ES2324818T3 - Procedimiento de dosificacion de ngf para el diagnostico in vitro de cancer de mama y utilizacion terapeutica. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de diagnóstico in vitro de cáncer de mama, caracterizado porque consiste en determinar la presencia de NGF en una muestra biológica obtenida de un paciente sospechoso de padecer cáncer de mama.
Description
Procedimiento de dosificación de NGF para el
diagnóstico in vitro de cáncer de mama y utilización
terapéutica.
La presente invención se refiere al campo de la
cancerología. Más particularmente, la presente invención tiene por
objeto un procedimiento de diagnóstico del cáncer de mama en un
paciente humano mediante determinación de la presencia de un factor
de crecimiento nervioso (NGF) en una muestra biológica obtenida de
este paciente, pudiendo utilizarse dicho procedimiento tanto en el
diagnóstico precoz, el cribado, el seguimiento terapéutico y el
pronóstico, como en el diagnóstico de recaídas en el marco del
cáncer de mama. Además, debido a la capacidad de las células de
cáncer de mama para producir NGF, la presente invención también se
refiere a la terapia.
En la mujer, el cáncer de mama es la primera
causa de mortalidad por cáncer en los países industrializados. Se
estima que el tamaño mínimo de un tumor detectable mediante
mamografía es de 1 cm. Los cánceres de mama se desarrollan
lentamente. Sin embargo, este tumor de pequeño tamaño presenta un
pasado evolutivo de 8 años de media en el momento del diagnóstico.
La etiología del cáncer de mama no está bien definida. Se han
demostrado predisposiciones familiares. La edad es el factor de
riesgo más importante. De este modo, el riesgo aumenta un 0,5% por
año de edad en los países occidentales. Se conocen otros factores de
riesgo, tales como el número de embarazos y la edad del primer
embarazo, la lactancia, la edad de la pubertad y de la menopausia,
los tratamientos con estrógenos después de la aparición de la
menopausia, el estrés y la alimentación.
El ensayo disponible y utilizado en el cribado
de masas para el cáncer de mama es una técnica de formación de
imágenes: la mamografía. Gracias a esta técnica, la mortalidad
debida al cáncer de mama se ha reducido fuertemente (30% de
reducción de la mortalidad), lo que subraya la importancia del
cribado de los tumores en términos de salud pública. Sin embargo,
las técnicas de cribado padecen cierto número de inconvenientes. La
mamografía necesita un material competitivo y personal cualificado
lo que es costoso en el marco de un cribado de masas.
El la práctica clínica, la caracterización de un
tumor en términos de malignidad se realiza después de su
descubrimiento mediante métodos histológicos en laboratorios
especializados. Un conjunto de parámetros tales como el tamaño del
tumor, su grado histopatológico, la inflamación asociada y la
invasión ganglionar, se utilizan para decidir la actuación
terapéutica y para estimar el pronóstico de la enfermedad.
Desde hace años se buscan y estudian marcadores
que permitan distinguir las células tumorales de las células sanas
para el cáncer de mama. Estos permitirían diagnosticar precozmente
la enfermedad, establecer su pronóstico y su sensibilidad al
tratamiento y supervisar su evolución. Hasta ahora los marcadores
candidatos que se han identificado y estudiado han sido oncogenes,
marcadores tisulares y marcadores asociados a la angiogénesis o a
las capacidades metastáticas del tumor. Actualmente, los marcadores
de cáncer de mama identificados sirven principalmente para el
seguimiento terapéutico. No existe ningún ensayo biológico validado
para el diagnóstico precoz ni para el cribado del cáncer de mama.
Solamente la detección de los receptores de estrógenos en el tejido
normal permite determinar si los tumores serán o no sensibles a
hormonas.
Un número limitado de marcadores antigénicos, en
particular el CA 15-3 (Basuyau, J. P., M. P.
Blanc-Vincent, J. M. Bidant, A. Daver, L. Deneux,
N. Eche, G. Gory-Delabaere, M. F. Pichon y J. M.
Riedinger, 2000 [Standards, Options and recommendations (SOR) for
tumor markers in breast cancer. SOR Working Group]. Bull Cancer. 87:
723-37) se ha identificado en el caso de las
células mamarias cancerosas. Este marcador se utiliza en la práctica
habitual para el seguimiento de los pacientes, en particular para
la detección de recidiva, pero debido a su reducida sensibilidad,
no se ha propuesto su uso en ensayos de cribado ni de
diagnóstico.
Desde hace varios años, se han desarrollado
trabajos relacionados con los antígenos asociados al cáncer de
mama, no para investigar marcadores, sino para investigar dianas
para una inmunoterapia. Estos se refieren a la demostración de una
inmunidad humoral contra los antígenos T/Tn (Springer, G. F. 1997.
Immunoreactive T and Tn epitopes in cancer diagnosis, prognosis,
and immunotherapy. J Mol Med. 75: 594-602), hasta el
descubrimiento más reciente de anticuerpos y de respuestas de
células T dirigidas contra p 53 (Gnjatic, S., Z. Cai, M. Viguier,
S. Chouaib, J. G. Guillet, y J. Choppin. 1998. Accumulation of the
p53 protein allows recognition by human CTL of a
wild-type p53 epitope presented by breast carcinomas
and melanomas. J. immunol. 160: 328-33) y
HER-2/neu (Disis, M L., y M. A. Cheever. 1997.
HER-2/neu protein: a target for
antigen-specific immunotherapy of human cancer. Adv
Cancer Res. 71: 343-71).
Más recientemente, se ha demostrado una serie de
nuevos antígenos potenciales mediante el enfoque SEREX
("serological expression cloning"), que se basa en la
construcción de bibliotecas de ADNc de células tumorales y un
cribado con suero autólogo. De este modo, un cribado serológico de
biblioteca de cáncer de mama permitió la demostración del antígeno
ING1 (Jager, D., E. Stockert, M. J. Scanlan, A. O. Gure, E.
Jager, A. Knuth, L. J. Old, y Y. T. Chen. 1999,
Cancer-testis antigens and ING1 tumor supresor gene
product are breast cancer antigens: characterization of
tissue-specific ING1 transcripts and a homologue
gene. Cancer Res. 59: 6197-204), y después de un
nuevo antígeno de diferenciación
NY-BR-1, expresado de acuerdo
con los autores en el 80% de los cánceres de mama y que induce la
producción de anticuerpos IgG en los pacientes (Jager, D., E.
Stockert, A. O. Gure, M. J. Scanian, J. Karbach, E. Jager, A.
Knuth, L. J. Old, y Y. T. Chen. 2001. Identification of a
tissue-specific putative transcription factor in
breast tissue by serological screening of a breast cancer library.
Cancer Res. 61: 2055-61). Este tipo de enfoque, que
servía principalmente para la búsqueda de dianas potencialmente
utilizables para el desarrollo de vacunas, no excluye a
priori los antígenos presentes en el tejido normal (este es el
caso de NY-BR-1), ni los
reconocidos por un número limitado de sueros de pacientes (2/14
para ING1), por lo tanto no son aprovechables para una
estrategia de cribado o de diagnóstico precoz. Mediante el mismo
enfoque, otros antígenos que inducen una respuesta inmune humoral en
los pacientes se señalaron como
NY-BR-62,
NY-BR-85 y la proteína D52. Estos
antígenos estarían sobre-expresados respectivamente
en el 60%, 90% y 60% de los cánceres de mama (Scanlan, M. J., y D.
Jager. 2001. Challenges to the development of
antigen-specific breast cancer vaccines. Breast
Cancer Res. 3: 95-8).
Los fenómenos moleculares que conducen al
desarrollo de un cáncer de mama implican modificaciones de la
estructura y de la expresión de oncogenes (tales como ras) y de
genes supresores de tumores como p53. El crecimiento de las células
tumorales en la mayor parte de los cánceres de mama depende de las
hormonas estrogénicas (estradiol y progesterona) y de factores de
crecimiento que controlan la proliferación, la migración y la
apoptosis. Estos factores de crecimiento estimulan o inhiben la
proliferación, migración y diferenciación de las células tumorales
para que actúen de forma concertada para favorecer el crecimiento
del cáncer y las metástasis. Por ejemplo, los factores de
crecimiento de tipo insulina, el factor de crecimiento transformante
\alpha (TGF-\alpha) y los factores de
crecimiento de fibroblastos (FGF) todos pueden estimular la
proliferación de las células del cáncer de mama, mientras que el
inhibidor del factor de crecimiento derivado de la mama (MDGI) y el
factor de crecimiento transformante \beta
(TGF-\beta) inhiben su creci-
miento.
miento.
Descamps, S. et al., demostraron que el
factor de crecimiento NGF, el primer factor neurotrófico
descubierto, añadido in vitro a líneas celulares en cultivo
(NGF exógeno), es potencialmente capaz de activar a la vez la
supervivencia y la proliferación de las células de cáncer de mama
(1998, J. Biol. Chem., 273(27), 16659-16662 y
2001, J. Biol. Chem., 276(21),
17864-17870).
El NGF se aisló originalmente por su capacidad
para estimular tanto la supervivencia como la diferenciación de las
neuronas periféricas, que se convierten más tarde en el elemento
arquetipo de la familia neurotrófica de los polipéptidos
(Levi-Montalcini, R., 1987, Science, 4237,
1154-1162). Una función biológica principal del NGF
es el mantenimiento y la supervivencia de las neuronas
post-mitóticas, lo que le convierte en un candidato
importante para el tratamiento de las enfermedades
neurodegenerativas. Además de su papel en el desarrollo y el
mantenimiento de las células neuronales, el NGF también tiene
efectos significativos sobre las células no neuronales. De este
modo, por ejemplo, es un factor de supervivencia autocrino de los
linfocitos B (Torcia, M., et al., 1996, Cell, 85,
345-356).
El NGF genera señales intracelulares mediante
interacción con dos clases de receptor de membrana: el producto
proto-oncogénico de TrkA p140^{trkA}, que posee
una actividad tirosina quinasa intrínseca y un segundo receptor,
p75^{NTR}, que pertenece a la familia de los receptores del factor
de necrosis tumoral (TNF). En las células de cáncer de mama,
existen dos vías de señalización distintas activadas por el NGF. El
efecto mitogénico necesita el receptor p140^{trkA} y la cascada
MAP quinasa, mientras que el efecto anti-apoptosis
depende del receptor p75^{NTR} y de la activación aguas abajo del
factor NF-\kappaB (Descamps, S. et al.,
2001, supra). De este modo, para el diagnóstico del cáncer
de mama, algunos autores se han centrado en la detección de los
receptores de NGF, como por ejemplo en la solicitud de patente
WO94/06935 que describe un procedimiento de diagnóstico de un
estado precanceroso o canceroso en un paciente mediante dosificación
de la cantidad del receptor p75.
El potente efecto biológico de NGF sobre las
células de cáncer de mama plantea también la cuestión de su
distribución en la glándula mamaria y de su origen. Se piensa
generalmente que el NGF es producido por dianas de inervación
simpática y sensorial, aunque no se ha encontrado en la circulación
sanguínea (Bonini, S. et al; 1996, Proc., Natl. Acad. Sci.
USA, 93, 10955-10960).
La solicitante ha demostrado ahora de forma
sorprendente que las propias células de cáncer de mama producen
NGF, mientras que las células epiteliales mamarias normales
correspondientes no lo producen, de modo que el NGF puede
utilizarse como marcador tumoral o bien como diana terapéutica.
De este modo, la presente invención tiene como
primer objeto un procedimiento de diagnóstico de cáncer de mama
mediante determinación de la presencia de NGF en muestras obtenidas
de pacientes sospechosos de padecer cáncer de mama.
El procedimiento de la invención permite, por lo
tanto, diagnosticar el cáncer de mama mediante un ensayo simple que
consiste en buscar la presencia de NGF en una muestra biológica
extraída de un paciente. La solicitante ha mostrado de forma
inesperada que las células cancerosas producen NGF, mientras que las
células correspondientes no cancerosas eran incapaces de
producirlo, como se demostrará de forma más detallada a
continuación. De este modo, la determinación de la presencia de NGF
en la muestra permite llegar a la conclusión de la presencia de la
patología buscada, permitiendo la ausencia de NGF llegar a la
conclusión de la ausencia de patología.
Se entiende por determinación de la presencia de
NGF, la detección directa de NGF o el cultivo de células sensibles
a NGF, o la detección del ARNm de NGF en la muestra biológica o
cualquier otro procedimiento de determinación de la presencia de
una proteína en una muestra, conocido por el experto en la
materia.
La determinación de la presencia de NGF mediante
detección directa del NGF constituye una realización particular de
la invención.
Por detección directa del NGF, se entiende la
demostración de la presencia del propio NGF en la muestra
biológica.
La detección directa de NGF en la muestra
biológica puede realizarse mediante cualquier medio conocido por el
experto en la materia, como por ejemplo mediante ensayo inmunológico
o mediante espectrometría de masas, lo que constituye una
realización particular de la invención.
El ensayo inmunológico puede ser cualquier
ensayo muy conocido por el experto en la materia que implica
reacciones inmunológicas, a saber reacciones entre el NGF y un socio
de unión específico del NGF.
Los socios de unión específicos de NGF son
cualquier socio susceptible de unirse a NGF. Como ejemplo, pueden
mencionarse los anticuerpos, las fracciones de anticuerpos, los
receptores y cualquier otra proteína capaz de unirse al NGF.
Los anticuerpos socios de unión son anticuerpos
policlonales o anticuerpos monoclonales.
Los anticuerpos policlonales pueden obtenerse
mediante inmunización de un animal con NGF, seguida de la
recuperación de los anticuerpos buscados en forma purificada,
mediante extracción del suero de dicho animal y separación de
dichos anticuerpos de los demás constituyentes del suero,
particularmente mediante cromatografía de afinidad en una columna en
la que se fija un antígeno específicamente reconocido por los
anticuerpos, particularmente el NGF.
Los anticuerpos monoclonales pueden obtenerse
mediante la técnica de hibridomas cuyo principio general se
recuerda a continuación.
En un primer momento, se inmuniza un animal,
generalmente un ratón (o células en cultivo en el marco de
inmunizaciones in vitro) con NGF, cuyos linfocitos B son
entonces capaces de producir anticuerpos contra dicho antígeno.
Estos linfocitos productores de anticuerpos se fusionan a
continuación con células mielomatosas "inmortales" (múridas en
el ejemplo) para dar lugar a hibridomas. A partir de la mezcla
heterogénea de las células obtenida de este modo, se realiza
entonces una selección de las células capaces de producir un
anticuerpo particular y de multiplicarse indefinidamente. Cada
hibridoma se multiplica en forma de clon, conduciendo cada uno a la
producción de un anticuerpo monoclonal cuyas propiedades de
reconocimiento con respecto al antígeno tumoral de interés podrían
ensayarse por ejemplo en ELISA, mediante inmunotransferencia en una
o dos dimensiones, en inmunofluorescencia o con ayuda de un
biosensor. Los anticuerpos monoclonales seleccionados de este modo,
se purifican a continuación particularmente de acuerdo con la
técnica de cromatografía de afinidad descrita anteriormente.
Ejemplos de anticuerpos anti-NGF
se conocen y están disponibles particularmente en el catálogo de
R&D Systems o de Santa Cruz.
Los socios de unión específicos de NGF podrán
marcarse para el revelado de la unión de NGF/socio de unión cuando
el socio de unión se utiliza como reactivo de detección, y por lo
tanto para la detección directa de NGF en la muestra biológica.
Por marcado de los socios de unión, se entiende
la fijación de un marcador capaz de generar directa o indirectamente
una señal detectable. Una lista no limitante de estos marcadores
consiste en:
- \bullet
- enzimas que producen una señal detectable por ejemplo por colorimetría, fluorescencia, luminiscencia, como peroxidasa de rábano rusticano, fosfatasa alcalina, \alpha-galactosidasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa,
- \bullet
- cromóforos como los compuestos fluorescentes, luminiscentes, colorantes,
- \bullet
- moléculas radiactivas como ^{32}P, ^{35}S o ^{125}I, y
- \bullet
- moléculas fluorescentes tales como alexa o ficocianinas.
También pueden utilizarse sistemas indirectos,
como por ejemplo ligandos capaces de reaccionar con un
anti-ligando. Las parejas
ligando/anti-ligando las conocen bien el experto en
la materia, como es el caso por ejemplo de las siguientes parejas:
biotina/estreptavidina, hapteno/anticuerpo, antígeno/anticuerpo,
péptido/anticuerpo, azúcar/lectinas, polinucleótido/complementario
del polinucleótido. En este caso, es el ligando el que tiene el
agente de unión. El anti-ligando puede ser
detectable directamente por los marcadores descritos en el párrafo
anterior o ser él mismo detectable por un
ligando/anti-ligando.
Estos sistemas indirectos de detección pueden
conducir, en algunas condiciones, a una amplificación de la señal.
Esta técnica de amplificación de la señal es bien conocida por el
experto en la materia y podremos remitirnos a las patentes
anteriores FR98/10084 o
WO-A-95/08000 de la solicitante o al
artículo J. Histochem. Cytochem. 45: 481-491,
1997.
Según el tipo de marcado del conjugado
utilizado, el experto en la materia añadirá reactivos que permiten
la visualización del marcado.
Como ejemplo de ensayos inmunológicos tales como
se han definido anteriormente, pueden mencionarse los métodos
"sándwich" tales como ELISA, IRMA y RIA, los métodos llamados
de competencia y los métodos de inmunodetección directa como
inmunohistoquímica, inmunocitoquímica transferencia de Western e
inmunotransferencia "Dot-blot."
También puede utilizarse espectrometría de masas
para la detección directa de NGF en la muestra biológica. El
principio de la espectrometría es muy conocido por el experto en la
materia y se describe por ejemplo en Patterson, S., 2000, Mass
spectrometry and proteomics. Physiological Genomics 2,
59-65.
Para ello, la muestra biológica, tratada
previamente o no, se pasa por un espectrómetro de masas y se compara
el espectro obtenido con el de NGF. Un ejemplo de tratamiento
previo de la muestra consiste en hacerle pasar sobre un soporte de
inmunocaptura, que comprende uno de los socios de unión a NGF, por
ejemplo un anticuerpo dirigido contra NGF.
La muestra biológica utilizada para la detección
directa del NGF, susceptible de contener NGF como tal, puede estar
constituida por fluido biológico o un tejido procedente de la
biopsia del tumor o de metástasis del paciente en cuestión.
Como fluido biológico, pueden mencionarse
sangre, médula ósea, leche, líquido cefalorraquídeo, orina y
exuda-
dos.
dos.
Para la detección de NGF, el fluido biológico,
que constituye una realización particular de la invención, puede
necesitar un tratamiento particular. En efecto, el fluido biológico
puede contener NGF como tal o puede contener células tumorales
circulantes que contienen NGF y eventualmente células tumorales
circulantes que son capaces de secretar NGF.
De este modo, de acuerdo con una realización de
la invención, el fluido biológico se trata previamente para aislar
las células tumorales circulantes contenidas en dicho fluido.
Por aislar las células tumorales circulantes, se
entiende obtener una fracción celular enriquecida en células
tumorales circulantes.
El tratamiento del fluido para aislar las
células tumorales circulantes puede realizarse mediante
clasificación celular en un citómetro de flujo, mediante
enriquecimiento en Ficoll, mediante enriquecimiento con perlas
magnéticas recubiertas de anticuerpos específicos o mediante
cualquier otro método de enriquecimiento específico conocido por el
experto en la materia.
En el caso de la sangre o de la médula ósea como
fluido biológico, las células tumorales circulantes pueden aislarse
gracias a una técnica de separación celular en Ficoll asociada a un
agotamiento de las células sanguíneas utilizando anticuerpos
anti-CD45 acoplados a perlas magnéticas (Dynal
Biotech ASA, Noruega).
La detección directa de NGF puede realizarse
entonces directamente a partir de células tumorales circulantes
aisladas del fluido biológico, por ejemplo mediante marcado
inmunocitoquímico de estas células con anticuerpo
anti-NGF, después de depositar las células tumorales
circulantes sobre un portaobjetos con citospina. La detección
directa del NGF también puede realizarse directamente en las células
tumorales circulantes utilizando el método de citometría de flujo
tal como se describe en Métézeau P, Ronot X, Le
Noan-Merdrignac G, Ratinaud MH, "La cytométrie en
flux pour l'étude de la cellule normale o pathologique" (Tomo I),
Eds Medsi-MacGrawhill.
En estas condiciones, dichas células circulantes
pueden tratarse en condiciones que permitan el bloqueo del NGF en
el interior de dichas células. Dicho tratamiento se describe por
ejemplo en "Intracellular Flow Cytometry, Applied reangents and
Techniques", págs 1-21, BD Pharmingen.
La detección del NGF se realiza entonces después
de haber permeabilizado la membrana de las células para hacer que
entren los socios de unión específica a NGF.
La detección directa de NGF a partir de las
células circulantes también puede realizarse con ayuda del
procedimiento descrito en la solicitud de patente WO03/076942
depositada por una de las Solicitantes.
La detección directa de NGF en las células
tumorales puede realizarse también en el medio de cultivo de dichas
células después de cultivarlas en condiciones tales que secreten
NGF.
Estas condiciones de cultivo son condiciones
convencionales tales como 37ºC en atmósfera húmeda y al 5% de
CO_{2}.
Cuando la muestra biológica a ensayar es tejido
procedente de la biopsia del tumor o de metástasis del paciente, lo
que constituye una realización particular de la invención, la
detección directa de NGF se realiza directamente en los cortes
obtenidos, sin tratamiento previo de dicho tejido.
Otro modo de detección de la presencia de NGF
consiste en el cultivo, en presencia de la muestra biológica, de
células sensibles a NGF, lo que constituye una realización
particular de la invención.
En este caso, la detección de la presencia de
NGF en una muestra biológica se demuestra mediante la reacción de
las células sensibles a NGF.
Por células sensibles a NGF, se entiende
cualquier célula estimulada en presencia de NGF (crecimiento,
apoptosis, etc.).
Como células sensibles a NGF, pueden mencionarse
las células de feocromocitoma PC12 (Honder marck H et al.,
1994, Proc. Natl. Acad. Sci., 91: 9377-81) y las
células embrionarias de origen neuronal (Hattori A, et al.,
1993, J. Biol. Chem., 268: 2577-2582).
La muestra biológica que puede utilizarse para
la detección de la presencia de NGF mediante cultivo de células
sensibles a NGF puede ser cualquier muestra tal como se ha descrito
anteriormente.
De este modo, la muestra biológica puede estar
constituida por fluido biológico, llegado el caso, tratado
previamente para aislar las células tumorales circulantes, que, a su
vez, pueden cultivarse en condiciones tales que secreten NGF, como
se ha descrito anteriormente.
Otro modo de detección de la presencia de NGF en
las muestras biológicas consiste en la detección del ARNm de NGF en
dicha muestra, lo que constituye una realización de la
invención.
La detección del ARNm en una muestra líquida es
conocida ampliamente por el experto en la materia.
Ésta puede realizarse por ejemplo mediante
reacciones de hibridación entre el ARNm diana y un ácido nucleico
capaz de unirse con el ARNm diana.
Se entiende por ácido nucleico los
oligonucleótidos, ácidos desoxirribonucleicos y ácidos
ribonucleicos, así como sus derivados.
El término "oligonucleótido" designa una
sucesión de al menos 2 nucleótidos (desoxirribonucleótidos o
ribonucleótidos, o ambos), naturales o modificados, que pueden
hibridar, en condiciones apropiadas de hibridación, con un
oligonucleótido al menos parcialmente complementario. Por
nucleótido modificado, se entiende por ejemplo un nucleótido que
comprende una base modificada y/o que comprende una modificación a
nivel del enlace internucleotídico y/o a nivel del esqueleto. Como
ejemplo de base modificada, puede mencionarse inosina,
metil-5-desoxicitidina,
dimetilamino-5-desoxiuridina. Para
ilustrar un enlace internucleotídico modificado, pueden mencionarse
los enlaces fosforotioato, N-alquilfosforamidato,
alquilfosfonato y alquilfosfodiéster. Los
alfa-oligonucleótidos tales como los descritos en
FR-A-2 607 507, los LNA tales como
fosforotioato-LNA y
2'-tio-LNA descritos en Bioorganic
& Medicinal Chemistry Letters, Volumen 8, Número 16, 18 de
agosto de 1998, páginas 2219-2222, y los PNA que
son el objeto del artículo de M. Egholm et al., J. Am. Chem.
Soc. (1992), 114, 1895-1897, son ejemplos de
oligonucleótidos constituidos por nucleótidos cuyo esqueleto está
modificado.
El revelado de las reacciones de hibridación
puede realizarse mediante marcado de los ácidos nucleicos de unión,
como se ha ilustrado anteriormente.
Antes de la hibridación con el ácido nucleico de
unión, el ARNm diana puede extraerse mediante métodos conocidos por
el experto en la materia y después amplificarse opcionalmente, como
por ejemplo por RT-PCR o por NASBA (Maleck, L.,
et al., 1994, Methods in Molecular Biology 28, cap. 36, Ed
P.G. Isaac, Humana Press, Inc., Totowa, NJ).
La muestra biológica que puede utilizarse para
la detección de la presencia de NGF mediante detección de ARNm de
NGF puede ser cualquier muestra tal como se ha descrito
anteriormente.
De este modo, la muestra biológica puede estar
constituida por tejido obtenido de biopsia de tumor o de metástasis,
o bien de fluido biológico, llegado el caso tratado previamente
para aislar las células tumorales circulantes, como se ha descrito
anteriormente.
El procedimiento de la invención puede
utilizarse tanto para el diagnóstico precoz, como para el cribado,
el seguimiento terapéutico, el pronóstico y el diagnóstico de
recaídas en el marco del cáncer de mama, ya que solamente las
células cancerosas producen NGF y que esta producción está en
función del grado del cáncer.
De este modo, otro objeto de la invención
consiste en la utilización del procedimiento de la invención en el
diagnóstico precoz, el cribado, el seguimiento terapéutico, el
pronóstico y el diagnóstico de recaídas en el marco del cáncer de
mama.
Además de un papel de marcador tumoral, el NGF
también puede tener un papel de diana terapéutica. En efecto,
debido a la capacidad de las células de cáncer de mama para producir
NGF, mientras que las células normales no lo producen, la
proliferación tumoral y la diseminación a distancia de las células
de cáncer de mama pueden ser bloqueadas por un socio de unión a NGF
susceptible de bloquear la proliferación celular o por un inhibidor
de NGF.
Los socios de unión a NGF y los inhibidores de
NGF pueden utilizarse por lo tanto como medicamentos.
De este modo, la presente invención también
tiene por objeto la utilización de un socio de unión a NGF o de un
inhibidor de NGF para la preparación de un medicamento,
entendiéndose que, en el marco del cáncer, los socios de unión a
NGF no son receptores para NGF o fragmentos activos de estos
receptores.
De acuerdo con una realización particular de la
invención, dicho medicamento es útil para bloquear la proliferación
tumoral y la diseminación a distancia en los pacientes que padecen
cáncer de mama.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden
como principio activo al menos un socio de unión a NGF o un
inhibidor de NGF, opcionalmente en asociación con un excipiente
farmacéuticamente aceptable, también se incluyen en la invención,
entendiéndose que, en el marco del cáncer, los socios de unión a NGF
no son receptores para NGF o fragmentos activos de estos
receptores.
Las composiciones farmacéuticas útiles contra el
cáncer de mama comprenden, como principio activo, al menos un socio
de unión a NGF susceptible de bloquear la proliferación tumoral
celular o un inhibidor de NGF.
Los socios de unión a NGF específicos apropiados
como principio activo son particularmente tal como se han definido
anteriormente en los ensayos inmunológicos y pueden ser cualquier
otro socio conocido por el experto en la materia capaz de bloquear
la proliferación tumoral. De acuerdo con una realización particular,
el socio específico susceptible de bloquear la proliferación de
células de cáncer de mama es un anticuerpo
anti-NGF.
Por inhibidor de NGF, se entiende inhibidores
directos de NGF, es decir inhibidores que bloquean la actividad
biológica de la proteína, inhibidores de las vías de exocitosis de
NGF, inhibidores de ARNm de NGF e inhibidores del gen que codifica
NGF.
Como inhibidor directo de NGF, puede mencionarse
el inhibidor K-252a (Tapley, P. et al., 1992,
Oncogene 7, 371-281).
Los inhibidores de las vías de exocitosis de las
proteínas y en particular del NGF son ampliamente conocidos por el
experto en la materia.
Como inhibidor del ARNm de NGF, puede utilizarse
un fragmento sintético de este ARNm. En efecto, la tecnología del
ARN interferente se basa en la utilización de un oligonucleótido de
ARN de cadena doble correspondiente a una corta secuencia del ARNm
celular a inhibir. Este oligonucleótido de cadena doble (introducido
o no en un plásmido), después de la entrada en la célula, queda a
cargo del sistema enzimático Dicer/Risc, lo que conlleva la
degradación del ARNm celular correspondiente (Dykxhoorn D et
al., 2003, Nature Reviews, vol. 4. p
457-467).
Como inhibidor del gen que codifica NGF, puede
mencionarse un oligonucleótido anti-sentido de NGF.
Este oligonucleótido puede prepararlo fácilmente el experto en la
materia.
Para dirigir la acción terapéutica de los socios
de unión a NGF o de los diferentes inhibidores, estos últimos
pueden ponerse en condiciones tales que penetren específicamente en
las células de interés, tales como las células tumorales, lo que
constituye otra realización de la invención.
Para ello, pueden estar fijados por ejemplo a un
socio que permita dicha penetración, como por ejemplo una molécula
portadora, un polímero tal como los polímeros utilizados en terapia
génica o bien un vector viral tal como los adenovirus y poxvirus,
también utilizados en terapia génica.
Por ejemplo, en el marco del cáncer de mama, la
molécula portadora puede ser un anticuerpo anti-MUCI
o un anticuerpo anti-célula epitelial o bien
también un anticuerpo
anti-HER-2/neu.
Preferentemente, cuando la composición
farmacéutica comprende como principio activo un socio de unión a NGF
o un inhibidor de NGF tal como un inhibidor directo o un inhibidor
de las vías de exocitosis de NGF, estos últimos se ponen en
condiciones tales que penetren específicamente en las células
tumorales de interés, los inhibidores del ARNm de NGF y los
inhibidores del gen que codifica el NGF que tiene la capacidad de
penetrar de forma natural en dichas células.
La cantidad y la naturaleza del excipiente puede
determinarlas fácilmente el experto en la materia. Éstas se
seleccionan de acuerdo con la forma farmacéutica y el modo de
administración deseados.
En las composiciones farmacéuticas de la
invención para administración oral, sublingual, subcutánea,
intramuscular, intratumoral, intravenosa, tópica, rectal, local,
intracraneal, intranasal, transdérmica, rectal, intraocular,
intra-auricular, pudiendo administrarse dicho
principio activo en forma de administración unitaria.
Las formas de administración unitaria pueden ser
por ejemplo, comprimidos, grageas, gránulos, polvos, soluciones o
suspensiones orales inyectables, parches transdérmicos
("patch"), formas de administración sublingual, bucal,
intratraqueal, intraocular, intranasal,
intra-auricular, por inhalación, formas de
administración tópica, transdérmica, subcutánea, intramuscular,
intratumoral o intravenosa, formas de administración rectal o
implantes. Para la administración tópica, pueden preverse cremas,
geles, pomadas, lociones o colirios.
Estas formas galénicas se preparan de acuerdo
con los métodos usuales de los campos considerados.
Dichas formas unitarias se dosifican para
permitir una administración diaria de 0,001 a 10 mg de principio
activo por kg de peso corporal, de acuerdo con la forma
galénica.
Puede haber casos particulares donde las
dosificaciones más altas o más reducidas son apropiadas; dichas
dosificaciones no salen del marco de la invención. De acuerdo con
la práctica habitual, la dosificación apropiada para cada paciente
es determinada por el médico de acuerdo con el modo de
administración, el peso y la respuesta del paciente.
De acuerdo con otra realización, la presente
invención también se refiere a un método de tratamiento del cáncer
de mama que comprende la administración, a un paciente, de una dosis
eficaz de un socio de unión a NGF o de un inhibidor de NGF.
La invención se entenderá mejor con ayuda de los
siguientes ejemplos que se dan a título ilustrativo y no limitante,
así como con ayuda de las figuras 1 a 5 adjuntas, en las que:
- la figura 1 se refiere a representaciones
gráficas relativas a la demostración de la expresión de NGF en
células cancerosas, en la que:
- \circ
- la figura 1A representa un gel de electroforesis que demuestra, después de RT-PCR, la secreción de NGF por las células cancerosas MCF-7, T47D, MDA-MB-231 y BT20 y por las células de la glándula submaxilar como control, así como la ausencia de dicha secreción por las células normales NBEC (Normal Breast Epithelial Cells),
- \circ
- la figura 1B representa un gel de electroforesis que demuestra, después de inmunotransferencia, la secreción de NGF por las células cancerosas MCF-7, T47D, MDA-MB-231 y BT20 y por las células de la glándula submaxilar, así como la ausencia de dicha secreción por las células NBEC, y
- \circ
- la figura 1C es un gráfico que da la cantidad de NGF secretado en función de las células ensayadas mediante ELISA, a saber las células cancerosas MCF-7, T47D, MDA-MB-231 y BT20, las células de la glándula submaxilar y las células NBEC,
- la figura 2 se refiere a las representaciones
sobre el co-cultivo de células cancerosas y de
células sensibles a NGF, en la que:
- \circ
- la figura 2A representa el esquema experimental de co-cultivo de las células PC12(1) que se desarrollan en presencia de NGF y de células cancerosas (2), y
- \circ
- la figura 2B está constituida por fotografías que representan el cultivo de células PC12 como control (foto 2), la diferenciación de las células PC12 bajo la influencia de NGF (foto 3), el co-cultivo de células sensibles a NGF en presencia de células cancerosas MCF-7 (foto 4), el cultivo de células cancerosas MCF-7 en presencia de un anticuerpo anti-NGF (foto 5), el cultivo de células cancerosas MCF-7 en presencia del inhibidor K252a (foto 6), el cultivo de células mamarias normales NBEC (foto 7)
- la figura 3 representa fotografías de
inmunocitoquímica que demuestran la expresión de NGF mediante
inmunodetección en tejido obtenido de biopsia, en la que las fotos
A y B se refieren al tejido normal, respectivamente con o sin
marcado con NGF, refiriéndose las fotos C a F al tejido canceroso,
refiriéndose las fotos C y E a los cortes sin marcado con NGF
(control negativo) y refiriéndose las fotos D y F a los cortes con
marcado con NGF,
- la figura 4 se refiere a gráficos que
demuestran la influencia de un socio de unión susceptible de
bloquear la proliferación de las células de cáncer de mama sobre el
crecimiento celular, en la que:
- \circ
- la figura 4A representa un gráfico que muestra el crecimiento de las células MCF-7 en número de células (10^{4} células/disco de 35 mm), sin agente de bloqueo de la proliferación tumoral como control o en presencia del anticuerpo anti-NGF MAB-256 o en presencia del inhibidor K-252a, y
- \circ
- las figuras 4B y 4C representan gráficos que dan el número de células MCF-7 en función de la dosis de anticuerpo MAB-256 (figura 4B) o de la dosis de inhibidor K-252a (figura 4C) y
- la figura 5 da gráficos que demuestran la
influencia de un anticuerpo anti-NGF, en función del
tiempo, sobre el volumen tumoral (figura 5A), sobre la masa tumoral
(figura 5B) y sobre el número de metástasis hepáticas (figura 5C)
de células de cáncer de mama de ratón.
Se ensayaron 4 líneas de células de cáncer de
mama humano, a saber las células MCF-7, T47D,
MDA-MB-231 y BT20, obtenidas de de
la colección ATCC (Rockville, MD) con los números
HTB-22, HTB-133,
HTB-26 y HTB-29,
respectivamente.
Estas células se mantuvieron en medio mínimo
esencial (sal de Earle, BioWhittaker, Bélgica) suplementado con
HEPES 20 mM, 2 g/l de bicarbonato sódico, 2 mM de
L-glutamina, 10% de suero fetal de ternero (FCS),
100 unidades/ml de penicilina-estreptomicina, 50
\mug/ml de gentamicina, 1% de aminoácidos esenciales y 5 \mug/ml
de insulina.
Como comparación, se ensayaron células
epiteliales de mama normales (NBEC) obtenidas de del Departamento de
Cirugía Plástica de la Universidad Médica de Lille (Prof. Pellerin,
Francia) que se cultivaron en medio DMEM/F12 (1/1) (BioWhittaker)
que contenía el 5% de FCS, 10 Ul/ml de insulina, 5 \muM de
cortisol, 2 ng/ml de EGF, 100 ng/ml de toxina del cólera, 100 ng/ml
de penicilina y 45 \mug/ml de gentamicina (medio B1). Cuando las
células se aproximaban a la confluencia, se les colocaba en el mismo
medio, excepto que se había reducido la concentración de calcio a
20 \muM.
También se utilizaron las células de glándula
submaxilar humana, obtenidas a partir de restos de disecciones
hospitalarias, como fuente conocida de NGF.
Se aisló el ARN total de células cancerosas, de
células NBEC y de la glándula submaxilar humana (20 mg de peso)
utilizando el kit Rneasy mini (Qiagen, Francia). Se realizó la
ruptura y la homogeneización de la glándula submaxilar utilizando un
homogeneizador Rotor-Stator (Bribolyser,
Hybaid).
Se cuantificó la cantidad de ARN extraída
midiendo la absorbancia a 260 nm y se investigó la pureza del ARN
mediante la proporción de absorbancia a 260 nm y a 280 nm. Se
confirmó la ausencia de degradación de ARN mediante electroforesis
del ARN en un gel de agarosa al 1,5% que contenía bromuro de
etidio.
Se realizó la transcripción inversa (RT)
añadiendo una mezcla de reacción que contenía 2 g de ARNm total
purificado, 1X tampón de reacción, 10 mM de DTT, 40 mM de dNTP cada
uno, 2,5 M de oligo(dT), 40 unidades de Rnasine y 200
unidades de transcriptasa inversa de virus de la leucemia múrida
Moloney a 25 \mul de volumen de reacción total. Todas las
reacciones se incubaron a 37ºC durante 1 h y después se inactivan a
95ºC durante 5 minutos.
La PCR se realizó en los ADNc después de la RT o
sobre las muestras de ARN sin etapa de RT para los controles
negativos de la siguiente manera:
A los tubos de PCR, se añaden 5 \mul de tampón
de PCR (200 mM de Tris-HCl, pH 8,4, KCl 500 mM), 10
\mul de MgCl_{2} 15 mM, 1 ml de dNTP mix 10 mM, 1 \mul de
ADNc o de ARNm total (para el control negativo), 1 \mul de las
sondas 50 mM para el gen ngf indicadas a continuación, 1
\mul de 2,5 unidades/\mul de ADN polimerasa Taq y agua hasta un
volumen total de 50 \mul.
| Sonda sentido: | 5'-GACAGTGTCAGCGTGTGGGTT-3' | |
| Sonda antisentido: | 5'-CCCAACACCATCACCTCCTT-3' |
Las condiciones de PCR eran las siguientes:
después del tratamiento a 95ºC durante 3 minutos para desnaturalizar
el ADNc, se realizaron 30 ciclos a 94ºC durante 1 minuto, 57ºC
durante 2 minutos y 72ºC durante 3 minutos. A continuación se
incubaron los tubos de PCR durante 10 minutos suplementarios a 72ºC
para la extensión de los fragmentos de ADNc después del ciclo
final.
La visualización del material amplificado bajo
luz ultravioleta mediante tinción con bromuro de etidio después de
electroforesis en gel de agarosa se representa en la figura 1A. Esta
figura muestra un producto de transcripción de ngf de 74 pb
para las células epiteliales cancerosas y las células de la glándula
submaxilar (control positivo), mientras que este producto no se
detecta para las células NBEC.
Este ensayo permite, por lo tanto, demostrar que
las células cancerosas secretan NGF, mientras que las células
epiteliales correspondientes no cancerosas no lo secretan.
Las células ensayadas son las indicadas en el
punto 1.1 anteriormente.
Las células subconfluentes, cultivadas como se
ha indicado en el punto 1.1 anteriormente, se aclararon y colocaron
en un medio sin suero que contenía fibronectina y transferrina
durante 24 h. Después de privarlas de nutrientes, las células se
recogieron mediante raspado en tampón PBS (solución salina tamponada
con fosfato) y se sometieron a un centrifugado (1000 x g, 5
min).
El sedimento se trató con tampón de lisis (SDS
al 10%, 0,5% de \beta-mercaptoetanol, Tris HCl 0,5
M pH 6,8, 25% de glicerol, 0,5%) y se llevó a ebullición durante 5
minutos a 100ºC.
Después del centrifugado (1000 x g, 5 min), se
buscaron las proteínas de los sobrenadantes utilizando los ensayos
de determinación de proteínas de Bio Rad.
Se sometieron a SDS-PAGE los
lisados procedentes de cada línea celular y de la glándula
submaxilar, se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa
mediante electrotransferencia (200 mA, 45 minutos).
A continuación se ensayó cada membrana con un
anticuerpo policlonal de conejo anti-NGF
(sc-548, Santa Cruz Biotechnology, Tebu, Francia) a
4ºC durante una noche. Se aclaró cada membrana tres veces con tampón
TBS-T y después se incubaron a temperatura ambiente
durante 2 h con un anticuerpo anti-inmunoglobulina
de conejo acoplado a peroxidasa de rábano rusticano (Molecular
Probes). Se aclaró cada membrana cuatro veces con tampón
TBS-T y se reveló la reacción utilizando el kit de
quimioluminiscencia ECL (Amersham Pharmacia Biotech) con la
película AR X-Omat de Kodak.
También es ese caso, como se representa en la
figura 1B, se detectó NGF con las células cancerosas y la glándula
submaxilar (banda a 14 kDa), mientras que esta banda estaba ausente
para las células no cancerosas.
Este resultado confirma el del ejemplo 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células ensayadas son las indicadas en el
punto 1.1 anteriormente.
Para este ensayo, se utilizó un ensayo con dos
sitios para \beta-NGF humano. En resumen, se
recubrieron inmunoplacas de 1 \mug/ml con anticuerpo monoclonal
de captura (R&D Systems, Reino Unido) diluido en un tampón de
dilución (BSA al 0,1%, Tween 20 al 0,005% en una solución salina
tamponada con Tris pH 7,3). Los pocillos de control se recubrieron
con la misma cantidad de IgG de ratón (R&D Systems). Cada
pocillo recibió 100 \mul de esta dilución y las placas se
sembraron e incubaron a temperatura ambiente, durante una noche.
Se lavaron los pocillos tres veces con 400
\mul de PBS, pH 7,4, que contenía el 0,05% de Tween 20. A
continuación se bloquearon las placas a temperatura ambiente
utilizando el 1% de albúmina de suero bovino, el 5% de sacarosa y el
0,005% de NaN_{3} en el mismo tampón.
Después de 2 h, se lavaron cuatro pocillos, se
aplicaron diluciones de productos desconocidos y patrones en un
volumen de 100 \mul y se recubrieron las placas con una banda
adhesiva y se incubaron a temperatura ambiente durante una
noche.
Se utilizó \beta-NGF humano
(R&D Systems) como muestra patrón a razón de 0,25 a 8 ng/ml en
10 \mul de tampón de dilución.
A continuación se lavaron las placas de forma
exhaustiva y se añadió el anticuerpo de detección IgG de cabra
específico anti-\beta-NGF humano
(BAF-256, R&D Systems) a razón de 50 ng/ml antes
de la incubación durante 2 h a temperatura ambiente.
Después de la incubación, se lavan las
inmunoplacas tres veces con tampón de lavado y se añaden 100 \mul
de estreptavidina/peroxidasa de rábano rusticano para una incubación
de 20 min a temperatura ambiente.
La reacción comenzó mediante la adición de 100
\mul de una solución sustrato durante 30 min de incubación a
temperatura ambiente y en oscuridad.
Después de este periodo, se añadieron 50 \mul
de una solución de interrupción (H_{2}SO_{4} 1 M) en cada
pocillo. Se determinó la densidad óptica en 30 minutos utilizando un
conjunto de lectura de microplacas a 595 ó 450 nm.
Los resultados de densidad óptica (media de 3
ensayos independientes) se dan en la figura 1C. Demuestran un nivel
similar de NGF en todas las líneas de células de cáncer de mama
ensayadas.
Para ello, se co-cultivaron
células que se desarrollan en presencia de NGF, a saber células
PC12, con células de cáncer de mama MCF-7, tal como
se describen en el punto 1.1 anteriormente, o bien con células NBEC,
tal como se han descrito en el punto 1.1 anteriormente, como
control.
Las células PC12 se cultivaron previamente a
37ºC en una atmósfera al 5% de CO_{2}, en medio mínimo esencial
modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 3 g/l de bicarbonato
sódico, 4 mM de L-glutamina, 10% de suero fetal de
ternero, 5% de suero de caballo y 100 unidades/ml de
penicilina/estreptomicina.
El co-cultivo se realizó con
placas de policarbonato tratado con el cultivo tisular Transwell®
(12 mm de diámetro y 12 \mum de tamaño de poro). Se observó un
periodo de equilibrio inicial añadiendo los medios al pocillo
central de la placa y después al inserto del Transwell®, operación
seguida de una incubación a 37ºC durante 3 h.
Las células PC12 se sembraron en placas de 12
pocillos recubiertas con colágeno durante 24 h para asegurar una
fijación correcta a las placas de cultivo. Se sembraron las células
MCF-7 o NCBE en el interior del inserto del
Transwell®, correspondiente al compartimento superior en el medio
completo durante 24 h.
Después de este periodo se aclaró cada línea
celular tres veces con un medio desprovisto de suero y se incubaron
en un medio de retirada. En los experimentos de control, el medio se
suplementó con medio que contenía NGF o un inhibidor de la
actividad tirosina quinasa trk
(K-252-a, Calbiochem, Francia) o
anticuerpo monoclonal de ratón
anti-\beta-NGF humano
(MAB-256, R&D Systems).
El co-cultivo se realizó durante
48 h. Después de este periodo, las células PC12 se fijaron con
metanol frío (-20ºC) durante 20 minutos y después se lavaron con
una solución salina tamponada con fosfato (PBS) antes del
ensamblaje con los cubreobjetos y Glycergel (Dako, Francia).
Se contó el porcentaje de células portadoras de
neuritos definidas como células con una o más prolongaciones
neuríticas que tienen al menos dos veces la longitud del cuerpo de
la célula. También se tomaron fotomicrografías con ayuda de un
microscopio de contraste de fases suplementado con una cámara
digital óptica Olympus.
Los resultados se dan en la figura 2, en la
que:
- la figura 2A muestra el esquema experimental
donde (2) corresponde a las células cancerosas o no cancerosas y
(1) corresponde a las células PC12,
- la figura 2B proporciona fotografías
donde:
- \circ
- las fotos 2 y 3 muestran el cultivo de las células PC12 como control, respectivamente sin NGF y en presencia de NGF donde se observa entonces un desarrollo de neuritos debido a la diferenciación,
- \circ
- la foto 4, que se refiere al co-cultivo de células MCF-7 y PC12, muestra que las células PC12 se diferenciaron después de 48 h de cultivo,
- \circ
- la foto 5, que se refiere al co-cultivo de células MCF-7 y PC12 en presencia del anticuerpo anti-NGF, muestra una inhibición fuerte de la diferenciación de las células PC12 debido al anticuerpo,
- \circ
- la foto 6, que se refiere al co-cultivo de células MCF-7 y PC12 en presencia del inhibidor K-252a, muestra una inhibición fuerte de la diferenciación de las células PC12 debido al inhibidor, y
- \circ
- la foto 7, que se refiere al co-cultivo de células normales NBEC y PC12, demuestra la ausencia de diferenciación de las células PC12.
Inmediatamente después de la operación, las
biopsias del tejido de cáncer de mama humano o de tejido sano no
canceroso (control) se fijaron mediante una solución de formol al
10% durante 24 horas. Después de la deshidratación mediante baños
de alcohol a concentración creciente (del 30 al 100%), las muestras
se incluyeron en parafina. Los cortes se realizaron con ayuda de un
microtomo (corte fino de 5 micrómetros) y después se fijaron en
portaobjetos recubiertos de
3-aminopropiltrietoxisilano (TESPA, Dako
Francia).
Se desparafinaron los portaobjetos sumergiendo
los portaobjetos en baños de acuerdo con el siguiente modo
operatorio:
- -
- 2 baños de tolueno (10 minutos),
- -
- 1 baño de alcohol al 100% (10 minutos),
- -
- 1 baño de alcohol al 95% (10 minutos),
- -
- 1 baño de alcohol al 70% (10 minutos),
- -
- 1 baño de agua (10 minutos).
A continuación, se conservaron los portaobjetos
a +4ºC.
Se aclararon los cortes con
TBS-Tween al 0,1% (TBS: 17,54 g de NaCl, 2,42 g de
Trisbase, csp 2 litros de agua, pH 7,4) durante 10 minutos en
agitación. Se reactivaron los antígenos mediante tampón citrato 0,01
M (1,05 g de ácido cítrico monohidratado, csp 500 ml de agua
destilada, pH 6 (NaOH)) 2 veces durante 5 minutos en un baño maría
a 95ºC. Se procedió a una incubación de los portaobjetos durante 5
minutos en agitación en el 3% de agua oxigenada/TBS. Se saturaron
los portaobjetos durante una hora a temperatura ambiente en TBS/BSA
al 3%.
A continuación se procedió a una incubación de
los portaobjetos durante 2 h a temperatura ambiente en cámara
húmeda con 80 \mul de anticuerpo primario anti-NGF
(Santa Cruz, Tebu Francia) diluido a 1/50 en TBS/BSA al 3%. Se
lavaron 3 veces en TBS/Tween durante 5 minutos con agitación.
A continuación se procedió a una nueva
incubación de los portaobjetos durante 2 h a temperatura ambiente en
cámara húmeda con 80 \mul de anticuerpo secundario de mono
anti-IgG de conejo, habiéndose unido dicho
anticuerpo a la peroxidasa de rábano rusticano (Jackson
Laboratories, US), diluida a 1/100 en TBS/BSA al 3%.
Se lavaron los portaobjetos tres veces en
TBS/Tween durante 5 minutos con agitación, se aclararon tres veces
con PBS durante 5 minutos con agitación, se secaron y después se
incubaron durante 10 minutos con 100 \mul de DAB (sigma fast
3,3-diaminobencidina; 1 pastilla de DAB + 1 pastilla
de urea H2O2 en 1 ml de agua).
Se verificó la tinción al microscopio y se
interrumpió en un baño de PBS. Se realizó una
contra-tinción para visualizar las estructuras
mamarias sumergiendo en hematoxilina de Harris en solución
modificada (Sigma) durante 4 s. Se aclaró en agua básica y después
en un baño de PBS.
Se montó el portaobjetos en glycergel calentado
al baño maría a 50ºC.
Se fotografiaron los portaobjetos por medio de
una lupa binocular (Zeiss).
Las fotos de inmunohistoquímica de los cortes
obtenidos de este modo se representan en la figura 3. Las fotos A y
B se refieren al tejido normal, respectivamente con o sin marcado
con NGF. Las fotos C a F se refieren al tejido canceroso, las fotos
C y E se refieren a los cortes sin marcado con NGF (control
negativo) y las fotos D y F se refieren a los cortes con marcado
con NGF. La barra de calibrado representa 250 micrómetros para las
fotos A, B, E y F o 600 micrómetros para las fotos C y D.
Los resultados muestran claramente que el NGF se
detecta mediante inmunohistoquímica en los portaobjetos de biopsia
en las células epiteliales de cáncer de mama, pero no en las células
epiteliales mamarias normales (células epiteliales marcadas con
anticuerpo anti-NGF, y debido a esto teñidas, en las
glándulas mamarias tumorales en D y F con respecto a C y E y no en
las glándulas mamarias normales en B con respecto a A).
Se despegaron las células MCF-7
raspando el fondo de la placa de cultivo. A continuación se
añadieron 100 \mul de fijador (Coulter) con una incubación de 15
minutos a temperatura ambiente. A continuación se lavaron las
células tres veces con PBS y se centrifugaron a 1900 rpm durante 5
minutos.
Se añadieron 100 \mul de permeabilizante
(Coulter) y después se incubó durante 5 minutos a temperatura
ambiente.
Se añadieron 20 \mul del anticuerpo monoclonal
de ratón anti-NGF no marcado (R&D Systems,
diluido a la 100ª) y después se incubó durante 15 minutos a
temperatura ambiente.
A continuación se lavaron las células tres veces
con PBS y se centrifugaron a 1900 rpm durante 5 minutos.
Se añadieron 20 \mul del 2º anticuerpo
anti-ratón marcado FITC (R&D Systems, diluido a
1/50) y después se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente
y en la oscuridad.
A continuación se lavaron las células tres veces
con PBS y se centrifugaron a 1900 rpm durante 5 minutos.
Las células se resuspendieron en 500 \mul de
PBS y después se realizó la lectura con un citómetro de flujo
(Beckman Coulter® EPICS®).
Los resultados obtenidos muestran que más del
30% de las células de esta línea celular contienen NGF dentro del
citoplasma.
Dicho método es aplicable con células tumorales
aisladas de una muestra biológica.
\vskip1.000000\baselineskip
Se estudiaron el efecto del anticuerpo de
bloqueo MAB-256 (supra) y del inhibidor
K-252a sobre el crecimiento de las células
MCF-7. Para ello, se sembraron las células a razón
de 2 x 10^{4} células/ml en placas de 35 mm en medio completo.
Después de alcanzar el 40% de confluencia, se lavaron las células
dos veces y se dejaron sin nutrientes en un medio desprovisto de
suero que contenía fibronectina (2 \mug/ml) y transferrina (30
\mug/ml) durante 3 h. Una hora después, se sustituyó el medio por
2 ml del mismo medio que contenía el inhibidor
K-252a o el anticuerpo MAB-26 a
diferentes concentraciones para estudiar el efecto del inhibidor
farmacológico o del inhibidor de bloqueo sobre el nivel basal de
crecimiento.
Después de 24, 36, 48 y 72 h de tratamiento, se
determinó el número de células después de la tripsinización del
cultivo en monocapa con una solución de tripsina al 0,25%/EDTA
utilizando un hemocitómetro.
También se utilizó un anticuerpo monoclonal
anti-ratón (A4700, SIGMA), es decir no pertinente,
para determinar la especificidad del anticuerpo de bloqueo.
Los resultados se indican en la figura 4 en la
que:
- la figura 4A muestra que el crecimiento de las
células MCF-7 en medio de base (cuadros) disminuye
en presencia de anticuerpo (triángulos) y de inhibidor (rombos),
- las figuras 4B y 4C muestran que hay un efecto
dependiente de la dosis de anticuerpo y de inhibidor,
respectivamente, sobre el efecto proliferativo de NGF para las
células cancerosas.
El NGF puede utilizarse por lo tanto como una
buena diana terapéutica.
\vskip1.000000\baselineskip
Se estudió el crecimiento de las células de
cáncer de mama MDA-MB.231 de la siguiente
manera:
Se realizó una inyección subcutánea en el
costado de 30 ratones SCID (Severe Combines
Immuno-Deficience) a tiempo 0 (D0) de 3 X
10^{6} células MDA-MB-231
obtenidas de cultivos in vitro, en 50 microlitos de PBS por
ratón. Se mantuvieron los ratones en condiciones de cría
convencionales a temperatura ambiente, con alternancia día/noche y
acceso sin límite a bebida y alimento.
Catorce, 21 y 28 días después de la inyección de
las células, se inyectaron a la mitad de los ratones anticuerpos de
bloqueo anti-NGF humanos (Oncogene Research Product,
VWR Francia) en la periferia del tumor (subcutánea a nivel del
costado a 1 cm del punto de inyección de las células tumorales) a la
concentración de 12,5 microgramos en 50 microlitos de tampón PBS por
ratón.
Se midió el tamaño de los tumores, en los
ratones vivos, tratados o no con el anticuerpo
anti-NGF, con un calibre "pie de rey"
electrónico 21 y 35 días después de la inyección de las células
cancerosas (D21 y D35, respectivamente). El volumen del tumor se
calculó con la siguiente fórmula: 0,5236 x longitud (mm) x anchura
(mm) x (longitud + anchura)/2.
También se midió el peso de los tumores el D35
en estos mismo ratones, después de sacrificar el animal, con ayuda
de una balanza de precisión electrónica.
Finalmente se contó macroscópicamente el número
de metástasis en el hígado.
Los respectivos resultados de las anteriores
mediciones (media) se indican en los gráficos de la figura 5 donde
el histograma rayado corresponde a los ratones no tratados con el
anticuerpo anti-NGF (controles) y el histograma sin
rellenar corresponde a los ratones tratados con dicho
anticuerpo.
Estos gráficos demuestran que los tratamientos
con un anti-NGF conllevan una disminución de la masa
y del volumen tumoral, así como del número de metástasis en el
marco del cáncer de mama.
Claims (16)
1. Procedimiento de diagnóstico in vitro
de cáncer de mama, caracterizado porque consiste en
determinar la presencia de NGF en una muestra biológica obtenida de
un paciente sospechoso de padecer cáncer de mama.
2. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque la presencia de NGF se
demuestra mediante detección directa de NGF en dicha muestra
biológica.
3. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 2, caracterizado porque la detección de NGF se
realiza mediante un ensayo inmunológico o mediante espectrometría de
masas.
4. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 2 ó 3, caracterizado porque dicha muestra
biológica está constituida por fluido biológico o por un tejido
procedente de la biopsia del tumor o de metástasis.
5. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 4, caracterizado porque la muestra biológica
está constituida por un tejido procedente de la biopsia del tumor o
de metástasis del paciente.
6. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 4, caracterizado porque la muestra biológica
está constituida por fluido biológico, preferentemente tratado
previamente para aislar las células tumorales circulantes contenidas
en dicho fluido.
7. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 6, caracterizado porque las células tumorales
circulantes se cultivan a continuación en condiciones tales que
secreten NGF.
8. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 6 ó 7, caracterizado porque las células
tumorales circulantes también se cultivan en condiciones que
permitan el bloqueo de NGF en el interior de dichas células.
9. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque la detección de NGF se
demuestra mediante cultivo, en presencia de dicha muestra
biológica, de células sensibles a NGF.
10. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 9, caracterizado porque dicha muestra
biológica está constituida por una muestra de fluido biológico,
preferentemente tratado previamente para aislar las células
tumorales circulantes contenidas en dicho fluido.
11. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 10, caracterizado porque las células tumorales
circulantes se cultivan a continuación en condiciones tales que
secreten NGF.
12. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque la detección de NGF se
demuestra mediante detección del ARNm de NGF en dicha muestra
biológica.
13. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 12, caracterizado porque dicha muestra
biológica está constituida por una muestra de fluido biológico o
por un tejido procedente de la biopsia del tumor o de metástasis del
paciente.
14. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 13, caracterizado porque la muestra biológica
está constituida por un tejido procedente de la biopsia del tumor o
de metástasis del paciente.
15. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 13, caracterizado porque la muestra biológica
está constituida por fluido biológico, preferentemente tratado
previamente para aislar las células tumorales circulantes contenidas
en dicho fluido.
16. Utilización del procedimiento de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el diagnóstico
precoz, cribado, seguimiento terapéutico, pronóstico y diagnóstico
de recaídas en el marco del cáncer de mama.
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