WO2004106922A1 - Método y aparato para la detección de sustancias o analitos a partir del análisis de una o varias muestras - Google Patents

Método y aparato para la detección de sustancias o analitos a partir del análisis de una o varias muestras Download PDF

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WO2004106922A1
WO2004106922A1 PCT/ES2004/000244 ES2004000244W WO2004106922A1 WO 2004106922 A1 WO2004106922 A1 WO 2004106922A1 ES 2004000244 W ES2004000244 W ES 2004000244W WO 2004106922 A1 WO2004106922 A1 WO 2004106922A1
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PCT/ES2004/000244
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French (fr)
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Javier Gomez-Elvira Rodriguez
Eduardo Sebastian Martinez
Carlos Briones Llorente
Victor Parro García
José Antonio RODRÍGUEZ MANFREDI
Carlos COMPOSTIZO SAÑUDO
Pedro Luis Herrero Gonzalo
Juan PÉREZ MERCADER
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Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Instituto Nacional de Tecnica Aeroespacial Esteban Terradas
Sener Ingenieria y Sistemas SA
Original Assignee
Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Instituto Nacional de Tecnica Aeroespacial Esteban Terradas
Sener Ingenieria y Sistemas SA
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
    • G01N1/31—Apparatus therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/286—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q involving mechanical work, e.g. chopping, disintegrating, compacting, homogenising
    • G01N2001/2866—Grinding or homogeneising

Definitions

  • the present invention relates to an apparatus for the detection of substances or analytes from the analysis of one or several samples, which allows the analysis of a large number of samples at the same time and which can also be managed by remote control. .
  • the invention also includes the method for the detection of such substances-or analytes.
  • biosensors that is, detection systems based on the molecular properties of living beings
  • biotechnological revolution since they allow the assessment of the existence of certain substances in a medium, and the analysis of their characteristics (among them, its possible toxicity or pathogenicity).
  • Biocatalysis a substance that is a contaminating compound
  • metabolic a substance that is a contaminating compound
  • transduction systems can be electrochemical, optical-electronic, optical or acoustic.
  • the catalytic transformation of a substance for example, a contaminating compound
  • a substance for example, a contaminating compound
  • the inhibition of an enzyme by said substance are the two basic operating mechanisms of biocatalysis-based biosensors.
  • Examples of the first are the use of tyrosinase for the detection of phenols (Chen WJ, 1995; Marko-Varga et al., 1995), or the use of organophosphate hydrolase for the detection of organophosphorus pesticides (Mulchandani et al. ., 2000).
  • tyrosinase for the detection of phenols
  • organophosphate hydrolase for the detection of organophosphorus pesticides
  • organophosphorus pesticides Mechandani et al. ., 2000.
  • the limitations inherent to these systems are the reduced number of contaminants that are known enzyme substrates, the need for relatively high concentrations of the contaminant to be detected, the presence of inhibitors in the environment, the need to use additional substrates, cofactors or mediators, development reagents, etc.
  • the irreversible nature of many enzyme-substrate interactions makes the biosensor not reusable.
  • bioaffinity biosensors with environmental applications were based on the use of antibodies due to the availability of Monoclonal and polyclonal antibodies against a high number of polluting substances (Van Emon and López-Avila, 1992; Marco et al., 1995), so that immunosensors constitute the type of biosensor most used for environmental purposes.
  • immunosensors there is a wide range of commercial formats and kits (both reusable and single use) that allow addressing such important aspects as multifunctionality, format versatility, test time, sensitivity, costs, reproducibility, conservation, etc.
  • biosensors based on affinity reactions between nucleic acids (specific hybridization) for environmental applications has only just begun. Examples of applications of this type of biosensors are the detection of DNA damage caused by chemical agents (Fojta and Palecek, 1997) or the detection of microorganisms through the use of species-specific DNA probes (Cheng et al., 1998) .
  • PE Biosystems www.pebiosvstems.com markets kits for the detection and identification of bacteria based on the amplification and sequencing of a universal gene, the gene that encodes 16S ribosomal RNA.
  • biosensors In the field of biomedicine there are also various types of biosensors, based on the antigen-antibody reaction or the specific hybridization of nucleic acids, for the detection and quantification of pathogenic microorganisms. Immunoassay detection techniques have been developed, in different formats, for the detection of bacterial and viral pathogens. The more refined variants of these techniques allow even quantifying the existing pathogen in a body fluid, such as those of "quantitative LCx-RNA" developed by Abbott (www.abbottdiaqnostics.com).
  • Another biological recognition system is based on the study of microbial metabolism.
  • the measurement of the increase in the concentration of a compound based on cellular respiration or inhibition of breathing said compound, and the specific recognition of promoters or regulators of gene expression by the compound, are examples of this type of biosensors (Karube, 1990; Riedel, 1998).
  • Genetically modified microorganisms have been developed, by transformation with plasmids that carry reporter genes (luciferase, beta-galactosidase, etc.) under the control of a promoter recognized by the analyte of interest, which recognize and detect the presence of environmental contaminants.
  • DNA microarray technology also called DNA chips or microchips (Southern et al., 1994; for a review see Nature Genetics 21, supplement, 1999), allows covalently fix to a solid support (glass, nitrocellulose , nylon etc.) thousands of molecular probes (nucleic acids, proteins, carbohydrates, etc.), thus constituting a considerable advance both scaling and possible development of biosensors bioaffinity.
  • DNA chips can be applied to studies of gene expression, genome resequencing and genotyping, mainly. It is possible to analyze the expression at the RNA level of thousands of genes from samples of diseased tissues (cancer, infected by viruses, bacteria, fungi, etc.) or the infectious agents themselves (Cheng et al., 1998). The discovery of the genes involved in these processes to find and design new drugs, new diagnostic methods, etc. Resequencing and genotyping studies allow to discover mutations and polymorphisms of a nucleotide (SNPs) in the organisms studied (Hacia et al., 1999).
  • SNPs nucleotide
  • Another field of application of DNA chips is the identification of species of microorganisms, mainly of the variants or strains (more or less virulent) of the same species (Gingeras et al., 1998), either for clinical purposes (resistance to drugs, toxins, pathogenicity factors, etc.) or for ecological purposes (biodiversity, polymorphic dispersion, etc.).
  • Gingeras et al. they constructed a DNA chip with oligonucleotides interrogating all the positions (in the two chains) of a 705 bp DNA fragment of the rpoB gene of Mycobacterium tuberculosis, to analyze in a collection of 63 clinical isolates of M.
  • tuberculosis the existence of mutations that confer resistance to rifampin.
  • Species identification is based on the existence of specific polymorphisms of species that can be easily determined with a DNA microchip.
  • Another example of the use of DNA chips to identify bacteria is US Patent No. 5,925,522, where Wong et al. (1999) describe methods for the detection of Salmonella using DNA chips with specific oligonucleotide sequences.
  • infectious Gram-negative bacteria may be present in less than 10 copies per milliliter (mi) of blood or drinking water
  • viruses such as that of human immunodeficiency may exist in less than 5 copies per mi of blood in an infected patient
  • infectious agents such as Escherichia coli and Salmonella can manifest in less than 10 copies per gram of food.
  • European patent number EP1179585, A3 provides a solution to the problem of applying large volumes to microfluidic-based analysis systems, by incorporating microfluidic chips or components in larger cartridges containing any combination of channels, cameras, reservoirs or regions of detection and processing.
  • a tool for separating analytes from a fluid and concentrating them in a volume smaller than the original is described.
  • Such analytes can be from organisms, cells, proteins, nucleic acids, carbohydrates, viral particles, chemical or biochemical compounds, although the preferred use is for the detection of nucleic acids.
  • the characterization of contaminated areas should be carried out by a combination of laboratory analytical methods and diagnostic and on-site tracking methods. Once a key marker has been identified, the field methods allow mapping its spatial and temporal distribution, as well as accurate monitoring throughout an eventual remediation process.
  • a great variety of laboratory techniques based on biosensors to detect and measure the concentration of biomarkers in a medium or in an organism have been described, and many of them already commercialized. A large number of such techniques are carried out by instruments and robotic semiautomatic way. Such instruments, in addition to their complexity, large size and high economic cost, must compete with other field methods such as immunoassays, chemical test kits, and other miniaturized laboratory techniques, apart from the marketing obstacles common to such products.
  • biosensor instrument must be versatile enough to measure several elements and in a wide range of concentrations, have a small size, as well as being able to detect complex chemical compounds automatically, continuously and by remote control.
  • Equipment of these characteristics are those indicated for the continuous monitoring of analytes in fixed stations of rivers, seas, lakes, etc., or to be incorporated into a mobile system (for example, a robot) that allows analyzing samples at different points of soils or media aquatic
  • the present invention aims to eliminate the disadvantages exposed by the development of a robotic apparatus capable of remote control operation and to a method that allows the analysis of multiple natural samples, and the simultaneous detection and characterization from tens to thousands of different analytes in One essay
  • the present invention benefits from the recent development of DNA and protein microarray technology, which has greatly increased the analysis capacity and detection sensitivity, allowing the study of biological, biomedical and biosanitary problems.
  • the treatment of the sample to be analyzed is considerably reduced and the whole process is done in a robotic way.
  • the invention includes an apparatus capable of processing volumes ranging from nanoliters to milliliters of a liquid sample (body fluids, water), or a suspension (of soil, sediment or previously crushed rock); and a method for detecting at least one analyte in the simple manner without purifying or concentrating the sample.
  • the apparatus comprises a number of operating modules, which are handled, treated and analyzed samples, and a series of control modules, operating modules that monitor the operation of these operating modules.
  • the apparatus of the invention consists of:
  • the apparatus of the invention may include a sample acquisition module and a sample distribution module.
  • the communication and control modules they will include: - a Communications Module
  • the sequence of processes to be carried out with the apparatus and method of the invention is: 1. Extraction of the sample to be analyzed through a sample acquisition module. Said samples may be in a liquid, solid or suspended state.
  • the samples are distributed by means of a sample distribution module to the homogenization and processing position. 3.
  • a solution or suspension is prepared with the content of said samples.
  • a reagent and solution management module controls the addition of a saline solution or a buffer solution to mix with said sample.
  • the homogenisation of the sample is to form a homogeneous mixture between the sample and saline or buffer, to the maximum disaggregate to particulate matter and solve the analytes. This process is carried out by the sample homogenizer module.
  • the homogenate can be subjected to different processes in the processing module samples: chemical, biochemical or modification biological (that interacts with a living cell), or physical modification such as filtering, concentration, etc.
  • the result of the processing may be the molecular labeling or not of the analytes present in the sample.
  • Such label may be formed of a fluorescent substance or any other substance that allows the identification of the 5 further modified analyte.
  • the processed sample circulates through the reaction module where it comes into contact with a sensor device.
  • Said sensor is constituted by one or more substances capable of interacting with the analytes (modified or not) present in the sample, such that said analytes are retained in the reaction module 0, while the excess sample is stored in a tank of waste
  • said module may be washed to remove residual sample processed with a solution controlled by the management module of reagents and solutions.
  • This washing operation 5 can be suppressed and add new reagents to the reaction module and subsequently make new washings, if necessary.
  • the ultimate goal is the detection of retained analytes in the reaction module sensor.
  • the data reading module is equipped with devices that detect those labeled analytes (fluorescent or not). If these or analytes have been modified with a (fluorochrome) fluorescent substance, the reading module will be provided with a radiation source to excite the fluorochrome and a fluorescence detector.
  • the detected data is processed by a suitable software for a final presentation of the result.
  • This presentation may be constituted by 5 a map of "bits" that originates an image susceptible to be computerized, either by the software module reading data, either by a remote station.
  • the method of the invention for detecting substances or analytes from the analysis of one or more samples comprising the steps of: a) mixing said sample with a liquid suitable buffer; b) homogenize with a homogenizing system: c) add reagents to modify said sample; d) filter the sample; e) injecting said sample into a reaction chamber; f) let the sample react with a biosensor; g) wash excess unreacted sample; and h) detect the sample retained in the biosensor.
  • the different stages will be developed in an order that can vary and will depend on the type of sample to be analyzed. 0 1. Communications Module
  • the Communications Module is the interface of the equipment with the user, which can be local or remote. In the case of a local one, the communications module will allow to establish a connection according to any of the following protocols: 5 1. Console, in case of local user.
  • Execution System tasks Global sequencing threads, sending orders-to the corresponding local controllers.
  • this controller can allow both the near and remote operation of the device.
  • Sample Acquisition Module is defined as the module that allows to extract, store and transport the samples to be analyzed in a robotic manner; These samples can be: solid, liquid, in suspension.
  • the Sample Acquisition Module consists of two parts: a device for extracting the sample and another for storage and transport to the input hopper.
  • the module for the extraction of solid samples, consists of a robot with at least six degrees of freedom with a tool placed at its distal end that allows drilling of the ground or rock by means of a firing pin that is operated by a hydraulic, pneumatic or mechanical system, when operated at frequencies between 1 Hz and 1 KHz, and operated by a piezoelectric actuator for frequencies up to 60 KHz.
  • Transport of the powdered solid it is performed by a suction system and pneumatic transport.
  • a hydraulic pumping system that deposits the sample is used for the extraction of liquid samples
  • the module for the extraction of samples in suspension (in air), the module consists of a suction and filtering system. The filter with the retained particles from the liquid is transferred to the sample distribution module. 0 4.
  • a suction system draws air from the medium surrounding the invention and the gas obtained in a solution is pumped, then a pump transfers part of the liquid to the Sample Distribution Module.
  • Controller 5 The sample acquisition Controller sample acquisition is responsible for controlling all the mechanisms to perform the functions described in paragraph 3.
  • the sample acquisition control module will be activated by the global control module, perform the preprogrammed functions and will send an analog or digital electrical signal to the global control module when its function is finished, or the same as when some has been detected. execution error.
  • the sample acquisition control module will perform the control of the articulated arm, as well as the tool available for making holes in the ground. , rocks, ... and the device used to collect the pulverized samples.
  • the sample acquisition control module will control the pump in charge of liquid sample collection.
  • the sample acquisition control module will control the air suction system and the mechanism that transfers the filter to the sample distribution module.
  • the sample acquisition control module 5 will control the air suction system and the pump that takes the liquid sample from the vessel where the air pumped and deposited in the sample distribution module.
  • Sample Distribution Module is defined as the set of
  • the sample distribution module consists of 0 a mobile device, for example in the form of a rotating drum, capable of accommodating one or more homogenization vessels, which allows the desired container to be placed under the inlet hopper. use, to receive the solid or liquid sample, or a filter with retained suspended particles.
  • a mobile device for example in the form of a rotating drum, capable of accommodating one or more homogenization vessels, which allows the desired container to be placed under the inlet hopper. use, to receive the solid or liquid sample, or a filter with retained suspended particles.
  • the drum is rotated again to move the container 5 aligned with the movable frame of the sample processing module, to start processing.
  • the mobile device or rotating drum can be mounted on a vertical or horizontal axis, with the power to rotate on it.
  • the Sample Distribution Controller is responsible for controlling the electromechanical mechanisms, sensors and actuators responsible for properly distributing the samples introduced in the sample distribution module.
  • the sample distribution control module will be activated by the global control module, perform the preprogrammed functions and will send an analog or digital electrical signal 5 to the global control module when its function is finished, as well as when some has been detected. execution error.
  • Module the sample homogenizer consists of a device capable of acting on the samples to produce homogenisation.
  • Said device may be of mechanical action, such as shredders and vibrators, of thermal action (resistances, etc.), or wave generators (ultrasound, etc.).
  • Sayings Devices are capable of regulating the degree of agitation and homogenization of said samples, from a gentle mixture to causing the rupture of cells (lysis) as resistant as the spores of some microorganisms can be.
  • sample homogenizer module 5 The following particular embodiments of the sample homogenizer module 5 have been identified:
  • the sample homogenizer module is formed by a piezoelectric ultrasonic generating device that converts high frequency electrical energy, supplied by the homogenizer controller, into longitudinal vibrations. Such vibrations are amplified 0 by the free end of a horn, firmly attached to the piezoelectric device.
  • the sample homogenizer module is housed inside the rack closing the main chamber of the sample processing module, firmly fixed to it and in contact with the closing wall of said chamber.
  • the vibrations of the horn generate pressure waves in the solution or suspension that contains the processed sample that, in turn, produce cavitation within said solution or suspension, disintegrating the particulate matter and using the cells that could exist in the sample, and homogenizing, in this way, said sample.
  • the lysate can be improved by introducing micro-spheres into the liquid sample.
  • the ultrasonic lysate can be performed by direct action of the horn in the liquid or through a membrane as performed in US Pat.
  • the pressure and temperature sensors of the Sample Processing Module monitor the proper functioning of the process.
  • the 5 sample homogenizer module is formed by a mechanical blade or piston homogenizer.
  • the mechanical action of the blades or the piston in the liquid and the friction itself with the walls allows homogenization and even lysing.
  • the improvement of homogenization is possible by adding abrasive agents.
  • the Sample Homogenizer Controller is responsible for controlling the electromechanical mechanisms and sensors necessary to properly homogenize the samples introduced in the sample homogenizer module.
  • the sample homogenizer control module will be activated by the global control module, perform the preprogrammed functions and send a signal analog or digital electrical to the global control module when its function has finished, as well as when an error in its execution has been detected.
  • control module of the sample homogenizer converts the electrical energy of the feeding system into high frequency electrical energy by transmitting it to the piezoelectric according to the predetermined time sequence. It also regulates the output voltage to the piezo by modifying the amplitude of the vibration.
  • control module of the sample homogenizer must activate / deactivate the electromechanical device that drives the blades or the piston.
  • sample Processing Module is defined as a set of devices whose purpose is to subject said samples to different physical treatments (homogenization, lysing, agitation, heating, radiation, etc.), chemicals (modification with chemical or biochemical agents such as enzymatic reactions , etc.), or biological (interaction with microorganisms).
  • the sample processing module consists of two clearly differentiated subsets: a homogenization vessel that houses the sample within the homogenization chamber, and a mobile closing frame of said chamber.
  • the sample processing module includes from one to several homogenization containers, allowing the analysis of at least one sample per container.
  • Each Homogenization Container is provided with one or more main homogenization chambers, surrounded by several secondary chambers connected to it by conduits of various sizes.
  • the main homogenization chamber which is open to receive, receives the samples in solid or liquid state, through the hopper of the sample acquisition module. During sample processing, this opening is tightly closed by the piston of the closing frame of the sample processing module.
  • the secondary chambers of the Homogenization Container are hermetically sealed with silicone plugs, and communicated by means of conduits of various section sizes with the main chamber.
  • These secondary chambers are used for the introduction of various reagents into the homogenization chamber, injected through the cannulas of the Reagents and Solutions Management Module.
  • Several of these secondary cameras house probes for Measure parameters of the processes performed in the main homogenization chamber (temperature, pressure, pH, conductivity, etc.).
  • the wall of the main chamber has a vent hole, which determines the closing time of said chamber by the piston, when said hole is exceeded by the piston, for example by an annular seal of said piston.
  • this piston will be movable inside the main chamber, from the hermetic closing position, to cause the pressure increase inside the chamber.
  • samples can be introduced into the main chamber.
  • the secondary chambers can be closed on one side by means of plugs through which cannulas belonging to the reagent management module for injection of reagents or solutions can be introduced, and on the other hand with valves normally closed and electrically actuated, mechanically by the movement of the frame module homogenization through overpressure generated by the reagent management module.
  • each homogenization vessel also includes a filter system and a valve located in the sample outlet duct.
  • the filter is used to prevent solids of a size larger than desired from accessing the Reaction Module.
  • the valve isolates or communicates to the Homogenization Container with the Reaction Module, allowing to control the moment in which the processed sample must be injected into the Reaction Module.
  • the sample processing module consists of a second subset consisting of the mobile closing frame of the homogenization chamber.
  • this subset performs the hermetic closure of the upper part of the homogenization chamber, by means of a piston fixed to the frame and provided with a sealing gasket.
  • the mobile frame is unique to all the containers of the sample processing module, which are aligned with the frame by means of the rotating drum of the sample distribution module.
  • the frame is guided axially and driven by a step, with a screw-nut reduction motor. For this, said frame is mounted on the axis of the sample distribution module, on one side of said drum or mobile device. This system allows a very precise control of the axial advance of the piston.
  • the mobile frame houses the cannulas of the reagent and solutions management module and the system Piezoelectric of the sample homogenizer module, which allows precise positioning for reagent injection, sample parameter measurements and homogenization execution.
  • the advance of the piston inside the homogenization chamber once the hermetic seal is produced, generates an overpressure in the solution or suspension to be treated, guaranteeing the necessary contact between the horn of the piezoelectric system and the wall of the piston for the generation of cavitation in the solution or suspension.
  • each of the containers the sample processing module can be provided with means for closure. These means may consist of a piston or valve mounted on each vessel and driven by the movement of the movable frame of the homogenization module.
  • the Sample Processing and Reaction Controller is responsible for controlling the electromechanical mechanisms and sensors necessary to properly process the samples introduced in the Sample Processing Module and inject them into the reaction module, then of processing
  • the CPR will be activated by the global control module, perform the preprogrammed functions and send an analog or digital electrical signal to the global control module when its function is finished, as well as when an error in its execution has been detected.
  • the CPR is responsible for controlling the electromechanical components that position the frame in the Homogenization Container, as well as the sensors used to know the position of the frame, and those that monitor the homogenization chamber .
  • reaction Module is defined as a device consisting of a support where a reaction chamber is located, communicated by a main conduit with the sample processing module, and by another conduit with the Module Reagents and Solutions Management.
  • the reaction chamber houses a biosensor or sensor system capable of detecting substances (from molecules to microorganisms complete) present in the solution or suspension.
  • Said sensor system may consist of at least one detecting substance in a microarray format (biochip) of DNA or proteins, or any microfluidic-based system.
  • Said detecting substances may be chosen from the group consisting of: a) a substance of an amino acid nature; b) a substance of a protein nature; c) a substance of a nucleotic nature; d) a nucleic acid; e) a nucleic-peptide acid (BNA); f) a substance of a lipid nature; g) a substance of saccharide nature; h) a substance that is a combination of at least two of the above; j) a live whole cell; j) a complete spore cell; k) a cell lysate or extractor; I) a tissue formed by cells; m) a complete virus or any of its components; n) synthetic polymers and i) molecularly printed polymers (MIP).
  • MIP molecularly printed polymers
  • Proteins capable of specifically binding to other substances may be monoclonal or polyclonal antibodies.
  • the sample modifying compounds may be chosen from a chemical reagent capable of binding to any of the analytes present in the sample, or one or more substances from those mentioned above, or a combination thereof.
  • Said microarray can be constituted by a single type or a mixture of the mentioned detecting substances (for example, a microarray containing DNA and protein points in the same support).
  • the reaction chamber can function as a flow cell, so that the solution or suspension from the sample processing module circulates through said reaction chamber to allow the interaction of the substances present in the solution or suspension with the substance or detecting substances present in the sensor.
  • the signal of the sample retained in the biosensor can be amplified by a cocktail or sample containing one or more substances of those mentioned above.
  • the solution or suspension circulates from the sample processing module to the reaction module through a valve, a filter system, and a main conduit.
  • a valve By this means enters the sample, after processing, to the reaction chamber.
  • This same chamber has an outlet duct connected to it a waste storage container where the sample ends once it has reacted with the detecting substance or substances present in the sensor.
  • One or more additional ducts directly reach the reaction chamber from the secondary chambers of the sample homogenizer module. These ducts allow reagents or simply wash solution to be injected into the reaction chamber before reading or measuring the reaction.
  • the solution or suspension once homogenized, is reacted with a fluorescent reagent that can be incorporated (by covalent, ionic, hydrophobic or other bonds) into the substances (from molecules to complete microorganisms) present in said solution or suspension.
  • a fluorescent reagent that can be incorporated (by covalent, ionic, hydrophobic or other bonds) into the substances (from molecules to complete microorganisms) present in said solution or suspension.
  • an inactivating substance may be a chemical blocker that provides an excess of reactive functional groups with the fluorescent reagent (for example, amino, carboxyl, sulfhydryl or other groups).
  • the signal of the sample retained in the sensor is amplified by a cocktail containing one or more substances (DNA, antibodies, PNA, etc.) labeled with a fluorescent substance, a metal compound, or an enzyme.
  • This cocktail is stored in one of the secondary chambers of the MPM, it is injected until the reaction chamber has been washed once excess sample unreacted with the sensor. After a suitable incubation period the excess of said cocktail not retained is evacuated with the wash solution.
  • the different chambers of the reaction module will be mounted on a mobile device, for example in the mobile drum of the distribution module.
  • Reagents and Solutions Management Module is defined as a set of devices for accurately storing and dispensing, at the required time, the different solutions and reagents involved in the different stages of sample processing: homogenization, modification, reaction , washing, etc.
  • the main element of the reagent and solution management module is made up of a motorized syringe that performs the functions of storage and fluid dispenser.
  • the module consists of many identical sets of motorized syringes different reagents as necessary. Each set incorporates the following elements:
  • a syringe fixed to the module frame, whose capacity depends on the number of samples to be analyzed.
  • 5 2.
  • the actuator is designed to be able to precisely inject fluids into the corresponding chambers when they are at the differential pressures defined by the functional procedure.
  • a position sensor determines the position of the plunger of the syringe 0, allowing control of the set in open loop ( "limit”) or closed loop ( "encoder").
  • a passive (non-return) or active (motorized) valve that maintains the pressure barrier in the fluid circuits when the syringe is not actuated.
  • the cannula is fixed to the mobile frame of the sample processing module and, therefore, its penetration movement is synchronized with the forward movement of said frame.
  • the reagent and solutions management module is formed by:
  • One or several distribution valves each of them provided with several pathways and an outlet capable of opening or closing the different lines or from stores to the homogenization chamber or reaction.
  • the reagent and solutions management module is formed by:
  • a closed circuit of the impeller fluid formed by a single pumping system capable of aspirating said fluid from a reservoir and dispensing it to the different sealed compartments of the syringes-reservoirs, thus actuating the pistons thereof.
  • This configuration of the reagents and solutions management module simplifies to the maximum the number of actuators required and allows the injection of reagents / solutions through individual routes or, optionally, through a single route, if fluid compatibility permits.
  • the Reagents and Solutions Management Module Controller is responsible for controlling the electromechanical mechanisms and sensors necessary to accurately store and dispense, at the required time, the different solutions and reagents involved in the different stages of sample processing.
  • the CMGRS will be activated by the global control module, perform the preprogrammed functions and send an analog or digital electrical signal to the global control module when its function is finished, as well as when an error in its execution has been detected.
  • the CMGRS is responsible for controlling the actuator moving the syringe; monitor the sensor that determines the position of the plunger and act on the solenoid valve that maintains the pressure barrier (see 4 of the first embodiment indicated in section 12).
  • Data Reading Module is defined as the set of devices that allow detecting the reactions produced in the reaction chamber, and conveniently processing the detected signals.
  • the detector of the reactions is 0 a high resolution and sensitive CCD reader, with the optics and filters necessary to read only the frequency of the electromagnetic radiation produced as a result of the reaction.
  • Said electromagnetic radiation is produced by excitation of a reactive substance that is involved in the reaction process (fluorescent molecule).
  • the excitation of said reactive substance is achieved with a monochromatic beam of light from a laser diode.
  • the CCD reader is facing the reaction chamber, and the laser light beam strikes the reaction chamber at an angle to prevent reflections impinge on the CCD reader.
  • the monochromatic light can be guided by a waveguide where the biosensor is excited by the evanescent modes that 0 formed on the outer surface of the waveguide is located.
  • the Data Reading Controller is responsible for controlling the devices used to detect the reactions produced in the reaction chamber.
  • the data reader control module will be activated by the global control module 5, perform the preprogrammed functions and send an analog or digital electrical signal to the global control module when its function is finished, as well as when an error has been detected In its execution.
  • the data reader control module in the particular embodiment indicated in section 14, is responsible for activating the laser for the preset time as well as for reading the information received from the camera and processing it properly (filtering, identification of the activated areas, quantification of the activated zones, etc.) and subsequently transmit it to the global control module.
  • Figure 1 is a front isometric view of the apparatus of the invention.
  • Figure 2 is a rear isometric view of the apparatus of the invention.
  • Figure 3 is a top view of the apparatus of the invention in which the top cover has been removed.
  • Figure 4 is a section along the line IV-IV of Figure 3.
  • Figures 5 and 6 are vertical sections of the processing module and the reaction module, according to the lines of cut VV and VI-VI, respectively , from figure 3.
  • Figure 7 is an isometric view of the reaction module.
  • FIGS 8 to 14 show different positions of processing modules 15 and homogenizing samples, along the process.
  • Figure 15 corresponds to the operating diagram of the apparatus of the invention.
  • Figures 16 and 17 show a variant of the implementation of the apparatus of the invention in anterior and posterior perspective.
  • the apparatus shown in the drawings consists of a robotic device that allows the detection of bio-markers (organic molecules and macromolecules of biological origin) that exist in the soil or subsoil.
  • the method of detection and characterization of such bio-markers is based on their interaction with a battery of specific antibodies immobilized at specific positions of a solid support (called “chip” or "microarray”).
  • This device includes all the mechanisms, detectors and electronics necessary for the automatic performance of the experiment.
  • the components used are primarily commercial, designed and / or selected to operate in environmental conditions. In order to facilitate the identification of the different components and their operation, then the different modules that make up the apparatus of the invention will be described.
  • the apparatus lacks a sample acquisition module, manually entering the samples to be analyzed. For this reason, the device also lacks the corresponding acquisition module controller.
  • the apparatus comprises a frame composed of an upper cover 1, a lower cover 2 and a series of intermediate frames 3. This frame serves as a frame for mounting the different modules.
  • the sample distribution module includes a cylindrical hopper 4 (see Figure 4), fixed to the upper cover 1 of the frame and provided with a conical mouth, through which, each soil sample is introduced, of an approximate mass of 250 mg and granulometry ⁇ 0.5 mm.
  • the lower end of the hopper is provided with an inner cone 4 ', whose function is to distribute the sample on the bottom of the container, belonging to the sample processing module, as will be explained later.
  • the hopper 4 could be replaced by another fixed or mobile adapter.
  • the sample distribution module could be manually fed by an operator or by sample injectors stored in multiwell plates.
  • the sample distribution module supports, houses and guides the components of the sample processing and reaction modules and is mainly formed by a rotating anodized aluminum drum, consisting of two flanges: the upper flange 5 (see Figure 4) accommodates twelve containers 6 the sample processing module; the lower flange 7 has devices for fixing the elements of the reaction module. Both flanges are mounted on two angular contact bearings 8, slightly preloaded by their connecting screws. Bearings mounted on the central shaft of the frame 9, allow the rotation of the drum about said axis.
  • the drum is rotated by a step-by-step motor 10, screwed to the lower cover 2 of the frame, through a gear transmission consisting of a pinion 11 fixed to the motor shaft, and a wheel 12 screwed to the Bottom flange 7 of the drum.
  • the engine has a resolution of 1, 8 step and is able to give a torque of 0.16 Nm.
  • the initial position of the rotating drum is determined by an optical sensor 13, fixed to the frame 3 of the frame, when the indicator 14, attached to the drum, interferes with the light beam of the sensor.
  • the sample homogenizer module includes a piezoelectric ultrasonic device formed by a commercial converter 15 (see Figure 4) and a horn 16 firmly screwed to the end of the converter.
  • This assembly is housed within the longitudinal displacement frame 17 closing the main chamber of the Sample Processing Module, firmly attached to it by means of a clamp 17 'that holds the cylindrical housing of the converter 15.
  • the converter transforms the electrical energy high frequency, supplied by the sample homogenizer control module, in longitudinal vibrations that are amplified by the free end of the horn.
  • the vibrations of the horn generate pressure waves in the solution of the processed sample, which produce cavitation within the solution, homogenizing the sample.
  • the intensity of the cavitation can be regulated and, in this way, the degree of homogenization of the mixture, being able to cover a range that goes from mild homogenization, for low amplitudes, to cell rupture, for high amplitude levels.
  • the control module of the sample homogenizer controls the converter in such a way that it tends to maintain the preselected amplitude, increasing or decreasing the power supplied, depending on the resistance found at the end of the horn.
  • the device is designed to provide a maximum output power of 130 w.
  • the sample processing module consists of two subsets distinct (see Figures 4 to 6):
  • the homogenization vessel 6 and the mobile closing frame 17 of the homogenization chamber are identical to The homogenization vessel 6 and the mobile closing frame 17 of the homogenization chamber.
  • the homogenization vessel 6 contains the sample deposited therein by the sample distribution module, during the homogenization process.
  • the device is designed to accommodate up to twelve homogenization vessels, allowing the analysis of a single sample per container.
  • the containers are made of transparent acrylic plastic to visualize the homogenization process.
  • Each vessel is provided with a main homogenization chamber 18, surrounded by four secondary chambers 19, 20, 21 and 22 connected thereto by ducts 23 of various sizes.
  • the homogenization chamber 18 in a cylindrical shape (0 19 mm, length 22 mm), is open in its upper part to receive the samples in solid or liquid state provided through the hopper 4. During the sample processing, This opening is hermetically sealed by the piston 24 of the mobile frame 17.
  • the bottom of the chamber is provided with a hole 25 of 0 10 mm, through which the homogenized sample is injected into the reaction module.
  • the cylindrical wall of the chamber is provided with a vent hole of 0.5 mm, not shown, located at a height of 9.3 mm above the bottom of the chamber, which determines the moment of the chamber's seal when the seal 26 carried by the piston of the frame seals said hole.
  • the secondary chambers 19 to 22 are hermetically sealed with silicone plugs 27, both at the top and bottom, and communicated by a conduit 23 with the main chamber.
  • the container has the following secondary chambers:
  • This chamber is used to inject the BSA blocker solution, through cannula 29 of the reagent and solution management module, necessary to block the excess fluorescent label that has not reacted with the sample molecules.
  • this chamber houses the cannula 29 ', carried by the mobile frame 17, which is connected to the pressure sensor 30, responsible for monitoring the differential pressure of the process.
  • Chamber 19 of the temperature sensor It is an identical chamber to the pressure sensor. During the homogenization process, this chamber houses the cannula 31, carried by the mobile frame 17, which, in turn, houses the probe of the temperature sensor 32, responsible for " monitoring the temperature of the sample solution during said process.
  • the bottom surfaces of the chambers 19 and 20 of the sensors and that of the homogenization chamber 18 are treated with a tensile-active, to facilitate the penetration of the solution in said secondary chambers.
  • Each homogenization vessel also includes a filter 33, of 012 mm and provided with a pore of 20 ⁇ m, used to prevent solids of a size larger than the desired one from accessing the reaction module.
  • the filter is located on the filter holder 34, which is housed inside the screw cap 35. This assembly is threaded into the base of the container, under the outlet hole of the homogenization chamber.
  • a gasket 36 provides the necessary sealing of the assembly.
  • the screw cap 35 is provided with a male Luer cone to which the non-return valve 37 is connected.
  • This valve connects the homogenization vessel 18 with the reaction module. Normally, the valve is closed, due to the overpressure of 1.3 bar existing in the reaction module, isolating both modules.
  • a normally closed and electrically operated valve could be arranged, or mechanically, by the movement of the homogenization module frame.
  • the mobile closing frame 17 of the homogenization chamber, figure 4 performs the hermetic closure of the upper part of the homogenization chamber 18, during sample processing.
  • the mobile frame is unique for all the containers of the module which are aligned with the frame by means of the rotating drum of the Sample Distribution Module.
  • the subset consists of the frame 17, made of aluminum, which accommodates the different elements of the subset. It is provided with an upper flange 38 for fixing the drive 15 of the sample homogenizer module. In turn, a lower flange 39 houses the piston 24, the cannulas 28 and 29 of the reagent and solution management module, and the cannulas 29 and 31 of the pressure and temperature sensors, respectively.
  • the frame slides along the axis 9, by means of two droppers 39, and is axially guided along the central rib of the frame 40.
  • the axial movement of the frame is carried out by a step-by-step motor 41, screwed to the top cover 1 of the demonstrator, through the transmission of the screw 42 fixed to the motor shaft and the nut 43 housed in the body of the moving frame 17.
  • the engine has a resolution of 1, 8 ° / step and is capable of giving a torque of 0.16 Nm.
  • the screw is provided with an M6x1 thread, then the final resolution of the displacement of the frame is 5 ⁇ m / step, allowing a very precise control of said displacement which, in turn, translates into a precise positioning for reagent injection , measurement of sample parameters and execution of ultrasonic homogenization.
  • the final position of the mobile frame is determined by an optical sensor 44, fixed to the frame 40 of the frame, when the indicator 45, attached to the lower flange of the frame, interferes with the light beam of the sensor.
  • the piston 24, figure 5, made of stainless steel, is a hollow piece of revolution, provided with an upper flange with which it is fixed to the mobile frame.
  • the membrane 47 is made of PTFE and has a thickness of 0.1 mm.
  • the interior of the piston houses the horn 16 of the sample homogenizer module, which rests on the membrane 47. This assembly hermetically closes the upper opening of the homogenization chamber, thanks to the tightness produced by the joint 26 and the membrane 47.
  • the pressure sensor 30 monitors the overpressure of the homogenization chamber. It is based on a Wheatstone bridge and its main features are:
  • the over-pressure parameter in the chamber is used to control and define the homogenization position of the piston-homogenizer assembly:
  • the CPR inhibits the motor 41 of the mobile frame when the chamber pressure reaches 0.8 bar. It is also used to control and define the homogenization time:
  • the control module of the sample homogenizer inhibits the converter 15 of the piezoelectric system when the overpressure in the chamber exceeds the value of 1.0 bar.
  • the temperature sensor 32 monitors the temperature of the sample solution during the homogenization process. It is based on a probe equipped with a K type thermocouple, housed in a stainless steel sheath of 00.5 mm and 250 mm in length. The probe is fixed in the upper cover 1 of the apparatus by means of a threaded stud while its free end is inserted in the cannula 31, which facilitates the insertion of the probe through the silicone plugs 27.
  • the sample solution temperature parameter is used to control and define the homogenization time:
  • the sample homogenizer control module inhibits the converter 15 of the piezoelectric system when the temperature of the solution exceeds a predetermined critical value.
  • the reaction module (see Figures 5 to 7) consists of a support 50, in a parallelepiped shape (size: 76x26x6.5 mm), where there is an open cavity 51, called the reaction chamber, which is in the form of a symmetrical irregular hexagon ( overall dimensions: 14x8 mm), with a depth of 0.3 mm.
  • This camera is provided with the following access paths:
  • Route 52 of the homogenized solution or suspension It is located in the upper corner of the chamber and is formed by a 01 mm conduit, terminated in a female Luer cone for tight connection with the non-return valve 37 of the sample processing module 75.
  • Route 53 of the washing solution It is located in the upper corner of the chamber and is formed by a 02.5 mm duct, for the tight connection of the washing duct 28 '.
  • Exit path 54 of the solutions It is located in the lower corner of the chamber and is formed by a 02 mm conduit, terminated in a female Luer cone for the watertight connection with the waste container 57.
  • the inlet holes 52 and 53 and the outlet hole 54 may be connected by a conduit provided with a pumping system, not shown, which will allow the recirculation of the sample on the biosensor.
  • the chamber 51 may include a system of agitation or movement of the liquid sample, to improve the functioning of the biosensor.
  • the reaction chamber 51 has a thin coating of hydrophobic agent SIGMACOTE, in order to improve the circulation of the different fluids, avoiding the adhesion of solid particles and molecules to their surfaces.
  • the reaction chamber 51 and its access paths are closed by means of a glass slide 55 (size: 75x25x1 mm), on whose inner face, coinciding with the chamber, the biosensor or sensor system 56 capable of detecting substances present is deposited in the homogenized solution, from molecules to whole microorganisms.
  • This sensor system consists of different detecting substances in micro-array format
  • the slide 55 is fixed to the bracket 50 by two clips 50 '.
  • the tightness of the joint is guaranteed by a rectangular silicone perimeter
  • CV-1152 that is injected through two holes located on the opposite side of the support 50.
  • the silicone once cured, forms a sealing gasket, section 1x1 mm, which surrounds the reaction chamber and its access roads .
  • the washing line 28 is formed by a plastic pipe, with an internal diameter of 1.6 mm and an approximate length of 90 mm. At its upper end it is provided with a metal coupling, terminated in a male Luer cone, which is tightly connected in the housing of the homogenization vessel 18, under the blocking chamber. At the lower end it has a plastic angled coupling for the tight connection with the washing path of the reaction chamber.
  • the waste container 57 is formed by a plastic syringe, 5 ml capacity, equipped with an eccentric male Luer cone, connected to the reaction chamber outlet.
  • the syringe lacks a plunger and instead, a silicone cap 58 tightly closes its upper opening.
  • the waste tank 57 may be common to all reaction modules and be connected to the outlet thereof by means of a cannula mounted on the sliding frame.
  • the set is made of transparent material (glass, acrylic, etc.) enabling the fluid circuits.
  • the chamber 18, together with its access roads, ducts and reservoir form a tight circuit which, previously, has been filled with saline solution, to a 1.3 bar overpressure.
  • the level of dissolution is 1 ml, the rest of the tank being filled with pressurized air at said overpressure.
  • the apparatus is designed to accommodate up to twelve reaction modules, allowing analysis of a single sample per module.
  • the reagents and solutions management module consists of all the elements necessary for storing and dispensing with precision, at the required time, the different solutions and reagents involved in the different stages of sample processing.
  • the main element of the management module reagents and solutions (see
  • Figures 1 and 2) are made up of a motorized syringe 60 that performs the functions of storage and fluid dispenser.
  • the module consists of two identical sets of motorized syringes: one dedicated to the saline solution used to dissolve the solid sample and another dedicated to the BSA blocker solution that, in turn, performs the functions of the reaction chamber wash solution .
  • the apparatus could include a device that injected them into the reaction chamber.
  • Each set incorporates the following elements: 1.
  • a motorized syringe 60 (size: 203x56x94 mm), commercial, fixed to a frame 3 of the structure of the apparatus through a base plate. Its main components are:
  • a non-return valve 65 that maintains the pressure barrier in the fluid circuits when the syringe is not actuated.
  • a threaded cannula (size: 01x20 mm), not shown, which, as the final element of the assembly, penetrates through the saddle caps of the side chambers of the homogenization vessel 18.
  • the cannula is fixed to the mobile frame 17 of the Sample processing module and, therefore, its penetration movement is synchronized with the forward movement of said frame.
  • All the conduits and accessories (size: 1/16 ") necessary to connect the different components that make up the fluid circuit.
  • a data reading module includes the components that allow detecting the reactions produced in the reaction chamber.
  • the laser diode 66 emits a 635 nm monochromatic beam of wavelength and width sufficient to irradiate the entire reaction chamber 51, exciting the fluorescent molecules. It is mounted on the bracket 68, so that the beam of light strikes 45 ° on the plane of the reaction chamber, preventing reflections in the direction of the axis of the CCD camera.
  • the laser diode 66 housed in a cylindrical housing (size: 038x158 mm), has a maximum power of 250 mW and has a cooling system that allows to regulate the temperature of the diode.
  • the CCD camera 67 detects the electromagnetic radiation emitted by the fluorescent molecules, when they are excited by the laser light beam.
  • the chamber is provided with a 695AF55 emission filter 69, 25 mm in diameter. They complement the device a lens 70 and a separator 71 that allow focusing and enlarging the image in the CCD.
  • the three components, filter, objective and separator, are commercial.
  • the camera is digital, black and white, high resolution and high sensitivity. It has the following characteristics:
  • the capacity of the apparatus can be adapted, including if necessary two or more sample homogenizing and sample processing modules, as well as two or more sample distribution modules.
  • the device includes a communications module (communications module) that is the interface of the equipment with the user, which can be locally or remotely manipulated through the appropriate communication protocols.
  • the communications module corresponds to software developed in
  • USB Universal Serial Bus
  • Field buses PROFIBUS, CAN, FieldBus, InterBUS-S, ...
  • the communications module performs the tasks of data coding, encapsulation, control of access to the medium, sending / receiving of data / commands and implementation of security options by validating the integrity of the data. the commands.
  • the communications module performs the tasks of data coding, encapsulation, control of access to the medium, sending / receiving of data / commands and implementation of security options by validating the integrity of the data. the commands.
  • the communications module performs the tasks of data coding, encapsulation, control of access to the medium, sending / receiving of data / commands and implementation of security options by validating the integrity of the data. the commands.
  • For the control of the set there is a global controller and one controller per module.
  • the overall controller represents the overall supervisor system and the process of each of the constituent modules of the invention. It can also allow both the near and remote operation of the device.
  • the global control module corresponds to the main process that interacts with the rest of the controllers to carry out The process and global analysis. It performs the following functions: - Receiving messages from the Module
  • Task execution system Global sequencing threads, sending commands to the corresponding local controllers. - Performing pre-programmed automatic tasks.
  • the Controller of the Sample Distribution Module is a process that is executed in the control system in addition to cards for the control of stepper motors, as well as other digital inputs and outputs for the reading of the sensors. He is responsible for the execution of the sub-task that involves the distribution of the samples collected by the Sample Acquisition Module among the different Sample Processing Modules.
  • the Sample Distribution Control Module must be able to perform the different tasks:
  • the sample distribution control module has the information from the limit switches and linear or angular position encoders, as well as control over the constituent actuators of the Sample Distribution Module. Given the appropriate orders from the Global Controller, the sample distribution control module will operate on the actuators to place the appropriate Sample Processing Module under the Sample Acquisition Module.
  • the task of the sample distribution control module is to attend the Global Controller orders rotating such drum to the desired position.
  • a first phase of the overall operation involves a calibration of the sample distribution module whereby the CMD takes the drum to the position where the optical limit switch is activated, which implies a known position. In this way, the CMD will hereafter know the absolute position of the drum.
  • the CMD can take the Sample Processing Module to any desired position through the appropriate number of motor steps, information that is handled by this controller.
  • the reagents and solutions manager control module controls those devices intended for the provision of the solutions necessary for the realization of the entire biochemical process.
  • the reagent and solution manager control module consists of a running thread in the control computer next to the cards for the control of the stepper motors, and digital inputs for the reading of the sensors.
  • the reagent and solution manager control module allows:
  • the CPR is responsible for controlling the electromechanical components that position the mobile frame in the homogenization vessel, as well as the sensor that determines the position of the mobile frame.
  • the CPR is also responsible for the monitoring and supervision of the parameters (pressure and temperature) involved in the process. At all times, you must analyze the information from the different sensors that monitor the process in order to determine if it is done within the allowable ranges.
  • the CPR In relation to the monitoring of the homogenization process of the sample, the CPR consists of two sensors, one of pressure and the other of temperature, as well as the hardware elements for the conditioning of these signals, through which the parameters can be measured physicists in which the reaction develops.
  • the analysis of these parameters can determine the time during which a certain thread is performed, if it is considered as a criterion to finish it, reaching a certain temperature.
  • the data reader control module is the means through which it is possible to interact with the Data Reading Module. Must allow:
  • Figure 15 corresponds to the operation scheme of the described apparatus:
  • the samples to be analyzed 72 are taken by the acquisition module 72, which includes them to the distribution module 74, from where it passes to the processing module 75, where they are homogenized by the module of homogenization 76.
  • the samples pass to the reaction module 86, with which the reagent management module 77 is in communication, finally producing a data collection by the data reading module 78.
  • Each of these modules is supervised by the corresponding controller 79 to 83, and the whole by the global controller 84, which is managed through the communications module 85.
  • step 1960 absolute values of the motor step counter 41
  • step 4480 absolute values of the motor step counter 41
  • the cannula 28 of the saline solution has passed through the upper cap 27a of the fluorescent marker chamber and is ready to dispense the solution.
  • 1mg of Cy5 fluorescent marker is deposited, in solid state and adhered to the bottom and walls of the chamber.
  • the seal 26 is located above the vent hole of the homogenization chamber, then, the chamber has not been sealed.
  • F Activation of the reagent and solution manager control module controller 82. Activation of engine 64 of the saline syringe until injected 1362 ⁇ l (139 engine steps @ 5 steps / s). Engine de-energization 64 at the end of the injection.
  • the saline solution (0.1 M NaCO 3 / NaHCO 3 ) dissolves the Cy5 fluorescent marker as it passes through the chamber, dragging it to the homogenization chamber 18 where the sample is located.
  • the saline solution enters the sensor chambers and other access ducts to the homogenization chamber.
  • about 1200 ⁇ l of sample and marker solution is obtained in this chamber, which is capable of binding to the carrier molecules of an amino group (NH2).
  • NH2 an amino group
  • the sealing of the homogenization chamber 18 is effected when the absolute step counter of the motor 38 marks step 4740 approximately (see Figures 11a-11b). From that moment, the homogenization chamber 18 begins to pressurize, increasing the overpressure as the piston 24 descends. In this position, cannulas 29 'and 31 of pressure sensors 30 and temperature 32, respectively, have passed through the upper caps of their respective chambers and, therefore, begin to monitor the conditions of the homogenization chamber. The lowering is stopped when the overpressure indicated by the sensor 30 reaches the value of 0.8 bar. At that time, the homogenization position is reached (see Figures 12a-12b).
  • the PTFE membrane 41 is in contact with the sample solution, ready to be excited by the horn 16 of the homogenizer.
  • the pressurized air in the chamber is occluded in the cavities formed by the sleeve 46 of the piston 24, close to the seal 26.
  • the downward movement is carried out in two continuous but differentiated stages: the first, until the chamber is closed, is carried out between the absolute steps 4480 and 4740 of the motor 41, at a speed of 10 steps / s, and, the second , until the homogenization position, it is carried out slowly between the absolute steps 4740 and 5080 (the final step is approximate, since the control is carried out with the pressure sensor) of the motor 41, at a speed of 5 steps / s. 4.
  • Homogenization of the sample solution Operational steps: to. Activation of the sample homogenizer control module controller 82. Activation of the piezoelectric system of the sample homogenizer module to homogenize the sample.
  • the converter 49 transforms the high frequency electrical energy (40 kHz), supplied by the control module of the sample homogenizer 82, into longitudinal vibrations that are amplified by the free end of the horn 16
  • the vibrations of the horn generate pressure waves in the solution of the processed sample, which produce cavitation within the solution, homogenizing the sample.
  • the intensity of the cavitation can be regulated and, in this way, the degree of homogenization of the mixture, being able to cover a range that goes from mild homogenization, for low amplitudes, to cell rupture, for high amplitude levels.
  • the temperature of the sample increases as a result of the energy contributed to it by the homogenizer.
  • the temperature increase causes increased the overpressure in the chamber. If the process is lengthened in time, the overpressure in the homogenization chamber 18 equals the overpressure in the reaction chamber, producing a spontaneous and uncontrolled flow of sample solution to said chamber. On the other hand, increasing the temperature of the solution can cause irreversible damage to the cells.
  • Both parameters are closely related to other parameters such as: «The excitation intensity of the homogenizer whose value, predefined according to the degree of homogenization desired, is related to the amplitude of the ultrasonic vibration. This amplitude is preselected in the control module of the sample homogenizer 82. The useful range can be considered between 10% and 100% of the amplitude. • The excitation time of the homogenizer, which is in relation to the selected excitation intensity: at higher intensity the temperature and pressure of the solution increase more rapidly and, therefore, the excitation interval must be reduced so as not to exceed the limits higher pressure and temperature. «The nature of the sample, the ambient temperature, etc.
  • One way of homogenization capable of producing the rupture and lysis of the possible cells present in the sample solution is to activate the sample homogenizer module 76, intermittently, at an excitation amplitude of 80%, in excitation intervals, not exceeding 20s, limited by the mentioned pressure and temperature limits.
  • the waiting time between intervals is defined by the drop in pressure, caused by the cooling of the sample, resuming the excitation when the overpressure reaches the value of 0.8 bar.
  • b. Wait 30 minutes to facilitate the reaction of the Cy5 marker with the sample molecules. 5. Blocking the fluorescent marker
  • the syringe of the blocker contains a saline solution with a concentration of 10% BSA blocker. Therefore, 34 mg of BSA blocker dissolved in the 343 ⁇ l of saline injected through cannula 25 is added. The blocker binds to the excess fluorescent label that has not reacted with the sample molecules. This allows to decrease the fund in the Image that is finally obtained, because the nonspecific binding of free marker to antibodies is avoided. c. Activating the motor 41 of the moving and lowering it into position by stirring the sample solution casting. De-energization of the engine 41.
  • This gentle agitation to homogenize object has the solution mixture shown more blocking BSA. It is performed at low excitation level (amplitude 0 20%) for a short interval of about 5 s. and. Wait 30 minutes to facilitate the reaction of the blocker with the excess marker.
  • the opening of the non-return valve occurs when the overpressure in the homogenization chamber is slightly greater than the overpressure in the reaction module circuit 86, that is, when it reaches an approximate value of 1.3 bar. o This situation occurs in the environment of step 5040 of motor 41 b. Introduction into the reaction chamber of the first sample injection by lowering the mobile frame
  • the engine 41 descends 210 (relative) steps, at a speed of 5 steps / s, so that the sample reaches the reaction chamber, 5 passing through the filter 33, the filter holder 34, the non-return valve 37 and all the access ducts, as well as the reaction chamber itself, where the micro-matrix of detecting substances is located.
  • the filter 33 placed under the homogenization chamber 18 prevents particles larger than 20 ⁇ m from entering the reaction module.
  • the volume of the reaction chamber is approximately 28 ⁇ l.
  • the useful dimension of the micro-matrix of detecting substances is 8x8 mm.
  • Fluorescent marker activation and fluorescence detection Operational steps: a. Activation of the data reader control module controller 83. b. Excitation of the Cy5 fluorescent marker by means of the laser diode and simultaneous detection, by means of the CCD sensor, of the electromagnetic radiation emitted by the fluorescent molecules.
  • Cy5 marker used has an absorption maximum at 649 nm and an emission maximum at 670 nm.
  • c Disc recording of the image of the CCD sensor. 9. Re-initiation of the device
  • the containers 6 of the sample processing module are mounted on a horizontal axis rotating drum which, as in the previous case, is driven by a gearmotor 10, with angular potentiometer 10 '.
  • the chambers 6 have a lateral loading mouth 90, provided with closing means, for the reception of samples, which can be fed through a hopper 4.
  • the homogenizer module includes a piezoelectric device that includes a converter 15 and a horn 16, all mounted on a frame 17, whose movement displaces the closing means and through of which and by activating the piezoelectric device homogenisation of the sample occurs.
  • the frame 17 is mounted on guides 92 along which it can be moved, to one side of the rotating drum and without the possibility of rotation, by means of a linear actuator 93 with linear potentiometer 15 '.
  • the apparatus corresponds to the constitution described with reference to Figures 4 to 14, including a laser 66, a data reading camera 67, etc. It can also have a cooling module 94, the solution tank 95 and pump 96 solution.
  • the whole assembly shown in figures 16 and 17 would be mounted in a cage structure, in which the hopper 4, the reagent management module, the data reading module and the communication and control modules would also be mounted.

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Abstract

El método comprende mezclar la muestra con un líquido tampón apropiado, homogeneizar dicha muestra, añadir reactivos a la misma, filtrada, inyectar la muestra a una cámara de incubación, dejar reaccionar la muestra con un biosensor, lavar el exceso de muestra no reaccionada y detectar la muestra retenida en el biosensor. El aparato incluye un módulo homogeneizador de muestras con un dispositivo piezoeléctrico de ultrasonidos formado por un convertidor (49) y una bocina (16); un módulo de procesamiento de muestras, que incluye un recipiente de homogeneización (6) y un bastidor móvil (17); un módulo de gestión de reactivos y soluciones, que incluye una jeringa (60) motorizada, un módulo de reacción, compuesto por un soporte (50) que forma una cámara de reacción (51), y un módulo de lectura de datos que incluye un diodo láser (66) y una cámara CCD (67).

Description

MÉTODO Y APARATO PARA LA DETECCIÓN DE SUSTANCIAS O ANALITOS A PARTIR DEL ANÁLISIS DE UNA O VARIAS MUESTRAS.
La presente invención se refiere a un aparato para la detección de sustancias o analitos a partir del análisis de una o varias muestras, que permite llevar a cabo al mismo tiempo el análisis de un elevado número de muestras y que además puede ser manejado por control remoto. La invención incluye también el método para la detección de tales sustancias-o analitos.
El desarrollo de biosensores, es decir sistemas de detección basados en las propiedades moleculares de los seres vivos ha constituido en los últimos años una auténtica revolución biotecnológica, ya que permiten la valoración de la existencia de determinadas sustancias en un medio, y el análisis de sus características (entre ellas, su posible toxicidad o patogenicidad).
Los biosensores de aplicación ambiental se basan en el uso de sistemas de reconocimiento biológico acoplados a transductores de señal. Existen tres mecanismos básicos de reconocimiento biológico: biocatálisis, bioafinidad y metabólico. Asimismo, los sistemas de transducción pueden ser electroquímicos, óptico-electrónicos, ópticos o acústicos. La transformación catalítica de una sustancia (por ejemplo, un compuesto contaminante) en una forma detectable con un sensor o la inhibición de una enzima por dicha sustancia, son los dos mecanismos operativos básicos de los biosensores basados en biocatálisis. Ejemplos del primero de ellos lo constituyen el uso de la tirosinasa para la detección de fenoles (Chen W.J., 1995; Marko- Varga et al., 1995), o el uso de la organofosfato hidrolasa para la detección de pesticidas organofoforados (Mulchandani et al., 2000). Entre las limitaciones inherentes a estos sistemas están el número reducido de contaminantes que son sustratos de enzimas conocidas, la necesidad de concentraciones relativamente altas del contaminante para que sea detectado, la presencia de inhibidores en el medio, la necesidad de usar sustratos adicionales, cofactores o mediadores, reactivos de revelado, etc. Además, la naturaleza irreversible de muchas interacciones enzima-sustrato hace que el biosensor no sea reutilizable.
Las reacciones altamente específicas de los anticuerpos con sus antígenos, o de hibridación entre ácidos nucleicos complementarios constituyen los sistemas de bioafinidad más empleados. Los primeros biosensores de bioafinidad con aplicaciones ambientales se basaban en el uso de anticuerpos debido a la disponibilidad de anticuerpos monoclonales y policlonales contra un elevado número de sustancias contaminantes (Van Emon and López-Avila, 1992; Marco et al., 1995), de tal manera que los inmunosensores constutuyen el tipo de biosensor más usados con fines ambientales. Entre los inmunosensores existe una amplia gama de formatos y kits comerciales (tanto reutilizables como de un solo uso) que permiten abordar aspectos tan importantes como la multifuncionalidad, versatilidad de formato, tiempo de ensayo, sensibilidad, costes, reproducibilidad, conservación, etc.
El desarrollo de biosensores basados en las reacciones de afinidad entre ácidos nucleicos (hibridación específica) para aplicaciones ambientales no ha hecho más que empezar. Ejemplos de aplicaciones de este tipo de biosensores son la detección de daños en el DNA producido por agentes químicos (Fojta and Palecek, 1997) o la detección de microorganismos mediante el uso de sondas de DNA específicas de especie (Cheng et al., 1998). La empresa PE Biosystems (www.pebiosvstems.com) comercializa kits para la detección e identificación de bacterias basados en la amplificación y secuenciación de un gen universal, el gen que codifica el RNA ribosómico 16S.
En el campo de la biomedicina también existen diversos tipos de biosensores, basados en la reacción antígeno-anticuerpo o en la hibridación específica de ácidos nucleicos, para la detección y cuantificación de microorganismos patógenos. Las técnicas de detección por inmunoensayo se han desarrollado, en distintos formatos, para la detección de patógenos bacterianos y víricos. Las variantes más refinadas de estas técnicas permiten incluso cuantificar el patógeno existente en un fluido corporal, como las de "LCx-RNA cuantitativo" desarrolladas por Abbott (www.abbottdiaqnostics.com). Como ejemplos de metodologías basadas en la hibridación de ácidos nucleicos pueden citarse diversas variantes de técnicas de "ranched-DNA", comercializada por Roche (www.roche-diaqnostics.com) que permiten la cuantificación directa de virus patógenos en el torrente sanguíneo, entre ellos el de la inmunodeficiencia humana o los de las hepatitis B o C (Collins et al, 1997). La hibridación diferencial de genomas de microorganismos con sondas de ácidos nucleicos inmovilizados en tiras de nitrocelulosa (técnicas de "LiPA", comercializadas por Abbott) permite realizar genotipado de variantes o cepas víricas (Stuyver et al. 1997).
Otro sistema de reconocimiento biológico se basa en el estudio del metabolismo microbiano. Así, la medida del aumento de la concentración de un compuesto en función de la respiración celular, o la inhibición de la respiración por dicho compuesto, y el reconocimiento específico de promotores o reguladores de la expresión génica por parte del compuesto, son ejemplos de este tipo de biosensores (Karube, 1990; Riedel, 1998). Se han desarrollado microorganismos genéticamente modificados, mediante la transformación con plásmidos que portan genes reporteros (luciferasa, beta-galactosidasa, etc) bajo el control de un promotor reconocido por el analito de interés, que reconocen y detectan la presencia de contaminantes ambientales.
El desarrollo reciente de la tecnología de microarrays de DNA, también llamados chips o microchips de DNA (Southern et al., 1994; para una revisión véase Nature Genetics 21 , suplemento, 1999), permite fijar covalentemente a un soporte sólido (vidrio, nitrocelulosa, nylon etc.) miles de sondas moleculares (ácidos nucleicos, proteínas, carbohidratos, etc), constituyendo así un avance considerable tanto en escalado como en posibilidad de desarrollo de los biosensores por bioafinidad.
Los chips de DNA pueden aplicarse a estudios de expresión génica, resecuenciación de genomas y genotipado, principalmente. Es posible analizar la expresión a nivel de RNA de miles de genes a partir de muestras de tejidos enfermos (cáncer, infectados por virus, bacterias, hongos, etc.) o de los agentes infecciosos propiamente dichos (Cheng et al., 1998). El descubrimiento de los genes implicados en estos procesos permite encontrar y diseñar nuevas drogas, nuevos métodos de diagnóstico, etc. Estudios de resecuenciación y genotipado permiten descubrir mutaciones y polimorfismos de un nucleótido (SNPs) en los organismos estudiados (Hacia et al., 1999).
Otro campo de aplicación de los chips de DNA es el de la identificación de especies de microorganismos, principalmente de las variantes o cepas (más o menos virulentas) de una misma especie (Gingeras et al., 1998), bien con fines clínicos (resistencia a drogas, toxinas, factores de patogenicidad, etc.) o bien con fines ecológicos (biodiversidad, dispersión polimórfica, etc.). Gingeras et al. construyeron un chip de DNA con oligonucleótidos interrogando todas las posiciones (en las dos cadenas) de un fragmento de DNA de 705 pb del gen rpoB de Mycobacterium tuberculosis, para analizar en una colección de 63 aislados clínicos de M. tuberculosis la existencia de mutaciones que confieren resistencia a rifampicina. La identificación de especies se basa en la existencia de polimorfismos específicos de especie que pueden ser fácilmente determinadas con un microchip de DNA. Otro ejemplo de la utilización de chips de DNA para identificar bacterias lo constituye la patente estadounidense número 5.925.522, donde Wong et al. (1999) describen métodos para la detección de Salmonella mediante chips de DNA con secuencias de oligonucleótidos específicas.
Uno de los principales problemas a la hora de analizar la presencia de sustancias en un medio es que éstas están, en la mayoría de los casos, muy diluidas, por lo que se hace necesaria la utilización de grandes volúmenes de partida. Por ejemplo, las bacterias Gram negativas infecciosas pueden estar presentes en menos de 10 copias por mililitro (mi) de sangre o de agua potable, virus como el de la inmunodeficiencia humana pueden existir en menos de 5 copias por mi de sangre en un paciente infectado, y agentes infecciosos como Escherichia coli y Salmonella pueden manifestarse en menos de 10 copias por gramo de comida. La patente europea número EP1179585, A3 (fecha de publicación 13-02-2002) aporta una solución al problema de aplicar grandes volúmenes a sistemas de análisis basados en microfluídica, mediante la incorporación de chips microfluídicos o componentes en cartuchos más grandes que contienen cualquier combinación de canales, cámaras, reservónos o regiones de detección y procesamiento. En dicha invención se describe un utensilio para la separación de analitos de un fluido y concentrarlos en un volumen inferior al original. Dichos analitos pueden ser desde organismos, células, proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos, partículas víricas, compuestos químicos o bioquímicos, aunque el uso preferencial es para la detección de ácidos nucleicos. Por todo lo anterior, resulta evidente que la capacidad de medir los contaminantes o patógenos del aire, agua y suelo es crucial a la hora de comprender y evaluar los riesgos de la presencia de dichos analitos sobre la salud humana y el ecosistema. Los costes inherentes a la química analítica son cada vez más altos, y como respuesta se ha avanzado considerablemente tanto en los métodos de detección en el laboratorio como el las técnicas analíticas de campo, donde la toma de muestras y el análisis se hacen in situ. Con la incorporación de métodos de campo se reduce el transporte de muestras con todo lo que ello conlleva, empaquetado, transporte, almacenaje y cuidado, etc, y se facilita la toma de decisiones. Por otra parte, las técnicas in situ permiten una importante reducción en el tiempo comprendido entre la toma de la muestra y su análisis, con lo que se reduce notablemente el riesgo de degradación (química, fotoquímica o térmica) o contaminación de la misma. No obstante, y aunque se trata de métodos relativamente más rápidos y baratos, tienen ciertas limitaciones como es la capacidad de analizar un rango estrecho de compuestos y una sensibilidad y precisión inferior a las técnicas clásicas de laboratorio. Sin embargo permiten la toma de un gran número de muestras en sitios contaminados y son especialmente importantes para planes de estudio integral en ciertas áreas donde un seguimiento continuo se hace imprescindible. Los métodos usados deben anticipar la presencia de contaminantes o patógenos no esperados, e incluso en concentraciones muy pequeñas que, sin embargo, pueden ser altamente peligrosas.
La caracterización de áreas contaminadas debe llevarse a cabo mediante una combinación de métodos analíticos de laboratorio y métodos de diagnóstico y rastreo in situ. Una vez identificado un marcador clave, los métodos de campo permiten mapear su distribución espacial y temporal, así como realizar un seguimiento preciso a lo largo de un eventual proceso de remediación. Han sido descritas, y muchas de ellas ya comercializadas, una gran variedad de técnicas de laboratorio basadas en biosensores para detectar y medir la concentración de biomarcadores en un medio o en un organismo. Un gran número de tales técnicas son llevadas a cabo por instrumentos de una forma semiautomática y robotizada. Tales instrumentos, además de su complejidad, gran tamaño y alto coste económico, deben competir con otros métodos de campo como inmunoensayos, kits para test químicos, y otras técnicas de laboratorio miniaturizadas, aparte de los obstáculos de comercialización comunes a este tipo de productos tan especializ do. Actualmente existen diversos equipos portátiles para la detección de analitos in situ, pero requieren de personal especializado para su manipulación. Por tanto, un buen instrumento biosensor debe ser suficientemente versátil como para medir varios elementos y en un amplio rango de concentraciones, poseer pequeño tamaño, así como ser capaz de detectar compuestos químicos complejos de una forma automática, continua y por control remoto. Equipos de estas características son los indicados para la monitorización continua de analitos en estaciones fijas de ríos, mares, lagos, etc, o para incorporarse a un sistema móvil (por ejemplo, un robot) que permita analizar muestras en diferentes puntos de suelos o medios acuáticos.
La detección de sustancias (analitos) contaminantes (tóxicas o no) en un medio u organismo es extremadamente importante a la hora de tomar decisiones tanto de carácter medio-ambiental como de carácter médico. En muchos casos basta con un análisis puntual, pero muchas veces es imprescindible una monitorización continua de uno o varios analitos. Para ello se requiere la repetición del proceso tantas veces como sea necesario por parte de un operario especializado, con el consiguiente coste en recursos (económicos, de tiempo y de personal debidamente formado) aparte de que los resultados pueden verse comprometidos por falta de uniformidad en dicho proceso. Este problema suele solventarse mediante sistemas de toma de muestras y análisis automáticos o semiautomáticos, con complicados y sofisticados instrumentos biomédicos, o complejas estaciones de seguimiento medioambiental. Además, el número de sustancias analizadas simultáneamente mediante los métodos actuales es muy bajo, o incluso de un único analito en la mayoría de los casos. Por ejemplo, los métodos actuales más usados para el análisis microbiológico de aguas, suelos y edificios están basados en las técnicas de cultivo clásicas, en ensayos inmunológicos, o más recientemente en la reacción de PCR, bien sea con equipos portátiles o en laboratorio, pero siempre un número limitado de muestras y analitos. Por otro lado, existen situaciones especiales donde la toma de muestras y el análisis in situ se hace especialmente difícil como en lugares de difícil acceso o sitios altamente contaminados con productos tóxicos o biológicos.
La presente invención tiene por objeto eliminar los inconvenientes expuestos mediante el desarrollo de un aparato robotizado y susceptible de manejo por control remoto y a un método que permiten el análisis de múltiples muestras naturales, y la detección y caracterización simultánea desde decenas hasta miles de analitos diferentes en un solo ensayo. La presente invención se beneficia del desarrollo reciente de la tecnología de microarrays de DNA y proteínas, que ha aumentado enormemente la capacidad de análisis y la sensibilidad de detección, permitiendo el estudio problemas biológicos, biomédicos y biosanitarios. A diferencia de las tecnologías basadas en microarrays que se han desarrollado hasta la fecha (que requieren de personal especializado, y de protocolos complejos y laboriosos para el procesado de las muestras), en la presente invención el tratamiento de la muestra a analizar se reduce considerablemente y todo el proceso se realiza de forma robotizada.
La invención incluye un aparato capaz de procesar volúmenes que pueden ir desde nanolitros hasta mililitros de una muestra líquida (fluidos corporales, agua), o una suspensión (de suelo, sedimento o roca previamente triturada); y un método que permite la detección de al menos un analito de una forma sencilla y sin necesidad de purificar o concentrar dicha muestra.
El aparato comprende una serie de módulos operativos, en los cuales se manipulan, tratan y analizan las muestras, y una serie de módulos de control, de los módulos operativos, que supervisan el funcionamiento de dichos módulos operativos.
El funcionamiento de todo el conjunto está supervisado por un módulo de control global. Además, el aparato cuenta con un módulo de comunicaciones Más concretamente, el aparato de la invención consta de:
- un Módulo Homogenizador de Muestras
- un Módulo de Procesamiento de Muestras
- un Módulo de Gestión de Reactivos y Soluciones - un Módulo de Reacción
- un Módulo de Lectura de Datos
Además el aparato de la invención puede incluir un módulo de adquisición de muestras y un módulo de distribución de muestras.
En cuanto a los módulos de comunicación y control incluirán: - un Módulo de Comunicaciones
- un Módulo de Control Global
- un Módulo de Control de la Adquisición de Muestras
- un Módulo de Control de la Distribución de Muestras
- un Módulo de Control del Homogeneizador de Muestras - un Módulo de Control de del Procesamiento y Reacción
- un Módulo de Control del Gestor de Reactivos y Soluciones
- un módulo de Control del Lector de Datos
La secuencia de procesos que se llevarán a cabo con el aparato y método de la invención es: 1. Extracción de la muestra a analizar a través de un módulo de adquisición de muestras. Dichas muestras pueden estar en estado líquido, sólido o en suspensión.
2. Las muestras son distribuidas por medio de un módulo de distribución de muestras hasta la posición de homogenización y procesamiento. 3. Previamente a la homogenización, se prepara una solución o suspensión con el contenido de dichas muestras. Para ello, un módulo de gestión de reactivos y soluciones controla la adición de una solución salina o una solución tampón para que se mezcle con dicha muestra.
4. La homogenización de la muestra consiste en formar una mezcla homogénea entre dicha muestra y la solución salina o tampón, con el fin de disgregar al máximo la materia particulada y de disolver los analitos presentes. Este proceso es llevado a cabo por el módulo homogenizador de muestras.
5. La muestra homogenizada puede ser sometida a diferentes procesos en el módulo de procesamiento de muestras: modificación química, bioquímica o biológica (que interaccione con una célula viva), o modificación física como filtrado, concentración, etc. El resultado del procesamiento puede ser el etiquetado molecular o no de los analitos presentes en la muestra. Dicho etiquetado puede estar formado por una sustancia fluorescente o cualquier otra sustancia que permita la identificación 5 posterior del analito modificado.
6. La muestra procesada circula a través del módulo de reacción donde entra en contacto con un dispositivo sensor. Dicho sensor está constituido por una o más sustancias capaces de interaccionar con los analitos (modificados o no) presentes en la muestra, de tal forma que dichos analitos son retenidos en el módulo 0 de reacción, mientras el exceso de muestra es almacenada en un depósito de desechos.
7. Una vez ha circulado toda la muestra a través del módulo de reacción, dicho módulo puede ser lavado, para eliminar restos de muestra procesada, con una solución controlada por el módulo de gestión de reactivos y soluciones. Esta operación 5 de lavado puede ser suprimida y añadir nuevos reactivos al módulo de reacción y posteriormente hacer nuevos lavados, en caso necesario.
8. El objetivo final es la detección de analitos retenidos en el sensor del módulo de reacción. Para ello el módulo de lectura de datos está dotado de dispositivos que detectan aquellos analitos etiquetados (fluorescentes o no). Si dichos o analitos han sido modificados con una sustancia fluorescente (fluorocromo), el módulo de lectura irá dotado de una fuente de radiación para excitar dicho fluorocromo y un detector de fluorescencia.
9. Los datos detectados son procesados por un software adecuado para una presentación final del resultado. Dicha presentación puede estar constituida por 5 un mapa de "bits" que origine una imagen susceptible de ser tratada informáticamente, bien por el software del módulo de lectura de datos, bien por una estación remota.
10. El resultado final del proceso es enviado a una estación remota a través del módulo de comunicaciones. 0 Las principales ventajas que aporta la presente invención respecto de los sistemas actuales son:
1. Potencial de automatización del sistema completo, desde la toma de muestras, procesamiento, análisis hasta el envío de datos 2. Simplificación considerable del número de etapas necesarias para el procesado de las muestras
3. Potencial de miniaturización
4. Capacidad para detectar de una sola vez desde unos cuantos hasta miles de sustancias, preferentemente compuestos de origen biológico.
5. Requerimientos energéticos bajos
6. Gran autonomía
7. Posibilidad de control remoto.
8. Posibilidad de aplicación a la exploración planetaria (por ejemplo Marte) 0 A continuación se va a proceder a realizar una descripción detallada de cada uno de los módulos que componen la invención.
En resumen, el método de la invención, para la detección de sustancias o analitos a partir del análisis de una o más muestras, comprende las etapas de: a) mezclar dicha muestra con un líquido tampón apropiados; b) homogeneizar con un 5 sistema homogeneizador: c) añadir reactivos para modificar dicha muestra; d) filtrar la muestra; e) inyectar dicha muestra a una cámara de reacción; f) dejar reaccionar la muestra con un biosensor; g) lavar el exceso de muestra no reaccionada; y h) detectar la muestra retenida en el biosensor. Las diferentes etapas se desarrollarán siguiendo un orden que puede variar y que dependerá del tipo de muestra a analizar. 0 1.- Modulo de Comunicaciones
El Módulo de Comunicaciones es el interfaz del equipo con el usuario, que puede ser local o remoto. En caso de tratarse de uno local el modulo de comunicaciones permitirá establecer una conexión según alguno de los siguientes protocolos: 5 1. Consola, en caso de usuario local.
2. Enlace vía serie RS232, RS422 o RS485.
3. Enlace paralelo.
4. Enlace mediante USB (Universal Serial Bus).
5. Enlace TCP, UDP, IP o cualquier otro protocolo para la transmisión de o datos entre ordenadores.
6. Enlaces vía radio, IRDA, ...
7. Buses de campo: PROFIBUS, CAN, FieldBus, InterBUS-S, ...
8. Enlaces telefónicos: GSM, ...
En el caso del establecimiento del enlace de datos, el módulo de 5 comunicaciones realiza las tareas de codificación de datos, encapsulamiento, control -lu ¬
de acceso al medio, envío/recepción de datos/comandos e implementación de opciones de seguridad mediante la validación de la integridad de los comandos.
2.- Controlador global
Este es el módulo que controla y supervisa el funcionamiento de todo el equipo y realiza al menos las siguientes funciones:
1. Recepción de los mensajes procedentes del Módulo de Comunicaciones. Validación de los parámetros y órdenes recibidas. Interpretación de tales órdenes (tareas) enviadas por el usuario.
2. Sistema de ejecución de tareas: secuenciación global de subprocesos, envío de órdenes- a los controladores locales correspondientes.
3. Realización de tareas automáticas preprogramadas.
4. Supervisión del funcionamiento de cada módulo: realización de subtareas y verificaciones de seguridad (monitorización de los parámetros del proceso y comprobación de su inclusión en los correspondientes rangos adecuados de funcionamiento). Control de parada de emergencia si la seguridad así lo requiere.
5. Recuperación ante fallos de subsistemas.
6. Envío al operador de los valores de los parámetros de trabajo para su monitorización general del proceso a través del Módulo de Comunicaciones.
Además, este controlador puede permitir tanto la operación cercana como remota del aparato.
3.- Módulo de Adquisición de las Muestras
Se define "Módulo de Adquisición de las Muestras" como el módulo que permite extraer, almacenar y transportar las muestras a analizar de una manera robotizada; estas muestras pueden ser: sólidas, líquidas, en suspensión. El Modulo de Adquisición de Muestras consta de dos partes: un dispositivo para la extracción de la muestra y otro para su almacenaje y transporte hasta la tolva de entrada.
Se identifican las siguientes realizaciones particulares: 1. En una realización particular de la invención, para la extracción de muestras sólidas, el módulo consta de un robot con al menos seis grados de libertad con una herramienta colocada en su extremo distal que permite el taladrado del suelo o la roca por medio de un percutor que esta accionado por un sistema hidráulico, neumático o mecánico, cuando funcione a frecuencias entre 1 Hz y 1 KHz, y accionado por un actuador piezoeléctrico para frecuencias hasta 60 KHz. El transporte del sólido pulverizado se realiza por medio de un sistema de aspiración y transporte neumático.
2. En otra realización particular de la invención, para la extracción de muestras liquidas se utiliza un sistema hidráulico de bombeo que deposita la muestra
5 liquida en la tolva.
3. En otra realización particular de la invención, para la extracción de muestras en suspensión (en aire), el módulo consta de un sistema de succión y filtrado. El filtro, con las partículas retenidas se traslada parte del líquido al Módulo de Distribución de Muestras. 0 4. En otra realización particular de la invención, un sistema de succión toma aire del medio que rodea a la invención y se bombea el gas obtenido en una disolución, posteriormente una bomba traslada parte del líquido al Módulo de Distribución de Muestras.
4.- Controlador de la Adquisición de Muestras 5 El Controlador de la Adquisición de Muestras se encarga de controlar todos los mecanismos encargados de realizar las funciones descritas en el apartado 3.
El módulo de control de la adquisición de muestras será activado por el módulo de control global, realizar las funciones preprogramadas y enviará una señal eléctrica analógica o digital al módulo de control global cuando haya finalizado su función, al o igual que cuando se haya detectado algún error en su ejecución.
En la realización particular del Módulo de adquisición de muestras identificada en el punto 1 del apartado 3 el módulo de control de la adquisición de muestras realizará el control del brazo articulado, así como de la herramienta de que disponga para la realización de orificios en el suelo, rocas, ... y del dispositivo que se utilice para 5 recoger las muestras pulverizadas.
En la realización particular del módulo de adquisición de muestras identificada en el punto 2 del apartado 3 el módulo de control de la adquisición de muestras realizará el control de la bomba encargada de la toma de muestras líquidas.
En la realización particular del módulo de adquisición de muestras identificada 0 en el punto 3 del apartado 3 el módulo de control de la adquisición de muestras controlará el sistema de succión de aire y el mecanismo que traslada el filtro al módulo de distribución de muestras.
En la realización particular del módulo de adquisición de muestras identificada en el punto 4 del apartado 3 el módulo de control de la adquisición de muestras 5 controlará el sistema de succión de aire y la bomba que toma la muestra liquida del depósito donde se ha bombeado el aire y la deposita en el módulo de distribución de muestras.
5.- Modulo de Distribución de Muestras
Se define "Modulo de Distribución de Muestras" como el conjunto de
5 dispositivos que permite el análisis independiente de varias muestras tomadas con el mismo módulo de adquisición de muestras, por lo que necesita de un mecanismo de distribución de las muestras desde la tolva de entrada hacia los diversos recipientes de homogeneización del Módulo de Procesamiento de Muestras
En una realización particular, el módulo de distribución de muestras consta de 0 un dispositivo móvil, por ejemplo en forma de tambor giratorio, capaz de alojar uno o mas recipientes de homogeneización, que permite situar debajo de la tolva de entrada el recipiente que se desea utilizar, para recibir la muestra sólida o liquida, o un filtro con partículas en suspensión retenidas. Una vez introducida la muestra en la cámara de homogeneización, se gira nuevamente el tambor hasta situar el recipiente alineado 5 con el bastidor móvil del Módulo de Procesamiento de Muestras, para iniciar su procesado.
El dispositivo móvil o tambor giratorio puede ir montado sobre un eje vertical u horizontal, con facultad de giro sobre el mismo.
6.- Controlador de la Distribución de Muestras 0 El Controlador de la Distribución de Muestras se encarga de controlar los mecanismos, sensores y actuadores electromecánicos encargados de distribuir adecuadamente las muestras introducidas en el módulo de distribución de muestras.
El módulo de control de la distribución de muestras será activado por el módulo de control global, realizar las funciones preprogramadas y enviará una señal eléctrica 5 analógica o digital al módulo de control global cuando haya finalizado su función, al igual que cuando se haya detectado algún error en su ejecución.
En la realización particular indicada en el apartado 5 se encarga de controlar el motor que gira el tambor giratorio utilizando los sensores correspondientes para identificar la posición del tambor. o 7.- Módulo del Homogeneizador de Muestras
El Módulo del Homogenizador de Muestras está constituido por un dispositivo capaz de actuar sobre las muestras para producir su homogenización. Dicho dispositivo puede ser de acción mecánica, como trituradores y vibradores, de acción térmica (resistencias, etc), o generadores de ondas (ultrasonidos, etc.). Dichos dispositivos son capaces de regular el grado de agitación y homogenización de dichas muestras, desde una mezcla suave hasta producir la ruptura de células (lisis) tan resistentes como pueden ser las esporas de algunos microorganismos.
Se han identificado las siguientes realizaciones particulares del módulo 5 homogenizador de muestras:
1. En una realización particular de la invención, el módulo homogenizador de muestras está formado por un dispositivo piezoeléctrico generador de ultrasonidos que convierte la energía eléctrica de alta frecuencia, suministrada por el controlador del homogeneizador, en vibraciones longitudinales. Tales vibraciones son amplificadas 0 por el extremo libre de una bocina, firmemente unida al dispositivo piezoeléctrico. El módulo homogenizador de muestras está alojado dentro del bastidor de cierre de la cámara principal del Modulo de Procesamiento de Muestras, firmemente sujeto a él y en contacto con la pared de cierre de dicha cámara.
Las vibraciones de la bocina generan ondas de presión en la solución o 5 suspensión que contiene la muestra procesada que, a su vez, producen cavitación dentro de dicha solución o suspensión, disgregando la materia particulada y usando las células que pudieran existir en la muestra, y homogeneizando, de esta forma, dicha muestra. El lisado se puede mejorar introduciendo en la muestra liquida micro-esferas.
El lisado por ultrasonidos se puede realizar por medio de la acción directa de la o bocina en el líquido o a través de una membrana tal como se realiza en la patente US
6431476.
Los sensores de presión y temperatura del Módulo de Procesamiento de Muestras monitorizan el adecuado funcionamiento del proceso.
2. En otra realización particular de la invención, el módulo homogenizador de 5 muestras está formado por un homogenizador mecánico de aspas o pistón. La acción mecánica de las aspas o el pistón en el liquido y el rozamiento mismo con las paredes permite la homogenización e incluso lisado. La mejora de la homogenización es posible añadiendo agentes abrasivos.
8.- Controlador del Homogeneizador de Muestras 0 El Controlador del Homogeneizador de Muestras se encarga de controlar los mecanismos electromecánicos y sensores necesarios para homogeneizar adecuadamente las muestras introducidas en el módulo homogenizador de muestras. El módulo de control del homogeneizador de muestras será activado por el módulo de control global, realizar las funciones preprogramadas y enviará una señal eléctrica analógica o digital al módulo de control global cuando haya finalizado su función, al igual que cuando se haya detectado algún error en su ejecución.
En la realización particular 1 del apartado 7 el módulo de control del homogeneizador de muestras convierte la energía eléctrica del sistema de alimentación en energía eléctrica de alta frecuencia trasmitiéndosela al piezoeléctrico según la secuencia temporal prefijada. Además regula el voltaje de salida al piezoeléctrico modificando la amplitud de la vibración.
En la realización particular 2 del apartado 7 el módulo de control del homogeneizador de muestras debe activar/desactivar el dispositivo electromecánico que acciona las aspas o el pistón.
9.- Módulo de Procesamiento de Muestras
El "Modulo de Procesamiento de Muestras" se define como un conjunto de dispositivos cuya finalidad es someter dichas muestras a diferentes tratamientos físicos (homogenización, lisado, agitación, calentamiento, radiación, etc), químicos (modificación con agentes químicos o bioquímicos como reacciones enzimáticas, etc), o biológicos (interacción con microorganismos).
En una realización particular de la invención el módulo de procesamiento de muestras consta de dos subconjuntos claramente diferenciados: un recipiente de homogeneización que alberga la muestra dentro de la cámara de homogeneización, y un bastidor móvil de cierre de dicha cámara.
En una realización particular de la invención, el módulo de procesamiento de muestras incluye desde uno a varios recipientes de homogenización, permitiendo el análisis de al menos una muestra por recipiente. Cada Recipiente de Homogenización está provisto de una o más cámaras principales de homogeneización, rodeada de varias cámaras secundarias conectadas con ella por conductos de diversos tamaños. La cámara principal de homogeneización, está abierta para recibir, recibe las muestras en estado sólido o líquido, a través de la tolva del módulo de adquisición de muestras. Durante el procesamiento de la muestra, esta abertura es herméticamente cerrada por el pistón del bastidor de cierre del módulo de procesamiento de muestras. Las cámaras secundarias del Recipiente de Homogenización están herméticamente selladas con tapones de silicona, y comunicadas por medio de conductos de varios tamaños de sección con la cámara principal. Estas cámaras secundarias son utilizadas para la introducción de diversos reactivos en la cámara de homogeneización, inyectados por medio de las cánulas del Módulo de Gestión de Reactivos y Soluciones. Varias de estas cámaras secundarias alojan sondas para medir parámetros de los procesos realizados en la cámara principal de homogeneización (temperatura, presión, pH, conductividad, etc.).
La pared de la cámara principal dispone de un orificio de venteo, que determina el momento de cierre hermético de dicha cámara por el pistón, al ser sobrepasado dicho orificio por el pistón, por ejemplo por una junta anular de estanquidad de dicho pistón. Además este pistón será desplazable dentro de la cámara principal, a partir de la posición de cierre hermético, para provocar el aumento de presión dentro de la cámara. A través de este orificio de venteo pueden introducirse las muestras en la cámara principal. Las cámara secundarias pueden ir cerradas por un lado mediante tapones a través de los cuales pueden introducirse cánulas pertenecientes al módulo de gestión de reactivos para la inyección de reactivos o soluciones, y por el otro lado con válvulas normalmente cerradas y accionadas eléctricamente, mecánicamente por el movimiento del bastidor del módulo de homogeneización, por medio de una sobrepresión generada por el módulo de gestión de reactivos.
En una realización particular de la invención, cada recipiente de homogeneización incluye, también, un sistema de filtros y una válvula situados en el conducto de salida de la muestra. El filtro se utiliza para evitar que sólidos de un tamaño superior al deseado accedan al Módulo de Reacción. La válvula aisla o comunica al Recipiente de Homogeneización con el Módulo de Reacción, permitiendo controlar el momento en el que la muestra procesada debe ser inyectada en el Modulo de Reacción.
En una realización particular de la invención el módulo de procesamiento de muestras consta de un segundo subconjunto consistente en el bastidor móvil de cierre de la cámara de homogeneización. Durante el procesamiento de la muestra, este subconjunto realiza el cierre hermético de la parte superior de la cámara de homogeneización, por medio de un pistón fijo al bastidor y provisto de una junta de estanqueidad. El bastidor móvil es único para todos los recipientes del módulo de procesamiento de muestras, los cuales son alineados con el bastidor mediante el tambor giratorio del módulo de distribución de muestras. El bastidor esta guiado axialmente y accionado por un motor paso a paso, con una reducción de tornillo- tuerca. Para ello, dicho bastidor va montado sobre el eje del módulo de distribución de muestras, a uno de los lados de dicho tambor o dispositivo móvil. Este sistema permite un control muy preciso del avance axial del pistón. A su vez, el bastidor móvil aloja las cánulas del módulo de gestión de reactivos y soluciones y el sistema piezoeléctrico del módulo homogenizador de muestras, lo cual permite un posicionamiento preciso para la inyección de reactivos, mediciones de parámetros de la muestra y ejecución de la homogeneización. El avance del pistón dentro de la cámara de homogeneización, una vez producido el cierre hermético, genera una sobre-presión en la solución o suspensión a tratar, garantizando el contacto necesario entre la bocina del sistema piezoeléctrico y la pared del pistón para la generación de cavitación en la solución o suspensión.
En la realización descrita el bastidor en el que va montado el pistón para el cierre del recipiente va situado por encima del tambor giratorio de eje vertical, pero en el caso de que el tambor giratorio sea de eje horizontal, dicho bastidor iría situado a un lado del tambor giratorio, de forma que al otro lado del mismo pueden situarse los diferentes recipientes. En cualquier caso, cada uno de los recipientes del módulo de procesamiento de muestras puede ir dotado de medios para su cierre. Estos medios pueden consistir en un pistón o válvula montado en cada recipiente y accionado por el movimiento del bastidor desplazable del módulo de homogeneización.
10.- Controlador del Procesamiento y Reacción de Muestras El Controlador de Procesamiento y Reacción de muestras se encarga de controlar los mecanismos electromecánicos y sensores necesarios para procesar adecuadamente las muestras introducidas en el Módulo de procesamiento de muestras e inyectarlas en el módulo de reacción, después del procesamiento
El CPR será activado por el módulo de control global, realizar las funciones preprogramadas y enviará una señal eléctrica analógica o digital al módulo de control global cuando haya finalizado su función, al igual que cuando se haya detectado algún error en su ejecución. En la realización particular mencionada en el apartado 9 el CPR se encarga de controlar los componentes electromecánicos que posicionan el bastidor en el Recipiente de Homogeneización, así como los sensores que se utilizan para conocer la posición del bastidor, y los que monitorizan la cámara de homogeneización.
11.- Modulo de Reacción Se define "Módulo de Reacción" como un dispositivo que consta de un soporte donde se encuentra una cámara de reacción, comunicada por un conducto principal con el módulo de procesamiento de muestras, y por otro conducto con el Módulo de Gestión de Reactivos y Soluciones. La cámara de reacción aloja un biosensor o sistema sensor capaz de detectar sustancias (desde moléculas a microorganismos completos) presentes en la solución o suspensión. Dicho sistema sensor puede estar constituido por al menos una sustancia detectora en formato de micromatriz ( biochip) de ADN o proteínas, o cualquier sistema basado en microfluídica. Dichas sustancias detectoras pueden elegirse del grupo formado por: a) una sustancia de naturaleza aminoácida; b) una sustancia de naturaleza proteica; c) una sustancia de naturaleza nucleótica; d) un ácido nucleico; e) un ácido nucleico-peptídico (BNA); f) una sustancia de naturaleza lipídica; g) una sustancia de naturaleza sacarídica; h) una sustancia que sea combinación de al menos dos de las anteriores; j) una célula completa viva; j) una célula completa en forma de espora; k) un lisado o extractor celular; I) un tejido formado por células; m) un virus completo o cualquiera de sus componentes; n) polímeros sintéticos y o) polímeros impresos molecularmente (MIP, molecularly imprinted polymers). Las proteínas capaces de unirse específicamente a otras sustancias pueden ser anticuerpos monoclonales o policlonales. Además, los compuestos modificadores de la muestra pueden elegirse entre un reactivo químico capaz de unirse a alguno de los analitos presentes en la muestra, o una o más sustancias de entre las mencionadas anteriormente, o una combinación de las mismas. Dicha micromatriz puede estar constituido por un único tipo o una mezcla de las sustancias detectoras mencionadas (por ejemplo, una micromatriz que contenga puntos de ADN y de proteínas en un mismo soporte). La cámara de reacción puede funcionar como una célula de flujo, de manera que la solución o suspensión procedente del módulo de procesamiento de muestras circula a través de dicha cámara de reacción para permitir la interacción de las sustancias presentes en la solución o suspensión con la sustancia o sustancias detectoras presentes en el sensor. La señal de la muestra retenida en el biosensor puede ser amplificada por un cóctel o muestra conteniendo una o mas sustancias de las citadas anteriormente.
En una realización particular de la invención, la solución o suspensión circula desde el módulo de procesamiento de muestras al módulo de reacción a través de una válvula, un sistema filtros, y un conducto principal. Por este conducto entra la muestra, una vez procesada, a la cámara de reacción. Esta misma cámara tiene un conducto de salida conectado con el un recipiente almacén de desechos donde termina la muestra una vez ha reaccionado con la sustancia o sustancias detectoras presentes en el sensor. A la cámara de reacción llegan directamente uno o varios conductos adicionales desde las cámaras secundarias del módulo homogenizador de muestras. Estos conductos permiten inyectar reactivos o, simplemente, disolución de lavado, en la cámara de reacción, antes de realizar la lectura o medida de la reacción. En una realización particular, la solución o suspensión, una vez homogeneizada, se hace reaccionar con un reactivo fluorescente que pueda quedar incorporado (mediante enlace covalente, iónico, hidrofóbico o de otro tipo) a las sustancias (desde moléculas a microorganismos completos) presentes en dicha solución o suspensión. Una vez incorporado dicho reactivo fluorescente, el exceso del mismo que no ha reaccionado es inactivado por una sustancia inactivante que impida su reacción posterior. Dicha sustancia inactivante puede ser un bloqueante químico que aporte un exceso de grupos funcionales reactivos con el reactivo fluorescente (por ejemplo, grupos amino, carboxilo, sulfhidrilo u otros). Una vez inactivado el exceso de reactivo fluorescente, la muestra es filtrada e inyectada en la cámara de reacción de forma continua o discontinua. Su paso por la cámara de reacción permite la interacción con las sustancias detectoras del sensor. Una vez producida la reacción, el exceso de muestra marcada no retenida en el sensor es eliminado por lavados sucesivos de la cámara de reacción. El líquido de lavado es almacenado en el depósito de desechos.
En otra realización particular de la invención, la señal de la muestra retenida en el sensor es amplificada por un cóctel conteniendo una o más sustancias (ADN, anticuerpos, PNA, etc) marcados con una sustancia fluorescente, un compuesto metálico, o una enzima. Dicho cóctel es almacenado en una de las cámaras secundarias del MPM, hasta que es inyectado a la cámara de reacción una vez ha sido lavado el exceso de muestra que no ha reaccionado con el sensor. Tras un período adecuado de incubación el exceso de dicho cóctel no retenido es evacuado con la solución de lavado.
Las diferentes cámaras del módulo de reacción irán montadas en un dispositivo móvil, por ejemplo en el tambor móvil del módulo de distribución.
12.- Módulo de Gestión de Reactivos y Soluciones
Se define "Módulo de Gestión de Reactivos y Soluciones" como un conjunto de dispositivos para almacenar y dispensar con precisión, en el momento requerido, las diferentes soluciones y reactivos que intervienen en las diferentes etapas de procesamiento de las muestras: homogeneización, modificación, reacción, lavado, etc.
En una realización particular de la invención, el elemento principal del módulo de gestión de reactivos y soluciones lo compone una jeringa motorizada que realiza las funciones de almacenamiento y dispensador de fluidos. El módulo consta de tantos conjuntos idénticos de jeringas motorizadas como reactivos diferentes sean necesarios. Cada conjunto incorpora los siguientes elementos:
1. Una jeringa, fija al bastidor del módulo, cuya capacidad depende del número de muestras a analizar. 5 2. Un actuador lineal provisto de motor paso-a-paso que acciona el vastago del émbolo de la jeringa. El actuador está diseñado para poder inyectar con precisión fluidos en las cámaras correspondientes cuando éstas se encuentran a las presiones diferenciales definidas por el procedimiento funcional.
3. Un sensor de posición que determina la posición del émbolo de la 0 jeringa, permitiendo el control del conjunto en lazo abierto ("fin de carrera") o en lazo cerrado ("encoder").
4. Una válvula pasiva (antirretorno) o activa (motorizada) que mantiene la barrera de presión en los circuitos de fluidos cuando la jeringa no está accionada.
5. Una cánula que, como elemento final del módulo, penetra a través de 5 los sellos de las cámaras laterales del Recipiente de Homogeneización. La cánula está fija al bastidor móvil del módulo de procesamiento de muestras y, por lo tanto, su movimiento de penetración está sincronizado con el movimiento de avance de dicho bastidor.
6. Todos los conductos y accesorios necesarios para conectar los 0 diferentes componentes que forman el circuito de fluidos.
En otra realización particular de la invención, caracterizada por un número importante de reactivos y/o soluciones, el módulo de gestión de reactivos y soluciones está formado por:
• Varios depósitos, tantos como reactivos y/o soluciones se quieran utilizar. 5 « Un único sistema de bombeo capaz de aspirar los fluidos de los diferentes depósitos y de dispensarlos a la cámara de homogeneización o de reacción.
• Una o varias válvulas de distribución, cada una de ellas provista de varias vías de entrada y una vía de salida, capaces de abrir o cerrar los diferentes o conductos desde los depósitos hasta la cámara de homogeneización o de reacción.
Esta configuración del módulo de gestión de reactivos y soluciones simplifica al máximo el número de actuadores requerido y el número de vías de inyección. En otra realización particular de la invención, caracterizada por un número importante de reactivos y/o soluciones, el módulo de gestión de reactivos y soluciones está formado por:
• Varias jeringas-depósito estancas, tantas como reactivos y/o soluciones 5 se quieran utilizar, provistas de un émbolo sin vastago, que divide la jeringa-depósito en dos compartimentos estancos: uno, provisto de vía de salida con válvula antirretorno, para el reactivo o solución, y otro, provisto de una vía de entrada, para el fluido impulsor.
• Un circuito cerrado del fluido impulsor, formado por un único sistema de i o bombeo capaz de aspirar dicho fluido de un depósito y de dispensarlo a los diferentes compartimentos estancos de las jeringas-depósito, accionando, de está forma, los émbolos de las mismas.
• Una o varias válvulas de distribución, en el circuito del fluido impulsor, cada una de ellas provista de varias vías de salida y una vía de entrada, que permiten
15 seleccionar la jeringa-depósito a actuar.
• Vías de salida e inyección individuales para cada jeringa-depósito, provistas de válvula antirretorno y cánula.
• Como alternativa al punto anterior, vía de inyección común, provista de válvula antirretorno y cánula, conectada con la vía de salida de cada jeringa-depósito
20 a través de una o varias válvulas de distribución.
Esta configuración del módulo de gestión de reactivos y soluciones simplifica al máximo el número de actuadores requerido y permite la inyección de reactivos/soluciones a través de vías individuales u, opcionalmente, a través de una única vía, si la compatibilidad de fluidos lo permite.
25 13.- Controlador de la Gestión de Reactivos y Soluciones
El Controlador del Módulo de Gestión de Reactivos y Soluciones se encarga de controlar los mecanismos electromecánicos y sensores necesarios para almacenar y dispensar con precisión, en el momento requerido, las diferentes soluciones y reactivos que intervienen en las diferentes etapas de procesamiento de las muestras.
30 El CMGRS será activado por el módulo de control global, realizar las funciones preprogramadas y enviará una señal eléctrica analógica o digital al módulo de control global cuando haya finalizado su función, al igual que cuando se haya detectado algún error en su ejecución. En la primera realización particular indicada en el apartado 12 el CMGRS se encarga de controlar el actuador que mueve la jeringa; de monitorizar el sensor que determina la posición del embolo y de actuar sobre la electroválvula que mantiene la barrera de presión (ver 4 de la primera realización indicada en el apartado 12).
5 14.- Modulo de Lectura de Datos
Se define "Módulo de Lectura de Datos" como el conjunto de dispositivos que permitan detectar las reacciones producidas en la cámara de reacción, y procesar convenientemente las señales detectadas.
En una realización particular de la invención, el detector de las reacciones es 0 un lector CCD de alta resolución y sensibilidad, con la óptica y filtros necesarios para leer únicamente la frecuencia de la radiación electromagnética producida como resultado de la reacción. Dicha radiación electromagnética se produce por excitación de una sustancia reactiva que interviene en el proceso de reacción (molécula fluorescente). La excitación de dicha sustancia reactiva se consigue con un haz de luz 5 monocromática procedente de un diodo láser. El lector CCD se encuentra enfrentado a la cámara de reacción, y el haz de luz láser incide en la cámara de reacción con un cierto ángulo para evitar que las reflexiones incidan sobre el lector CCD.
La luz monocromática puede ser guiada por medio de una guía de onda donde se encuentra el biosensor que es excitado gracias a los modos evanescentes que se 0 forman en la superficie exterior de la guía de onda.
15.- Controlador de la Lectura de Datos
El Controlador de la Lectura de Datos se encarga de controlar los dispositivos utilizados para detectar las reacciones producidas en la cámara de reacción.
El módulo de control del lector de datos será activado por el módulo de control 5 global, realizar las funciones preprogramadas y enviará una señal eléctrica analógica o digital al módulo de control global cuando haya finalizado su función, al igual que cuando se haya detectado algún error en su ejecución.
El módulo de control del lector de datos, en la realización particular indicada en el apartado 14 se encarga de activar el láser el tiempo prefijado así como de leer la o información recibida de la cámara y procesarla adecuadamente (filtrado, identificación de las zonas activadas, cuantificación de las zonas activadas, etc.) y transmitirla posteriormente al módulo de control global. Las características y ventajas del aparato y método de la invención podrán comprenderse mejor con la siguiente descripción, hecha con referencia a los dibujos adjuntos, en los que se muestra un ejemplo de realización no limitativo.
En los dibujos: 5 La figura 1 es una vista isométrica frontal del aparato de la invención.
La figura 2 es una vista isométrica posterior del aparato de la invención.
La figura 3 es una vista superior del aparato de la invención en la que se ha retirado la tapa superior.
La figura 4 es una sección según la línea de corte IV-IV de la figura 3. l o Las figuras 5 y 6 son secciones verticales del módulo de procesamiento y del módulo de reacción, según las líneas de corte V-V y VI-VI, respectivamente, de la figura 3.
La figura 7 es una vista isométrica del módulo de reacción.
Las figuras 8 a 14 muestran diferentes posiciones de los módulos de 15 procesamiento y de homogeneización de muestras, a lo largo del proceso.
La figura 15 corresponde al diagrama de funcionamiento del aparato de la invención.
Las figuras 16 y 17 muestran en perspectivas anterior y posterior una variante de ejecución del aparato de la invención. 20 El aparato mostrado en los dibujos consiste en un equipo robotizado que permite la detección de bio-marcadores (moléculas orgánicas y macromoléculas de origen biológico) que existan en el suelo o subsuelo. El método de detección y caracterización de tales bio-marcadores se basa en su interacción con una batería de anticuerpos específicos inmovilizados en posiciones concretas de un soporte sólido 25 (denominado "chip" o "microarray").
Este aparato incluye todos los mecanismos, detectores y electrónica necesarios para la realización automática del experimento. Los componentes utilizados son primordialmente comerciales, diseñados y/o seleccionados para funcionar en condiciones ambientales. 30 Con el fin de facilitar la identificación de los diferentes componentes y el funcionamiento de los mismos, seguidamente se irán describiendo los diferentes módulos que componen el aparato de la invención.
En el ejemplo representado en las figuras 1 a 14, el aparato carece de módulo de adquisición de muestras, introduciéndose manualmente las muestras a analizar. Por este motivo el aparato carece también del correspondiente controlador del módulo de adquisición.
El aparato comprende un bastidor compuesto por una tapa superior 1 , una tapa inferior 2 y una serie de marcos intermedios 3. Este bastidor sirve como armadura para el montaje de los diferentes módulos.
El módulo de distribución de muestras incluye una tolva cilindrica 4 (ver Figura 4), fija a la tapa superior 1 del bastidor y provista de una boca cónica, a través de la cual, se introduce cada muestra de suelo, de una masa aproximada de 250 mg y una granulometría <0,5 mm. El extremo inferior de la tolva está provisto de un cono interior 4', cuya función es repartir la muestra sobre el fondo del recipiente, perteneciente al módulo de procesamiento de muestras, como se expondrá mas adelante. La tolva 4 podría sustituirse por otro adaptador fijo o móvil. Además el módulo de distribución de muestras podría ser alimentado manualmente por un operador o por inyectores de muestras almacenadas en placas multipocillos. El módulo de distribución de muestras soporta, aloja y orienta a los componentes de los módulos de procesamiento de muestras y de reacción y está formado, principalmente, por un tambor giratorio de aluminio anodizado, compuesto por dos bridas: la brida superior 5 (ver Figura 4) aloja a doce recipientes 6 del módulo de procesamiento de muestras; la brida inferior 7 tiene dispositivos para fijar los elementos del módulo de reacción. Ambas bridas están montadas sobre sendos rodamientos 8 de contacto angular, ligeramente precargados por los tornillos de unión de las mismas. Los rodamientos, montados sobre el eje central 9 del bastidor, permiten el giro del tambor alrededor de dicho eje.
El giro del tambor es efectuado por un motor paso-a-paso 10, atornillado a la tapa inferior 2 del bastidor, a través de una transmisión de engranajes compuesta por un piñón 11 fijo al eje del motor, y una rueda 12 atornillada a la brida inferior 7 del tambor. El motor tiene una resolución de 1 ,8 paso y es capaz de dar un par de 0,16 Nm. La relación de transmisión de los engranajes es de i=5:1 , luego, la resolución final del tambor giratorio es de 0,36 °/paso, lo cual permite una resolución de 0,45 mm/paso en el desplazamiento circunferencial de eje de los recipientes del módulo de procesamiento de muestras.
La posición inicial del tambor giratorio es determinada por un sensor óptico 13, fijo al marco 3 del bastidor, cuando el indicador 14, unido al tambor, interfiere con el haz de luz del sensor. El módulo del homogeneizador de muestras incluye un dispositivo piezoeléctrico de ultrasonidos formado por un convertidor 15 (ver Figura 4) comercial y una bocina 16 firmemente atornillada al extremo del convertidor.
El convertidor 15 tiene forma cilindrica (032 mm, longitud = 89 mm) y es excitado a una frecuencia de 40 kHz.
La bocina (016 mm, longitud = 49 mm), fabricada en titanio (Ti 6AI 4V), está formada por tramos cilindricos unidos por transiciones suaves. El extremo libre de la bocina termina en una brida circular (012,2 mm) y plana, que está en contacto con la pared de cierre de la cámara de homogeneización del módulo de procesamiento de muestras.
Este conjunto está alojado dentro del bastidor de desplazamiento longitudinal 17 de cierre de la cámara principal del Modulo de Procesamiento de Muestras, firmemente sujeto a él por medio de una abrazadera 17' que sujeta la carcasa cilindrica del convertidor 15. El convertidor transforma la energía eléctrica de alta frecuencia, suministrada por el módulo de control del homogeneizador de muestras, en vibraciones longitudinales que son amplificadas por el extremo libre de la bocina. A su vez, las vibraciones de la bocina generan ondas de presión en la disolución de la muestra procesada, que producen cavitación dentro de la disolución, homogeneizando la muestra. Seleccionando la amplitud de las vibraciones, se puede regular la intensidad de la cavitación y, de esta forma, el grado de homogeneización de la mezcla, pudiendo cubrir un rango que va desde la homogeneización suave, para amplitudes bajas, hasta la ruptura de células, para los niveles de amplitud altos.
El módulo de control del homogeneizador de muestras controla al convertidor de tal forma que tiende a mantener la amplitud preseleccionada, aumentando o disminuyendo la potencia suministrada, en función de la resistencia encontrada en el extremo de la bocina. El dispositivo está diseñado para suministrar una potencia máxima de salida de 130 w.
El módulo de procesamiento de muestras consta de dos subconjuntos claramente diferenciados (ver Figuras 4 a 6):
El recipiente de homogeneización 6 y el bastidor móvil 17 de cierre de la cámara de homogeneización.
El recipiente de homogeneización 6 contiene la muestra depositada en su interior por el módulo de distribución de muestras, durante el proceso de homogeneización. El aparato está diseñado para alojar hasta doce recipientes de homogeneización, permitiendo el análisis de una única muestra por recipiente.
Los recipientes están fabricados en plástico acrílico transparente para poder visualizar el proceso de homogenización. Cada recipiente está provisto de una cámara principal de homogeneización 18, rodeada de cuatro cámaras secundarias 19, 20, 21 y 22 conectadas con ella por conductos 23 de diversos tamaños.
La cámara de homogeneización 18, de forma cilindrica (0 19 mm, long. 22 mm), está abierta en su parte superior para recibir las muestras en estado sólido o líquido facilitadas a través de la tolva 4. Durante el procesamiento de la muestra, esta abertura es herméticamente cerrada por el pistón 24 del bastidor móvil 17. El fondo de la cámara está provisto de un agujero 25 de 0 10 mm, a través del cual, se inyecta la muestra homogeneizada en el módulo de reacción. La pared cilindrica de la cámara está provista de un agujero de venteo de 0 0,5 mm, no mostrado, situado a una altura de 9,3 mm sobre el fondo de la cámara, el cual determina el momento del cierre hermético de la cámara, cuando la junta de estanqueidad 26 portada por el pistón del bastidor sella dicho agujero.
Las cámaras secundarias 19 a 22 están herméticamente selladas con tapones de silicona 27, tanto en su parte superior como inferior, y comunicadas por un conducto 23 con la cámara principal. El recipiente dispone de las siguientes cámaras secundarias:
Cámara 22 del marcador fluorescente. Es una cámara cilindrica (tamaño = 04x7 mm), unida a la cámara principal a través de un conducto 23 de 01 mm. En su interior aloja 1 g de un compuesto marcador fluorescente, en estado sólido, adherido al fondo de la cámara. Esta cámara es empleada para inyectar la solución salina, a través de la cánula 28 del módulo de gestión de reactivos y soluciones, necesaria para la preparación de 1 mi de disolución de muestra. Durante la inyección de la solución salina, el marcador fluorescente es disuelto e introducido en la cámara de homogeneización 18, formando parte de la disolución de la muestra. Cámara 21 del bloqueante. Es una cámara cilindrica (tamaño = 04x4 mm), unida a la cámara principal a través de un conducto 23 de 01 mm. Esta cámara es empleada para inyectar la disolución de bloqueante BSA, a través de la cánula 29 del módulo de gestión de reactivos y soluciones, necesaria para bloquear el exceso de marcador fluorescente que no haya reaccionado con las moléculas de la muestra. Bajo el tapón inferior 27 de esta cámara, se encuentra un agujero cónico, en el cual se aloja el acoplamiento Luer 28' del conducto de lavado del módulo de reacción.
Cámara 20 del sensor de presión. Es una cámara cilindrica (tamaño = 04x5 mm), unida a la cámara principal a través de un conducto 23 amplio, de 04 mm, con objeto de facilitar la entrada de disolución en su interior. Durante el proceso de homogeneización, esta cámara aloja a la cánula 29', portada por el bastidor móvil 17, la cual está conectada con el sensor de presión 30, encargado de monitorizar la presión diferencial del proceso.
Cámara 19 del sensor de temperatura. Es una cámara idéntica a la del sensor de presión. Durante el proceso de homogeneización, esta cámara aloja a la cánula 31, portada por el bastidor móvil 17, que, a su vez, aloja la sonda del sensor de temperatura 32, encargado" de monitorizar la temperatura de la disolución de la muestra, durante dicho proceso.
Las superficies del fondo de las cámaras 19 y 20 de los sensores y el de la cámara 18 de homogeneización están tratados con un tenso-activo, para facilitar la penetración de la disolución en dichas cámaras secundarias.
Cada recipiente de homogeneización incluye, también, un filtro 33, de 012 mm y provisto de un poro de 20 μm, utilizado para evitar que sólidos de un tamaño superior al deseado accedan al módulo de reacción. El filtro está situado sobre el portafiltros 34, el cual se aloja dentro del tapón roscado 35. Este conjunto está roscado en la base del recipiente, bajo el agujero de salida de la cámara de homogeneización. Una junta elástica 36 provee la necesaria estanqueidad del conjunto.
El tapón roscado 35 está provisto de un cono Luer macho al cual se conecta la válvula antirretorno 37. Esta válvula conecta el recipiente 18 de homogeneización con el módulo de reacción. Normalmente, la válvula está cerrada, debido a la sobrepresión de 1 ,3 bar existente en el módulo de reacción, aislando ambos módulos. En lugar de la válvula antirretorno 37 podría disponerse una válvula normalmente cerrada y accionada eléctricamente, o bien mecánicamente por el movimiento del bastidor del módulo de homogeneización.
El bastidor móvil 17 de cierre de la cámara de homogeneización, figura 4, realiza el cierre hermético de la parte superior de la cámara 18 de homogeneización, durante el procesamiento de la muestra. El bastidor móvil es único para todos los recipientes del módulo los cuales, son alineados con el bastidor mediante el tambor giratorio del Módulo de Distribución de Muestras.
El subconjunto consta del bastidor 17, fabricado en aluminio, el cual, acomoda los diferentes elementos del subconjunto. Está provisto de una brida superior 38 para la fijación del convertidor 15 del módulo homogenizador de muestras. A su vez, una brida inferior 39 aloja al pistón 24, a las cánulas 28 y 29 del módulo de gestión de reactivos y soluciones, y a las cánulas 29 y 31 de los sensores de presión y temperatura, respectivamente. El bastidor desliza a lo largo del eje 9, por medio de dos caequillos 39, y está guiado axialmente a lo largo del nervio central del marco 40.
El movimiento axial del bastidor es efectuado por un motor paso-a-paso 41 , atornillado a la tapa superior 1 del demostrador, a través de la transmisión del tornillo 42 fijo al eje del motor y la tuerca 43 alojada en el cuerpo del bastidor móvil 17. El motor tiene una resolución de 1 ,8 °/paso y es capaz de dar un par de 0,16 Nm. El tornillo está provisto de una rosca M6x1, luego, la resolución final del desplazamiento del bastidor es de 5 μm/paso, permitiendo un control muy preciso de dicho desplazamiento que, a su vez, se traduce en un posicionamiento preciso para la inyección de reactivos, mediciones de parámetros de la muestra y ejecución de la homogeneización por ultrasonidos.
La posición final del bastidor móvil es determinada por un sensor óptico 44, fijo al marco 40 del bastidor, cuando el indicador 45, unido la brida inferior del bastidor, interfiere con el haz de luz del sensor.
El pistón 24, figura 5, fabricado en acero inoxidable, es una pieza de revolución, hueca, provista de una brida superior con la que se fija al bastidor móvil. El extremo inferior acaba en cono y lleva montado el casquillo roscado 46, el cual está provisto de una junta de estanqueidad 26. Ambas piezas están roscadas entre sí, sujetando firmemente a la membrana 47, por medio de la presión ejercida por el cono interior del casquillo 46. La membrana 47 es de PTFE y tiene un espesor de 0,1 mm. El interior del pistón aloja a la bocina 16 del módulo homogenizador de muestras, la cual descansa sobre la membrana 47. Este ensamblaje cierra herméticamente la abertura superior de la cámara de homogeneización, gracias a la estanqueidad producida por la junta 26 y la membrana 47. El avance del pistón 24 dentro de la cámara de homogeneización, una vez producido el cierre hermético de la misma, genera una sobre-presión en la disolución a tratar, garantizando el contacto necesario entre la bocina 16 del sistema piezoeléctrico y la membrana 47 del pistón, para la generación de cavitación en la disolución.
El sensor de presión 30 monitoriza la sobre-presión de la cámara de homogeneización. Está basado en un puente de Wheatstone y sus principales características son:
• Rango de medida: 0 207 kPa
• Tensión de- excitación: 10 V
• Fondo de escala de la señal de salida: 100 mV
• Sensibilidad de la señal de salida: 0,483 mV/kPa El parámetro de sobre-presión en la cámara se utiliza para controlar y definir la posición de homogeneización del conjunto pistón-homogeneizador: El CPR inhibe el motor 41 del bastidor móvil cuando la sobre-presión en la cámara alcanza el valor de 0,8 bar. También se utiliza para controlar y definir el tiempo de homogeneización: El módulo de control del homogeneizador de muestras inhibe el convertidor 15 del sistema piezoeléctrico cuando la sobre-presión en la cámara supera el valor de 1 ,0 bar.
El sensor de temperatura 32 monitoriza la temperatura de la disolución de la muestra durante el proceso de homogeneización. Está basado en una sonda provista de un termopar tipo K, alojado en una vaina de acero inoxidable de 00,5 mm y 250 mm de longitud. La sonda se fija en la tapa superior 1 del aparato mediante un espárrago roscado mientras que su extremo libre está introducido en la cánula 31 , la cual, facilita la inserción de la sonda a través de los tapones de silicona 27.
El parámetro de temperatura de la disolución de la muestra se utiliza para controlar y definir el tiempo de homogeneización: El módulo de control del homogeneizador de muestras inhibe el convertidor 15 del sistema piezoeléctrico cuando la temperatura de la disolución supera un valor crítico predeterminado.
El módulo de reacción (ver Figuras 5 a 7) consta de un soporte 50, de forma paralelepípeda (tamaño: 76x26x6,5 mm), donde se encuentra una oquedad abierta 51 , llamada cámara de reacción, que tiene forma de hexágono irregular simétrico (dimensiones globales: 14x8 mm), con una profundidad de 0,3 mm. Esta cámara está provista de las siguientes vías de acceso:
• Vía de entrada 52 de la disolución o suspensión homogeneizada. Se encuentra en la esquina superior de la cámara y está formada por un conducto de 01 mm, finalizado en un cono Luer hembra para la conexión estanca con la válvula antirretorno 37 del módulo de procesamiento de muestras 75. • Vía de entrada 53 de la disolución de lavado. Se encuentra en la esquina superior de la cámara y está formada por un conducto de 02,5 mm, para la conexión estanca del conducto de lavado 28'.
• Vía de salida 54 de las disoluciones. Se encuentra en la esquina inferior de la cámara y está formada por un conducto de 02 mm, finalizado en un cono Luer hembra para la conexión estanca con el depósito de desechos 57.
• Los orificios de entrada 52 y 53 y el orificio de salida 54 pueden estar conectados por un conducto dotado de un sistema de bombeo, no representados, que permitirá la recirculación de la muestra sobre el biosensor. Además la cámara 51 puede incluir un sistema de agitación o movimiento de la muestra líquida, para mejorar el funcionamiento de biosensor.
La cámara 51 de reacción tiene un fino recubrimiento de agente hidrofóbico SIGMACOTE, con objeto de mejorar la circulación de los distintos fluidos, evitando la adhesión de partículas sólidas y moléculas a sus superficies. La cámara de reacción 51 y sus vías de acceso están cerradas por medio de un portaobjetos 55 de vidrio (tamaño: 75x25x1 mm), en cuya cara interior, coincidiendo con la cámara, está depositado el biosensor o sistema sensor 56 capaz de detectar sustancias presentes en la disolución homogeneizada, desde moléculas a microorganismos completos. Este sistema sensor está constituido por diferentes sustancias detectoras en formato de micro-matriz
El portaobjetos 55 se fija al soporte 50 mediante dos presillas 50'. La estanqueidad de la unión está garantizada por un perímetro rectangular de silicona
CV-1152 que se inyecta a través de dos agujeros situados en la cara opuesta del soporte 50. La silicona, una vez curada, forma una junta de sellado, de sección 1x1 mm, que rodea a la cámara de reacción y a sus vías de acceso.
El conducto de lavado 28', está formado por una tubería de plástico, de diámetro interior de 1,6 mm y una longitud aproximada de 90 mm. En su extremo superior está provisto de un acoplamiento metálico, terminado en un cono Luer macho, que se conecta herméticamente en el alojamiento del recipiente de homogeneización 18, bajo la cámara de bloqueante. En extremo inferior dispone de un acoplamiento acodado de plástico para la conexión estanca con la vía de lavado de la cámara de reacción.
El depósito de desechos 57 está formado por una jeringa de plástico, de 5 mi de capacidad, provista de un cono Luer macho, excéntrico, conectado a la vía de salida de la cámara de reacción. La jeringa carece de émbolo y en su lugar, un tapón de silicona 58 cierra herméticamente su abertura superior.
El depósito de desecho 57 puede ser común para todos los módulos de reacción y estar conectado a la salida de los mismos por medio de una cánula montada sobre el bastidor deslizante.
El conjunto está fabricado con materiales transparentes (vidrio, acrílicos, etc.) para poder visualizar los circuitos de fluidos.
Una vez ensamblado y conectado al recipiente de homogeneización 6 del módulo de procesamiento de muestras, la cámara 18, junto con sus vías de acceso, conductos y depósito forman un circuito estanco al que, previamente, se le ha llenado de disolución salina, a una sobre-presión de 1 ,3 bar. En el depósito de desechos 57, el nivel de disolución es de 1 mi, estando el resto del depósito lleno de aire presurizado a la mencionada sobre-presión.
El aparato está diseñado para alojar hasta doce módulos de reacción, permitiendo el análisis de una única muestra por módulo.
El módulo de gestión de reactivos y soluciones consta de todos los elementos necesarios para almacenar y dispensar con precisión, en el momento requerido, las diferentes soluciones y reactivos que intervienen en las diferentes etapas de procesamiento de las muestras. El elemento principal del módulo de gestión de reactivos y soluciones (ver
Figuras 1 y 2) lo compone una jeringa 60 motorizada que realiza las funciones de almacenamiento y dispensador de fluidos. El módulo consta de dos conjuntos idénticos de jeringas motorizadas: uno dedicado a la solución salina empleada para disolver la muestra sólida y otro dedicado a la solución de bloqueante BSA que, a su vez, realiza las funciones de solución de lavado de la cámara de reacción. En el caso de que los fluidos estuvieran en el módulo de gestión de reactivos, el aparato podría incluir un dispositivo que los inyectara en la cámara de reacción. Cada conjunto incorpora los siguientes elementos: 1. Una jeringa motorizada 60 (tamaño: 203x56x94 mm), comercial, fija a un marco 3 de la estructura del aparato a través de una placa base. Sus principales componentes son:
• Jeringa 60 de 10 mi de capacidad, provista de cono Luer macho, con cierre de bloqueo. El extremo del cono está sujeto al soporte 61 que, a su vez, está atornillado a la placa base 62 del conjunto. El vastago del émbolo está atornillado a la varilla 63 del actuador lineal. • Un actuador lineal provisto de motor paso-a-paso 64 que acciona el vastago del émbolo de la jeringa. El actuador está diseñado para ejercer una fuerza máxima de 89 N. La resolución que se obtiene cuando se inyecta sin sobre-presión es de 10 μl/paso. « Un sensor óptico, no mostrado, alojado en la placa base, que determina la posición del émbolo de la jeringa, permitiendo el control del conjunto en lazo abierto.
2. Una válvula antirretorno 65 que mantiene la barrera de presión en los circuitos de fluidos cuando la jeringa no está accionada.
3. Una cánula roscada (tamaño: 01x20 mm), no mostrada, que, como elemento final del conjunto, penetra a través de los tapones de sillcona de las cámaras laterales del recipiente de homogeneización 18. La cánula está fija al bastidor móvil 17 del módulo de procesamiento de muestras y, por lo tanto, su movimiento de penetración está sincronizado con el movimiento de avance de dicho bastidor. 4. Todos los conductos y accesorios (tamaño: 1/16") necesarios para conectar los diferentes componentes que forman el circuito de fluidos.
Un módulo de lectura de datos incluye los componentes que permiten detectar las reacciones producidas en la cámara de reacción.
Principalmente, está compuesto por un diodo láser 66 (ver Figuras 1 y 4) y una cámara CCD 67, ambos comerciales y montados sobre una ménsula 68 atornillada al marco 40 de la estructura del aparato.
El diodo láser 66 emite un haz de luz monocromática de 635 nm de longitud de onda y ancho suficiente para irradiar toda la cámara de reacción 51 , excitando las moléculas fluorescentes. Está montado sobre la ménsula 68, de tal forma que, el haz de luz incide a 45° sobre el plano de la cámara de reacción, evitando que se produzcan reflexiones en la dirección del eje de la cámara CCD. El diodo láser 66, alojado en una carcasa cilindrica (tamaño: 038x158 mm), tiene una potencia máxima de 250 mW y dispone de un sistema de refrigeración que permite regular la temperatura del diodo. La cámara CCD 67 detecta la radiación electromagnética emitida por las moléculas fluorescentes, cuando son excitadas por el haz de luz láser. Dicha radiación, de banda espectral centrada en 670 nm, correspondiente a la máxima emitancia del colorante fluorescente Cy5, usado como marcador. Con objeto de evitar la entrada de radiaciones de otras longitudes de onda en el CCD, la cámara está provista de un filtro 69 de emisión 695AF55, de 25 mm de diámetro. Complementan el dispositivo un objetivo 70 y un separador 71 que permiten enfocar y ampliar la imagen en el CCD. Los tres componentes, filtro, objetivo y separador, son comerciales.
La cámara es digital, en blanco y negro, de alta resolución y alta sensibilidad. Tiene las siguientes características:
Tamaño: 146x76x64 mm Sensor: CCD con 1280x1024 pixels Tamaño píxel cuadrado: 6,7x6,7 Tamaño del sensor: 2/3" Rango dinámico: 12 bits • Sensibilidad: 4350 e/lux/um2/s
Refrigerada
Como puede comprenderse, dependiendo de las necesidades, la capacidad del aparato podrá adaptarse, incluyendo en caso necesario dos o más módulos homogeneizadores de muestras y de procesamiento de muestras, así como dos o más módulos de distribución de muestras.
Como se ha indicado, el aparato incluye un módulo de comunicaciones (módulo de comunicaciones) que es el interfaz del equipo con el usuario, pudiendo ser aquel local o remotamente manipulado a través de los adecuados protocolos de comunicaciones. El módulo de comunicaciones corresponde a un software desarrollado en
LabView®, de National Instruments®, que se ejecuta en el sistema de control del dispositivo y que implementa la máquina de protocolos necesaria para el establecimiento de los enlaces de comunicaciones, independientemente de la conexión a través de la cual se controle. Esta conexión puede ser alguna de las siguientes:
Consola, en caso de usuario local. Enlace vía serie RS232, RS422 o RS485. Enlace paralelo.
Enlace mediante USB (Universal Serial Bus). - Enlace TCP, UDP, IP o cualquier otro protocolo para la transmisión de datos entre ordenadores.
Enlaces vía radio, IRDA, ...
Buses de campo: PROFIBUS, CAN, FieldBus, InterBUS-S, ...
Enlaces telefónicos: GSM, ... En el caso del establecimiento del enlace de datos, el módulo de comunicaciones realiza las tareas de codificación de datos, encapsulamiento, control de acceso al medio, envío/recepción de datos/comandos e implementación de opciones de seguridad mediante la validación de la integridad de los comandos. Para el control del conjunto existe un controlador global y un controlador por módulo.
El controlador global (módulo de control global) supone el sistema supervisor global del proceso y de cada uno de los módulos constituyentes de la invención. Además puede permitir tanto la operación cercana como remota del aparato. Considerando el sistema de control como una arquitectura PC con tarjetas de entrada/salida que ejecuta un software desarrollado en Lab View®, de National Instruments®, el módulo de control global corresponde al proceso principal que interactúa con el resto de controladores para llevar a cabo el proceso y análisis global. Realiza las siguientes funciones: - Recepción de los mensajes procedentes del Módulo de
Comunicaciones. Validación de los parámetros y órdenes recibidas. Interpretación de tales órdenes (tareas) enviadas por el usuario.
Sistema de ejecución de tareas: secuenciación global de subprocesos, envío de órdenes a los controladores locales correspondientes. - Realización de tareas automáticas preprogramadas.
Supervisión del funcionamiento de cada módulo: realización de subtareas y verificaciones de seguridad (monitorización de los parámetros del proceso y comprobación de su inclusión en los correspondientes rangos adecuados de funcionamiento). Control de parada de emergencia si la seguridad así lo requiere. - Recuperación ante fallos de subsistemas.
Envío al operador de los valores de los parámetros de trabajo para su monitorización general del proceso a través del Módulo de Comunicaciones.
Recepción, preprocesamiento y envío al operador de los datos recibidos por el Módulo de Lectura de Datos. El Controlador del Módulo Distribución de Muestras es un proceso que se ejecuta en el sistema de control además de unas tarjetas para el control de motores paso a paso, así como otras de entradas y salidas digitales para la lectura de los sensores. Es el encargado de la ejecución de la subtarea que implica la distribución de las muestras recogidas por el Módulo de Adquisición de Muestras entre los distintos Módulos de Procesamiento de Muestras.
El Módulo de control de la distribución de muestras deberá ser capaz de realizar las diferentes tareas:
Conocer en todo momento la posición de cada Módulo de Procesamiento de Muestras.
Posiciona adecuadamente el módulo de procesamiento de muestras. Realizar una supervisión local sobre el Módulo de Distribución de Muestras.
Recibir órdenes procedentes del Controlador Global. Enviar datos correspondientes al estado actual al Controlador Global. El módulo de control de la distribución de muestras dispone de la información procedente de finales de carrera y encoders lineales o angulares de posición, así como control sobre los actuadores constituyentes del Módulo de Distribución de Muestras. Ante las adecuadas órdenes procedentes del Controlador Global, el módulo de control de la distribución de muestras operará sobre los actuadores para situar el adecuado Módulo de Procesamiento de Muestras bajo el Módulo de Adquisición de Muestras.
Considerando un Módulo de Distribución de Muestras compuesto por el tambor giratorio antes descrito, al que se une un motor paso a paso para el movimiento y un sensor óptico de final de carrera, la tarea del módulo de control de la distribución de muestras consiste en atender las órdenes del Controlador Global haciendo girar tal tambor hasta la posición deseada.
Una primera fase del funcionamiento global implica una calibración del módulo de distribución de muestras por la cual el CMD lleva el tambor hasta la posición en la que se activa el sensor óptico de final de carrera, lo que implica una posición conocida. De esta forma, el CMD conocerá en lo sucesivo la posición absoluta del tambor.
Mediante la correspondiente orden del módulo de control global, el CMD puede llevar el Módulo de Procesamiento de Muestras a cualquier posición deseada a través del adecuado número de pasos de los motores, información que es manejada por este controlador.
El Módulo de control del gestor de reactivos y soluciones controla aquellos dispositivos destinados a la provisión de las disoluciones necesarias para la realización de todo el proceso bio-químico. Al igual que los controladores anteriores, el módulo de control del gestor de reactivos y soluciones consiste en un subproceso en ejecución en el ordenador de control junto a las tarjetas para el control de los motores paso a paso, y de entradas digitales para la lectura de los sensores. El módulo de control del gestor de reactivos y soluciones permite:
Supervisar el estado y la operación de cada uno de los dispositivos constituyentes del Módulo Gestor de Reactivos y Soluciones: capacidad, disponibilidad, errores/fallos que se produzcan en los dispositivos, ...
Accionar tales elementos dispensadores para la inyección de cantidades precisas y concretas de las soluciones, en las cámaras de reacción.
Recibir órdenes del Controlador Global y enviar datos de estado a éste. En la configuración del módulo de gestión de reactivos y soluciones antes descrita, el accionamiento de los motores paso a paso que controlan la jeringa permite la inyección de una cantidad precisa de soluciones en el sistema. El CPR está encargado de controlar los componentes electromecánicos que posicionan el bastidor móvil en el recipiente de homogeneización, así como el sensor que determina la posición del bastidor móvil.
El CPR está encargado, también, de la monitorización y supervisión de los parámetros (presión y temperatura) que intervienen en el proceso. En todo momento, debe analizar la información procedente de los diferentes sensores que monitorizan el proceso con el fin de determinar si éste se realiza dentro de los rangos admisibles.
El resultado de este análisis es enviado al Controlador Global, que toma las decisiones oportunas dentro del proceso global. En relación con la monitorización del proceso de homogeneización de la muestra, el CPR consta de dos sensores, uno de presión y otro de temperatura, así como los elementos hardware para el acondicionamiento de estas señales, a través de los cuales se pueden medir los parámetros físicos en los que se desarrolla la reacción. El análisis de estos parámetros puede determinar el tiempo durante el cual se realiza cierto subproceso, si se plantea como criterio para finalizarlo el llegar a determinada temperatura.
El módulo de control del lector de datos es el medio a través del cual es posible interactuar con el Módulo de Lectura de Datos. Debe permitir:
Accionar los mecanismos para el análisis de los resultados obtenidos tras la reacción llevada a cabo en el Módulo de Reacción, proporcionados por el Módulo de Lectura de Datos. Este accionamiento se llevará a cabo tras la correspondiente orden procedente del Controlador Global.
Adquisición de los resultados de la reacción y que son proporcionados por el Módulo de Lectura de Datos. - Supervisar el estado del Módulo de Lectura de Datos.
Realizar un procesamiento de la información obtenida de la reacción. A través de determinadas órdenes enviadas por el Controlador Global, enviar toda la información anterior a éste.
La figura 15 corresponde al esquema de funcionamiento del aparato descrito: Las muestras a analizar 72 son tomadas por el módulo de adquisición 72, que las incluye al módulo de distribución 74, de donde pasa al módulo de procesamiento 75, donde son homogeneizadas por el módulo de homogeneización 76. Finalmente las muestras pasan al módulo de reacción 86, con el que está en comunicación el módulo gestor de reactivos 77, produciéndose finalmente una toma de datos por el módulo de lectura de datos 78.
Cada uno de estos módulos está supervisado por el controlador correspondiente 79 a 83, y el conjunto por el controlador global 84, que es gestionado a través del módulo de comunicaciones 85.
La descripción funcional del aparato de la invención se detallada en los siguientes apartados, teniendo en cuenta dos aspectos: el proceso de detección de sustancias y la secuencia operacional, robotizada, de dicho aparato.
1. Iniciación del sistema (ver Figura 8a y 8b a 11a y 11b y Figura 15.) Pasos operacionales: a. Activación del módulo de control global 84 b. Activación del módulo de control del procesamiento y reacción 81
Activación del motor 41 y verificación de la correcta posición inicial del bastidor móvil 17 (posición superior contra el tope mecánico). Inicialización de la cuenta de pasos del motor 41. Desenergización del motor 41 y desactivación del controlador módulo de control del homogeneizador de muestras 82. c. Activación del controlador módulo de control de la distribución de muestras 80. activación del motor 10 y verificación de la correcta posición inicial del tambor giratorio 5 (contra el tope mecánico). Inicialización de la cuenta de pasos del motor 10.
2. Introducción de la muestra en la cámara 18 de homogeneización Pasos operacionales: a) Rotación del tambor giratorio 5 hasta que el recipiente de homogeneización 6 que se va a utilizar esté alineado verticalmente con la tolva 4. b) Introducción manual de 250 mg de muestra sólida, de granulometría inferior a 0,5mm, en la cámara de homogeneización, a través de la tolva 4 3. Preparación de la disolución de la muestra
Pasos operacionales: a. Rotación del tambor giratorio 5 (+180°) hasta que el eje del recipiente de homogeneización 6 que contiene la muestra esté alineado verticalmente con el eje del pistón 24 del módulo de procesamiento de muestras 75. El motor 10 continúa energizado para mantener la posición del tambor giratorio 5. b. Activación del controlador Módulo de control del procesamiento y reacción 81. Activación del motor 41. c. Descenso del bastidor móvil 17 hasta la posición de captura (ver figura 9a-9b). El movimiento se efectúa desde el paso 0 al paso 1960 (valores absolutos del contador de pasos del motor 41), a una velocidad de 100 pasos/s.
En esta posición, el pistón 24 y las cánulas 29, 31 , 28 y 29' están parcialmente introducidas en el recipiente de homogeneización 18, pero sin producirse contacto entre los diferentes elementos. El giro accidental del tambor no es posible ya que interferiría el recipiente con el pistón. d. Desenergización del motor 10.
En este momento el tambor giratorio 5 queda desbloqueado pero su giro es evitado por el pistón 24. e. Descenso del bastidor móvil 17 hasta la posición de inyección de la solución salina (ver figura 10a-10b). El movimiento se efectúa desde el paso 1960 al paso 4480 (valores absolutos del contador de pasos del motor 41), a una velocidad de 50 pasos/s. Desenergización el motor 41 del bastidor móvil al final del recorrido.
En esta posición, la cánula 28 de la disolución salina ha atravesado el tapón superior 27a de la cámara del marcador fluorescente y está lista para dispensar la solución. En esta cámara está depositado 1mg de marcador fluorescente Cy5, en estado sólido y adherido al fondo y paredes de la cámara.
A su vez, la junta de estanqueidad 26 se encuentra por encima del agujero de venteo de la cámara de homogeneización, luego, no se ha producido el cierre hermético de la cámara. f. Activación del controlador módulo de control del gestor de reactivos y soluciones 82. Activación del motor 64 de la jeringa de solución salina hasta inyectar 1362 μl (139 pasos del motor @ 5 pasos/s). Desenergización del motor 64 al finalizar la inyección.
La solución salina (0,1 M NaCO3/NaHCO3) disuelve el marcador fluorescente Cy5 al atravesar la cámara, arrastrándolo hasta la cámara de homogeneización 18 donde se encuentra la muestra. Durante el proceso de inyección, la solución salina penetra en las cámaras de los sensores y otros conductos de acceso a la cámara de homogeneización. Al final, en esta cámara se obtiene unos 1200 μl de disolución de muestra y marcador, el cual, es capaz de unirse a las moléculas portadoras de un grupo amino (NH2). g. Activación del motor 41 del bastidor móvil y descenso del mismo hasta la posición de homogeneización. Desenergización del motor 41.
Durante este movimiento de descenso del pistón 24, se efectúa el cierre hermético de la cámara 18 de homogeneización cuando el contador de pasos absolutos del motor 38 marca el paso 4740, aproximadamente (ver Figuras 11a-11b). A partir de ese instante, la cámara 18 de homogeneización comienza a presurizarse, aumentando la sobre-presión a medida que el pistón 24 desciende. En esta posición, las cánulas 29' y 31 de los sensores de presión 30 y temperatura 32, respectivamente, han atravesado los tapones superiores de sus respectivas cámaras y, por lo tanto, comienzan a monitorizar las condiciones de la cámara de homogeneización. El descenso se detiene cuando la sobre-presión indicada por el sensor 30 alcanza el valor de 0,8 bar. En ese momento, se alcanza la posición de homogeneización (ver Figuras 12a-12b).
En esta posición, la membrana 41 de PTFE está en contacto con la disolución de la muestra, lista para ser excitada por la bocina 16 del homogeneizador. El aire presurizado existente en la cámara se encuentra ocluido en las cavidades formadas por el casquillo 46 del pistón 24, cercanas a la junta de estanqueidad 26.
El movimiento de descenso se efectúa en dos etapas continuas pero diferenciadas: la primera, hasta el cierre hermético de la cámara, se efectúa entre los pasos absolutos 4480 y 4740 del motor 41, a una velocidad de 10 pasos/s, y, la segunda, hasta la posición de homogeneización, se efectúa lentamente entre los pasos absolutos 4740 y 5080 (el paso final es aproximado, ya que el control se realiza con el sensor de presión) del motor 41, a una velocidad de 5 pasos/s. 4. Homogeneización de la disolución de la muestra Pasos operacionales: a. Activación del controlador módulo de control del homogeneizador de muestras 82. Activación del sistema piezoeléctrico del módulo homogenizador de muestras para homogeneizar la muestra.
Durante el proceso de homogeneización de la muestra, el convertidor 49 transforma la energía eléctrica de alta frecuencia (40 kHz), suministrada por el módulo de control del homogeneizador de muestras 82, en vibraciones longitudinales que son amplificadas por el extremo libre de la bocina 16. A su vez, las vibraciones de la bocina generan ondas de presión en la disolución de la muestra procesada, que producen cavitación dentro de la disolución, homogeneizando la muestra. Seleccionando la amplitud de las vibraciones, se puede regular la intensidad de la cavitación y, de esta forma, el grado de homogeneización de la mezcla, pudiendo cubrir un rango que va desde la homogeneización suave, para amplitudes bajas, hasta la ruptura de células, para los niveles de amplitud altos.
Durante el proceso de homogeneización, la temperatura de la muestra se incrementa como consecuencia de la energía aportada a la misma por el homogeneizador. El aumento de temperatura genera un aumento de la sobre-presión en la cámara. Si el proceso se alarga en el tiempo, la sobre-presión en la cámara 18 de homogeneización iguala a la sobre-presión de la cámara de reacción, produciéndose un flujo espontáneo e incontrolado de disolución de muestra a dicha cámara. Por otra parte, el aumento de temperatura de la disolución puede causar daños irreversibles a las células. Estos riesgos potenciales se evitan controlando el proceso de homogeneización mediante dos parámetros:
• La temperatura de la disolución, monitorizada por el sensor de temperatura 32, cuyo límite superior no debe superar temperatura crítica prefijada « La sobre-presión en la cámara de homogeneización, monitorizada por el sensor de presión 30, cuyo rango útil para la homogeneización debe ser de 0,8*1 ,0 bar.
Ambos parámetros están en estrecha relación con otros parámetros tales como: « La intensidad de la excitación del homogeneizador cuyo valor, predefinido según el grado de homogeneización que se desee, está relacionado con la amplitud de la vibración ultrasónica. Esta amplitud se preselecciona en el controlador módulo de control del homogeneizador de muestras 82. El rango útil puede considerarse entre el 10% y 100% de la amplitud. • El tiempo de excitación del homogenizador, el cual está en relación con la intensidad de excitación seleccionada: a mayor intensidad la temperatura y presión de la disolución aumentan más rápidamente y, por lo tanto, el intervalo de excitación debe reducirse para no superar los límites superiores de presión y temperatura. « La naturaleza de la muestra, la temperatura ambiental, etc.
Un modo de homogeneización capaz de producir la rotura y lisis de las posibles células presentes en la disolución de la muestra consiste en activar el módulo homogenizador de muestras 76, de forma intermitente, a una amplitud de excitación del 80%, en intervalos de excitación, no superiores a 20s, limitados por los límites de presión y temperatura mencionados. El tiempo de espera entre intervalos lo define la caída de la presión, originada por el enfriamiento de la muestra, reanudándose la excitación cuando la sobre-presión alcanza el valor de 0,8 bar. b. Espera de 30 minutos para facilitar la reacción del marcador Cy5 con las moléculas de la muestra. 5. Bloqueo del marcador fluorescente
Pasos operacionales: a. Activación del motor 41 del bastidor móvil y elevación del mismo hasta la posición de inyección del bloqueante (ver Figuras 13a-13b). Desenergización del motor 41. Este movimiento de elevación se efectúa, de forma continua, entre los pasos absolutos 5080 (aproximado) y 4500 del motor 41 , a una velocidad de 20 pasos/s. La sobre-presión en la cámara de homogeneización disminuye a medida que el pistón 24 es elevado, reduciéndose a 0 bar cuando la junta de estanqueidad 26 supera el agujero de venteo de la cámara (paso absoluto 4560 del motor 38). Al final de este paso, la cánula 29 se encuentra dentro de la cámara 21 del bloqueante, lista para dispensar la solución de BSA. b. Activación del controlador módulo de control del gestor de reactivos y soluciones 77. Activación del motor 64 de la jeringa 10 de solución de bloqueante BSA hasta inyectar 343 μl (35 pasos del motor @ 5 pasos/s). Desenergización del motor 64 al finalizar la inyección.
La jeringa del bloqueante contiene una disolución salina con una concentración del 10% de bloqueante BSA. Por lo tanto, se añaden 34 mg de bloqueante BSA disueltos en los 343 μl de solución salina inyectada a través de la cánula 25. El bloqueante se une al exceso de marcador fluorescente que no haya reaccionado con las moléculas de la muestra. Esto permite disminuir el fondo en la imagen que se obtenga finalmente, debido a que se evita la unión inespecífica de marcador libre a los anticuerpos. c. Activación del motor 41 del bastidor móvil y descenso del mismo hasta la posición de agitación de la disolución de la muestra. Desenergización del motor 41. 5 Como en el paso operacional 3 g), durante este movimiento de descenso del pistón 24, se efectúa el cierre hermético de la cámara de homogeneización cuando el contador de pasos absolutos del motor 41 marca el paso 4740, aproximadamente. A partir de ese instante, la cámara de homogeneización comienza a presurizarse, aumentando la sobre-presión a medida que el pistón 24 desciende. El descenso se 0 detiene cuando la sobre-presión indicada por el sensor 30 alcanza el valor de 0,8 bar (aproximadamente, en el paso 4980 del motor 41). El movimiento de descenso se efectúa en dos etapas continuas: la primera, entre los pasos absolutos 4500 y 4740 del motor 41, a una velocidad de 20 pasos/s, y, la segunda, hasta alcanzar una sobre- presión de 0,8 bar, a una velocidad de 5 pasos/s. 5 d. Activación del controlador Módulo de control del homogeneizador de muestras 82. Activación del sistema piezoeléctrico del módulo homogenizador de muestras 76 para agitar suavemente la muestra.
Esta agitación suave tiene por objeto homogeneizar la mezcla de disolución de muestra más bloqueante BSA. Se realiza a un nivel bajo de excitación (amplitud del 0 20%), durante un intervalo corto de unos 5 s. e. Espera de 30 minutos para facilitar la reacción del bloqueante con el exceso de marcador.
6. Inyección del la muestra en la cámara de reacción 18
Pasos operacionales: 5 a. Activación del motor 41 del bastidor móvil y descenso del mismo hasta la posición de apertura de la válvula antirretorno 37.
La apertura de la válvula antirretorno ocurre cuando la sobre-presión en la cámara de homogeneización es ligeramente mayor que la sobre-presión en el circuito del módulo de reacción 86, es decir, cuando alcanza un valor aproximado de 1 ,3 bar. o Esta situación ocurre en el entorno del paso 5040 del motor 41 b. Introducción en la cámara de reacción de la primera inyección de muestra mediante el descenso del bastidor móvil
En la primera inyección el motor 41 desciende 210 pasos (relativos), a una velocidad de 5 pasos/s, para que la muestra llegue hasta la cámara de reacción, 5 atravesando el filtro 33, el portafiltro 34, la válvula antirretorno 37 y todos los conductos de acceso, así como la propia cámara de reacción, donde se encuentra la micro-matriz de sustancias detectoras.
El filtro 33 colocado bajo la cámara 18 de homogeneización, evita que partículas mayores de 20 μm entren en el módulo de reacción. El volumen de la cámara de reacción es de 28 μl, aproximadamente. La dimensión útil de la micro- matriz de sustancias detectoras es de 8x8 mm. c. Desenergización del motor 41. d. Espera de 20 minutos para facilitar la reacción de las sustancias de la muestra homogeneizada con las sustancias detectoras de la cámara de reacción. e. Introducción en la cámara de reacción de la segunda inyección de muestra mediante el descenso del bastidor móvil.
Se hace pasar varios volúmenes de la muestra sobre la misma micro-matriz, de una manera secuencial. En la segunda inyección y sucesivas, el motor 41 desciende 20 pasos (relativos), a una velocidad de 5 pasos/s, para que la cavidad de la cámara de reacción sea ocupada por una nueva muestra. La muestra ensayada en el paso anterior pasa al depósito de desechos 46 donde es almacenada. f. Repetición de los pasos c), d) y e), tantas veces como sea necesario, hasta llegar a la posición final (ver Figuras 14a-14b). Esta situación ocurre en el entorno del paso 5500 del motor 41. A medida que se van introduciendo nuevas inyecciones de muestra en la cámara de reacción, la sobre-presión del circuito crece hasta llegar a un valor aproximado de 1 ,7 bar al final del proceso de inyección de muestra. g. Desenergización del motor 41. 7. Lavado de la cámara de reacción Pasos operacionales: a. Activación del controlador módulo de control del gestor de reactivos y soluciones 82. Activación del motor 64 de la jeringa 60 de solución de bloqueante BSA hasta inyectar 1000 μl (160 pasos del motor @ 5 pasos/s). Desenergización del motor 64 al finalizar la inyección. En la posición final mostrada en las Figuras 14a-14b, la cánula 29 ha atravesado el tapón inferior 27 de la cámara 21 de bloqueante, penetrando en el conducto 53 de lavado del módulo de reacción 86. Esto permite inyectar la disolución de bloqueante BSA al 10% que es usada, también, como disolución de lavado de la cámara de reacción. El lavado permite retirar el exceso de marcador y muestra existente en la cámara de reacción. La solución de lavado se almacena, finalmente, en el depósito de desecho 57, subiendo la sobre-presión en el módulo de reacción hasta los 2,5 bar, aproximadamente. Esta sobre-presión no es monitorizada por el sensor 30 porque la válvula antirretorno 37 hace de barrera de presión.
8. Activación del marcador fluorescente y detección de las fluorescencias Pasos operacionales: a. Activación del controlador módulo de control del lector de datos 83. b. Excitación del marcador fluorescente Cy5 mediante el diodo láser y detección simultánea, por medio del sensor CCD, de la radiación electromagnéticas emitida por las moléculas fluorescentes.
El marcador Cy5 utilizado tiene un máximo de absorción a 649 nm y un máximo de emisión a 670 nm. c. Grabación en disco de la imagen del sensor CCD. 9. Re-iniciación del aparato
Pasos operacionales: a. Activación del motor 41 del bastidor móvil y elevación del mismo hasta la posición de captura del recipiente de homogeneización (ver Figuras 9a-9b).
Este movimiento de elevación se efectúa, de forma continua, hasta el paso 1960 del motor 41 , a una velocidad de 50 pasos/s. b. Energización del motor 10 del tambor giratorio. c. Activación del motor 41 del bastidor móvil y elevación del mismo hasta la posición inicial (ver Figuras 8a-8b). Desenergización del motor 41.
Este movimiento de elevación se efectúa, de forma continua, hasta el paso 0 del motor 41 , a una velocidad de 50 pasos/s. d. Rotación del tambor giratorio a su posición inicial
En esta posición el aparato está listo para procesar una nueva muestra. En las figuras 16 y 17 se muestra una variante de ejecución del aparato, en las que se utilizan las mismas referencias para designar elementos iguales o equivalentes.
En esta realización, los recipientes 6 del módulo de procesamiento de muestras van montados en un tambor giratorio de eje horizontal que, como en el caso anterior, va accionado por un motorreductor 10, con potenciómetro angular 10'. Las cámaras 6 disponen de una boca lateral de carga 90, dotada de medios de cierre, para la recepción de muestras, las cuales pueden ser alimentadas a través de una tolva 4.
Como en la realización antes descrita, en el caso de las figuras 16 y 17 el módulo homogeneizador incluye un dispositivo piezoeléctrico que incluye un convertidor 15 y una bocina 16, todo ello montado en un bastidor 17, cuyo movimiento desplaza los medios de cierre y a través de los cuales y mediante la activación del dispositivo piezoeléctrico se produce la homogeneización de la muestra. El bastidor 17 va montado sobre guías 92 a lo largo de las que puede desplazarse, a un lado del tambor giratorio y sin posibilidad de giro, mediante un actuador lineal 93 con potenciómetro lineal 15'.
Por lo demás, en esta realización el aparato se corresponde con la constitución descrita con referencia a las figuras 4 a 14, incluyendo un láser 66, una cámara de lectura de datos 67, etc. Puede además disponer de un módulo de refrigeración 94, depósito de disolución 95 y bomba de disolución 96.
Todo el conjunto mostrado en las figuras 16 y 17 iría montado en una estructura de jaula, en la que además irían montados la tolva 4, el módulo de gestión de reactivos, el módulo de lectura de datos y los módulos de comunicación y control.

Claims

REIVINDICACIONES
1.- Aparato para la detección de sustancias o analitos a partir del análisis de una o varias muestras, que comprende: un módulo homogeneizador de muestras, capaz de actuar sobre la muestra contenida en un recipiente para producir
5 su homogeneización; un módulo de procesamiento de muestras, que incluye una serie de recipientes independientes, cada uno de los cuales está destinado a recibir una de las muestras a analizar; un módulo de reacción, que incluye una serie de cámaras de reacción, tantas como recipientes incluye el módulo de procesamientos de muestras, cada una de las cuales está en comunicación con uno de dichos recipientes a través 0 de un conducto de paso controlado e incluye un sistema sensor para la detección de sustancias; un módulo de gestión de reactivos y soluciones, que almacena y dispensa los reactivos y soluciones necesarios en cada etapa del proceso; un módulo de lectura de datos, a través del que se detectan las reacciones producidas en las cámaras de reacción y procesa las señales detectadas; y un controlador global que supervisa el 5 proceso y cada uno de los módulos de la invención.
2.- Aparato según la reivindicación 1, caracterizado porque incluye además un módulo de distribución de muestras, encargado de adicionar o distribuir las muestras al recipiente o recipientes seleccionados del módulo de procesamiento y poner en contacto las muestras contenidas en los recipientes seleccionados con el o módulo homogeneizador.
3.- Aparato según la reivindicación 1 y 2, caracterizado porque el módulo de distribución de muestras incluye una tolva o embudo de posición fija, en la que son vertidas las muestras a analizar.
4.- Aparato según las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque el 5 módulo de distribución de muestras es alimentado por inyectores de muestras almacenadas en placas multipocillo.
5.- Aparato según las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el módulo de distribución de muestras incluye un tambor giratorio en el que van montados los recipientes del módulo de procesamiento de muestras, cuyo tambor es o capaz de situar cada vez un recipiente seleccionado en comunicación con la tolva o embudo y, posteriormente, con el pistón del módulo de procesamiento de muestras.
6.- Aparato según la reivindicación 5, caracterizado porque el tambor giratorio en el que van montados los recipientes del módulo de procesamiento de muestras es giratorio sobre un eje vertical. 7 '.- Aparato según la reivindicación 5, caracterizado porque el tambor giratorio en el que van montados los recipientes del módulo de procesamiento de muestras es giratorio sobre un eje horizontal.
8.- Aparato según las reivindicaciones 1 y 5, caracterizado porque las 5 cámaras del módulo de reacción van montadas en el tambor giratorio del módulo de distribución de muestras.
9.- Aparato según las reivindicaciones 1 y 6, caracterizado porque el módulo de procesamiento de muestras comprende además medios para el cierre del recipiente que aloja las muestras a analizar durante el procesamiento de dicha 0 muestra., cuyos medios consisten en un pistón que va montado en un bastidor situado por encima del tambor giratorio y bajo el que pueden situarse los diferentes recipientes por el giro de dicho tambor, siendo el bastidor desplazable en dirección longitudinal entre una posición superior de apertura y otra inferior de cierre del recipiente situado inmediatamente por debajo. 5 10.- Aparato según las reivindicaciones 1 y 7, caracterizado porque el módulo de procesamiento de muestras comprende además medios para el cierre del recipiente que aloja las muestras a analizar durante el procesamiento de dichas muestras, cuyos medios consisten en un pistón que va montado en un bastidor situado a un lado del tambor giratorio y frente al cual pueden situarse los diferentes o recipientes, colocados al otro lado del tambor, gracias al giro de dicho tambor, siendo el bastidor desplazable entre una posición de apertura y otra de cierre.
11.- Aparato según la reivindicación 1 , caracterizado porque cada uno de los recipientes del módulo de procesamiento de muestras comprende además medios para su cierre, cuyos medios consisten en un pistón o válvula montada en 5 cada recipiente y accionada por el movimiento del bastidor desplazable del módulo de homogeneización.
12.- Aparato según la reivindicación 1, caracterizado porque cada recipiente del módulo de procesamiento de muestras incluye una o más cámaras principales de homogeneización y una o más cámaras secundarias independientes 0 destinadas a contener los reactivos, intercomunicadas con la cámara principal, estando dicha cámara principal abierta para recibir la muestra a analizar y los medios de cierre, y disponiendo de un orificio inferior con filtro y válvula de paso, a través del que se inyecta la muestra homogeneizada en el módulo de reacción.
13.- Aparato según las reivindicaciones 9 y 12, caracterizado porque la 5 pared de la cámara principal dispone de un orificio de venteo, situado por encima de los orificios de intercomunicación con las cámaras secundarias, que determina el momento del cierre hermético de dicha cámara por el pistón, al ser sobrepasado dicho orificio por una junta de estanquidad del pistón, siendo dicho pistón desplazable dentro de la cámara principal, a partir de la posición de cierre hermético, para provocar el 5 aumento de presión dentro de la citada cámara.
14.- Aparato según la reivindicación 13, caracterizado porque la entrada de muestras en la cámara principal se efectúa a través del orificio de venteo.
15.- Aparato según la reivindicación 12, caracterizado porque las cámaras secundarias van cerradas superior e inferiormente mediante tapones a través 0 de los cuales pueden introducirse cánulas pertenecientes al módulo de gestión de reactivos para la inyección de reactivos o soluciones, o que son portadoras de sensores de presión, temperatura u otros parámetros físico-químicos.
16.- Aparato según la reivindicación 12, caracterizado porque la válvula de paso situada entre la cámara principal de cada recipiente del módulo de 5 procesamiento de muestras y la cámara del módulo de reacción consiste en una válvula antirretorno cuyo cierre se produce cuando se crea en la cámara del módulo de reacción una sobrepresión respecto de la cámara principal del módulo de procesamiento de muestras.
17.- Aparato según la reivindicación 9, caracterizado porque el bastidor o del módulo de procesamiento de muestras va montado sobre el eje de desplazamiento del módulo de distribución de muestras, a uno de los lados de dicho módulo, sin posibilidad de giro, pero con facultad de deslizamiento sobre el mismo entre posiciones límite determinadas por un sensor.
19.- Aparato según las reivindicaciones 1 y 9, caracterizado porque el 5 bastidor de desplazamiento longitudinal incluye los medios para la homogeneización de las muestras, los cuales están constituidos por un dispositivo de acción mecánica, térmica o generador de ondas capaz de actuar sobre las muestras.
20.- Aparato según las reivindicaciones 9 o 10, caracterizado porque dicho pistón es de estructura tubular y a través del mismo actúa el dispositivo para la o homogeneización de las muestras.
21.- Aparato según las reivindicaciones 1 y 16, caracterizado porque el módulo de reacción comprende, por cada recipiente del módulo de procesamiento de muestras, un cuerpo que define una cámara de reacción interna que dispone de una entrada conectada a la cámara principal de dicho recipiente a través de la válvula 5 antirretorno, de una entrada conectada la cámara secundaria de dicho recipiente, a través de la cual se inyecta una disolución de lavado, y de una salida de disoluciones hacia un depósito de desechos; siendo una de las paredes de dicha cámara portadora del sistema sensor encargado de detectar las sustancias presentes en la disolución o suspensión homogeneizada inyectada en la cámara. 22.- Aparato según la reivindicación 1 , caracterizado porque el módulo de gestión de reactivos y soluciones comprende al menos una jeringa motorizada encargada de almacenar y dispensar fluidos, que va acompañada de un actuador lineal que acciona el vastago del émbolo de la jeringa, de un sensor de posición para obtener la posición del émbolo, de una válvula antirretorno, y de una cánula de inyección que va fijada al bastidor móvil del módulo de procesamiento de muestras.
23.- Aparato según la reivindicación 22, caracterizado porque comprende una serie de depósitos de reactivos y soluciones, tantos como reactivos y soluciones diferentes sean necesarias, y al menos un dispositivo de bombeo capaz de aspirar los fluidos de los diferentes depósitos y dispensarlos a la cámara de homogeneización o de reacción.
24.- Aparato según la reivindicación 1 , caracterizado porque el módulo de reacción está constituido por un receptáculo para alojar un biosensor, que dispone de al menos un orificio de entrada para la muestra procedente del recipiente del módulo de procesamiento de muestras, al menos un orificio de entrada para soluciones líquidas adicionales, y al menos un orificio de salida para las distintas soluciones y los tubos o conducciones necesarios.
25.- Aparato según la reivindicación 24, caracterizado porque los orificios de entrada y salida están conectados por un conducto donde se sitúa un sistema de bombeo, el cual permite la recirculación de la muestra sobre el biosensor. 26.- Aparato según la reivindicación 24, caracterizado porque el receptáculo donde se encuentra el biosensor incluye un sistema de agitación o movimiento de la muestra líquida, para mejorar el funcionamiento de dicho biosensor.
27.- Aparato según la reivindicación 24, caracterizado porque dicho biosensor está formado por sustancias detectoras inmovilizadas en un soporte sólido en forma micro-matriz, o biochip, distribuidas en canales o cámaras de flujo.
28.- Aparato según la reivindicación 1 , caracterizado porque el módulo de lectura de datos comprende un detector de reacciones que incluye una fuente de luz para excitar el biosensor y un sistema de detección de la radiación apropiada.
29.- Aparato según la reivindicaciones 1 y 28, caracterizado porque dicha fuente de luz es monocromática y el sistema detector es una cámara CCD acoplada a filtros para detectar sólo la radiación apropiada.
30.- Aparato según las reivindicaciones 28 y 29, caracterizado porque la luz monocromática es conducida por medio de una guía de onda donde se encuentra el biosensor, que es excitado gracias a los modos evanescentes que se forman en la superficie exterior de dicha guía.
31.- Aparato según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una estructura en forma de jaula en la que va montada una columna vertical central, 0 que define el eje de giro del tambor giratorio del módulo de distribución de muestras y a lo largo de la que puede deslizar el bastidor del módulo de procesamiento de muestras, estando montados en dicha estructura en forma de jaula la tolva o embudo del módulo de adquisición de muestras, el módulo de gestión de reactivos y el módulo de lectura de datos. 5 32.- Aparato según las reivindicaciones 1 y 7, caracterizado porque comprende una estructura de jaula en la que va montado según un eje horizontal el tambor giratorio del módulo de distribución de muestras y paralelo a dicho eje las guías por la que se desliza el bastidor del módulo de procesamiento de muestras, estando además montados en dicha estructura la tolva o embudo del módulo de 0 adquisición de muestras, el módulo de gestión de reactivos, el módulo de lectura de datos y los módulos de comunicación y control.
33.- Un método para la detección de sustancias o analitos a partir del análisis de una o más muestras, caracterizado porque comprende las etapas de: a) mezclar dicha muestra con un líquido tampón apropiado; b) homogeneizar con un 5 sistema homogenizador; c) añadir reactivos para modificar dicha muestra, d) filtrar la muestra, e) inyectar dicha muestra a una cámara de reacción; f) dejar reaccionar la muestra con un biosensor; g) lavar el exceso de muestra no reaccionada; y h) detectar la muestra retenida en el biosensor.
34.- Un método según la reivindicación 33, caracterizado porque el o líquido tampón apropiado es una solución salina.
35.- Un método según la reivindicación 33, en el que el líquido tampón lleva un compuesto marcador de la muestra.
36.- Un método según la reivindicación 33, caracterizado porque el exceso de compuesto marcador se bloquea con un compuesto bloqueador.
37.- Un método según las reivindicaciones 1 y 33, caracterizado porque el biosensor está constituido por al menos una sustancia capaz de unirse específicamente a otra sustancia.
38.- Un método según la reivindicación 37, caracterizado porque la 5 sustancia o sustancias capaces de unirse específicamente a otra u otras sustancias se eligen del grupo formado por: a) una sustancia de naturaleza aminoacídica; b) una sustancia de naturaleza proteica; c) una sustancia de naturaleza nucleotídica; d)un ácido nucleico; e) un ácido nucleico-peptídico (PNA); f) una sustancia de naturaleza lipídica; g) una sustancia de naturaleza sacarídica; h) una sustancia que sea 0 combinación de al menos dos de las anteriores; j) una célula completa viva; j)una célula completa en forma de espora; k) un lisado o extracto celular, I) un tejido formado por células; m)un virus completo o cualquiera de sus componentes; n) polímeros sintéticos; y o) polímeros impresos molecularmente (MIP, molecularly imprinted polymers) 5 39.- Un método según la reivindicación 38, caracterizado porque las proteínas capaces de unirse específicamente a otras sustancias son anticuerpos monoclonales o policlonales.
40. Un método según la reivindicaciones 33 y 35 , caracterizado porque dichos compuestos modificadores de la muestra se eligen entre un reactivo químico 0 capaz de unirse a alguno de los analitos presentes en la muestra, o una o más sustancias de entre las mencionadas en las reivindicaciones 38 y 39, o una combinación de ambas.
41. Un método según la reivindicación 33 caracterizado porque la señal de la muestra retenida en el biosensor es amplificada por un cóctel o mezcla 5 conteniendo una o más sustancias de las mencionadas en las reivindicaciones 38 y 39.
42. Un método según las reivindicaciones 33 y 41 , caracterizado porque dicho cóctel está constituido por uno o más anticuerpos marcados con una sustancia fluorescente, un compuesto metálico, o una enzima. o 43. Un método según las reivindicaciones 33 y 41 , caracterizado porque dicho cóctel está constituido por uno o más fragmentos de ácidos nucleicos o PNA marcados con una sustancia fluorescente, un compuesto metálico, o una enzima.
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