide et efficace, la technique d'amplification peut se suffire à elle- même, pour autant que les moyens et outils utilisés répondent aux exigences de spécificité, fiabilité, reproductibilité et pouvoir discriminant évoquées supra. Une telle technique présente en outre l'avantage d'être particulièrement sensible et, en conséquence, de permettre de traiter de faibles volumes et/ou quantités d'acides nucléiques. Ainsi, compte-tenu des enjeux considérables en termes de santé et sécurité publique, il s'avère absolument nécessaire de développer des procédés de détection et identification des bactéries satisfaisant aux critères suivants, lesdits critères étant imposés par les exigences de mise en œuvre en routine rencontrées par les cliniciens, laboratoires de recherche et d'analyses, industries agroalimentaires et pharmaceutiques : (i) simplicité ; (ii) rapidité ; (iii) acuité ; (iv) fiabilité ; (v) reproductibilité ; (vi) performance, notamment au niveau du nombre d'échantillons susceptibles d'être traités simultanément ; (vii) coût ; et (viii) volume des installations.
La présente invention concerne donc un procédé de détection, identification et, le cas échéant, quantification des bactéries contenues dans un mélange complexe ou en milieu aqueux, ledit procédé remplissant l'ensemble des impératifs de mise en œuvre répertoriés ci-dessus. Ce procédé implique la réalisation d'au moins deux réactions d'amplification, simultanées mais séparées dans l'espace, d'au moins deux séquences d'acides nucléiques cibles spécifiques et exclusives d'au moins deux espèces, genres ou groupes bactériens distincts. A cet égard, ledit procédé comprend au moins les étapes suivantes : a) la mise en contact de l'échantillon d'acides nucléiques avec au moins deux couples d'amorces pour amplification et, le cas échéant, au moins deux sondes associées, chaque couple et chaque sonde associée audit couple étant spécifiques et exclusifs d'une séquence nucléotidique cible ; b) l'amplification des séquences nucléotidiques cibles, notamment par PCR en temps réel ; et c) la détection de la présence, l'identification et, le cas échéant, la quantification des bactéries contenues dans le mélange complexe ou dans l'eau de départ.
Dans le procédé ci-dessus, il est préférable que les différentes amplifications réalisées présentent des sensibilités comparables, afin de fournir des résultats exploitables concernant chacun des microorganismes visés. Par « sensibilité » d'une réaction d'amplification, on entendra ici le nombre de copies d'équivalents d'ADN génomique du microorganisme visé nécessaires dans une réaction PCR pour amplifier un signal. Lorsque le gène cible utilisé pour la détection du microorganisme est présent dans le génome de ce microorganisme en 1 exemplaire unique, comme cela est le cas pour les gènes cibles cités dans le présent texte, la quantification d'une séquence de ce gène cible correspond exactement au nombre de copies de l'ADN génomique du microorganisme recherché. Dans le procédé de l'invention, les amplifications des séquences nucléotidiques cibles, bien que séparées dans l'espace, sont a priori toutes réalisées dans les mêmes conditions, notamment en ce qui concerne le tampon dans lequel la réaction a lieu, les paramètres d'hybridation des amorces, les paramètres d'un éventuel thermocyclage, etc. Il est donc préférable, pour obtenir des réactions de sensibilités comparables, d'utiliser des couples d'amorces présentant des efficacités comparables, dans des conditions données d'amplification. Les conditions dans lesquelles la sensibilité de chaque réaction sera déterminée peuvent être, par exemple, celles décrites dans la première partie expérimentale ci-dessous. Alternativement, d'autres conditions expérimentales peuvent être employées, le point important étant que les mêmes conditions physicochimiques soient employées pour déterminer la sensibilité de toutes les réactions qui doivent se dérouler simultanément suivant le procédé de l'invention. Le cas échéant, lorsque des sondes associées sont utilisées, ces sondes doivent également présenter des efficacités d'hybridation comparables, dans des conditions données. Dans le cadre de la présente invention, on considérera que deux couples d'amorces (et, le cas échéant, deux sondes associées aux couples d'amorces) ont des efficacités comparables s'ils permettent, dans des conditions identiques, de détecter leurs séquences cibles avec des sensibilités ne différant pas plus que d'un facteur 100 ou mieux, pas plus que d'un facteur 50. Par commodité de langage, on dira alors qu'elles ont la « même sensibilité ».
Dans le procédé décrit ci-dessus, les différentes réactions d'amplification ont donc, de manière préférée, la même sensibilité, c'est-à- dire des sensibilités ne différant pas plus que d'un facteur 100.
Les amorces pour amplification et sondes associées objets de la présente invention ont été choisies à partir de séquences cibles issues de la littérature en application du critère suivant, dit de double spécificité, à savoir une spécificité de séquence et de taille. D'une part, la spécificité de séquence est telle que : (i) lesdites amorces et sondes associées pourraient être utilisées dans le cadre de réactions d'amplification de type multiplex, c'est-à-dire des réactions d'amplification multiples, simultanées et ayant lieu au sein d'un seul et même milieu réactionnel, et ce, sans risque d'obtenir des produits d'amplification secondaires non désirés, susceptibles de fausser l'analyse ; (ii) elles ne sont pas hybridables entre elles, ce qui prévient l'obtention de résultats faussement négatifs ; et (iii) elles sont spécifiques de séquences nucléotidiques elles-mêmes spécifiques d'espèces ou de genres, voire de groupes bactériens. D'autre part, la spécificité de taille des produits d'amplification générés permet d'attribuer sans ambiguïté, au moyen de méthodes analytiques conventionnelles connues de l'homme du métier, telle l'électrophorèse sur gel, chacun desdits produits à la bactérie dont il est issu. Dans une mise en œuvre préférée des procédés de la présente invention, les couples d'amorces utilisés sont donc spécifiques de séquences nucléotidiques elles-mêmes spécifiques d'espèces, de genres, ou de groupes bactériens, et choisis de telle sorte que les différentes amorces ne s'hybrident pas entre elles. Ils présentent, de plus, une spécificité de taille telle que décrite ci-dessus. Il convient toutefois de noter que cette spécificité de taille n'exclut pas que différents couples d'amorces, permettant l'amplification de produits de tailles très voisines, voire identiques, soient utilisés simultanément dans un procédé selon l'invention, comme cela est le cas pour certains des couples d'amorces décrits ci- après. Lesdites amorces pour amplification et sondes associées, en sus d'être spécifiques, sont également exclusives dans les conditions d'utilisation décrites dans le cadre de la présente invention. Cette « exclusivité » s'entend non seulement (i) à l'égard des espèces, genres voire groupes bactériens en présence, les amorces et sondes étant choisies de manière à éviter toute hybridation avec les acides nucléiques d'autres espèces, genres ou groupes bactériens que celui effectivement recherché, mais aussi (ii) vis-à-vis des séquences nucléotidiques de l'espèce, du genre ou du groupe cible, dans la mesure où lesdites amorces et sondes ne sont pas capables d'hybrider avec d'autres séquences que la séquence souhaitée. A ce titre, l'exclusivité des amorces pour amplification et sondes associées selon l'invention garantit l'obtention de résultats dépourvus de faux-positifs.
Dans une autre mise en œuvre préférée des procédés de l'invention, les amorces pour amplification et, le cas échéant, les sondes associées, sont donc exclusives au sens défini ci-dessus.
Les caractéristiques de « spécificité » et « exclusivité » sus-définies sont applicables non seulement aux amorces pour amplification et sondes associées, mais aussi aux séquences d'acides nucléiques cibles.
Dans le cadre de la présente description, l'on conviendra que les termes « espèces » ou « espèces bactériennes » pourront faire référence, selon les cas, à des espèces bactériennes proprement dites et conformément à l'usage taxonomique classique, ou à des genres bactériens, niveau de classification taxonomique immédiatement supérieur à l'espèce, ou encore à des groupes bactériens, lesdits groupes représentant soit des familles bactériennes telles que classiquement répertoriées dans le domaine de la systématique microbienne et correspondant au niveau de classification situé au-dessus du genre, soit des groupes de genres ou de familles de bactéries présentant un ou plusieurs caractères phénotypiques ou physiologiques communs. Par exemple, de tels groupes bactériens peuvent rassembler les bacilles par opposition aux coques, ou les organismes mésophiles (Le., les organismes dont la température optimale de croissance se situe entre 20 et 37 °C environ) par opposition aux organismes psychrophiles ou thermophiles (Le., les organismes dont la température optimale de croissance se situe respectivement entre 4 et 10 °C environ ou entre 45 et 60 °C environ), ou encore les bactéries saprophytes ( e., les bactéries vivant dans la nature de manière indépendante) par opposition aux bactéries commensales, symbiotiques ou parasites ( e., les bactéries vivant en association étroite avec les cellules hôtes, respectivement sans bénéfice ni désavantage pour les unes et les autres, ou tirant chacune bénéfice de cette association, ou encore dont seules les bactéries tirent bénéfice, ces dernières altérant généralement le métabolisme des cellules hôtes). L'homme du métier spécialisé en bactériologie est parfaitement à même de définir des groupes bactériens, en sus de ceux listés ci-dessus, sur la base de critères morphologiques et/ou phénotypiques et/ou physiologiques communs. Le sens à donner aux termes « espèces » ou « espèces bactériennes » ressortira clairement du contexte. En particulier, l'homme du métier pourra se référer au Tableau I infra pour savoir si les séquences nucléotidiques cibles des réactions d'amplification, et les séquences des amorces pour amplification et sondes associées selon l'invention, sont spécifiques et exclusives d'espèces, genres (Salmonella spp. par exemple) ou groupes bactériens (Escherichia coli, Shigella spp., Yersinia enterocolitica et Hafnia alvei par exemple).
Ainsi, un mode préféré de mise en œuvre du procédé objet de l'invention consiste à utiliser à titre de matrice un échantillon constitué d'acides nucléiques préalablement extraits et purifiés à partir des cellules de bactéries contenues dans un mélange complexe, notamment alimentaire, ou dans de l'eau, à l'aide d'un automate d'extraction. Un exemple d'un tel automate a été décrit dans la demande de brevet français N° 0204424 relative à un procédé d'extraction des acides nucléiques de microorganismes contenus dans un mélange complexe, notamment alimentaire, ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes :
1) la clarification du mélange par filtration ;
2) la rétention des microorganismes contenus dans le filtrat sur un dispositif de type cartouche de filtration ; 3) la lyse des microorganismes in situ ;
4) la récupération des acides nucléiques à partir de la cartouche de filtration ; et
5) la concentration et la purification des acides nucléiques par chromatographie d'adsorption liquide-solide, telle la chromatographie sur colonne de silice.
La demande N° 0204424 concerne également un automate capable de mettre en œuvre un tel procédé d'extraction.
Selon le procédé de détection objet de la présente invention, le terme « amplification » est revêtu d'un sens générique, en ce qu'il fait référence à toute technique de biologie moléculaire dont le principe consiste à amplifier ou multiplier de manière exponentielle une séquence d'acide nucléique cible. L'on peut citer à titre d'exemples non limitatifs, la
PCR, l'amplification par transcription (Transcription-Mediated Amplification ;
TMA), l'amplification basée sur des séquences d'acides nucléiques (Nucleic Acid Séquence Based Amplification ; NASBA), l'auto-réplication de séquences (Self-Sustained Séquence Replication ; 3SR), l'amplification par déplacement de brin (Strand Displacement Amplification ; SDA) et la réaction de ligature en chaîne (Ligase Chain Reaction ; LCR).
Il convient de noter que l'acronyme « PCR » peut être utilisé dans le cadre de la présente invention pour désigner de manière spécifique la réaction de PCR, ou de manière indifférente toute réaction d'amplification telle que celles sus-citées.
Les réactions d'amplification ainsi visées peuvent être isothermes ou nécessiter l'exposition cyclique à différentes températures. Selon cette dernière configuration, l'on parle avantageusement de réaction d'amplification « thermo-dépendante », bien que ce dernier terme puisse parfois être tacite, auquel cas l'homme du métier est à même de le déduire clairement et sans ambiguïté du contexte.
Selon un mode de réalisation de l'invention, l'amplification est effectuée aux fins d'une détection purement qualitative des bactéries contenues dans un mélange complexe ou dans de l'eau.
En revanche, selon un autre mode de réalisation, l'analyse effectuée conformément au procédé objet de l'invention est quantitative, en ce qu'elle permet de déterminer la concentration initiale de la séquence cible au sein de l'échantillon d'acides nucléiques. Il est alors fait appel aux techniques d'amplification dite « quantitative », « cinétique » ou « en temps réel » connues de l'homme du métier.
En particulier, ces techniques permettent de mesurer par fluorescence l'accumulation des produits au cours de la réaction d'amplification, l'intensité de la fluorescence émise étant proportionnelle à la quantité de molécules amplifiées. De nombreux systèmes de détection en temps réel des produits d'amplification PCR ont ainsi été développés, parmi lesquels l'on distingue les agents intercalants émettant un signal fluorescent lorsqu'ils sont liés à l'ADN double brin (« DNA binding dye »), les amorces fluorescentes, les sondes d'hybridation et les sondes d'hydrolyse (pour revue, voir Le Technoscope intitulé « La PCR en temps réel », cahier N°139, dans la revue Biofutur N°219 de février 2002). Parmi les systèmes les plus utilisés, figurent notamment les sondes d'hydrolyse de type TaqMan™ (ABI®, Foster City, CA, Etats-Unis). Ces sondes comptent entre 25 et 35 nucléotides environ, et portent un fluorophore au niveau de leur extrémité 5' et un absorbeur de fluorescence (ci-après « quencheur ») à l'extrémité 3'. Le quencheur, placé à faible distance du fluorophore, absorbe la fluorescence émise par celui-ci et émet une fluorescence qui n'est pas détectée par l'automate PCR. A titre d'exemple, le 5-TAMRA, qui ré-émet à 568 nm peut être inhibé. La Taq DNA polymerase (ci-après « Taq polymerase »), de par son activité exonucléase dans le sens 5' vers 3', va dégrader la sonde hybridée à la région de la séquence cible qui lui est complémentaire. Cette dégradation est effectuée par l'enzyme de manière séquentielle, à partir de l'extrémité 5' de la sonde. C'est précisément ce processus de dégradation par hydrolyse de la sonde qui est à l'origine de la fluorescence émise, le fluorophore étant ainsi physiquement séparé du quencheur par un mécanisme impliquant directement la séquence à détecter.
Brièvement, lors de l'étape d'hybridation de la réaction PCR, les amorces pour amplification et la « sonde associée » reconnaissent leur séquence complémentaire. La Taq polymerase procède ensuite à l'extension des amorces dans le sens 5' vers 3' jusqu'à rencontrer la structure double brin formée par la région de la séquence cible hybridée avec la sonde. L'activité exonucléase de 5' vers 3' de l'enzyme clive alors séquentiellement la sonde à partir de son extrémité 5'. Cette hydrolyse progressive libère le fluorophore dans le milieu réactionnel, ce qui entraîne une augmentation de la fluorescence émise. La mesure de la fluorescence au terme de chaque étape d'extension de la réaction PCR permet de suivre l'évolution de la réaction au cours du temps et de déterminer la concentration initiale en acides nucléiques cibles dans l'échantillon de départ. L'on peut également citer à titre purement illustratif les balises moléculaires (« molecular beacons »), appartenant au groupe des sondes d'hybridation. Ces balises portent un fluorophore et un quencheur, respectivement situés aux extrémités 5' et 3' des sondes. Les séquences des extrémités 5' et 3' des sondes sont dessinées indépendamment de la séquence cible et sont mutuellement complémentaires, afin de former en solution une structure tige-boucle, ou structure en épingle à cheveux, dans laquelle fluorophore et quencheur sont situés en vis-à-vis. La région centrale des sondes est complémentaire d'une région interne de la séquence cible, et forme la boucle de cette structure. En présence de la séquence cible, les sondes s'hybrident à leur séquence complémentaire par leur partie centrale, ce qui provoque le déploiement de la structure repliée des sondes. Le fluorophore est alors séparé du quencheur. A la différence de la chimie TaqMan™, la fluorescence émise doit être mesurée durant l'étape d'hybridation, lorsque les sondes émettent un signal fluorescent en se liant à la région de la séquence cible qui leur est complémentaire.
Au sens de la présente invention, le terme « analyse » ainsi que l'expression « détection de bactéries » sont susceptibles de signifier à la fois détection, identification et, le cas échéant, quantification desdites bactéries. Un tel sens ressort pour l'homme du métier clairement et sans équivoque du contexte.
La présente invention concerne un procédé d'amplifications « multiples, simultanées mais séparées dans l'espace » dans la mesure où se déroulent, non pas une réaction d'amplification à l'aide d'un « trio » unique comprenant un couple d'amorces et une sonde associée, mais plusieurs réactions concomitantes d'amplification de plusieurs séquences cibles différentes présentes dans le même échantillon, lesdites réactions étant telles que : (i) elles mettent en jeu plusieurs « trios » distincts associant couples d'amorces et sondes ; (ii) à chaque couple d'amorces et sonde associée est assigné un espace réactionnel particulier ; et (iii) chaque réaction d'amplification est effectuée au sein d'un milieu réactionnel spécifique, contenu dans ledit espace. Comme mentionné ci-dessus, les différents « trios » impliqués dans un procédé selon l'invention, constitués chacun d'un couple d'amorces et d'une sonde associée, sont de préférence choisis de façon à permettre l'amplification et la détection de leur cible avec des sensibilités comparables, dans des conditions identiques d'amplification.
Avantageusement, l'espace dans lequel est effectuée chaque réaction est une chambre réactionnelle d'une cartouche à usage unique décrite dans la demande de brevet US n°09/981070 bénéficiant de la priorité de la demande de brevet français publiée le 1er février 2002 sous le numéro 2812306. Par exemple, une telle cartouche comprend notamment une pluralité de chambres réactionnelles, chacune contenant un couple d'amorces et une sonde associée pour l'amplification de séquences nucléotidiques cibles, auxquelles se trouve relié un réservoir d'alimentation en échantillon d'acides nucléiques servant de matrices lors des amplifications multiples, simultanées mais séparées dans l'espace. Le nombre de chambres réactionnelles peut varier de 20 à 500 environ, ou de 30 à 100 environ. Par exemple, le Genedisc®, commercialisé par GeneSystems (Bruz, France), comprend 36 chambres réactionnelles.
Cette cartouche est utilisable dans un dispositif de type automate pour l'amplification de séquences d'acides nucléiques, ledit dispositif comprenant, outre la ou les cartouches elles-mêmes, au moins une platine de chauffage dont au moins deux zones distinctes peuvent être portées à au moins deux températures différentes et maintenues constantes, chaque température correspondant ainsi à une étape donnée d'un cycle d'amplification, à savoir l'étape de dénaturation, d'hybridation ou d'élongation, ainsi que des moyens de déplacement relatif entre la ou les cartouches et la ou les platines, ledit déplacement assurant une exposition cyclique des chambres réactionnelles d'une cartouche à la température de chacune des zones d'une platine, ce qui permet d'enchaîner automatiquement les cycles de la réaction d'amplification se déroulant à l'intérieur desdites chambres. Au sens de l'invention, le terme « plusieurs » s'entend comme étant synonyme des expressions, elles-mêmes équivalentes, « au moins deux » et « deux ou plus ».
Les « acides nucléiques » couvrent, selon l'acception usuelle, les ADN et les ARN, les premiers pouvant être par exemple génomiques, plasmidiques, recombinants, complémentaires (ADNc), et les seconds, messagers (ARNm), ribosomaux (ARNr), de transfert (ARNt).
Les réactions d'amplification sont applicables tant aux ADN qu'aux ARN, moyennant dans le second cas, l'introduction d'une étape préliminaire de transcription inverse, fournissant une copie de l'ARN sous la forme d'un ADNc et générant par là-même une matrice utilisable aux fins de l'amplification à l'aide des couples d'amorces nucléotidiques choisis et, le cas échéant, des sondes associées auxdits couples. En ce cas, la réaction d'amplification est connue de l'homme du métier sous l'acronyme RT-PCR (Reverse Transcription - PCR). Elle figure parmi l'ensemble des réactions regroupées, conformément à la définition supra, sous la dénomination « amplification » ou « PCR ».
D'après le vocabulaire usuel en matière de PCR, les séquences d'acides nucléiques à amplifier sont dites « cibles » ou « matrices ». Comme précisé supra, dans le contexte particulier de la présente invention, lesdites séquences sont revêtues des propriétés de spécificité et exclusivité telles que définies supra.
Ainsi, selon le procédé objet de la présente invention, les séquences d'acides nucléiques cibles sont amplifiées à l'aide de couples d'amorces nucléotidiques spécifiques et exclusives, l'expression « amorce spécifique et exclusive » désignant en l'espèce toute séquence nucléotidique utile comme amorce pour amplification et capable d'hybrider en conditions strictes avec au moins 80 % des séquences d'acides nucléiques cibles. Les « conditions strictes d'hybridation » obéissent à la définition classique et sont connues de l'homme du métier (Sambrook et Russel. 2001. Molecular cloning : a laboratory manual, 3rd éd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) Des « conditions strictes d'hybridation » sont, par exemple, des conditions permettant l'hybridation spécifique de deux séquences d'ADN simple brin, et ce, après au moins une étape de lavage. L'étape d'hybridation peut notamment être réalisée à environ 65 °C, dans une solution comprenant du SSC 6X, du SDS 0,5 %, de la solution de Denhardt 5X et 100 μg d'ADN non spécifique (par exemple de l'ADN de sperme de saumon), ou dans toute autre solution de force ionique équivalente. L'étape suivante, comprenant au moins un lavage, est par exemple effectuée à environ 65 °C, dans une solution comprenant du SSC à au plus 0,2X et du SDS à au plus 0,1 %, ou dans toute autre solution de force ionique équivalente. Les paramètres définissant les conditions d'hybridation dépendent de la température Tm à laquelle 50 % des brins appariés se séparent. S'agissant des séquences de plus de 30 bases, la température Tm est définie par la relation : Tm = 81 ,5 + 0,41x(% G+C) + 16,6xLog(concentration en cations) - 0,63x(% formamide) - (600/nombre de bases). Pour les séquences de moins de 30 bases, la température Tm est définie par la relation : Tm = 4x(nombre de G+C) + 2x(nombre de A+T). Les conditions d'hybridation peuvent donc être adaptées par l'homme du métier selon la taille des séquences, la teneur en GC et d'autres paramètres, comme indiqué notamment dans les protocoles décrits dans Sambrook et Russel (2001 , supra).
Dans la suite du présent texte, les amorces et les sondes seront de préférences définies par leur pourcentage d'identité avec les séquences décrites. Plusieurs logiciels existent pour calculer le pourcentage d'identité entre deux séquences, au nombre desquels figure le logiciel BLAST, qui peut être utilisé ici. En particulier, la version 2.06 peut être utilisée, de même que la version standard d'alignement de nucléotides disponible sur le site de la NCBI ou, pour les séquences entre 7 et 20 nucléotides, la version spécifique pour les séquences courtes, disponible sur ce même site (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Les séquences similaires ainsi envisagées peuvent être de la même longueur que les séquences décrites dans le présent texte et dans le Tableau I, ou d'une longueur différente, alors comprise de préférence entre 15 et 35 bases.
Les termes et expressions « amorces », « amorces pour amplification » et « amorces nucléotidiques » sont équivalents au sens de la présente invention. Il est entendu que les amorces ainsi désignées sont nécessairement spécifiques et exclusives, même si tel n'est pas toujours explicitement précisé dans le texte.
La présente demande décrit notamment des couples d'amorces spécifiques de certains micro-organismes, et utilisables dans certaines conditions. Il est bien évident qu'un couple d'amorces correspondant aux séquences réverses complémentaires de chacune des amorces d'un couple d'amorces décrit dans la présente demande peut être utilisé en lieu et place dudit couple d'amorces. Un tel couple d'amorces sera dit « couple d'amorces réverse complémentaire » du premier couple. De manière préférée, le procédé selon la présente invention conduit à la détection de bactéries pathogènes de mammifères, hommes et/ou animaux. En particulier, ledit procédé permet de détecter la présence éventuelle de plusieurs espèces bactériennes parmi les agents infectieux pathogènes suivants : Escherichia coli et ou Shigella spp. et ou Hafnia alvei et/ou Yersinia enterocolitica, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Salmonella spp., Bacillus cereus, Clostridium perfringens, Y. enterocolitica, Campylobacter jejuni, et Legionella spp., notamment Legionella pneumophila. Ces espèces bactériennes figurent, pour l'essentiel, parmi les contaminants alimentaires et les contaminants de l'eau les plus fréquents et les plus préoccupants eu égard à leur pathogénicité et leur résistance, voire leur multirésistance vis-à-vis des antibiotiques courants.
S'agissant de H. alvei, cette entérobactérie, bien que rare, peut néanmoins être à l'origine de l'altération de certains aliments, notamment des viandes emballées sous une atmosphère pauvre en oxygène. En outre, H. alvei est difficile à identifier par les méthodes conventionnelles et fréquemment confondue avec des Salmonelles par exemple. La présente invention permet précisément de discriminer de façon simple et rapide H. alvei de Salmonella spp..
Pour la plupart, ces bactéries sont pathogènes et provoquent des troubles gastro-intestinaux (diarrhées, vomissements...), parfois sévères et éventuellement accompagnés de fièvres. Elles représentent à cet égard un danger particulier pour les femmes enceintes, les jeunes enfants et les personnes âgées notamment, danger qu'il convient d'écarter par des mesures au besoin drastiques, comme l'atteste le fait que ces dernières années ont vu se multiplier les campagnes de retrait d'aliments, en particulier de fromages au lait cru, dans lesquels les concentrations en Listeria monocytogenes ou Salmonella spp. dépassaient les seuils normatifs tolérés.
Les bactéries du genre Legionella spp. sont plutôt présentes dans l'eau (eaux de boisson, eaux chaudes et froides sanitaires, eaux de tours aéroréfrigérantes, eaux de surface, eaux souterraines), et ont été responsables d'infections nosocomiales ou chez des personnes fréquentant certains établissements thermaux, entraînant la fermeture provisoire desdits établissements. Il est donc important de pouvoir détecter facilement et rapidement une éventuelle contamination de l'eau par des legionelles.
Afin de détecter les espèces bactériennes sus-visées, les couples d'amorces et sondes associées ci-après ont été choisis ou dessinés de manière à remplir les conditions de spécificité et d'exclusivité requises dans le cadre de la mise en œuvre du procédé objet de l'invention et en particulier, de l'étape d'amplifications multiples, simultanées mais séparées dans l'espace. De plus, ils ont été choisis de manière à permettre la détection de leurs séquences cibles avec une sensibilité identique ou au moins comparable dans des conditions données d'amplification, c'est-à-dire que dans de telles conditions, les sensibilités des différentes réactions ne diffèrent pas plus que d'un facteur 100, de préférence pas plus que d'un facteur 50.
Avantageusement, les séquences nucléotidiques dessinées pour E. coli permettent également d'identifier H. alvei, et par-là même de distinguer cette espèce bactérienne des Salmonelles, avec lesquelles elle est généralement confondue.
Le cas échéant, la discrimination ultérieure entre E. coli et H. alvei peut être effectuée par détermination du type de nitrate reductase, la majorité des entérobactéries, dont E. coli, possédant une nitrate reductase du type A, alors que H. alvei possède une nitrate reductase du type B (pour la procédure à suivre aux fins de cette détermination, voir Marchai et al. 1982. In Les milieux de culture pour l'isolement et l'identification biochimique des bactéries. Doin Editeurs, Paris, France).
Les séquences dessinées pour E. coli permettent, outre H. alvei, de détecter également Shigella spp. et Y. enterocolitica.
Cependant, la distinction entre E. coli, Shigella spp. et H. alvei d'une part, et Y. enterocolitica d'autre part, est assurée par l'utilisation des séquences nucléotidiques spécifiques et exclusives de cette dernière espèce bactérienne. Par ailleurs, la discrimination entre E. coli, Shigella spp. et H. alvei peut être effectuée sur la base de. critères biochimiques tels que celui susmentionné et, par exemple, en utilisant des tests commerciaux de type Galerie API20E (bioMérieux, supra).
Le couple d'amorces (LmHlyAf ; LmHlyAr) a été décrit par Nogva et al. (2000. Appl. Environ. Microb. 66 : 4266-4271). Les couples d'amorces (Ye86f ; Ye86r), (Ec97f ; Ec97r), (Se98f ; Se98r), (Sa193f ; Sa193r), (Bc84f ; Bc84r), (Cp97f ; Cp97r) et (Cju76f ; Cju76r) ont été dessinés aux fins de la présente invention d'après les séquences génomiques respectivement publiées et déposées dans GenBank par Ibrahim et al. (1997. J. Clin. Microbiol. 35 : 1636-1638 ; N° d'accès X65999), Smith et al. (1992. J. Bacteriol. 174 : 5820-5826 ; N° d'accès M84024), Bâumler et al. (1996. Gène 183 : 207-213 ; N° d'accès U62129), Shortle (1983. Gène 22 : 181-189 ; N° d'accès V01281), Gilmore ét al. (1989. J. Bacteriol. 171 : 744- 753 ; N° d'accès M24149), Saint-Joanis ét al. (1989. Mol. Gen. Genêt. 219 : 453-460 ; N° d'accès X17300) et Taylor et al. (1990. Mol. Cell. Probes 4 : 261-271 ; N° d'accès U27272). Les couples d'amorces (Lg189f ; Lg69r), (Lg69f ; Lg69r), et (Lpn112f ; Lpn112r) ont été dessinés aux fins de la présente invention d'après les séquences génomiques respectivement déposées dans GenBank sous les numéros AF122885 (pour les deux premiers couples) et Y12705. Le Tableau I suivant détaille, pour chaque bactérie, les caractéristiques des couples d'amorces et sondes associées, ainsi que des produits d'amplification générés au moyen desdits couples. Dans ce Tableau, les séquences SEQ ID N°17 à 24, dont le nom porte l'extension « TqFT », correspondent aux sondes associées aux couples d'amorces pour amplification, lesdites sondes étant par exemple de type TaqMan™ (supra).
Il est entendu que toute séquence hybridable en conditions strictes à au moins 80 % avec les séquences des sondes figurant dans le Tableau I, ou toute séquence présentant au moins 80% d'identité avec une telle sonde ou sa séquence réverse complémentaire, et répondant aux critères de spécificité et exclusivité de séquence donnés supra, est susceptible d'être utilisée, dans le cadre de la présente invention, comme sonde.
De même, il est clair que toute séquence nucléotidique présentant au moins 80% d'identité avec une des amorces listées dans le Tableau I ou sa séquence réverse complémentaire, est susceptible d'être utilisée comme amorce pour amplification conformément à l'invention, ainsi qu'une amorce sélectionnée d'après la séquence du même gène spécifique de l'espèce considérée, mais décalée, par rapport à une des amorces listées dans le Tableau I ou sa séquence réverse complémentaire. En effet, il est aisé, pour l'homme du métier disposant d'une séquence d'un couple d'amorces répondant aux critères de double spécificité, d'exclusivité, et de compatibilité avec d'autres couples d'amorces énumérés ci-dessus, et disposant également de la séquence du gène visé, de choisir une autre séquence d'amorce dérivée de celle mentionnée dans le Tableau I par un décalage de quelques bases sur la séquence visée.
TABLEAU I
Taille des
Désignation des
SEQ Gène produits
Bactérie amorces et Séquence Produit du gène DD N° cible d'amplification sondes
(Pb)
LmHlyAf 5 ' CCTgCAAgTCCTAAgACgCCA 3 ' 1
Listeria
LmHlyAr 5 ' CACTgCATCTCCgTggTATAC 3 ' 2 HlyA Listériolysine O 113 monocytogenes
Lml 13TqFT 5' CgATTTCATCCgCgTgTTTCTTTTCg 3' 17
Ye86f 5' CAgTgATgCATTATCgACACC 3 ' 3 86
Yersinia
Ye86r 5 ' CACTACTgACTTCggCTggT 3 ' 4 Yst enterotoxine enterocolitica
Ye86TqFT 5' CAAgCAAgCTTgTgATCCTCCgC 3' 18
Escherichia coli Ec97f 5' CgACCTgCgTTgCgTAAATATg 3' 5
GAD et/ou Hafiiia alvei Ec97r 5' CCTCggAAgAACCAATggTgT 3 ' 6 glutamate décarboxylase 97 et/ou Shigella spp. Ec97TqFT 5' CCgAAAAATggTCAggCCgTTg 3' 19 et/ou Yersinia ND ND enterocolitica
Se98f 5 ' TggACCACTgATTgCCgCTA 3 ' 7
Salmonella spp. Se98r 5 ' gTgATTTCgTCACgCCTTTg 3 ' 8 IroB glucosyl-transferase 98
Se98TqFT 5' CTTCggTCATACgCCCTggCAC 3 ' 20
Sal93f 5' ATggACgTggCTTAgCgTAT 3' 9
Staphylococcus
Sal93r 5' TgACCTgAATCAgCgTTgTC 3' 10 Nue nucléase 193 aureus
Sal93TqFT 5' TCgTCAAggCTTggCTAAAgTTgC 3' 21
Bacillus cereus Bc84f 5' gATTggTTCgTAAgAgCAgCTg 3' 11 CerA phospholipase C 84
Bc84r 5' AACgCTTACCTgTCATTggTg 3 ' 12
Bc84TqFT 5' TgCAgATAAATggCgCgCTgAAg 3 ' 22
Cp97f 5 ' CTATCTTggAgAAgCTATgCAC 3 ' 13
Clostridium toxine alpha ou
Cρ97r 5 ' gTCTCAAACTTAACATgTCCTg 3 ' 14 PLC 97 perfringens phospholipase C
Cp97TqFT 5' CATCCTgCTAATgTTACTgCCgTTg 3' 23
Cju76f 5' CTTgCAAATCgTTCTTTggg 3' 15 76
Campylobacter
Cju76r 5' TAgCggTACgACTgTCTTgg 3' 16 ND ND jejuni
Cju76TqFT 5' TCAAACCCTAACCTCAgCTCCAgC 3 ' 24
Lgl 89f 5' - GCAGCAAACGCGATAAGTTG -3' 33
16S
Legionella spp. Lg69r 5' - CAGTGTTCCCGAAGGCACTA -3 ' 34 rDNA ARN 16S 189
Lgl89TqFT 5'- CCCTTGACATACAGTGGATTTTGCA -3' 38
Lg69f 5' - GCAACGCGAAGAACCTTACC -3' 35
16S
Legionella spp. Lg69r 5 ' - CAGTGTTCCCGAAGGCACTA -3 ' 34 ARN 16S 69 rDNA
Lg69TqFT 5 '- CATACAGTGGATTTTGCAGAGATGCA -3 ' 39
Lpnll2f 5' - TCAGAAACGGGTTTGCTACC -3' 36
Legionella Lpnll2r 5' - CTAGTAACGCCCCTTCAGAC -3' 37 icmS IcmS 112 pneumophila Lpnll2TqFT 5'- CCATTGCCAAGAGAGCGGATC -3' 40
ND, non déterminé.
Selon un mode de mise en oeuvre préféré du procédé objet de la présente invention, l'étape b) relative aux amplifications multiples, simultanées mais séparées dans l'espace, des séquences nucléotidiques cibles est du type thermo-dépendante, telle la PCR en temps réel. En ce cas, un cycle d'amplification comprend au moins les sous-étapes suivantes : b1) l'étape de dénaturation, au cours de laquelle l'ADN double brin est séparé en deux molécules d'ADN simple brin, est effectuée entre 94 et 95 °C, ou entre 94 et 98°C, de préférence à environ 94, 95 ou 96°C, pendant 15 secondes à 1 minute, de préférence pendant 30 secondes ; b2) l'étape d'hybridation, permettant d'apparier aux acides nucléiques simple brin complémentaires, lesquels serviront de matrices dans l'étape suivante, les amorces nucléotidiques spécifiques et, le cas échéant, la sonde associée, est réalisée entre 55 et 62 °C, de préférence à environ 60 °C, la température de cette étape étant en tous les cas dictée par les séquences des couples d'amorces pour amplification et sondes associées (cf. la définition de la température Tm supra), pendant 15 secondes à 1 minute, de préférence pendant 30 secondes ; et b3) l'étape d'élongation, conduisant à la réplication de la ou des matrices, est mise en oeuvre entre 55 ou 60 °C et 72 °C, pendant 15 secondes à 2 minutes, de préférence pendant 30 secondes environ.
Avantageusement, l'étape b) du procédé objet de l'invention comprend, outre les sous-étapes b1) à b3) susvisées, une sous-étape préliminaire bO) d'activation de la Taq polymerase à une température de 94 °C environ, pendant 3 à 15 minutes, de préférence pendant 3 à 5 minutes. Cette étape bO) est facultative, mais devient requise si la Taq polymerase utilisée est une enzyme dite « Hot start », telle la Platinum™ Taq DNA Polymerase (Invitrogen™ Life Technologies, Invitrogen, Cergy Pontoise, France). De manière générale, les sous-étapes b1) à b3) supra subissent au moins 40 cycles d'amplification. La présente invention a en outre pour objets des couples d'amorces pour amplification utiles à la mise en œuvre du procédé décrit ci-dessus pour la détection de séquences d'acides nucléiques spécifiques et exclusives de bactéries contenues dans un mélange complexe. Lesdits couples d'amorces permettent l'amplification de fragments d'acides nucléiques spécifiques et exclusifs de Y. enterocolitica, E. coli et/ou H. alvei et/ou Shigella spp. et/ou Y. enterocolitica, Salmonella spp., S. aureus, B. cereus, C. perfringens, C. jejuni, Legionella spp. et L. pneumophila et sont constitués par des séquences choisies parmi les amorces suivantes :
Ye86f (SEQ ID N°3) et Ye86r (SEQ ID N°4) pour Y. enterocolitica ;
Ec97f (SEQ ID N°5) et Ec97r (SEQ ID N°6) pour E. coli et/ou H. alvei et/ou Shigella spp. et/ou Y. enterocolitica ; - Se98f (SEQ ID N°7) et Se98r (SEQ ID N°8) pour
Salmonella spp. ;
Sa193f (SEQ ID N°9) et Sa193r (SEQ ID N°10) pour S. aureus ;
Bc84f (SEQ ID N°11) et Bc84r (SEQ ID N°12) pour B. cereus ;
Cp97f (SEQ ID N°13) et Cp97r (SEQ ID N°14) pour C. perfringens ;
Cju76f (SEQ ID N°15) et Cju76r (SEQ ID N°16) pour C. jejuni ; et - Lg189f (SEQ ID N°33) et Lg69r (SEQ ID N°34) pour
Legionella spp. ;
Lg69f (SEQ ID N°35) et Lg69r (SEQ ID N°34) pour Legionella spp. ; et
Lpn112f (SEQ ID N°36) et Lpn112r (SEQ ID N°37) pour Legionella pneumophila. Comme indiqué précédemment, l'on considère en outre que toute séquence présentant au moins 80 % d'identité avec l'une des séquences nucléotidiques sus-visées, ou avec sa séquence réverse complémentaire, constitue une amorce spécifique et exclusive convenant à une utilisation dans le cadre d'un procédé de détection des espèces bactériennes simple, rapide et fiable, et en particulier dans le cadre du procédé objet de l'invention. Il est important de noter que les couples d'amorces cités ci- dessus, avantageusement utilisables dans le cadre des procédés de l'invention, ne sont nullement limités dans leur utilisation, et sont également utilisables dans le cadre d'autres procédés, notamment de tout procédé impliquant des réactions d'amplification.
En outre, la présente invention a pour objets des sondes nucléotidiques pouvant être, selon les modes de réalisation, associées à des couples d'amorces pour amplification tels que ceux décrits ci-dessus, aux fins de l'amplification en temps réel de séquences d'acides nucléiques cibles, ou utilisées pour la détection de séquences cibles selon des techniques d'hybridation ADN-ADN.
Ainsi, selon un premier mode de réalisation des sondes objets de l'invention, celles-ci sont aptes à être utilisées dans le cadre de réactions d'amplification en temps réel, conformément aux principes de la chimie TaqMan™ (supra) ou des balises moléculaires évoqués précédemment et connus de l'homme du métier. En particulier, lesdites sondes sont des oligonucléotides de type TaqMan™ (supra), marqués en 5' par un fluorophore, telle la 6-méthylfluorescéine (FAM), et en 3' par un quencheur, telle la tétraméthylrhodamine (TAMRA), dont les séquences, spécifiques et exclusives d'espèces bactériennes, sont choisies parmi :
Lm113TqFT (SEQ ID N°17) pour L monocytogenes ; Ye86TqFT (SEQ ID N°18) pour Y. enterocolitica ; Ec97TqFT (SEQ ID N°19) pour E. coli et ou H. alvei et/ou Shigella spp. et/ou Y. enterocolitica ;
Se98TqFT (SEQ ID N°20) pour Salmonella spp. ; Sa193TqFT (SEQ ID N°21) pour S. aureus ; Bc84TqFT (SEQ ID N°22) pour β. cereus ; Cp97TqFT (SEQ ID N°23) pour C. perfringens ; Cju76TqFT (SEQ ID N°24) pour C. jejuni ; - Lg189TqFT (SEQ ID N°38) pour Legionella spp. ;
Lg69TqFT (SEQ ID N°39) pour Legionella spp. ; Lpn112TqFT (SEQ ID N°40) pour Legionella pneumophila ; et toute séquence hybridable en conditions strictes à au moins 80 % avec les séquences ci-dessus, ou toute séquence présentant au moins 80 % d'identité avec lesdites séquences SEQ ID 17 à 24 et 38 à 40 ou avec leurs séquences réverses complémentaires.
De préférence, les sondes sus-citées sont utilisées en association avec les couples d'amorces pour amplification décrits ci-dessus. Un autre objet de l'invention est d'ailleurs ensemble d'acides nucléiques comportant un ou plusieurs couple(s) d'amorces et sonde(s) y associée(s), tels que les couples d'amorces spécifiques de micro-organismes et les sondes correspondantes décrits ci-dessus. Bien entendu, dans ces ensembles d'acides nucléiques, un couple d'amorces peut être remplacé par son couple d'amorces réverse complémentaire, et la sonde peut être remplacée par sa séquence réverse complémentaire, le remplacement du couple d'amorces ou de la sonde étant indépendants l'un de l'autre. Des amorces ou sondes présentant au moins 80% d'identité avec les séquences décrites dans la présente demande, ou avec leurs séquences réverses complémentaires, sont également utilisables.
Selon un autre mode de réalisation des sondes nucléotidiques objets de la présente invention, celles-ci sont utiles pour la détection de séquences d'acides nucléiques spécifiques et exclusives de bactéries contenues dans un mélange complexe ou dans de l'eau. Lesdites sondes, marquées chimiquement (à froid) ou radioactivement (à chaud), permettent alors la mise en œuvre de procédures d'hybridation telles l'hybridation Southern, l'hybridation sur colonies et l'hybridation sur dépôts en points (Dot Blot) (Sambrook et Russel, 2001 , supra). Ces techniques d'hybridation, couramment utilisées tant en laboratoire que dans l'industrie, font à ce titre partie des connaissances générales de l'homme du métier.
Ainsi, les sondes nucléotidiques objets de l'invention permettent la détection de fragments d'acides nucléiques spécifiques et exclusifs de Y. enterocolitica, E. coli et/ou H. alvei et/ou Shigella spp. et/ou Y. enterocolitica, Salmonella spp., S. aureus, B. cereus, C. perfringens, C. jejuni, Legionella spp. et L. pneumophila.
Selon un premier aspect de ce mode de réalisation, lesdites sondes sont constituées par les produits d'amplification susceptibles d'être obtenus à l'aide des couples d'amorces choisis parmi :
Ye86f (SEQ ID N°3) et Ye86r (SEQ ID N°4) pour Y. enterocolitica ;
Ec97f (SEQ ID N°5) et Ec97r (SEQ ID N°6) pour E. coli et/ou H. alvei et/ou Shigella spp. et/ou Y. enterocolitica ; Se98f (SEQ ID N°7) et Se98r (SEQ ID N°8) pour Salmonella spp. ; - Sa193f (SEQ ID N°9) et Sa193r (SEQ ID N°10) pour S. aureus ;
Bc84f (SEQ ID N°11) et Bc84r (SEQ ID N°12) pour R cereus ;
Cp97f (SEQ ID N°13) et Cp97r (SEQ ID N°14) pour C. perfringens ; et
Cju76f (SEQ ID N°15) et Cju76r (SEQ ID N°16) pour C. jejuni ;
Lg189f (SEQ ID N°33) et Lg69r (SEQ ID N°34) pour Legionella spp. ; - Lg69f (SEQ ID N°35) et Lg69r (SEQ ID N°34) pour
Legionella spp. ; Lpn112f (SEQ ID N°36) et Lpn112r (SEQ ID N°37) pour Legionella pneumophila ; tout couple d'amorces réverse complémentaire des couples ci-dessus ; et - tout couple d'amorces comportant au moins une amorce de séquence hybridable en conditions strictes à au moins 80 % avec les séquences ci-dessus, ou de séquence présentant au moins 80% d'identité avec elles.
Dans le cadre de la présente invention I les séquences génomiques respectivement publiées et déposées dans GenBank par Ibrahim et al.
(1997. J. Clin. Microbiol. 35 : 1636-1638 ; N° d'accès X65999), Smith et al.
(1992. J. Bacteriol. 174 : 5820-5826 ; N° d'accès M84024), Bâumler et al.
(1996. Gène 183 : 207-213 ; N° d'accès U62129), Shortle (1983. Gène 22 :
181-189 ; N° d'accès V01281), Gilmore et al. (1989. J. Bacteriol. 171 : 744- 753 ; N° d'accès M24149), Saint-Joanis et al. (1989. Mol. Gen. Genêt. 219 :
453-460 ; N° d'accès X17300) et Taylor et al. (1990. Mol. Ce». Probes 4 :
261-271 ; N° d'accès U27272), et à partir desquelles les couples d'amorces ci-dessus ont été dessinés, ne sont pas considérées comme des sondes.
En effet, bien qu'elles soient, dans l'absolu et prises isolément, potentiellement utilisables comme sondes, leur taille excessive risquerait de nuire à leur spécificité.
Selon un autre aspect, les sondes objets de l'invention sont des oligonucléotides dont les séquences sont choisies parmi :
Lm113TqFT (SEQ ID N°17) pour L. monocytogenes ; - Ye86TqFT (SEQ ID N°18) pour Y. enterocolitica ;
Ec97TqFT (SEQ ID N°19) pour E. coli et/ou H. alvei et/ou Shigella spp. et/ou Y. enterocolitica ; Se98TqFT (SEQ ID N°20) pour Salmonella spp. ; Sa193TqFT (SEQ ID N°21) pour S. aureus ; - Bc84TqFT (SEQ ID N°22) pour β. cereus ;
Cp97TqFT (SEQ ID N°23) pour C. perfringens ; Cju76TqFT (SEQ ID N°24) pour C. jejuni ; Lg189TqFT (SEQ ID N°38) pour Legionella spp. ; Lg69TqFT (SEQ ID N°39) pour Legionella spp. ; Lpn112TqFT (SEQ ID N°40) pour Legionella pneumophila ; et toute séquence hybridable en conditions strictes à au moins 80 % avec les séquences ci-dessus, ou toute séquence présentant au moins 80 % d'identité avec lesdites séquences SEQ ID 17 à 24 et 38 à 40 ou leurs séquences réverses complémentaires.
Un avantage des deux groupes de sondes cités ci-dessus est que les différentes sondes mentionnées dans chacun des groupes sont utilisables dans des conditions identiques, parce qu'elles présentent des efficacités d'hybridation comparables, ce qui permet de les utiliser simultanément, dans un procédé de l'invention.
La présente invention porte donc également sur un ensemble de sondes (2, 3, 4 ou davantage) sélectionnées parmi le groupe de sondes oligonucléotidiques mentionnées ci-dessus (SEQ ID Nos 17 à 24 et 38 à 40), ou sélectionnées parmi le groupe de sondes constituées des produits d'amplification mentionnés ci-dessus, auquel il faut rajouter le produit de l'amplification du gène HlyA de L. monocytogenes par le couple d'amorces de SEQ ID No :1 et SEQ ID No :2, ou par le couple d'amorces réverse complémentaire de ce dernier, ou encore par tout couple d'amorces comportant au moins une amorce de séquence hybridable en conditions strictes à au moins 80 % avec les séquences ci-dessus, ou de séquence présentant au moins 80% d'identité avec elles.
Il est entendu que, pour la mise en oeuvre de cet aspect de l'invention, les séquences SEQ ID N°17 à 24 et 38 à 40, utiles pour la détection d'espèces bactériennes par des techniques d'hybridation ADN- ADN, sont dépourvues des marquages au moyen d'un fluorophore en 5' et d'un quencheur en 3', caractéristiques des systèmes TaqMan™ (supra) ou des balises moléculaires, tels que décrits supra.
La présente invention concerne enfin des outils de biologie moléculaire, kit d'analyse et micro-réseaux ou puces à acides nucléiques, pour la détection de bactéries contenues dans un mélange complexe ou dans un milieu aqueux.
Ainsi, la présente invention vise un kit ou système pour la détection des acides nucléiques d'au moins deux espèces bactériennes différentes contenues dans un mélange complexe ou dans de l'eau. Ledit kit permet notamment de mettre en œuvre le procédé selon l'invention, en ce qu'il fournit des couples d'amorces utilisables lors de l'étape d'amplifications multiples dudit procédé. Ainsi, ce kit comprend :
- au moins deux couples d'amorces dont les séquences sont choisies dans le groupe constitué par SEQ ID N°1 à SEQ ID N°16 et SEQ ID N° 33 à SEQ ID N°37 du Tableau I, et toute séquence présentant au moins 80 % d'identité avec ces dernières ou leurs séquences réverses complémentaires, pour l'amplification de fragments spécifiques et exclusifs de bactéries choisies dans le groupe constitué de Y. enterocolitica, E. coli et/ou H. alvei et/ou Shigella spp. et/ou Y. enterocolitica, S. aureus, L. monocytogenes, Salmonella spp., B. cereus, C. perfringens, C. jejuni, Legionella spp. et L. pneumophila ;
- et/ou au moins deux sondes nucléotidiques, respectivement marquées en 5' et en 3' par un fluorophore et un quencheur, sélectionnées parmi les séquences SEQ ID N°17 à SEQ ID N°24 et SEQ ID N°38 à SEQ ID N°40 du Tableau I, et toute séquence hybridable en conditions strictes à au moins 80 % avec ces dernières ou présentant au moins 80% d'identité avec elles ou leurs séquences réverses complémentaires ;
- et/ou au moins deux sondes nucléotidiques choisies dans le groupe comprenant les sondes de séquences SEQ ID N°17 à 24 et SEQ ID N°38 à SEQ ID N°40 (Tableau I, supra), dépourvues des marquages par un fluorophore en 5' et un quencheur en 3', les produits d'amplification obtenus à l'aide des couples d'amorces de séquences SEQ ID N°1 à SEQ
ID N°16 et SEQ ID N°33 à SEQ ID N°37 (Tableau I, supra), et toute séquence hybridable en conditions strictes à au moins 80 % avec ces dernières, ou présentant au moins 80% d'identité avec elles ou leurs séquences réverses complémentaires, pour la détection de Y. enterocolitica, E. coli et/ou H. alvei et/ou Shigella spp. et/ou Y. enterocolitica, S. aureus, L. monocytogenes, Salmonella spp., B. cereus, C. perfringens et C. jejuni.
Un kit tel que défini ci-dessus comprendra de préférence le couple d'amorces constitué par les séquences suivantes : LmHlyAf (SEQ ID N°1) et LmHlyAr (SEQ ID N°2), ou le couple d'amorces réverse complémentaire du couple {LmHlyAf, LmHlyAr}, ou toute séquence présentant au moins
80% d'identité avec celles-ci, pour l'amplification spécifique et exclusive de
L. monocytogenes. L'invention porte enfin sur des micro-réseaux ou puces à acides nucléiques pour la détection d'au moins deux espèces bactériennes différentes contenues dans un mélange complexe ou dans de l'eau.
Selon un premier mode de réalisation, un micro-réseau conforme à la présente invention est utile aux fins de la mise en oeuvre de réactions d'amplification multiples, simultanées mais séparées dans l'espace. Ledit micro-réseau comprend alors :
- au moins deux couples d'amorces dont les séquences sont choisies dans le groupe constitué par SEQ ID N°1 à SEQ ID N°16 du
Tableau I, et toute séquence similaire à 80 % au moins à ces dernières, pour l'amplification de fragments spécifiques et exclusifs de microorganimes du groupe constitué de Y enterocolitica, E. coli et/ou H. alvei et/ou Shigella spp. et/ou Y. enterocolitica, S. aureus, L. monocytogenes, Salmonella spp., B. cereus, C. perfringens, C. jejuni,
Legionella spp. et L. pneumophila ; - et, le cas échéant, au moins deux sondes nucléotidiques, respectivement marquées en 5' et en 3' par un fluorophore et un quencheur, sélectionnées parmi les séquences SEQ ID N°17 à SEQ ID N°24 et SEQ ID N°33 à SEQ ID N°37 du Tableau I, et toute séquence hybridable en conditions strictes à au moins 80 % avec ces dernières ou présentant au moins 80% d'identité avec elles ou leurs séquences réverses complémentaires.
Selon un autre mode de réalisation, un micro-réseau objet de l'invention peut servir à la détection d'au moins deux espèces bactériennes parmi Y. enterocolitica, E. coli et/ou H. alvei et/ou Shigella spp. et/ou Y. enterocolitica, S. aureus, L. monocytogenes, Salmonella spp., B. cereus, C. perfringens, et C. jejuni, lesdites espèces étant contenues dans un mélange complexe, et parmi Legionella spp. et L. pneumophila, présentes dans de l'eau, la détection étant effectuée par des techniques d'hybridation ADN-ADN. En ce cas, le micro-réseau comprend au moins deux sondes nucléotidiques choisies parmi : - les séquences SEQ ID N°17 à 24 et 38 à 40 (Tableau I, supra), dépourvues du fluorophore en 5' et du quencheur en 3', et toute séquence hybridable en conditions strictes à au moins 80 % avec ces dernières ou présentant au moins 80% d'identité avec elles ou leurs séquences réverses complémentaires ; et les produits d'amplification obtenus à l'aide des couples d'amorces de séquences SEQ ID N°1 à 16 et 33 à 37 (Tableau I, supra) ou les couples d'amorces réverses complémentaires desdits couples, et toute séquence présentant au moins 80% d'identité avec ces produits d'amplification. Les figures suivantes sont fournies à titre purement illustratif et ne limitent en aucune façon l'objet de la présente invention.
Figure 1 : courbes d'amplification obtenues avec l'ADN de L. monocytogenes en utilisant les amorces LmHlyAF (SEQ ID n°1) et
LmHlyAR (SEQ ID n°2) ainsi que la sonde Lm113TqFT (SEQ ID n°17) et correspondant à des quantités initiales d'équivalent d'ADN génomique de :
* : 5.105 ; + : 5.104 ; O : 5.103 ; Ω : 5.102 ; et : 5 copies par réaction.
RFU : unité de fluorescence relative.
Figure 2 : courbes d'amplification de l'ADN de L. monocytogenes obtenues par détection multiparamétrique en PCR rotative.
Figure 3 : courbes obtenues par amplification de l'ADN de Salmonella spp. à l'aide des amorces Se98f (SEQ ID n°7) et Se98r (SEQ ID n°8) en présence de la sonde Se98TqFT (SEQ ID n°20) et correspondant à des quantités initiales d'équivalent d'ADN génomique de : ^ : 5.105 ; O : 5.104 ; * : 5.103 ; + : 5.102 ; O : 50 ; et D : 5 copies par réaction.
Figure 4 : électrophorèse sur gel d'agarose à 2 %.
Pistes 1 et 2 : fragments obtenus par amplification de l'ADN de Salmonella spp. à l'aide des amorces Se98f (SEQ ID n°7) et Se98r (SEQ ID n°8), respectivement à partir de 5.105 et 5 copies d'équivalents génomique.
Piste 3 : témoin négatif de PCR (les 5 μl d'ADN ont été remplacés par 5 μl d'eau).
Piste Mq : marqueur de poids moléculaire (Low DNA Mass Ladder, Invitrogen, supra)
Figure 5 : courbes obtenues par amplification de l'ADN de E. coli en utilisant les amorces Ec97f (SEQ ID n°5) et Ec97r (SEQ ID n°6) et correspondant à des quantités initiales d'équivalent d'ADN génomique de :
• : 5.106 ; ' : 5.105 ; + : 5.103 ; : 50 ; et • : 5 copies par réaction. Figure 6 : courbes d'amplification de l'ADN de Y. enterocolitica obtenues à l'aide des amorces Ye86f (SEQ ID n°3) et Ye86r (SEQ ID n°4) associées à la sonde Ye86TqFT (SEQ ID n°18) et correspondant à des quantités initiales d'équivalent d'ADN génomique de : * : 5.106 ; : 5.105 ; + .- 5.104 ; O : 5.103 ; D : 5.102 ; » : 50 ; et •: 5 copies par réaction. Figure 7 : courbes d'amplification de l'ADN de β. cereus en utilisant les amorces Bc84f (SEQ ID n°11) et Bc84r (SEQ ID n°12) ainsi que la sonde Bc84TqFT (SEQ ID n°22) et correspondant à des quantités initiales d'équivalent d'ADN génomique de : ^ : 5.106 ; : 5.105 ; * : 5.104 ; + : 5.103 ; O : 5.102 ; et D : 50 copies par réaction.
Figure 8 : électrophorèse sur gel d'agarose à 2 %. Pistes 1 et 2 : fragments issus de l'amplification de l'ADN de β. cereus à l'aide des amorces Bc84f (SEQ ID n°11) et Bc84r (SEQ ID n°12), respectivement à partir de 5.106 et 50 copies d'équivalents génomique.
Piste 3 : témoin négatif de PCR (les 5 μl d'ADN ont été remplacés par 5 μl d'eau) ; la bande qui apparaît correspond à des dimères d'amorces.
Piste Mq : marqueur de poids moléculaire (Low DNA Mass Ladder, supra).
Figure 9 : courbes d'amplification de l'ADN de β. cereus obtenues par détection multiparamétrique en PCR rotative.
Figure 10 : courbes obtenues par amplification de l'ADN de C. perfringens en utilisant les amorces Cp97f (SEQ ID n°13) et Cp97r (SEQ ID n°14) ainsi que la sonde associée Cp97TqFT (SEQ ID n°23) et correspondant à des quantités initiales d'équivalent d'ADN génomique de : O : 5.106 ; D : 5.105 ; • : 5.104 ; >, : 5.103 ; • : 5.102 ; bi : 50 ; et ^ : 5 copies par réaction.
Figure 11 : courbes d'amplification de l'ADN de C. jejuni obtenues à l'aide des amorces Cju76f (SEQ ID n°15) et Cju76r (SEQ ID n°16) associées à la sonde Cju76TqFT (SEQ ID n°24) et correspondant à des quantités initiales d'équivalent d'ADN génomique de : * : 5.105 ; + : 5.104 ;
O : 5.103 ; D : 5.102 ; • : 50 ; et : 5 copies par réaction.
Figure 12 : courbes d'amplification de l'ADN de S. aureus obtenues à l'aide des amorces Sa193f (SEQ ID n°9) et Sa193r (SEQ ID n°10) ainsi que la sonde Sa193TqFT (SEQ ID n°21) et correspondant à des quantités initiales d'équivalent d'ADN génomique de : •, : 5.106 ; : 5.105 ; Λ : 5.104 ;
4- : 5.103 ; * : 5.102 ; et + : 50 copies par réaction. Figure 13 : courbes issues de l'amplification de l'ADN de L. pneumophila avec les amorces Lg189f et Lg69r ainsi que la sonde
Lg189TqFT correspondant à des quantités initiales d'équivalent d'ADN génomique de L. : 2.106, • : 2.105, D : 2.104, *: 2.103 et ^ : 2.102 copies /réaction.
Figure 14 : courbes issues de l'amplification de l'ADN de L. pneumophila avec les amorces Lg69f et Lg69r ainsi que la sonde
Lg69TqFT correspondant à des quantités initiales d'équivalent d'ADN génomique de : 2.105, L : 2.104, : 2.103, O : 2.102 et * : 20 copies /réaction.
Figure 15 : courbes issues de l'amplification de l'ADN de L. pneumophila avec les amorces Lpn112f et Lpn112r ainsi que la sonde
Lpn112TqFT correspondant à des quantités initiales d'équivalent d'ADN génomique de * : 2.106, < : 2.105, i : 2.104, • : 2.103 et O : 2.102 copies /réaction.
Figure 16 : électrophorèse sur gel d'agarose à 2 %. Piste 1 : produit d'amplification du gène icms par les amorces Lpn112f et Lpn112r
Piste 2 : marqueur de poids moléculaire avec, de haut en bas, les bandes correspondant à 2000, 1200, 800, 400, 200, et 100 pb.
Piste 3 : produit d'amplification du gène codant pour l'ARN 16S par les amorces Lg69f et Lg69r
Piste 4 : produit d'amplification du gène codant pour l'ARN 16S par les amorces Lg189f et Lg69r.
La partie expérimentale ci-après, appuyée par des exemples et des figures, vise à illustrer l'invention, sans en limiter la portée. PARTIE EXPERIMENTALE
I- Conditions de mise en œuvre des réactions PCR :
1-1- Mélange réactionnel :
Dans un volume final compris entre environ 5 et 15 μl, et de préférence égal à environ 10 μl, les réactifs classiques des réactions PCR ont été ajoutés. Selon les conditions de mise en oeuvre, il s'est parfois avéré utile de rajouter du Tween20®, notamment afin d'éliminer les inhibiteurs résiduels de la Taq DNA polymerase éventuellement présents dans le mélange réactionnel.
Le Tableau II ci-dessous indique les concentrations finales des différents constituants du « mix » réactionnel, lequel correspond, dans le cadre de la présente invention, au mélange réactionnel avant addition de l'échantillon d'acides nucléiques. TABLEAU II
Constituant Concentration finale
Amorces et sondes associées entre 0,1 et 0,5 μmole/L de chaque, de préférence 0,25 μmole/L de chaque
Tampon de PCR 10X 1X
MgCI2 entre environ 2 et 5 mmole/L, de préférence environ 4 mmole/L
Mélange dNTP au moins 200 μmole/L de chaque
Tween20® entre 0 et 0,01 %
BSA (Sérum Albumine Bovine) entre environ 0 et 0,5 % m/v
Taq DNA polymerase entre environ 0,5 et 0,75 unités
Selon un mode particulier de mise en œuvre de l'invention, les réactions PCR ont été effectuées dans les conditions suivantes. Le tampon de PCR 10X, par exemple le « Qiagen PCR Buffer 10X »
(Qiagen, Courtaboeuf, France), avait pour composition la formule suivante :
Tris-HCI, KCI, (NH4)2SO4 et MgCI2, et un pH égal à 8,7 (mesuré à 20 °C). Le mélange dNTP était constitué de 10 mM de dATP, dCTP, dGTP et dTTP (Sigma-AIdrich, Lyon, France).
Le mélange réactionnel pour une réaction d'amplification avait la composition suivante : 5 μl de « mix » réactionnel, soit :
1 μl de Qiagen PCR Buffer 10X 1 μl de MgCI2 à 25 mM 0,1 μl de BSA I % 0,2 μl de mélange dNTP 0, 75 unités de Taq DNA polymerase (Qiagen, supra) eau ultra pure qsp. 5 μl et 5 μl d'échantillon d'acides nucléiques, soit un volume final de 10 μl.
1-2- Echantillons d'acides nucléiques :
1-2-1- Extraction d'ADN génomique à partir d'une culture pure :
Aux fins de la lyse chimique des cellules bactériennes, 500 μl d'une culture bactérienne pure ont été mélangés à 500 μl d'une solution de TENS 2X - Chelex-100 15 % (Tris-HCI 100 mM pH 8,0 ; EDTA 40 mM pH 8,0 ;
NaCI 200 mM ; SDS 2 % et Chelex-100 15 %) ou à 500 μl d'une solution de
Chelex-100 à 25 % dans l'eau.
Ce mélange a été incubé entre 60 et 100 °C, pendant 10 à 20 minutes. Le cas échéant, ce mélange a subi un deuxième traitement de lyse cellulaire, par voie mécanique.
Ce traitement mécanique, consistant en l'ultrasonication des cellules bactériennes et/ou des résidus issus de la lyse chimique, a été appliqué au mélange subséquemment à la lyse chimique, dans les mêmes conditions de tampon et température que celle-ci. Dans certains cas, la lyse par traitement mécanique pouvait être appliquée alternativement à la lyse chimique.
De manière facultative, le lysat a été purifié et concentré à l'aide du système « Nucleospin Plant L » (Macherey Nagel, Dϋren, Allemagne). En ce cas, les acides nucléiques ont été mélangés volume à volume avec un tampon de liaison (« C4 ») et de l'éthanol absolu. Ce mélange a été vigoureusement agité pendant 30 secondes, puis déposé sur une colonne de silice.
La colonne a été lavée successivement avec 1 et 2 ml des tampons « CQW » et « C5 », respectivement, avant d'être séchée pendant 10 minutes par centrifugation à 5500 x g, à température ambiante.
Afin d'éluer l'ADN fixé sur la silice, 200 μl de tampon « CE » préchauffé à 70 °C ont été incubés 5 minutes sur la colonne.
Alternativement, si le lysat n'était pas purifié, 200 μL étaient prélevés et stockés dans la glace en vue de l'analyse par PCR.
1-2-2- Extraction d'acides nucléiques à partir d'une matrice alimentaire :
25 g de matrice alimentaire ont été dilués dans 225 ml d'EPT [eau peptonee tamponnée (Biokar, Beauvais, France)] ou de Fraser Y∑ (Biokar), respectivement, pour les enrichissements en Salmonella spp. ou Listeria monocytogenes.
Le mélange a été homogénéisé à l'aide d'un « stomacher » pendant 3 minutes. Les milieux ainsi obtenus ont été incubés 18 h à 37 °C et 24 h à
30 °C, respectivement, pour les enrichissements en Salmonella spp. et en L. monocytogenes.
Entre 1 et 10 ml de broyât alimentaire ont été prélevés et centrifugés 5 minutes à 500 x g afin d'éliminer les gros débris, Le., les particules de matrice alimentaire de grande taille.
Le surnageant a été récupéré puis centrifugé 3 minutes à 16 000 x g. 300 μl de tampon TENS 2X - Chelex-100 15% ou de solution aqueuse de Chelex-100 à 25% ont été ajoutés au culot bactérien.
Ce mélange a été incubé entre 60 et 100 °C aux fins de la lyse chimique (voir paragraphe 1-2-1- supra). Comme décrit ci-dessus, le mélange pouvait, de manière alternative ou subséquente à la lyse chimique, être traité mécaniquement.
De manière facultative, le lysat a été purifié et concentré à l'aide du système « Nucleospin Plant L » (voir paragraphe 1-2-1- supra).
Alternativement, si le lysat n'était pas purifié, 200 μl étaient prélevés et stockés dans la glace en vue de l'analyse par PCR.
1-2-3- Extraction d'acides nucléiques à partir d'eau : 250 à 1000 ml d'eau sont filtrés sur membrane en polycarbonate 0.45 μm (Sartorius). 1 à 4 ml (préférentiellement 2 ml) de tampon de TENS 2X - Chelex-100 15% ou de solution aqueuse de Chelex-100 à 25% sont ajoutés sur la membrane ayant retenu les bactérie. Ce mélange est incubé entre 60 et 100°C aux fins de la lyse chimique et peut de manière alternative ou subséquente être traité mécaniquement. Le lysat est ensuite purifié et concentré à l'aide du système « Nucleospin Plant L ».
I-3- Dépôts dans le Genedisc® :
Comme indiqué dans la partie descriptive, la présente invention est susceptible d'être mise en œuvre au moyen d'une cartouche à usage unique décrite dans la demande de brevet US n°09/981070 bénéficiant de la priorité de la demande de brevet français publiée le 1er février 2002 sous le numéro 2812306. Le Genedisc® commercialisé par GeneSystems (Bruz, France) est un exemple d'une telle cartouche.
Cette cartouche, et en particulier le Genedisc®, est utilisable dans un dispositif de type automate pour l'amplification de séquences d'acides nucléiques, également décrit dans les demandes de brevet sus-citées. Avantageusement, le Genedisc® est divisé en secteurs identiques. L'on désigne par « secteur », une partie du Genedisc® constituée d'une fraction du nombre total de chambres réactionnelles portées par ledit Genedisc®, par exemple 1/3 ou 1/6 des 36 chambres, associée à un compartiment du réservoir central, ledit compartiment alimentant les chambres réactionnelles comprises dans la fraction susvisée. Par exemple, le réservoir central du Genedisc® est divisé en trois ou six compartiments en tous points identiques, chacun de ces compartiments assurant ainsi la desserte d'un tiers ou d'un sixième du nombre total de chambres réactionnelles. Le Genedisc® comprend alors, selon cet exemple, trois ou six secteurs.
Les composants suivants ont été préalablement déposés dans les chambres réactionnelles du Genedisc® : les amorces et sondes associées, ainsi que le Tween20®. S'agissant des amorces et sondes, chaque « trio » couple d'amorces et sonde associée a été déposé dans une ou plusieurs chambres réactionnelles du Genedisc®. Le Tween20® a, quant à lui, été distribué dans toutes les chambres réactionnelles.
Les autres constituants cités dans le Tableau II ci-dessus ont été déposés, avec l'échantillon d'acides nucléiques, dans le réservoir d'alimentation du Genedisc®.
Pour un secteur du Genedisc®, le volume de mélange réactionnel à préparer comme décrit dans le paragraphe 1-1- supra, correspondait au volume de mélange réactionnel pour une amplification (10 μl) multiplié par le nombre de chambres réactionnelles incluses dans le secteur, chacune desdites chambres étant le siège d'une amplification. Par exemple, avec un Genedisc® comprenant trois secteurs, un secteur étant alors représenté par un tiers des 36 chambres, c'est-à-dire 12 chambres, le volume de mélange réactionnel à préparer pour un secteur était de 120 μl.
Ainsi, pour chaque secteur du Genedisc®, les 120 μl de mélange réactionnel ont été déposés dans un compartiment du réservoir central. Le mélange a ensuite été desservi dans les chambres réactionnelles contenant les pré-dépôts de « trios », couples d'amorces et sondes associées, et de Tween20® à des concentrations respectives de 200 nM et 0,01 % pour 10 μl finals.
I-4- Mise en œuyre de l'étape d'amplifications multiples .étape b) du procédé objet de l'invention] :
Le nombre de cycles d'amplification effectués au cours de cette étape a varié entre 40 et 45. Les conditions de thermocyclage utilisées sur le GeneDisc Cycler ® sont les suivantes :une étape de dénaturation à 96°C pendant 30 secondes, une étape d'hybridation à 58°C pendant 30 secondes, et une étape d'élongation à 58°C pendant 30 secondes, pour chaque cycle.
En fin de réaction, les secteurs du Genedisc® ont été ramenés à température ambiante. Il- Exemples et résultats :
11-1- Analyse multiparamétrique :
Un mélange d'acides nucléiques extraits de cultures pures de L. monocytogenes et β. cereus, respectivement à 102 et 105 copies d'équivalents d'ADN génomique par μl, a été ajouté au « mix » réactionnel, avant d'être introduit dans un compartiment du réservoir du Genedisc®. Comme indiqué dans le paragraphe I-3 précédent, du Tween20®, à une concentration finale de 0,01 %, ainsi que les couples d'amorces et sondes spécifiques de L. monocytogenes et B. cereus, à une concentration finale de 200 nM, avaient préalablement été déposés dans les chambres réactionnelles du secteur correspondant, à raison d'une répartition de 8 chambres par microorganisme à détecter, soit un total de 16 chambres réactionnelles. La PCR rotative a permis d'obtenir des courbes d'amplification dans le cadre des deux détections, avec des cycles seuils (cycles à partir desquels la fluorescence est significativement plus élevée que le bruit de fond ; Ct) moyens respectifs de 25,2 ± 0.84 cycles et 29,5 ± 0,55 cycles pour β. cereus (Figure 11 ) et L. monocytogenes (Figure 3).
II-2- Comparaison de la mise en œuyre manuelle vs automatisée, à l'aide du Genedisc® :
Deux échantillons d'acides nucléiques extraits de steak haché enrichi en L. monocytogenes ont été soumis à une amplification par PCR dans un volume réactionnel final de 10 μl, d'une part manuellement, par un expérimentateur, dans le iCycler® (Bio-Rad, Marne la Coquette, France), et d'autre part de manière automatisée, à l'aide du Genedisc®, dans le Genedisc Cycler® (GeneSystems, Bruz, France). Les extraits d'ADN ont été dilués au loeme avant d'être ajoutés au mélange réactionnel.
Les Ct moyens calculés par les deux appareils étaient comparables, avec des valeurs de 26,4 ± 1 ,7 et 26,2 ± 0,2 cycles pour le iCycler®, et 26,3 ± 0,3 et 25,8 ± 0,1 pour le Genedisc Cycler®.
II-3- Amplification des acides nucléiques extraits de cultures pures par des couples d'amorces et sondes associées spécifiques d'espèces, genres ou groupes bactériens :
11-3-1- Microorganismes étudiés :
Les amplifications ont été effectuées dans un volume réactionnel final de 10 μl, sur des gammes de dilution au ιoème d'échantillons d'acides nucléiques extraits de cultures pures de différents microorganismes.
Les microorganismes étudiés avec le couple d'amorces et la sonde spécifiques de Escherichia coli et/ou Hafnia alvei et/ou Shigella spp, ansi qu'avec les couples d'amorces et sondes associées spécifiques de Yersinia enterocolitica, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Salmonella spp., Bacillus cereus, Clostridium perfringens, et Campylobacter jejuni sont : Listeria monocytogenes (11 souches), Listeria innocua, Listeria ivanovii, Listeria welshimeri, Salmonella spp. (27 sérovars), Yersinia enterocolitica, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Campylobacter lari, Escherichia coli (4 souches), Clostridium perfringens, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus durans, Pseudomonas stutzeri, Shigella flexneri, Morganella morganii, Hafnia alvei, Providencia rettgeri, Serratia marcescens, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae (2 souches),
Les microorganismes étudiés avec les couples d'amorces et sondes associées spécifiques de Legionella spp. et Legionella pneumophila sont : Acanthamoeba polyphaga, Acinetobacter baumanii, Acinetobacter junit', Acinetobacter Iwofii, Aerococcus viridans, Aeromonas hydrophila, Alcaligenes faecalis, Bacillus subtilis, Bulkhoderia cepacia, Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Citrobacter freundii, Clostridium perfringens, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus durans, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas paucimobilis, Pseudomonas putida, Proteus peneri, Shigella dysenteriae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus gallinarum, Staphylococcus lugdunensis, Stenotrophomonas maltophilia, Streptococcus bovis, Streptococcus equinus, Yersinia enterocolitica, L. pneumophila sérogroupes 1 à 14 (14 souches de collection et 9 souches d'origine environnementale), L. anisa, L. birminghamensis, L. erythra, L. bozemanii, L. brumensis, L. cherrii, L. cincinatiensis, L. dumofii, L. feelei, L. gormanii, L. gratiana, L. hackeliae (2 souches), L. israelensis, L. jamestowniensis, L. jordanis, L. lansingensis, L. longbeacheae sérogroupes 1 et 2, L. micdadei, L. maceachernii, L. nagaro, L. oakridgensis, L. parisiensis, L. rubriculens, L. santicrusis, L. sainthelensi, L. tucsonensis, L. wadsworthii et 13 souches de Legionella spp. issues de l'environnement.
11-3-2- Séquences dessinées pour la détection de Listeria monocytogenes ;
Les couple d'amorces et sonde associée dessinés pour la détection de L. monocytogenes ont permis d'obtenir des courbes d'amplification en temps réel spécifique de cette espèce, avec une sensibilité de 1 à 10 copies d'équivalents d'ADN génomique par réaction PCR (Figure 1). Aucun produit d'amplification n'a été obtenu avec les autres espèces de Listeria, pas plus qu'avec les bactéries étudiées appartenant à d'autres genres que
Listeria. Le produit d'amplification (SEQ. ID n° 25 et 26 ci-dessous) a été purifié et sa séquence déterminée sur les deux brins en utilisant les amorces LmHlyAf (SEQ ID n°1) et LmHlyAr (SEQ ID n°2). La séquence SEQ ID n°25 a été obtenue en utilisant l'amorce LmHlyAr (SEQ ID n°2).
Les nucléotides situés entre les positions 72 et 92, soulignés dans la séquence SEQ ID n°25 ci-dessous, représentent la séquence complémentaire de l'amorce LmHlyAf (SEQ ID n°1). La séquence
SEQ ID n°26 a été déterminée à l'aide de l'amorce LmHlyAf (SEQ ID n°1). Les nucléotides soulignés, situés entre les positions 74 et 94 de la séquence SEQ ID n°26 ci-dessous, représentent la séquence complémentaire de l'amorce LmHlyAr (SEQ ID n°2). La séquence du produit d'amplification ainsi déterminée sur chaque brin et correspondant aux séquences SEQ ID n°25 et SEQ ID n°26, était identique à la séquence cible recherchée.
SEQ ID n°25 :
5' ATACATTGTTTTTATTGTAATCCAATCCTTGTATATACTTATCGATTT CATGCCGCGTGTTTCTTTTCGATTGGCGTCTTAGGACTTGCAGG 3' SEQ ID n°26 : 5' CGAAAAGAACACGCGGATGAAATCGATAAGTATATACAAGGATT
GGATTACAATATAAAACAATGTATTAGTATACCACGGAGATGCAGTfi 3' 11-3-3- Séquences dessinées pour la détection de Salmonella spp. :
Les couple d'amorces et sonde associée dessinés pour l'amplification d'une séquence de Salmonella spp. ont permis d'amplifier un fragment de la taille attendue, et ce, de manière spécifique, avec une sensibilité de 1 à 10 copies d'équivalents d'ADN génomique par réaction
PCR (Figure 3). Aucun produit d'amplification n'a été obtenu au cours des réactions réalisées sur les extraits provenant des autres genres bactériens étudiés. La taille du produit d'amplification estimée par électrophorèse sur gel d'agarose était conforme à la taille attendue, à savoir 98 pb (Figure 4).
11-3-4- Séquences dessinées pour la détection de Escherichia coli :
Les couple d'amorces et sonde associée dessinés pour E. coli ont permis d'amplifier un fragment d'ADN de la taille attendue pour les 4 souches d'E. coli étudiées (Figure 5), ainsi que pour Y. enterocolitica, S. flexneri et H. alvei. La sensiblité pour les 4 souches d'E.coli, ainsi que pour Y. enterocolitica, S. flexneri et H. alvei, est de 1 à 10 copies équivalents d'ADN génomique par réaction de PCR, pour chacun des microorganismes.
11-3-5- Séquences dessinées pour la détection de Yersinia enterocolitica ; Les couple d'amorces et sonde associée dessinés pour Y. enterocolitica ont permis d'obtenir des courbes d'amplification en temps réel spécifique de cette espèce, avec une sensibilité de 1 à 10 copies d'équivalents d'ADN génomique par réaction PCR (Figure 6). Aucun produit d'amplification n'a été obtenu dans le cadre des réactions réalisées sur les extraits provenant des genres bactériens étudiés autres que Yersinia. Le produit d'amplification unique a été purifié. La séquence de ce produit, correspondant à la séquence SEQ ID n°27, a été déterminée en utilisant l'amorce Ye86f (SEQ ID n°3). Les bases situées entre les positions 37 et 56, soulignées dans la séquence SEQ ID n°27 ci-dessous, représentent la séquence complémentaire de l'amorce Ye86r (SEQ ID n°4). La séquence SEQ ID n°27 ci-dessous correspondait à la séquence cible attendue.
SEQ ID n° 27 :
5' TGANGTTTANCAGCAAGCTTGTGATCCTCCGTCGCCACCAGCCG
AAGTCAGTAGTGATCCAGCCGAAG 3'
11-3-6- Séquences dessinées pour la détection de Bacillus cereus : Les couple d'amorces et sonde associée dessinés pour β. cereus ont permis d'obtenir des courbes d'amplification en temps réel spécifique, avec une sensibilité de 50 copies d'équivalents d'ADN génomique par réaction PCR (Figure 7). La taille du produit d'amplification a été vérifiée par électrophorèse sur gel d'agarose et correspondait effectivement à la taille attendue, à savoir 84 pb (Figure 8). Aucun produit d'amplification n'a été obtenu au cours des réactions effectuées sur les extraits provenant d'autres genres bactériens.
11-3-7- Séquences dessinées pour la détection de Clostridium perfringens ;
Les couple d'amorces et sonde associée dessinés pour C. perfringens ont permis d'obtenir, de manière spécifique à cette espèce, des courbes d'amplification en temps réel, avec une sensibilité de 1 à 10 copies d'équivalents d'ADN génomique par réaction de PCR (Figure 10). Aucun produit d'amplification n'a été obtenu lors des réactions réalisées sur les extraits provenant des genres bactériens étudiés autres que Clostridium. Le produit d'amplification a été purifié. Sa séquence, SEQ ID n°28, a été déterminée en utilisant l'amorce Cp97f (SEQ ID n°13). Les nucléotides soulignés dans la séquence SEQ ID n°28 ci-dessous, situés entre les positions 59 et 78, représentent l'amorce Cp97r (SEQ ID n°14). La séquence SEQ ID n°28 ci-dessous était identique à la séquence cible recherchée.
SEQ ID n° 28 : 5' TATTTTGGAGTAATAGATACTCCATATCATCCTGCTAATGTTACTG
CCGTTGATAGCGCAGGACATGTTAAGTTTGAG 3'
11-3-8- Séquences dessinées pour la détection de Campylobacter jejuni : Les couple d'amorces et sonde associée dessinés pour C. jejuni ont permis d'obtenir des courbes d'amplification en temps réel de manière spécifique à cette espèce, avec une sensibilité de 1 à 10 copies d'équivalents d'ADN génomique par réaction PCR (Figure 11 ). Le produit d'amplification a été purifié et sa séquence déterminée sur les deux brins. La séquence SEQ ID n°29 suivante : 5'
ATTCAGCCAAACCCTAACCTCAGCTCCAGCCCAAGACAGTCGACCGCTA 3', a été obtenue à l'aide de l'amorce Cju76f (SEQ ID n°15). Les bases soulignées, situées entre les positions 31 et 49 de la séquence ci-dessus, représentent la séquence complémentaire de l'amorce Cju76r (SEQ ID n°16).
La séquence SEQ ID n°30 suivante : 5'
CTGGAGCTGAGGTTAGGGTTTGGCTGAATTTAATACCCAAAGAACGATTTGC AAG 3', a été déterminée au moyen de l'amorce Cju76r (SEQ ID n°16). Les nucléotides situés entre les positions 36 et 55 et soulignés dans la séquence supra, représentent la séquence complémentaire de l'amorce Cju76f (SEQ ID n°15).
Les séquences SEQ ID n°29 et 30 correspondaient à celles de la cible recherchée. Aucun produit d'amplification n'a été obtenu au cours des réactions mises en oeuvre sur les échantillons d'acides nucléiques extraits à partir d'espèces ou de genres bactériens analysés, autres que Campylobacter. 11-3-9- Séquences dessinées pour la détection de Staphylococcus aureus ; Les couple d'amorces et sonde associée dessinés pour S. aureus ont permis d'obtenir des courbes d'amplification en temps réel spécifique de cette espèce, avec une sensibilité de 50 copies d'équivalents d'ADN génomique par réaction PCR (Figure 12). Le produit d'amplification a été purifié et sa séquence déterminée sur les deux brins. La séquence SEQ ID n°31 suivante : 5' TTTATGCTGATGGAAAAATGGTAAACGAAGCTTTAGTTCGTCAAGGCT
TGGCTAAAGTTGCTTATGTTTATAAACCTAACAATACACATGAACAACTTTTAA GAAAAAGTGAAGCACAAGCAAAAAAAGAGAAATTAAATATTTGGAGCGAAGAC AACGCTGATTCAGGTCA 3', a été obtenue avec l'amorce Sa193f (SEQ ID n°9). Les bases soulignées, situées entre les positions 154 et 172, représentent la séquence complémentaire de l'amorce Sa193r (SEQ ID n°10).
La séquence SEQ ID n°32 : 5' AAATATTTAATTTCTCTTTTTTTGCTTGTGCTTCACTTTTTCTTAAAA GTTGTTCATGTGTATTGTTAGGTTTATAAACATAAGCAACTTTAGCCAAGCCTT GACGAACTAAAGCTTCGTTTACCATTTTTCCATCAGCATAAATATACGCTAAG CCACGTCCAT 3', a été déterminée en utilisant l'amorce Sa193r (SEQ ID n°10). Les nucléotides situés entre les positions 146 et 165 et soulignés dans la séquence ci-dessus représentent la séquence complémentaire de l'amorce Sa193f (SEQ ID n°9). La séquence double brin ainsi obtenue, correspondant aux séquences SEQ ID n°31 et 32 supra, s'est révélée identique à la séquence cible recherchée.
11-3-10- Séquences dessinées pour la détection de Legionella spp. ; Deux couples d'amorces et sondes associées ont été mis au point pour la détection et la quantification de Legionella spp. :
1er couple : Le premier couple, dessiné à partir de la séquence du gène codant pour l'ARN 16S de L. pneumophila subsp. pascullei (Genbank Accession Number : AF122885), est constitué des amorces Lg189f (SEQ ID N°33), et Lg69r (SEQ ID N°34), et associé à la sonde Lg189TqFT (SEQ ID N°38). Ces couple d'amorces et sonde associées, dessinés pour la détection et la quantification du genre Legionella spp., ont permis d'obtenir, avec une sensibilité de 200 copies par réaction, des courbes d'amplification en temps réel spécifique de ce genre sur des extraits d'ADN de L. pneumophila sérogroupes 1 à 14 (14 souches de collection et 9 souches d'origine environnementale), L. anisa, L. birminghamensis, L. bozemanii, L. brumensis, L. cherrii, L. cincinatiensis, L. dumofii, L. feelei, L. gormanii, L. gratiana, L. hackeliae (2 souches), L. jamestowniensis, L. jordanis, L. longbeacheae sérogroupes 1 et 2, L. nagaro, L. oakridgensis, L. parisiensis, L. santicrusis, L. sainthelensi, L. tucsonensis, L. wadsworthii et de 13 souches de Legionella spp. issues de l'environnement (Figure 13). Ces couples d'amorces et sonde associées ont également permis d'obtenir, avec une sensibilité de 104 copies par réaction, des courbes d'amplification en temps réel spécifiques de ce genre sur des extraits d'ADN de L. israelensis, L. lansingensis, L. micdadei et L. rubriculens.
La taille du produit d'amplification estimée par électrophorèse était conforme à la taille attendue à savoir 189 pb (Figure 16, piste 4).
Seul l'ADN de l'espèce L. erythra n'a pas donné lieu à une amplification. Les ADN issus d'autres micro-organismes susceptibles d'être retrouvés dans l'eau tels que Acanthamoeba polyphaga, Acinetobacter baumanii, Acinetobacter junii, Acinetobacter Iwofii, Aerococcus viridans, Alcaligenes faecalis, Bacillus subtilis, Bulkhoderia cepacia, Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Citrobacter freundii, Clostridium perfringens, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Enterococcus durans, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas paucimobilis, Pseudomonas putida, Proteus peneri, Shigella dysenteriae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus gallinarum, Staphylococcus lugdunensis, Streptococcus bovis, Streptococcus equinus et Yersinia enterocolitica n'ont pas donné de produit d'amplification. Les ADN issus ô'Aeromonas hydrophila, Enterococcus faecium et Stenotrophomonas maltophilia ont généré un faible signal d'amplification lorsque leur équivalent en ADN génomique dépasse les 105 copies.
2ème couple :
Ce deuxième couple, également dessiné à partir de la séquence du gène codant pour l'ARN 16S de L. pneumophila subsp. pascullei (Genbank Accession Number : AF122885), comprend les amorces Lg69f (SEQ ID N°35) et Lg69r 5SEQ ID N°34, idem que pour le 1er couple), est associé à la sonde Lg69TqFT (SEQ ID N°39).
Ces couple d'amorces et sonde associées dessinés pour la détection et la quantification du genre Legionella spp., ont permis d'obtenir, avec une sensibilité de 20 copies d'équivalent génomiques, des courbes d'amplification en temps réel spécifique de ce genre sur des extraits d'ADN de L. pneumophila sérogroupes 1 à 14 (14 souches de collection et 9 souches d'origine environnementale), L. anisa, L. birminghamensis,L. bozemanii, L. brumensis, L. cherrii, L. cincinatiensis, L. dumofii, L. feelei, L. gormanii, L. gratiana, L. hackeliae (2 souches), L. jamestowniensis, L. jordanis, L. longbeacheae sérogroupes 1 et 2, L. micdadei, L. nagaro, L. oakridgensis, L. parisiensis, L. santicrusis, L. sainthelensi, L. tucsonensis, L. wadsworthii et de 13 souches de Legionella spp. issues de l'environnement (Figure 14). Ces couples d'amorces et sonde associées ont également permis d'obtenir, avec une sensibilité de 104 copies par réaction, des courbes d'amplification en temps réel spécifique de ce genre sur des extraits d'ADN de L. erythra, L. israelensis, et L. rubriculens.
La taille du produit d'amplification estimée par électrophorèse était conforme à la taille attendue à savoir 69 pb (Figure 16, piste 3). Seul l'ADN de l'espèce L. lansingensis, n'a pas donné lieu à une amplification. Les ADN issus d'autres genres susceptibles d'être retrouvés dans l'eau tels qu'Acanthamoeba polyphaga, Acinetobacter baumanii, Acinetobacter junii, Acinetobacter Iwofii, Aerococcus viridans, Aeromonas hydrophila, Alcaligenes faecalis, Bacillus subtilis, Bulkhoderia cepacia, Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Citrobacter freundii, Clostridium perfringens, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Enterococcus durans, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas paucimobilis, Pseudomonas putida, Proteus peneri, Shigella dysenteriae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus gallinarum, Staphylococcus lugdunensis, Streptococcus bovis, Streptococcus equinus, Yersinia enterocolitica, et Stenotrophomonas maltophilia n'ont pas donné de produit d'amplification. L'ADN issu d' Enterococcus faecium a généré un faible signal d'amplification lorsque son équivalent en ADN génomique dépasse les 105 copies.
11-3-11- Séquences dessinées pour la détection de Legionella pneumophila :
Dessiné à partir de la séquence du gène icmS codant pour une protéine IcmS impliquée dans le caractère infectieux de L. pneumophila
(Genbank Accession Number : Y12705), le couple d'amorces comprend les amorces Lpn112f (SEQ ID N°36) et Lpn112r (SEQ ID N°37). Il est associé à la sonde Lpn112TqFT (SEQ ID N°40).
Les couples d'amorces et sonde associées dessinés pour la détection et la quantification du genre Legionella spp. ont permis d'obtenir, avec une sensibilité de 200 équivalents génomiques, des courbes d'amplification en temps réel spécifique de ce genre sur des extraits d'ADN de L. pneumophila sérogroupes 1 à 14 (14 souches de collection et 9 souches d'origine environnementale) (Figure 15).
La taille du produit d'amplification estimée par électrophorèse était conforme à la taille attendue à savoir 112 pb (Figure 16, piste 1).
Aucun signal n'a été obtenu pour les ADN issus des autres espèces de Legionelles : L. anisa, L. birminghamensis, L. bozemanii, L. brumensis, L. cherrii, L. cincinatiensis, L. dumofii, L. erythra, L. feelei, L. gormanii, L. gratiana, L. hackeliae (2 souches), L. israelensis, L. jamestowniensis, L. jordanis, L. lansingensis, L. longbeacheae sérogroupes 1 et 2, L. micdadei, L. maceachernii, L. nagaro, L. oakridgensis, L. parisiensis, L. rubriculens, L. santicrusis, L. sainthelensi, L. tucsonensis, L. wadsworthii et 13 souches de Legionella spp. issues de l'environnement ni pour les ADN issus d'autres genres susceptibles d'être retrouvés dans l'eau tels que Acanthamoeba polyphaga, Acinetobacter baumanii, Acinetobacter junii, Acinetobacter Iwofii, Aerococcus viridans, Aeromonas hydrophila, Alcaligenes faecalis, Bacillus subtilis, Bulkhoderia cepacia, Enterococcus faecalis, Enterococcus durans, Enterococcus faecium, Klebsiella oxytoca, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Proteus peneri, Shigella dysenteriae, Staphylococcus gallinarum, Staphylococcus lugdunensis, Stenotrophomonas maltophilia, Streptococcus bovis et Streptococcus equinus.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de détection et d'identification de bactéries contenues dans un mélange complexe ou dans de l'eau par des amplifications multiples, simultanées mais séparées dans l'espace, de séquences d'acides nucléiques cibles, ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes : a) la mise en contact de l'échantillon d'acides nucléiques avec au moins deux couples d'amorces pour amplification, chaque couple étant spécifique et exclusif d'une séquence nucléotidique d'une espèce, d'un genre ou d'un groupe bactérien ; b) l'amplification des séquences nucléotidiques cibles ; et c) la détection de la présence et l'identification des bactéries contenues dans le mélange complexe ou dans l'eau de départ, dans lequel les couples d'amorces pour amplification utilisés permettent la détection de chacune des séquences d'acide nucléique cibles avec une sensibilité comparable.
2. Procédé de détection, d'identification et de quantification de bactéries contenues dans un mélange complexe ou dans de l'eau par des amplifications multiples, simultanées mais séparées dans l'espace, de séquences d'acides nucléiques cibles, ledit procédé comprenant au moins les étapes suivantes : a) la mise en contact de l'échantillon d'acides nucléiques avec au moins deux couples d'amorces pour amplification et au moins deux sondes nucléotidiques associées, chaque couple et sonde associée étant spécifique et exclusif d'une séquence nucléotidique d'une espèce, d'un genre ou d'un groupe bactérien ; b) l'amplification des séquences nucléotidiques cibles par PCR en temps réel ; et c) la détection de la présence, l'identification et la quantification des bactéries contenues dans le mélange complexe ou dans l'eau de départ, dans lequel les couples d'amorces pour amplification utilisés permettent la détection de chacune des séquences d'acide nucléique cibles avec une sensibilité comparable.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel les bactéries détectées sont des pathogènes de mammifères, en particulier de l'homme.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel au moins deux espèces, genres ou groupes bactériens sont choisis parmi Yersinia enterocolitica, Escherichia coli et/ou Hafnia alvei et/ou Shigella spp. et/ou Yersinia enterocolitica, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Salmonella spp., Bacillus cereus, Clostridium perfringens, Campylobacter jejuni, Legionella spp. et Legionella pneumophila.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, pour la détection et l'identification de bactéries contenues dans un mélange complexe, dans lequel au moins deux espèces, genres ou groupes bactériens sont choisis parmi Yersinia enterocolitica, Escherichia coli et/ou Hafnia alvei et/ou Shigella spp. et/ou Yersinia enterocolitica, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Salmonella spp., Bacillus cereus, Clostridium perfringens, et Campylobacter jejuni.
6. Procédé selon la revendication 4 ou 5, permettant de détecter distinctement des bactéries Hafnia alvei et Salmonella spp contenues dans un mélange complexe.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, pour la détection et l'identification de bactéries Legionella spp. et/ou Legionella pneumophila contenues dans de l'eau.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, dans lequel les couples d'amorces sont choisis dans le groupe de séquences suivantes :
LmHlyAf (SEQ ID N°1), LmHlyAr (SEQ ID N°2), pour l'amplification spécifique et exclusive de L. monocytogenes ;
Ye86f (SEQ ID N°3), Ye86r (SEQ ID N°4), pour l'amplification spécifique et exclusive de Y. enterocolitica ;
Ec97f (SEQ ID N°5), Ec97r (SEQ ID N°6), pour l'amplification spécifique et exclusive de E. coli et/ou H. alvei et/ou Shigella spp. et/ou Y. enterocolitica ;
Se98f (SEQ ID N°7), Se98r (SEQ ID N°8), pour l'amplification spécifique et exclusive de Salmonella spp. ;
Sa193f (SEQ ID N°9), Sa193r (SEQ ID N°10), pour l'amplification spécifique et exclusive de S. aureus ;
Bc84f (SEQ ID N°11), Bc84r (SEQ ID N°12), pour l'amplification spécifique et exclusive de B. cereus ; Cp97f (SEQ ID N°13), Cp97r (SEQ ID N°14), pour l'amplification spécifique et exclusive de C. perfringens ;
Cju76f (SEQ ID N°15), Cju76r (SEQ ID N°16), pour l'amplification spécifique et exclusive de C. jejuni ;
Lg189f (SEQ ID N°33), Lg69r (SEQ ID N°34) pour l'amplification spécifique et exclusive de Legionella spp. ; Lg69f (SEQ ID N°35), Lg69r (SEQ ID N°34) pour l'amplification spécifique et exclusive de Legionella spp. ; et
Lpn112f (SEQ ID N°36), Lpn112r (SEQ ID N°37) pour l'amplification spécifique et exclusive de Legionella pneumophila ; ou toute séquence présentant au moins 80 % d'identité avec celles- ci ou leurs séquences réverses complémentaires.
9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel les sondes associées aux couples d'amorces sont choisies dans le groupe de séquences suivantes :
Lm113TqFT (SEQ ID N°17), pour l'amplification en temps réel spécifique et exclusive de L. monocytogenes ;
Ye86TqFT (SEQ ID N°18), pour l'amplification en temps réel spécifique et exclusive de Y. enterocolitica ; Ec97TqFT (SEQ ID N°19), pour l'amplification en temps réel spécifique et exclusive de E. coli et/ou H. alvei et/ou Shigella spp. et/ou Y enterocolitica ;
Se98TqFT (SEQ ID N°20), pour l'amplification en temps réel spécifique et exclusive de Salmonella spp. ; Sa193TqFT (SEQ ID N°21), pour l'amplification en temps réel spécifique et exclusive de S. aureus ;
Bc84TqFT (SEQ ID N°22), pour l'amplification en temps réel spécifique et exclusive de B. cereus ;
Cp97TqFT (SEQ ID N°23), pour l'amplification en temps réel spécifique et exclusive de C. perfringens ;
Cju76TqFT (SEQ ID N°24), pour l'amplification en temps réel spécifique et exclusive de C. jejuni ;
Lg189TqFT (SEQ ID N°38), pour l'amplification en temps réel spécifique et exclusive de Legionella spp. ; Lg69TqFT (SEQ ID N°39), pour l'amplification en temps réel spécifique et exclusive de Legionella spp. ; et Lpn112TqFT (SEQ ID N°40), pour l'amplification en temps réel spécifique et exclusive de Legionella pneumophila ; ou toute séquence présentant au moins 80 % d'identité avec celles- ci ou avec leurs séquences réverses complémentaires.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il est mis en œuvre sur un échantillon d'acides nucléiques préalablement extraits et purifiés à partir des cellules de bactéries contenues dans un mélange complexe, notamment alimentaire, ou dans de l'eau, à l'aide d'un automate d'extraction.
11. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel l'étape b) comprend au moins les sous-étapes suivantes : b1) une étape de dénaturation effectuée entre 94 et 98 °C, de préférence à environ 96 °C, pendant 15 secondes à 1 minute, de préférence 30 secondes ; b2) une étape d'hybridation réalisée entre 55 et 62 °C, de préférence à environ 60 °C, pendant 15 secondes à 1 minute, de préférence 30 secondes ; et b3) une étape d'élongation mise en oeuvre entre 55 et 72 °C, pendant 15 secondes à 2 minutes, de préférence pendant environ 30 secondes ; lesdites sous-étapes représentant un cycle d'amplification et l'étape b) comprenant au moins 40 cycles d'amplification.
12. Procédé selon la revendication 11 , comprenant en outre une étape préliminaire bO) d'activation de la Taq polymerase à environ 94 °C pendant 3 à 15 minutes, de préférence 3 à 5 minutes.
13. Couple d'amorces pour la mise en œuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, ledit couple étant choisi dans le groupe constitué de :
Ye86f (SEQ ID N°3) et Ye86r (SEQ ID N°4), ou toute séquence présentant au moins 80% d'identité avec celles-ci, pour l'amplification d'un fragment d'acide nucléique spécifique et exclusif de Yersinia enterocolitica ;
Ec97f (SEQ ID N°5) et Ec97r (SEQ ID N°6) ; ou toute séquence présentant au moins 80% d'identité avec celles-ci, pour l'amplification d'un fragment d'acide nucléique spécifique et exclusif de Escherichia coli et/ou Hafnia alvei et/ou Shigella spp. et/ou Yersinia enterocolitica ;
Se98f (SEQ ID N°7) et Se98r (SEQ ID N°8), ou toute séquence présentant au moins 80% d'identité avec celles-ci, pour l'amplification d'un fragment d'acide nucléique spécifique et exclusif de Salmonella spp. ;
Sa193f (SEQ ID N°9) et Sa193r (SEQ ID N°10), ou toute séquence présentant au moins 80% d'identité avec celles-ci, pour l'amplification d'un fragment d'acide nucléique spécifique et exclusif de Staphylococcus aureus ;
Bc84f (SEQ ID N°11) et Bc84r (SEQ ID N°12), ou toute séquence présentant au moins 80% d'identité avec celles-ci, pour l'amplification d'un fragment d'acide nucléique spécifique et exclusif de Bacillus cereus ;
Cp97f (SEQ ID N°13) et Cp97r (SEQ ID N°14), ou toute séquence présentant au moins 80% d'identité avec celles-ci, pour l'amplification d'un fragment d'acide nucléique spécifique et exclusif de Clostridium perfringens ; Cju76f (SEQ ID N°15) et Cju76r (SEQ ID N°16), ou toute séquence présentant au moins 80% d'identité avec celles-ci, pour l'amplification d'un fragment d'acide nucléique spécifique et exclusif de Campylobacter jejuni ;
Lg189f (SEQ ID N°33) et Lg69r (SEQ ID N°34), ou toute séquence présentant au moins 80% d'identité avec celles-ci, pour l'amplification d'un fragment d'acide nucléique spécifique et exclusif de Legionella spp. ; Lg69f (SEQ ID N°35) et Lg69r (SEQ ID N°34), ou toute séquence présentant au moins 80% d'identité avec celles-ci, pour l'amplification d'un fragment d'acide nucléique spécifique et exclusif de Legionella spp. ;
Lpn112f (SEQ ID N°36) et Lpn112r (SEQ ID N°37), ou toute séquence présentant au moins 80% d'identité avec celles-ci, pour l'amplification d'un fragment d'acide nucléique spécifique et exclusif de Legionella pneumophila ; et tout couple d'amorces réverse complémentaire d'un des couples mentionnés ci-dessus.
14. Couples d'amorces et sonde associées pour la mise en œuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, lesdits couples d'amorces et sonde associées étant choisis dans le groupe constitué de : LmHlyAf (SEQ ID N°1), LmHlyAr (SEQ ID N°2), et Lm113TqFT
(SEQ ID N°17), ou toute séquence présentant au moins 80% d'identité avec celles-ci ou leurs séquences réverses complémentaires, pour l'amplification en temps réel d'un fragment d'acide nucléique spécifique et exclusif de Listeria monocytogenes ; Ye86f (SEQ ID N°3), Ye86r (SEQ ID N°4), et Ye86TqFT (SEQ ID
N°18), ou toute séquence présentant au moins 80% d'identité avec celles-ci ou leurs séquences réverses complémentaires, pour l'amplification en temps réel d'un fragment d'acide nucléique spécifique et exclusif de Yersinia enterocolitica ; Ec97f (SEQ ID N°5), Ec97r (SEQ ID N°6), et Ec97TqFT (SEQ ID
N°19), ou toute séquence présentant au moins 80% d'identité avec celles-ci ou leurs séquences réverses complémentaires, pour l'amplification en temps réel d'un fragment d'acide nucléique spécifique et exclusif de Escherichia coli et/ou Hafnia alvei et/ou Shigella spp. et/ou Yersinia enterocolitica ; Se98f (SEQ ID N°7), Se98r (SEQ ID N°8), et Se98TqFT (SEQ ID
N°20), ou toute séquence présentant au moins 80% d'identité avec celles-ci ou leurs séquences réverses complémentaires, pour l'amplification en temps réel d'un fragment d'acide nucléique spécifique et exclusif de Salmonella spp. ;
Sa193f (SEQ ID N°9), Sa193r (SEQ ID N°10), et Sa193TqFT (SEQ
ID N°21), ou toute séquence présentant au moins 80% d'identité avec celles-ci ou leurs séquences réverses complémentaires, pour l'amplification en temps réel d'un fragment d'acide nucléique spécifique et exclusif de Staphylococcus aureus ;
Bc84f (SEQ ID N°11), Bc84r (SEQ ID N°12), et Bc84TqFT (SEQ ID
N°22), ou toute séquence présentant au moins 80% d'identité avec celles-ci ou leurs séquences réverses complémentaires, pour l'amplification en temps réel d'un fragment d'acide nucléique spécifique et exclusif de Bacillus cereus ;
Cp97f (SEQ ID N°13), Cp97r (SEQ ID N°14), et Cp97TqFT (SEQ ID
N°23), ou toute séquence présentant au moins 80% d'identité avec celles-ci ou leurs séquences réverses complémentaires, pour l'amplification en temps réel d'un fragment d'acide nucléique spécifique et exclusif de Clostridium perfringens ;
Cju76f (SEQ ID N°15), Cju76r (SEQ ID N°16), et Cju76TqFT (SEQ
ID N°24), ou toute séquence présentant au moins 80% d'identité avec celles-ci ou leurs séquences réverses complémentaires, pour l'amplification en temps réel d'un fragment d'acide nucléique spécifique et exclusif de Campylobacter jejuni ;
Lg189f (SEQ ID N°33), Lg69r (SEQ ID N°34), et Lg189TqFT (SEQ
ID N°38), ou toute séquence présentant au moins 80% d'identité avec celles-ci ou leurs séquences réverses complémentaires, pour l'amplification en temps réel d'un fragment d'acide nucléique spécifique et exclusif de Legionella spp. ; Lg69f (SEQ ID N°35), Lg69r (SEQ ID N°34), et Lg69TqFT (SEQ ID
N°39), ou toute séquence présentant au moins 80% d'identité avec celles-ci ou leurs séquences réverses complémentaires, pour l'amplification en temps réel d'un fragment d'acide nucléique spécifique et exclusif de Legionella spp. ; et
Lpn112f (SEQ ID N°36), Lpn112r (SEQ ID N°37), et Lpn112TqFT
(SEQ ID N°40), ou toute séquence présentant au moins 80% d'identité avec celles-ci ou leurs séquences réverses complémentaires, pour l'amplification en temps réel d'un fragment d'acide nucléique spécifique et exclusif de Legionella pneumophila.
15. Sonde nucléotidique pour la mise en œuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, ladite sonde étant spécifique et exclusive d'une espèce, un genre ou un groupe bactérien choisi parmi Yersinia enterocolitica, Escherichia coli et/ou Hafnia alvei et/ou Shigella spp. et/ou Yersinia. enterocolitica, Staphylococcus aureus, Salmonella spp., Bacillus cereus, Clostridium perfringens, Campylobacter jejuni, Legionella spp. et Legionella pneumophila et correspondant à un produit d'amplification susceptible d'être obtenu à l'aide d'un couple d'amorces de séquences choisies parmi les séquences SEQ ID N°3 à 16 et toute séquence présentant au moins 80% d'identité avec celles-ci.
16. Ensemble de sondes nucléotidiques pour la mise en œuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, comportant au moins deux sondes sélectionnées parmi le groupe constitué
- des sondes de la revendication 15 ; et
- de toute sonde spécifique et exclusive de L. monocytogenes, correspondant à un produit d'amplification susceptible d'être obtenu à l'aide d'un couple d'amorces de séquences SEQ ID N°1 et 2 ou toute séquence présentant au moins 80% d'identité avec ledit produit d'amplification.
17. Sonde nucléotidique pour la mise en œuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, ladite sonde ayant une séquence choisie parmi :
Lm113TqFT (SEQ ID N°17) et toute séquence présentant au moins 80% d'identité avec celle-ci ou avec sa séquence réverse complémentaire, lesdites séquences étant spécifiques et exclusives de Listeria monocytogenes ;
YeδδTqFT (SEQ ID N°18) et toute séquence présentant au moins 80% d'identité avec celle-ci ou avec sa séquence réverse complémentaire, lesdites séquences étant spécifiques et exclusives de Yersinia enterocolitica ;
Ec97TqFT (SEQ ID N°19) et toute séquence présentant au moins 80% d'identité avec celle-ci ou avec sa séquence réverse complémentaire, lesdites séquences étant spécifiques et exclusives de Escherichia coli et/ou Hafnia alvei et/ou Shigella spp. et ou Yersinia enterocolitica ;
Se98TqFT (SEQ ID N°20) et toute séquence présentant au moins 80% d'identité avec celle-ci ou avec sa séquence réverse complémentaire, lesdites séquences étant spécifiques et exclusives de Salmonella spp. ;
Sa193TqFT (SEQ ID N°21) et toute séquence présentant au moins 80% d'identité avec celle-ci ou avec sa séquence réverse complémentaire, lesdites séquences étant spécifiques et exclusives de Staphylococcus aureus ;
Bc84TqFT (SEQ ID N°22) et toute séquence présentant au moins 80% d'identité avec celle-ci ou avec sa séquence réverse complémentaire, lesdites séquences étant spécifiques et exclusives de Bacillus cereus ;
Cp97TqFT (SEQ ID N°23) et toute séquence présentant au moins 80% d'identité avec celle-ci ou avec sa séquence réverse complémentaire, lesdites séquences étant spécifiques et exclusives de Clostridium perfringens ; Cju76TqFT (SEQ ID N°24) et toute séquence présentant au moins
80% d'identité avec celle-ci ou avec sa séquence réverse complémentaire, lesdites séquences étant spécifiques et exclusives de Campylobacter jejuni ;
Lg189TqFT (SEQ ID N°38), et toute séquence présentant au moins 80% d'identité avec celle-ci ou avec sa séquence réverse complémentaire, lesdites séquences étant spécifiques et exclusives de Legionella spp. ;
Lg69TqFT (SEQ ID N°39), et toute séquence présentant au moins 80% d'identité avec celle-ci ou avec sa séquence réverse complémentaire, lesdites séquences étant spécifiques et exclusives de Legionella spp. ; et
Lpn112TqFT (SEQ ID N°40), et toute séquence présentant au moins 80% d'identité avec celle-ci ou avec sa séquence réverse complémentaire, lesdites séquences étant spécifiques et exclusives de Legionella pneumophila .
18. Ensemble de sondes nucléotidiques pour la mise en œuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, comportant au moins deux sondes sélectionnées parmi le groupe constitué des sondes de la revendication 17.
19. Kit pour la détection et l'identification des acides nucléiques de bactéries contenues dans un mélange complexe ou dans de l'eau, ledit kit comprenant :
- au moins deux couples d'amorces choisis dans un groupe comprenant les couples d'amorces selon la revendication 13, dont le couple d'amorces constitué par les séquences suivantes : LmHlyAf (SEQ ID N°1) et LmHlyAr (SEQ ID N°2), ou le couple d'amorces réverse complémentaire du couple {LmHlyAf, LmHlyAr}, ou toute séquence présentant au moins 80% d'identité avec celles-ci, pour l'amplification spécifique et exclusive de L. monocytogenes ;
- et/ou au moins deux sondes nucléotidiques selon la revendication 15 et/ou la revendication 17.
20. Kit pour la détection, l'identification et la quantification des acides nucléiques de bactéries contenues dans un mélange complexe ou dans de l'eau, ledit kit comprenant :
- au moins deux couples d'amorces et sondes associées selon la revendication 14 ;
- et/ou au moins deux sondes nucléotidiques selon la revendication 15 et/ou la revendication 17.
21. Micro-réseau ou puce à acides nucléiques pour la détection et l'identification de bactéries contenues dans un mélange complexe ou dans de l'eau, comprenant au moins deux couples d'amorces choisis dans un groupe comprenant les couples d'amorces selon la revendication 13 et le couple d'amorces constitué par les séquences suivantes : LmHlyAf (SEQ ID N°1) et LmHlyAr (SEQ ID N°2), ou toute séquence similaire à 80 % au moins à celles-ci, pour l'amplification spécifique et exclusive de L. monocytogenes.
22. Micro-réseau ou puce à acides nucléiques pour la détection, l'identification et la quantification de bactéries contenues dans un mélange complexe ou dans de l'eau, comprenant au moins deux couples d'amorces et sondes associées selon la revendication 14.
23. Micro-réseau ou puce à acides nucléiques pour la détection et l'identification de bactéries contenues dans un mélange complexe ou dans de l'eau, ledit micro-réseau comprenant au moins deux sondes nucléotidiques selon la revendication 15 et/ou la revendication 17.
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