WO2004071518A1 - 癌治療薬 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to cancer immunotherapy targeting vascular endothelial cells of tumor tissue.
  • Therapies for cancer include surgical therapy, chemotherapy, and radiation therapy. Each has its own characteristics, and the most effective cancer treatment is selected in consideration of their characteristics.
  • Surgery is an effective method for cancers of a certain size or larger, but the invasiveness of surgery is extremely burdensome for patients, and it is difficult to remove sites such as brain tumors and several millimeters. The difficulty of finding such small cancers is the limitation of external therapy.
  • Chemotherapy is mainly performed by injection or oral administration, so that the burden on the patient is light.
  • anticancer drugs are transported via blood, it can be applied to small tumors.
  • anticancer drugs are basically cytotoxins, and their side effects are extremely serious, and sufficient effects are often not obtained due to restrictions on the amount and period of use.
  • Radiation therapy has problems in that it is difficult to selectively irradiate the target site with radiation, and it also affects nearby normal cells.
  • cancer immunotherapy that eliminates cancer by "immunity", which is the system of foreign body elimination inherent in the living body.
  • Early cancer immunotherapy adjuvanted cancer cell fragments and cancer-specific antigens
  • the drug is administered as a cancer vaccine together with drugs and the like to activate cytotoxic T cells (CTLs) and eliminate cancer, but cancer cells themselves are originally their own cells that have changed. Poor antigenicity and little success in cancer immunotherapy.
  • CTLs cytotoxic T cells
  • Dendritic cells are cells that have the strongest antigen-presenting ability in vivo. Therefore, in an ex vivo system, cancer cell fragments and cancer-specific antigens are pulsed into dendritic cells, and the dendritic cells are returned to the living body, whereby the dendritic cells activate CTLs and cancer is immunized by cancer immunity. It is to be eliminated. Cancer immunotherapy using dendritic cells has been reported not only in animal experiments but also in clinical results in humans, and its potential and efficacy are attracting attention as a novel cancer treatment (J. Immunol., 156, p. 2918 (1996), J.
  • An object of the present invention near-Q 0 to provide a new cancer immunotherapy using dendritic cell function
  • the present inventor focused on the fact that tumor tissue has a higher growth rate than normal tissue, and it is essential to supply nutrients and angiogenesis as a pipe for eliminating waste products.
  • dendritic cells are useful as cancer immunotherapy drugs targeting vascular endothelial cells in tumor tissues. They found that cells could be obtained, and completed the present invention.
  • the present invention relates to vascular endothelial cells cultured in a medium containing a cancer cell culture supernatant. It is intended to provide a therapeutic agent for cancer comprising, as an active ingredient, dendritic cells stimulated with a derived antigen.
  • the present invention also provides use of dendritic cells stimulated with vascular endothelial cell-derived antigens cultured in a medium containing a cancer cell culture supernatant for the production of a therapeutic agent for cancer.
  • the present invention provides a method for treating cancer, which comprises administering dendritic cells stimulated with an antigen derived from vascular endothelial cells cultured in a medium containing a culture supernatant of cancer cells. is there.
  • the cancer therapeutic agent of the present invention is a cancer immunotherapy targeting vascular endothelial cells of tumor tissue instead of targeting tumor cells themselves. Therefore, they are superior to the conventional cancer immunotherapy in the following points.
  • FIG. 1 shows the therapeutic effect (lung weight) of dendritic cells stimulated with vascular endothelial cell-derived antigens cultured in a medium containing B16 cancer cell culture supernatant on mouse lung cancer.
  • None is B1 6 alone administration group; None pulsed DC is B16 and nothing pulses to have a I dendritic cells administered group; BAEC pulsed DC are dendritic cells administered group pulsed with BAEC; B1 6 CM -BAEC pulsed DC indicates a group to which B16 and dendritic cells pulsed with BAEC cultured in the culture supernatant of B16 were administered.
  • Dendritic cells which are active ingredients of the therapeutic agent for cancer of the present invention, target vascular endothelial cells of tumor tissue. Therefore, vascular endothelial cells for stimulating dendritic cells are those cultured in a medium containing a cancer cell culture supernatant.
  • the cancer cells used are preferably human cancer cells, but the type of cancer cells is not limited.
  • cancer cells include solid cancer cells such as stomach cancer, liver cancer, colorectal cancer, lung cancer, skin cancer, bladder cancer, child cancer, ovarian cancer, breast cancer, prostate cancer, and brain tumor.
  • the conditions for culturing the cancer cells are not particularly limited, for example, in a medium such as RPMI1640, MEM ⁇ DMEM, Ham F12, M199, or the like. C, 5% C0 2, 9 5% air, have preferably carried out saturated steam conditions.
  • the medium can also be supplemented with antibiotics, sodium bicarbonate, non-essential amino acids, and the like.
  • the culture supernatant of the cancer cells can be collected, for example, by centrifugation at 500 to 150 O rpm for 2 to 10 minutes or filtration with a filter.
  • the species of the vascular endothelial cells is not particularly limited, and vascular endothelial cells of humans, mice, mice and the like are used.
  • vascular endothelial cells of blood vessels such as umbilical vein, umbilical artery, aorta, pulmonary artery, neonatal foreskin, and adult skin are used.
  • the vascular endothelial cells are cultured in a medium containing the cancer cell culture supernatant.
  • the amount of the culture supernatant of cancer cells added to the medium is preferably 10 to 10 Ov / v%, particularly preferably 20 to 10 Ov / v%.
  • the medium for vascular endothelial cell culture is not particularly limited.
  • RPMI1640 M A medium such as EM, DMEM, Ham F12, and M199
  • a vascular endothelial cell growth factor, heparisi, an antibiotic, etc. may be added in addition to the cancer cell culture supernatant.
  • the conditions for culturing vascular endothelial cells are not particularly limited, and the vascular endothelial cells are preferably cultured under conditions of 37 ° C., 5% CO 2 , 95% air and saturated steam for 2 to 4 days.
  • the vascular endothelial cell-derived antigen may be the vascular endothelial cell itself, but may also be a vascular endothelial cell component (for example, total RNA), a vascular endothelial cell lysate or a vascular endothelial cell membrane vesicle.
  • a vascular endothelial cell component for example, total RNA
  • a vascular endothelial cell lysate or a vascular endothelial cell membrane vesicle.
  • the intracellular components, cell framing fluid and membrane vesicles are more preferred because they are easy to prepare and have high stimulation efficiency for dendritic cells.
  • the cell lysate can be obtained, for example, by centrifugation (40 ° C, 10 minutes) at a low speed by repeatedly freezing (160 ° C) and thawing (37 ° C) 4 to 6 times.
  • membrane vesicles for example, 1 0 O mM paraformaldehyde in DMEM, 2 mM Jichiosurei torr, 1 niM CaCl 2, 0. 5 niM MgCl 2 to 3 7 ° C in plus, 5% C0 2, 9 Treat overnight under 5% air and saturated steam conditions, then centrifuge at 150 g for 5 minutes, then prepare the supernatant by centrifugation at 300 ° C for 30 minutes at 4 ° C. be able to.
  • Intracellular components for example, Total RM, can be prepared by a conventional method.
  • dendritic cells it is preferable to use human-derived dendritic cells, in particular, dendritic cells from the patient to be administered, or human-compatible dendritic cells with the patient.
  • Dendritic cells can be obtained by inducing differentiation from bone marrow cells, cord blood-derived cells, peripheral blood mononuclear cells, and the like, for example, by the methods described in Non-Patent Documents 8, 9 and the like.
  • dendritic cells from peripheral blood mononuclear cells, for example, in a medium containing GM-CSF (10-lOOng / mL) and IL-4 (50-500IU / mL) for 5 to 10 days
  • GM-CSF 10-lOOng / mL
  • IL-4 50-500IU / mL
  • cytolysis of dendritic cells and vascular endothelial cells may be presented to dendritic cells by law.
  • the total RNA of vascular endothelial cells may be introduced into dendritic cells to present the antigen.
  • the amount of the antigen to be added is preferably from 0.1 to 100 / zg Zm as protein concentration per 1 ⁇ 10 6 dendritic cells, particularly preferably from 0.1 to 100 ⁇ g / mL.
  • the dendritic cells thus obtained present the vascular endothelial cell-specific antigen of the cancer tissue in vivo, induce cytotoxic T cells (CTL) to the vascular endothelial cells of the tumor tissue, and induce the vascular endothelial cells of the tumor tissue
  • CTL cytotoxic T cells
  • the treatment can be performed under such conditions that the protein of the cancer cells is denatured while leaving the function as a cancer therapeutic drug, such as heat treatment, radiation treatment, or mitomycin C treatment.
  • a cancer therapeutic drug such as heat treatment, radiation treatment, or mitomycin C treatment.
  • the ratio of mitomycin C treatment method for example, dendritic cells were suspended at a density of 1 to 3 X 1 0 7 6 cells / mL, fine ⁇ 1 nil per mitomycin 'C 2 5 ⁇ 5 0 ⁇ g And incubate at 37 ° C for 30-60 minutes.
  • the heat treatment of cells for example, a centrifuge tube containing the cell suspension prepared live cell concentration to 1 X 1 0 7 or ZmL 5 0 ⁇ 6 5. It can be prepared by heating at 20C for 20 minutes.
  • the cancer targeted by the cancer therapeutic agent of the present invention is not particularly limited, but is preferably a solid cancer, for example, stomach cancer, liver cancer, colon cancer, lung cancer, skin cancer, bladder cancer, cervical cancer, ovarian cancer, breast cancer, Prostate cancer, brain tumor and the like.
  • the dosage of the dendritic cells of the present invention varies depending on the age, weight, sex, type of cancer, degree of progression of the cancer, symptoms, etc. of the patient, and cannot be determined unconditionally. It is only necessary to administer the same amount to the patient as to be injected with the liposome.
  • the dendritic cells of the present invention can be used for patients themselves, but due to the development of bone marrow banks and umbilical cord blood banks, they are administered to a large number of MHC-compatible patients of the same type. Examples that can be
  • cancer cell culture supernatant (cancer CM)
  • New medium Human umbilical cord vein endothelial cell culture medium; the following HUVEC medium.
  • CM action vascular endothelial cells were added with membrane vesicle preparation solution (dissolved 10 OmM paraformaldehyde, 2 mM dithiothreitol, ImM CaCl 2 , 0.5 mM MgCl 2 in DMEM medium) at 37 ° C , Processed overnight.
  • the supernatant is then centrifuged at 150 xg for 5 minutes, and then the supernatant is centrifuged at 4 ° C for 30 minutes. After centrifugation at 00 ⁇ g, the precipitate was used as a membrane vesicle of cancer CM vascular endothelial cells and used as an antigen to pulse to dendritic cells.
  • cell lysate obtained by suspending cultured vascular endothelial cells with CM acting on cultured cancer in physiological saline and repeating freeze-thaw four times was also used as an antigen to pulse dendritic cells.
  • Cancer CM Vessel endothelial cell membrane vesicles or cell lysate and lipofectin are mixed (in a quantitative ratio) and the lipid concentration is adjusted to 10%. And left at room temperature for 20 minutes. This was added to a cell suspension of mouse dendritic cell line DC2.4 cells or bone marrow-derived primary cultured dendritic cells (1 ⁇ 10 6 cells / mL), and incubated for 5 hours. After centrifugation and washing with a phosphate buffer, the cells were treated with mitomycin C (50 ⁇ g / mL) at 37 ° C for 30 minutes. The cells were centrifuged twice, washed and washed with a phosphate buffer, and resuspended in a phosphate buffer.
  • mitomycin C 50 ⁇ g / mL
  • B 16 F 10 cells (1 ⁇ 10 6 cells) were injected into the tail vein.
  • the number of lung metastases in the group receiving no dendritic cells was (924, 799, 550), and the number of lung metastases in the group receiving dendritic cells was (184, 414, 0). there were .
  • the dendritic cells of the present invention significantly suppressed lung metastasis of cancer cells, and were useful as cancer therapeutics.
  • Vascular endothelial cells subcultured from the aorta of the rat by the detachment method were used.
  • DMEM fetal serum
  • This vascular endothelial cell was used in the same manner as in Example 1 and a cell lysate was used as an antigen.
  • Example 2 Other operations were performed in the same manner as in Example 1 to culture vascular endothelial cells derived from aortic aorta in a medium containing the culture supernatant of B16 cells, and pulsed dendritic cells with the obtained cell lysate as an antigen. did.
  • the obtained dendritic cells were administered to B57 / BL6 mice in the same manner as in Example 1. Two weeks after the administration of the cancer cells, the lungs were removed and the lung weight was measured. As a result, as shown in Fig.

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Abstract

本発明は、癌細胞培養上清を含有する培地で培養した血管内皮細胞由来の抗原で刺激された樹状細胞を有効成分とする癌治療薬に関する。

Description

明 細 書
癌治療薬 技術分野
本発明は腫瘍組織の血管内皮細胞をターゲットにした癌免疫療法に関する。 背景技術
癌の治療法には外科的療法、 化学療法、 放射線療法などがあり、 それぞれに特 徴を有しており、 それらの特性を考慮して、 最も有効な癌治療法が選択されてい る。 外科療法は一定の大きさ以上の癌に対しては、 有効な方法であるが、 手術と いう侵襲は患者にとって極めて負担が大きく、 また脳腫瘍のように摘出が困難な 部位の場合や、 数ミリといった小さな癌は発見そのものが困難なことなどが、 外 科療法の限界となっている。 化学療法は、 主に注射又は経口投与という方法によ るため、 方法としては患者への負担が軽く、 また血液を介して、 抗癌剤が運搬さ れるため、 小さな腫瘍への適応も可能である。 しかしながら、 抗癌剤は基本的に は細胞毒であり、 その副作用は極めて重篤であり、 使用量、 使用期間の制限によ つて充分な効果が得られないことが多い。 放射線療法は目的とする部位に選択的 に放射線を当てることが困難であり、 また近傍の正常細胞にも影響を与えるとレ、 う問題点を有している。
前述のとおり、 これらの治療法は一長一短であることから、 多くの場合、 単独 で行われるものではく、 有効に併用され、 癌治療が行われている。 しかしながら 、 依然、 癌は我が国の死因の第一位であり、 新規な癌治療法の確立は急務な課題 である。
さて、 これら 3つの癌治療法とは異なり、 4つめの方法として、 生体が本来有 している異物排除のシステムである 「免疫」 によって、 癌を排除しょうという 「 癌免疫療法」 がある。 初期の癌免疫療法は癌細胞断片や癌特異抗原をアジュバン ドなどとともに癌ワクチンとして投与し、 細胞傷害性 T細胞 （CTL) を活性化し、 癌を排除しょうというものであるが、 癌細胞自身は、 本来、 自己の細胞が変化し たものであり、 極めて抗原性が乏しく、 癌免疫療法の成果はほとんど得られてい なかった。
近年、 樹状細胞の役割が明らかとなり、 新規な癌免疫療法のブレークスルーと して注目されている。 榭状細胞は、 生体内において最も強力な抗原提示能を有す る細胞である。そこで ex vivoの系で、癌細胞断片や癌特異抗原を樹状細胞にパル スし、 本樹状細胞を生体內に戻すことによって、樹状細胞が CTLを活性化し、癌免 疫により癌が排除されるというものである。 樹状細胞を用いた癌免疫療法は動物 実験にとどまらず、 ヒ トにおける臨床結果でも成功例が報告されており、 その可 能性と有効性は新規癌治療法として注目されている （J. Immunol. , 156， p. 2918 (1996)、 J. Exp. Med. , 183, p. 7 (1996)、 Blood, 84, p. 3054 (1994)、 Immunol. , 95， p. 141 (1998)、 J. Exp. Med. , 185, p. 1101 (1997)、 J. Exp. Med.， 187, p. 1 019 (1998)、 Blood, 93, p. 780 (1999)、 Science, 283, p. 1183 (1999)、 J. Exp. M ed， 185, p. 1101 (1997) ) 。 発明の開示
本発明の目的は、 樹状細胞の機能を利用した新たな癌免疫療法を提供すること にあ Q 0
そこで本発明者は、 腫瘍組織は、 正常組織に比べて増殖率が大きく、 栄養の供 給、 及び老廃物の排除のパイプとしての血管新生が不可欠であることに着目し、 まず血管内皮細胞を癌細胞培養上清を含有する培地で培養し、 得られた血管内皮 細胞由来の抗原で樹状細胞を刺激すれば、 腫瘍組織の血管内皮細胞をターゲット にした癌免疫療法薬として有用な樹状細胞が得られることを見出し、 本発明を完 成した。
すなわち、 本発明は、 癌細胞培養上清を含有する培地で培養した血管内皮細胞 由来の抗原で刺激された榭状細胞を有効成分とする癌治療薬を提供するものであ る。
また、 本発明は、 癌細胞培養上清を含有する培地で培養した血管内皮細胞由来 の抗原で刺激された樹状細胞の、 癌治療薬製造のための使用を提供するものであ る。
さらに、 本発明は、 癌細胞培養上清を含有する培地で培養した血管内皮細胞由 来の抗原で刺激された樹状細胞を投与することを特徴とする癌の治療法を提供す るものである。
本発明の癌治療薬は、 腫瘍細胞自体をターゲットとするのではなく、 腫瘍組織 の血管内皮細胞をターゲットとした癌免疫療法である。 従って、 従来の癌免疫療 法に比べて以下の点で優れている。
( 1 ) 腫瘍組織を構成する細胞は癌細胞：血管内皮細胞 = 1 0 0〜 1 0 0 0 ： 1 であり、 これは 1つの血管内皮細胞が 1 0 0〜1 0 0 0個の癌細胞を支えている ことを意味している。 従って 1つの血管内皮細胞の死は 1 0 0〜 1 0 0 0個の癌 細胞の死が予想される。 従って血管内皮細胞をターゲットにした場合、 癌細胞を ターゲットにした場合の 1 0 0〜 1 0 0 0倍効率が良い。
( 2 ) 従来の癌免疫療法では、 原発癌の場合、 肝癌なら肝癌、 肺癌なら肺癌と癌 種によって異なった細胞を免疫しなければ効果が期待できない。 しかし、 血管内 皮細胞をターゲットとした場合、 肝癌であれ肺癌であれ血管内皮細胞を抗原とす るため、 癌細胞の影響を受けた血管内皮細胞という点から、 これらは癌種によら ず共通の性質を有し、 共通の抗原を発現していることから、 いかなる癌種にも有 効である。
( 3 ) 生体内で血管新生が盛んに行われている部位は、 成人において腫瘍組織以 外では創傷治癒部位のみであり、 癌血管内皮細胞をターゲットとした場合、 腫瘍 への選択性が極めて高く、 副作用が少ない。 図面の簡単な説明
図 1は、 B16癌細胞培養上清を含有する培地で培養した血管内皮細胞由来の抗原 で刺激された樹状細胞のマウス肺癌に対する治療効果 （肺重量） を示す図である 。 図中、 Noneは B16のみ投与群を； None pulsed DCは B16及び何もパルスしていな ぃ樹状細胞投与群を； BAEC pulsed DCは BAECをパルスした樹状細胞投与群を ； B1 6 CM- BAEC pulsed DCは B16と、 B16の培養上清で培養した BAECをパルスした樹状細 胞を投与した群を示す。 発明を実施するための最良の形態
本発明の癌治療薬の有効成分である樹状細胞は、 腫瘍組織の血管内皮細胞をタ 一ゲットとする。 そのため、 樹状細胞を刺激するための血管内皮細胞は、 癌細胞 培養上清を含有する培地で培養したものを用いる。
用いる癌細胞は、 ヒ ト癌細胞であるのが好ましいが、 癌細胞の種類は限定され ない。 癌細胞の例としては、 胃癌、 肝臓癌、 大腸癌、 肺癌、 皮膚癌、 膀胱癌、 子 宫潁部癌、 卵巣癌、 乳癌、 前立腺癌、 脳腫瘍などの固形癌の細胞が挙げられる。 癌細胞の培養条件は、 特に制限されず、 例えば RPMI1640、 MEMゝ DMEM、 ハム F12、 M 199等の培地中、 3 7。C、 5 %C02, 9 5 %air、 飽和水蒸気条件下行うのが好まし い。 なお培地には、 抗生物質、 炭酸水素ナトリウム、 非必須アミノ酸等を添加す ることもできる。 癌細胞の培養上清の採取は、 例えば 5 0 0〜 1 5 0 O rpm、 2〜 1 0分間遠心分離や、 フィルターろ過することにより得られる。
血管内皮細胞としては、 種は特に限定されず、 ヒ ト、 ゥシ、 マウスなどの血管内 皮細胞が用いられる。 例えば、 ヒ ト由来であれば、 臍帯静脈、 臍帯動脈、 大動脈、 肺動脈、 新生児包皮、 成人皮膚等の血管の内皮細胞が用いられる。 当該血管内皮 細胞の培養は、 前記癌細胞培養上清を含有する培地で行われる。 ここで、 培地中 への癌細胞培養上清の添加量は、 1 0〜 1 0 O v/v%、 特に 2 0〜 1 0 O v/v%が 好ましい。 血管内皮細胞培養のための培地は特に制限されず、 例えば RPMI1640、 M EM、 DMEM、 ハム F12、 M199等の培地、 さらに癌細胞培養上清以外に血管内皮細胞増 殖因子、 へパリシ、 抗生物質等が添加されていてもよい。 血管内皮細胞の培養条 件は、 特に制限されず、 3 7 °C、 5 %C02, 9 5 %air、 飽和水蒸気条件下で 2〜 4日間行うのが好ましい。
前記血管内皮細胞由来の抗原としては、 当該血管内皮細胞自体でもよいが、 血 管内皮細胞内成分 （例えば Total RNA等） 、血管内皮細胞破砕液又は血管内皮細胞 膜小胞を用いてもよい。 当該細胞内成分、 細胞破枠液や膜小胞は、 調製が容易で あり、 かつ樹状細胞に対する刺激効率が高いのでより好ましい。
細胞破砕液は、 例えば凍結 （一 1 6 0 °C) と融解 （3 7 °C) を 4〜 6回繰り返 したものを低速度で遠心 （4 0 O rpm, 1 0分間） することにより調製することが できる。 また、 膜小胞は、 例えば DMEMに 1 0 O mMパラホルムアルデヒ ド、 2 mM ジチォスレイ トール、 1 niM CaCl2、 0 . 5 niM MgCl2を加えたもので 3 7 °C、 5 %C0 2、 9 5 %air、 飽和水蒸気条件下で一晩処理し、 次に 1 5 0 gで 5分間遠心し、 続 いてその上清を 4 °Cにおいて 3 0分間 3 0 0 0 O gの遠心により調製することが できる。 細胞内成分、 例えば Total RMは常法により調製することができる。
樹状細胞としては、 ヒ ト由来の樹状細胞、 特に投与しょうとする患者自身由来 の樹状細胞又は患者と MH C適合のヒ ト由来の樹状細胞を用いるのが好ましい。 樹状細胞は、 例えば非特許文献 8， 9等に記載の方法により、 骨髄細胞、 臍帯血 由来細胞、 末梢血単核細胞などから分化誘導させることにより得ることができる 。 末梢血単核細胞から樹状細胞を分化誘導するには、 例えば GM - CSF (10-lOOng/m L) 、 IL-4 (50-500IU/mL) を加えた培地で、 5〜 1 0日間培養するのが好ましい 樹状細胞を前記血管内皮細胞由来の抗原で刺激するには、 例えば樹状細胞の懸 濁液に当該内皮血管細胞由来抗原を添加し、 4〜2 4時間インキュベートするこ とにより行われる。 また抗原刺激がより効率的に行われるよう、 カチォニックリ ポソ一ム等を併用することが好ましい。 さらに樹状細胞と血管内皮細胞の細胞融 合法によって、 樹状細胞に血管内皮細胞抗原を提示させても構わない。 また、 血 管内皮細胞の Total RNAを榭状細胞に導入させ、抗原を提示させてもよい。 当該抗 原の添加量は、 樹状細胞 1 X 1 0 6個あたり蛋白濃度として 0 . 0 1〜1 0 0 /z g Zmレ 特に 0 . 1〜； 1 0 0 μ g/mLが好ましい。
かくして得られた樹状細胞は、 生体内で癌組織の血管内皮細胞特異抗原を提示 し、 腫瘍組織血管内皮細胞への細胞障害性 T細胞 （CTL) が誘導され、 腫瘍組織の 血管内皮細胞が攻撃され、 腫瘍組織内の血管が破綻し、 腫瘍はその栄養供給路を 絶たれ、 腫瘍が退縮することから、 癌治療薬として有用である。
得られた樹状細胞を含む細胞懸濁液は、 ヒ トに癌治療薬として投与することか ら、 細胞増殖性を無く しておくのが好ましい。 より安全に利用するため加熱処理 、 放射線処理、 あるいはマイ トマイシン C処理など、 癌治療薬としての機能を残 しつつ、 癌細胞のタンパク質が変性する程度の条件下で処理をすることができる 。 例えば、 X線照射を利用する場合、 X線照射器の管球の下に榭状細胞を含むフ ラスコを置き、総放射線量 1 0 0 0〜3 3 0 O Radで照射する。マイ トマイシン C 処理法は、 例えば、 樹状細胞を 1〜3 X 1 0 7個細胞/ mLの密度で懸濁し、 細胞浮 遊液 1 niLあたりマイ トマイシン' C 2 5〜 5 0 μ gの比で添加して、 3 7 °C、 3 0— 6 0分間保温処理する。 熱による細胞処理方法は、 例えば、 生細胞濃度を 1 X 1 0 7個 ZmLに調製した細胞懸濁液を入れた遠心管を 5 0〜 6 5。Cで 2 0分間加熱 処理を行うことで調製しうる。
本発明の癌治療薬の対象となる癌は、 特に制限されないが固形癌が好ましく、 例えば胃癌、 肝臓癌、 大腸癌、 肺癌、 皮膚癌、 膀胱癌、 子宮頸部癌、 卵巣癌、 乳 癌、 前立腺癌、 脳腫瘍等が挙げられる。 本発明の榭状細胞の投与量は、 患者の年 齢、 体重、 性別、 癌の種類及び癌の進行度、 症状等により異なり、 一概に決定で きないが、 現在行われている細胞ワクチン療法で注入されるのと同程度の量が患 者に投与されればよい。 本発明の榭状細胞は、 患者本人に使用することもできる が、 骨髄バンク、 臍帯血バンクの発達により、 MHC適合の同種の多数の患者に投与 することができる 実施例
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、 本発明は何らこれに限 定されるものではない。
実施例 1
A. 方法
( 1 ) 癌細胞培養上清 （癌 CM) の調製
マウス黒色腫 B 1 6細胞を RPMI1640培地中、 3 7°C、 5 %C02, 9 5 %air、 飽 和水蒸気条件でサブコンフルェント状態まで培養した。 新しい培地 （ヒ ト臍帯静 脈血管内皮細胞培養用の培地；以下 HUVE C培地。 組成は、 Mediuml99:RPMI16 40= 1 ： 1に混合し、 1 5 %ゥシ胎児血清、 血管内皮細胞増殖因子（2 0 / g/mL) 、 へパリン ( 2 5 μ g/mL) 、 抗生物質を添加したもの) に交換した。 4 8時間後 、 培地を回収し、 1 0 0 0 rpm、 5分間遠心し、 上清を 0. 2 2 μηιのフィルター にてろ過した。 これと等量の新鮮な H U VE C培地とを混合したものを癌細胞の 馴らし培地 （癌 CM) として使用した。
(2) 癌 CM作用血管内皮細胞の調製
上記の HUVE C培地中にヒ ト臍帯静脈血管内皮細胞を 2 5 0 0個 /cm2の濃 度で播種、 3 7°C、 5 %C02, 9 5 %air、 飽和水蒸気条件で、 培養した。 翌日、 癌 CMに培地を交換した。 3 7。C、 5 %C02, 9 5 %air、 飽和水蒸気条件で 4 8 時間培養したものを、 癌 CM作用血管内皮細胞とした。
(3) 榭状細胞への抗原パルス
培養癌 CM作用血管内皮細胞に膜小胞調製液 （DMEM培地に 1 0 OmMパラホルム アルデヒ ド、 2mM ジチオスレィ トール， ImM CaCl2, 0. 5 mM MgCl2を溶解） を添 加し、 3 7°C、 一夜処理した。
次に上清を 1 5 0 X gで 5分間、 遠心し、 続いて上清を 4°C、 3 0分間 3 0 0 00 X gの遠心し、 その沈殿を癌 CM血管内皮細胞の膜小胞とし、 樹状細胞へパ ルスする抗原とした。
また培養癌 CM作用血管内皮細胞を生理食塩水に懸濁し、 凍結融解を 4回繰り 返した細胞破砕液も樹状細胞へパルスする抗原とした。
癌 CM血管内皮細胞の膜小胞又は細胞破碎液とリポフエクチンとを （量比） 混 合し、脂質濃度として 1 0
Figure imgf000009_0001
るように調製し、 20分間室温で放置した 。 これをマウス樹状細胞株 DC 2. 4細胞又は骨髄由来初代培養樹状細胞の細胞 懸濁液 （1 X 1 06個/ mL) に加え、 5時間ィンキュベートした。 リン酸緩衝液で 遠心、 洗浄後、 マイ トマイシン C ( 50 μ g/mL) で 37°C、 30分間処理した。 リン酸緩衝液で 2回遠心、 洗浄洗し、 リン酸緩衝液に再懸濁した。
(4) 樹状細胞の投与
上記方法によつて調製した D C 2. 4細胞又は初代培養樹状細胞 （1 X 1 05 c ells) を B 57/B L 6マウスに皮下又は皮内投与した。
(5) 癌細胞の投与
DC 2. 4細胞又は初代培養樹状細胞投与の一週間後、 B 1 6 F 1 0細胞 （ 1 X 106 cells) を尾静脈内注射した。
(6) 肺転移数の評価
B 1 6 F 1 0細胞投与一週間後、 肺を摘出し、 実体顕微鏡により肺に転移した コロニー数を計測した。
B. 結果
各 3例の榭状細胞を投与していない群の肺転移数は （924， 799, 5 50 ) であり、 樹状細胞を投与した群の肺転移数は （1 84， 414, 0) であった 。 この結果、 本発明の樹状細胞は、 癌細胞の肺転移を有意に抑制し、 癌治療薬と して有用であることが判明した。
実施例 2
A. 方法 ゥシ大動脈より剥離法により継代培養した血管内皮細胞 (BAEC)を用いた。 血管 内皮細胞の培養は、 DMEMに 1 0 %ゥシ胎児血清を添加したものを培地とした。 こ の血管内皮細胞を実施例 1と同様にして細胞破砕液を抗原とした。
その他の操作は実施例 1と同様にして、 B16細胞の培養上清を含有する培地でゥ シ大動脈由来血管内皮細胞を培養し、 得られた細胞の破砕液を抗原として、 樹状 細胞へパルスした。得られた榭状細胞を実施例 1と同様にして B57/BL6マウスに投 与した。 癌細胞投与 2週間後、 肺を摘出し、 肺重量を測定した。 その結果、 図 1に示すように None群 （B16のみ投与） 、 None pulsed DC群 （B16 及ぴ何もパルスしていない樹状細胞を投与） 及び BAEC pulsed DC群 （B16と、 BAE Cをパルスした樹状細胞を投与） は、 肺の大部分が B16で黒色になっており、 肺重 量も増加していた。 これに対し、 B16CM - BAEC pulsed DC群 （B16と、 B16の培養上 清で培養した BAECをパルスした樹状細胞を投与） は黒色部がわずかであり、 肺重 量の増加も抑制されていた。

Claims

請求の範囲
1 . 癌細胞培養上清を含有する培地で培養した血管内皮細胞由来の抗原で刺激 された樹状細胞を有効成分とする癌治療薬。
2 . 血管内皮細胞由来の抗原が、 血管内皮細胞、 その細胞内成分、 その細胞破 砕液又はその細胞膜小胞である請求項 1記載の癌治療薬。
3 . 癌細胞培養上清を含有する培地で培養した血管内皮細胞由来の抗原で刺激 された樹状細胞の癌治療薬製造のための使用。
4 . 血管内皮細胞由来の抗原が、 血管内皮細胞、 その細胞内成分、 その細胞破 砕液又はその細胞小胞である請求項 3記載の使用。
5 . 癌細胞培養上清を含有する培地で培養した血管内皮細胞由来の抗原で刺激 された樹状細胞を投与することを特徴とする癌の治療法。
6 . 血管内皮細胞由来の抗原が、 血管内皮細胞、 その細胞内成分、 その細胞破 碎液又はその細胞小胞である請求項 5記載の治療法。
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