WO2004032912A1 - Medicament comprenant une thiouree pour son utilisation en tant que depigmentant ou agent antimutagene et anticarcinogene - Google Patents

Medicament comprenant une thiouree pour son utilisation en tant que depigmentant ou agent antimutagene et anticarcinogene Download PDF

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Daniel Jean
Véronique SCHWAAB
Chérif RABHI
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Definitions

  • TITLE MEDICINAL PRODUCT COMPRISING THIOURAE FOR ITS USE AS A DEPIGMENTANT OR ANTIMUTAGENIC AND ANTICARCINOGENIC AGENT
  • the present invention relates to medicaments containing thioureas or their mono or dioxid derivatives, in particular having a depigmenting action, but also as an antimutagenic and / or anticarcinogenic agent.
  • melanocytes Skin pigmentation in humans comes from a complex series of cellular processes that take place in a single population of cells called melanocytes.
  • Melanocytes are located in the lower part of the epidemic, and their function is to synthesize a brown pigment, melanin, which protects the body from the damaging effects of ultraviolet radiation.
  • Melanin is deposited in the melanosomes, vesicles present inside the melanocytes.
  • Melanosomes are expelled from melanocytes and transported to the surface of the skin by keratinocytes, which assimilate the melanin contained in the melanosomes.
  • the dark shade of the skin is proportional to the amount of melanin synthesized by the melanocytes and transferred to the keratinocytes. In some cases, it is better to reduce or inhibit melanogenesis, for example, to lighten the skin, to remove age spots or to reduce the hyperactivity of melanocytes.
  • Isothiocyanates and thiocyanates have also been described as depigmenting (WO 02/058664).
  • 1,3-bis- (5-methanesulf ⁇ nylbutyl) thiourea is known to be one of the degradation products of sulforaphane (isothiocyanate having depigmenting activity: WO 02/058664) during prolonged contact with water, and in particular with hot water by the following process:
  • Mutagenesis occurs in DNA and in cell development spontaneously or naturally, or as a side effect due to chemicals, high energy radiation, stress, etc.
  • Mutagens are agents that cause such mutations. They are also often carcinogenic (i.e. capable of inducing cancer).
  • Today's society is now aware of and concerned by the presence of mutagens in its environment. Mutagens are ubiquitous; some are naturally present in plants, many others are produced by the combustion of organic materials (especially during cooking), and others are produced by industry.
  • the population is faced with many health problems. Many of these health problems are the result of damage to cells and DNA in the human body caused by mutagens and also by mutagenic factors, factors that contribute to increased damage to cells and DNA.
  • mutagens and mutagenesis factors include among others pollution, stress, aging, cigarette smoke, ultraviolet light, excessive exercise, tissue damage, etc.
  • diseases resulting from cell damage and DNA we can cite: aging, age spots, cancer, cataracts, dry skin, fatigue, skin cancer, damage caused by stress and wrinkles.
  • compositions exist to induce antimutagenic activity inside the body, they sometimes have significant side effects.
  • the present invention therefore relates to a medicament comprising at least one thiourea of general formula I below: I in which: n is an integer between 1 and 12, m is an integer between 1 and 12,
  • Ri, R 2 , R and R independently of one another represent a hydrogen atom, a C ⁇ -C 6 alkyl group or an aryl group, or at least one of its mono or dioxid derivatives of general formulas Ha , ITb and
  • C ⁇ -C 6 alkyl group is meant in the sense of the present invention any alkyl group of 1 to 6 carbon atoms, linear or branched, in particular, the group CH 3 .
  • aryl group in the sense of the present invention one or more aromatic rings having 5 to 8 carbon atoms, which can be joined or fused.
  • the aryl groups can be phenyl or naphthyl groups and can be substituted by halogen atoms, alkyl groups as defined above, the OH group or the nitro group.
  • the thioureas according to the present invention are either commercially available or can be prepared, for example for 1,3-bis (5-methanesulfinylbutyl) -thiourea, by thermal degradation of sulforaphane.
  • the mono or dioxid derivatives can be obtained from the corresponding non-oxidized thiourea by the action of an oxidizing agent such as, for example, hydrogen peroxide.
  • the medicament according to the present invention is useful for inhibiting tyrosinase, in particular reducing by 50% the action of tyrosinase, inhibiting the synthesis of melanin, reducing the hyperactivity of melanocytes.
  • the medicament according to the present invention is useful as an antimutagenic agent, in particular with respect to mutagenic substances and / or with respect to UVB, and / or as an anticarcinogenic agent .
  • this drug can prevent the appearance of cancers, in particular skin cancers, age spots, aging, in particular that of the skin, and wrinkles.
  • the present invention also relates to cosmetic compositions comprising at least one thiourea, according to the present invention, of general formula I below:
  • n is an integer between 1 and 12
  • m is an integer between 1 and 12
  • Ri, R, R and 1 ⁇ independently of one another represent a hydrogen atom, a C ⁇ -C 6 alkyl group or an aryl group, or at least one of its mono or dioxid derivatives of general formulas Ha , Ilb and III below:
  • this cosmetic composition is a depigmenting composition. It can be used to lighten, whiten or depigment the epidermis, remove skin spots, especially from old age or freckles, or prevent pigmentation of the epidermis.
  • this composition is intended for topical administration.
  • the medicament or the cosmetic composition according to the present invention is in a form for oral or topical use, advantageously for topical use.
  • He or she may be in the forms which are usually known for this type of administration, that is to say in particular lotions, mousses, gels, dispersions, sprays, serums, masks, body milks. or creams, for example, with excipients allowing in particular skin penetration in order to improve the properties and accessibility of the active principle.
  • These compositions generally contain, in addition to the drug or the cosmetic active agent according to the present invention, a physiologically acceptable medium, generally based on water or on a solvent, for example alcohols, ethers or glycols.
  • They can also contain surfactants, preservatives, stabilizing agents, emulsifiers, thickeners, other active ingredients leading to a complementary or possibly synergistic effect, trace elements, essential oils, perfumes, dyes, collagen, chemical or mineral filters, moisturizers or thermal waters.
  • the present invention also relates to a cosmetic treatment of the skin by applying to the skin a cosmetic composition according to the present invention.
  • a suspension of 25 g of lithium aluminum hydride in 400 ml of ethyl ether is prepared.
  • the suspension is then neutralized by slowly adding 80 ml of distilled water under reflux. When the boiling stops, 120 ml of distilled water are then added to complete the neutralization of the remaining hydride. Filter on sintered glass.
  • the NMR spectra of the proton and of carbon 13 were obtained on a Brucker AM 200 SY apparatus at 200 MHz for the proton, 50.3 MHz for the carbon. Chemical shifts are indicated in part per million (ppm) relative to the signal of the deuterated chloroform CDC13 at 7.25 ppm for the proton and 76.9 ppm (central line of deuterochloroform) for the carbon.
  • the mass spectra were obtained on a Normag / SIDAR V 2.3 device by chemical ionization (NH) or electronic impact techniques.
  • compositions of the different solutions used are as follows:
  • the inhibitory molecules are dissolved directly in the pH 6.8 buffer, in 50% methanol (methanol - distilled water) or in pure methanol depending on their solubility.
  • the weight-by-volume concentrations of the different inhibitor solutions are: 0.2%, 0.1%, 0.05%, 0.025%, 0.0125%, 0.00625% and 0.00312%.
  • tyrosinase The action of tyrosinase is evaluated by the initial speed of the reaction measured on the D.O.
  • the initial rates of the reactions without inhibitors (concentration 0) and the rates at the various concentrations tested are plotted on a curve.
  • the inhibitory power of a molecule is defined as the concentration which reduces the action of tyrosinase by 50%.
  • the reading is done for 3 minutes and the percentage of inhibition is calculated (inhibition speed and saturation plateau).
  • the bis MSoBT produced in the manner indicated above inhibits the enzymatic activity of tyrosinase by 50% at concentration of 8.3 mM final
  • the kojic acid shows the same percentage of inhibition at the concentration of 0.670 mM final.
  • the low solubility in water of bis MSiBT and MSBMSBT did not allow these molecules to be tested for their anti-tyrosinase effect.
  • Example 6 Study of the depigmenting effect of bis MSiBT, MSBMSBT and bis MSoBT in comparison with koiic acid and dimethylthiourea
  • the bis MSiBT, MSBMSBT and bis MSoBT molecules were also tested on melanocyte - human keratinocyte melanin co-cultures in order to test their depigmenting effect on a living system representing the melanization unit as it exists in the skin. functional human.
  • the pigmented epidermis (black phenotype / co-culture of normal keratinocytes and melanocytes at the air-liquid interface) originate and are cultured according to the recommendations of MatteKcorporation, USA. Culture media are also provided by this manufacturer.
  • the products (kjjic acid 35 mM, dimethylthiourea 2.8 mM obtained from the company Aldrich ref.: D 18,870-0, bis
  • MSiBT 2.8 mM obtained by the method indicated above, MSBMSBT 2.8 mM obtained by the method indicated above and bis MSoBT obtained by the method indicated above 2.8 mM) are applied in the culture medium for 21 days.
  • the depigmenting effect is evaluated by extracting melanin from the culture wells.
  • the extraction is carried out on a pool of two culture wells which are homogenized in 0.45 ml of sodium dodecyl sulfate (SDS) at 1% containing 0.05 mM of EDTA and 10 mM of Tris Hcl (amino-2- (hydroxymethyl) -2-propanediol-
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • bis MSiBT manifests a weaker depigmenting activity than MSBMSBT and especially that bis MSoBT, the concentration of which is necessary to obtain approximately 30% inhibition is 25 times lower than for kojic acid. which is the reference molecule widely used in the trade of products intended to lighten the skin.
  • the products according to the present invention therefore have a depigmenting activity.
  • the Vitotox test is based on bacteria containing the lux operon of Vibrio fisheri under the transcriptional control of the mutated recN promoter (controlled by the SOS system of the bacteria). After incubation of the bacteria with a genotoxic product, the recN promoter is depressed and the lux operon is expressed: light emission, emission which is proportional to the genotoxicity of the product. Certain products act directly on the production of light or increase the metabolism of bacteria, creating false positives. Also, a bacterial strain, having a constitutive lux operon is used in control. This same strain is used as a cytoxicity control (false negatives).
  • Example 7.1 evaluation of the antimutagenic effect of bis MsoBT vis-à-vis MMS (methylmethanesulfonate)
  • a genotoxic molecule is used, methylmethanesulfonate (MMS) which is compared to the genotoxicity of a mixture of reference mutagenic molecules, 4-nitroquinoline oxide and benzo (a) pyrene.
  • MMS methylmethanesulfonate
  • the MMS is placed alone or as a mixture with the bis MsoBT at increasing concentrations and the light emissions are compared. We can then define an inhibitory concentration 50 of mutagenesis.
  • Cultures of Salmonella typhimurium TA 104 recN2-4 (for the genotoxicity test) and Salmonella typhimurium TA 104 prl (for the cytotoxicity test) in Nutrient Broth medium 8 g / L are produced and then incubated at 37 ° C. agitation overnight (OD between 0.2 and 0.5 for bacteria for the genotoxicity test and between 0.4 and 0.6 for bacteria for the cytotoxicity test). The next day, the bacteria for the genotoxicity test are diluted 1/10 with Nutrient Broth medium and with Vi for the bacteria for the cytotoxicity test.
  • a stock solution of MMS at 90 mM in H 2 O was prepared and serial dilutions at '/ 2 plate 96 are performed.
  • the reference genotoxic products (4-nitroquinolineoxide (NQO) / benzo (a) pyrene (BAP)) are used at 0.4 ppm for NQO and 800 ppm for BAP).
  • the product to be tested is used with or without metabolic activation (fraction S9: microsomal homogenate containing cytochrome P450: 2.45 mL / mL final).
  • the light emission kinetics as a function of the genotoxicity and the cytotoxicity of the product, is measured for 3 hours (measurements every 5 minutes) with a Fluoroskan Ascent FL (ThermoLabsystems).
  • the products are supplied by the Sigma - Aldrich companies.
  • Bis MsoBT has a concentration 50 inhibiting the mutagenic effect of MMS of 17 p.p.m without S9 and 20 p.p.m with S9.
  • the bacterial cultures are irradiated for a period allowing an average emission of 20 light units (RLU).
  • RLU light units
  • the bis MsoBT is then placed at increasing concentrations in the culture medium before irradiation and an inhibitory concentration 50 is determined.
  • Example 2 The procedure is as in Example 1 but without MMS and by irradiating the bacterial cultures for 20 s with UVB 254 nm. Under these conditions, MsoBT has a concentration 50 inhibiting the mutagenic effect induced by UV B of 25 p.p.m.

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Abstract

La présente invention concerne un médicament ou une composition cosmétique comprenant au moins une thiourée de formule générale I suivante : I, ou au moins un de ses dérivés mono ou dioxydés de formules générales IIa, IIb et III suivantes : ou leurs mélanges. Avantageusement ce médicament est utilisé pour inhiber la tyrosinase, inhiber la synthèse de la mélanine, éclaircir ou dépigmenter l'épiderme ou éliminer les taches de vieillesse et en tant qu'agent antimutagène et anticarcinogène.

Description

TITRE : MEDICAMENT COMPRENANT UNE THIOUREE POUR SON UTILISATION EN TANT QUE DEPIGMENTANT OU AGENT ANTIMUTAGENE ET ANTICARCINOGENE
La présente invention concerne des médicaments contenant des thiourées ou leurs dérivés mono ou dioxydés, en particulier ayant une action dépigmentante, mais également en tant qu'agent antimutagène et/ou anticarcinogène.
La pigmentation de la peau chez les humains provient d'une série complexe de processus cellulaires qui s'effectue dans une unique population de cellules appelées mélanocytes. Les mélanocytes sont situés dans la partie inférieure de l'épidémie, et leur fonction est de synthétiser un pigment brun, la mélanine, qui protège le corps des effets dommageables des radiations ultra violettes. La mélanine est déposée dans les mélanosomes, vésicules présentes à l'intérieur des mélanocytes. Les mélanosomes sont expulsés des mélanocytes et véhiculés vers la surface de la peau par les kératinocytes, qui assimilent la mélanine contenue dans les mélanosomes. La teinte foncée de la peau est proportionnelle à la quantité de mélanine synthétisée par les mélanocytes et transférée aux kératinocytes. Dans certains cas, il est préférable de réduire ou d'inhiber la mélanogénèse, par exemple, pour éclaircir la peau, pour éliminer les taches de vieillesse ou pour réduire l'hyperactivité des mélanocytes.
Pendant longtemps, les compositions cosmétiques contenant un peroxyde tel que le peroxyde d'hydrogène ou le peroxyde de zinc ont été utilisées dans le but d'enlever les taches, telles que les taches de rousseur, qui apparaissent sur la peau. Toutefois, les peroxydes sont extrêmement instables et, en conséquence, leur stockage est problématique. De plus, l'incorporation stable de ces peroxydes dans des bases cosmétiques est difficile et les peroxydes eux-mêmes n'ont pas un effet suffisamment blanchissant.
D'un autre côté, des préparations cosmétiques comprenant de la vitamine C, de la cystéine ou du soufre colloïdal ont commencé à être utilisées dans le but de blanchir la peau. Toutefois, les effets de ces substances ne sont pas satisfaisants. Pendant longtemps, l'hydroquinone a été la molécule dépigmentante de référence et employée dans de nombreuses préparations de dermo-cosmétique. Toutefois, ce produit n'est pas sans danger et présente une cytotoxicité importante pour les mélanocytes susceptibles de provoquer des dépigmentations irréversibles. Récemment, l'acide kojique a été utilisé efficacement en tant que substance inhibant la formation de la mélanine dans la peau humaine. En conséquence, différentes préparations cosmétiques destinées à dépigmenter la peau et contenant de l'acide kojique (publication de brevet japonais n°56-18569) ou un ester de l'acide kojique avec un acide carboxylique aromatique telle que l'acide cinnamique ou l'acide benzoïque (publication de brevet japonais N° 60/100005) ou des diester de l'acide kojique (publications des brevets japonais N°61-60801 et 60-17961) ont été décrites. Ces acides kojiques et esters d'acide kojique sont donc connus comme étant des substances capables d'inhiber la mélanogénèse. Toutefois, l'acide kojique présente une efficacité variable selon les individus et en moyenne insuffisante.
Les isothiocyanates et thiocyanates ont également été décrits comme dépigmentant (WO 02/058664).
En conséquence, la recherche d'autres produits dépigmentants est toujours d'actualité.
Jusqu'à présent, seules les phénylthiourées ont été décrites comme possédant une activité dépigmentante (demande de brevet n° US 2002/0044914). Certaines autres thiourées comme la thiourée, la phénylthiourée et la diméthylthiourée sont connues pour être sensibilisantes (Contact and photocontact sensitivity problems assiociated with thiourea and its derivatives : A review of the literature and case reports. A. Dooms-Goosens et al., British Journal of Dermatology, 116, 4, 573-579).
Par ailleurs, certaines d'entre elles comme le carbimazole, sont utilisées comme anti-tyroïdes. De façon surprenante, les déposants ont découvert que certaines molécules appartenant à la famille des thiourée avaient un effet inhibiteur très net de la synthèse de la mélanine in vitro.
Certes, la l,3-bis-(5-méthanesulfιnylbutyl) thiourée est connue comme étant un des produits de dégradation du sulforaphane (isothiocyanate ayant une activité dépigmentante : WO 02/058664) lors d'un contact prolongé avec l'eau, et en particulier avec de l'eau chaude par le procédé suivant :
Figure imgf000004_0001
(Thermal dégradation of sulforaphane in aqueous solution, Yi Jin, Mingfu Wang, Robert T. Rosen, and Chi-Tang-Ho. J. Agric. Food Chem. 1999, 47, 3121-3123). Toutefois, son activité pharmaceutique ou cosmétique, en particulier en tant que dépigmentant n'a jamais été décrit ou suggéré dans les documents de l'art antérieur, et il n'était pas évident qu'un produit de dégradation d'un produit dépigmentant ait une activité supérieure audit produit dépigmentant.
La mutagénèse se produit dans l'ADN et dans le développement des cellules spontanément ou naturellement, ou en tant qu'effet secondaire dû à des produits chimiques, à des radiations de haute énergie, au stress, etc... Les mutagenes sont des agents qui causent de telles mutations. Ils sont aussi également souvent carcinogènes (c'est-à-dire capable d'induire le cancer). La société actuelle est maintenant au courant et concernée par la présence de mutagenes dans son environnement. Les mutagenes sont omniprésents ; certains sont naturellement présents dans les plantes, beaucoup d'autres sont produits par la combustion de matériaux organiques (en particulier durant la cuisson), et d'autres sont produits par l'industrie. De nos jours, la population se retrouve confrontée à beaucoup de problèmes de santé. Beaucoup de ces problèmes de santé sont le résultat des lésions des cellules et de l'ADN du corps humain causés par les mutagenes et mais aussi par des facteurs de mutagénèse, facteurs qui contribuent à augmenter les lésions des cellules et de l'ADN. Ces mutagenes et facteurs de mutagénèse incluent entre autres la pollution, le stress, le vieillissement, la fumée de cigarette, la lumière ultraviolette, l'exercice excessif, les lésions des tissus, etc.... Parmi les maladies résultant des lésions des cellules et de l'ADN, on peut citer : le vieillissement, les taches de vieillesse, les cancers, la cataracte, la peau sèche, la fatigue, les cancers de la peau, les dommages causés par le stress et les rides.
Bien que des compositions pharmaceutiques existent pour induire une activité antimutagene à l'intérieur du corps, elles possèdent parfois des effets secondaires significatifs.
En conséquence, un besoin existe de trouver un nouveau produit ayant un effet antimutagene pour prévenir la mutagénèse à l'intérieur du corps et un effet anticarcinogène.
De façon surprenante, les déposants ont découvert que certaines molécules appartenant à la famille des thiourées avaient un effet antimutagene et anticarcinogène très net aussi bien vis-à-vis des substances mutagenes que vis-à- vis des UVB.
La présente invention concerne donc un médicament comprenant au moins une thiourée de formule générale I suivante :
Figure imgf000006_0001
I dans laquelle : n est un nombre entier compris entre 1 et 12, m est un nombre entier compris entre 1 et 12,
Ri, R2, R et R représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un groupe alkyle en Cι-C6 ou un groupe aryle, ou au moins un de ses dérivés mono ou dioxydés de formules générales Ha, ITb et
III suivantes :
Figure imgf000006_0002
Ha Ilb
Figure imgf000006_0003
III dans lesquels les Ri, R2, R , R-, m et n sont tels que définis ci-dessus, ou leurs mélanges.
Par le terme « groupe alkyle en Cι-C6», on entend au sens de la présente invention tout groupe alkyle de 1 à 6 atomes de carbones, linéaire ou ramifié, en particulier, le groupe CH3.
Par le terme « groupe aryle », on entend au sens de la présente invention un ou plusieurs cycles aromatiques ayant 5 à 8 atomes de carbones, pouvant être accolés ou fusionnés. En particulier, les groupes aryles peuvent être des groupes phényle ou naphtyle et peuvent être substitués par des atomes d'halogène, des groupes alkyle tels que définis ci-dessus, le groupe OH ou le groupe nitro.
Avantageusement les thiourées de formules générales I, lia, Ilb et III, sont telles que les groupes Rj et R sont identiques, R et I^t sont identiques et m = n. De façon encore plus avantageuse, Ri = R2 = CH3. Avantageusement m = n = 4. De façon avantageuse R3 = R4 = H.
De façon encore plus avantageuse, il s'agit de la l,3-bis-(5-méthanesulfinylbutyl) thiourée, de la l-(5-méthanesulfinylbutyl)-3-(5-méthanesulfonylbutyl) thiourée, ou de la l,3-bis-(5-méthanesulfonylbutyl) thiourée de formules suivantes :
Figure imgf000007_0001
Les thiourées selon la présente invention sont soit disponibles commercialement, soit peuvent être préparés, par exemple pour la l,3-bis(5- méthanesulfinylbutyl)-thiourée, par dégradation thermique du sulforaphane. En particulier les dérivés mono ou dioxydés peuvent être obtenus à partir de la thiourée non oxydée correspondante par action d'un agent oxydant tel que par exemple le peroxyde d'hydrogène.
De façon avantageuse, le médicament selon la présente invention est utile pour inhiber la tyrosinase, en particulier réduire de 50 % l'action de la tyrosinase, inhiber la synthèse de la mélanine, réduire l'hyperactivité des mélanocytes.
De façon avantageuse, le médicament selon la présente invention est utile en tant qu'agent antimutagene, en particulier, vis-à-vis des substances mutagenes et/ou vis-à-vis des UVB, et/ou en tant qu'agent anticarcinogène.
Avantageusement, ce médicament peut prévenir l'apparition de cancers, en particulier de cancers de la peau, des taches de vieillesse, du vieillissement, notamment celui de la peau, et des rides.
La présente invention concerne également des compositions cosmétiques comprenant au moins une thiourée, selon la présente invention, de formule générale I suivante :
Figure imgf000008_0001
dans laquelle : n est un nombre entier compris entre 1 et 12, m est un nombre entier compris entre 1 et 12, Ri, R , R et 1^ représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un groupe alkyle en Cι-C6 ou un groupe aryle, ou au moins un de ses dérivés mono ou dioxydés de formules générales Ha, Ilb et III suivantes :
Ha Ilb
Figure imgf000009_0002
III dans lesquels les Ri, R2, R , R , m et n sont tels que définis ci-dessus, ou leurs mélanges.
Avantageusement cette composition cosmétique est une composition dépigmentante. Elle peut être utilisée pour éclaircir, blanchir ou dépigmenter l'épiderme, éliminer les taches de la peau, en particulier de vieillesse ou de rousseur, ou prévenir la pigmentation de l'épiderme. De façon avantageuse, cette composition est destinée à une administration par voie topique. De façon avantageuse, le médicament ou la composition cosmétique selon la présente invention se trouve sous une forme à usage orale ou topique, avantageusement à usage topique.
Il ou elle pourra se présenter sous les formes qui sont habituellement connues pour ce type d'administration, c'est à dire notamment les lotions, les mousses, les gels, les dispersions, les sprays, les sérums, les masques, les laits corporels ou les crèmes par exemple, avec des excipients permettant notamment une pénétration cutanée afin d'améliorer les propriétés et l'accessibilité du principe actif. Ces compositions contiennent généralement, outre le médicament ou l'actif cosmétique selon la présente invention, un milieu physiologiquement acceptable, en général à base d'eau ou de solvant, par exemple des alcools, des éthers ou des glycols. Elles peuvent également contenir des agents tensioactifs, des conservateurs, des agents stabilisants, des émulsifiants, des épaississants, d'autres principes actifs conduisant à un effet complémentaire ou éventuellement synergique, des oligo-éléments, des huiles essentielles, des parfums, des colorants, du collagène, des filtres chimiques ou minéraux, des agents hydratants ou des eaux thermales.
La présente invention concerne également un traitement cosmétique de la peau par application sur la peau d'une composition cosmétique selon la présente invention.
Les exemples suivant sont donnés à titre indicatif non limitatif.
Exemple 1 : Synthèse de la l,3-bis-(5-méthanesulfinylbutyl)-thiourée à partir du sulforaphane
Synthèse du (DX)-sulforaphane : On dissout 40 g de 4-chlorobutyronitrile (réf. Aldrich C 3,000-0) dans 800 ml d'alcool éthylique absolu préalablement distillé sur sodium.
On ajoute ensuite 27 g de méthane thioate (réf. Fluka 71742) et on laisse sous agitation à 25°C pendant 15 heures. La suspension est filtrée sur papier et évaporée sous pression réduite. On reprend par 400 ml d'éther éthylique. On filtre à nouveau sur papier. On obtient une solution éthérée contenant 32 g de 4- méthylthiobutyronitrile brut.
On prépare une suspension de 25 g d'hydrure de lithium-aluminium dans 400 ml d'éther éthylique.
On ajoute progressivement la solution de 4-méthylthiobutyronitrile à la suspension d'hydrure de lithium-aluminium, puis on porte à reflux pendant 2 h
30.
La suspension est ensuite neutralisée en ajoutant lentement et sous reflux 80 ml d'eau distillée. Quand l'ébullition cesse, on ajoute ensuite 120 ml d'eau distillée pour achever la neutralisation de l'hydrure restant. On filtre sur verre fritte.
L'insoluble est lavé sur le filtre par 200 ml d'éther éthylique. Les fractions éthérées sont réunies et évaporées à sec. On obtient 26,9 g de méthylthiobutylamine. On reprend le produit obtenu par 80 ml d'acétone à laquelle on ajoute petit à petit 23 ml de peroxyde d'hydrogène à 35 %. On place une nuit au bain-marie à 50°C.
On ajoute ensuite un peu de charbon actif, on filtre et on ajoute lentement 200 ml de chloroforme contenant 20 ml de thiophosgène, puis 300 ml d'une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium à 5 %. On laisse agir 30 min. On extrait ensuite le mélange à contre-courant par 8 fois 200 ml de dichlorométhane. La phase organique est recueillie, séchées sur sulfate de sodium et évaporée.
Le résidu est ensuite rectifié à 135 °C sous 7.10"2 Torr. On obtient 12,5 g de D,L- sulforaphane dont l'identité est vérifiée par spectrométrie de masse.
Synthèse de la l,3-bis-(5-méthanesulfinylbutyl>thiourée :
Les spectres infrarouges ont été obtenus sur un appareil Perkin-Elmer 1600 FUR
(neat).
Les spectres de RMN du proton et du carbone 13 ont été obtenus sur un appareil Brucker AM 200 SY à 200 MHz pour le proton, 50,3 MHz pour le carbone. Les déplacements chimiques sont indiqués en partie par million (ppm) par rapport au signal du chloroforme deutérié CDC13 à 7,25 ppm pour le proton et 76,9 ppm (raie centrale du deutériochloroforme) pour le carbone.
Les spectres de masse ont été obtenus sur un appareil Normag/SIDAR V 2.3 par les techniques d'ionisation chimique (NH ) ou d'impact électronique.
Chromatographie
Les réactions ont été suivies en chromatographie sur couche mince sur des plaques de type silice gel 60F 254 (Merck, Art. 7735). Réactifs et produits ont été visualisés en lumière UV puis par traitement avec une solution éthanolique à 10% d'acide phosphomolybdique suivi d'un chauffage.
Les Flash chromatographies ont été effectuées sur gel de silice ICN 60, 230-400 mesh.
Distillation des solvants L'éther éthylique et le THF ont été distillés sous azote sur sodium/benzophénone. Le cyclohexane, l'acétate d'éthyle et le méthanol utilisés pour les chromatographies ont été distillés avant emploi.
Méthode Sous atmosphère inerte, 2g (11 mmol) de sulforaphane obtenu ci-dessus sont dilués dans 15 ml d'eau, puis la solution est portée à reflux pendant 24 heures, à l'abri de la lumière.
A température ambiante, la solution est concentrée sous pression réduite et le résidu est repris par du dichlorométhane pour être chromatographie sur une colonne de gel de silice (éluant : CH2C12/ CH3OH : 90 /10) pour conduire à 1,70 g
(5 mmol) de l,3-bis-(5-méthanesulfinylbutyl)-thiourée (bis MSiBT) sous la forme d'une huile incolore, avec un rendement de 43%.
RMN 1H (300 MHz) : 6,45 (dl, 2H, NH), 3,53 (t. H, J = 6,0 Hz), 2.87 (m, 4H), 2,65 (s, 6H), 1,78 (m, 8H).
RMN 13C (50,3 MHz) : 24,0 (CH2), 32,1 (CH2), 41,2 (CH2-CH2), 47,2 (CH3), 57,4 (CH2SO), C (IV) non observe. IR (v, cm-1) : 2176, 2096, 1140, 940 cm"1.
Figure imgf000013_0001
Exemple 2 : Préparation de la l-(5-méthanesulfinylbutyl)-3-(5- méthanesulfonylbutyD-thiourée
L'oxydation d'un seul des deux atomes de soufre de la molécule de sulforaphane est obtenue en ne réalisant pas la réaction de l'exemple 1 de synthèse de la l,3-bis-(5-méthanesulfinylbutyl)-thiourée sous atmosphère inerte mais à l'air libre. lg (5,5 mmol) de sulforaphane sont dilués dans 10 ml d'eau, puis la solution est portée aux reflux pendant 24 heures, à l'abri de la lumière.
A température ambiante, la solution est concentrée sous pression réduite et le résidu est repris par du dichlorométhane pour être chromatographie sur une colonne de gel de silice (éluant : CH2C12 / CH3OH : 90/10) pour conduire à 200mg de l-(5-méthanesulfinylbutyl)-3-(5-méthanesulfonylbutyl)-thiourée (MSBMSBT) sous la forme d'une huile incolore, avec un rendement de 12%.
RMN Η (300 MHz) : 6,55 (si, 2H, NH), 3,55 (t, 4H, CH2), 3,15 (t, 2H, S02CH2), 2,80 (t, 2H, SOCH2), 2,60 (s, 3H, SOCH3), 2,90 (s, 3H, SO2CH3), 1,80-1,87 (m,
8H, CH2).
RMN ,3C (50,3 MHz) : 20,5 (CH2), 28,5 (CH2), 39,8 (CH3SO), 41,0 (CH3SO2),
43,5 (CH2-NH), 54,1 (CH2SO), 44,8 (CH2SO2), 183,35 (C=S).
IR (v, cm-1) : 2176, 2096, 1140, 940 cm"1. IC.MS m/z : 328 (MH+).
Exemple 3 : préparation de la l,3-bis-(5-méthanesulfonylbutyl) thiourée à partir de l-isothiocyanato-4- méthylsulfonylbutane
1 g, (5 mmol) d'une solution de l-isothiocyanato-4-méthylsulfonylbutane dans 15 ml d'eau est porté à reflux pendant 3 heures. A température ambiante, la solution est concentrée sous pression réduite et le résidu purifié par recristallisation au méthanol pour conduire à 535 mg de la l,3-bis-(5-méthanesulfonylbutyl) thiourée (bis MSoBT) sous la forme d'un solide beige, soit un rendement de 40%.
RMN 1H (300 MHz) : 6,50 (si, H, NH), 3,55 (t, 4H, J = 6.0 Hz), 2,75 (t, 4H, SO2CH2), 2,60 (s. 6H, SO2CH3), 1,70-1 ,90 (m, 8H, CH2CH2).
RMN ,3C (50,3 MHz) : 21,0 (CH2), 29,2 (CH2), 38,5 (CH3), 44,0 (CH2-NH), 53,9 (CH2SO), 182,6 (C=S). IR (v, cm-1) : 2168, 2096, 1144, 930 cm"1. IC.MS m/z : 344 (MH+). Point de fusion: 142 °C.
Exemple 4: préparation de la bis (MSoBT) à partir de la bis MSiBT
A une solution de bis MSiBT (1 g, 3 mmol) dans 10 ml d'acétone sont ajoutés lentement à O°C 0,70 ml (2,2 équiv., 6,6 mmol) de peroxyde d"hydrogène à 35%. Le milieu réactionnel est alors laissé évoluer à température ambiante pendant 40 heures. L'acétone est éliminée par évaporation sous vide. Le résidu aqueux est repris dans du chloroforme et la phase est directement piégée par du sulfate de sodium. La phase organique est concentrée sous vide et le résidu purifié par recristallisation au méthanol pour conduire à la bis MSoBT sous forme d'un solide beige avec un rendement de 30%.
Exemple 5: étude de l'effet anti-tyrosinase de la bis MSoBT en comparaison avec l'acide koiique
Mesure du pouvoir inhibiteur de la tyrosinase
On utilise la réaction suivante : la L Dopa (L-3,4-dihydroxyphenylalanine, obtenue chez la société Sigma (ref D-9626)) incolore est oxydée en dopachrome colorée absorbant à 475 nm. Cette réaction est catalysée par la tyrosinase fongique
(EC 1.14.18.1, obtenue chez la société Sigma (réf T-7755)). La cinétique de la réaction est enregistrée par la mesure de la densité optique (D.O.) en fonction du temps à 30° C.
Les compositions des différentes solutions utilisées sont les suivantes :
Tampon pH 6.8 :
Tampon phosphate 0,1 M, pH 6,8
Solution de substrat :
5mM de L-DOPA dans la solution tampon pH 6,8
Solutions d'inhibiteurs :
Les molécules inhibitrices sont dissoutes directement dans le tampon pH 6,8, dans le méthanol à 50 % (méthanol - eau distillée) ou dans le méthanol pur selon leur solubilité.
Les concentrations en poids par volume des différentes solutions d'inhibiteurs sont : 0,2 %, 0,1 %, 0,05 %, 0,025 %, 0,0125 %, 0,00625 % et 0,00312 %.
Solution d'enzyme :
250 unités de tyrosinase dans la solution tampon pH 6,8.
L'action de la tyrosinase est évaluée par la vitesse initiale de la réaction mesurée sur les enregistrements de D.O.
On porte sur une courbe les vitesses initiales des réactions sans inhibiteurs (concentration 0) et les vitesses aux diverses concentrations testées. Le pouvoir inhibiteur d'une molécule est défini comme la concentration qui réduit de 50 % l'action de la tyrosinase.
La lecture se fait pendant 3mn et le pourcentage d"inhibition est calculé (vitesse d'inhibition et plateau de saturation). La bis MSoBT fabriquée de la façon indiquée ci-dessus, inhibe l'activité enzymatique de la tyrosinase de 50 % à la concentration de 8,3 mM final. L'acide kojique (obtenu chez la société Aldrich ref. : 22,046-9) montre le même pourcentage d'inhibition à la concentration de 0,670 mM final. La faible solubilité dans l'eau de la bis MSiBT et de la MSBMSBT n'a pas permis de tester ces molécules pour leur effet anti-tyrosinase.
Exemple 6 : étude de l'effet dépigmentant de la bis MSiBT, de la MSBMSBT et de la bis MSoBT en comparaison avec l'acide koiique et la diméthylthiourée
Les molécules bis MSiBT, MSBMSBT et bis MSoBT ont également été testés sur des co-cultures mélanocytes - kératinocytes humains produisant de la mélanine afin de tester leur effet dépigmentant sur un système vivant représentant l'unité de mélanisation telle qu'elle existe dans la peau humaine fonctionnelle.
L'acide kojique et la diméthylthiourée ont été utilisés comme témoins positifs dans ce test.
Les épidermes pigmentés (phénotype noir / co-culture de kératinocytes et mélanocytes normaux à l'interface air - liquide) proviennent et sont cultivés selon les recommandations de MatteKcorporation, USA. Les milieux de cultures sont fournis également par ce fabricant. Les produits (acide kojique 35 mM, diméthylthiourée 2,8 mM obtenue chez la société Aldrich ref. : D 18,870-0, bis
MSiBT 2,8 mM obtenu par le procédé indiqué ci-dessus, MSBMSBT 2,8 mM obtenu par le procédé indiqué ci-dessus et bis MSoBT obtenu par le procédé indiqué ci-dessus 2,8 mM) sont appliqués dans le milieu de culture pendant 21 jours.
Chaque produit est appliqué à quatre puits de culture en solution dans du milieu de culture. L'effet dépigmentant des produits est nettement visible puisque les épidermes témoins se pigmentent progressivement alors que les épidermes traités par les produits les plus actifs montrent une pigmentation nettement moins foncée.
L'évaluation de l'effet dépigmentant est réalisée par extraction de la mélanine des puits de culture.
L'extraction est réalisée sur un pool de deux puits de culture qui sont homogénéisés dans 0,45 ml de sodium dodécyl sulfate (SDS) à 1% contenant 0,05 mM d'EDTA et 10 mM de Tris Hcl (amino-2-(hydroxyméthyl)-2-propanediol-
1,3), pH 6,8. A chaque homogénat. 20 μl de protéinase K à 5 mg/ml est ajoutée. La digestion est réalisée pendant une nuit à 45°C. On ajoute ensuite à nouveau 20 μl de protéinase K et l'incubation est poursuivie pendant 4 heures. On ajoute ensuite 50 μl de solution 0,5 M de carbonate de sodium et 10 μl d'une solution à 30% de peroxyde d'hydrogène. Les échantillons sont maintenus à 80°C pendant 30 min et refroidis. Les échantillons sont extraits par 100 μl d'un mélange chloroforme- méthanol (2 : 1, v/v). Après centrifugation à 10,000 g pendant 10 min, la densité optique du surnageant est mesurée à 405 nm. Les produits sont comparés entre eux dans le tableau 1 suivant (les résultats sont exprimés en pourcentage d'inhibition de la mélanine dans les co-cultures) :
Figure imgf000017_0001
D'une façon surprenante, la bis MSiBT manifeste une activité dépigmentante plus faible que la MSBMSBT et surtout que la bis MSoBT dont la concentration nécessaire à l'obtention de 30% d'inhibition environ est 25 fois plus faible que pour l'acide kojique qui est la molécule de référence largement utilisée dans le commerce des produits destinés à éclaircir la peau. Les produits selon la présente invention possèdent donc une activité dépigmentante.
Exemple 7 : évaluation de l'effet antimutagene de la bis MsoBT
Cette propriété a été mise en évidence dans une version modifiée du test de Ames, le test Vitotox lOkit (6400000) de la société Thermolab Systems.
D'une façon générale le test Vitotox est basé sur des bactéries contenant l'operon lux de Vibrio fisheri sous le contrôle transcriptionnel du promoteur recN muté (contrôlé par le système SOS de la bactérie). Après incubation des bactéries avec un produit génotoxique, le promoteur recN est déréprimé et l'operon lux s'exprime : émission de lumière, émission qui est proportionnelle à la genotoxicite du produit. Certains produits agissent directement sur la production de lumière ou augmentent le métabolisme des bactéries, créant de faux positifs. Aussi, une souche bactérienne, possédant un opéron lux constitutif est utilisée en contrôle. Cette même souche est utilisée comme contrôle de cytoxicité (faux négatifs).
Exemple 7.1. : évaluation de l'effet antimutagene de la bis MsoBT vis-à-vis du MMS (methylméthanesulfonate)
Afin de tester l'effet antimutagene vis-à-vis de molécules génotoxiques, on utilise une molécule génotoxique, le methylméthanesulfonate (MMS) que l'on compare à la genotoxicite d'un mélange de molécules mutagenes de référence, 4- nitroquinoline oxide et benzo(a)pyrene. Le MMS est placé seul ou en mélange avec la bis MsoBT à des concentrations croissantes et on compare les émissions de lumière. On peut alors définir une concentration inhibitrice 50 de la mutagénèse.
Des cultures de Salmonella typhimurium TA 104 recN2-4 (pour le test de la genotoxicite) et de Salmonella typhimurium TA 104 prl (pour le test de la cytotoxicité) dans du milieu Nutrient Broth 8g/L sont réalisées puis incubées à 37°C sous agitation pendant une nuit (DO comprise entre 0,2 et 0,5 pour les bactéries pour le test de genotoxicite et entre 0,4 et 0,6 pour les bactéries pour le test de cytotoxicité). Le lendemain, les bactéries pour le test de genotoxicite sont diluées au 1/10 avec du milieu Nutrient Broth et au Vi pour les bactéries pour le test de cytotoxicité.
Une solution mère de MMS à 90 mM dans de l'H2O est préparée et des dilutions sériées au '/2 dans plaque 96 sont réalisées. Les produits génotoxiques de référence (4-nitroquinolineoxide (NQO)/benzo(a)pyrene(BAP)) sont utilisés à 0,4 ppm pour le NQO et 800 ppm pour le BAP). Le produit à tester est utilisé avec ou sans activation métabolique (fraction S9 : homogénat microsomal contenant du cytochrome P450 : 2,45 mL/mL finale).
La cinétique d'émission de lumière, en fonction de la genotoxicite et de la cytotoxicité du produit, est mesurée pendant 3 heures (mesures toutes les 5 minutes) avec un Fluoroskan Ascent FL (ThermoLabsystems).
Les produits sont fournis par les sociétés Sigma - Aldrich.
Résultats :
La bis MsoBT présente une concentration inhibitrice 50 de l'effet mutagène du MMS de 17 p.p.m sans S9 et de 20 p.p.m avec S9.
Exemple 7.2 : évaluation de l'effet antimutagene de la bis MsoBT vis-à-vis des UV B
Afin d'évaluer l'effet antimutagene vis-à-vis des UVB, les cultures bactériennes sont irradiées pendant une durée permettant une émission moyenne de 20 unités lumineuses (RLU). On place ensuite la bis MsoBT à concentrations croissantes dans le milieu de culture avant irradiation et on détermine une concentration inhibitrice 50.
On opère comme dans l'exemple 1 mais sans MMS et en irradiant les cultures bactériennes pendant 20 s par des UVB 254 nm. Dans ces conditions, la MsoBT présente une concentration inhibitrice 50 de l'effet mutagène induit par les UV B de 25 p.p.m.

Claims

REVENDICATIONS
1. Médicament comprenant au moins une thiourée de formule générale I suivante
Figure imgf000020_0001
dans laquelle : n est un nombre entier compris entre 1 et 12, m est un nombre entier compris entre 1 et 12,
Ri, R2, R et IL* représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un groupe alkyle en Cι-C6 ou un groupe aryle, ou au moins un de ses dérivés mono ou dioxydés de formules générales Ha, Ilb et
III suivantes :
Figure imgf000020_0002
Ha Ilb
Figure imgf000021_0001
III
dans lesquels les Ri, R2, R3, P , m et n sont tels que définis ci-dessus. ou leurs mélanges.
2. Médicament selon la revendication 1 pour inhiber la tyrosinase, inhiber la synthèse de la mélanine, ou réduire l'hyperactivité des mélanocytes.
3. Médicament selon la revendication 1 en tant qu'agent antimutagene et/ou anticarcinogène.
4. Médicament selon la revendication 3 pour prévenir l'apparition du cancer, en particulier du cancer de la peau.
5. Médicament selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les groupes Ri et R2 sont identiques, R et R4 sont identiques et m = n.
6. Médicament selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que Ri = R2 = CH3.
7. Médicament selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que et m = n = 4.
8. Médicament selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que R3 = R4 = H.
9. Médicament selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce qu'il se trouve sous une forme à usage topique.
10. Composition cosmétique dépigmentante comprenant au moins une thiourée de formule générale I suivante :
Figure imgf000022_0001
dans laquelle : n est un nombre entier compris entre 1 et 12, m est un nombre entier compris entre 1 et 12,
Ri, R2, R et R représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un groupe alkyle en Cι-C6 ou un groupe aryle, ou au moins un de ses dérivés mono ou dioxydés de formules générales lia, Ilb et
III suivantes :
Figure imgf000022_0002
lia Ilb
Figure imgf000023_0001
III
dans lesquels les Ri, R2, R , R4, m et n sont tels que définis ci-dessus, ou leurs mélanges.
11. Utilisation d'une composition cosmétique selon la revendication 10 pour éclaircir, blanchir ou dépigmenter l'épiderme, éliminer les taches de la peau, en particulier de vieillesse ou de rousseur, ou prévenir la pigmentation de l'épiderme.
PCT/FR2003/002907 2002-10-11 2003-10-03 Medicament comprenant une thiouree pour son utilisation en tant que depigmentant ou agent antimutagene et anticarcinogene Ceased WO2004032912A1 (fr)

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