WO2004106519A2 - Mrp8/mrp14 inhibitoren und ihre verwendung zur prävention und/oder behandlung von hypertrophen narben und keloiden - Google Patents

Mrp8/mrp14 inhibitoren und ihre verwendung zur prävention und/oder behandlung von hypertrophen narben und keloiden Download PDF

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mrp
sirnas
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Definitions

  • Mrp8 / Mrpl4 inhibitors and their use for the prevention and / or treatment of hypertrophic scars and keloids
  • the invention relates to the use of Mrp8 / Mrpl4 inhibitors for the manufacture of a medicament for the prevention and / or treatment of hypertrophic scars and keloids.
  • the invention further relates to novel Mrp8 or Mrpl4 inhibitors.
  • Scars always form after skin injuries after healing is complete. After the re-epithelization of injured skin is complete, the extracellular matrix, in particular collagens, is reorganized. Ideally, a flat scar is created that cannot be recognized macroscopically as such. In some cases, however, there is an excessive formation of the extracellular matrix in the Dennis, so that the excessive scar formation creates a visually unattractive, raised and irregularly shaped hypertrophic scar. These scars are not only a cosmetic problem but are also characterized by the lack of skin attachments, such as hair follicles, sebaceous glands, and poor mechanical properties, so that great problems for the patient arise when subjected to thermal or mechanical stress. Furthermore, keloids can arise; i.e. Scar growths that even grow into the healthy skin tissue, which creates a constantly growing scar.
  • Hypertrophic scars and keloids are characterized by an aberrant production of extracellular matrix components in the Dennis, which leads to a thickened Dennis.
  • the fibroblasts that lie in the epidermis play a crucial role in this.
  • the keratinocytes of the overlying epidermis have a significant influence on the fibroblasts during the formation of scars.
  • keratinocytes isolated from keloids when cocultivated with fibroblasts, stimulate them to produce more liferate and secrete collagen, similar to the known behavior of fibroblasts from keloids.
  • Incorrectly regulated keratinocytes in fresh scar tissue are therefore responsible for the excessive production of collagens and glycoproteins in the underlying dermal layer.
  • Classical methods include the surgical removal of scars, whereby a new formation of the hypertrophic scar is frequently observed, as well as treatment with silicone gel bandages, treatment with pressure bandages, treatment with corticosteroids (e.g. triamcinolone acetonide), radiation with lasers or CO and tissue cryotherapy.
  • silicone gel bandages the effect is probably less based on the silicone itself, but on the hydrating and final effect of the bandage.
  • the intralesional lesion of corticosteroids leads to a reduction in collagen synthesis, but severe side effects such as skin atrophy, hypopigmentation or ulcers are observed with long-term treatment.
  • attempts are also made to inject collagen or hyaluronic acid into the scar tissue in order to optically achieve a flatter skin surface.
  • the object of the present invention is therefore to provide improved agents for the prevention and / or treatment of hypertrophic scars and / or keloids.
  • the object is achieved by using at least one Mrp8 and / or Mrpl4 inhibitor for the manufacture of a medicament for the prevention and / or treatment of hypertrophic scars and / or keloids.
  • Mrp8 and / or Mrpl4 inhibitors in particular siRNA molecules directed against Mrp8 and / or Mrpl4, are suitable for the prevention and / or treatment of hypertrophic scars and keloids.
  • Mrp8 / Mrpl4 are expressed specifically in aberrant hypertrophic scars and keloids, but not in normal scars, the overexpression being found specifically in the suprabasal keratinocytes of the diseased tissue.
  • siRNA molecules which are directed against Mrp8 and Mr7 or Mrpl4 a significant inhibition of the proliferation of keratinocytes can be achieved in vitro. Since, as stated above, these keratinocytes play a crucial role in the formation of hypertrophic scars and keloids, the present invention thus provides effective means for the prevention and / or treatment of hypertrophic scars and kelodids.
  • Mrp8 and Mrpl4 are proteins of the SlOO family of proteins which have been known for a long time and which together can form a non-covalent heterodimer Mrp8 / 14.
  • the expression of the proteins is greatly increased in a number of diseases, but decreased in others.
  • the expression in wounds is either increased or decreased (WO 92/088181, EP 1114862).
  • an inhibitor is defined in that it is able to inhibit the function of MRP8 and / or MRP14 in the organism and can therefore be used therapeutically. This can be done by the inhibitor inhibiting the function of the molecule, for example by attachment to the protein, or by the expression of the protein being inhibited.
  • assays are preferably used to determine whether a substance is an inhibitor in the sense of the present invention, in which the inhibition of Mrp8 and / or Mrp 14 expression or Mrp8 and / or Mrpl4 activity is measured.
  • the inhibition of expression can be investigated, for example, in vitro (example 3), in vivo or in cell lysates.
  • the differences in expression are detected at the level of the mRNA or proteins, in particular at the level of the proteins. For example, how shown in Example 3, cell lines, in particular keratinocyte cell lines, which are transiently or stably overexpressing Mrp8 and Mrpl4 in order to be able to quantitatively determine the inhibition of expression after administration of an inhibitor.
  • Mrp8 or Mrp 14 can be detected using suitable antibodies, each of which specifically recognizes Mrp8 or Mrpl4. Suitable detection methods are, for example, Western blot analysis or immunolocalization.
  • Such an assay for determining the effect of an inhibitor on protein expression can consist, for example, of the following steps:
  • Mrp8 and / or Mrp 14 protein compared to control cells demonstrates the effect as an inhibitor.
  • the amount of a Mrp8 and / or Mrp 14 mRNA can also be determined in order to determine the inhibitory effect:
  • Mrp8 and / or Mrpl4 mRNA compared to control cells demonstrates the effect as an inhibitor.
  • Suitable detection methods are for example PCR-based methods such as RTPCR or in situ hybridization (Current Protocols, John Wiley & Son, Inc., New York (2003)).
  • the inhibitory effect of an inhibitor to be tested can also be demonstrated in vivo.
  • the influence of an inhibitor to be tested on Mrp8 and / or Mrp 14 expression in a specific tissue can be tested in the animal model.
  • a substance to be tested can be applied to a tissue, in particular the skin of an animal; the treated sample is then removed, the amount of Mrp8 and / or Mrp 14 protein or mRNA determined as described above and compared with the amount of Mrp8 and / or Mrp 14 protein or mRNA in untreated tissue.
  • the untreated tissue can come from the same animal or from another animal.
  • a reduced amount of Mrp8 and / or Mrp 14 protein or mRNA compared to control cells demonstrates the effect as an inhibitor.
  • the samples can be taken, for example, by taking biopsies, in particular the skin, or by taking body fluids, for example blood.
  • hypertrophic scars denotes a clinical picture in which, after wound healing has ended, there is an increased production of extracellular matrix components in the Dennis, as a result of which the Dennis is thickened.
  • keloid denotes a clinical picture in which scar growths proliferate in the healthy skin tissue and thus form a scar that proliferates beyond the limits of the location of the original dream or the wound.
  • the inhibitor is an inhibitor of human Mrp8 and / or human Mrp 14.
  • the invention also includes that it is an inhibitor against Mrp8 and / or Mrp 14 from other species, for example monkey, Pig, beef, horse, rat or mouse.
  • only one inhibitor is used.
  • an inhibitor which is directed either against Mrp8 or Mrp 14 already has the same effect as a combination of two inhibitors which are directed against Mrp8 and Mrp 14.
  • full therapeutic success can be achieved simply by administering an inhibitor.
  • the inhibitor is selected from the group consisting of nucleic acids, antibodies, other natural or synthetic proteins and peptides which, for example, bring about increased degradation or sequestration of Mrp8 and / or Mrp 14, molecules with low molecular weight (LMWs) and Mrp8 / Mrpl4 receptor antagonists.
  • LMWs low molecular weight
  • Low molecular weight molecules are molecules which are not proteins, peptides, antibodies or nucleic acids and which have a molecular weight of less than about 5000 Da, preferably less than 2000 Da, in particular less than 1000 Da, most preferably less than 500 Da.
  • Such inhibitors can be identified, in particular, in the context of high-through put methods based on molecular banks. Such methods are known to the person skilled in the art.
  • the inhibitor is an antibody.
  • This antibody is either polyclonal or monoclonal, the antibody is preferably a monoclonal antibody.
  • the term “antibody” also means genetically engineered and possibly modified antibodies or antigen-binding parts thereof, such as, for example, chimeric antibodies, humanized antibodies, multifunctional antibodies, bi- or oligo-specific antibodies, single-stranded antibodies, F (ab) - or F (ab) 2-fragments (see, for example, EP- Bl-368684, US 4,816,567, US 4,816,397, WO 88/01649, WO 93/06213, WO 98/24884).
  • the inhibitor is a nucleic acid, preferably with a maximum length of approximately 200 nucleotides.
  • these nucleic acids bind to Mrp8 and / or Mrp 14 mRNA or DNA, in particular genomic DNA, particularly preferably to mRNA.
  • nucleic acids with a length of a single strand of at most 100 nucleic acids, preferably at most 50 nucleic acids, particularly preferably at most 30 nucleic acids.
  • the nucleic acids inhibit the expression and / or activity of Mrp8 and / or Mrpl4. They particularly preferably inhibit the expression of Mrp8 and / or Mrp 14 polypeptides.
  • nucleic acids used in the context of the use according to the invention can be modified.
  • the nuclear acid binds to a human Mrp8 or Mrpl4 mRNA according to SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or variants thereof, e.g. allelic variants, sequences with polymorphisms to the sequences SEQ ID No. 1 and 2 or splice variants.
  • the nucleic acid is an antisense molecule or an siRNA, preferably an siRNA.
  • siRNAs small interfering RNAs
  • small dsRNA molecules cause a sequence-specific, so-called knock-down of gene expression, in contrast to long dsRNA molecules, which cause non-specific inhibition of translation in mammalian cells (Elbashir et al., 2001, Genes Dev, 15: 188-200 ; Vattem et al., 2001; Eur. J. Biochem., 268: 3674-84).
  • RNAi sequence-specific RNA interference
  • siRNAs are double-stranded or partially double-stranded RNAs that are capable of target-specific interference.
  • An siRNA molecule usually consists of two RNA single strands, but it is also possible to use siRNAs which consist of an RNA strand and are designed in such a way that they form a double strand with a hairpin structure.
  • the “sense strand” of the siRNA is to be understood as the RNA strand of an siRNA that is identical or over a range of at least approximately 16, in particular at least approximately 17, preferably at least approximately 18, most preferably at least approximately 19 nucleotides is at least about 90% identical to the target sequence, preferably it is identical.
  • the "antisense strand" of the siRNA is then the complementary strand.
  • a target is understood to mean a nucleic acid whose expression is to be modulated at the protein and / or mRNA level, preferably at the protein level.
  • a target sequence in the sense of the present invention is the sequence of that strand of a target which is complementary to the strand which is used as a template in the transcription; ie the target sequence is the sense strand of the target.
  • Targets of the lying invention are nucleic acids coding for Mrp8 and Mrpl4 proteins.
  • the “basic sequence of the siRNA molecules” is understood to mean that part of the sense strand of an siRNA which is double-stranded.
  • Base target sequence is to be understood as a part of a target sequence with a length X which is identical to the base sequence of the siRNA molecules in the region of the nucleotides 3-X or is at least 90% identical, preferably identical.
  • siRNA interference is achieved in that the antisense strand of the siRNA is complementary to part of the target sequence or at least approximately 90% complementary, with complementarity being preferred.
  • the antisense strand of the siRNA is in a range of at least 16 to 23 amino acids, preferably 17 to 22, in particular 18 to 21, particularly preferably 19 to 20, most preferably 19 nucleic acids complementary to at least one target sequence according to the invention 90% complementary, preferably complementary.
  • the siRNA is double-stranded in a range from approximately 16 to 23 amino acids, preferably 17 to 22, in particular 18 to 21, particularly preferably 19 to 20, most preferably 19.
  • the double-stranded part is preferably that part of the siRNA which, as defined above, is complementary to the target sequence.
  • the siRNA forms a double strand without a single strand overhang (“blunt end”).
  • the siRNA at the 3 ′ end of the sense or antisense strand has, independently of one another, single strand overhangs of at least 1, 2, 3, 4, 5 or 6 nucleic acids in length.
  • the number of overhanging nucleic acids at the sense and antisense 3 'end is preferably identical.
  • the length of the single strand overhangs at the 3' end of the sense or antisense is -Strands 0 to 5.
  • the length of the single strand overhangs at the 3 'end of the sense or antisense strand is 0 or 2, in particular equal to 2.
  • siRNA molecules with a GC content of about 20-80%, especially about 30-70%, especially of about 50% is preferred, and the selection of those siRNAs is preferred in which the target sequence in front of the region (ie 5 'thereof) is at least approximately 90% identical, preferably identical, to the sense strand of the siRNA, 1, in particular 2 Adenosine carries.
  • siRNAs which are composed of 21 nucleotide long RNA strands which are paired such that 1-3 nucleotide long overhangs, in particular 2 nucleotide long 3 'overhangs, are present at both ends of the dsRNA.
  • siRNAs which are each composed of 21 nucleotide long RNAs and are paired such that 2 nucleotide long 3 'overhangs, namely dTdT overhangs, are present at both ends of the dsRNA were successfully used in Examples 1 and 2.
  • only one siRNA is used in the context of the use according to the invention which is directed either against Mrp8 or Mr ⁇ l4.
  • the administration of an siRNA is sufficient to modulate both the expression of Mrp8 and that of Mrp 14.
  • a complete therapeutic success can thus be achieved by an siRNA. This solves the problem of the unknown role of Mrp8 and Mrp 14, bypassed the heterogeneous binding partner and the unclear intra- or extracellular importance of the two proteins.
  • SiRNAs used according to the invention can be derived from any region of a Mrp8 or Mrp 14 mRNA sequence, in particular from human Mrp8 and Mrpl4 mRNA sequences, most preferably from sequences according to SEQ ID No. 1 or SEQ ID No: 2.
  • siRNAs used according to the invention are characterized in that the sense strand comprises the sequence of one of the sequences shown in SEQ ID No: 3 to 946.
  • siRNAs used according to the invention are characterized in that the double-stranded portion of the sense strand has the sequence of one of the sequences shown in SEQ ID No: 3 to 946.
  • siRNAs are preferred in which both strands of the siRNAs contain Watson-Crick base pairings over a range of 19 nucleotides and the antisense strand is 100% complementary to a target sequence and both strands at the 3 ′ end have overhangs of length 0 -5 nucleotides, preferably 1-3 nucleotides, most preferably 2 nucleotides.
  • an siRNA used according to the invention is characterized in that the section of the Mrp8 or Mrp 14 target sequence which is identical or approximately 90% identical to the sense strand of the siRNA is on the first nucleic acid before the first nucleic acid of the sense Strands of siRNA (corresponds to position -1) has an adenosine; particularly preferably has two adenosines on the first two nucleic acids before the first nucleic acid of the sense strand of the siRNA (corresponds to positions -2 and -1).
  • siRNAs in the sense strand that are listed in SEQ ID No. Contained 164, 202 and 238 sequences were successfully used to inhibit Mrp8 expression and / or to inhibit keratinocytes (Examples 1, 2).
  • the siRNA is therefore characterized in that the sense strand contains the sequence of one of SEQ ID No: 164, 202, 238.
  • siRNAs which contain one of the sequences shown in SEQ ID No: 548, 649, 712 in the sense strand have been successfully used to inhibit Mrpl4 expression and / or to inhibit keratinocytes (Examples 1, 2).
  • the siRNA is therefore characterized in that the sense strand contains the sequence of one of SEQ ID No: 548, 649, 712.
  • siRNAs that were used in Examples 1 and 2 are characterized in that the length of the single strand is 21 nucleotides, the RNA single strands at the 3 ′ end have 2-nucleotide overhangs, namely dTdT overhangs, and in the region of the double strand Watson-Crick bonds are only 19 nucleotides in length.
  • an siRNA used according to the invention is therefore characterized in that the sense and antisense strands are complementary over a range of 19 nucleotides and thus form a double strand of 19 nucleotides in length.
  • the siRNA is characterized in that the siRNA at the 3 'end has single-strand overhangs of 2 nucleotides in length, for example with the sequence dTdT.
  • the nucleic acid used according to the invention is an antisense molecule.
  • Antisense molecules are usually single-stranded DNA molecules which are complementary to the sense strand of a gene and cause a "knock-down" in the expression of the desired gene.
  • the mechanisms which play a role here include the inhibition of translation, but mainly that Deactivation of the mRNA by causing the endonuclease RNAse H to degrade the mRNA after binding of the antisense molecule to the target mRNA.
  • Effective antisense molecules can be directed against any part of a target sequence.
  • An antisense molecule preferably has a maximum length of approximately 30 nucleotides, preferably approximately 18 and 26 nucleotides.
  • an antisense molecule used according to the invention is characterized in that the nucleic acid has the complementary sequence of one of the sequences shown in SEQ ID No. SEQ ID No: 3 to 946 shown sequences or parts thereof or is a DNA or DNA / RNA hybrid analogue thereof.
  • siRNA or antisense molecules can be produced by methods known to the person skilled in the art.
  • RNA interference in mammalian cells can be controlled by the expression of Pol II and Pol III promoters, such as CMV, HI and U6, stand.
  • the expression cassettes can be constructed in such a way that a single siRNA molecule with an inverted hairpin structure is formed, or the two strands of the siRNA can be expressed separately. are expressed, followed by annealing the two strands.
  • the siRNAs can be used directly as a therapeutic agent or used in gene therapy-acceptable carrier systems.
  • gene therapy-acceptable carrier systems which allow stable expression of the siRNAs in cells are, for example, plasmids and viral expression systems, for example adenoviruses and lentiviruses.
  • siRNAs either directly or as an expression system expressing an siRNA according to the invention can be carried out by formulation, for example, together with suitable cationic lipids, such as, for example, Cytofectin TM, AdVectin TM or Oligofectamine TM.
  • suitable cationic lipids such as, for example, Cytofectin TM, AdVectin TM or Oligofectamine TM.
  • the substances can also be injected, for example intravenously or infradermally.
  • Intravenous application of siRNA expression systems have already been successfully tested in animal models (Xia et al., 2002, Nature Biotech., 20: 1006-10010).
  • nucleic acids by lonophoresis or electroporation.
  • Local administration of the agent according to the invention is preferred in order to avoid side effects. Topical or intradermal application is therefore preferred.
  • the inhibitors can be administered as such, or preferably in combination with at least one suitable auxiliary or additive, e.g. with one or more suitable adjuvants and / or one or more pharmaceutically active and / or compatible carriers, diluents, fillers, binders, etc.
  • suitable auxiliary or additive e.g. with one or more suitable adjuvants and / or one or more pharmaceutically active and / or compatible carriers, diluents, fillers, binders, etc.
  • the auxiliary or additive is preferably hydrophobic and is preferably selected from the group comprising wax, oleyl alcohol, propylene glycol monostearate, propylene glycol monopalmitostearate, isopropyl laurate, isopropyl myristate, isopropyl palmitate, isopropyl stearate, ethyl myristate, ethyl, propyl myristate, propyl myristate Vaseline, lanolin alcohol and paraffin oil.
  • the antisense molecules according to the invention can be applied using the same methods as for siRNA molecules.
  • the methods for the topical application of antisense molecules, such as lonophoresis, electroporation, intradermal application and direct topical application are summarized in Wraight and White (Pharmacology & Therapeutics, 2001, 89-104).
  • the siRNA is produced recombinantly by expression of a single nucleic acid molecule, a double-stranded RNA molecule with stem loop initially being produced.
  • the molecule can be used directly as a siRNA molecule.
  • the siRNA is produced by chemical synthesis, for example using protected ribonucleoside phosphoramidites.
  • siRNA molecules can be produced recombinantly by simultaneous expression of both strands in a cell, for example by expression under the control of a Pol III promoter.
  • a Pol III promoter examples are the U6 and the Hl promoter.
  • the antisense molecules and siRNAs have modified nucleic acids, preferably nucleic acids modified with phosphothioate, methylphosphonate or peptide bonds.
  • Suitable modified nucleic acids are summarized in Uhlmann & Peimann (1990; Chem. Ref. 90, 544) (see also Beigelman et al., 1995; Nucleic Acid Research 23: 3989-94; Dudycz 1995, WO 95/11910; Macadam et al , 1998; WO 98/37240; Reese et al. 1997; WO 97/29116).
  • Modified intemucleotide phosphate bridges in a nucleic acid that can be used in one of the uses according to the invention contain, for example, methylphosphonate, phosphophorothioate, phosphoramidate, phosphorodithioate, phosphorus phate ester, while non-phosphate internucleotide analogs contain, for example, siloxane bridges, carbonate bridges, carboxymethyl esters, acetamidate bridges and / or thioether bridges.
  • the inhibitors according to the invention are preferably used in the context of a topical treatment. It is preferred that the inhibitors, preferably the nucleic acids, can penetrate the epidermis.
  • the invention further relates to inhibitors of Mrp8 and / or Mrp 14, which are nucleic acids.
  • the embodiments defined above also apply to this aspect of the invention.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition which contains the nucleic acids according to the invention, preferably in combination with suitable auxiliaries or additives.
  • suitable auxiliaries or additives are defined as above.
  • the invention also relates to a method for the prevention and / or treatment of hypertrophic scars and / or keloids in patients, in which an effective amount of at least one Mrp8 and or Mrpl4 inhibitor is administered.
  • an effective amount of at least one Mrp8 and or Mrpl4 inhibitor is administered.
  • an effective amount means an amount sufficient to achieve a desired physiological result, either in cells treated in vitro or in a subject treated in vivo. More specifically, an effective amount is a pharmaceutically effective amount sufficient to treat hypertrophic scars and / or keloids
  • the effective amount may depend on the particular inhibitor selected, and also depends on a variety of factors and conditions that affect the subject to be treated and the severity of the disease For example, if the inhibitor is administered in vivo, factors such as Age, weight, gender, and general health of the patient, as well as dose response curves and toxicity data obtained in preclinical animal studies are important. The determination of an effective amount for a particular inhibitor is known to the person skilled in the art.
  • the inhibitor is preferably present in a construction of 0.1-50% by weight of the pharmaceutical composition, particularly preferably 1-30%.
  • the inhibitor can be administered once or in repeated doses. Repeated doses are preferred until the hypertrophic scars and / or keloids have disappeared.
  • the present invention thus provides for the first time means with which hypertrophic scars and or keloids can be treated or by means of which these diseases can be prevented.
  • Mrp8 and Mrpl4 are specifically upregulated in hypertrophic scars and keloids, the increased expression in the proliferating, suprabasal keratinocytes being observed.
  • no expression is observed in intact skin and in normal healthy scars, which always occur after a wound.
  • siRNAs which are directed against Mrp8 and / or Mrp 14
  • a locally specific therapy or prevention approach is provided which is limited to proliferating keratinocytes and thus to pathological scarring processes, while the normal scar formation required for the Completion of the normal healing process is necessary, is not affected.
  • Figure 1 Sequence of a human Mrp8 mRNA target sequence according to SEQ ID NO: 1
  • Figure 2 Sequence of a human Mrp 14 mRNA target sequence according to SEQ ID NO: 2.
  • Figure 3 Localization of Mrp8 and Mrp 14 mRNA in scar tissue.
  • A Expression of Mrp 14 (left pictures) and Mrp8 (right pictures) in keloids (upper pictures) compared to intact skin (lower pictures) of the same person. While no staining is visible in intact skin, a strong staining is observed in both Mrp8 and Mrp 14 only in suprabasal keratinocytes of the keloid. Examples of stained supra-basal layers are marked with an arrow.
  • B Localization in normal scars of a healthy subject. No staining was observed.
  • Figure 4 Detection of Mrp8 and Mrpl4 mRNA expression in scar and keloid biopsies using TaqMan analysis compared to intact skin of healthy volunteers. It has been observed that, particularly in hypertrophic scars and keloids, but not in normal scars of healthy volunteers, a strong upregulation of the expression of both Mrp8 and Mrp 14 takes place. Furthermore, an increased amount of Mrp8 and Mrp 14 can be observed in keloid patients even in intact skin, which shows that the expression of Mrp8 and Mrp 14 mRNA in the skin is a suitable marker for detecting a keloid predisposition.
  • FIG. 5 Influence of siRNAs directed against Mrp8 and / or Mrp 14 on the proliferation of HaCaT keratinocytes. 2 typical test results are shown. A higher luminescence indicates an increased proliferation.
  • An siRNA directed against EGFP was used as negative control (GFP-d3; Table 7).
  • the effect of various siRNAs directed against Mrp8 (1333-dl, 1333-d3; Tab. 3) and Mrpl4 (1759-d2, 1759-d3; Tab. 4) as well as mixtures thereof (1333-dl / 1759-d3) were examined. It was observed that a full therapeutic or preventive effect can be achieved with a single siRNA.
  • FIG. 6 Influence of siRNAs directed against Mrp8 and Mrp 14 on the expression of Mrp8 and Mrp 14 protein in keratinocytes.
  • A Influence of siRNAs directed against Mrp 8 on the expression of Mrp8 protein detected by Western blot. The effect of various siRNAs directed against Mrp8 (1333-dl, 1333-d2, 1333-d3; Tab. 3) and mixtures with siRNAs directed against Mrpl4 (1333-dl / 1759-d3; 1333-dl / 1759-d2 ; Tab. 3, 4) was examined. All siRNAs and siRNA mixtures showed a clear inhibitory effect on Mrp8 expression. Recombinantly produced Mrp8 / 14 was detected as a positive control.
  • siRNA GFP-d3 The influence of siRNA GFP-d3 was examined as a negative control.
  • B Influence of siRNAs directed against Mrp 14 on the expression of Mrp 14 protein detected by means of Western blot. The effect of different siRNAs against Mrp 14 (1759-dl, 1759-d2, 1759-d3; Table 3) and mixtures with siRNAs directed against Mrp8 (1333-dl / 1759-d3; 1333-dl / 1759- d2; 1333dl-1759-dl; Tab. 3, 4) was examined. All siRNAs or siRNA mixtures showed a clear inliibitior effect on Mrp 14 expression. Recombinantly produced Mrp8 / 14 was detected as a positive control.
  • Example 1 Specific upregulation of Mrp8 and Mrpl4 in hypertrophic scars and the like keloids
  • the recombinant plasmids were Checking the insert sequenced.
  • the DIG RNA Labeling Kit (Röche, Mannheim) was used to label the probes with digoxigenin-11-DUTP ("random primed" DNA labeling) by means of in vitro transcription, and the transcripts were then precipitated and checked by gel electrophoresis.
  • Antisense probes were generated via SP6 RNA polymerases, while the sense probe (negative control) was transcribed with T3 RNA polymerase.
  • In situ hybridization staining was carried out on cryofixed (PFA) sections (8 ⁇ m) using the probes described above for rnrp8 and mrp 14.
  • the following biopsies were used: keloid scar and healthy area of the same patient as well as intact skin of a healthy patient and normal, "healthy" scar of a healthy patient.
  • the sections were prepared after appropriate preparation (drying, proteinase K digestion, fix, acetylation ) was first mixed with hybridization solution (without probe) and incubated at 55 ° C. (1 h), after which the solution was replaced by a hybridization solution (containing antisense or sense probe, 80 ng / 20 ⁇ l). The sections were incubated overnight at 55 ° C.
  • Mrp8 and Mrp 14 mRNA were detected by means of TaqMan analysis in biopsies.
  • a DNAse I digestion of the RNA was then carried out.
  • 20 ⁇ g RNA (ad 50 ⁇ l with DEPC-treated water) with 5.7 ⁇ l transcription buffer (Röche), 1 ⁇ l RNAse inhibitor (Röche; 40 U / ⁇ l) and 1 ⁇ l DNAse I (Röche; 10 U / ⁇ l) Incubated for 20 min at 37 ° C. Then 1 ⁇ l of DNAse I was again added and incubated at 37 ° C. for a further 20 min.
  • the RNA was then phenolized, ethanol precipitated and washed. All of the steps listed above were carried out with DEPC (diethyl pyrocarbonate) -treated solutions or liquids, provided that these did not contain any reactive amino groups.
  • the cDNA was then produced from the extracted RNA. This was done in the presence of 1 x TaqMan RT buffer (Perkin Elmer), 5.5 mM MgCl 2 (Perkin Elmer), each 500 ⁇ M dNTPs (Perkin Elmer), 2.5 ⁇ M random hexamers (Perkin Elmer), 1.25 U / ⁇ l MultiScribe Reverse Transcriptase (50 U / ⁇ l Perkin Elmer), 0.4 U / ⁇ l RNase Inhibitor (20 U / ⁇ l, Perkin Elmer), 20 ⁇ l RNA (50 ng / ⁇ l) and DEPC-treated water (ad 100 ⁇ l volume).
  • RNA was distributed into two 0.2 ml tubes (50 ⁇ l each) and the reverse transcription was carried out in a temperature cycler (10 min at 25 ° C; 30 min at 48 ° C and 5 min at 95 ° C).
  • the subsequent quantification of the cDNA was carried out by means of quantitative PCR using the SYBR Green PCR Master Mix (Perkin Elmer), a triple determination being carried out for the determination of the Mrp8 or Mrp 14 cDNA amount. Cyclophilin A (Gen Bank: XM039526) was used as reference.
  • the stock solution for each triplet contained 37.5 ⁇ l 2 x SYBR Master Mix, 0.75 ⁇ l AmpErase UNG (1 U / ⁇ l) and 18.75 ⁇ l DEPC-treated water for a total volume of 57 ⁇ l.
  • 1.5 ⁇ l of forward and reverse primers were added to 57 ⁇ l stock solution in a previously optimized concentration ratio.
  • 60 ⁇ l each of the stock solution / primer mixture was mixed with 15 ⁇ l cDNA solution (2 ng / ⁇ l) and distributed over three wells.
  • a stock solution with primers for the determination of cyclophilin A was prepared, mixed with another 15 ⁇ l of the same cDNA solution and distributed over three wells.
  • cDNA solutions were prepared as a dilution series (4 ng / ⁇ l; 2 ng / ⁇ l; 1 ng / ⁇ l; 0.5 ng / ⁇ l and 0.25 ng / ⁇ l ). 15 ⁇ l of these cDNA solutions were mixed with 60 ⁇ l stock solution / primer mixture for the determination of cyclophiline and distributed over three wells. A standard curve was also created for Mrp8 and Mrp 14; the same dilutions used for the standard cyclophilin curve were used. As a control served a PCR approach without cDNA.
  • Mrp8 and Mrp 14 are suitable for diagnosing a predisposition to keloids, since increased amounts of mRNA were found in intact skin of keloid patients compared to intact skin of healthy subjects for both Mrp8 and Mrp 14.
  • Example 2 Influence of siRNAs which bind to Mrp8 or Mrpl4 on the proliferation of keratinocytes
  • the expression of the two genes was inhibited by the transfection of gene-specific siRNAs and the influence on cell proliferation was analyzed using a vitality assay.
  • siRNAs which are directed against Mrp8 or Mrp 14 and mixtures of siRNAs which are directed against Mrp8 and Mrp 14 were used.
  • the basic sequence and structure of siRNAs used are listed in Tables 3 and 4: 1333-dl, 1333-d3, 1759-d2, 1759-d3.
  • the base sequences given in the tables represent the first 19 nucleic acids of the sense strand of the siRNA molecule. All siRNAs were each composed of two RNA strands which were complementary in the region of the 19 nucleotide sequence given (ie Watson-Crick base pairing) and on the 3rd 'End had 2-nucleotide dTdT overhangs each.
  • An EGFP-specific siRNA (GFP-d3, Tab. 7) was fransfected as a negative control.
  • HaCaT cells were used, which are cultivated in DMEM (GIBCO TM) with 10% FCS (PAN TM). The entire assay was run for 5 days.
  • the cells were seeded into a 24-well plate (BD Falcon) with a cell count of 150,000 cells per well 24 hours before the first transfection.
  • the lyophilized siRNAs were adjusted to a concentration of 20 ⁇ M.
  • the first part of the transfection batch was prepared by carefully mixing 9 ⁇ l Optimem I (GIBCO TM) with 6 ⁇ l Oligofectamin TM (Invitrogen). The mixture was incubated for 10 minutes at room temperature. During this incubation period, the second part, consisting of 47 ⁇ l Optimem I and 6 ⁇ l siRNA (in the case of a combination of two siRNAs, 3 ⁇ l each), was placed in a new Eppendorf vessel.
  • the first part was pipetted into the second part, mixed carefully and incubated for a further 22 min at room temperature. This was followed by the addition of 182 ⁇ l Optimem I.
  • the culture medium was aspirated from the cells and the cells were washed once with Optimem I.
  • 250 ⁇ l of transfection batch / well were added to the cells and these were incubated for 4 h in the incubator (37 ° C./10% CO 2 /95% rH). After the incubation period, 150 ⁇ l DMEM / 30% FCS was added to regenerate the cells overnight.
  • siRNAs directed against Mrp8 and / or Mrp 14 inhibit the proliferation of keratinocytes and thus these siRNAs for the prevention and / or therapy of hypertrophic scars and keloids. can be used.
  • the administration of an siRNA directed against Mrp8 or Mrp 14 is sufficient to achieve the effect which a mixture of siRNAs directed against Mrp8 and Mrp 14 has (see Figure 5).
  • the new nucleic acids surprisingly have the advantage that the administration of a single nucleic acid, a dsRNA, is sufficient to achieve the full therapeutic effect.
  • Example 3 Influence of siRNAs which bind to Mrp8 or Mrpl4 on expression of Mrp8 and Mrpl4
  • siRNAs used which are directed against Mrp8 or Mrp 14, actually influence the expression of Mrp8 or Mrp 14.
  • SiRNAs used are listed in Tables 4 and 3 (see also Example 1): 1333-dl, 1333-d2, 1333-d3, 1759-dl, 1759-d2, 1759-d3.
  • An IGF-RI-specific siRNA (IGd-1; Table 7) was transfected as a positive control and an EGFP-specific siRNA (GFP-d3, Table 7) as a negative control.
  • HaCaT cells were used which, after stable transfection with Mrp8 and Mrpl4 expression plasmids, overexpress both proteins (HaCaT mrp8pl4n; S. Werner, ETH Zurich). These cells were cultured in DMEM (GIBCO TM) with 10% FCS (PAN TM), 0.1 mg / ml puromycin (SIGMA TM) and 0.4 mg / ml geneticin (GIBCO TM). The entire assay was run over a period of 4 days.
  • the cells were seeded with a cell count of 100,000 cells per well 24 hours before the first transfection in a 24-well plate (BD Falcon) in DMEM (GIBCO TM) with 10% FCS (PAN TM) without antibiotics.
  • the lyophilized siRNAs were adjusted to a concentration of 20 ⁇ M.
  • the first part of the transfection batch was prepared by carefully mixing 9 ⁇ l Optimem I (GIBCO TM) with 6 ⁇ l Oligofectamin TM (Invitrogen). The mixture was incubated for 10 minutes at room temperature.
  • the second part consisting of 47 ⁇ l Optimem I and 6 ⁇ l siRNA (in the case of a combination of two siRNAs, 3 ⁇ l each), was placed in a new Eppendorf tube.
  • the first part was pipetted into the second part, mixed carefully and incubated for a further 22 min at room temperature. This was followed by the addition of 182 ⁇ l Optimem I.
  • the culture medium was aspirated from the cells and the cells were washed once with Optimem I. Then 250 ⁇ l of transfection batch / well were added to the cells and these were incubated for 4 h in the incubator (37 ° C./10% CO2 / 95% rH).
  • the cell lysate was heated to 95 ° C. for 5 min and homogenized by centrifugation with QIAshredder (QIAGEN) Siert.
  • Western blot analysis was performed using the XCell SureLock TM Mini-Cell and XCell II TM Blot Module System and 18% Novex® Tris-Glycine Gels with 10 wells (INVITROGEN). 25 ⁇ l of each sample were applied to two gels.
  • the runtime of the SDS-PAGE was 2.5h at 130V and the transfer time to the nitrocellulose membrane (AMERSHAM Biosciences) was at 25V.
  • Mrp8 was detected using a mouse anti-Mrp8 biotin antibody (Dianova) and steptavidin-HRP (R&D Systems) each in a 1: 200 dilution. Mrp 14 was detected with a rabbit anti-Mrpl4 antibody (J. Roth, University Hospital Weg) in a 1: 500 dilution and a mouse anti-rabbit Ig-HRP antibody (Promega) in a 1: 5000 dilution.
  • the membrane was divided after the transfer at a running height of 36 kDa and the upper part of the membrane with a mouse anti-actin antibody (Chemicon) and an anti-mouse Ig-HRP antibody each in a 1 : 5000 dilution stained.
  • the ECL TM Western Blotting Detection Reagent and ECL TM Hyperfilm were used for the chemiluminescence reaction and its detection.
  • a first approach the influence of siRNAs 1333-dl, 1333-d2 and 1333-d3 and mixtures of 1333-dl with 1759-d2 and 1759-d3 on the expression of Mrp8 protein was examined. The result is shown in Fig. 6 A: As expected, all siRNAs and siRNA mixtures result in a reduced amount of Mrp8 protein, since one siRNA directed against Mrp8 was transfected (albeit partly in a mixture with another siRNA which towards Mrp 14). In contrast, no reduced expression was observed when using the GFP-d3 control siRNA.
  • siRNAs which are directed against M ⁇ l4, decrease the M ⁇ 8 and M ⁇ l4 amounts equally (see e.g. lane 6 M ⁇ 8 and M ⁇ l4 blots vs. lane 3 (control)) and that siRNAs, which are directed against M ⁇ 8 , reduce the amount of M ⁇ 8 and M ⁇ l4 to the same extent (see, for example, lanes 5, 8 M ⁇ 8 and M ⁇ l4 blots vs. lane 3 (control)).
  • the use of mixtures of siRNAs which are directed against M ⁇ 8 and M ⁇ l4 have no additional effect on the expression. It was thus possible to confirm that the nucleic acids according to the invention are suitable for reducing both M ⁇ 8 and M ⁇ l4 protein amounts in HaCaT cells and thus bring about a reduction in cell proliferation, as shown in Example 2.

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Mrp8/Mrp14 hihibitoren zur Herstellung eines Medikaments zur Prävention und/oder Behandlung von hypertrophen Narben und Keloiden. Ferner betrifft die Erfindung neuartige Mrp8 oder Mrp 14 Inhibitoren, insbesondere siRNAs.

Description

Mrp8/Mrpl4 Inhibitoren und ihre Verwendung zur Prävention und/oder Behandlung von hypertrophen Narben und Keloiden
Die Erfindung betrifft die Verwendung von Mrp8/Mrpl4 Inhibitoren zur Herstellung eines Medikaments zur Prävention und/oder Behandlung von hypertrophen Narben und Keloiden. Ferner betrifft die Erfindung neuartige Mrp8 oder Mrpl4 Inhibitoren.
Narben bilden sich immer nach Verletzungen der Haut nach Abschluss der Heilung. Dabei kommt es nach Abschluss der Reepithelisierung von verletzter Haut zu einer Reorganisation der extrazellulären Matrix, insbesondere von Kollagenen. Im Idealfall entsteht eine flache Narbe, die makroskopisch nicht als solche zu er- kennen ist. In manchen Fällen kommt es jedoch zu einer übermäßigen Ausbildung der extrazellulären Matrix in der Dennis, sodass durch die überschießende Narbenbildung eine optisch unschöne, erhabene und unregelmäßig geformte hypertrophe Narbe entsteht. Diese Narben stellen nicht nur ein kosmetisches Problem dar sondern sind auch durch das Fehlen von Hautanhanggebilden, wie Haarfolli- kein, Talgdrüsen, sowie schlechte mechanische Eigenschaften gekennzeichnet, sodass bei thermischer oder mechanischer Belastung große Probleme für den Patienten entstehen. Des Weiteren können Keloide entstehen; d.h. Narbenwucherungen, die sogar in das gesunde Hautgewebe einwuchern, wodurch sich eine sich ständig vergrößernde Narbe bildet.
Hypertrophe Narben und Keloide sind durch eine aberrante Produktion von Extrazellulärmatrix-Komponenten in der Dennis gekennzeichnet, was zu einer verdickten Dennis führt. Dabei spielen die Fibroblasten, die in der Epidermis liegen, eine entscheidende Rolle. Es ist jedoch auch bekannt, dass die Keratinozyten der dar- über liegenden Epidermis maßgeblich die Fibroblasten bei der Narbenbildung beeinflussen. So wurde beispielsweise gezeigt, dass aus Keloiden isolierte Keratinozyten bei Kokultivierung mit Fibroblasten diese dazu anregen, verstärkt zu pro- liferieren und Kollagen zu sekretieren, ähnlich dem bekannten Verhalten von Fibroblasten aus Keloiden. Somit sind falsch regulierte Keratinozyten in frischem Narbengewebe für die übermäßigen Produktion von Kollagenen und Glykoprotei- nen in der darunter liegenden dermalen Schicht verantwortlich.
Die der Narbenbildung zu Grunde liegenden molekularbiologischen Faktoren sind im Wesentlichen ungeklärt. Deswegen sind im Stand der Technik auch keine Behandlungsmethoden von hypertrophen Narben und/oder Keloiden bekannt, welche auf die molekularen Mechanismen selbst gerichtet sind. Die im Stand der Technik bekannten Behandlungsmethoden von Keloiden beschränken sich sehr häufig auf einfaches chirurgisches Entfernen der Keloide; jedoch findet man in bis zu 90% der Fälle ein erneutes Auftreten der Keloide. Generell existieren für Keloide keine Behandlungsmöglichkeiten mit annehmbarer Erfolgsrate. Bei hypertrophen Narben führen bestehende Behandlungstechniken ebenfalls meist nicht zu befriedi- genden Ergebnissen. Klassische Methoden umfassen das operative Entfernen von Narben, wobei häufig eine Neubildung der hypertrophen Narbe beobachtet wird, sowie Behandlung mit Silikongel- Verbänden, Behandlung mit Druckverbänden, Behandlung mit Kortikosteroiden (z.B. Triamcinolon acetonid), Bestrahlung mit Lasern oder CO sowie Kryobehandlung des Gewebes. Bei Verwendung von Sili- kongel-Verbänden beruht der Effekt wahrscheinlich weniger auf dem Silikon selbst, sondern auf dem hydratisierenden und abschließenden Effekt des Verbandes. Die intraläsionale Läsion von Kortikosteroiden führt zu einer Verminderung der Kollagensynthese, jedoch werden bei andauernder Behandlung schwere Nebeneffekte wie Atrophien der Haut, Hypopigmentierung oder Geschwüre beo- bachtet. Weiterhin wird auch versucht, Kollagen oder Hyaluronsäure in das Narbengewebe einzuspritzen, um optisch eine ebenere Hautoberfläche zu erreichen. Diese Substanzen werden jedoch innerhalb von wenigen Monaten resorbiert, und die Behandlung muss alle 6-12 Monate wiederholt werden. Neuere Behandlungsansätze umfassen die Gabe von Interferon-alpha, Interferon-beta oder Interferon-gamma oder die Gabe von Imiquimod, das die Expression von Interfe- ronen induziert. Auch Gabe von TGF-beta wird für die Verhinderung der Bildung hypertropher Narben diskutiert. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, verbesserte Mittel zur Prävention und/oder Behandlung von hypertrophen Narben und/oder Keloiden bereitzustellen.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch die Verwendung mindestens eines Mrp8- und/oder Mrpl4 Inhibitors zur Herstellung eines Medikaments zur Prävention und/oder Behandlung von hypertrophen Narben und/oder Keloiden gelöst.
Im Rahmen der Erfindung hat es sich überraschenderweise herausgestellt, dass Mrp8 und/oder Mrpl4 Inhibitoren, insbesondere gegen Mrp8 und/oderMrpl4 gerichtete siRNA Moleküle, zur Prävention und/oder Behandlung von hypertrophen Narben und Keloiden geeignet sind. Es hat sich überraschenderweise ergeben, dass Mrp8/Mrpl4 spezifisch in aberranten hypertrophen Narben und Keloiden, jedoch nicht in normalen Narben exprimiert werden, wobei die Überexpression spezifisch in den suprabasalen Keratinozyten des erkranktem Gewebe zu finden ist. Ferner wurde überraschenderweise gefunden, dass durch Zugabe von siRNA- Molekülen, die gegen Mrp8 unά7oderMrpl4 gerichtet sind, eine signifikante Inhibition der Proliferation von Keratinozyten in vitro erreicht werden kann. Da wie oben dargestellt diese Keratinozyten bei der Bildung von hypertrophen Narben und Keloiden eine entscheidende Rolle spielen, stellt die vorliegende Erfindung damit wirksame Mittel zur Prävention und/oder Behandlung von hypertrophen Narben und Kelodiden bereit.
Mrp8 und Mrpl4 sind Proteine der SlOO-Proteinfamilie, die seit langem bekannt sind und zusammen ein nicht-kovalentes Heterodimer Mrp8/14 bilden können. Die Expression der Proteine ist in einer Vielzahl von Erkrankungen stark gesteigert, in anderen jedoch erniedrigt. Die biologische Funktion der Proteine ist völlig unklar. Beispiele solcher Erkrankungen, in denen eine erhöhte Menge an Mrp8 und/oder Mrpl4 nachgewdesen wurde, sind rheumatoide Arthritis und andere Arthritiserkrankungen, Inflammatory Bowel disease und andere entzündliche Darmerkrankungen, zystische Fibröse, Parodontose, sowie Autoimmunerkran- kungen wie das Kawasaki Syndrom. Je nach unterschiedlichem Wundtyp ist die Expression in Wunden entweder erhöht oder erniedrigt (WO 92/088181, EP 1114862).
Eine enzymatische Funktion der Proteine ist unbekannt. Gleichzeitig weiß man, dass die Proteine eine Vielzahl von Stoffen binden können, wie beispielsweise Calcium, Zink, Fettsäuren, insbesondere Arachidonsäure, Heparin, Heparansulfat Glykosaminoglykane und Tubulinfilamente. Welche von diesen extra- wie intrazellulären Bindungspartners in vivo eine Rolle spielen, ist unklar. Mrp8 und Mrpl4 werden sekretiert, allerdings ist unklar, ob das intrazelluläre und/oder das extrazelluläre Auftreten für die Pathogenese einer Erkrankung entscheidend ist.
Aufgrund der unklaren biologischen Funktion der Proteine bzw. des Heterodimers wird im Stand der Technik im Allgemeinen nur die diagnostische Verwendung der Proteine vorgeschlagen, d.h. es wird eine veränderte Expression der Proteine in einer Erkrankung festgestellt, ohne dass daraus ein therapeutisches Konzept abzuleiten wäre.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist ein Inhibitor dadurch definiert, dass er in der Lage ist, die Funktion von MRP8 und/oder MRP14 im Organismus zu hemmen und daher therapeutisch eingesetzt werden kann. Dies kann dadurch geschehen, dass der Inhibitor die Funktion des Moleküls inhibiert, beispielsweise durch Anlagern an das Protein, oder dadurch, dass die Expression des Proteins inhibiert wird.
Im Rahmen der Erfindung werden zur Bestimmung, ob eine Substanz ein Inhibitor im Sinne der vorliegenden Erfindung ist, bevorzugt Assays verwendet, in denen die Inhibition der Mrp8 und/oder Mrp 14 Expression oder Mrp8 und/oder Mrpl4 Aktivität gemessen wird. Die Inhibition der Expression kann beispielswei- se in vitro (Beispiel 3), in vivo oder in Zelllysaten untersucht werden. Die Expressionsunterschiede werden dabei auf der Ebene der mRNA oder Proteine, insbesondere auf der Ebene der Proteine nachgewiesen. So können beispielsweise, wie in Beispiel 3 gezeigt, Zelllinien, insbesondere Keratinozytenzelllinien, untersucht werden, die transient oder stabil Mrp8 und Mrpl4 überexprimieren, um nach Gabe eines Inhibitors die Inhibition der Expression quantitativ bestimmen zu kön- nen. Der Nachweis von Mrp8 oder Mrp 14 kann über geeignete Antikörper erfol- gen, die jeweils spezifisch Mrp8 oder Mrpl4 erkennen. Geeignete Nachweismethoden sind beispielsweise Western Blot Analyse oder Immunlokalisierung. Ein solcher Assay zur Bestimmung der Wirkung eines Inhibitors auf die Proteinexpression kann beispielsweise aus folgenden Schritten bestehen:
(1) Kultivierung von Zellen, die nachweisbare Mengen an Mrp8 und/oder
Mrp 14 Protein produzieren,
(2) Gabe eines Inhibitors zu den Zellen,
(3) Nachweis der Menge an Mrp8 und/oder Mrpl4 Protein in den Zellen,
(4) Vergleich zu der Menge an Mrp8 und/oder Mrp 14 Protein in nichtbehandelten Kontrollzellen.
Eine im Vergleich zu Kontrollzellen erniedrigte Menge an Mrp8 und/oder Mrp 14 Protein weist die Wirkung als Inhibitor nach.
Analog kann auch die Menge einer Mrp8 und/oder Mrp 14 mRNA bestimmt werden, um die inhibitorische Wirkung zu bestimmen:
(1) Kultivierung von Zellen, die nachweisbare Mengen an Mrp8 und/oder Mrp 14 mRNA produzieren, (2) Gabe eines Inhibitors zu den Zellen,
(3) Nachweis der Menge an Mrp8 und/oder Mrpl4 mRNA in den Zellen,
(4) Vergleich zu der Menge an Mrp8 und oder Mrp 14 mRNA in nichtbehandelten Kontrollzellen.
Eine im Vergleich zu Kontrollzellen erniedrigte Menge an Mrp8 und/oder Mrpl4 mRNA weist die Wirkung als Inhibitor nach. Geeignete Nachweismethoden sind beispielsweise PCR-basierte Methoden, wie RTPCR oder in situ Hybridisierung (Current Protocols, John Wiley & Son, Inc., New York (2003)).
Der Nachweis der inhibitorischen Wirkung eines zu testenden Inhibitors kann auch in vivo erfolgen. So kann beispielsweise der Einfluss eines zu testenden Inhibitors auf die Mrp8 und/oder Mrp 14 Expression in einem bestimmten Gewebe im Tiermodell getestet werden. Analog zu den oben beschriebenen in vitro Experimenten zur Bestimmung der Mrp8 und/oder Mrp 14 Expression kann eine zu testende Substanz auf ein Gewebe, insbesondere die Haut eines Tieres aufgetragen werden; anschließend wird die behandelte Probe entnommen, wie oben beschrieben die Menge an Mrp8 und/oder Mrp 14 Protein oder mRNA bestimmt und mit der Menge an Mrp8 und/oder Mrp 14 Protein oder mRNA in unbehandeltem Gewebe verglichen. Dabei kann das unbehandelte Gewebe vom gleichen Tier oder von einem anderen Tier stammen. Eine im Vergleich zu Kontrollzellen erniedrigte Menge an Mrp8 und/oder Mrp 14 Protein oder mRNA weist die Wirkung als Inhibitor nach.
Die Entnahme der Proben kann beispielsweise durch Biopsienahme, insbesondere der Haut, oder durch Entnahme von Körperflüssigkeiten, beispielsweise Blut, ge- schehen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bezeichnet „hypertrophe Narben" ein Krankheitsbild, bei dem es nach Abschluss der Wundheilung zu einer verstärkten Produktion von Extrazellulärmatrix-Komponenten in der Dennis kommt, wodurch die Dennis verdickt wird.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bezeichnet „Keloid" ein Krankheitsbild, bei dem Narbenwucherungen in das gesunde Hautgewebe einwuchern und sich somit eine Narbe bildet, die über die Grenzen des Ortes des ursprünglichen Trau- mas bzw. der Wunde hinauswuchert. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Inhibitor um einen Inhibitor von humanem Mrp8 und/oder humanem Mrp 14. Erfindungsgemäß ist aber auch eingeschlossen, dass es sich um einen Inhibitor gegen Mrp8 und/oder Mrp 14 aus anderen Spezies handelt, beispielsweise Affe, Schwein, Rind, Pferd, Ratte oder Maus.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform wird nur ein Inhibitor verwendet. Im Rahmen der Erfindung hat es sich überraschenderweise gezeigt, dass ein Inhibitor, der entweder gegen Mrp8 oder Mrp 14 gerichtet ist, bereits die selbe Wirkung wie eine Kombination zweier Inhibitoren zeigt, die gegen Mrp8 und Mrp 14 gerichtet sind. Somit kann bereits durch die Gabe eines Inhibitors ein voller therapeutischer Erfolgt erreicht werden.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der Inhibitor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Nukleinsäuren, Antikörpern, anderen natürlichen oder synthetischen Proteinen und Peptiden, die beispielsweise eine erhöhte Degradation oder Sequestrierung von Mrp8 und/oder Mrp 14 bewirken, Molekülen mit geringem Molekulargewicht (LMWs) und Mrp8/Mrpl4 Rezeptor- Antagonisten.
Moleküle mit geringem Molekulargewicht sind Moleküle, die keine Proteine, Peptide, Antikörper oder Nukleinsäuren sind und die ein Molekulargewicht von weniger als ca. 5000 Da, vorzugsweise weniger als 2000 Da, insbesondere weniger als 1000 Da, am meisten bevorzugt weniger als 500 Da aufweisen. Derartige Inhibitoren können insbesondere im Rahmen von High-Through-Put Verfahren ausgehend von Molekülbanken identifiziert werden. Derartige Verfahren sind dem Fachmann bekannt.
Gemäß einer bevorzugten Ausfuhrungsform ist der Inhibitor ein Antikörper. Die- ser Antikörper ist entweder polyklonal oder monoklonal, bevorzugt ist der Antikörper ein monoklonaler Antikörper. Unter dem Begriff „Antikörper" versteht man gemäß der vorliegenden Erfindung auch gentechnisch hergestellte und ggf. modifizierte Antikörper bzw. antigenbindende Teile davon, wie z.B. chimäre An- tiköφer, humanisierte Antikörper, multifunktionelle Antikörper, bi- oder oli- gospezifische Antikörper, einzelsträngige Antikörper, F(ab)- oder F(ab)2- Fragmente (siehe z.B. EP-Bl-368684, US 4,816,567, US 4,816,397, WO 88/01649, WO 93/06213, WO 98/24884).
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Inhibitor eine Nukleinsäure, vorzugsweise mit einer Länge von maximal ca. 200 Nukleotiden.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform binden diese Nukleinsäuren an Mrp8 und/oder Mrp 14 mRNA oder DNA, insbesondere genomische DNA, besonders bevorzugt an mRNA.
Bevorzugt sind Nukleinsäuren mit einer Länge eines Einzelstrangs von maximal 100 Nukleinsäuren, vorzugsweise maximal 50 Nukleinsäuren, insbesondere bevorzugt maximal 30 Nukleinsäuren.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform hemmen die Nukleinsäuren die Expression und/oder Aktivität von Mrp8 und/oder Mrpl4. Besonders be- vorzugt hemmen sie die Expression von Mrp8 und/oder Mrp 14 Polypeptiden.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können die im Rahmen der erfindungsgemäßen Verwendung verwendeten Nukleinsäuren modifiziert sein.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausf hrungsform bindet die Nuklemsäure an eine humane Mrp8 oder Mrpl4 mRNA gemäß SEQ ID NO:l oder SEQ ID NO:2 oder Varianten davon, z.B. allelische Varianten, Sequenzen mit Polymorphismen zu den Sequenzen SEQ ID No. 1 und 2 oder splice Varianten.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäure ein Antisense-Molekül oder eine siRNA, vorzugsweise eine siRNA. siRNAs (small interfering RNAs) wirken über den Mechanismus der dsRNA vermittelten RNA Interferenz. Dabei bewirken kleine dsRNA Moleküle einen sequenzspezifischen, so genannten Knock-Down der Genexpression, im Unterschied zu langen dsRNA Molekülen, die in Säugerzellen eine unspezifische Inhi- bition der Translation bewirken (Elbashir et al., 2001, Genes Dev, 15: 188-200; Vattem et al., 2001; Eur. J. Biochem., 268: 3674-84). Eine Länge von ca. <30 Nukleotiden pro Einzelstrang ist nötig, um eine sequenzspezifische RNA Interferenz (RNAi) in Säugetierzellen zu erreichen (Xia et al., 2002, Nature Biotech., 20: 1006-1010). dsRNAs mit 2-3 Nukleotiden langen 3 '-Überhängen wurden als effi- ziente siRNAs beschrieben, jedoch gibt es Hinweise, dass auch dsRNAs ohne Überhang (blunt end) in vivo funktionieren.
siRNAs sind doppelsträngige oder partiell doppelsfrängige RNAs, die zu targetspezifischer Interferenz fähig sind. Üblicherweise besteht ein siRNA Molekül aus zwei RNA Einzelsträngen, es können aber auch siRNAs verwendet werden, die aus einem RNA-Strang bestehen und so beschaffen sind, dass sie einen Doppelstrang mit Hairpin Struktur bilden.
Unter dem „Sense-Strang" der siRNA ist derjenige RNA Strang einer siRNA zu verstehen, der über einen Bereich von mindestens ca. 16, insbesondere mindestens ca. 17, vorzugsweise mindestens ca. 18, am meisten bevorzugt mindestens ca. 19 Nukleotide identisch oder zu mindestens ca. 90% identisch zu der Targetsequenz ist. Vorzugsweise ist er identisch.
Der „Antisense-Strang" der siRNA ist dann der dazu komplementäre Strang.
Unter einem Target wird erfindungsgemäß eine Nukleinsäure verstanden, deren Expression auf Protein- und/oder mRNA-Ebene, vorzugsweise auf Proteinebene moduliert werden soll. Dabei ist eine Targetsequenz im Sinne der vorliegenden Erfindung die Sequenz desjenigen Stranges eines Targets, der komplementär zu dem Strang ist, der als Matrize bei der Transkription verwendet wird; d.h. bei der Targetsequenz handelt es sich um den Sense-Strang des Targets. Targets der vor- liegenden Erfindung sind Nukleinsäuren, die für Mrp8 und Mrpl4 Proteine kodieren.
Unter „Basissequenz der siRNA Moleküle" ist derjenige Teil des Sense-Strangs einer siRNA zu verstehen, der doppelsträngig vorliegt.
Unter „Basis-Targetsequenz" ist ein Teil einer Targetsequenz mit einer Länge X zu verstehen, die im Bereich der Nukleotide 3-X zur Basissequenz der siRNA Moleküle identische oder zu mindestens 90% identisch, vorzugsweise identisch ist.
„Vor" im Zusammenhang mit der relativen Position von Nukleinsäuren innerhalb von Oligo- oder Polynukleinsäuren ist als in Richtung des 5 '-Endes des Moleküls zu verstehen.
„Hinter" im Zusammenhang mit der Position von Nukleinsäuren und Oligo- oder Polynukleinsäuren ist als in Richtung des 3 '-Endes des Moleküls zu verstehen.
siRNA-Interferenz wird dadurch erreicht, dass der Antisense-Strang der siRNA zu einem Teil der Targetsequenz komplementär oder zu mindestens ca. 90% komplementär ist, wobei Komplementarität bevorzugt ist. In einer bevorzugten Ausfuhrungsform ist der Antisense-Strang der siRNA in einem Bereich von mindestens 16 bis 23 Aminosäuren, vorzugsweise 17 bis 22, insbesondere 18 bis 21, besonders bevorzugt 19 bis 20, am meisten bevorzugt 19 Nukleinsäuren zu einer erfindungsgemäßen Targetsequenz komplementär oder zu mindestens 90% komplementär, vorzugsweise komplementär. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die siRNA in einem Bereich von ungefähr 16 bis 23 Aminosäuren, vorzugsweise 17 bis 22, insbesondere 18 bis 21, besonders bevorzugt 19 bis 20, am meisten bevorzugt 19 Nukleinsäuren doppelsträngig. Bevorzugt ist der dopplesträngige Teil derjenige Teil der siRNA, der wie oben definiert komplementär zur Targetsequenz ist. In einer bevorzugten Ausführungsform bildet die siRNA einen Doppelstrang ohne Einzelstrangüberhang („blunt end"). In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform hat die siRNA am 3 '-Ende des Sense- bzw. Antisense-Strangs unabhängig voneinander Einzelstrangüberhänge von mindestens 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 Nuklei- näuren Länge. Vorzugsweise ist die Anzahl der überhängenden Nukleinsäuren am Sense- und Antisense 3 '-Ende identisch. In einer besonders bevorzugten Ausfüh- rungsform ist die Länge der Einzelstrangüberhänge am 3 '-Ende des Sense- oder Antisense-Strangs 0 bis 5. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Länge der Einzelstrangüberhänge am 3' Ende des Sense- oder Antisense- Strangs gleich 0 oder 2, insbesondere gleich 2. Häufig werden als überhängende Nukleinsäuren dTdT verwendet, dies ist jedoch für die Funktion der siRNA nicht entscheidend. Weiterhin sind siRNA Moleküle mit einem GC-Gehalt von ca. 20- 80%, besonders ca. 30-70%, insbesondere von ca. 50% bevorzugt. Weiterhin ist die Auswahl solcher siRNAs bevorzugt, bei denen die Targetsequenz vor dem Bereich (d.h. 5' davon) der zum Sense-Strang der siRNA zu mindestens ca. 90% identisch, vorzugsweise identisch ist, 1, insbesondere 2 Adenosine trägt.
Am effektivsten haben sich siRNAs erwiesen, die aus 21 Nukleotide langen RNA Strängen aufgebaut sind, die so gepaart sind, dass 1-3 Nukleotide lange Überhän- ge, insbesondere 2 Nukleotide lange 3 '-Überhänge an beiden Enden der dsRNA vorhanden sind. siRNAs, die aus jeweils 21 Nukleotiden langen RNAs aufgebaut sind, und so gepaart sind, dass 2 Nukleotide lange 3 '-Überhänge, nämlich dTdT- Überhänge, an beiden Enden der dsRNA vorhanden sind, wurden in den Beispielen 1 und 2 erfolgreich verwendet.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird im Rahmen der erfindungsgemäßen Verwendung nur eine siRNA verwendet, die entweder gegen Mrp8 oder Mrρl4 gerichtet ist. Somit genügt überraschenderweise die Gabe einer siRNA, um sowohl die Expression von Mrp8 als auch die von Mrp 14 zu modulie- ren. Damit kann durch eine siRNA ein vollständiger therapeutischer Erfolg erzielt werden. Dadurch wird das Problem der unbekannten Rolle von Mrp8 und Mrp 14, der heterogenen Bindungspartner und der unklaren intra- bzw. extrazellulären Bedeutung der beiden Proteine umgangen.
Erfindungsgemäß verwendete siRNAs können aus jedem Bereich einer Mrp8 oder Mrp 14 mRNA Sequenz abgeleitet werden, insbesondere aus humanen Mrp8 und Mrpl4 mRNA Sequenzen, am meisten bevorzugt aus Sequenzen gemäß SEQ ID No. 1 oder SEQ ID No: 2. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind erfmdungsgemäß verwendete siRNAs dadurch gekennzeichnet, dass der Sense- Strang die Sequenz einer der in SEQ ID No: 3 bis 946 dargestellten Sequenzen umfasst. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind erfindungsgemäß verwendete siRNAs dadurch gekennzeichnet, dass der doppelsträngige Anteil des Sense-Strangs die Sequenz einer der in SEQ ID No: 3 bis 946 dargestellten Sequenzen aufweist. Insbesondere sind solche siRNAs bevorzugt, in denen beide Stränge der siRNAs über einen Bereich von 19 Nukleotiden Watson-Crick Basen- paarungen enthalten und der Antisense-Strang zu 100% komplementär ist zu einer Targetsequenz und beide Stränge am 3 '-Ende Überhänge der Länge 0-5 Nukleotide, bevorzugt 1-3 Nukleotide, am meisten bevorzugt 2 Nukleotide haben.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist eine erfindungsgemäß verwendete siRNA dadurch gekennzeichnet, dass der Abschnitt der Mrp8 oder Mrp 14 Targetsequenz, der identisch oder zu ca. 90% identisch ist zum Sense-Strang der siRNA, an der ersten Nukleinsäure vor der ersten Nukleinsäure des Sense-Strangs der siRNA (entspricht Position -1) ein Adenosin aufweist; insbesondere vorzugsweise an den ersten beiden Nukleinsäuren vor der ersten Nukleinsäure des Sense- Strangs der siRNA zwei Adenosine aufweist (entspricht Positionen -2 und -1). Weitere bevorzugte siRNAs (bzw. deren Basissequenz), die dadurch gekennzeichnet sind, dass der Abschnitt der Mrp8 oder Mrp 14 Targetsequenz, der identisch ist zum Sense-Strang der siRNA, an den ersten beiden Nukleinsäuren vor der ersten Nukleinsäure des Sense-Strangs der siRNA zwei Adenosine aufweist (ent- spricht Positionen -2 und -1), sind in den Tabellen 5 und 6 aufgeführt, bzw. es wird in den Tabellen 5 und 6 auf die SEQ ID NOs der Sequenzen, die eine solche bevorzugte siRNA enthalten kann (= eine der möglichen Basissequenzen) verwiesen.
siRNAs, die im Sense-Strang eine der in SEQ ID No. 164, 202 und 238 darge- stellten Sequenzen enthalten, wurden erfolgreich zur Inhibition der Mrp8 Expression und/oder zur Inhibition der Keratinozyten eingesetzt (Beispiele 1, 2). In einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform ist die siRNA daher dadurch gekennzeichnet, dass der Sense-Strang die Sequenz einer der SEQ ID No: 164, 202, 238 enthält.
siRNAs, die im Sense-Strang eine der in SEQ ID No: 548, 649, 712 dargestellten Sequenzen enthalten, wurden erfolgreich zur Inhibition der Mrpl4 Expression und/oder zur Inhibition der Keratinozyten eingesetzt (Beispiele 1, 2). In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die siRNA daher dadurch gekennzeich- net, dass der Sense-Strang die Sequenz einer der SEQ ID No: 548, 649, 712 enthält.
Die siRNAs, die in Beispielen 1 und 2 verwendet wurden, sind dadurch gekennzeichnet, dass die Länge des Einzelsfranges 21 Nukleotide beträgt, die RNA- Einzelstränge am 3 '-Ende 2-Nukleotide lange Überhänge, nämlich dTdT- Überhänge haben und im Bereich des Doppelstranges von 19 Nukleotiden Länge ausschließlich Watson-Crick Bindungen vorliegen.
In einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform ist eine erfindungsgemäß ver- wendete siRNA daher dadurch gekennzeichnet, dass der Sense- und Antisense- Strang über einen Bereich von 19 Nukleotiden komplementär sind und somit einen Doppelstrang von 19 Nukleotiden Länge bilden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die siRNA dadurch gekennzeichnet, dass die siRNA am 3 '-Ende Einzelstrangüberhänge von 2 Nukleotiden Länge besitzt, beispielsweise mit der Sequenz dTdT. In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform ist die erfindungsgemäß verwendete Nukleinsäure ein Antisense-Molekül.
Antisense-Moleküle sind üblicherweise einsträngige DNA Moleküle die zum Sense-Strang eines Gens komplementär sind und einen „Knock-down" in der Expression des gewünschten Gens bewirken. Die Mechanismen, die dabei eine Rolle spielen, umfassen die Inhibition der Translation, hauptsächlich jedoch die Desta- bilisierung der mRNA, indem nach Bindung des Antisense-Moleküls an die Target mRNA die Endonuklease RNAse H einen Abbau der mRNA bewirkt. Wirk- same Antisense-Moleküle können gegen jeden Teil einer Targetsequenz gerichtet sein.
Vorzugsweise hat ein Antisense-Molekül eine Länge von maximal ca. 30 Nukleotiden, vorzugsweise von ca. 18 und 26 Nukleotiden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein erfindungsgemäß verwendetes Antisense-Molekül dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure die komplementäre Sequenz einer der in SEQ ID No. SEQ ID No:3 bis 946 dargestellten Sequenzen oder Teile davon besitzt oder ein DNA oder DNA/RNA Hybrid Analogon davon ist.
siRNA oder Antisense-Moleküle können durch dem Fachmann bekannte Verfahren hergestellt werden.
Geeignete Expressionssysteme, um stabile RNA Interferenz in Säugerzellen zu erhalten, sind beispielsweise in McManus und Sharp (Nature Genetics, 3:737- 747) beschrieben: Beispielsweise können die siRNAs unter der Expressionskontrolle von Pol II und Pol III Promotoren, wie CMV, Hl und U6, stehen. Die Pol III Transkription endet mit einer Reihe von Thymidin-Resten, und die transkri- bierte RNA enthält daher mehrere Uridine am Ende. Die Expressionskassetten können so konstruiert sein, dass ein einzelnes siRNA Molekül mit invertierter Hairpin-Struktur entsteht, oder die beiden Stränge der siRNA können separat ex- exprimiert werden, gefolgt von Annealen der beiden Stränge. Die siRNAs können direkt als therapeutisches Agens eingesetzt werden oder in gentherapeutisch annehmbare Trägersysteme eingesetzt werden. Beispiele für gentherapeutisch annehmbare Trägersysteme, die eine stabile Expression der siRNAs in Zellen erlau- ben, sind beispielsweise Plasmide und virale Expressionssysteme, beispielsweise Adenoviren und Lentiviren.
Die Applikation der siRNAs entweder direkt oder als Expressionssystem expri- mierend eine erfindungsgemäße siRNA kann durch Formulierung beispielsweise zusammen mit geeigneten kationischen Lipiden, wie beispielsweise Cytofectin™, AdVectin™ oder Oligofectamine™ erfolgen. Weiterhin können die Substanzen gespritzt werden, beispielsweise intravenös oder infradermal. Intravenöse Applikation von siRNA Expressionssystemen wurden im Tiermodell bereits erfolgreich getestet (Xia et al., 2002, Nature Biotech., 20:1006-10010). Weiterhin besteht die Möglichkeit, die Nukleinsäuren durch lonophorese oder Elektroporation zu appli- zieren. Bevorzugt ist eine lokale Gabe des erfindungsgemäßen Mittels, um Nebenwirkungen zu vermeiden. Bevorzugt ist daher eine topische oder intradermale Applikation.
Erfindungsgemäß können die Inhibitoren als solche verabreicht werden, oder vorzugsweise in Kombination mit mindestens einem geeigneten Hilfs- oder Zusatzstoff, z.B. mit einem oder mehreren geeigneten Adjuvanzien und/oder einem oder mehreren pharmazeutisch wirksamen und/oder verträglichen Trägerstoffen, Verdünnungsmitteln, Füllstoffen, Bindemitteln u.a.
Wenn die Verabreichung topisch ist, ist vorzugsweise der Hilfs- oder Zusatzstoff hydrophob und ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Wachs, Oleylalkohol, Propylenglykolmonostearat, Propylenglykolmonopalmitostearat, Isopropyllaureat, Isopropylmyristat, Isopropylpalmitat, Isopropylstearat, Ethylmy- ristat, Propylmyristat, Butylmyristat, Ethyloleat, Cetylstearylalkohol, Vaseline, Lanolinalkohol und Paraffinöl. Die Applikation von erfindungsgemäßen Antisense-Molekülen kann über die gleichen Methoden erfolgen wie für siRNA Moleküle. Die Methoden zur topischen Applikation von Antisense-Molekülen, wie lonophorese, Elektroporation, intradermale Applikation und direktes topisches Auftragen sind in Wraight und White (Pharmacology & Therapeutics, 2001, 89-104) zusammengefasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die siRNA rekombinant durch Expression eines einzigen Nukleinsäuremoleküls hergestellt, wobei zunächst ein doppelsträngiges RNA Molekül mit stem loop entsteht. Das Molekül kann direkt als siRNA Molekül eingesetzt werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die siRNA durch chemische Synthese, beispielsweise unter Verwendung geschützter Ribonukleosidphosphor- amidite, hergestellt.
Weiterhin können die siRNA Moleküle rekombinant durch gleichzeitige Expression beider Stränge in einer Zelle hergestellt werden, beispielsweise durch Expression unter der Kontrolle eines Pol III Promotors. Beispiele sind der U6 und der Hl Promotor.
Gemäß einer besonders bevorzugen Ausführungsform weisen die Antisense- Moleküle und siRNAs modifizierte Nukleinsäuren auf, vorzugsweise mit Phospho- thioat, Methylphosphonat oder Peptidbindungen modifizierte Nukleinsäuren.
Geeignete modifizierte Nukleinsäuren sind in Uhlmann & Peimann (1990; Chem. Ref. 90, 544) zusammengefasst (siehe auch Beigelman et al., 1995; Nucleic Acid Research 23:3989-94; Dudycz 1995, WO 95/11910; Macadam et al, 1998; WO 98/37240; Reese et al. 1997; WO 97/29116).
Modifizierte Intemukleotid Phosphatbrücken in einer Nukleinsäure, die bei einer der erfindungsgemäßen Verwendung eingesetzt werden können, enthalten z.B. Methylphosphonat, Phosophorothioat, Phosphoramidat, Phosphorodithioat, Phos- phatester, während nicht-Phosphat Internukleotidanaloga beispielsweise Silo- xanbrücken, Carbonatbrücken, Carboxymethylester, Acetamidatbrücken und/oder Thioetherbrücken enthalten.
Die erfindungsgemäßen Inhibitoren werden vorzugsweise im Rahmen einer topischen Behandlung verwendet. Bevorzugt ist, dass die Inhibitoren, bevorzugt die Nukleinsäuren, in die Epidermis eindringen können.
Die Erfindung betrifft ferner Inhibitoren von Mrp8 und/oder Mrp 14, welche Nukleinsäuren darstellen. Dabei gelten die oben definierten Ausführungsformen auch für diesen Aspekt der Erfindung.
Ferner betrifft die Erfindung auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren enthält, vorzugsweise in Kombination mit geeigneten Hilfs- oder Zusatzstoffen. Dabei sind die geeigneten Hilfs- oder Zusatzstoffe wie oben definiert.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Prävention und/oder Behandlung von hypertrophen Narben und/oder Keloiden in Patienten, bei dem eine wirksame Menge mindestens eines Mrp8- und oder Mrpl4 Inhibitors verabreicht wird. Dabei gelten die oben im Rahmen der erfindungsgemäßen Verwendung offenbarten Ausführungsformen auch für das erfindungsgemäße Verfahren.
Im Rahmen der vorliegenden Verwendung bedeutet der Ausdruck „wirksame Menge" eine Menge, die ausreicht, um ein gewünschtes physiologisches Ergebnis zu erreichen, entweder in in vitro behandelten Zellen oder in einem in vivo behandelten Subjekt. Genauer gesagt ist eine wirksame Menge eine pharmazeutisch wirksame Menge, die ausreicht, hypertrophe Narben und/oder Keloide zu behandeln. Die wirksame Menge kann von dem jeweiligen ausgewählten Inhibitor ab- hängen, und hängt außerdem von einer Vielzahl von Faktoren und Bedingungen ab, die sich auf das zu behandelnde Subjekt und die Schwere der Krankheit beziehen. Beispielsweise, falls der Inhibitor in vivo verabreicht wird, sind Faktoren wie Alter, Gewicht, Geschlecht und allgemeiner Gesundheitszustand des Patienten genauso wie Dosisantwortkurven und Toxizitätsdaten, die in vorklinischen Tierversuchen erhalten wurden, von Bedeutung. Die Bestimmung einer wirksamen Menge für einen bestimmten Inhibitor ist dem Fachmann bekannt. Vorzugsweise ist der Inliibitor in einer Konstruktion von 0,1 - 50 Gew.-% der pharmazeutischen Zusammensetzung vorhanden, besonders bevorzugt 1 - 30%.
Der Inhibitor kann einmal oder in wiederholten Dosen verabreicht werden. Wiederholte Dosen sind bevorzugt, bis die hypertrophen Narben und/oder Keloide verschwunden sind.
Die vorliegende Erfindung stellt somit erstmals Mittel bereit, mit denen hypertrophe Narben und oder Keloide behandelt werden können oder mittels derer diesen Erkrankungen vorgebeugt werden kann. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnte überraschenderweise gezeigt werden, dass Mrp8 und Mrpl4 spezifisch in hypertrophen Narben und Keloiden krankhaft hochreguliert sind, wobei die verstärkte Expression in den proliferierenden, suprabasalen Keratinozyten zu beobachten ist. Dagegen wird in intakter Haut und in normalen gesunden Narben, die immer nach einer Verwundung auftreten, keine Expression beobachtet. Somit wird insbesondere durch den Einsatz von siRNAs, die gegen Mrp8 und/oder Mrp 14 gerichtet sind, ein lokalspezifischer Therapie bzw. Präventionsansatz bereitgestellt, der auf proliferierende Keratinozyten und damit auf krankhafte Ver- narbungsprozesse beschränkt ist, während die normale Narbenbildung, die für den Abschluss des normalen Heilungsprozesses notwendig ist, nicht beeinträchtigt wird.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
Abbildung 1 : Sequenz einer humanen Mrp8 mRNA Targetsequenz gemäß SEQ ID NO:l Abbildung 2: Sequenz einer humanen Mrp 14 mRNA Targetsequenz gemäß SEQ ID NO:2.
Abbildung 3: Lokalisierung von Mrp8 und Mrp 14 mRNA in Narbengewebe. A: Expression von Mrp 14 (linke Abbildungen) und Mrp8 (rechte Abbildungen) in Keloiden (obere Abbildungen) im Vergleich zu intakter Haut (untere Abbildungen) desselben Menschen. Während in intakter Haut keine Färbung sichtbar ist wird sowohl bei Mrp8 als auch Mrp 14 eine starke Färbimg ausschließlich in suprabasalen Keratinozyten des Keloids beobachtet. Beispiele für angefärbte suprabasale Schichten sind mit einem Pfeil gekennzeichnet. B: Lokalisierung in normalen Narben eines gesunden Probanden. Es wurde keine Färbung beobachtet.
Abbildung 4: Nachweis der Mrp8 und Mrpl4 mRNA Expression in Narben- und Keloidbiopsien mittels TaqMan Analyse im Vergleich zu intakter Haut gesunder Probanden. Es wurde beobachtet dass spezifisch in hypertrophen Narben und Keloiden, jedoch nicht in normalen Narben gesunder Probanden eine starke Hochregulation der Expression sowohl von Mrp8 als auch Mrp 14 stattfindet. Weiterhin ist bei Keloidpatienten bereits in intakter Haut ein eine erhöhte Menge an Mrp8 und Mrp 14 zu beobachten, was zeigt dass die Expression von Mrp8 und Mrp 14 mRNA in der Haut ein geeigneter Marker zum Nachweis einer Keloidprädisposition ist.
Abbildung 5: Einfluss von siRNAs die gegen Mrp8 und/oder Mrp 14 gerichtet sind auf die Proliferation von HaCaT Keratinozyten. 2 typische Versuchsergebnisse sind gezeigt. Eine höhere Lumineszenz zeigt dabei eine erhöhte Proliferation an. Als Negativkontrolle wurde eine siRNA verwendet die gegen EGFP gerichtet ist (GFP-d3; Tabelle 7). Der Effekt von verschiedenen siRNAs die gegen Mrp8 (1333-dl, 1333-d3; Tab. 3) und Mrpl4 (1759-d2, 1759-d3; Tab. 4) gerichtet sind sowie Mischungen davon (1333-dl/1759-d3) wurden untersucht. Es wurde beobachtet dass bereits mit einer einzelnen siRNA ein voller therapeutischer bzw. präventiver Effekt erzielt werden kann. Abbildung 6: Einfluss von siRNAs die gegen Mrp8 und Mrp 14 gerichtet sind auf die Expression von Mrp8 und Mrp 14 Protein in Keratinozyten. A: Einfluss von siRNAs die gegen Mrp 8 gerichtet sind auf die Expression von Mrp8 Protein nachgewiesen mittels Western Blot. Der Effekt von verschiedenen siRNAs die gegen Mrp8 (1333-dl, 1333-d2, 1333-d3; Tab. 3) und Mischungen mit siRNAs die gegen Mrpl4 gerichtet sind (1333-dl/1759-d3; 1333-dl/1759-d2; Tab. 3, 4) wurde untersucht. Alle siRNAs bzw. siRNA Mischungen zeigten einen deutlichen inhibitorischen Effekt auf die Mrp8 Expression. Als Positivkonfrolle wurde rekombinant hergestelltes Mrp8/14 nachgewiesen. Als Negativkontrolle wurde der Einfluss der siRNA GFP-d3 untersucht. B: Einfluss von siRNAs die gegen Mrp 14 gerichtet sind auf die Expression von Mrp 14 Protein nachgewiesen mittels Western Blot. Der Effekt von verschiedenen siRNAs die gegen Mrp 14 (1759-dl, 1759-d2, 1759-d3; Tab. 3) und Mischungen mit siRNAs die gegen Mrp8 gerichtet sind (1333-dl/1759-d3; 1333-dl/1759-d2; 1333dl-1759-dl; Tab. 3, 4) wurde un- tersucht. Alle siRNAs bzw. siRNA Mischungen zeigten einen deutlichen inliibito- rischen Effekt auf die Mrp 14 Expression. Als Positivkontrolle wurde rekombinant hergestelltes Mrp8/14 nachgewiesen. Als Negativkontrolle wurde der Einfluss der siRNAs GFP-d3 und IGdl untersucht (Tab. 7). C: Effekt von siRNAs die gegen Mrp8 und/oder Mrpl4 gerichtet sind auf die Expression von Mrp8 und Mrpl4 mittels Western Blot. Der obere Blot zeigt einen Mrp 14 Western Blot; der untere Blot zeigt einen Mrp8 Western Blot. Es wurden Proben aus dem gleichen Versuchsansatz zum Nachweis beider Proteine aufgetragen. Spurbelegung: 1 : Marker; 2: Marker, 3: Negativkontrolle, mit GFP-d3 siRNA behandelte Zellen, 4: Negativkontrolle, mit IGD-dl siRNA (Tab.7) behandelte Zellen, 5: mit siRNA 1333- dl behandelte Zellen (Tab. 3), 6: mit siRNA 1759-d3 behandelte Zellen (Tab. 4), 7: mit siRNA Mischung 1333-dl/1759-d3 behandelte Zellen (Tab. 3, 4), 8: mit siRNA 1333-d3 behandelte Zellen (Tab. 3) 9: mit siRNA 1759-d2 behandelte Zellen (Tab. 4), 10: Kontrolle, unbehandelte Kontrollzellen.
Beispiele Beispiel 1: Spezifische Hochregulation von Mrp8 und Mrpl4 in hypertrophen Narben u. Keloiden
Zunächst wurde die Expression von Mrp8 und Mrp 14 mRNA in verschiedenen Narbengewebeschnitten untersucht. Die in situ Hybridisierung (nicht radioaktiv) ermöglicht den Nachweis von mRNA am Gewebeschnitt. Der Vorteil dieser Methode gegenüber der PCR ist, dass' ein Bezug zur Morphologie hergestellt werden kann. Zunächst wurden zur Sondenherstellung mit Hilfe folgender Primer Ampli- kons mittels PCR generiert:
1333-T3 -aat taa ccc tca cta aag gg gggaatttccatgccgtctacaag
1333-SP6- att tag gtg aca cta tag aat ac ccacgcccatctttatcaccag
- Mrp8 Sonde mit 171 bp Länge
1759-T3- aat taa ccc tca cta aag gg gtg tgg ctc ctc ggc ttt ga
1759-SP6- att tag gtg aca cta tag aat ac cat tct tat tct cct tct tga
- Mrp 14 Sonde mit 200 bp Länge
Die Amplikons wurden gelelektrophoretisch aufgetrennt, dokumentiert und die spezifische Bande mit dem Skalpell ausgeschnitten, um anschließend das PCR Produkt mit dem QIAquick Extraction Kit (Qiagen, Hilden) zu eluieren. Die gereinigten Amplikons wurden nach Angaben des Herstellers in das Plasmid TOPO 2.1 (Invitrogen, Karlsruhe) kloniert und in kompetente Zellen (TOP 10) transformiert. Die Bakterienanzucht (Transformanten) und Plasmidisolation wurden gemäß Standardtechniken (Sambrook et al., 1989) durchgeführt. Klone mit rekom- binanten Plasmid (=weiß) wurden gepickt und erneut in flüssigem LB-Medium angezüchtet. Nach Aufreinigung der Plasmide über eine Silica Säule (QIAprep Spin Miniprep Kit, Qiagen, Hilden) wurden die rekombinanten Plasmide zur Ü- berprüfung des Inserts sequenziert. Zur Markierung der Sonden mit Digoxigenin- 11-dUTP ("random primed" DNA-Markierung) mittels in vitro Transkription wurde der DIG RNA Labeling Kit (Röche, Mannheim) verwendet und die Transkripte anschließend präzipitiert und gelelektrophoretisch überprüft. Anti- sense-Sonden wurden über SP6 RNA Polymerasen generiert, während die Sense- Sonde (Negativ-Kontrolle) mit T3 RNA Polymerase transkribiert wurde.
In situ Hybridisierung:
An kryo-fixierten (PFA) Schnitten (8μm) wurden in situ Hybrisierungsfarbungen mit den oben beschriebenen für rnrp8 als auch mrp 14 spezifischen Sonden vorgenommen. Folgende Biopsien wurden verwendet: keloide Narbe und gesundes A- real des gleichen Patienten sowie intakte Haut eines gesunden Patienten und normale, „gesunde" Narbe eines gesunden Patienten. Die Schnitte wurden nach ent- sprechender Vorbereitung (Trocknen, Proteinase K Verdau, Fix, Acetylierung) zunächst mit Hybridisierungs-Lösung (ohne Sonde) versetzt und bei 55°C (lh) inkubiert. Danach wurde die Lösung durch eine Hybridisierungs-Lösung (Anti- sense- bzw. Sense-Sonde enthalten, 80 ng/20 μl) ersetzt. Die Schnitte wurden über Nacht bei 55°C inkubiert. Anschließend wurden mehrere Waschschritte (SSC (2x) ± 50% Formamid-Puffer) durchgeführt, um ungebundene Sonden zu entfernen. Nach RNAse Verdau (20 μg/ml NTE-Puffer) und mehreren Waschschritten (SSC (0,lx) bzw. PBT (lx) sowie Waschpuffer (Röche, Mannheim)) wurden die Schnitte in Blockierungspuffer (Röche, Mannheim) 30 min inkubiert. Nach Entfernen des Puffers wurde ein mit alkaline Phosphatase konjugierter anti-DIG An- tikörper (Verdünnung: 1:100) versetzter Blockierungspuffer zugesetzt und die Schnitte 2h darin inkubiert. Nach mehrmaligem Waschen (Waschpuffer, Röche) wurden die Schnitte in Detektionspuffer (Röche, Mannheim) äquilibriert und anschließend in Färbelösung (NBT/BCIP, 200 μl/10 ml Detektionspuffer) überfuhrt und die Schnitte 2 bis 24 h darin inkubiert. Nach Abstoppen der Reaktion wurden die Schnitte mit ddH2O gewaschen, mikroskopisch betrachtet und ausgewertet. Alle Hybridisierungsschritte wurden unter RNAse-freien Bedingungen durchge- führt. Alle Puffer und Lösungen wurden mit DEPC (Diethylpyrocarbonat) versetzt. Glaswaren wurden vor Gebrauch mit Hitze behandelt.
Die Ergebnisse des Versuchs sind in Abbildung 3 zusammengestellt. Sowohl Mrp8 als auch Mrp 14 mRNA wurde mittels in situ Hybridisierung spezifisch in den unteren suprabasalen, proliferierenden Zellschichten der keloiden Narbe de- tektiert, während in intakter Haut sowohl des Keloidpatienten als auch des gesunden Probanden wie auch in der normalen Narbe des gesunden Probanden keine Expression detektiert wurde. Mrp8 und Mrp 14 zeigten ein vergleichbares Expres- sionsprofil. Die Negativ-Kontrolle (Sense-Sonde) zeigte keine Färbung der Schnitte.
Um die Expressionsunterschiede in Narbengewebe bzw. intakter Haut zu quantifizieren, wurde die Expression von Mrp8 und Mrp 14 mRNA mittels TaqMan- Analyse in Biopsien nachgewiesen.
Dazu wurden von gesunden Probanden aus intakter Haut sowie aus normalen Narben Stanzbiopsien entnommen. Weiterhin wurden von Patienten mit hypertrophen Narben Biopsien von Narbengewebe und intakter Haut entnommen. Außer- dem wurden von Patienten mit Keloiden Biopsien von Keloid und intakter Haut entnommen. Aus allen Biopsien wurde RNA isoliert. Dazu wurden die Biopsien in RNAclean-Puffer (AGS, Heidelberg), dem 1/100 Volumenanteil 2-Mercapto- ethanol zugesetzt worden war, unter Verwendung eines Dispersers homogenisiert. Anschließend wurde die RNA durch zweimaliges Phenolisieren mittels mit Was- ser gesättigtem saurem Phenol und in Gegenwart von l-Bromo-3-Chloro-Propan extrahiert. Anschließend wurden eine Isopropanol- und eine Ethanol-Fällung durchgeführt und die RNA mit 75% Ethanol gewaschen. Danach wurde ein DNAse I Verdau der RNA durchgeführt. Hierzu wurden 20 μg RNA (ad 50 μl mit DEPC-behandeltem Wasser) mit 5,7 μl Transkriptionspuffer (Röche), 1 μl RNAse Inhibitor (Röche; 40 U/μl) und 1 μl DNAse I (Röche; 10 U/μl) 20 min bei 37°C inkubiert. Dann wurde wiederum 1 μl DNAse I zugegeben und weitere 20 min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die RNA phenolisiert, Ethanol-gefällt und gewaschen. Alle oben aufgeführten Schritte wurden mit DEPC (Diethylpyrocar- bonat)-behandelten Lösungen bzw. Flüssigkeiten durchgeführt, soweit diese keine reaktiven Aminogruppen enthielten.
Anschließend erfolgte die Herstellung von cDNA aus der extrahierten RNA. Dies erfolgte in Gegenwart von 1 x TaqMan RT-Puffer (Perkin Eimer), 5,5 mM MgCl2 (Perkin Eimer), je 500 μM dNTPs (Perkin Eimer), 2,5 μM Random Hexamere (Perkin Eimer), 1,25 U/μl MultiScribe Reverse Transcriptase (50 U/μl Perkin Eimer), 0,4 U/μl RNase Inhibitor (20 U/μl, Perkin Eimer), 20 μl RNA (50 ng/μl) und DEPC-behandeltem Wasser (ad 100 μl Volumen). Nach Zugabe der RNA und guter Durchmischung wurde die Lösung auf zwei 0,2 ml Gefäße verteilt (je 50 μl) und die reverse Transkription in einem Temperatur-Cycler durchgeführt (10 min bei 25°C; 30 min bei 48°C und 5 min bei 95°C). Die nachfolgende Quantifizierung der cDNA erfolgte mittels quantitativer PCR unter Verwendung des SYBR Green PCR Master Mixes (Perkin Eimer), wobei für die Bestimmung der Mrp8 bzw. Mrp 14 cDNA Menge eine Dreifachbestimmung durchgeführt wurde. Als Referenz wurde Cyclophilin A (Gen Bank: XM039526) verwendet. Die Stammlösung für jedes Triplett enthielt bei 57 μl Gesamtvolumen 37,5 μl 2 x SYBR Master Mix, 0,75 μl AmpErase UNG (1 U/μl) und 18,75 μl DEPC- behandeltes Wasser. Pro Dreifachbestimmung wurden zu 57 μl Stammlösung je 1,5 μl Vorwärts- und Rückwärts-Primer in einem zuvor optimierten Konzentrationsverhältnis hinzugefügt. Je 60 μl der Stammlösung/Primer-Mischung wurde mit 15 μl cDNA-Lösung (2 ng/μl) gemischt und auf drei Wells verteilt. Parallel dazu wurde eine Stammlösung mit Primern zur Bestimmimg von Cyclophilin A herge- stellt, mit weiteren 15 μl der gleichen cDNA-Lösung gemischt und auf drei Wells verteilt. Außerdem wurden, um eine Standardkurve für die Cyclophilin-PCR zu erstellen, verschiedene cDNA-Lösungen als Verdünnungsreihe hergestellt (4 ng/μl; 2 ng/μl; 1 ng/μl; 0,5 ng/μl und 0,25 ng/μl). Je 15 μl dieser cDNA-Lösungen wurden mit 60 μl Stammlösung/Primer-Mischung zur Bestimmung von Cyclophi- lin gemischt und auf drei Wells verteilt. Ebenso wurde eine Standardkurve für Mrp8 bzw. Mrp 14 erstellt; dabei wurden dieselben Verdünnungen, die auch für die Cyclophilin-Standardkurve zum Einsatz kamen, verwendet. Als Kontrolle diente ein PCR Ansatz ohne cDNA. Zu jeweils 60 μl Stammlösung/Primer- Mischung von jeweils humanem Mrp8 bzw. Mrp 14 und Cyclophilin wurden je 15 μl DEPC-Wasser gegeben, gemischt und jeweils auf drei Wells verteilt. Die Amplifikation der Ansätze wurde im GeneAmp 5700 durchgeführt (2 min bei 50°C; 10 min bei 95°C, gefolgt von 3 Zyklen mit 15 sek bei 96°C und 2 min bei 60°C; danach 37 Zyklen mit 15 sek bei 95°C und 1 min bei 60°C). Die Auswertung erfolgte durch die Bestimmung der relativen Abundanz von Mrp8 und Mrp 14 in Bezug auf die Cyclophilin Referenz. Dazu wurde zuerst eine Standardkurve erstellt, indem die Cr- Werte der Verdünnungsreihe gegen den Logarithmus der cDNA-Menge im PCR- Ansatz (in ng umgeschriebener RNA) aufgetragen wurden und die Steigung (s) der Geraden ermittelt wurde. Die Effizienz (E) der PCR ergibt sich dann wie folgt: E = 10"1/s - 1. Die relative Abundanz (X) der untersuchten cDNA Spezies (Y) in Bezug auf Cyclophilin ist dann: X=(l+ECyciophiiin)Cτ(Cyclophilin)/(l+Eγ)c τ (Y . Anschließend wurden die Zahlenwerte normiert, indem die Menge an cDNA aus intakter Haut gesunder Probanden 1 gesetzt wurden. Die Ergebnisse sind in Abbildung 4 zusammengestellt.
Es zeigte sich, dass, wie bereits oben gezeigt, eine spezifische Fehlregulation von Mrp8 und Mrp 14 mRNA in krankhaftem Narbengewebe, aber nicht in gesundem Narbengewebe auftritt: sowohl in hypertrophen Narben als auch in Keloiden ist die Expression beider mRNAs stark erhöht, während in normalen Wunden keine Erhöhung der Expression gegenüber intakter Haut festgestellt wurde. Dies zeigt, dass die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren zur Therapie und/oder Prävention von hypertrophen Narben und Keloiden eingesetzt werden können, da eine spezifische Fehlregulation in erkranktem Gewebe vorliegt. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass Mrp8 und Mrp 14 geeignet sind eine Prädisposition für Keloide zu diagnostizieren, da sowohl für Mrp8 und Mrp 14 erhöhte Mengen an mRNA in intakter Haut von Keloidpatienten gefunden wurde im Vergleich zu intakter Haut von gesunden Probanden.
Beispiel 2: Einfluss von siRNAs die an Mrp8 oder Mrpl4 binden auf die Proliferation von Keratinozyten Um den Einfluß von Mrp8 und Mrp 14 auf die Proliferation von Keratinozyten zu untersuchen, wurde die Expression der beiden Gene durch die Transfektion genspezifischer siRNAs inhibiert und der Einfluß auf die Zeilproliferation über einen Vitalitätsassay analysiert. Dazu wurden siRNAs, die gegen Mrp8 oder Mrp 14 gerichtet sind eingesetzt, sowie Mischungen aus siRNAs die gegen Mrp8 und Mrp 14 gerichtet sind. Die Basissequenz und Aufbau verwendeter siRNAs sind in Tabellen 3 und 4 aufgeführt: 1333-dl, 1333-d3, 1759-d2, 1759-d3. Die in den Tabellen angegebenen Basissequenzen stellen die ersten 19 Nukleinsäuren des Sense-Strangs des siRNA Moleküls dar. Alle siRNAs waren aus je zwei RNA Strängen aufgebaut die im Bereich der angegebenen 19 Nukleotide langen Sequenz komplementär waren (d.h. Watson-Crick Basenpaarung) und am 3 '-Ende jeweils 2-Nukleotide lange dTdT-Überhänge hatten. Als Negativkontrolle wurde eine EGFP spezifische siRNA (GFP-d3, Tab. 7) fransfiziert. Zur Durchführung dieses Assays wurden HaCaT Zellen verwendet, welche in DMEM (GIBCO™) mit 10% FCS (PAN™) kultiviert werden. Der gesamte Assay lief über einen Zeitraum von 5 Tagen. Die Zellen wurden mit einer Zellzahl von 150.000 Zellen pro Well 24 Stunden vor der ersten Transfektion in eine 24-Well-Platte (BD Falcon) ausgesät. Die lyophilisierten siRNAs wurden auf eine Konzentration von 20 μM eingestellt. Der 1. Teil des Transfektionsansatzes wurde durch vorsichtiges Mischen von 9μl Optimem I (GIBCO™) mit 6μl Oligofectamin™ (Invitrogen) hergestellt. Das Gemisch wurde 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Während dieser Inkubationszeit wurde der 2. Teil, bestehend aus 47 μl Optimem I und 6 μl siRNA (Bei einer Kombination zweier siRNAs, je 3 μl), in einem neuen Eppen- dorfgefäß vorgelegt. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde der 1. Teil in den 2. Teil pipettiert, vorsichtig vermischt und weitere 22 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend folgte eine Zugabe von 182μl Optimem I. Das Kulturmedium wurde von den Zellen abgesaugt und die Zellen einmal mit Optimem I gewaschen. Anschließend wurden 250μl Transfektionsansatz/Well auf die Zellen gegeben und diese 4 h im Brutschrank (37°C/10% CO2/95% rH) inkubiert. Nach der Inkubationszeit erfolgte die Zugabe von 150μl DMEM/30% FCS zur Regeneration der Zellen über Nacht. Am darauf folgenden Tag wurde die Transfektion wie oben beschrieben wiederholt mit dem einzigen Unterschied, dass die Zellen vor Zugabe des Transfektionsansatzes nicht mit Optimem I gewaschen wurden, da sie hierdurch austrocknen würden. Um dies zu verhindern gibt man vor dem Absaugen des Mediums DPBS (PAN™ Biotech GmbH) in die Wells. Am 5. Tag, 48 h nach der 2. Transfektion, wurde die Zeil Vitalität mit Hilfe des CellTiter-Glo™ Lumineszenz Zellvitalitätsassays von Promega analysiert. Hierfür wurde der Ü- berstand abgesaugt, die Zellen mit PBS gewaschen und dann 200μl CellTiter- Glo/Well auf die Zellen gegeben. Die Platte wurde 10 min bei RT auf dem Rotationsschüttler inkubiert, anschließend lOOμl in eine 96-Well-Platte (BD Falcon) überführt und die Lumineszenz im Fusion™α (Packard BioScience) gemessen.
Die Versuche wurden mehrfach durchgeführt; 2 repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 5 dargestellt. Übenaschenderweise wurde zum ersten Mal gefunden, dass siRNAs die gegen Mrp8 und/oder Mrp 14 gerichtet sind, die Proliferation von Keratinozyten hemmen und somit diese siRNAs zur Prävention und/oder Therapie von von hypertrophen Narben und Keloiden. eingesetzt werden können. Darüber hinaus wurde überraschenderweise festgestellt dass die Gabe einer siRNA die gegen Mrp8 oder Mrp 14 gerichtet ist, ausreicht, um den Effekt zu erreichen, die eine Mischung von siRNAs die gegen Mrp8 und Mrp 14 gerichtet sind, bewirkt (siehe Abbildung 5). Somit haben die neuen Nukleinsäuren den übenaschenderweise Vorteil, dass die Gabe einer einzelnen Nukleinsäure, einer dsRNA, ausreicht um den vollen therapeutischen Effekt zu eneichen.
Beispiel 3: Einfluss von siRNAs die an Mrp8 oder Mrpl4 binden auf Expres- sion von Mrp8 und Mrpl4
Es wurde untersucht, ob die verwendeten siRNAs, die gegen Mrp8 oder Mrp 14 gerichtet sind, tatsächlich die Expression von Mrp8 oder Mrp 14 beeinflussen. Verwendete siRNAs sind in Tabellen 4 und 3 aufgeführt (siehe auch Beispiel 1): 1333-dl, 1333-d2, 1333-d3, 1759-dl, 1759-d2, 1759-d3. Als Positivkontrolle wurde eine IGF-RI spezifische siRNA (IGd-1; Tabelle 7) und als Negativkontrolle eine EGFP spezifische siRNA (GFP-d3, Tab. 7) transfiziert. Zur Durchführung dieses Assays wurden HaCaT Zellen verwendet, welche nach stabiler Transfektion mit Mrp8 und Mrpl4-Expressions-Plasmiden, beide Proteine überexprimieren ( HaCaT mrp8pl4n; S. Werner, ETH Zürich). Diese Zellen wurden in DMEM (GIBCO™) mit 10% FCS (PAN™), 0,lmg/ml Puromycin (SIGMA™) und 0,4mg/ml Geneticin (GIBCO™) kultiviert. Der gesamte Assay lief über einen Zeitraum von 4 Tagen. Die Zellen wurden mit einer Zellzahl von 100.000 Zellen pro Well 24 Stunden vor der ersten Transfektion in eine 24-Well-Platte (BD Fal- con) in DMEM (GIBCO™) mit 10% FCS (PAN™) ohne Antibiotika ausgesät. Die lyhophilisierten siRNAs wurden auf eine Konzentration von 20 μM einge- stellt. Der 1. Teil des Transfektionsansatzes wurde durch vorsichtiges Mischen von 9μl Optimem I (GIBCO™) mit 6μl Oligofectamin™ (Invitrogen) hergestellt. Das Gemisch wurde 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Während dieser Inkubationszeit wurde der 2. Teil, bestehend aus 47 μl Optimem I und 6 μl siRNA (Bei einer Kombination zweier siRNAs, je 3 μl), in einem neuen Eppendorfgefäß vorgelegt. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde der 1. Teil in den 2. Teil pipet- tiert, vorsichtig vermischt und weitere 22 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend folgte eine Zugabe von 182μl Optimem I. Das Kulturmedium wurde von den Zellen abgesaugt und die Zellen einmal mit Optimem I gewaschen. Anschließend wurden 250μl Transfektionsansatz/Well auf die Zellen gegeben und diese 4 h im Brutschrank (37°C/10% CO2/95% rH) inkubiert. Nach der Inkubationszeit erfolgte die Zugabe von 150μl DMEM/30% FCS zur Regeneration der Zellen über Nacht. Am darauf folgenden Tag wurde die Transfektion wie oben beschrieben wiederholt mit dem einzigen Unterschied, dass die Zellen vor Zugabe des Transfektionsansatzes nicht mit Optimem I gewaschen wurden, da sie hier- durch austrocknen würden. Um dies zu verhindern gibt man vor dem Absaugen des Mediums DPBS (PAN™ Biotech GmbH) in die Wells. Am 4. Tag, 24 h nach der 2. Transfektion, wurden die Zellen für die anschließende Western-Blot- Analyse geerntet. Dazu wurde das Medium abgesaugt, und die Zellen einmal mit DPBS gewaschen. Durch Zugabe von 50μl/ Well Roti®-Loadl-Proteinauftrags- puffer (ROTH) wurden die Zellen lysiert. Das Zell-Lysat wurde für 5 min auf 95°C erhitzt und durch Zentrifugation mit QIAshredder (QIAGEN) homogeni- siert. Die Western-Blot-Analyse wurde mit dem XCell SureLock™ Mini-Cell- und XCell II™ Blot Module-System und 18% Novex® Tris-Glycin Gelen mit 10 Taschen (INVITROGEN) dmchgeführt. Von jeder Probe wurden je 25 μl auf zwei Gele aufgetragen. Die Laufzeit der SDS-PAGE betrug 2,5h bei 130V und die Transferzeit auf die Nitrozellulose-Membran (AMERSHAM Biosciences) lh bei 25V. Der Nachweis von Mrp8 erfolgte mit einem Maus-anti-Mrp8-Biotin Antikörper (Dianova) und Steptavidin-HRP (R&D Systems) jeweils in einer 1:200 Verdünnung. Der Nachweis von Mrp 14 erfolgte mit einem Kaninchen-anti-Mrpl4 Antikörper (J. Roth, Universitätsklinikum Münster) in einer 1:500 Verdünnung und einem Maus-anti-Kaninchen-Ig-HRP Antikörper (Promega) in einer 1:5000 Verdünnung. Zur Kontrolle der Gesamtproteinmenge in jeder Spur wurde die Membran nach dem Transfer bei einer Laufhöhe von 36kDa geteilt und der obere Teil der Membran mit einem Maus-anti-Aktin Antikörper (Chemicon) und einem anti-Maus-Ig-HRP Antikörper jeweils in einer 1 :5000 Verdünnung gefärbt. Für die Chemilumineszenz-Reaktion und deren Nachweis wurde das ECL™ Western Blotting Detection Reagent und ECL™ Hyperfilm (AMERSHAM Biosciences) verwendet.
In einem ersten Ansatz wurde der Einfluss der siRNAs 1333-dl, 1333-d2 und 1333-d3 sowie Mischungen von 1333-dl mit 1759-d2 und 1759-d3 auf die Expression von Mrp8 Protein untersucht. Das Ergebnis ist in Abb. 6 A dargestellt: Erwartungsgemäß bewirken alle siRNAs und siRNA Mischungen eine verminderte Menge an Mrp8 Protein, da jeweils eine gegen Mrp8 gerichtete siRNA fransfi- ziert wurde (wenn auch z.T. in einer Mischung mit einer weiteren siRNA, die ge- gen Mrp 14 gerichtet ist). Dagegen wurde bei Verwendung der GFP-d3 Kontroll- siRNA keine verminderte Expression beobachtet. In einem weiteren Ansatz wurde der Einfluss der siRNAs 1759-dl, 1759-d2 und 1759-d3 sowie Mischungen von 1759-dl, 1759-d2 und 1759-d3 mit 1333-dl auf die Expression von Mrpl4 Protein untersucht. Das Ergebnis ist in Abb. 6 B dargestellt: Erwartungsgemäß bewir- ken alle diese siRNAs und siRNA Mischungen eine verminderte Menge an Mrp 14 Protein, da jeweils eine gegen Mrp 14 gerichtete siRNA transfiziert wurde (wenn auch z.T. in einer Mischung mit einer weiteren siRNA, die gegen Mrp8 gerichtet ist). Dagegen wurde bei Verwendung der IG-dl und GFP-d3 Kontroll-siR As keine verminderte Expression beobachtet. In einem weiteren Versuch wurde gestestet ob siRNAs die gegen Mrp8 gerichtet sind einen Einfluss auf die Menge an M l4 Protein haben und umgekehrt. Dazu wurden wiederum die Mφ8 und Mφl4 überexprimierenden HaCaT Zellen mit siRNAs die gegen Mrp8 gerichtet sind (1333-dl, 1333-d3), sowie siRNAs die gegen Mφl4 gerichtet sind (1759-d2, 1759-d3) sowie Mischungen davon transfiziert und anschließend die Proben parallel auf Mφ8 und M l4 mittels Western Blot analysiert. Als Kontrolle wurden siRNAs IgD-dl und GFP-d3 eingesetzt. Als Positivkontrolle für den Western Blot wurde rekombinantes Mφ8/Mrpl4 mit aufgefragen. Die Ergebnisse sind in Abb. 6 C zusammengestellt. Übereaschenderweise wurde festgestellt, dass siRNAs, die gegen Mφl4 gerichtet sind, eine Erniedrigung der Mφ8 und Mφl4 Menge in gleichem Masse bewirken (siehe z.B. Spur 6 Mφ8 und Mφl4 Blots vs. Spur 3 (Kontrolle)) und dass siRNAs, die gegen Mφ8 gerichtet sind, eine Eraied- rigung der Mφ8 und Mφl4 Menge in gleichem Masse bewirken (siehe z.B. Spuren 5, 8 Mφ8 und Mφl4 Blots vs. Spur 3 (Kontrolle)). Außerdem ist übena- schenderweise festgestellt worden dass der Einsatz von Mischungen aus siRNAs die gegen Mφ8 und Mφl4 gerichtet sind keinen zusätzlichen Effekt auf die Expression haben. Somit konnte bestätigt werden dass die erfindungsgemässen Nuk- leinsäuren geeignet sind sowohl Mφ8 und Mφl4 Proteinmengen in HaCaT Zellen zu verringern und somit eine Veningerung der Zellproliferation bewirken, wie in Beispiel 2 gezeigt.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung mindestens eines Mφ8- und/oder eines Mφl4 Inhibitors zur Herstellung eines Medikaments zur Prävention und/oder Behandlung von hypertrophen Narben und/oder Keloiden.
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen Inhibitor von humanem Mφ8 und/oder humanem Mφl4 handelt.
3. Verwendung nach einem der Ansprüche 1-2, dadurch gekennzeichnet, dass ein Inhibitor verwendet wird.
4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Nukleinsäuren, Antiköφern, anderen natürlichen oder synthetischen Proteinen und Peptiden, die beispielsweise eine erhöhte Degradation von Mxp8 und/oder Mφl4 bewirken, Molekülen mit geringem Molekulargewicht (LMWs) und Mφ8/Mφl4 Rezeptor- Antagonisten.
5. Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor eine Nukleinsäure ist.
6. Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Nuklein- säure ein Antisense-Molekül oder eine siRNA ist, vorzugsweise eine siRNA.
7. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Sense- Strang der siRNA oder der doppelsträngige Anteil des Sense-Stranges der siRNA eine wie in SEQ ID NO:3-946 dargestellte Sequenz aufweist oder umfasst.
8. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeiclmet, dass die SEQ ID NO ausgewählt ist aus den Nummern 164, 202, 230, 548, 649, 712.
9. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Anti- sense-Molekül eine komplementäre Sequenz zu einer der in SEQ ID
NO:3-946 dargestellten Sequenzen oder Teilen davon aufweist.
10. Verwendung nach einem der Ansprüche 5 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Antisense-Molekül modifizierte Nukleinsäuren aufweist, vor- zugsweise Phosphothioat-, Methylphosphonat- oder Peptidbindungen.
11. Mφ8 oder M l4 Inhibitor, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Nukleinsäure, wie in den Ansprüchen 6-10 definiert, ist.
12. Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend einen Inhibitor gemäß Anspruch 11.
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