WO2004040312A2 - Proceded de dosage du ngf pour le diagnostic in vitro du cancer du sein et utilisation en therapie - Google Patents

Proceded de dosage du ngf pour le diagnostic in vitro du cancer du sein et utilisation en therapie Download PDF

Info

Publication number
WO2004040312A2
WO2004040312A2 PCT/FR2003/003193 FR0303193W WO2004040312A2 WO 2004040312 A2 WO2004040312 A2 WO 2004040312A2 FR 0303193 W FR0303193 W FR 0303193W WO 2004040312 A2 WO2004040312 A2 WO 2004040312A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
ngf
cells
breast cancer
biological sample
inhibitor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR2003/003193
Other languages
English (en)
Other versions
WO2004040312A3 (fr
Inventor
Eric Adriaenssens
Geneviève CHOQUET-KASTYLEVSKY
Laurent Dolle
Belkoura Ikram El-Yazidi
Hubert Hondermarck
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biomerieux SA
Universite Lille 1 Sciences et Technologies
Original Assignee
Biomerieux SA
Universite Lille 1 Sciences et Technologies
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biomerieux SA, Universite Lille 1 Sciences et Technologies filed Critical Biomerieux SA
Priority to EP03778473A priority Critical patent/EP1556699B1/fr
Priority to DE60326871T priority patent/DE60326871D1/de
Priority to JP2004547728A priority patent/JP4619125B2/ja
Priority to US10/530,568 priority patent/US7618790B2/en
Priority to AU2003285472A priority patent/AU2003285472B2/en
Priority to BRPI0315735A priority patent/BRPI0315735B8/pt
Publication of WO2004040312A2 publication Critical patent/WO2004040312A2/fr
Publication of WO2004040312A3 publication Critical patent/WO2004040312A3/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/55—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole
    • A61K31/553—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole having at least one nitrogen and one oxygen as ring hetero atoms, e.g. loxapine, staurosporine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors
    • G01N2333/48—Nerve growth factor [NGF]

Definitions

  • the present invention relates to the field of oncology. More particularly, the subject of the present invention is a method of diagnosing breast cancer in a human patient by determining the presence of nerve growth factor (NGF) in a biological sample originating from this patient, said method being able to be used both in early diagnosis, screening, therapeutic monitoring, prognosis, as in the diagnosis of relapses in the context of breast cancer.
  • NGF nerve growth factor
  • the present invention also relates to therapy.
  • breast cancer is the leading cause of death from cancer in industrialized countries. It is estimated that the minimum size of a tumor detectable by mammography is 1 cm. Breast cancer develops slowly. However, this small tumor has an evolutionary past of 8 years on average at diagnosis. The etiology of breast cancer is not well defined. Family predispositions have been highlighted. Age is the most important risk factor. Thus, the risk increases by 0.5% per year of age in Western countries. Other risk factors are known such as the number of pregnancies and the age of the first pregnancy, breastfeeding, the age of puberty and menopause, estrogen treatments after the onset of menopause, stress. and nutrition.
  • the test available and used in mass screening for breast cancer is an imaging technique: mammography. Thanks to this technique, mortality due to breast cancer has greatly decreased (30% reduction in mortality), which underlines the importance of tumor screening in terms of public health.
  • screening techniques suffer from a number of handicaps. Mammography requires high-performance equipment and qualified personnel, which is expensive for mass screening.
  • characterization of a tumor in terms of malignancy is carried out after its discovery by histological methods in specialized laboratories.
  • a set of parameters such as the size of the tumor, its grade Histopathology, associated inflammation and lymph node invasion are used to decide on therapy and to estimate the prognosis of the disease.
  • the molecular phenomena leading to the development of breast cancer involve changes in the structure and expression of oncogenes (such as ras) and tumor suppressor genes such as p53.
  • oncogenes such as ras
  • tumor suppressor genes such as p53.
  • the growth of tumor cells in most breast cancers is dependent on estrogen hormones (estradiol and progesterone) and growth factors that control proliferation, migration and apoptosis.
  • These growth factors either stimulate or inhibit proliferation, migration and differentiation of tumor cells so as to act in concert to promote the growth of cancer and metastases.
  • insulin-like growth factors, transforming growth factor ⁇ (TGF- ⁇ ), and fibroblast growth factors (FGF) can all stimulate the proliferation of breast cancer cells, while the inhibitor breast-derived growth factor (MDGI) and transforming growth factor ⁇ (TGF- ⁇ ) inhibit their growth.
  • MDGI inhibitor breast-derived growth factor
  • TGF- ⁇ transforming growth factor ⁇
  • NGF neurotrophic family of polypeptides
  • a major biological function of NGF is the maintenance and survival of post-mitotic neurons, which makes it an important candidate for the treatment of neurodegenerative diseases.
  • NGF also has significant effects on non-neuronal cells. So, for example, it is an autocrine factor for B cell survival (Torcia, M., et al., 1996, Cell, 85, 345-356).
  • NGF tumor necrosis factor
  • NGF neurotrophic factor
  • the Applicant has now surprisingly demonstrated that breast cancer cells themselves produce NGF, while corresponding normal breast epithelial cells do not produce it, so that NGF can be used as a marker. tumor or as a therapeutic target.
  • the presence of the invention first relates to a method of diagnosing breast cancer by determining the presence of NGF in biological samples from patients suspected of having breast cancer.
  • the method of the invention therefore makes it possible to diagnose breast cancer by a simple test consisting in searching for the presence of NGF in a biological sample taken from a patient.
  • the Applicant has unexpectedly shown that cancer cells produce NGF, while the corresponding non-cancer cells are incapable thereof, as will be demonstrated in more detail below.
  • the determination of the presence of NGF in the sample makes it possible to conclude that the pathology sought, the absence of NGF making it possible to conclude that there is no pathology.
  • NGF NGF mRNA
  • the determination of the presence of NGF by direct detection of NGF constitutes a particular embodiment of the invention.
  • direct detection of NGF is meant the detection of NGF itself in the biological sample.
  • Direct detection of NGF in the biological sample can be implemented work by any means known to those skilled in the art, such as for example by immunological test or by mass spectrometry, which constitutes a particular embodiment of the invention.
  • the immunological test can be any test widely known to those skilled in the art involving immunological reactions, namely reactions between NGF and a specific binding partner for NGF.
  • the specific NGF liaison partners are any partner likely to bind to the NGF.
  • antibodies, antibody fractions, receptors and any other protein capable of binding to NGF are either polyclonal antibodies or monoclonal antibodies.
  • the polyclonal antibodies can be obtained by immunization of an animal with NGF, followed by the recovery of the antibodies sought in purified form, by sampling the serum of said animal, and separation of said antibodies from the other constituents of the serum, in particular by affinity chromatography on a column on which is fixed an antigen specifically recognized by the antibodies, in particular NGF.
  • Monoclonal antibodies can be obtained by the hybridoma technique, the general principle of which is recalled below.
  • an animal generally a mouse
  • NGF neutrophil-derived factor receptor 1
  • B lymphocytes of which are then capable of producing antibodies against said antigen.
  • These antibody-producing lymphocytes are then fused with "immortal" myeloma cells (murine in the example) to give rise to hybridomas.
  • a selection is then made of cells capable of producing a particular antibody and of multiplying indefinitely.
  • Each hybridoma is multiplied in the form of a clone, each leading to the production of a monoclonal antibody whose recognition properties with respect to the tumor antigen of interest can be tested, for example by ELISA, by immunoblotting in one or two dimensions, in immunofiuorescence, or using a biosensor.
  • Monoclonal antibodies as well selected, are subsequently purified in particular according to the affinity chromatography technique described above.
  • anti-NGF antibodies are known and are available in particular in the catalog of R&D Systems or Santa Cruz.
  • the specific NGF binding partners may be labeled for the revelation of the NGF / binding partner binding when the binding partner is used as detection reagent, and therefore for the direct detection of NGF in the biological sample.
  • binding partners By labeling the binding partners is meant the binding of a marker capable of directly or indirectly generating a detectable signal.
  • a marker capable of directly or indirectly generating a detectable signal.
  • the enzymes which produce a detectable signal for example by colorimetry, fluorescence, luminescence, such as horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, • chromophores such as fluorescent, luminescent compounds, colorants,
  • radioactive molecules such as P, S or I
  • fluorescent molecules such as alexa or phycocyanins.
  • Indirect systems can also be used, such as for example ligands capable of reacting with an anti-ligand.
  • the ligand / anti-ligand pairs are well known to those skilled in the art, which is the case for example of the following couples: biotin / streptavidin, hapten / antibody, antigen / antibody, peptide / antibody, sugar / lectin, polynucleotide / complementary to the polynucleotide. In this case, it is the ligand which carries the binding agent.
  • the anti-ligand can be detectable directly by the markers described in the preceding paragraph or be itself detectable by a ligand / anti-ligand.
  • immunological tests as defined above, mention may be made of the “sandwich” methods such as ELISA, IRMA and RIA, the so-called competition methods and the direct immunodetection methods such as immunohistochemistry, immunocytochemistry, Western-blot and Dot-blot.
  • Mass spectrometry can also be used for the direct detection of NGF in the biological sample.
  • the principle of spectrometry is widely known to those skilled in the art and is described for example in Patterson, S., 2000, Mass spectrometry and proteomics. Physiological Genomics 2, 59-65.
  • the biological sample previously treated or not is passed through a mass spectrometer and the spectrum obtained is compared with that of NGF.
  • An example of prior treatment of the sample consists in passing it over an immunosensor support comprising one of the NGF binding partners, for example an antibody directed against NGF.
  • the biological sample used for the direct detection of NGF which may contain NGF as such, may be constituted by biological fluid or a tissue originating from the biopsy of the tumor or metastases of the patient considered.
  • biological fluid mention may be made of blood, bone marrow, milk, cerebrospinal fluid, urine and effusions.
  • the biological fluid which constitutes a particular embodiment of the invention, may require special treatment.
  • the biological fluid can contain NGF as such, or it can contain circulating tumor cells which contain NGF, and possibly circulating tumor cells which are capable of secreting NGF.
  • the biological fluid is previously treated to isolate the circulating tumor cells contained in said fluid.
  • isolating the circulating tumor cells is meant to obtain a cell fraction enriched in circulating tumor cells.
  • Fluid treatment to isolate circulating tumor cells can be performed by cell sorting in a flow cytometer, by enrichment on Ficoll, by enrichment with magnetic beads covered with specific antibodies, or by any other specific enrichment method known to those skilled in the art.
  • the circulating tumor cells can be isolated using a cell separation technique on Ficoll associated with depletion of blood cells using anti-CD45 antibodies coupled to magnetic beads ( Dynal Biotech ASA, Norway).
  • the direct detection of NGF can then be carried out directly from circulating tumor cells isolated from the biological fluid, for example by immunocytochemical labeling of these cells with an anti-NGF antibody, after having deposited the circulating tumor cells on a slide by cytospin.
  • Direct detection of NGF can also be carried out directly in circulating tumor cells using the flow cytometry method as described in Mciezeau P, Ronot X, Le Noan-Merdrignac G, Ratinaud MH, Flow cytometry for the study of the normal or pathological cell (Volume I), Eds Medsi-MacGrawhill.
  • said circulating cells can be treated under conditions allowing blocking of the NGF inside said cells.
  • Such processing is described for example in Intracellular Flow Cytometry, Applied reagents and Techniques, pp 1-21, BD Pharmingen.
  • the detection of NGF is then done after permeability of the cell membrane to bring in the specific binding partners of NGF.
  • Direct detection of NGF from circulating cells can also be carried out using the method described in patent application WO03 / 076942 filed by one of the Applicants.
  • the direct detection of NGF in tumor cells can also be carried out in the culture medium of said cells after having grown them under conditions such that they secrete NGF.
  • These culture conditions are conventional conditions such as 37 ° C. in a humid atmosphere and at 5% CO 2 .
  • the biological sample to be tested is tissue originating from the biopsy of the tumor or from the metastases of the patient, which constitutes an embodiment particular of the invention, the direct detection of NGF is carried out directly on the sections obtained, without prior treatment of said tissue.
  • Another mode of detecting the presence of NGF consists in the culture, in the presence of the biological sample, of cells sensitive to NGF, which constitutes a particular embodiment of the invention.
  • cells sensitive to NGF any cell stimulated in the presence of NGF (growth, apotosis, etc.).
  • NGF growth, apotosis, etc.
  • the biological sample which can be used for the detection of the presence of NGF by culturing cells sensitive to NGF can be any sample as described above.
  • the biological sample can consist of biological fluid, if necessary previously treated to isolate the circulating tumor cells, themselves which can then be cultured under conditions such that they secrete NGF, as described above.
  • Another mode of detecting the presence of NGF in biological samples consists in detecting the NGF mRNA in said sample, which constitutes another embodiment of the invention.
  • It can for example be implemented by hybridization reactions between the target mRNA and a nucleic acid capable of binding to the target mRNA.
  • nucleic acid is intended to mean oligonucleotides, deoxyribonucleic acids and ribonucleic acids, as well as their derivatives.
  • oligonucleotide designates a sequence of at least 2 nucleotides
  • modified nucleotide is meant, for example, a nucleotide comprising a modified base and / or comprising a modification at the level of the internucleotide bond and / or at the level of the skeleton.
  • modified base mention may be made of inosine, methyl-5-deoxycytidine, dimethylamino-5-deoxyuridine, diamino-2,6-purine and bromo-5-deoxyuridine.
  • Alpha-oligonucleotides such as those described in FR-A-2 607 507, LNAs such as phosphorothioate-LNA and 2'-thio-LNA described in Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Volume 8, Issue 16, 18 August 1998 .pages 2219-2222, and the PNAs which are the subject of the article by M. Egholm et al., J. Am. Chem. Soc. (1992), 114, 1895-1897, are examples of oligonucleotides consisting of nucleotides whose skeleton is modified. The revelation of the hybridization reactions can be carried out by labeling the binding nucleic acids, as illustrated above.
  • the target mRNA can be extracted by methods known to those skilled in the art, then optionally amplified, such as for example by RT-PCR or by NASBA (Maleck, L., et al ., 1994, Methods in Molecular Biology, 28, ch 36, Ed PG Isaac, Humana Press, Inc., Totowa, NJ).
  • the biological sample which can be used for the detection of the presence of NGF by detection of NGF mRNA can be any sample as described above.
  • the biological sample can consist of tissue obtained from a tumor or metastasis biopsy, or else from biological fluid, if necessary previously treated to isolate the circulating tumor cells, as described above.
  • the method of the invention can be used both for early diagnosis and for screening, therapeutic monitoring, prognosis and diagnosis of relapses in the context of breast cancer since only cancer cells produce NGF and this production is a function of the grade of the cancer.
  • Another object of the invention thus consists in the use of the method of the invention in the early diagnosis, screening, therapeutic monitoring, prognosis and diagnosis of relapses in the context of breast cancer.
  • NGF can also have a role of therapeutic target.
  • NGF binding agent capable of blocking cell proliferation or by an NGF inhibitor.
  • NGF binding partners and NGF inhibitors can therefore be used as drugs.
  • the subject of the present invention is also the use of an NGF binding partner or an NGF inhibitor for the preparation of a medicament, it being understood that, in the context of cancer, the binding partners of the NGF are not receptors for NGF or active fragments of these receptors.
  • said medicament is useful for blocking tumor proliferation and remote dissemination in patients with breast cancer.
  • compositions comprising as active principle at least one NGF binding partner or an NGF inhibitor, optionally in combination with a pharmaceutically acceptable excipient, are also included in the invention, it being understood that, in the context of cancer, NGF binding partners are not receptors for NGF or active fragments of these receptors.
  • compositions useful against breast cancer include, as active ingredient, at least one NGF binding partner capable of blocking cell tumor proliferation or an NGF inhibitor.
  • the specific NGF binding partners suitable as active principle are in particular as defined above in the immunological tests and can be any other partner known to those skilled in the art capable of blocking tumor proliferation.
  • the specific partner capable of blocking the proliferation of breast cancer cells is an antibody anti-NGF.
  • NGF inhibitor direct inhibitors of NGF, that is to say inhibitors blocking the biological activity of the protein, inhibitors of the NGF exocytosis pathways, inhibitors of NGF mRNA and inhibitors of the gene encoding NGF.
  • Inhibitors of the protein exocytosis pathways and in particular of NGF are widely known to those skilled in the art.
  • a synthetic fragment of this mRNA can be used as an inhibitor of the NGF mRNA.
  • RNA interference technology is based on the use of a double-stranded RNA oligonucleotide corresponding to a short sequence of cellular mRNA to be inhibited. This duplex oligonucleotide (introduced or not into a plasmid), after entering the cell, is taken up by the Dicer / Risc enzymatic system, which will lead to the degradation of the corresponding cellular mRNA (Dykxhoorn D et al., 2003, Nature Reviews, vol. 4, p457-467).
  • an antisense oligonucleotide of NGF As an inhibitor of the gene coding for NGF, there may be mentioned an antisense oligonucleotide of NGF.
  • This oligonucleotide can be easily prepared by a person skilled in the art.
  • the latter can be put into conditions such that they specifically penetrate into the cells of interest, such as tumor cells, which constitutes another mode of realization of the invention.
  • a partner which allows such penetration such as for example a carrier molecule, a polymer such as the polymers used in gene therapy or else a viral vector such as adenoviruses and poxviruses, also used in gene therapy.
  • the carrier molecule can be an anti-MUCl antibody or an anti-epithelial cell antibody, or alternatively an anti-HER-2 / neu antibody.
  • the pharmaceutical composition comprises, as active principle, an NGF binding partner or an NGF inhibitor such as a direct inhibitor or an inhibitor of the NGF exocytosis pathways, the latter are placed under conditions such as they penetrate specifically into the tumor cells of interest, the inhibitors of the NGF mRNA and the inhibitors of the gene coding for NGF having the capacity to penetrate naturally into said cells.
  • compositions of the invention for oral, sublingual, subcutaneous, intramuscular, intratumoral, intravenous, topical, local, intratracheal, intranasal, transdermal, rectal, intraocular, intra-auricular administration, said active principle capable of being administered in unit administration form.
  • the unit administration forms can be, for example tablets, capsules, granules, powders, injectable oral solutions or suspensions, transdermal patches (“patch”), sublingual, buccal, intratracheal, intraocular administration forms. , intranasal, in-ear, inhalation, topical, transdermal, subcutaneous, intramuscular, intratumoral or intravenous administration forms, rectal administration forms or implants.
  • transdermal patches (“patch”)
  • sublingual, buccal, intratracheal intraocular administration forms.
  • intranasal, in-ear, inhalation topical, transdermal, subcutaneous, intramuscular, intratumoral or intravenous administration forms, rectal administration forms or implants.
  • creams, gels, ointments, lotions or eye drops can be considered.
  • Said unit forms are dosed to allow daily administration of 0.001 to 10 mg of active principle per kg of body weight, depending on the dosage form.
  • the present invention also relates to a method of treating breast cancer which comprises administering to a patient an effective dose of an NGF binding partner or an NGF inhibitor .
  • FIG. 1 relates to graphic representations relating to the demonstration of the expression of NGF in cancer cells, in which:
  • FIG. 1A represents an electrophoresis gel showing, after RT-PCR, the secretion of NGF by the cancer cells MCF-7, T47D, MDA-
  • MB-231 and BT20 and by the cells of the submaxillary gland as a control, as well as the absence of such secretion by normal NBEC cells (Normal Breast Epithelial Cells),
  • FIG. 1B represents an electrophoresis gel demonstrating, after immunoblotting, the secretion of NGF by the cancer cells MCF-7,
  • FIG. 1C is a graph giving the quantity of NGF secreted as a function of the cells tested by ELISA, namely the cancer cells MCF-7, T47D, MDA-MB-231 and BT20, the cells of the submaxillary gland and the cells
  • FIG. 2 relates to representations on the coculture of cancer cells and of cells sensitive to NGF, in which:
  • FIG. 2A represents the experimental scheme for coculture of PC 12 cells (1) developing in the presence of NGF and cancer cells (2), and
  • FIG. 2B consists of photographs representing the culture of PCI 2 cells as a control (photo 2), the differentiation of PC 12 cells under the influence of NGF (photo 3), the coculture of cells sensitive to NGF in the presence of MCF-7 cancer cells (photo 4), culture of MCF-7 cancer cells in the presence of an anti-NGF antibody (photo 5), culture of cancer cells MCF-7 in the presence of the inhibitor K252a (photo 6), and the culture of normal breast cells NBEC (photo 7)
  • FIG. 3 shows photographs of immunocytochemistry highlighting the expression of NGF by immunodetection in tissue from biopsy, in which photos A and B relate to normal tissue, respectively with or without labeling with NGF, photos C to F for cancerous tissue, photos C and E for sections without NGF labeling (negative control) and photos D and F for sections with NGF labeling,
  • FIG. 4 relates to graphs showing the influence of a binding partner capable of blocking the proliferation of breast cancer cells on cell growth, in which:
  • FIG. 4A represents a graph showing the growth of MCF-7 cells in number of cells (10 4 cells / 35 mm disc), either without an agent for blocking tumor proliferation as a control, or in the presence of anti-NGF antibody MAB-256, either in the presence of the inhibitor K-252a, and
  • FIGS. 4B and 4C represent graphs giving the number of MCF-7 cells as a function of the dose of the antibody MAB-256 (FIG. 4B) or of the dose of the inhibitor K-252a (FIG. 4C) and
  • Figure 5 gives graphs highlighting the influence of an anti-NGF antibody, as a function of time, on tumor volume ( Figure 5A), on tumor mass
  • HEPES 20 raM 2 g / 1 sodium bicarbonate, 2 mM L-glutamine, 10% fetal calf serum (FCS), 100 units / ml penicillin-streptomycin, 50 ⁇ g / ml gentamycin, 1% non-essential amino acids and 5 ⁇ g / ml insulin.
  • FCS fetal calf serum
  • NBEC normal breast epithelial cells
  • DMEM / F12 medium 1/1 (BioWhittaker) containing 5% FCS, 10 IU / ml insulin, 5 ⁇ M cortisol, 2 ng / ml EGF, 100 ng / ml cholera toxin, 100 ng / ml penicillin and 45 ⁇ g / ml gentamycin (medium Bl).
  • RNA extracted was quantified by measuring the absorbance at 260 nm and the purity of the RNA was sought by the absorbance ratio at 260 nm and at 280 nm. The absence of RNA degradation was confirmed by RNA electrophoresis on a 1.5% agarose gel containing ethidium bromide.
  • Reverse transcriptase (RT) was carried out by adding a reaction mixture containing 2 g of purified total mRNA, IX reaction buffer, 10 mM of DTT, 400 mM of dNTP each, 2.5 M of oligo (dT), 40 units of Rnasine and 200 units of reverse transcriptase from Moloney murine leukemia virus at 25 ⁇ l of total reaction volume. All reactions were incubated at 37 ° C for 1 h, then inactivated at 95 ° C for 5 min. The PCR was carried out on the cDNAs after RT or on the RNA samples without the RT step for the negative controls as follows:
  • PCR buffer 200 mM Tris-HCl, pH, were added to PCR tubes
  • Sense probe 5'-GACAGTGTCAGCGTGTGGGTT-3 'Antisense probe: 5'-CCCAACACCATCACCTCCTT-3'
  • the PCR conditions were as follows: after treatment at 95 ° C for
  • FIG. 1A The visualization of the amplified material under UN light by staining with ethidium bromide after electrophoresis on agarose gel is shown in FIG. 1A.
  • This figure shows a transcription product of the ngf of 1A bpd for cancer epithelial cells and cells of the submaxillary gland (positive control), while this product is not detected for ⁇ BEC cells. This test therefore makes it possible to demonstrate that cancer cells secrete ⁇ GF, while the corresponding non-cancerous epithelial cells do not secrete it.
  • the subconfluent cells cultured as indicated in point 1.1 above, were rinsed and placed in a serum-free medium containing fibronectin and transferrin for 24 h. After depriving them of nutrients, the cells have were collected by scraping in PB S buffer (phosphate buffered saline) and subjected to centrifugation (1000 ⁇ g, 5 min).
  • PB S buffer phosphate buffered saline
  • the pellet was treated with lysis buffer (10% SDS, 0.5% ⁇ -mercaptoethanol, 0.5M Tris HC1 pH 6.8, 25% glycerol, 0.5%) and boiled 5 min at 100 ° C.
  • lysis buffer (10% SDS, 0.5% ⁇ -mercaptoethanol, 0.5M Tris HC1 pH 6.8, 25% glycerol, 0.5%) and boiled 5 min at 100 ° C.
  • the lysates from each cell line and the submaxillary gland were subjected to SDS-PAGE, and transferred to a nitrocellulose membrane by electroblotting (200 mA, 45 min).
  • Each membrane was then tested with a polyclonal rabbit anti-NGF antibody (sc-548, Santa Cruz Biotechnology, Tebu, France) at 4 ° C overnight. Each membrane was rinsed three times with TBS-T buffer, then incubated at room temperature for 2 h with rabbit anti-immunoglobulin antibody coupled to horseradish peroxidase (Molecular Probes). Each membrane was rinsed four times with TBS-T buffer and the reaction was revealed using the ECL chemiluminescence kit (Amersham Pharmacia Biotech) with Kodak AR X-Omat film.
  • NGF was detected with cancer cells and the submaxillary gland (band at 14 kDa), while this band was absent for non-cancer cells.
  • Example 3 Demonstration of the expression of NGF in breast cancer cells by ELISA 3.1 Cells tested
  • the wells were washed three times with 400 ⁇ l of PBS, pH 7.4, containing 0.05% Tween 20. The plates were then blocked at room temperature using 1% bovine serum albumin, 5% sucrose and 0.005% NaN 3 in the same buffer.
  • Human ⁇ -NGF (R&D Systems) was used as standard sample at a rate of 0.25 to 8 ng / ml in 100 ⁇ l of the dilution buffer.
  • the plates were then washed extensively and the specific anti-human ⁇ -NGF goat IgG detection antibody (BAF-256, R&D Systems) was added at 50 ng / ml before incubation for 2 h at temperature. room.
  • the immunoplates were washed three times with washing buffer and 100 ⁇ l of streptavidin / horseradish peroxidase were added for an incubation of 20 min at room temperature.
  • the reaction started by adding 100 ⁇ l of a substrate solution for 30 min of incubation at room temperature and in the dark.
  • the PC 12 cells were cultivated beforehand at 37 ° C. in an atmosphere containing 5% CO 2 , in minimal essential medium modified by Dulbecco (DMEM) supplemented with 3 gA of sodium bicarbonate, 4 mM L-glutamine, 10% fetal calf serum, 5% horse serum and 100 units / ml of penicillin / streptomycin.
  • DMEM minimal essential medium modified by Dulbecco
  • the coculture was carried out with polycarbonate plates treated with Transwell® tissue culture (12 mm in diameter and 12 ⁇ m pore size). An initial equilibrium period was observed by adding the media to the central well of the plate, then to the Transwell® insert, operation followed by incubation at 37 ° C for 3 h.
  • the PC 12 cells were seeded in 12-well plates coated with collagen for 24 h to ensure correct attachment to the culture plates.
  • MCF-7 or NCBE cells were seeded inside the Transwell® insert, corresponding to the upper compartment in the complete medium for 24 h. After this time, each cell line was rinsed three times with serum-free medium and incubated in withdrawal medium. In the control experiments, the medium was supplemented with medium containing either NGF or an inhibitor of trk tyrosine kinase activity (K-252-a, Calbiochem, France), or anti-mouse mouse monoclonal antibody. Human ⁇ -NGF (MAB-256, R&D Systems).
  • FIG. 2A shows the experimental diagram where (2) corresponds to cancerous or non-cancerous cells and (1) corresponds to PCI 2 cells,
  • Photo 4 which relates to the coculture of the MCF-7 and PC 12 cells, shows that the PC 12 cells have differentiated after 48 h of culture
  • Photo 5 which concerns the coculture of MCF-7 and PC 12 cells in the presence of the anti-NGF antibody, shows a strong inhibition of the differentiation of PC 12 cells due to the antibody
  • Photo 6 which relates to the coculture of MCF-7 and PC 12 cells in the presence of the inhibitor K-252a, shows a strong inhibition of the differentiation of PC12 cells due to the inhibitor, and • photo 7, which concerns the coculture of normal NBEC and PC 12 cells, highlights the absence of differentiation of PC12 cells.
  • Photo 7 which concerns the coculture of normal NBEC and PC 12 cells, highlights the absence of differentiation of PC12 cells.
  • biopsies of human breast cancer tissue or healthy non-cancerous tissue were fixed with 10% formalin solution for 24 hours. After dehydration by increasing alcoholic baths (30 to 100% o), the samples were included in the paraffin. The sections were made using a microtome (fine section of 5 micrometers), then fixed on slides coated with 3-aminopropyltriethoxysilane (TESPA, Dako France).
  • the blades were dewaxed by soaking the blades in baths according to the following procedure:
  • the slides were then stored at + 4 ° C. 5.3 Labeling of NGF
  • the sections were rinsed with 0.1% TBS-Tween (TBS: 17.54 g of NaCl, 2.42 g of Trisbase, qs 2 liters of water, pH 7.4) for 10 min. under agitation.
  • the antigens were reactivated with 0.01M citrate buffer (1.05 g of citric acid monohydrate, qs 500 ml of distilled water, pH 6 (NaOH)) 2 times 5 min in a water bath at 95 ° C.
  • the slides were incubated for 5 min with shaking in 3% hydrogen peroxide / TBS.
  • the slides were saturated for one hour at room temperature in TBS / 3% BSA.
  • the slides were then incubated for 2 h at room temperature in a humid chamber with 80 ⁇ l of anti-NGF primary antibody (Santa Cruz, Tebu France) diluted 1/50 in TBS / 3% BSA. They were washed 3 times in TBS / Tween for 5 min with stirring. A further incubation of the slides was then carried out for 2 h at room temperature in a humid chamber with 80 ⁇ l of secondary anti-rabbit IgG monkey antibody, said antibody having been linked to horseradish peroxidase (Jackson Laboratories, US), diluted 1/100 in TBS / 3% BSA.
  • the staining was checked under a microscope and stopped in a PBS bath.
  • a counter staining was performed to visualize the breast structures by immersing in the Harris hematoxylin in modified solution (Sigma) for 4 s. Rinsed in basic water, then in a PBS bath.
  • Photos A and B relate to the normal tissue, respectively with or without labeling with NGF.
  • Photos C to F relate to cancerous tissue, photos C and E for sections without NGF marking (negative control) and photos D and F for sections with NGF marking.
  • the calibration bar represents 250 micrometers for photos A, B, E and F or 600 micrometers for photos C and D.
  • NGF is detected by immunohistochemistry on biopsy slides in breast cancer epithelial cells, but not in normal mammary epithelial cells (epithelial cells labeled with anti-NGF antibody, and therefore stained , within the mammary tumor glands in D and F compared to C and E, and not in the normal mammary glands in B compared to A).
  • Example 6 Detection of NGF in tumor cells by flow cytometry The MCF-7 cells were detached by scraping the bottom of the culture dish. 100 ⁇ l of fixative (Coulter) was then added with an incubation of 15 minutes at room temperature. The cells were then washed three times with PBS and centrifuged at 1900 rpm for 5 minutes. 100 ⁇ l of permeabilizer (Coulter) was added, then incubated for 5 minutes at room temperature.
  • the cells were then washed three times with PBS and centrifuged at 1900 rpm for 5 minutes.
  • the cells were then washed three times with PBS and centrifuged at 1900 rpm for 5 minutes.
  • the cells were taken up in 500 ⁇ l of PBS, then the reading was carried out with a flow cytometer (Beckman Coulter® EPICS®).
  • the effect of the blocking antibody MAB-256 (supra) and the inhibitor K-252a on the growth of MCF-7 cells was studied. To do this, the cells were seeded at the rate of 2 ⁇ 10 4 cells / ml in 35 mm dishes in complete medium. After reaching 40% confluence, the cells were washed twice and left without nutrients in a medium devoid of serum containing fibronectin (2 ⁇ g / ml) and transferrin (30 ⁇ g / ml) for 3 h. The next hour, the medium was replaced by 2 ml of the same medium containing the inhibitor K-252a or the antibody MAB-26 at different concentrations in order to study the effect of the pharmacological inhibitor or of the blocking inhibitor on the basal level of growth.
  • the number of cells was determined after trypsinization of the monolayer culture with a 0.25% trypsin / EDTA solution using a hemocytometer.
  • a monoclonal anti-mouse antibody (A4700, SIGMA), that is to say irrelevant, was also used to determine the specificity of the blocking antibody.
  • FIG. 4A shows that the growth of MCF-7 cells in base medium (squares) decreases in the presence of antibodies (triangles) and of inhibitor (diamonds), - the Figures 4B and 4C show that there is a dose effect of the antibody and the inhibitor, respectively, on the proliferative effect of NGF for cancer cells.
  • NGF can therefore be used as a therapeutic target.
  • Example 8 Effect of anti-NGF antibodies on tumorigenesis of breast cells in vivo The growth of breast cancer cells MDA-MB-231 was studied as follows:
  • mice from in vitro cultures, in 50 microliters of PBS per mouse.
  • the mice were kept under standard breeding conditions at room temperature, with a day / night alternation and unrestricted access to food and drink.
  • Fourteen, 21 and 28 days after injection of the cells, half of the mice were injected with anti-human NGF blocking antibodies (Oncogene Research Product,
  • VWR France at the periphery of the tumor (subcutaneous at the flank 1 cm from the injection point of the tumor cells) at the concentration of 12.5 micrograms in 50 microliters of PBS buffer per mouse.
  • the size of the tumors was measured on living mice, whether or not treated with the anti-NGF antibody, with an electronic caliper 21 and 35 days after the injection of the cancer cells (D21 and D35, respectively).
  • the tumor volume was calculated with the following formula: 0.5236 x length (mm) ⁇ width (mm) x (length + width) / 2.
  • the weight of the tumors was also measured on D35 on these same mice, after sacrifice of the animal, using an electronic precision balance.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Magnetic Resonance Imaging Apparatus (AREA)
  • Medical Treatment And Welfare Office Work (AREA)
  • Measuring And Recording Apparatus For Diagnosis (AREA)

Abstract

La présente invention concerne un procédé de diagnostic in vitro du cancer du sein consistant à déterminer la présence de NGF dans un échantillon biologique issu d'un patient suspecté d'être atteint du cancer du sein, ledit procédé pouvant être utilisé tant dans le diagnostic précoce, le dépistage, le suivi thérapeutique, le pronostic, que dans le diagnostic des rechutes dans le cadre du cancer du sein. La présente invention concerne également l'utilisation d'un partenaire de liaison du NGF ou d'un inhibiteur du NGF pour la préparation: d'un médicament, ledit médicament étant notamment utile pour bloquer la prolifération tumorale et la dissémination à distance chez l'es patients atteints du cancer du sein.

Description

Procédé de dosage du NGF pour le diagnostic in vitro du cancer du sein et utilisation en thérapie
La présente invention concerne le domaine de la cancérologie. Plus particulièrement, la présente invention a pour objet un procédé de diagnostic du cancer du sein chez un patient humain par détermination de la présence du facteur de croissance nerveux (NGF) dans un échantillon biologique issu de ce patient, ledit procédé pouvant être utilisé tant dans le diagnostic précoce, le dépistage, le suivi thérapeutique, le pronostic, que dans le diagnostic des rechutes dans le cadre du cancer du sein. De plus, du fait de la capacité des cellules du cancer du sein à produire du NGF, la présente invention concerne également la thérapie.
Chez la femme, le cancer du sein est la première cause de mortalité par cancer dans les pays industrialisés. Il est estimé que la taille minimale d'une tumeur repérable par mammographie est de 1 cm. Les cancers du sein se développent lentement. Néanmoins, cette tumeur de petite taille présente un passé évolutif de 8 ans en moyenne lors du diagnostic. L'étiologie du cancer du sein n'est pas bien définie. Des prédispositions familiales ont été mises en évidence. L'âge est le facteur de risque le plus important. Ainsi, le risque augmente de 0,5% par année d'âge dans les pays occidentaux. D'autres facteurs de risques sont connus tels que le nombre des grossesses et l'âge de la première grossesse, l'allaitement, l'âge de la puberté et de la ménopause, les traitements oestrogéniques après la survenue de la ménopause, le stress et la nutrition.
Le test disponible et utilisé en dépistage de masse pour le cancer du sein est une technique d'imagerie : la mammographie. Grâce à cette technique, la mortalité due aux cancers du sein a fortement diminué (30% de réduction de mortalité), ce qui souligne l'importance du dépistage des tumeurs en terme de santé publique. Néanmoins, les techniques de dépistage souffrent d'un certain nombre de handicaps. La mammographie nécessite un matériel performant et du personnel qualifié ce qui est coûteux dans le cadre d'un dépistage de masse.
En pratique clinique, la caractérisation d'une tumeur en terme de malignité est réalisée après sa découverte par des méthodes histologiques dans des laboratoires spécialisés. Un ensemble de paramètres tels que la taille de la tumeur, son grade histopathologique, l'inflammation associée et l'invasion ganglionnaire sont utilisés pour décider de la thérapeutique et pour estimer le pronostic de la maladie.
Des marqueurs qui permettent de distinguer les cellules tumorales des cellules saines sont recherchés et étudiés depuis des années pour le cancer du sein. Ils permettraient de diagnostiquer précocement la maladie, d'en établir le pronostic et la sensibilité au traitement, et d'en surveiller l'évolution. Jusqu'à présent les marqueurs candidats qui ont été identifiés et étudiés ont été des oncogènes, des marqueurs tissulaires et des marqueurs associés à Pangiogénèse ou aux capacités métastatiques de la tumeur. Actuellement les marqueurs de cancer du sein identifiés servent principalement pour le suivi thérapeutique. H n'existe pas de test biologique validé pour le diagnostic précoce, ni pour le dépistage du cancer du sein. Seule la détection des récepteurs aux œstrogènes sur le tissu tumoral permet de déterminer si les tumeurs seront ou non hormono-sensibles.
Un nombre limité de marqueurs antigéniques, en particulier le CA 15-3 (Basuyau, J. P., M. P. Blanc-Vincent, J. M. Bidart, A. Daver, L. Deneux, N. Eche, G. Gory-Delabaere, M. F. Pichon, and J. M. Riedinger. 2000. [Standards, Options and Recommendations (SOR) for tumor markers in breast cancer. SOR Working Group]. Bull Cancer. 87:723-37.) a été identifié dans le cas des cellules mammaires cancéreuses. Ce marqueur est utilisé en pratique courante pour le suivi des patientes, en particulier pour la détection de récidive, mais, en raison de sa faible sensibilité, il n'est pas proposé en test de dépistage ni de diagnostic.
Depuis plusieurs années des travaux portant sur les antigènes associés au cancer du sein ont été développés non pas pour rechercher des marqueurs, mais pour rechercher des cibles pour une immunothérapie. Ceux-ci vont de la mise en évidence d'une immunité humorale contre les antigènes T/Tn (Springer, G. F. 1997. Immunoreactive T and Tn epitopes in cancer diagnosis, prognosis, and immunotherapy. J Mol Med. 75:594-602.), jusqu'à la découverte plus récente d'anticorps et de réponses des cellules T dirigés contre p53 (Gnjatic, S., Z. Cai, M. Viguier, S. Chouaib, J. G. Guillet, and J. Choppin. 1998. Accumulation of the p53 protein allows récognition by human CTL of a wild-type p53 epitope presented by breast carcinomas and melanomas. J lmmunol. 160:328-33) et HER-2/neu (Disis, M. L., and M. A. Cheever. 1997. HER- 2/neu protein: a target for antigen-specific immunotherapy of human cancer. Adv Cancer Res. 71:343-71).
Plus récemment, une série de nouveaux antigènes potentiels a été mise en évidence par l'approche SEREX (serological expression cloning), reposant sur la construction de librairies d'ADNc de cellules tumorales et un screening par le sérum autologue. Un screening sérologique de librairie de cancer du sein a ainsi permis la mise en évidence de l'antigène ING1 (Jager, D., E. Stockert, M. J. Scanlan, A. O. Gure, E. Jager, A. Knuth, L. J. Old, and Y. T. Chen. 1999. Cancer-testis antigens and ING1 tumor suppressor gène product are breast cancer antigens: characterization of tissue- spécifie ING1 transcripts and a homologue gène. Cancer Res. 59:6197-204.), puis d'un nouvel antigène de différenciation NY-BR-1, exprimé selon les auteurs dans 80% des cancers du sein et induisant la production d'anticorps IgG chez les patientes (Jager, D., E. Stockert, A. O. Gure, M. J. Scanlan, J. Karbach, E. Jager, A. Knuth, L. J. Old, and Y. T. Chen. 2001. Identification of a tissue-specific putative transcription factor in breast tissue by serological screening of a breast cancer library. Cancer Res. 61:2055-61). Ce type d'approche, qui a principalement servi à la recherche de cibles potentiellement utilisables pour le développement de vaccins, n'exclut pas a priori les antigènes présents dans le tissu normal (c'est le cas de NY-BR-1), ni ceux reconnus par un nombre limité de sérums de patientes (2/14 pour ING1), ils ne sont donc pas exploitables pour une stratégie de dépistage ou de diagnostic précoce. Par la même approche, d'autres antigènes induisant une réponse immunitaire humorale chez des patientes ont été signalés comme NY-BR-62, NY-BR-85 et la protéine D52. Ces antigènes seraient surexprimés respectivement dans 60%, 90% et 60% des cancers du sein (Scanlan, M. J., and D. Jager. 2001. Challenges to the development of antigen-specific breast cancer vaccines. Breast Cancer Res. 3:95-8.).
Les phénomènes moléculaires conduisant au développement d'un cancer du sein impliquent des modifications de la structure et de l'expression d'oncogènes (tel que ras) et de gènes suppresseurs de tumeurs comme p53. La croissance des cellules tumorales dans la plupart des cancers du sein est dépendante des hormones œstrogéniques (œstradiol et progestérone) et de facteurs de croissance qui contrôlent la prolifération, la migration et l'apoptose. Ces facteurs de croissance soit stimulent, soit inhibent la prolifération, migration et différentiation des cellules tumorales de manière à agir de concert pour favoriser la croissance du cancer et les métastases. Par exemple, les facteurs de croissance de type insuline, le facteur de croissance de transformation α (TGF-α) et les facteurs de croissance du fibroblaste (FGF) peuvent tous stimuler la prolifération des cellules du cancer du sein, tandis que l'inhibiteur du facteur de croissance dérivé du sein (MDGI) et le facteur de croissance de transformation β (TGF-β) inhibent leur croissance.
Descamps, S. et al. ont démontré que le facteur de croissance NGF, le premier facteur neurotrophique découvert, ajouté in vitro à des lignées cellulaires en culture (NGF exogène), est potentiellement capable d'activer à la fois la survie et la prolifération des cellules du cancer du sein (1998, J. Biol. Chem., 273(27), 16659- 16662 et 2001, J. Biol. Chem., 276(21), 17864-17870).
Le NGF a été isolé à l'origine pour sa capacité à stimuler tant la survie que la différentiation des neurones périphériques, devenant plus tard l'élément archétype de la famille neurotrophique des polypeptides (Levi-Montalcini, R., 1987, Science, 4237, 1154-1162). Une fonction biologique majeure du NGF est le maintien et la survie des neurones post-mitotiques, ce qui fait de lui un candidat important pour le traitement des maladies neurodégénératives. Outre son rôle dans le développement et le maintien des cellules neuronales, le NGF a également des effets significatifs sur les cellules non neuronales. Ainsi, par exemple, il est un facteur de survie autocrine des lymphocytes B (Torcia, M., et al., 1996, Cell, 85, 345-356).
Le NGF génère des signaux intracellulaires par interaction avec deux classes de récepteur de membrane : le produit proto-oncogénique de TrkA p\ 0tikA, qui possède une activité tyrosine kinase intrinsèque, et un deuxième récepteur, p75NTR, qui appartient à la famille des récepteurs du facteur de nécrose tumorale (TNF). Dans les cellules du cancer du sein, il existe deux voies de signalisation distinctes activées par le NGF. L'effet mitogénique nécessite le récepteur i 40*^ et la cascade MAP kinase, tandis que l'effet anti-apoptose dépend du récepteur p75NTR et de l'activation en aval du facteur NF-κB (Descamps, S. et al., 2001, supra). Ainsi, pour le diagnostic du cancer du sein, certains auteurs se sont tournés vers la détection des récepteurs au NGF, comme par exemple dans la demande de brevet WO94/06935 qui décrit un procédé de diagnostic d'un état précancéreux ou cancéreux chez un patient par dosage de la quantité du récepteur p75.
L'effet biologique puissant du NGF sur les cellules du cancer du sein soulève également la question de sa distribution dans la glande mammaire et de son origine. On pense généralement que le NGF est produit par des cibles de l'innervation sympathique et sensorielle, bien qu'il n'ait pas été trouvé dans la circulation sanguine (Bonini, S. et al ; 1996, Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 93, 10955-10960).
La demanderesse a maintenant mis en évidence de façon surprenante que les cellules du cancer du sein produisent elles-mêmes du NGF, tandis que des cellules épithéliales mammaires normales correspondantes n'en produisent pas, de sorte que le NGF peut être utilisé à titre de marqueur tumoral ou bien à titre de cible thérapeutique.
Ainsi, la présence invention a pour premier objet un procédé de diagnostic du cancer du sein par détermination de la présence de NGF dans des échantillons biologiques issus de patients suspectés d'être atteints du cancer du sein. Le procédé de l'invention permet donc de diagnostiquer le cancer du sein par un test simple consistant à rechercher la présence de NGF dans un échantillon biologique prélevé d'un patient. La demanderesse a montré de façon inattendue que des cellules cancéreuses produisaient du NGF, tandis que les cellules correspondantes non cancéreuses en étaient incapables, comme cela sera mis en évidence de façon plus détaillée ci-après. Ainsi, la détermination de la présence de NGF dans l'échantillon permet de conclure à la pathologie recherchée, l'absence de NGF permettant de conclure à l'absence de pathologie.
On entend par détermination de la présence de NGF soit la détection directe du NGF, soit la culture de cellules sensibles au NGF, soit la détection de l' ARNm du NGF dans l'échantillon biologique, ou tout autre procédé de détermination de la présence d'une protéine dans un échantillon, connu de l'homme du métier.
La détermination de la présence de NGF par détection directe du NGF constitue un mode de réalisation particulier de l'invention.
Par détection directe du NGF, on entend la mise en évidence du NGF lui-même dans l'échantillon biologique.
La détection directe du NGF dans l'échantillon biologique peut être mise en œuvre par tout moyen connu de l'homme du métier, comme par exemple par test immunologique ou par spectrométrie de masse, ce qui constitue un mode de réalisation particulier de l'invention.
Le test immunologique peut être tout test largement connu de l'homme du métier impliquant des réactions immunologiques, à savoir des réactions entre le NGF et un partenaire de liaison spécifique du NGF.
Les partenaires de liaison spécifiques du NGF sont tout partenaire susceptible de se lier au NGF. A titre d'exemple, on peut citer les anticorps, les fractions d'anticorps, les récepteurs et toute autre protéine capable de se lier au NGF. Les anticorps partenaires de liaison sont soit des anticorps polyclonaux, soit des anticorps monoclonaux.
Les anticorps polyclonaux peuvent être obtenus par immunisation d'un animal avec du NGF, suivie de la récupération des anticorps recherchés sous forme purifiée, par prélèvement du sérum dudit animal, et séparation desdits anticorps des autres constituants du sérum, notamment par chromatographie d'affinité sur une colonne sur laquelle est fixée un antigène spécifiquement reconnu par les anticorps, notamment le NGF.
Les anticorps monoclonaux peuvent être obtenus par la technique des hybridomes dont le principe général est rappelé ci-après. Dans un premier temps, on immunise un animal, généralement une souris, (ou des cellules en culture dans le cadre d'immunisations in vitro) avec du NGF, dont les lymphocytes B sont alors capables de produire des anticorps contre ledit antigène. Ces lymphocytes producteurs d'anticorps sont ensuite fusionnés avec des cellules myélomateuses "immortelles" (murines dans l'exemple) pour donner lieu à des hybridomes. A partir du mélange hétérogène des cellules ainsi obtenu, on effectue alors une sélection des cellules capables de produire un anticorps particulier et de se multiplier indéfiniment. Chaque hybridome est multiplié sous la forme de clone, chacun conduisant à la production d'un anticorps monoclonal dont les propriétés de reconnaissance vis-à-vis de l'antigène tumoral d'intérêt pourront être testées par exemple en ELISA, par immunotransfert en une ou deux dimensions, en immunofiuorescence, ou à l'aide d'un biocapteur. Les anticorps monoclonaux ainsi sélectionnés, sont par la suite purifiés notamment selon la technique de chromatographie d'affinité décrite ci-dessus.
Des exemples d'anticorps anti-NGF sont connus et sont disponibles notamment dans le catalogue de R&D Systems ou de Santa Cruz. Les partenaires de liaison spécifiques du NGF pourront être marqués pour la révélation de la liaison NGF/partenaire de liaison lorsque le partenaire de liaison est utilisé comme réactif de détection, et donc pour la détection directe du NGF dans l'échantillon biologique.
Par marquage des partenaires de liaison, on entend la fixation d'un marqueur capable de générer directement ou indirectement un signal détectable. Une liste non limitative de ces marqueurs consiste en :
• les enzymes qui produisent un signal détectable par exemple par colorimétrie, fluorescence, luminescence, comme la péroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la α-galactosidase, la glucose-6-phosphate déshydrogénase, • les chromophores comme les composés fluorescents, luminescents, colorants,
• les molécules radioactives comme le P, le S ou le I, et
• les molécules fluorescentes telles que l'alexa ou les phycocyanines.
Des systèmes indirects peuvent être aussi utilisés, comme par exemple des ligands capables de réagir avec un anti-ligand. Les couples ligand/anti-ligand sont bien connus de l'homme du métier, ce qui est le cas par exemple des couples suivants : biotine/streptavidine, haptène/anticorps, antigène/anticorps, peptide/anticorps, sucre/lectine, polynucléotide/complémentaire du polynucléotide. Dans ce cas, c'est le ligand qui porte l'agent de liaison. L' anti-ligand peut être détectable directement par les marqueurs décrits au paragraphe précédent ou être lui-même détectable par un ligand/anti-ligand.
Ces systèmes indirects de détection peuvent conduire, dans certaines conditions, à une amplification du signal. Cette technique d'amplification du signal est bien connue de l'homme du métier, et l'on pourra se reporter aux demandes de brevet antérieures FR98/10084 ou WO-A-95/08000 de la demanderesse ou à l'article J. Histochem. Cytochem. 45 : 481-491, 1997. Selon le type de marquage du conjugué utilisé, l'homme du métier ajoutera des réactifs permettant la visualisation du marquage.
A tire d'exemple de tests immunologiques tels que définis ci-dessus, on peut citer les méthodes « sandwich » telles qu' ELISA, IRMA et RIA, les méthodes dites de compétition et les méthodes d'immunodétection directe comme l'immunohistochimie, l'immunocytochimie, le Western-blot et le Dot-blot.
La spectrométrie de masse peut également être utilisée pour la détection directe du NGF dans l'échantillon biologique. Le principe de la spectrométrie est largement connu de l'homme du métier et est décrit par exemple dans Patterson, S., 2000, Mass spectrometry and proteomics. Physiological Genomics 2, 59-65.
Pour ce faire, l'échantillon biologique préalablement traité ou non est passé dans un spectromètre de masse et on compare le spectre obtenu avec celui du NGF. Un exemple de traitement préalable de l'échantillon consiste à le faire passer sur un support d'immunocapture, comportant un des partenaires de liaison du NGF, par exemple un anticorps dirigé contre le NGF.
L'échantillon biologique utilisé pour la détection directe du NGF, susceptible de contenir du NGF en tant que tel, peut être constitué par du fluide biologique ou un tissu provenant de la biopsie de la tumeur ou des métastases du patient considéré.
A titre de fluide biologique, on peut citer le sang, la moelle osseuse, le lait, le liquide céphalo-rachidien, les urines et les épanchements.
Pour la détection du NGF, le fluide biologique, qui constitue un mode de réalisation particulier de l'invention, peut nécessiter un traitement particulier. En effet, le fluide biologique peut contenir le NGF en tant que tel, ou bien il peut contenir des cellules tumorales circulantes qui contiennent du NGF, et éventuellement des cellules tumorales circulantes qui sont capables de sécréter le NGF.
Ainsi, selon un mode de réalisation de l'invention, le fluide biologique est préalablement traité pour isoler les cellules tumorales circulantes contenues dans le dit fluide.
Par isoler les cellules tumorales circulantes, on entend obtenir une fraction cellulaire enrichie en cellules tumorales circulantes.
Le traitement du fluide pour isoler les cellules tumorales circulantes peut être effectué par tri cellulaire dans un cytomètre de flux, par enrichissement sur Ficoll, par enrichissement par billes magnétiques recouvertes d'anticorps spécifiques, ou par toute autre méthode d'enrichissement spécifique connue de l'homme du métier.
Dans le cas du sang ou de la moelle à titre de fluide biologique, les cellules tumorales circulantes peuvent être isolées grâce à une technique de séparation cellulaire sur Ficoll associée à une déplétion des cellules sanguines utilisant des anticorps anti- CD45 couplés à des billes magnétiques (Dynal Biotech ASA, Norvège).
La détection directe du NGF peut alors être effectuée directement à partir de cellules tumorales circulantes isolées du fluide biologique, par exemple par marquage immunocytochimique de ces cellules avec un anticorps anti-NGF, après avoir déposé les cellules tumorales circulantes sur une lame par cytospin. La détection directe du NGF peut également être effectuée directement dans les cellules tumorales circulantes en utilisant la méthode de cytométrie de flux telle que décrite dans Métézeau P, Ronot X, Le Noan-Merdrignac G, Ratinaud MH, La cytométrie en flux pour l'étude de la cellule normale ou pathologique (Tome I), Eds Medsi-MacGrawhill.
Dans ces conditions, lesdites cellules circulantes peuvent être traitées dans des conditions permettant le blocage du NGF à l'intérieur desdites cellules. Un tel traitement est décrit par exemple dans Intracellular Flow Cytometry, Applied reagents and Techniques, pp 1-21, BD Pharmingen. La détection du NGF se fait alors après avoir rendu perméable la membrane des cellules pour faire rentrer les partenaires de liaison spécifique du NGF.
La détection directe du NGF à partir des cellules circulantes peut également être effectuée à l'aide du procédé décrit dans la demande de brevet WO03/076942 déposée par l'une des Demanderesses. La détection directe du NGF dans les cellules tumorales peut encore être effectuée dans le milieu de culture desdites cellules après les avoir cultivées dans des conditions telles qu'elles sécrètent du NGF.
Ces conditions de culture sont des conditions classiques telles que 37°C sous atmosphère humide et à 5% de CO2. Lorsque l'échantillon biologique à tester est du tissu provenant de la biopsie de la tumeur ou des métastases du patient, ce qui constitue un mode de réalisation particulier de l'invention, la détection directe du NGF est effectuée directement sur les coupes obtenues, sans traitement préalable dudit tissu.
Un autre mode de détection de la présence du NGF consiste en la culture, en présence de l'échantillon biologique, de cellules sensibles au NGF, ce qui constitue un mode de réalisation particulier de l'invention.
Dans ce cas, la détection de la présence du NGF dans un échantillon biologique est mise en évidence par la réaction des cellules sensibles au NGF.
Par cellules sensibles au NGF, on entend toute cellule stimulée en présence de NGF (croissance, apotose, etc.). A titre de cellules sensibles au NGF, on peut citer les cellules phéochromocytomes PC12 (Hondermarck H. et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci., 91 :9377-81) et les cellules embryonnaires d'origine neuronale (Hattori A., et al., 1993, J. Biol. Chem., 268 :2577-2582).
L'échantillon biologique que l'on peut utiliser pour la détection de la présence du NGF par culture de cellules sensibles au NGF peut être tout échantillon tel que décrit précédemment.
Ainsi, l'échantillon biologique peut être constitué de fluide biologique, le cas échéant préalablement traité pour isoler les cellules tumorales circulantes, elles-mêmes pouvant ensuite être cultivées en conditions telles qu'elles sécrètent du NGF, comme décrit précédemment.
Un autre mode de détection de la présence de NGF dans les échantillons biologiques consiste en la détection de l'ARNm du NGF dans ledit échantillon, ce qui constitue un autre mode de réalisation de l'invention.
La détection d'ARNm dans un échantillon liquide est largement connue de l'homme du métier.
Elle peut par exemple être mise en œuvre par des réactions d'hybridation entre l'ARNm cible et un acide nucléique capable de liaison avec l'ARNm cible.
On entend par acide nucléique les oligonucléotides, les acides désoxyribonucléiques et les acides ribonucléiques, ainsi que leurs dérivés. Le terme « oligonucléotide » désigne un enchaînement d'au moins 2 nucléotides
(désoxyribonucléotides ou ribonucléotides, ou les deux), naturels ou modifiés, susceptibles de s'hybrider, dans des conditions appropriées d'hybridation, avec un oligonucléotide au moins partiellement complémentaire. Par nucléotide modifié, on entend par exemple un nucléotide comportant une base modifiée et/ou comportant une modification au niveau de la liaison internucléotidique et/ou au niveau du squelette. A titre d'exemple de base modifiée, on peut citer l'inosine, la méthyl-5-désoxycytidine, la diméthylamino-5-désoxyuridine, la diamino-2,6-purine et la bromo-5-désoxyuridine. Pour illustrer une liaison internucléotidique modifiée, on peut mentionner les liaisons phosphorothioate, N-alkylphosphoramidate, alkylphosphonate et alkylphosphodiester. Les alpha-oligonucléotides tels que ceux décrits dans FR-A-2 607 507, les LNA tels que phosphorothioate-LNA and 2'-thio-LNA décrits dans Bioorganic & Médicinal Chemistry Letters, Volume 8, Issue 16, 18 August 1998 .pages 2219-2222, et les PNA qui font l'objet de l'article de M. Egholm et al., J. Am. Chem. Soc. (1992), 114, 1895- 1897, sont des exemples d'oligonucléotides constitués de nucléotides dont le squelette est modifié. La révélation des réactions d'hybridation peut être effectuée par marquage des acides nucléiques de liaison, comme illustré précédemment.
Avant hybridation avec l'acide nucléique de liaison, l'ARNm cible peut être extrait par des méthodes connues de l'homme du métier, puis éventuellement amplifié, comme par exemple par RT-PCR ou par NASBA (Maleck, L., et al., 1994, Methods in Molecular Biology, 28, ch 36, Ed P. G. Isaac, Humana Press, Inc., Totowa, NJ).
L'échantillon biologique que l'on peut utiliser pour la détection de la présence du NGF par détection d'ARNm du NGF peut être tout échantillon tel que décrit précédemment.
Ainsi, l'échantillon biologique peut être constitué de tissu issu de biopsie de tumeur ou de métastase, ou bien de fluide biologique, le cas échéant préalablement traité pour isoler les cellules tumorales circulantes, comme décrit précédemment.
Le procédé de l'invention peut être utilisé tant pour le diagnostic précoce, que pour le dépistage, le suivi thérapeutique, le pronostic et le diagnostic des rechutes dans le cadre du cancer du sein puisque seules les cellules cancéreuses produisent du NGF et que cette production est fonction du grade du cancer.
Ainsi, un autre objet de l'invention consiste en l'utilisation du procédé de l'invention dans le diagnostic précoce, le dépistage, le suivi thérapeutique, le pronostic et le diagnostic des rechutes dans le cadre du cancer du sein.
Outre un rôle de marqueur tumoral, le NGF peut également avoir un rôle de cible thérapeutique. En effet, du fait de la capacité des cellules du cancer du sein à produire du NGF, tandis que les cellules normales n'en produisent pas, la prolifération tumorale et la dissémination à distance des cellules du cancer du sein peuvent être bloquées par un partenaire de liaison du NGF susceptible de bloquer la prolifération cellulaire ou par un inhibiteur du NGF.
Les partenaires de liaison du NGF et les inhibiteurs du NGF peuvent donc être utilisés comme médicaments.
Ainsi, la présente invention a également pour objet l'utilisation d'un partenaire de liaison du NGF ou d'un inhibiteur du NGF pour la préparation d'un médicament, étant entendu que, dans le cadre du cancer, les partenaires de liaison du NGF ne sont pas des récepteurs pour le NGF ou des fragments actifs de ces récepteurs. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, ledit médicament est utile pour bloquer la prolifération tumorale et la dissémination à distance chez les patients atteints du cancer du sein.
Les compositions pharmaceutiques comprenant à titre de principe actif au moins un partenaire de liaison du NGF ou un inhibiteur du NGF, éventuellement en association avec un excipient pharmaceutiquement acceptable, sont également incluses dans l'invention, étant entendu que, dans le cadre du cancer, les partenaires de liaison du NGF ne sont pas des récepteurs pour le NGF ou des fragments actifs de ces récepteurs.
Les compositions pharmaceutiques utiles contre le cancer du sein comprennent, à titre de principe actif, au moins un partenaire de liaison du NGF susceptible de bloquer la prolifération tumorale cellulaire ou un inhibiteur du NGF.
Les partenaires de liaison du NGF spécifiques appropriés à titre de principe actif sont notamment tels que définis précédemment dans les tests immunologiques et peuvent être tout autre partenaire connu de l'homme du métier capable de bloquer la prolifération tumorale. Selon un mode de réalisation particulier, le partenaire spécifique susceptible de bloquer la prolifération de cellules de cancer du sein est un anticorps anti-NGF.
Par inhibiteur du NGF, on entend les inhibiteurs directs du NGF, c'est-à-dire les inhibiteurs bloquant l'activité biologique de la protéine, les inhibiteurs des voies d'exocytose du NGF, les inhibiteurs de l'ARNm du NGF et les inhibiteurs du gène codant pour le NGF.
A titre d'inhibiteur direct du NGF, on peut citer l'inhibiteur K-252a (Tapley, P., et al., 1992, Oncogene 7, 371-381).
Les inhibiteurs des voies d'exocytose des protéines et en particulier du NGF sont largement connus de l'homme du métier. A titre d'inhibiteur de l'ARNm du NGF, on peut utiliser un fragment synthétique de cet ARNm. En effet, la technologie du ARN interférence est basée sur l'utilisation d'un oligonucléotide ARN double brin correspondant à une courte séquence de l'ARNm cellulaire à inhiber. Cet oligonucléotide en duplex (introduit ou non dans un plasmide), après entrée dans la cellule, est pris en charge par le système enzymatique Dicer/Risc, ce qui va entraîner la dégradation de l'ARNm cellulaire correspondant (Dykxhoorn D et al., 2003, Nature Reviews, vol. 4, p457-467).
A titre d'inhibiteur du gène codant pour le NGF, on peut citer un oligonucléotide anti-sens du NGF. Cet oligonucléotide peut être facilement préparé par l'homme du métier. Pour cibler l'action thérapeutique des partenaires de liaison du NGF ou des différents inhibiteurs, ces derniers peuvent être mis en conditions telles qu'ils pénètrent spécifiquement dans les cellules d'intérêt, telles que les cellules tumorales, ce qui constitue un autre mode de réalisation de l'invention.
A cet effet, ils peuvent par exemple être fixés à un partenaire qui permet une telle pénétration, comme par exemple une molécule porteuse, un polymère tel que les polymères utilisés en thérapie génique ou bien un vecteur viral tel que les adénovirus et les poxvirus, également utilisés en thérapie génique.
Par exemple, dans le cadre du cancer du sein, la molécule porteuse peut être un anticorps anti-MUCl ou un anticorps anti-cellule épithéliale, ou bien encore un anticorps anti-HER-2/neu. De préférence, lorsque la composition pharmaceutique comprend à titre de principe actif un partenaire de liaison du NGF ou un inhibiteur du NGF tel qu'un ihnibiteur direct ou un inhibiteur des voies d'exocytose du NGF, ces derniers sont mis en conditions telles qu'ils pénètrent spécifiquement dans les cellules tumorales d'intérêt, les inhibiteurs de l'ARNm du NGF et les inhibiteurs du gène codant pour le NGF ayant la capacité de pénétrer naturellement dans lesdites cellules.
La quantité et la nature de l'excipient peuvent être facilement déterminées par l'homme du métier. Elles sont choisies selon la forme pharmaceutique et le mode d'administration souhaités. Dans les compositions pharmaceutiques de l'invention pour l'administration orale, sublinguale, sous-cutanée, intramusculaire, intratumorale, intraveineuse, topique, locale, intratrachéale, intranasale, transdermique, rectale, intraoculaire, intra-auriculaire, ledit principe actif pouvant être administré sous forme unitaire d'administration.
Les formes unitaires d'administration peuvent être par exemple des comprimés, des gélules, des granules, des poudres, des solutions ou suspensions orales injectables, des timbres transdermiques (« patch »), des formes d'administration sublinguale, buccale, intratrachéale, intraoculaire, intranasale, intra-auriculaire, par inhalation, des formes d'administration topique, transdermique, sous-cutanée, intramusculaire, intratumorale ou intraveineuse, des formes d'administration rectale ou des implants. Pour l'administration topique, on peut envisager des crèmes, gels, pommades, lotions ou collyres.
Ces formes galéniques sont préparées selon les méthodes usuelles des domaines considérés.
Lesdites formes unitaires sont dosées pour permettre une administration journalière de 0,001 à 10 mg de principe actif par kg de poids corporel, selon la forme galénique.
Il peut y avoir des cas particuliers où des dosages plus élevés ou plus faibles sont appropriés ; de tels dosages ne sortent pas du cadre de l'invention. Selon la pratique habituelle, le dosage approprié à chaque patient est déterminé par le médecin selon le mode d'administration, le poids et la réponse du patient. Selon un autre mode de réalisation, la présente invention concerne également une méthode de traitement du cancer du sein qui comprend l'administration, à un patient, d'une dose efficace d'un partenaire de liaison du NGF ou d'un inhibiteur du NGF. L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples suivants donnés à titre illustratif et non limitatif, ainsi qu'à l'aide des figures 1 à 5 annexées, sur lesquelles :
- la figure 1 concerne des représentations graphiques relatives à la mise en évidence de l'expression du NGF dans des cellules cancéreuses, dans laquelle :
• la figure 1A représente un gel d'électrophorèse mettant en évidence, après RT- PCR, la sécrétion du NGF par les cellules cancéreuses MCF-7, T47D, MDA-
MB-231 et BT20 et par les cellules de la glande submaxillaire à titre de témoin, ainsi que l'absence d'une telle sécrétion par les cellules normales NBEC (Normal Breast Epithelial Cells),
• la figure 1B représente un gel d'électrophorèse mettant en évidence, après immunoblotting, la sécrétion du NGF par les cellules cancéreuses MCF-7,
T47D, MDA-MB-231 et BT20 et par les cellules de la glande submaxillaire, ainsi que l'absence d'une telle sécrétion par les cellules NBEC, et
• la figure 1C est un graphe donnant la quantité de NGF sécrétée en fonction des cellules testées par ELISA, à savoir les cellules cancéreuses MCF-7, T47D, MDA-MB-231 et BT20, les cellules de la glande submaxillaire et les cellules
NBEC,
- la figure 2 concerne des représentations sur la coculture de cellules cancéreuses et de cellules sensibles au NGF, dans laquelle :
• la figure 2 A représente le schéma expérimental de coculture des cellules PC 12 (1) se développant en présence de NGF et de cellules cancéreuses (2), et
• la figure 2B est constituée de photographies représentant la culture de cellules PCI 2 à titre de témoin (photo 2), la différenciation des cellules PC 12 sous l'influence du NGF (photo 3), la coculture de cellules sensibles au NGF en présence de cellules cancéreuses MCF-7 (photo 4), la culture de cellules cancéreuses MCF-7 en présence d'un anticorps anti-NGF (photo 5), la culture de cellules cancéreuses MCF-7 en présence de l'inhibiteur K252a (photo 6), et la culture de cellules mammaires normales NBEC (photo 7)
- la figure 3 représente des photographies d'immunocytochimie mettant en évidence l'expression de NGF par immunodétection dans du tissu issu de biopsie, dans laquelle les photos A et B concernent le tissu normal, respectivement avec ou sans marquage au NGF, les photos C à F concernant le tissu cancéreux, les photos C et E concernant les coupes sans marquage au NGF (contrôle négatif) et les photos D et F concernant les coupes avec marquage au NGF,
- la figure 4 est relative à des graphes mettant en évidence l'influence d'un partenaire de liaison susceptible de bloquer la prolifération des cellules du cancer du sein sur la croissance cellulaire, dans laquelle :
• la figure 4A représente un graphe montrant la croissance des cellules MCF-7 en nombre de cellules (104 cellules/disque de 35 mm), soit sans agent de blocage de la prolifération tumorale à titre de témoin, soit en présence de l'anticorps anti-NGF MAB-256, soit en présence de l'inhibiteur K-252a, et
• les figures 4B et 4C représentent des graphes donnant le nombre de cellules MCF-7 en fonction de la dose de l'anticorps MAB-256 (figure 4B) ou de la dose de l'inhibiteur K-252a (figure 4C) et
- la figure 5 donne des graphes mettant en évidence l'influence d'un anticorps anti- NGF, en fonction du temps, sur le volume tumoral (figure 5A), sur la masse tumorale
(figure 5B) et sur le nombre de métastases hépatiques (figure 5C) de cellules de cancer du sein de souris.
Exemple 1 : Mise en évidence de l'expression du NGF dans des cellules du cancer du sein par RT-PCR
1.1 Cellules testées
On a testé 4 lignées de cellules de cancer du sein humain, à savoir les cellules MCF-7, T47D, MDA-MB-231 et BT20, obtenues auprès de la collection ATCC (Rockville, MD) sous les numéros HTB-22, HTB-133, HTB-26 et HTB-29, respectivement. Ces cellules ont été maintenues dans du milieu essentiel minimal (sel de Earle,
BioWhittaker, Belgique) supplémenté avec de l'HEPES 20 raM, 2 g/1 de bicarbonate de sodium, 2 mM de L-glutamine, 10% de sérum de veau fœtal (FCS), 100 unités/ml de pénicilline-streptomycine, 50 μg/ml de gentamycine, 1% d'acides aminés non essentiels et 5 μg/ml d'insuline.
A titre de comparaison, on a testé des cellules épithéliales du sein normales (NBEC) obtenues auprès du Département de Chirurgie Plastique de l'Université Médicale de Lille (Pr. Pellerin, France) qu'on a cultivées dans du milieu DMEM/F12 (1/1) (BioWhittaker) contenant 5% de FCS, lO UI/ml d'insuline, 5 μM de cortisol, 2 ng/ml de EGF, 100 ng/ml de toxine de choléra, 100 ng/ml de pénicilline et 45 μg/ml de gentamycine (milieu Bl). Lorsque les cellules ont approché la confluence, on les a placées dans le même milieu, à ceci près qu'on a réduit la concentration en calcium à 20 μM.
On a également utilisé les cellules de glande submaxillaire humaine, obtenues à partir de résidus de dissection hospitaliers, comme source connue de NGF. 1.2 RT-PCR
On a isolé l'ARN total des lignées de cellules cancéreuses, des cellules NBEC et de la glande submaxillaire humaine (20 mg de poids) en utilisant le kit Rneasy mini (Qiagen, France). On a mis en œuvre la rupture et l'homogénéisation de la glande submaxillaire en utilisant un homogénéisateur Rotor-Stator (Bribolyser, Hybaid).
On a quantifié la quantité d'ARN extrait en mesurant l'absorbance à 260 nm et on a recherché la pureté de l'ARN par le rapport d'absorbance à 260 nm et à 280 nm. On a confirmé l'absence de dégradation de l'ARN par électrophorèse de l'ARN sur un gel d'agarose à 1,5% contenant du bromure d'éthidium. On a réalisé la transcriptase inverse (RT) en ajoutant un mélange réactionnel contenant 2 g d'ARNm total purifié, IX tampon de réaction, 10 mM de DTT, 400 mM de dNTP chacun, 2,5 M d'oligo(dT), 40 unités de Rnasine et 200 unités de transcriptase inverse de virus de la leucémie murine Moloney à 25 μl de volume réactionnel total. Toutes les réactions ont été incubées à 37°C pendant 1 h, puis inactivées à 95°C pendant 5 min. La PCR a été mise en œuvre sur les ADNc après RT ou sur les échantillons d'ARN sans l'étape de RT pour les contrôles négatifs comme suit :
A des tubes de PCR, on a ajouté 5 μl de tampon PCR (200 mM de Tris-HCl, pH
8,4, 500 mM KC1), 10 μl de 15 mM MgCl2, 1 ml de 10 mM dNTP mix, 1 μl d'ADNc ou d'ARNm total (pour le contrôle négatif), 1 μl de 50 mM des sondes pour le gène ngf indiquées ci-dessous, 1 μl de 2,5 unités/μl d'ADN polymérase Taq et de l'eau jusqu'à un volume total de 50 μl.
Sonde sens : 5'-GACAGTGTCAGCGTGTGGGTT-3' Sonde antisens : 5'-CCCAACACCATCACCTCCTT-3' Les conditions de PCR étaient les suivantes : après traitement à 95°C pendant
3 min pour dénaturer l'ADNc, on a effectué 30 cycles à 94°C pendant 1 min, 57°C pendant 2 min et 72°C pendant 3 min. On a ensuite incubé les tubes de PCR pour 10 min supplémentaires à 72°C pour l'extension des fragments d'ADNc après le cycle final. La visualisation du matériel amplifié sous lumière UN par coloration au bromure d'éthidium après électrophorèse sur gel d'agarose est représentée sur la figure 1A. Cette figure montre un produit de transcription du ngf de 1A pdb pour les cellules épithéliales cancéreuses et les cellules de la glande submaxillaire (témoin positif), alors que ce produit n'est pas détecté pour les cellules ΝBEC. Ce test permet donc de mettre en évidence que les cellules cancéreuses sécrètent du ΝGF, tandis que les cellules épithéliales correspondantes non cancéreuses n'en sécrètent pas.
Exemple 2 : Mise en évidence de l'expression du ΝGF dans des cellules du cancer du sein par Immunoblo ting 2.1 Cellules testées
Les cellules testées sont celles indiquées dans le point 1.1 ci-dessus. 2.2 Immunoblotting
Les cellules subconfluentes, cultivées comme indiqué dans le point 1.1 ci- dessus, ont été rincées et placées dans un milieu sans sérum contenant de la fibronectine et de la transferrine pendant 24 h. Après les avoir privées de nutriments, les cellules ont été collectées par raclage dans du tampon PB S (solution saline tamponnée au phosphate) et on les a soumises à une centrifugation (1000χg, 5 min).
On a traité le culot avec du tampon de lyse (10% SDS, 0,5% de β- mercaptoéthanol, 0,5M Tris HC1 pH 6,8, 25% glycérol, 0,5%) et on a mis à bouillir 5 min à lOO°C.
Après centrifugation (lOOOxg, 5 min), on a recherché les protéines des surnageants en utilisant les tests de détermination de protéines de Bio Rad.
On a soumis à SDS-PAGE les lysats provenant de chaque lignée cellulaire et de la glande submaxillaire, on les a transférés sur une membrane de nitrocellulose par électroblotting (200 mA, 45 min).
On a ensuite testé chaque membrane avec un anticorps polyclonal de lapin anti- NGF (sc-548, Santa Cruz Biotechnology, Tebu, France) à 4°C toute la nuit. On a rincé chaque membrane à trois reprises avec du tampon TBS-T, puis on les a incubées à température ambiante pendant 2 h avec un anticorps anti-immunoglobuline de lapin couplé à la peroxydase de raifort (Molecular Probes). On a rincé chaque membrane à quatre reprises avec du tampon TBS-T et on a révélé la réaction en utilisant le kit de chimioluminescence ECL (Amersham Pharmacia Biotech) avec le film AR X-Omat de Kodak.
Là-encore, comme représenté sur la figure 1B, du NGF a été détecté avec les cellules cancéreuses et la glande submaxillaire (bande à 14 kDa), tandis que cette bande était absente pour les cellules non cancéreuses.
Ce résultat confirme celui de l'exemple 1. Exemple 3 : Mise en évidence de l'expression du NGF dans des cellules du cancer du sein par ELISA 3.1 Cellules testées
Les cellules testées sont celles indiquées dans le point 1.1 ci-dessus. 3.2 ELISA
Pour ce test, on a utilisé un test à deux sites pour du β-NGF humain. En résumé, on a revêtu des immunoplaques de 1 μg/ml d'anticorps monoclonal de capture (R&D Systems, UK) dilué dans un tampon de dilution (0,1% BSA, 0,005% Tween 20 dans une solution saline tamponnée au Tris pH 7,3). On a revêtu les puits contrôles de la même quantité d'IgG de souris (R&D Systems). Chaque puits a reçu 100 μl de cette dilution et les plaques ont été scellées et incubées à la température ambiante, toute la nuit.
On a lavé les puits à trois reprises avec 400 μl de PBS, pH 7,4, contenant 0,05% de Tween 20. On a ensuite bloqué les plaques à la température ambiante en utilisant 1% de sérum albumine bovine, 5% de saccharose et 0,005% de NaN3 dans le même tampon.
Après 2 h, on a lavé chaque puits, on a appliqué des dilutions de produits inconnus et standards dans un volume de 100 μl, et on a recouvert les plaques d'une bande adhésive et on les a incubées à température ambiante toute la nuit.
On a utilisé du β-NGF humain (R&D Systems) comme échantillon standard à raison de 0,25 à 8 ng/ml dans 100 μl du tampon de dilution.
On a ensuite lavé les plaques de façon extensive et on a ajouté l'anticorps de détection IgG de chèvre spécifique anti-β-NGF humain (BAF-256, R&D Systems) à raison de 50 ng/ml avant incubation pendant 2 h à température ambiante.
Après incubation, on a lavé les immunoplaques à trois reprises avec du tampon de lavage et on a ajouté 100 μl de streptavidine/peroxydase de raifort pour une incubation de 20 min à la température ambiante.
La réaction a commencé par ajout de 100 μl d'une solution substrat pendant 30 min d'incubation à la température ambiante et à l'obscurité.
Après cette durée, on a ajouté 50 μl d'une solution stop (H2SO4 1M) dans chaque puits. On a déterminé la densité optique en 30 min en utilisant un ensemble de lecture de microplaque à 595 ou 450 nm.
Les résultats de densité optique (moyenne de 3 tests indépendants) sont donnés sur la figure IC. Ils mettent en évidence un niveau similaire de NGF dans toutes les lignées de cellules du cancer du sein testées. Exemple 4 : Culture de cellules sensibles au NGF
Pour ce faire, on a cocultivé des cellules qui se développent en présence de NGF, à savoir les cellules PC 12, avec des cellules de cancer du sein MCF-7, telles que décrites dans le point 1.1 ci-dessus, ou bien avec des cellules NBEC, telles que décrites dans le point 1.1 ci-dessus, à titre de témoin.
Les cellules PC 12 ont été cultivées au préalable à 37°C dans une atmosphère à 5% de CO2, dans du milieu essentiel minimal modifié de Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 3 gA de bicarbonate de sodium, 4 mM de L-glutamine, 10% de sérum de veau fœtal, 5% de sérum de cheval et 100 unités/ml de pénicilline/streptomycine.
La coculture a été réalisée avec des plaques de polycarbonate traitée à la culture tissulaire Transwell® (12 mm de diamètre et 12 μm de taille de pore). Une période d'équilibre initial a été observée en ajoutant les milieux au puits central de la plaque, puis à l'insert du Transwell®, opération suivie d'une incubation à 37°C pendant 3 h.
Les cellules PC 12 ont été ensemencées dans des plaques à 12 puits revêtues de collagène pendant 24 h pour assurer une fixation correcte aux plaques de culture. On a ensemencé les cellules MCF-7 ou NCBE à l'intérieur de l'insert du Transwell®, correspondant au compartiment supérieur dans le milieu complet pendant 24 h. Après ce temps, on a rincé chaque lignée cellulaire à trois reprises avec un milieu dénué de sérum et on les a incubées dans un milieu de retrait. Dans les expériences témoins, le milieu a été supplémenté avec du milieu contenant soit du NGF, soit un inhibiteur de l'activité tyrosine kinase trk (K-252-a, Calbiochem, France), soit de l'anticorps monoclonal de souris anti-β-NGF humain (MAB-256, R&D Systems).
La coculture a été réalisée pendant 48h. Après ce délai, les cellules PC 12 ont été fixées avec du méthanol froid (-20°C) pendant 20 min, puis lavées avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avant assemblage avec des lamelles couvre-objet et du Glycergel (Dako, France). On a compté le pourcentage de cellules portant des neurites définies comme des cellules avec un ou plusieurs prolongements neuritiques ayant au moins deux fois la longueur du corps de la cellule. On a également pris des photomicrographies à l'aide d'un microscope à contraste de phase supplémenté avec une caméra digitale optique Olympus. Les résultats sont donnés sur la figure 2, sur laquelle : - la figure 2A montre le schéma expérimental où (2) correspond aux cellules cancéreuses ou non cancéreuses et (1) correspond aux cellules PCI 2,
- la figure 2B donnent des photographies où :
• les photos 2 et 3 montrent la culture des cellules PCI 2 à titre de témoin, respectivement sans NGF et en présence du NGF où on observe alors un développement de neurites dû à la différenciation,
• la photo 4, qui concerne la coculture des cellules MCF-7 et PC 12, montre que les cellules PC 12 se sont différenciées après 48 h de culture,
• la photo 5, qui concerne la coculture des cellules MCF-7 et PC 12 en présence de l'anticorps anti-NGF, montre une inhibition forte de la différenciation des cellules PC 12 du fait de l'anticorps,
• la photo 6, qui concerne la coculture des cellules MCF-7 et PC 12 en présence de l'inhibiteur K-252a, montre une inhibition forte de la différenciation des cellules PC12 du fait de l'inhibiteur, et • la photo 7, qui concerne la coculture des cellules normales NBEC et PC 12, met en évidence l'absence de différenciation des cellules PC12. Exemple 5 : Immunohistochimie pour la détection du NGF dans les biopsies de cancer de sein
5.1 Prélèvement et fixation des biopsies Immédiatement après opération, les biopsies de tissu de cancer du sein humain ou de tissu sain non cancéreux (témoin) ont été fixées par une solution de formol à 10% pendant 24 heures. Après déshydratation par des bains alcooliques croissants (30 à 100%o), les échantillons ont été inclus dans la paraffine. Les coupes ont été réalisées à l'aide d'un microtome (coupe fine de 5 micromètres), puis fixées sur des lames revêtues du 3-aminopropyltriéthoxysilane (TESPA, Dako France).
5.2 Déparaffinage des lames
On a déparaffiné les lames en trempant les lames dans des bains selon le mode opératoire suivant :
- 2 bains de toluène (10 min), - 1 bain d'alcool à 100% (10 min), - 1 bain d'alcool à 95% (10 min), - 1 bain d'alcool à 70% (10 min),
- 1 bain d'eau (10 min).
On a ensuite conservé les lames à +4°C. 5.3 Marquage du NGF On a rincé les coupes avec du TBS-Tween 0,1% (TBS : 17,54 g de NaCl, 2,42 g de Trisbase, qsp 2 litres d'eau, pH 7,4) pendant 10 min sous agitation. On a réactivé les antigènes par du tampon citrate 0,01M (1,05 g d'acide citrique monohydraté, qsp 500 ml d'eau distillée, pH 6 (NaOH)) 2 fois 5 min dans un bain marie à 95°C. On a procédé à une incubation des lames 5 min sous agitation dans 3% d'eau oxygénée/TBS. On a saturé les lames pendant une heure à température ambiante dans du TBS/3% BSA. On a ensuite procédé à une incubation des lames 2 h à température ambiante en chambre humide avec 80 μl d'anticorps primaire anti-NGF (Santa Cruz, Tebu France) dilué au 1/50 dans du TBS/3% de BSA. On les a lavées à 3 reprises dans du TBS/Tween pendant 5 min sous agitation. On a ensuite procédé à une nouvelle incubation des lames 2 h à température ambiante en chambre humide avec 80 μl d'anticorps secondaire de singe anti-IgG de lapin, ledit anticorps ayant été lié à la peroxydase de raifort (Jackson Laboratories, US), dilué au 1/100 dans du TBS/3% de BSA.
On a lavé les lames à trois reprises dans du TBS/Tween pendant 5 min sous agitation, on les a rincées à trois reprises avec du PBS pendant 5 min sous agitation, on les a séchées, puis on les a incubées pendant 10 min avec 100 μl de DAB (sigma fast 3,3-diaminobenzidine ; 1 pastille de DAB + 1 pastille d'urée H2O2 dans 1 ml d'eau).
On a vérifié la coloration sous microscope et on a arrêté dans un bain de PBS. On a effectué une contre coloration pour visualiser les structures mammaires en plongeant dans l'hématoxyline de Harris en solution modifiée (Sigma) pendant 4 s. On a rincé dans de l'eau basique, puis dans un bain de PBS.
On a monté la lame sur glycergel chauffé au bain-marie 50°C. On a photographié les lames par l'intermédiaire d'une loupe binoculaire (Zeiss). Les photos d'immunohistochimie des coupes ainsi obtenues sont représentées sur la figure 3. Les photos A et B concernent le tissu normal, respectivement avec ou sans marquage au NGF. Les photos C à F concernent le tissu cancéreux, les photos C et E concernant les coupes sans marquage au NGF (contrôle négatif) et les photos D et F concernant les coupes avec marquage au NGF. La barre de calibration représente 250 micromètres pour les photos A, B, E et F ou 600 micromètres pour les photos C et D.
Les résultats montrent clairement que le NGF est détecté par immunohistochimie sur des lames de biopsie dans les cellules épithéliales de cancer du sein, mais pas dans les cellules épithéliales mammaires normales (cellules épithéliales marquées par l'anticorps anti-NGF, et de ce fait colorées, au sein des glandes mammaires tumorales en D et F par rapport à C et E, et non dans les glandes mammaires normales en B par rapport à A). Exemple 6 : Détection du NGF dans les cellules tumorales par cytométrie en flux On a décollé les cellules MCF-7 en raclant le fond de la boîte de culture. On a ensuite ajouté lOOμl de fixateur (Coulter) avec une incubation de 15 minutes à température ambiante. On a ensuite lavé les cellules à trois reprises avec du PBS et on a centrifugé à 1900 tr/min pendant 5 minutes. On a ajouté 100 μl de perméabilisateur (Coulter), puis incubé 5 minutes à température ambiante.
On a ajouté 20 μl de l'anticorps monoclonal de souris anti-NGF non marqué (R&D System, dilué au 100e"16), puis on a incubé 15 minutes à température ambiante.
On a ensuite lavé les cellules à trois reprises avec du PBS et centrifugé 1900 tr/min pendant 5 minutes.
On a ajouté 20μl du 2eme anticorps anti-souris marqué FITC (R&D System, dilué au l/50eme) puis incubé 15 minutes à température ambiante et dans l'obscurité.
On a ensuite lavé les cellules à trois reprises avec du PBS et centrifugé 1900 tr/min pendant 5 minutes. Les cellules ont été reprises dans 500μl de PBS, puis la lecture a été effectuée avec un cytomètre en flux (Beckman Coulter® EPICS®).
Les résultats obtenus montrent que plus de 30% des cellules de cette lignée cellulaire contiennent du NGF en intracytoplasmique.
Une telle méthode est applicable avec des cellules tumorales isolées d'un échantillon biologique. Exemple 7 : Influence d'un anticorps anti-NGF et d'un inhibteur pharmacologique sur la croissance des cellules cancéreuses
On a étudié l'effet de l'anticorps de blocage MAB-256 (supra) et de l'inhibiteur K-252a sur la croissance des cellules MCF-7. Pour ce faire, on a ensemencé les cellules à raison de 2χl04 cellules/ml dans des boîtes de 35 mm dans du milieu complet. Après avoir atteint 40% de confluence, on a lavé les cellules à deux reprises et on les a laissées sans nutriments dans un milieu dénué de sérum contenant de la fibronectine (2 μg/ml) et de transferrine (30 μg/ml) pendant 3 h. L'heure d'après, on a remplacé le milieu par 2 ml du même milieu contenant l'inhibiteur K-252a ou l'anticorps MAB-26 à différentes concentrations afin d'étudier l'effet de l'inhibiteur pharmacologique ou de l'inhibiteur de blocage sur le niveau basai de croissance.
Après 24, 36, 48 et 72 h de traitement, on a déterminé le nombre de cellules après trypsinisation de la culture monocouche avec une solution de 0,25% trypsine/EDTA en utilisant un hémocytomètre. On a également utilisé un anticorps monoclonal anti-souris (A4700, SIGMA), c'est-à-dire non pertinent, pour déterminer la spécificité de l'anticorps de blocage.
Les résultats sont indiqués sur la figure 4 sur laquelle : - la figure 4A montre que la croissance des cellules MCF-7 en milieu de base (carrés) diminue en présence d'anticorps (triangles) et d'inhibiteur (losanges), - les figures 4B et 4C montrent qu'il y a un effet dose de l'anticorps et de l'inhibiteur, respectivement, sur l'effet prolifératif du NGF pour les cellules cancéreuses.
Le NGF peut donc bien être utilisé à titre de cible thérapeutique. Exemple 8 : Effet des anticorps anti-NGF sur la tumorigénèse des cellules mammaires in vivo On a étudié la croissance des cellules de cancer du sein MDA-MB-231 comme suit :
On a effectué une injection sous-cutanée dans le flanc de 30 souris SCID
(Severe Combined Immuno-Deficience) au temps 0 (J0) de 3x106 cellules MDA-MB-
231, issues de cultures in vitro, dans 50 microlitres de PBS par souris. On a maintenu les souris en conditions standard d'élevage à température ambiante, avec une alternace jour/nuit et accès sans limitation à la boisson et à la nourriture. Quatorze , 21 et 28 jours après injection des cellules, on a injecté chez la moitié des souris des anticorps bloquant anti-NGF humains (Oncogene Research Product,
VWR France) en périphérie de la tumeur (sous-cutané au niveau du flanc à 1 cm du point d'injection des cellules tumorales) à la concentration de 12,5 microgrammes dans 50 microlitres de tampon PBS par souris.
On a mesuré la taille des tumeurs, sur les souris vivantes, traitées ou non par l'anticorps anti-NGF, avec un pieds à coulisse électronique 21 et 35 jours après l'injection des cellules cancéreuses (J21 et J35, respectivement). Le volume de la tumeur a été calculé avec la formule suivante : 0,5236xlongueur (mm)χlargeur (mm)x(longueur+largeur)/2.
On a également mesuré le poids des tumeurs à J35 sur ces mêmes souris, après sacrifice de l'animal, à l'aide d'une balance de précision électronique.
On a enfin compté macroscopiquement le nombre de métastases sur leur foie. Les résultats respectifs des mesures ci-dessus (moyenne) sont indiqués sur les graphes de la figure 5 où l'histogramme rayé correspond aux souris non traitées par l'anticorps anti-NGF (contrôles) et l'histogramme non rempli correspond aux souris traitées par ledit anticorps.
Ces graphes mettent en évidence que les traitements par un anti-NGF entraîne une diminution de la masse et du volume tumoraux, ainsi que le nombre de métastases dans le cadre du cancer du sein.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de diagnostic in vitro du cancer du sein, caractérisé en ce qu'il consiste à déterminer la présence de NGF dans un échantillon biologique issu d'un patient suspecté d'être atteint du cancer du sein.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la présence de NGF est mise en évidence par détection directe du NGF dans ledit échantillon biologique.
3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la détection du NGF est mise en œuvre par un test immunologique ou par spectrométrie de masse.
4. Procédé selon l'une des revendications 2 ou 3, caractérisé en ce que ledit échantillon biologique est constitué de fluide biologique ou d'un tissu provenant de la biopsie de la tumeur ou de métastases.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'échantillon biologique est constitué d'un tissu provenant de la biopsie de la tumeur ou des métastases du patient.
6. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'échantillon biologique est constitué de fluide biologique, de préférence préalablement traité pour isoler les cellules tumorales circulantes contenues dans ledit fluide.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que les cellules tumorales circulantes sont ensuite cultivées en conditions telles qu'elles sécrètent du NGF.
8. Procédé selon l'une des revendications 6 ou 7, caractérisé en ce que les cellules tumorales circulantes sont également cultivées dans des conditions permettant le blocage du NGF à l'intérieur desdites cellules.
9. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la détection de NGF est mise en évidence par culture, en présence dudit échantillon biologique, de cellules sensibles au NGF.
10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que ledit échantillon biologique est constitué d'un échantillon de fluide biologique, de préférence préalablement traité pour isoler les cellules tumorales circulantes contenues dans ledit fluide.
11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que les cellules tumorales circulantes sont ensuite cultivées en conditions telles qu'elles sécrètent du NGF.
12. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la détection de NGF est mise en évidence par détection de l'ARNm du NGF dans ledit échantillon biologique.
13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que ledit échantillon biologique est constitué d'un échantillon de fluide biologique ou d'un tissu provenant de la biopsie de la tumeur ou des métastases du patient.
14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'échantillon biologique est constitué d'un tissu provenant de la biopsie de la tumeur ou des métastases du patient.
15. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'échantillon biologique est constitué de fluide biologique, de préférence préalablement traité pour isoler les cellules tumorales circulantes contenues dans ledit fluide.
16. Utilisation du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 15 dans le diagnostic précoce, le dépistage, le suivi thérapeutique, le pronostic et le diagnostic des rechutes dans le cadre du cancer du sein.
17. Utilisation d'un partenaire de liaison du NGF ou d'un inhibiteur du NGF pour la préparation d'un médicament, étant entendu que, dans le cadre du cancer, les partenaires de liaison du NGF ne sont pas des récepteurs pour le NGF ou des fragments actifs de ces récepteurs.
18. Utilisation selon la revendication 17, caractérisée en ce que le médicament est utile pour bloquer ladite prolifération des cellules du cancer du sein et la dissémination à distance chez les patients atteints du cancer du sein.
19. Utilisation selon l'une des revendications 17 ou 18, caractérisée en ce que le partenaire de liaison du NGF est un anticorps anti-NGF.
20. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 17 à 19, caractérisé en ce que ledit partenaire de liaison du NGF ou ledit inhibiteur du NGF a été préalablement mis en conditions telles qu'il pénètre spécifiquement dans les cellules d'intérêt.
21. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de principe actif au moins un partenaire de liaison du NGF ou un inhibiteur du NGF, éventuellement en association avec un excipient pharmaceutiquement acceptable, étant entendu que, dans le cadre du cancer, les partenaires de liaison du NGF ne sont pas des récepteurs pour le NGF ou des fragments actifs de ces récepteurs.
22. Méthode de traitement du cancer du sein qui comprend l'administration, à un patient, d'une dose efficace d'un partenaire de liaison du NGF ou d'un inhibiteur du NGF.
PCT/FR2003/003193 2002-10-28 2003-10-28 Proceded de dosage du ngf pour le diagnostic in vitro du cancer du sein et utilisation en therapie Ceased WO2004040312A2 (fr)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP03778473A EP1556699B1 (fr) 2002-10-28 2003-10-28 Procede de dosage du ngf pour le diagnostic in vitro du cancer du sein et utilisation en therapie
DE60326871T DE60326871D1 (de) 2002-10-28 2003-10-28 Verfahren zur dosierung von ngf zur in vitro diagnose von brustkrebs und therapeutische verwendung
JP2004547728A JP4619125B2 (ja) 2002-10-28 2003-10-28 ｉｎｖｉｔｒｏで乳がんを診断するためのＮＧＦアッセイの方法及び治療におけるその使用
US10/530,568 US7618790B2 (en) 2002-10-28 2003-10-28 Method for NGF assay for in vitro diagnosis of breast cancer and therapeutic use
AU2003285472A AU2003285472B2 (en) 2002-10-28 2003-10-28 Method for NGF assay for in vitro diagnosis of breast cancer and therapeutic use
BRPI0315735A BRPI0315735B8 (pt) 2002-10-28 2003-10-28 método para o ensaio de ngf a diagnose in vitro de câncer de mama e uso terapêutico

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0213428A FR2846426B1 (fr) 2002-10-28 2002-10-28 Procede de dosage du ngf pour le diagnostic in vitro du cancer du sein et utilisation en therapie
FR02/13428 2002-10-28

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2004040312A2 true WO2004040312A2 (fr) 2004-05-13
WO2004040312A3 WO2004040312A3 (fr) 2004-06-17

Family

ID=32088308

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2003/003193 Ceased WO2004040312A2 (fr) 2002-10-28 2003-10-28 Proceded de dosage du ngf pour le diagnostic in vitro du cancer du sein et utilisation en therapie

Country Status (10)

Country Link
US (1) US7618790B2 (fr)
EP (2) EP2085783A1 (fr)
JP (1) JP4619125B2 (fr)
AT (1) ATE426813T1 (fr)
AU (1) AU2003285472B2 (fr)
BR (1) BRPI0315735B8 (fr)
DE (1) DE60326871D1 (fr)
ES (1) ES2324818T3 (fr)
FR (1) FR2846426B1 (fr)
WO (1) WO2004040312A2 (fr)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006003293A (ja) * 2004-06-21 2006-01-05 Norio Nagao 癌転移抑制能測定する方法およびその測定器
FR2896881A1 (fr) * 2006-01-31 2007-08-03 Biomerieux Sa Procede de dosage du prongf pour le diagnostic in vitro du cancer du sein et utilisation du prongf en therapie

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2009256118A1 (en) * 2008-06-05 2009-12-10 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Methods and instrumentation for during-synthesis monitoring of polymer functional evolution
US9487582B2 (en) * 2010-01-08 2016-11-08 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Methods for treating pancreatic cancer
US9884909B2 (en) 2010-12-01 2018-02-06 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF compositions and use thereof
EP2646468B1 (fr) 2010-12-01 2018-07-25 AlderBio Holdings LLC Compositions anti-ngf et leur utilisation
US9067988B2 (en) 2010-12-01 2015-06-30 Alderbio Holdings Llc Methods of preventing or treating pain using anti-NGF antibodies
US9078878B2 (en) 2010-12-01 2015-07-14 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF antibodies that selectively inhibit the association of NGF with TrkA, without affecting the association of NGF with p75
US11214610B2 (en) 2010-12-01 2022-01-04 H. Lundbeck A/S High-purity production of multi-subunit proteins such as antibodies in transformed microbes such as Pichia pastoris
US9539324B2 (en) 2010-12-01 2017-01-10 Alderbio Holdings, Llc Methods of preventing inflammation and treating pain using anti-NGF compositions
JP7467866B2 (ja) * 2019-10-02 2024-04-16 住友ゴム工業株式会社 親水性基材及び親水性基材作製方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2607507A1 (fr) 1986-12-02 1988-06-03 Centre Nat Rech Scient Nouveaux derives a-d-oligonucleotides, leur preparation et leur emploi
WO1994006935A1 (fr) 1992-09-11 1994-03-31 Cephalon, Inc. Procede de detection et de traitement de la maladie de la prostate
WO1995008000A2 (fr) 1993-09-15 1995-03-23 Bio Merieux Reactif et procede pour la detection d'une sequence nucleotidique avec amplification de signal
WO2003076942A2 (fr) 2002-03-13 2003-09-18 Biomerieux Quantification de cellules tumorales circulantes issues de cancers solides

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5475110A (en) * 1994-10-14 1995-12-12 Cephalon, Inc. Fused Pyrrolocarbazoles
CN1153064C (zh) * 1996-04-05 2004-06-09 约翰斯·霍普金斯大学 富集稀少细胞的方法
US20030104364A1 (en) * 1997-06-25 2003-06-05 Patricia A. Billing-Medel Reagents and methods useful for detecting diseases of the breast
US6008003A (en) * 1997-10-28 1999-12-28 Promega Corporation Non-invasive diagnostic method for interstitial cystitis and bladder cancer
FR2781802B1 (fr) 1998-07-31 2001-05-11 Bio Merieux Derives satures ou insatures de l'abietane, conjugues derives et utilisations dans une composition diagnostique, un reactif et un dispositif
NZ520967A (en) * 2000-02-25 2004-04-30 Oxford Glycosciences Uk Ltd Use of breast cancer associated membrane proteins (BCMP) for treatment, prophylaxis and diagnosis of breast cancer
US6548062B2 (en) * 2000-02-29 2003-04-15 Cephalon, Inc. Method of treating cancer with anti-neurotrophin agents
AU2002323151A1 (en) * 2001-08-13 2003-03-03 University Of Pittsburgh Application of lipid vehicles and use for drug delivery

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2607507A1 (fr) 1986-12-02 1988-06-03 Centre Nat Rech Scient Nouveaux derives a-d-oligonucleotides, leur preparation et leur emploi
WO1994006935A1 (fr) 1992-09-11 1994-03-31 Cephalon, Inc. Procede de detection et de traitement de la maladie de la prostate
WO1995008000A2 (fr) 1993-09-15 1995-03-23 Bio Merieux Reactif et procede pour la detection d'une sequence nucleotidique avec amplification de signal
WO2003076942A2 (fr) 2002-03-13 2003-09-18 Biomerieux Quantification de cellules tumorales circulantes issues de cancers solides

Non-Patent Citations (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BASUYAU, J. P. ET AL.: "Standards, Options and Recommendations (SOR) for tumor markers in breast cancer. SOR Working Group", BULL CANCER., vol. 87, 2000, pages 723 - 37
BIOORGANIC & MÉDICINAL CHEMISTRY LETTERS, vol. 8, no. 16, 18 August 1998 (1998-08-18), pages 2219 - 2222
BONINI, S. ET AL., PROC., NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 93, 1996, pages 10955 - 10960
DISIS, M. L.; M. A. CHEEVER.: "HER- 2/neu protein: a target for antigen-specific immunotherapy of human cancer", ADV CANCER RES., vol. 71, 1997, pages 343 - 71, XP000982776
DYKXHOORN D ET AL., NATURE REVIEWS, vol. 4, 2003, pages 457 - 467
GNJATIC, S. ET AL.: "Accumulation of the p53 protein allows recognition by human CTL of a wild-type p53 epitope presented by breast carcinomas and melanomas", J IMMUNOL., vol. 160, 1998, pages 328 - 33
HATTORI A. ET AL., J. BIOL. CHEM., vol. 268, 1993, pages 2577 - 2582
HONDERMARCK H. ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI., vol. 91, 1994, pages 9377 - 81
INTRACELLULAR FLOW CYTOMETRY, APPLIED REAGENTS AND TECHNIQUES, pages 1 - 21
J. BIOL. CHEM., vol. 273, no. 27, 1998, pages 16659 - 16662
J. BIOL. CHEM., vol. 276, no. 21, 2001, pages 17864 - 17870
J. HISTOCHEM. CYTOCHEM., vol. 45, 1997, pages 481 - 491
JAGER, D. ET AL.: "Cancer-testis antigens and ING1 tumor suppressor gene product are breast cancer antigens: characterization of tissue-specific ING1 transcripts and a homologue gene", CANCER RES., vol. 59, 1999, pages 6197 - 204
JAGER, D. ET AL.: "Identification of a tissue-specific putative transcription factor in breast tissue by serological screening of a breast cancer library", CANCER RES., vol. 61, 2001, pages 2055 - 61
LEVI-MONTALCINI, R., SCIENCE, vol. 4237, 1987, pages 1154 - 1162
M. EGHOLM ET AL., J. AM. CHEM. SOC., vol. 114, 1992, pages 1895 - 1897
MALECK, L. ET AL.: "Methods in Molecular Biology", vol. 28, 1994, HUMANA PRESS, INC.
PATTERSON, S.: "Mass spectrometry and proteomics", PHYSIOLOGICAL GENOMICS, vol. 2, 2000, pages 59 - 65
SCANLAN, M. J.; D. JAGER.: "Challenges to the development of antigen-specific breast cancer vaccines", BREAST CANCER RES., vol. 3, 2001, pages 95 - 8, XP002361282, DOI: doi:10.1186/bcr278
SPRINGER, G. F.: "Immunoreactive T and Tn epitopes in cancer diagnosis, prognosis, and immunotherapy", J MOL MED., vol. 75, 1997, pages 594 - 602, XP002998516, DOI: doi:10.1007/s001090050144
TAPLEY, P. ET AL., ONCOGENE, vol. 7, 1992, pages 371 - 381
TORCIA, M. ET AL., CELL, vol. 85, 1996, pages 345 - 356

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006003293A (ja) * 2004-06-21 2006-01-05 Norio Nagao 癌転移抑制能測定する方法およびその測定器
FR2896881A1 (fr) * 2006-01-31 2007-08-03 Biomerieux Sa Procede de dosage du prongf pour le diagnostic in vitro du cancer du sein et utilisation du prongf en therapie
WO2007088305A1 (fr) * 2006-01-31 2007-08-09 Biomerieux Procede de dosage du prongf pour le diagnostic in vitro du cancer en particulier du cancer du sein, de la thyroide ou du poumon et utilisation du prongf en therapie
JP2009525478A (ja) * 2006-01-31 2009-07-09 ビオメリュー 癌、特に乳癌、甲状腺癌及び肺癌のインビトロ診断のためのＰｒｏＮＧＦアッセイのための方法とＰｒｏＮＧＦの治療的使用
US8008009B2 (en) 2006-01-31 2011-08-30 Biomerieux Method for ProNGF assay for in vitro diagnosis of cancer in particular breast, thyroid or lung cancer and therapeutic use of ProNGF
JP2012211148A (ja) * 2006-01-31 2012-11-01 Biomerieux 癌、特に乳癌、甲状腺癌及び肺癌のインビトロ診断のためのＰｒｏＮＧＦアッセイのための方法とＰｒｏＮＧＦの治療的使用
CN101395478B (zh) * 2006-01-31 2013-08-28 生物梅里埃公司 用于体外诊断癌症具体是乳腺癌、甲状腺癌或肺癌的ProNGF测定的方法以及ProNGF的治疗用途
US9061045B2 (en) 2006-01-31 2015-06-23 Biomerieux Method for ProNGF assay for in vitro diagnosis of cancer in particular breast, thyroid or lung cancer and therapeutic use of ProNGF

Also Published As

Publication number Publication date
BR0315735A (pt) 2005-09-06
US7618790B2 (en) 2009-11-17
EP1556699B1 (fr) 2009-03-25
FR2846426B1 (fr) 2004-12-10
ATE426813T1 (de) 2009-04-15
EP1556699A2 (fr) 2005-07-27
ES2324818T3 (es) 2009-08-17
FR2846426A1 (fr) 2004-04-30
BRPI0315735A8 (pt) 2018-09-18
JP4619125B2 (ja) 2011-01-26
WO2004040312A3 (fr) 2004-06-17
DE60326871D1 (de) 2009-05-07
US20060051818A1 (en) 2006-03-09
BRPI0315735B1 (pt) 2018-10-30
BRPI0315735B8 (pt) 2021-05-25
EP2085783A1 (fr) 2009-08-05
AU2003285472B2 (en) 2009-10-08
AU2003285472A1 (en) 2004-05-25
JP2006504101A (ja) 2006-02-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wu et al. WSX1 act as a tumor suppressor in hepatocellular carcinoma by downregulating neoplastic PD-L1 expression
EP1982192B1 (fr) PROCEDE DE DOSAGE DU ProNGF POUR LE DIAGNOSTIC IN VITRO DU CANCER EN PARTICULIER DU CANCER DU SEIN, DE LA THYROIDE, de la prostate, OU DU POUMON ET UTILISATION DU PRONGF EN THERAPIE
Wang et al. CSPG4 protein as a new target for the antibody-based immunotherapy of triple-negative breast cancer
Zhou et al. Suppression of stromal-derived Dickkopf-3 (DKK3) inhibits tumor progression and prolongs survival in pancreatic ductal adenocarcinoma
JP2021152022A (ja) 細胞透過性抗体
JP2021167329A (ja) 細胞透過性タンパク質−抗体コンジュゲートおよび使用方法
EP1556699B1 (fr) Procede de dosage du ngf pour le diagnostic in vitro du cancer du sein et utilisation en therapie
Tabasum et al. EDIL3 as an angiogenic target of immune exclusion following checkpoint blockade
JP2010096748A (ja) アトピー性皮膚炎の検出方法および予防・治療剤のスクリーニング方法
You et al. Cysteine-rich 61, a member of the CCN family, as a factor involved in the pathogenesis of proliferative diabetic retinopathy
Ding et al. Aberrant STING activation promotes macrophage senescence by suppressing autophagy in vascular aging from diabetes
Lou et al. The G-Protein-Coupled Formyl Peptide Receptor 2 Promotes Endothelial-Mesenchymal Transition in Diabetic Retinopathy
KR20050103474A (ko) 갈렉틴 9 함유 의약
Ochirbat et al. The angiogenic role of the alpha 9-nicotinic acetylcholine receptor in triple-negative breast cancers
Scordamaglia et al. Interleukin-1β mediates a tumor-supporting environment prompted by IGF1 in triple-negative breast cancer (TNBC)
Wang et al. A novel role of the scaffolding protein JLP in tuning CD40-induced activation of dendritic cells
Lin et al. Low SOCS3 expression in CD4+ T cells from pemphigus vulgaris patients enhanced Th1-and Th17-cell differentiation and exacerbated acantholysis via STAT activation
JP5808288B2 (ja) 微小胞膜タンパク質及びその応用
Ristić et al. GPR55 in the tumor microenvironment of pancreatic cancer controls tumorigenesis
Cao et al. SUMOylation of HMGA2: selective destabilization of promyelocytic leukemia protein via proteasome
Huang et al. Cardiomyocyte-derived Galectin-9 induces macrophage M2 polarization via the TIM3 pathway to attenuate myocardial remodeling post-myocardial infarction
Chen et al. CXXC5 function blockade promotes diabetic wound healing through stimulating fibroblast and vascular endothelial cell activation
KR102137531B1 (ko) Pld2 단백질 억제제를 유효성분으로 함유하는 노인성 근감소증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
KR102129532B1 (ko) Pten 억제제에 대한 췌장암 치료 반응성 예측용 바이오마커 및 이의 용도
JP2001328949A (ja) プロスタサイクリン合成酵素遺伝子含有医薬組成物

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2006051818

Country of ref document: US

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10530568

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2003285472

Country of ref document: AU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2003778473

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2004547728

Country of ref document: JP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2003778473

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 10530568

Country of ref document: US