WO2005007864A2 - Verfahren zur herstellung von carbonsäure-metallseifen - Google Patents

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Eike Ulf Mahnke
Santiago Ciruelos
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats

Definitions

  • the present invention is in the field of biotechnology and describes a process for the enzymatically catalyzed production of carboxylic acid metal soaps with nutritionally physiologically and pharmacologically relevant carboxylic acids and their use.
  • Enzymes are increasingly used as catalysts in chemical and biochemical synthesis.
  • hydrolases especially lipases (EC 3.1.1.3)
  • lipases EC 3.1.1.3
  • Enzymes are already known from the prior art which are stabilized by immobilization, for example by microencapsulation, and can be used repeatedly. However, there are already commercially available enzyme preparations today whose stability and availability make enzymatically catalyzed reactions economical.
  • metal soaps from C18 fatty acids can be prepared by reacting their methyl esters with suitable bases.
  • this synthetic route requires temperatures well above 130 ° C, so that CLA soaps with the required purity are not accessible via this process.
  • CLA ester Starting from the CLA ester, it chemically requires two steps to produce the metal soap, while the enzymatic process proceeds in one step.
  • the chemical hydrolysis of the ester requires stoichiometric amounts of base (and corresponding amounts of acid for neutralization), which leads to very cost-intensive processes.
  • Esters of PUFAs polyunsaturated fatty acids
  • fish oil or borage oil can easily be produced via transesterification.
  • the purification and enrichment of esters by distillation is generally easier than that of free acids.
  • the enzymatic process has the same advantages over the chemical two-step process as described above.
  • the prior art describes metal soaps of fatty acids which are used as a carrier material and for dispersions of bioactive substances such as amino acids in animal feed, especially for ruminants (US 5532008).
  • oils which are to be used in the feed industry are used as metal soaps (JP 4117294).
  • a mixture of raw materials from triglycerides of an unspecified composition is hydrolyzed by means of a lipase and converted to the metal soaps by divalent metal salts.
  • the raw material mixtures implemented here are undefined and the resulting product mixtures are still tolerable in the animal feed sector, but not desirable in the food and pharmaceutical industries.
  • the object of the present invention was to provide an improved process for the preparation of metal soaps of nutritionally physiologically and pharmacologically relevant carboxylic acids from the respective alkyl esters, which works under mild reaction conditions and leads to the metal soaps being separated from the reaction mixture directly and simply as solids can be and can be used directly.
  • the metal soaps thus obtained should also serve as a carrier or capsule material for other components.
  • the metal soaps should be obtained in high yields and lead to defined compositions up to the high purity of the individual metal soaps, since the metal soaps are used in addition to feed should also be used for the food industry and pharmacy. Furthermore, this process should be inexpensive.
  • the invention relates to a process for the production of metal soaps in which alkyl esters of polyunsaturated carboxylic acids are reacted enzymatically with a hydrolase in the presence of a basic metal salt.
  • the reaction can be carried out both in an aqueous medium and in an organic solvent with a small proportion of water.
  • the process according to the invention leads to very high yields of metal soaps of nutritionally physiologically and pharmacologically relevant carboxylic acids due to mild reaction conditions and inexpensively, which can be removed directly from the reaction mixture as solids.
  • the enzymatic process of converting the esters takes place in one reaction step and therefore shows advantages by saving process steps, avoiding waste and, of course, resulting in an enormous cost advantage.
  • the nutritionally relevant carboxylic acids include all that can be used in human or animal nutrition. These are preferably polyunsaturated fatty acids which have two to six double bonds (polyunsaturated fatty acids PUFAs) with a chain length of 16 to 22 carbon atoms or mixtures of fatty acids which make up more than 10% of one of the polyunsaturated fatty acids contain.
  • polyunsaturated fatty acids PUFAs polyunsaturated fatty acids which have two to six double bonds
  • PUFAs polyunsaturated fatty acids which make up more than 10% of one of the polyunsaturated fatty acids contain.
  • mixtures can be prepared by all conventional methods with which these two isomers can be enriched or with which one of the two isomers can be enriched, so that a mixing ratio of conjugated linoleic acids of at least 25% of the cis9, transl l-linoleic acid and the translO , cisl2-linoleic acid is formed.
  • unsaturated carboxylic acids are used in the form, their alkyl esters or triglycerides, the alkyl esters being particularly preferred.
  • AI alkyl esters in which the alkyl radical has a chain length of 1-4 carbon atoms, the alcohol component starting from a monohydric or dihydric, primary, secondary or tertiary alcohol.
  • Methyl or ethyl esters of the fatty acids are particularly preferably used in the process according to the invention.
  • glycerides of the fatty acids are used, which can be mono-, di- or triglycerides and the di- or triglycerides can in each case be esterified with the same or with different fatty acids and at least one of the fatty acids can be added to them mono- or polyunsaturated fatty acids according to the invention should count.
  • the mono-, di- or triglycerides can be produced synthetically or can be isolated naturally occurring.
  • the naturally occurring triglycerides to be used according to the invention are preferably isolated from borage oil, linseed oil, evening primrose oil, walnut oil, shrimp and fish oil or single cell oil, the single cell oil being isolated in particular from fungi and microalgae.
  • esters and triglycerides The difference between esters and triglycerides is that the hydrolysis equilibrium of the triglycerides is very far on the side of the fatty acids (> 95% degree of splitting can be reached in one step at 50% water), whereas the balance of the esters is very far on the side of the esters ( ⁇ 50 % Degree of splitting at 50% water).
  • the process according to the invention proceeds without removing the alcohol components.
  • the reaction equilibrium is shifted to the educts only via soap formation.
  • CLA conjugated linoleic acids
  • the conjugated linoleic acids (CLA) are part of many animal products such as meat or milk.
  • the CLA isomers are also found in low concentrations in some plant products. Their nutritional significance has been the subject of much research for many years. It could be shown that the most frequently occurring isomers cis9, fransll-CLA and translO, cisl2-CLA deliver very interesting and important results from a pharmaceutical and nutritional point of view.
  • the availability of these isomers by enrichment with the required high purity represents a major hurdle.
  • the process according to the invention is preferably used to produce metal soaps of any CLA isomers, but particularly preferred is the production of metal soaps of the most frequently occurring nutritionally important CLA isomers cis9, transll-CLA and frans 10, cisl2-CLA.
  • the calcium and magnesium soaps of these isomers are particularly preferred, the calcium soaps again being preferred.
  • the cis9, transII-CLA isomer is a natural component of milk that shows an anticarcinogenic effect in various animal models (Chin et al., J. Food Compos. Anal. 5 (1992), 185-197; Pariza et al. Prog. Lipid Res. 40 (2001) 283-298; Parodi, Austral. J. Dairy Technol. 56 (2001), 65-73).
  • the frans 10, cisl2-CLA isomer reduces the formation of body fat in mammals (Baumgard et al., Cornell Nutr. Conf. Feed Manuf. (2000), 180-190; Park et al., Lipids 34 (1999) 235-241 ) and reduces the proportion of milk fat in milk-producing mammals (Baumgard et al., J. Nutr. 131 (2001) 1764-1769; Masters et al, FASEB J. 13 (1999), A697; Harrell et al., J. A ⁇ im Sci. 77 (2000), 137-138; Chouinard et al. J. Nutr. 129 (1999, 1579-1584).
  • CLA has an anti-arterosclerotic activity (Röche et al., (Nutrition Research Reviews 14 (2001) 173-187, Stanley et al., Chemistry & Industry 19 (2001), 729-731).
  • PUFAs polyunsaturated fatty acids
  • fish oil contains a high proportion of DHA (Docosahexanoic acid) and EPA (Eicosapentanoic acid).
  • DHA Docosahexanoic acid
  • EPA Ecosapentanoic acid
  • Gama-linolenic acid is a component of Borage and Evening Primrose oil. Alpha linolenic acid is found e.g. in flaxseed oil in high concentration. In addition to algae, micro-fungi also produce PUFAs. For example, from the genus Morteriella gamma-linolenic acid, dihomo-gamma-linolenic acid and arachidonic acid (Ratledge, TIBTECH 11 (1993), 278-284; Shimizu et al., Comments Agric. Food Chem. 2 (1990) 211-235 ).
  • Linoleic acid and alpha-linolenic acid are essential fatty acids from which the more unsaturated n-3 (from linolenic acid) and n-6 (from linoleic acid) PUFAs are built. Linoleic acid is needed to maintain the skin's water barrier. The higher PUFAs are precursors to the synthesis of eicosanoids and prostaglandins. DHA is also found in brain lipids and in the retina (Vishwanath et al., Nutr. Clin. Practice 7 (1992) 179-186).
  • omega-3 fatty acids EPA, DHA, alpha-linolenic acid
  • omega-6 fatty acids linoleic acid
  • omega-3 fatty acids such as alpha-linolenic acid, DHA and EPA is therefore recommended in order to reduce the risk of coronary heart disease (heart attack, coronary artery disease).
  • omega-3 PUFAs have one alleviating influence on rheumatoid arthritis (de Deckere et al., European J. Clin. Nutrition 52 (1998) 749-753).
  • omega-3 PUFAs have immunomodulatory properties and have an anti-inflammatory potential (Calder, Proc. Nutr. Soc. 55 (1996) 737-774).
  • Gamma-linolenic acid has been described as having an anti-inflammatory potential and being suitable for the treatment of rheumatoid arthritis (Zurier et al., Rec. Adv. Biotech. Clin. Appl. (2001) 242-250; Zilberberg et al., Rec Adv. Biotech. Clin. Appl. (2001) 90-104).
  • Unsaturated fatty acids are modified in the rumen of ruminants via biohydration. This biohydration can be at least partially prevented if fatty acids in a protected form, e.g. are added as calcium soaps (Chalupa et al, J. Daiy Sei 69 (1986), 1293-1301). It has been shown that feeding calcium-soap-protected fatty acid mixtures influences the fat composition of the milk of ruminants, reduces the concentration of unwanted trans-fatty acids and e.g. Makes butter more spreadable (Chouinard et al., J. Dairy Sei. 81 (1998), 471-481, Precht et al., Eur. J. lipid Sei. Technol. 103 (2001) 783-792, Precht et al., Kiel Dairy Research Reports 54 (2002) 225 - 242.
  • PUFAs (mainly DHA and EPA) from fish oils or algae hides are enriched either by hydrolysis of the oil or by transesterification to ethyl ester (Wanasundara et al., Seafoods - Quality, Technology and Nutraceutical applications (2002) 157-174).
  • the ethyl ester route is the most commonly used.
  • the PUFA ethyl esters are then enriched by molecular distillation and optionally further enrichment, for example by urea precipitation (WO 9524459; Nakajima et al., Essential Fatty Acids and Eicosanoids, Invited Papers from the Third Int. Congress (1992), 57-64).
  • the enrichment of alpha- and gamma-linolenic acid or arachidonic acid from vegetable oils and microbial lipids can in principle also be carried out via molecular distillation and / or urea precipitation after transesterification of the oils.
  • methyl or ethyl esters of the carboxylic acids mentioned are particularly preferred for the process according to the invention.
  • the methyl and / or ethyl esters of the conjugated linoleic acids (CLA) are to be reacted and saponified by the process according to the invention.
  • basic metal salts are understood to be those which are formed by calcium, magnesium, zinc or aluminum.
  • the hydroxides calcium hydroxide Ca (OH) 2 , magnesium hydroxide Mg (OH) 2 , aluminum hydroxide Al (OH) 3 and zinc hydroxide Zn (OH) 2 or the oxides are preferred in each case.
  • Calcium hydroxide and magnesium hydroxide are particularly preferred for use in the process according to the invention.
  • Calcium shows an effect in cancer prevention in colon cancer (Parodi, Austral. J. Dairy Technol. 56 (2001), 35-58).
  • the combination of vitamin D and calcium is particularly effective. Calcium also showed a supportive function in the breakdown of adipose tissue. In combination with a diet, calcium supplementation led to improved weight loss, as shown in a 2-year study of women from Purdue University.
  • the metal loops are made into granules directly during the enzymatic production, the particles or granules having an average particle size of 0.05 mm to 3 cm, preferably 0.1 mm to 2 mm and particularly preferably 0 , 2 mm to 3 mm.
  • the particle sizes can be varied depending on the process and reaction conditions used and can be set within narrow limits.
  • the particle size can be flexibly adjusted depending on the application (human nutrition, animal feed additive, fish feed additive).
  • the process according to the invention can be carried out both in the aqueous medium and in the organic medium of a solvent with a water content of at least 5%, preferably with a water content of 5% to 50%.
  • the temperature during the enzymatic production process is between 15 and 60 ° C, a temperature between 20 and 40 ° C being particularly preferred.
  • a method is preferred in which the proportion of the aqueous phase and or of the organic solvent containing 5-50% water is between 50% by weight and 90% by weight in the reaction vessel.
  • the carboxylic acid ester is metered in during the enzymatic reaction.
  • the metering can be carried out either continuously or in several individual steps. If appropriate, further hydrolase is metered in during the reaction.
  • a process is preferred in which the carboxylic acid ester is metered into the reaction mixture comprising water and / or solvent, hydrolase and metal salt via a nozzle process.
  • the dosage can either be continuous or in several steps.
  • the carboxylic acid ester is emulsified with the reaction mixture comprising water and / or solvent and metal salt via membrane processes or dispersion processes and the hydrolase is mixed in by stirring.
  • an emulsion is produced using a ceramic hollow fiber membrane using an apparatus consisting of: storage tank for aqueous phase, pressure tank for the methyl ester up to 2 bar, membrane module with ceramic membrane (e.g. membrane module 100 my single-channel membrane type C), post-reaction tank and peristaltic pump.
  • the starting materials are mixed by means of a rotor / stator process using an apparatus consisting, for example, of IKA Process-Pilot 2000/4 generator means 4 M, with a metering device on the pump side.
  • the nozzle method is preferred according to the invention. All processes have in common that the carboxylic acid ester is mixed into the aqueous phase in such a way that during the reaction the product is simultaneously made up by crystallization.
  • the reaction is preferably carried out by the nozzle, membrane or dispersion process with continuous stirring in a batch reactor.
  • the reaction in a crude or column reactor is also preferred.
  • the particle size of the particles or the granules can be adjusted by metering in the ester and the stirrer geometry and speed.
  • the granulated soap is easy to isolate by filtration and is a free-flowing product after drying.
  • the soaps produced in this way are low in dust and can be incorporated directly into food or feed.
  • the metal salts can also be incorporated into solid dishes or can be encapsulated before incorporation.
  • a crystallization aid is added to the process in order to improve the product packaging.
  • particles or granules with an average particle size of 2 to 5 mm are obtained, particularly preferably particles or granules with an average particle size of 2 to 3 mm are obtained.
  • the crystallization aids according to the invention are starch or cellulose, the starch being preferred.
  • the soaps produced by the crystallization aid are also low in dust and can be worked in directly, worked into solid dishes or encapsulated. Bio availability of the soaps
  • the particles or granules have good bioavailability.
  • the mildly dried granules dissolve in gastric juice within a few minutes and are then available as free fatty acids.
  • the rate of degradation of the granules is similar or even better than that of commercially available stearate soaps of Ca, Mg or Zn.
  • the metal soaps are converted into the free acids and mainly the chlorides of the metals.
  • the soaps cannot be reduced from the metal chlorides and the free acids, so that the carboxylic acids can be completely adsorbed. Comparative studies with metal chlorides have shown that metal soaps are not formed or only to a very small extent.
  • the hydrolases used according to the invention are enzymes which have lipolytic activity under basic conditions.
  • the hydrolases are preferably lipases, esterases or phospholipases which are active at a temperature between 15 and 60 ° C. They can be used either alone or in combination with several enzymes.
  • the activity of the amount of enzyme to be used of Lipozym TL 1001 is typically between 200-10,000 kU per kg of carboxylic acid ester used (specified by the activity assay from Novozym A / S).
  • hydrolases from organisms which are selected from the group formed by Thermomyces, Candida antarctica A, Candida antarctica B, Rhizomucor miehei, Candida cylindracea, Rhizopus javanicus, Porcine pancreas, Aspergillus niger, Candida rugosa, Mucor javanicus, Pseudomonas fluorescens, Rhizopus oryzae, Pseudomonas sp., Chromobacterium viscosum, Fusarium oxysporum and Penicilium camenberti. The use of the alkaline lipase / esterase from the organism Thermomyces is preferred.
  • the hydrolases to be used according to the invention can be used in various forms. In principle, all dosage forms of enzymes customary for the person skilled in the art can be used.
  • the enzymes are preferably used in pure form or as a technical enzyme preparation in solution, in particular in aqueous solution.
  • the proportion of active enzyme in the respective technical enzyme preparations varies from manufacturer to manufacturer. However, the proportion is 2-10% active enzyme on average.
  • the reaction conditions of the enzymatically catalyzed reaction according to the invention depend on the optimal reaction range of the selected enzymes and on the alkyl esters of the carboxylic acids used. In particular, these are conditions in which, among other things, the reaction temperature is chosen between 15 and 60 ° C., preferably a temperature between 20 and 40 ° C.
  • the particles or granules produced by this mild process still contain lipase activity if lipase was used as hydrolase, which is released in the stomach after the capsules have dissolved.
  • This lipase activity can have an additional digestive support by breaking down fats.
  • the lipase can be deactivated by briefly heating the soaps.
  • Another object of the invention is the use of metal soaps of nutritionally relevant carboxylic acids which are produced by the process according to the invention as a food supplement and / or as a feed additive and / or as a pharmaceutical fatty acid derivative.
  • feed additives use in ruminants is particularly preferred.
  • Another object of the invention results from this effect.
  • This further object of the invention are preparations containing metal soaps of polyunsaturated carboxylic acids in the form of granules, produced by the method according to the invention as carrier or capsule material and one or more additional components which are selected from the group formed by enzymes, vitamins, antioxidants, Preservatives, dyes, carotenoids, sterols, flavone and isoflavone compounds and fatty acid derivatives.
  • the enzymes are an additional component in the preparation according to the invention.
  • preparation of enzymes selected from the group consisting of proteases, glycosidases, lipases, esterases, amidases and phytases.
  • the vitamins are fat-soluble vitamins of classes A, D, E and K and their derivatives and / or water-soluble vitamin C and its derivatives.
  • the antioxidants are the food-approved substances selected from the group which is formed by ascorbic acid E300, calcium ascorbate E302, sodium ascorbate E301, ascorbyl palmitate E304, vitamin E (mixture of tocopherols E306 - E309), propyl gallate E310, octyl gallate E311, dodecyl gallate E312, isoascorbic acid E315, sodium isoascorbate E316, butyl-4-hydroxyanisole E320 and butylhydroxytyrosol E321.
  • the preferred preservatives as an additional component in the preparation according to the invention are the food-approved substances selected from the group which is formed by E200 - E203 (sorbic acid, sodium sorbate, potassium sorbate, calcium sorbate), E210 - E219 (benzoic acid, sodium benzoate, potassium benzoate) , Calcium benzoate) E214 - E219 (parahydroxybenzoate), E236 - E238 (formic acid, sodium formate, calcium formate), E260 - E263 (acetic acid, potassium acetate, sodium acetate, calcium acetate), E270 (lactic acid) and E280 - E283 (propionic acid) , Calcium propionate, potassium propionate).
  • E200 - E203 sorbic acid, sodium sorbate, potassium sorbate, calcium sorbate
  • E210 - E219 benzoic acid, sodium benzoate, potassium benzoate
  • Calcium benzoate E214 - E219 (parahydroxybenzoate)
  • the preferred carotenoids are in particular carotenoids selected from the group which is formed by carotenes, lycopene, lutein, astaxanthin, zeaxanthin and canthaxantin.
  • the sterols are in particular sterols which are isolated from plant sources, such as, for example, sitosterol, campesterol or stigmasterol.
  • the preferred fatty acid derivatives are lipoic acid and its derivatives such as esters or glycerides.
  • the additional components mentioned are encapsulated either alone or in combination with several components in the granules from the metal soaps, produced by the process according to the invention, or are bound to the metal soaps, so that they act as a carrier material.
  • the way in which the components are assembled with the metal soaps depends on the respective manufacturing process. These substances are released when the granulated soaps dissolve in the acidic environment of the stomach.
  • Another object of the invention is a process for the preparation of preparations containing metal soaps of polyunsaturated carboxylic acids in the form of granules produced by the process according to the invention as carrier or capsule material and one or more additional components which are selected from the group which is formed by enzymes, Vitamins, antioxidants, preservatives, dyes, carotenoids, sterols, flavone and isoflavone compounds and fatty acid derivatives, one or more of the additional components being incorporated directly into the granules of metal soaps of polyunsaturated carboxylic acids during the enzymatic reaction.
  • An essential advantage of the method according to the invention for the production of metal soaps, in particular of nutritional and / or pharmacologically relevant carboxylic acids, is that the metal soaps can be produced directly as granules of different particle sizes. These production processes therefore enable a further process in which one or more additional components are incorporated directly into the granules or the granules function directly as a carrier material for the additional components. No further process step is necessary to incorporate the additional components. Depending on the reaction conditions of the manufacturing process, the optimal conditions can be set for the preferred components in order to incorporate them as desired.
  • the additional components are fat-soluble substances and / or substances which form a water-insoluble soap in the presence of a basic metal salt and or substances which are bound by a metal soap.
  • additional components or substances are used synonymously in the sense of the invention. It is possible according to the invention to add the additional components to the reaction mixture comprising water and / or organic solvent, metal salt, hydrolase and according to the invention before or during the enzymatic reaction. dosedi carboxylic acid esters, a continuous dosage or a dosage to be carried out in several steps being possible.
  • a method is particularly preferred in which the fat-soluble substances are dissolved or suspended and evenly distributed in the carboxylic acid ester before the enzymatic conversion to the metal soaps and in that the water-soluble substances are dissolved in the form of the hydroxides or oxides in the reaction medium comprising water and metal salt in the reaction medium or suspended and evenly distributed.
  • Another object of the invention is the use of the preparations according to the invention as a nutritional supplement and / or as a feed additive and / or as a pharmaceutical fatty acid derivative.
  • the three main components oleic acid, 9cisJltrans-CLA and 10trans, 12cis-CLA were used for the analysis.
  • the fatty acid distribution of the products was checked against one enzymatically mild conditions hydrolyzed CLA methyl ester compared.
  • the formation of new CLA isomers during the reaction and purification was less than 1%. The results too
  • the incubation is ended after 24 h.
  • the solvent was removed on a rotary evaporator and the still moist samples were frozen. All batches were lyophilized and the products obtained were analyzed by gas chromatography after the free fatty acids formed had been silylated.
  • the conversions of the enzymatic hydrolysis were determined by comparing the peak areas of the free acids formed to the unreacted CLA methyl esters.
  • the three main components oleic acid, 9cis, Htrans-CLA and 10transJ2cis-CLA were used for the analysis.
  • the fatty acid distribution of the products was compared directly against the substrate CLA ethyl ester. The formation of new CLA isomers during the reaction and purification was less than 1%.
  • the results for conversion and isomer distribution are shown in the following table:
  • the incubation was ended after 24 hours and the batches were frozen completely without product separation. All batches were lyophilized, the soaps formed are digested acidically and the fatty acids released were extracted with isooctane. The fatty acids obtained were analyzed by gas chromatography after sylylation. The turnover of the enzymatic hydrolysis was determined by comparing the peak areas of the free acids formed to the mono-, di- and triglycerides still present.
  • the incubation is ended after 24 h.
  • the approaches are frozen completely without product separation. All batches are lyophilized, the soaps formed are digested acidically and the fatty acids released are extracted with isooctane. The fatty acids obtained are analyzed by gas chromatography after sylylation. The turnover of the enzymatic hydrolysis is determined by comparing the peak areas of the free acids formed to the mono-, di- and triglycerides still present.
  • the batches are incubated for a total of 24 h at 30 ° C on the laboratory shaker. The incubation is ended after 24 h.
  • the approaches are frozen completely without product separation. All batches are lyophilized, the soaps formed are digested acidically and the fatty acids released are extracted with isooctane. The fatty acids obtained are analyzed by gas chromatography after sylylation. The turnover of the enzymatic hydrolysis is determined by comparing the peak areas of the free acids formed to the mono-, di- and triglycerides still present.
  • the approaches are frozen completely without product separation. All batches are lyophilized, the soaps formed are digested acidically and the fatty acids released are extracted with isoctane. The fatty acids obtained are analyzed by gas chromatography after sylylation. The conversions of the enzymatic hydrolysis are determined by comparing the peak areas of the free acids formed to the methyl ester still present.
  • linolenic acid ethyl ester and 1.8 g of water are weighed into 2 batches in closable bottles.
  • 30 mg Ca (OH) 2 are added to batch 1 and 30 mg Mg (OH) 2 are added to batch 2.
  • 300 ⁇ l of a technical lipolase preparation (Novozymes A / S) are pipetted into all batches. The batches are incubated at 30 ° C. on a laboratory shaker. After 5 hours, 6 mg of Ca (OH) 2 are added to batch 1 and 6 mg of Mg (OH) 2 to batch 2.
  • 300 ⁇ l of a technical lipolase preparation are pipetted into all batches. The batches are incubated for a total of 24 h at 30 ° C on the laboratory shaker.
  • the incubation is ended after 24 h.
  • the approaches are frozen completely without product separation. All batches are lyophilized, the soaps formed are digested acidically and the fatty acids released are extracted with isoctane. The fatty acids obtained are analyzed by gas chromatography after sylylation. The conversions of the enzymatic hydrolysis are determined by comparing the peak areas of the free acids formed to the ethyl ester still present.
  • the conversions of the enzymatic hydrolysis were determined by comparing the peak areas of the free acids formed to the unreacted CLA methyl esters.
  • the three main components oleic acid, 9cis, l ltrans-CLA and 10trans, 12cis-CLA were used for the analysis. Result:
  • the conversion of the enzymatic reaction is 100%.
  • reaction solution was continuously stirred with a three-bladed paddle stirrer.
  • the reaction was incubated for a total of 24 h with stirring.
  • the precipitated calcium soap was then filtered off.
  • the conversions of the enzymatic hydrolysis were determined by comparing the peak areas of the free acids formed to the unreacted CLA methyl esters.
  • the three main components oleic acid, 9cis, lltrans-CLA and 10trans, 12cis-CLA were used for the analysis.
  • the precipitated magnesium soap is then filtered off.
  • the conversions of the enzymatic hydrolysis are determined by comparing the peak areas of the free acids formed to the unreacted CLA methyl esters.
  • the three main components oleic acid, 9cis, Htrans-CLA and 1 Otrans, 12cis-CLA were used for the analysis.
  • the conversion of the enzymatic reaction is 91%.
  • the metering in of the CLA methyl ester causes the formation of soft round Mg-CLA particles in a size range of 2-5 mm.
  • the reaction was readily stirrable over the entire duration of the reaction.
  • the product is easy to filter.
  • the product is less free-flowing than Ca soaps of the appropriate particle size.
  • the addition of starch to the reaction leads to the formation of a soft powdery product.
  • the conversions of the enzymatic hydrolysis are determined by comparing the peak areas of the free acids formed to the unreacted CLA methyl esters.
  • the three main components oleic acid, 9cis, Htrans-CLA and 10transJ2cis-CLA were used for the analysis.
  • the fatty acid distribution of the products was compared against an enzymatically hydrolyzed CLA methyl ester under mild conditions.
  • the grain size of the CLA soaps formed was analyzed by sieve analysis.
  • the grain size of the products is smaller when the methyl ester is metered in via a nozzle than when the ester is added dropwise, as described in Example 12.
  • the grain size of the product can be adjusted using the stirrer speed.
  • the reac- tion stirred for a further 2 h while cooling to about 15 ° C. with cold water.
  • the Ca-CLA beads formed are filtered off on a suction filter and dried under vacuum.
  • the conversions of the enzymatic hydrolysis are determined by comparing the peak areas of the free acids formed to the unreacted CLA methyl esters.
  • the three main components oleic acid, 9cis, ltrans-CLA and 10trans, 12cis-CL ⁇ were used for the analysis.
  • the fatty acid distribution of the products was compared against an enzymatically hydrolyzed CLA methyl ester under mild conditions.
  • the grain size of the CLA soaps formed was analyzed by sieve analysis.
  • Apparatus consisting of: Storage tank for aqueous phase, pressure tank CLA methyl ester up to 2 bar, membrane module with ceramic membrane (membrane module 100 my single-channel membrane type C), post-reaction tank, peristaltic pump
  • the aqueous phase consisting of 500 ml deionized water, 55 g calcium hydroxide, 25 g Starch and 5 ml of Lipozym TL 100 L are mixed using Ulfra-Turrax and filled into the storage container. 100 g of CLA methyl ester are placed in the pressure vessel.
  • the peristaltic pump is switched on (6.7 l / h) and the drain container is pressurized with 2 bar.
  • IKA Process-Pilot 2000/4 generator medium 4 M with pump-side dosing device for CLA methyl ester dosing.
  • the IKA ProcessPilot was used as the test apparatus for the Ca-CLA particle production, 200 g demineralized water, 10 g starch, 22 g calcium hydroxide and 2 g lipozyme TL 100 1 were introduced and mixed for the container. The device was then started up at 6500 rpm. 100 ml of CLA methyl ester were metered in within 3 min. About 5 g of calcium hydroxide were then added and the experiment was ended after 3 more minutes. Particle agglomerates of up to 1 cm in diameter were formed.
  • the lipolase activity in the supernatant and soap is determined by hydrolysis of sunflower oil. For this, 50 mg of the lyophilized soap or 0.5 ml of the supernatant are added to small vials. 2 ml of water are pipetted into the lyophilisate and 1.5 ml of water into the supernatant. Then 2 g of sunflower oil and 200 mg of lauric acid are added as an internal standard. As a comparison standard, 10 ⁇ l lipolase are mixed with 1.5 ml water, 0.5 ml saturated Mg (OH) 2 solution, 2 g sunflower oil and 200 mg lauric acid. The 3 batches are incubated on a shaker at 30 ° C.
  • a lipolase activity corresponding to 100% of the lipolase activity of the standard was detected in the lyophilisate. 4% of the enzyme activity of the standard was detected in the supernatant. The recovery rate is 104%. About 96% of the lipolase activity used is in the product.
  • the CLA soap is suitable as an enzyme carrier for hydrophobic enzymes. Lipase activity is largely found in the product. Comparisons to the standard show that the enzyme was not deactivated during product processing.
  • the soaps are washed once with 1 ml of water, frozen and lyophilized.
  • the lyophilizate of sample 4 is heated to 95 ° C for 10 min and the lyophilisate of sample 5 is heated to 95 ° C for 60 min.
  • Lipolase activity in the supernatants and soaps is determined by hydrolysis of sunflower oil.
  • 50 mg of the lyophilized soaps or 0.5 ml of the supernatants are added to small vials. 2 ml of water are pipetted into the lyophilisates and 1.5 ml of water are pipetted into the supernatants.
  • 2 g of sunflower oil and 200 mg of lauric acid are added as an internal standard.
  • the batches are incubated on a shaker at 30 ° C. Samples are taken after 30 min, 3 h and 24 h, the oil phase is separated off, sylylated and analyzed by gas chromatography for the formation of partial glycerides and fatty acids.
  • the formation of diglycerides per hour from sunflower oil was chosen as a measure of the hydrolytic activity.
  • the amounts of lyophihsate and supernatant used correspond to a maximum amount of 10 ⁇ l lipolase.
  • the CLA methyl ester is placed in the round bottom flask and calcium hydroxide (96%) is stirred in. After the reaction solution has been stirred at 130 ° C. for two hours, the mixture is heated at 140-150 ° C. for 1.5 hours. Subsequent stirring in a water jet vacuum at 150 ° C. does not lead to the conversion of the methyl ester. Since temperatures of over 130 ° C already favor the formation of undesired CLA isomers, the choice of longer reaction times and temperatures does not appear to make sense.
  • the fat-soluble constituents (hydrolytically released fatty acid and myristic acid methyl ester) are extracted with an Ultraturrax for 60 seconds, the organic phase is separated and immediately separated. The organic phase is sylilated and analyzed by gas chromatography. The degree of hydrolysis is determined against a sample which is completely digested in 1 M HC1 at 60 ° C. and consists of 250 mg of soap and 75 mg of myristic acid methyl ester.
  • the Ca-CLA is almost completely dissolved in gastric fluid at 30 ° C after 10 minutes, so that the free CLA is available.
  • the Ca-CLA is therefore very bioavailable.
  • the rate of hydrolysis is higher than that of Ca stearate.
  • the fat-soluble constituents (hydrolytically released fatty acid and myristic acid methyl ester) are extracted with an Ultraturrax for 60 seconds, the organic phase is separated and immediately separated. The organic phase is sylilated and analyzed by gas chromatography. The degree of hydrolysis is determined against a sample which is completely digested in 1 M HC1 at 60 ° C. and consists of 250 mg of soap and 75 mg of myristic acid methyl ester.
  • the Mg-CLA is completely dissolved in gastric juice at 30 ° C after just 10 minutes, so that the free CLA is available.
  • the Mg-CLA is therefore very bioavailable.
  • the rate of hydrolysis is comparable to that of Mg stearate.
  • the fat-soluble constituents (hydrolytically released fatty acid and myristic acid methyl ester) are extracted with an Ultraturrax for 60 seconds, the organic phase is separated and immediately separated. The organic phase is sylilated and analyzed by gas chromatography. The degree of hydrolysis is determined against a sample which is completely digested in 1 M HC1 at 60 ° C. and consists of 250 mg of soap and 75 mg of myristic acid methyl ester.
  • the Zn-CLA is completely dissolved in gastric juice at 30 ° C after just 10 minutes, so that the free CLA is available.
  • the Zn-CLA is therefore very bioavailable.
  • the hydrolysis rate is comparable to that of Zn stearate.
  • the soaps are washed once with 1 ml of water, then the soaps and the supernatants are frozen and lyophilized.
  • the supernatants are taken up directly in silylating agent and examined by gas chromatography.
  • the dried soaps are digested acidically, sylilized and then analyzed by gas chromatography.
  • the sylylated additives are analyzed in parallel as standards.
  • the soaps are washed once with 1 ml of water, then the soaps and the supernatants are frozen and lyophilized.
  • the supernatants are taken up directly in silylating agent and examined by gas chromatography.
  • the dried soaps are acidically digested, sylilized and then analyzed by gas chromatography.
  • the sylylated additives are analyzed in parallel as standards.
  • the substances riboflavin, retinyl propionate and thiamine are analyzed by photo speculation.
  • the soaps and the supernatants are recorded in DMSO. The adsorption of the substances are compared to each other at their maximum adsorption.
  • the fat-soluble vitamins are completely or almost completely built into the Ca-CLA. Most of the water-soluble vitamins are found in the supernatant, with the exception of vitamin C and ascorbyl palmitate, which form insoluble calcium soaps. The recovery rate of vitamin C and ascorbyl palmitate is low because most of the product remains undissolved as Ca soap and not with the analytical method is recorded. The proportion of vitamin C is therefore higher than the value determined by gas chromatography. Vitamins and vitamin derivatives of classes A, C, D, E and K are therefore suitable for formulation in soaps.
  • the soaps are washed once with 1 ml of water, then the soaps and the supernatants are frozen and lyophilized.
  • the supernatants are taken up directly in silylating agent and examined by gas chromatography.
  • the dried soaps are digested acidically, sylylated and then searched for by gas chromatography.
  • the sylylated additives are analyzed in parallel as standards.
  • the substances carotene and astaxanthin are analyzed by photospectrometry.
  • the soaps and the supernatants are recorded in DMSO. The adsorption of the substances is compared with each other at their maximum adsorption.
  • metal soaps of fatty acids are suitable as carriers for carotenoids, sterols, sterols, flavone compounds and fatty acid derivatives. 33. Incorporation of enzymes in Ca-CLA
  • the soap is washed once with 1 ml of water, then the soap and the supernatant are frozen and lyophilized. 200 ⁇ l of supernatant and 20 mg of soap are taken up in 1 ml of citrate buffer, pH 5.0 and analyzed photometrically for enzyme activity.

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Abstract

Vorgeschlagen wird ein Verfahren zur Herstellung von Metallseifen bei dem Alkylester von einfach- oder mehrfach ungesättigten Carbonsäuren in Anwesenheit eines basischen Metallsalzes mit einer Hydrolase enzymatisch umgesetzt werden, sowie die Verwendung von Metallseifen mehrfach ungesättigter Carbonsäuren hergestellt nach dem erfindungsgemässen Verfahren als Nahrungsergänzungsmittel und/oder als Futtermitteladditiv und/oder als pharmazeutisches Fettsäurederivat. Weiterhin werden Zubereitungen vorgeschlagen, enthaltend Metallseifen mehrfach ungesättigter Carbonsäuren in Form von Granulat hergestellt nach dem erfindungsgemässen Verfahren als Träger- oder Kapselmaterial und eine oder mehrere zusätzliche Komponenten die ausgewählt sind aus der Gruppe, die gebildet wird von Enzymen, Vitaminen, Antioxidantien, Konservierungsmitteln, Farbstoffen, Carotinoiden, Sterolen, Flavon- und Isoflavonverbindungen und Fettsäurederivaten. Neben diesen Zubereitungen wwird des weiteren ein Verfahren vorgeschlagen zur Herstellung der Zubereitungen bei dem eine oder mehrere der zusätzlichen Komponenten direkt während der enzymatischen Umsetzung in das Granulat aus Metallseifen mehrfach ungesättigter Carbonsäuren eingearbeitet werden, sowie die Verwendung der erfindungsgemässen Zubereitungen als Nahrungsergänzungsmittel und/oder als Futtermitteladditiv und/oder als pharmazeutisches Fettsäurederivat.

Description

Verfahren zur Herstellung von Carbonsäure- Metallseifen
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung befindet sich auf dem Gebiet der Biotechnologie und beschreibt ein Verfahren zur enzymatisch katalysierten Herstellung von Carbonsäure- Metallseifen ernährungsphysiologisch und pharmakologisch relevanter Carbonsäuren sowie deren Verwendung.
Stand der Teehnik
In der chemischen und biochemischen Synthese werden vermehrt Enzyme als Katalysatoren eingesetzt. So werden in vielen Fällen aufgrund der oft milderen Reaktionsbedingungen bereits in großtechnischen Verfahren Hydrolasen, speziell Lipasen (EC 3.1.1.3) zur Fettspaltung eingesetzt.
Der Nachteil bei enzymatisch katalysierten Reaktionen liegt oft in der Verfügbarkeit und Stabilität der Polypeptide. Aus dem Stand der Technik sind bereits Enzyme bekannt, die durch Immobilisierung beispielsweise durch Mikroeinkapselung stabilisiert vorliegen und mehrfach Verwendung finden können. Es gibt heutzutage jedoch bereits kommerziell erhältliche Enzympräparate, deren Stabilität und Verfügbarkeit enzymatisch katalysierte Reaktionen wirtschaftlich machen.
Die Synthese von Fettsäureseifen durch Neutralisation der freien Säure mit geeigneten Basen verläuft bereits bei Raumtemperatur vollständig und in ausreichender Geschwindigkeit. Dieser Darstellungsweg erweist sich im Falle von CLA-Seifen wegen der hohen Eduktkosten für viele Anwendungsbereiche als unwirtschaftlich: Die Herstellung qualitativ hochwertiger CLA erfolgt über die Transesterifizierung von linolsäurereichen Ölen zum Methyl- oder Ethylester, optional einer destillativen Anreicherung der Linolsäurees- ter und dann einer basisch katalysierten Isomerisierung. Die so hergestellten Ester müss- ten dann basisch verseift und anschliessend wieder neutralisiert werden um zur freien Säure zu gelangen, was zusätzliche Kosten und eine hohe Salzfracht erzeugt. Alternativ lassen sich Metallseifen von C18-Fettsäuren durch Umsetzung ihrer Methylester mit geeigneten Basen herstellen. Dieser Syntheseweg erfordert jedoch Temperaturen deutlich über 130 °C, so dass CLA-Seifen mit der erforderlichen Reinheit über diesen Prozess nicht zugänglich sind. Ausgehend vom CLA-Ester erfordert es chemisch zwei Schritte zur Herstellung der Metallseife, während das enzymatische Verfahren in einer Stufe verläuft. Die chemische Hydrolyse des Esters erfordert stöchiometrische Mengen an Base (und zur Neutralisation entsprechende Mengen an Säure) was zu sehr kostenintensiven Prozessen führt.
Ester von PUFAs (polyunsaturated fatty acids) z.B. aus Fischöl oder Borretschöl können leicht über Transesterifizierung hergestellt werden. Die destillative Aufreinigung und Anreicherung von Estern ist generell einfacher als die von freien Säuren. Ausgehend von den Estern hat dass enzymatische Verfahren die gleichen Vorteile gegenüber dem chemischen Zweistufenverfahren wie oben beschrieben.
Im Stand der Technik werden Metallseifen von Fettsäuren beschrieben, die als Trägermaterial und für Dispersionen von bioaktiven Wirkstoffen wie beispielsweise Aminosäuren in Futtermitteln speziell für Wiederkäuer eingesetzt werden (US 5532008).
Aus dem Stand der Technik ist weiterhin bereits bekannt, dass Öle, die in der Futtermittelindustrie verwendet werden sollen, als Metallseifen eingesetzt werden (JP 4117294). Ein Gemisch an Rohstoffen aus Triglyceriden nicht näher definierter Zusammensetzung wird mittels einer Lipase hydrolysiert und durch zweiwertige Metallsalze zu den Metallseifen umgesetzt. Die hier umgesetzten Rohstoffgemische sind Undefiniert und die resultierenden Produktgemische im Futtermittelsektor noch tolerabel, doch in der Nahrungsmittelindustrie und Pharmazie nicht wünschenswert.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung hat darin bestanden, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Metallseifen ernährungsphysiologisch und pharmakologisch relevanter Carbonsäuren aus den jeweiligen Alkylestern zur Verfügung zu stellen, welches unter milden Reaktionsbedingungen arbeitet und dazu führt, dass die Metallseifen als Feststoffe direkt und einfach vom Reaktionsgemisch abgetrennt werden können und direkt einsetz- bar sind. Die so erhaltenen Metallseifen sollten außerdem als Träger- oder Kapselmaterial für weitere Komponenten dienen. Insbesondere sollten die Metallseifen in hohen Ausbeuten erhalten werden und zu definierten Zusammensetzungen bis hin zur hohen Reinheit der einzelnen Metallseifen führen, da die Metallseifen neben der Futtermittelanwendung auch für die Nahrungsmittelindustrie und Pharmazie zuiή Einsatz kommen sollen. Des weiteren sollte dieses Verfahren kostengünstig sein.
Beschreibung der Erfindung
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Metallseifen bei dem Alkylester von mehrfach ungesättigten Carbonsäuren in Anwesenheit eines basischen Metallsalzes mit einer Hydrolase enzymatisch umgesetzt werden. Die Reaktion kann sowohl im wässrigen Medium als auch in organischem Lösungsmittel mit einem geringen Anteil an Wasser durchgeführt werden.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass das erfindungsgemäße Verfahren durch milde Reaktionsbedingungen und kostengünstig zu Metallseifen ernährungsphysiologisch und pharmakologisch relevanter Carbonsäuren in sehr hohen Ausbeuten fuhrt, die als Feststoffe direkt dem Reaktionsgemisch entzogen werden können. Im Vergleich zum zweistufigen chemischen Verfahren verläuft das enzymatische Verfahren der Umsetzung der Ester über einen Reaktionsschritt und zeigt deshalb Vorteile durch Einsparung von Prozessschritten, Vermeidung von Abfall und daraus resultierend natürlich auch einen enormen Kostenvorteil.
Im Sinne der Erfindung zählen zu den ernährungsphysiologisch relevanten Carbonsäuren alle, die in der Human- oder Tierernährung verwendet werden können. Bevorzugt handelt es sich dabei um mehrfach ungesättigte Fettsäuren die zwei bis sechs Doppelbindungen aufweisen (polyunsaturated fatty acids PUFAs) mit einer Kettenlänge von 16 bis 22 C- Atomen oder um Mischungen aus Fettsäuren, die einen Anteil von größer als 10 % einer der mehrfach ungesättigten Fettsäuren enthalten.
Insbesondere bevorzugt sind Arachidonsäure, Docosahexanoic acid (DHA), Eicosapenta- noic acid (EPA), alpha- und gamma Linolensäure, konjugierte Linolsäuren (conjugated linoleic acid = CLA) insbesondere die cis9,transll-Linolsäure und die frans 10,cis 12- Linolsäure sowie deren Gemische oder insbesondere um Gemische konjugierter Linolsäuren, die einen Anteil von mindestens 25 % der cis9,transl l-Linolsäure und der translO,cisl2-Linolsäure enthalten. Diese Gemische können nach allen herkömmlichen Verfahren hergestellt werden, mit denen diese beiden Isomere angereichert werden können, oder mit denen man eines der beiden Isomere anreichern kann, sodass ein Mischungsverhältnis von konjugierten Linolsäuren von mindestens 25 % der cis9,transl l- Linolsäure und der translO,cisl2-Linolsäure entsteht.
hn Sinne der Erfindung werden ungesättigten Carbonsäuren in Form, ihrer Alkylester oder Triglyceride eingesetzt, wobei die Alkylester besonders bevorzugt sind. Insbesondere AI- kylester bei denen der Alkyhest eine Kettenlänge von 1-4 C- Atomen besitzt wobei die Alkoholkomponente von einem einwertigen oder zweiwertigen, primärem, sekundärem oder tertiärem Alkohol ausgeht. Insbesondere bevorzugt werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren Methyl- oder Ethylester der Fettsäuren eingesetzt. In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden Glyceride der Fettsäuren eingesetzt, wobei es sich um Mono-, Di- oder Triglyceride handeln kann und die Di- oder Triglyceride jeweils mit der gleichen oder mit unterschiedlichen Fettsäuren verestert sein können und wenigstens eine der Fettsäuren zu den erfindungsgemäßen einfach- oder mehrfach ungesättigten Fettsäuren zählen soll. Die Mono-, Di- oder Triglyceride können synthetisch hergestellt sein oder natürlich vorkommend isoliert werden. Die erfindungsgemäß einzusetzenden, natürlich vorkommenden Triglyceride werden bevorzugt aus Borretschöl, Leinsamenöl, Nachtkerzenöl, Walnussöl, Shrimp- und Fischöl oder Single Cell Öl isoliert, wobei das Single Cell Öl insbesondere aus Pilzen und Mikro- algen isoliert wird.
Der Unterschied zwischen Estern und Triglyceriden liegt darin, dass das Hydrolysegleichgewicht der Triglyceride sehr weit auf Seiten der Fettsäuren liegt (> 95 % Spaltgrad einstufig erreichbar bei 50 % Wasser), wogegen das Gleichgewicht bei den Estern sehr weit auf Seite der Ester liegt (< 50 % Spaltgrad bei 50 % Wasser).
Das erfindungsgemäße Verfahren verläuft beim Einsatz der Methyl- oder Ethylester ohne Entfernung der Alkoholkomponenten. Das Reaktionsgleichgewicht wird ausschließlich über die Seifenbildung zu den Edukten verschoben.
CLA-Isomere
Die konjugierten Linolsäuren (CLA) sind Bestandteil vieler Tierprodukte wie Fleisch oder auch Milch. Man findet die Isomere der CLA in geringen Konzentrationen auch in einigen pflanzlichen Produkten. Ihre ernährungsphysiologische Bedeutung ist seit vielen Jahren Thema vieler Forschungsarbeiten. So konnte gezeigt werden, dass die am häufigsten vorkommenden Isomere cis9,fransll-CLA und translO,cisl2-CLA pharmazeutisch und ernährungsphysiologisch sehr interessante und bedeutende Ergebnisse liefern. Die weiteren, weniger häufig vorkommenden Isomere trans9,cisll-CLA, trans9,transll-CAL, cis9,cisll-CLA, cislO,transl2-CLA, frans 10,transl2-CAL, cislO,cisl2-CLA oder auch trans7,cis9-CAL, trans8,cisl0-CLA, trans8,transl0-CLA, cisll,transl3-CLA, transl l,transl3-CLA sind bislang in ihren physiologischen Wirkungen wenig untersucht worden, da eine wesentliche Vorraussetzung für die Verwendung von CLA und CLA- Derivaten im Nahrungs- und Futteimittelsektor sowie in der Pharmazie die hohe Reinheit des Produktes darstellt. Die Verfügbarkeit dieser Isomere durch Anreicherung mit einer benötigten hohen Reinheit stellt eine große Hürde dar. Das erfindungsgemäße Verfahren ist bevorzugt einzusetzen um Metallseifen beliebiger CLA-Isomere herzustellen, besonders bevorzugt ist jedoch die Herstellung von Metallseifen der am häufigsten vorkommenden ernährungsphysiologisch bedeutenden CLA-Isomere cis9,transll-CLA und frans 10,cisl2-CLA. Insbesondere bevorzugt sind die Calzium- und Magnesiumseifen dieser Isomere, wobei die Calziumseifen wiederum bevorzugt sind.
Das cis9,transll-CLA Isomer ist ein natürlicher Bestandteil der Milch, der eine anticarci- nogene Wirkung in verschiedenen Tiermodellen zeigt (Chin et al., J. Food Compos. Anal. 5 (1992), 185 - 197; Pariza et al. Prog. Lipid Res. 40 (2001) 283-298; Parodi, Austral. J. Dairy Technol. 56 (2001), 65 - 73).
Das frans 10,cisl2-CLA Isomer reduziert die Bildung von Körperfett in Säugetieren (Baumgard et al., Cornell Nutr. Conf. Feed Manuf. (2000), 180 - 190; Park et al., Lipids 34 (1999) 235 - 241) und reduziert den Anteil von Milchfett in milchproduzierenden Säugetieren (Baumgard et al., J. Nutr. 131 (2001) 1764 - 1769; Masters et al, FASEB J. 13 (1999), A697; Harrell et al., J. Aήim. Sei. 77 (2000), 137 - 138; Chouinard et al. J. Nutr. 129 (1999, 1579 - 1584).
Zusätzlich besitzt CLA eine antiarterosklerotische Wirkung (Röche et al., (Nutrition Research Reviews 14 (2001) 173 - 187, Stanley et al., Chemistry & Industry 19 (2001), 729 - 731).
Die basisch induzierte Isomerisierung von Linolsäureestern liefert als Primärprodukte lediglich die erwünschten cis9,fransll- und translO,cisl2-Isomere, deren positive physiologische Wirkung erwiesen ist. Wird das Produkt jedoch auf über 130 °C erhitzt, fuhren Umlagerungsreaktionen zur Bildung unerwünschter Isomere, die das erhaltene Material unbrauchbar machen.
Die Synthese von Fettsäureseifen durch Neutralisation der freien Säure mit geeigneten Basen verläuft bereits bei Raumtemperatur vollständig und in ausreichender Geschwindigkeit. Dieser Darstellungsweg erweist sich im Falle von CLA-Seifen wegen der hohen Eduktkosten für viele Anwendungsbereiche als unwirtschaftlich. Alternativ lassen sich Metallseifen von C18-Fettsäuren durch Umsetzung ihrer Methylester mit geeigneten' Basen herstellen. Dieser Syntheseweg erfordert jedoch Temperaturen deutlich über 130 °C, so dass CLA-Seifen mit der erforderlichen Reinheit über diesen Prozess nicht zugänglich sind. PUFAs
PUFAs (polyunsaturated fatty acids) kommen in verschiedenen tierischen, pflanzlichen und mikrobiellen Lipiden vor.
Fischöl enthält beispielsweise einen hohen Anteil an DHA (Docosahexanoic acid) und EPA (Eicosapentanoic acid). Diese Fettsäuren werden hauptsächlich von Mikroalgen produziert und werden über die Nahrungskette in Fischen angereichert. Mikroalgen produzieren zum Teil nur ein bestimmtes PUFA, was die Anreicherung erleichtert (Ratledge, TIBTECH 11 (1993), 278 - 284).
Gama-Linolensäure ist ein Bestandteil von Borage und Evening Primrose Öl. Alpha- Linolensäure findet sich z.B. in Leinsamenöl in hoher Konzentration. Neben Algen produzieren auch Mikropilze PUFAs. So können z.B. aus der Gattung Mor- teriella Gamma-Linolensäure, Dihomo-Gamma-Linolensäure und Arachidonsäure isoliert werden (Ratledge, TIBTECH 11 (1993), 278 - 284; Shimizu et al., Comments Agric. Food Chem. 2 (1990) 211 - 235).
Linolsäure und alpha-Linolensäure sind essentielle Fettsäuren, aus denen die höher ungesättigten n-3 (aus Linolensäure) und n-6 (aus Linolsäure) PUFAs aufgebaut werden. Linolsäure wird zur Aufrechterhaltung der Wasserbarriere der Haut benötigt. Die höheren PUFAs sind Vorstufen zur Synthese der Eicosanoide und Prostaglandine. DHA wird zudem in Lipiden des Gehirns und in der Retina gefunden (Vishwanath et al., Nutr. Clin. Practice 7 (1992) 179 - 186).
Das Verhältnis der Aufnahme von omega-3 -Fettsäuren (EPA, DHA, Alpha-Linolensäure) zu omega-6-Fettsäuren (Linolsäure) hat sich in den letzten Jahren deutlich zu einer erhöhten Aufnahme von omega-6-Fettsäuren verschoben, was z.B. auch zu einem Shift der Muttermilchkomponenten geführt hat (Sanders, Am. J. Clin. Nutr. 71 (2000) 176S - 178S). Es wird vermutet, dass das Verhältnis von omega 3 zu omega 6 Fettsäuren auch einen Einfluss auf depressive Zustände hat. Niedrige Level von omega-3 -Fettsäuren im Gehirn und in der spinalen Flüssigkeit sind korreliert mit einer niedrigen Konzentration des Neurotransmitters Serotonin (Small, New Scientist (2002) 35 - 37). Bevölkerungen, die einen hohen Anteil an omega-3 -Fettsäuren zu sich nehmen, wie Eskimos oder Japaner, haben ein deutlich niedrigeres Risiko an Herz- und Kreislauferkrankungen (Bilo et al., Biomed & Pharmacother 44 (1990) 169 - 174; Sugano et al., Am. J. Clin. Nutr. 71 (2000) 189S - 196S).
Eine Erhöhung des Anteils an omega-3-Fettsäuren wie alpha-Linolensäure, DHA und EPA wird daher empfohlen, um die Gefahr an coronary heart disease (Herzinfarkt, Erkrankung der Herzkranzgefäße) zu erniedrigen. Zusätzlich haben omega-3-PUFAs einen lindernden Einfluss auf rheumatische Arthritis (de Deckere et al., European J. Clin. Nutrition 52 (1998) 749 - 753). Zudem besitzen omega-3 PUFAs immunomodulatorische Eigenschaften und besitzen ein antiinflammatorisches Potential (Calder, Proc. Nutr. Soc. 55 (1996) 737 - 774).
Für gamma-Linolensäure ist beschrieben, dass sie ein antiinflammatorisches Potential besitzt und zur Behandlung von rheumatoider Arthritis geeignet ist (Zurier et al., Rec. Adv. Biotech. Clin. Appl. (2001) 242 - 250; Zilberberg et al., Rec. Adv. Biotech. Clin. Appl. (2001) 90 - 104).
Säuglinge können zwar PUFAs (Arachidonsäure, DHA) aus Linol- und Linolensäure selbst synthetisieren, allerdings nur sehr langsam (Uauy et al., Proc. Nutr. Soc. 59 (2000) 3 - 15. Aus diesem Grund ist eine Supplementierung von PUFAs, insbesondere von Arachidonsäure und DHA für die visuelle und neuronale Entwicklung von Neugeborenen hilfreich. Einen wichtigen Einfluss scheint die richtige Balance zwischen DHA und Arachidonsäure zu haben (Horocks et al., Pharmacol. Research 40 (1999) 211 - 225; Jensen et al., Clin. Perinatology 29 (2002) 261 - 281; Forsyth et al., New Comprehensive bio- chemistry 35 (2002) 129 - 146; Gibson et al., Adv. Exp. Med. Biol. 501 (2001) 375 - 383; Wainwright et al., Rec. Adv. Biotech. Clin. Appl. (2001) 180 - 189).
Ungesättigte Fettsäuren werden im Pansen von Wiederkäuern über Biohydrierung modifiziert. Diese Biohydrierung kann zumindest zum Teil unterbunden werden, wenn Fettsäuren in geschützter Form, z.B. als Calziumseifen zugefüttert werden (Chalupa et al, J. Dai- ry Sei 69 (1986), 1293 - 1301). Es konnte gezeigt werden, dass die Fütterung von Calzi- um Seifen geschützten Fettsäuremischungen die Fettzusammensetzung der Milch von Wiederkäuern beeinflusst, die Konzentration an unerwünschten Trans-Fettsäuren verringert und z.B. Butter streichfähiger macht (Chouinard et al., J. Dairy Sei. 81 (1998), 471 - 481, Precht et al., Eur. J. lipid Sei. Technol. 103 (2001) 783 - 792, Precht et al., Kieler Milchwirtschaftliche forschungsberichte 54 (2002) 225 - 242.
Die Anreicherung von PUFAs (hauptsächlich DHA und EPA) aus Fischölen oder auch Algenhpiden erfolgt entweder über Hydrolyse des Öls oder aber über Transesterifizierung zum Ethylester (Wanasundara et al., Seafoods - Quality, Technology and Nutraceutical applications (2002) 157 - 174). Die Ethylesterroute ist die industriell gebräuchlichste. Die Anreicherung der PUFA-Ethylester erfolgt dann über Molekulardestillation und optional weitere Anreicherung z.B. über Hamstoffällung (WO 9524459; Nakajima et al., Essential Fatty Acids and Eicosanoids, Invited Papers from the Third Int. Congress (1992), 57 - 64).
Die Anreicherung von alpha- und gamma-Linolensäure oder Arachidonsäure aus pflanzlichen Ölen und mikrobiellen Lipiden kann prinzipiell ebenfalls über Molekulardestillation und/oder Hamstoffällung nach Transesterifizierung der Öle durchgeführt werden.
Besonders bevorzugt für das erfindungsgemäße Verfahren sind die Methyl- oder Ethylester der genannten Carbonsäuren. Insbesondere sollen die Methyl- und/oder Ethylester der konjugierten Linolsäuren (CLA) nach dem erfindungsgemäßen Verfahren umgesetzt und verseift werden.
Die basisch induzierte Isomerisierung von Linolsäureestern liefert als Primärprodukte lediglich die erwünschten cis9,transll- und frans 10,cisl2-Isomere, deren positive physiologische Wirkung erwiesen ist. Wird das Produkt jedoch auf über 130 °C erhitzt, führen Umlagerungsreaktionen zur Bildung unerwünschter Isomere, die das erhaltene Material unbrauchbar machen.
Die Synthese von Fettsäureseifen durch Neutralisation der freien Säure mit geeigneten Basen verläuft bereits bei Raumtemperatur vollständig und in ausreichender Geschwindigkeit. Dieser Darstellungsweg erweist sich im Falle von CLA-Seifen wegen der hohen Eduktkosten für viele Anwendungsbereiche als unwirtschaftlich. Alternativ lassen sich Metallseifen von C18-Fettsäuren durch Umsetzung ihrer Methylester mit geeigneten Basen herstellen. Dieser Syntheseweg erfordert jedoch Temperaturen deutlich über 130 °C, so dass CLA-Seifen mit der erforderlichen Reinheit über diesen Prozess nicht zugänglich sind.
Metallsalze
Im Sinne der Erfindung sind unter basischen Metallsalzen solche zu verstehen, die von Calzium, Magnesium, Zink oder Aluminium gebildet werden. Bevorzugt sind dabei jeweils die Hydroxide Calziumhydroxid Ca(OH)2, Magnesiumhydroxid Mg(OH)2, Alumi- niumhydroxid Al(OH)3 und Zinkhydroxid Zn(OH)2 oder die Oxide. Besonders bevorzugt für den Einsatz im erfmdungsgemäßen Verfahren sind Calziumhydroxid und Magnesiumhydroxid.
Calzium zeigt Wirkung in der Krebsvorbeugung bei Dickdarmkrebs (Parodi, Austral. J. Dairy Technol. 56 (2001), 35 - 58). Insbesondere die Kombination aus Vitamin D und Calzium ist wirkungsvoll. Calzium zeigte außerdem eine unterstützende Funktion beim Abbau von Fettgewebe. In Kombination mit einer Diät führte die Gabe von Calzium zu einem verbesserten Gewichtsverlust, wie eine 2- Jahresstudie an Frauen von der Purdue University zeigt.
Magnesium ist ebenso wie Calzium ein essentielles Mineral. Magnesium Unterversorgung führt zu Änderungen der gastrointestinalen, cardiovaskulären und neuromuskulären Funktionen (Bohl et al., Grit. Rev. Food Sei. Nutr. 42 (2002) 533 - 563). Die ausreichende Versorgung mit Magnesium in der Bevölkerung ist nicht immer gegeben.
Partikel oder Granulat Konfektionierung
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung werden die Metalsleifen direkt während der enzymatischen Herstellung zu einem Granulat konfektioniert, wobei die Partikel oder Granulate eine mittlere Teilchengröße von 0,05 mm bis 3 cm, bevorzugt von 0,1 mm bis 2 mm und insbesondere bevorzugt von 0,2 mm bis 3 mm besitzen. Die Partikelgrößen können je nach eingesetztem Verfahren und Reaktionsbedingungen variiert werden und innerhalb enger Grenzen eingestellt werden. Die Partikelgröße kann in Abhängigkeit der Anwendung (Humanemährung, Tierfütterzusatz, Fischfutterzusatz) flexibel eingestellt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann sowohl im wässrigen Medium als auch in organischem Medium eines Lösungsmittels mit einem Wasseranteil von mindestens 5 %, bevorzugt mit einem Wasseranteil von 5 % bis 50 % durchgeführt werden. Die Temperatur während des enzymatischen Herstellungsverfahren liegt zwischen 15 und 60 °C wobei eine Temperatur zwischen 20 und 40 °C besonders bevorzugt ist. Erfindungsgemäß bevorzugt ist ein Verfahren, bei dem der Anteil der wässrigen Phase und oder des organischen Lösungsmittel enthaltend 5-50 % Wasser zwischen 50 Gew.-% und 90 Gew.-% im Reaktionsgefäß beträgt.
Prinzipiell sind alle möglichen Verfahren zur Vermischung der Edukte erfindungsgemäß einsetzbar, die zu Partikeln oder Granulaten führen.
In einer besondern Ausführungsform wird der Carbonsäureester während der enzymatischen Umsetzung zudosiert. Die Zudosierung kann entweder kontinuierlich oder in mehreren einzelnen Schritten erfolgen. Gegebenenfalls wird während der Reaktion weitere Hydrolase zudosiert. Bevorzugt ist ein Verfahren, bei dem der Carbonsäureester dem Reaktionsgemisch enthaltend Wasser und/oder Lösungsmittel, Hydrolase und Metallsalz über ein Düsenverfahren zudosiert wird. Die Dosierung kann hier entweder kontinuierlich oder in mehreren Schritten erfolgen. In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßeh Verfahren wird der Carbonsäureester mit dem Reaktionsgemisch enthaltend Wasser und/oder Lösungsmittel und Metallsalz über Membranverfahren oder Dispergierverfahren emulgiert und die Hydrolase durch Rühren untergemischt. Bei dem Membranverfahren wird mittels keramischer Hohlfasermembran über eine Apparatur bestehend aus: Vorlagebehälter für wässrige Phase, Druckbehälter für den Methylester bis 2 bar, Membranmodul mit keramischer Membran (beispielsweise Membranmudul 100 my Einkanalmembran Typ C), Nachreaktionsbehälter und Schlauchpumpe eine Emulsion hergestellt. Bei dem Dispergierverfahren wird die Vermischung der Edukte mittels Rotor/Stator Verfahren durch eine Apparatur bestehend beispielsweise aus IKA Process-Pilot 2000/4 Generator Mittel 4 M, mit pumpenseitiger Dosierungseinrichtung durchgeführt.
Das Düsenverfahren ist erfϊndungsgemäß bevorzugt. Allen Verfahren ist gemeinsam, dass der Carbonsäureester in die wässrige Phase so vermischt wird, dass bei der Reaktion das Produkt durch Kristallisation gleichzeitig konfektioniert wird. Bevorzugt wir die Umsetzung nach dem Düsen-, Membran- oder Dispergierverfahren unter kontinuierlichem Rühren in einem Batch-Reaktor durchgeführt. Ebenfalls bevorzugt ist die Umsetzung in einem Roh- oder Säulenreaktor.
Die Teilchengröße der Partikel oder des Granulates lässt sich über die Zudosierung des Esters sowie der Rührergeometrie und -drehzahl einstellen.
Die granulierte Seife ist einfach über Filtration isolierbar und ist nach Trocknung ein rie- selfähiges Produkt. Die so hergestellten Seifen sind staubarm und können direkt in Nah- rungs- oder Futtermittel eingearbeitet werden. Die Metallsalze können jedoch ebenfalls in feste Speisen eingearbeitet sein oder vor der Einarbeitung verkapselt werden.
Kristallisierhilfe
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wir dem Verfahren eine Kristallisierhilfe beigemischt um die Produktkonfektionierung zu verbessern. Auf diesem Wege werden Partikel oder Granulate mit einer mittleren Teilchengröße von 2 bis 5 mm erhalten, besonders bevorzugt werden Partikel oder Granulate mit einer mittleren Teilchengröße von 2 bis 3 mm erhalten.
Bei den erfindungsgemäßen Kristallisierhilfen handelt es sich um Stärke oder Cellulose, wobei die Stärke bevorzugt ist. Die durch die Kristallisierhilfe hergestellten Seifen sind ebenfalls staubarm und können direkt eingearbeitet werden, in feste Speisen eingearbeitet werden oder verkapselt vorliegen. Bio Verfügbarkeit der Seifen
Die Partikel oder Granulate besitzen eine gute Bioverfügbarkeit. Die mild getrockneten Granulate lösen sich innerhalb weniger Minuten in Magensaftflüssigkeit auf und liegen dann als freie Fettsäure vor. Die Abbaugeschwindigkeit der Granulate ist ähnlich oder sogar besser als technisch verfügbare Stearatseifen von Ca, Mg oder Zn. Im sauren Milieu des Magens werden die Metallseifen in die freien Säuren und hauptsächlich die Chloride der Metalle umgewandelt. Im neutralen pH- Wert des Darms können die Seifen aus den Metallchloriden und den freien Säuren nicht zurückgebildet werden, so dass die Carbonsäuren vollständig adsorbiert werden können. Vergleichende Untersuchungen mit Metallchloriden haben gezeigt, dass es nicht oder nur in sehr geringem Maße zur Bildung von Metallseifen kommt.
Hydrolasen
Die erfindungsgemäß verwendeten Hydrolasen stellen Enzyme dar, die eine lipolytische Aktivität unter basischen Bedingungen aufweisen. Es handelt sich erfindungsgemäß bei den Hydrolasen bevorzugt um Lipasen, Esterasen oder Phospholipasen die bei einer Temperatur zwischen 15 und 60 °C aktiv sind. Sie können entweder allein oder in Kombination mit mehreren Enzymen eingesetzt werden. Speziell bevorzugt ist die Verwendung von technischer Lipolase Präparation, insbesondere Lipozy ® TL 1001 (Novozym A/S) der Firma Novozym. Die Aktivität der einzusetzenden Enzymmenge an Lipozym TL 1001 beträgt typischerweise zwischen 200 - 10.000 kU pro kg eingesetztem Carbonsäureester (spezifiziert nach Aktivitätsassay der Firma Novozym A/S).
Typische Beispiele für geeignete Hydrolasen, die jedoch nicht einschränkend sein sollen, sind Hydrolasen von Organismen die ausgewählt sind aus der Gruppe, die gebildet wird von Thermomyces, Candida antarctica A, Candida antarctica B, Rhizomucor miehei, Candida cylindracea, Rhizopus javanicus, Porcine pancreas, Aspergillus niger, Candida rugosa, Mucor javanicus, Pseudomonas fluorescens, Rhizopus oryzae, Pseudomonas sp., Chromobacterium viscosum, Fusarium oxysporum und Penicilium camenberti. Bevorzugt ist der Einsatz der alkalinen Lipase/Esterase aus dem Organismus Thermomyces.
Die erfindungsgemäß einzusetzenden Hydrolasen können in unterschiedlichen Formen eingesetzt werden. Prinzipiell sind alle dem Fachmann gebräuchlichen Darreichungsformen von Enzymen anwendbar. Vorzugsweise werden die Enzyme in reiner Form oder als technisches Enzympräparat in Lösung, insbesondere in wässriger Lösung eingesetzt. Der Anteil an aktiven Enzym in den jeweiligen technischen Enzympräparaten variiert von Hersteller zu Hersteller. Der Anteil liegt j edoch im Mittel bei 2- 10 % aktiven Enzym. Die erfindungsgemäßen Reaktionsbedingungen der enzymatisch katalysierten Reaktion richten sich nach dem optimalen Reaktionsbereich der ausgewählten Enzyme und nach den verwendeten Alkylestern der Carbonsäuren. Im Besonderen handelt es sich um Bedingungen bei denen unter anderem die Reaktionstemperatur zwischen 15 und 60 °C, bevorzugt eine Temperatur zwischen 20 und 40 °C gewählt wird.
Die über dieses milde Verfahren hergestellten Partikel oder Granulate enthalten noch Li- paseaktivität, wenn Lipase als Hydrolase eingesetzt wurde, die nach Auflösung der Kapseln im Magen freigesetzt wird. Diese Lipaseaktivität kann durch den Abbau von Fetten eine zusätzliche Verdauungsunterstützende Wirkung haben. Alternativ kann die Lipase über kurze Erhitzung der Seifen deaktiviert werden.
Verwendung der Metallseifen
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von Metallseifen ernährungsphysiologisch relevanter Carbonsäuren, welche nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden als Nahrungserganzungsmittel und/oder als Futtermitteladditiv und/oder als pharmazeutisches Fettsäurederivat. Im Falle der Verwendung als Futtermitteladditive ist die Anwendung bei Wiederkäuern besonders bevorzugt.
Zubereitungen enthaltend Metallseifen und weitere Komponenten
Das enzymatische Herstellverfahren mit integrierter Konfektionierung erlaubt die direkte
Einarbeitung insbesondere hydrophober Komponenten.
Aus diesem Effekt resultiert ein weiterer Gegenstand der Erfindung.
Dieser weitere Gegenstand der Erfindung sind Zubereitungen enthaltend Metallseifen mehrfach ungesättigter Carbonsäuren in Form von Granulat, hergestellt nach dem erfindungsgemäßen Verfahren als Träger- oder Kapselmaterial und eine oder mehrere zusätzliche Komponenten die ausgewählt sind aus der Gruppe, die gebildet wird von Enzymen, Vitaminen, Antioxidantien, Konservierungsmitteln, Farbstoffen, Carotinoiden, Sterolen, Flavon- und Isoflavonverbindungen und Fettsäurederivaten.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieses weiteren Gegenstandes der Erfindung handelt es sich bei den Enzymen als zusätzliche Komponente in der erfindungsgemäßen Zu- bereitung um Enzyme, ausgewählt aus der Gmppe, die gebildet wird von Proteasen, Gly- kosidasen, Lipasen, Esterasen, Amidasen und Phytasen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den Vitaminen um fettlösliche Vitamine der Klassen A, D, E und K sowie deren Derivate und/oder um wasserlösliches Vitamin C sowie dessen Derivate.
Die Kombination aus Metallseifen ernährungsphysiologisch und pharmakologisch relevanter Carbonsäuren mit essentiellen Vitaminen macht eine Anwendung in der Nahrungsmittel und Futtermittelindustrie besonders attraktiv.
In einer weiteren Ausführungsform des weiteren Gegenstandes der Erfindung handelt es sich bei den Antioxidantien um die lebensmittelzugelassenen Stoffe ausgewählt aus der G ppe die gebildet wird von Ascorbinsäure E300, Calciumascorbat E302, Natriumascor- bat E301, Ascorbylpalmitat E304, Vitamin E (Mischung von Tocopherolen E306 - E309), Propylgallat E310, Octylgallat E311, Dodecylgallat E312, Isoascorbinsäure E315, Natri- umisoascorbat E316, Butyl-4-hydroxyanisol E320 und Butylhydroxytyrosol E321.
Bei den bevorzugten Konservierungsmitteln als zusätzliche Komponente in der erfindungsgemäßen Zubereitung handelt es sich um die lebensmittelzugelassenen Stoffe ausgewählt aus der Gmppe die gebildet wird von E200 - E203 (Sorbinsäure, Natriumsorbat, Kaliumsorbat, Calciumsorbat), E210 - E219 (Benzoesäure, Natriumbenzoat, Kaliumben- zoat, Calciumbenzoat) E214 - E219 (Parahydroxybenzoeester), E236 - E238 (Ameisensäure, Natriumformiat, Calciumformiat), E260 - E263 (Essigsäure, Kaliumacetat, Natri- umacetat, Calciumacetat), E270 (Milchsäure) und E280 - E283 (Propionsäure, Natri- umpropionat, Calciumpropionat, Kaliumpropionat).
In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei den bevorzugten Carotinoiden insbesondere um Carotinoide ausgewählt aus der Gmppe die gebildet wird von Carotin, Ly- copen, Lutein, Astaxanthin, Zeaxanthin und Canthaxantin.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des weiteren Gegenstandes der Erfindung handelt es sich bei den Sterolen insbesondere um Sterole, die aus pflanzlichen Quellen isoliert werden wie beispielsweise um Sitosterol, Campesterol oder Stigmasterol.
Bei den bevorzugten Fettsäurederivaten handelt es sich um Liponsäure und dessen Derivate wie Ester oder Glyceride. Die genannten zusätzlichen Komponenten werden entweder allein oder in Kombination mit mehreren Komponenten in die Granulate aus den Metallseifen, hergestellt nach dem erfindungsgemäßen Verfahren eingekapselt oder liegen gebunden an den Metallseifen vor, sodass diese als Trägermaterial fungieren. In welcher Weise die Komponenten mit den Metallseifen konfektioniert werden, hängt vom jeweiligen Herstellungsverfahren ab. Diese Substanzen werden mit der Auflösung der granulierten Seifen im sauren Milieu des Magens freigesetzt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Zubereitungen enthaltend Metallseifen mehrfach ungesättigter Carbonsäuren in Form von Granulat hergestellt nach dem erfindungsgemäßen Verfahren als Träger- oder Kapselmaterial und eine oder mehrere zusätzliche Komponenten die ausgewählt sind aus der Gmppe, die gebildet wird von Enzymen, Vitaminen, Antioxidantien, Konservierungsmitteln, Farbstoffen, Carotinoiden, Sterolen, Flavon- und Isoflavonverbindungen und Fettsäurederivaten wobei eine oder mehrere der zusätzlichen Komponenten direkt während der enzymatischen Umsetzung in das Granulat aus Metallseifen mehrfach ungesättigter Carbonsäuren eingearbeitet werden.
Ein wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von Metallseifen, insbesondere von ernährungsphysiologischen und/oder pharmakologisch relevanten Carbonsäuren liegt darin, dass die Metallseifen direkt als Granulate unterschiedlicher Teilchengröße herstellbar sind. Diese Herstellungsverfahren ermöglichen deshalb ein weiteres Verfahren, bei dem ein oder mehrere zusätzliche Komponenten direkt in die Granulate eingearbeitet werden oder die Granulate direkt als Trägermaterial für die zusätzlichen Komponenten fungieren. Es ist kein weiterer Verfahrensschritt notwendig um die zusätzlichen Komponenten einzuarbeiten. Je nach Reaktionsbedingengen des Herstellverfahrens lassen sich für die jeweilig bevorzugten Komponenten die optimalen Bedingungen einstellen um diese gewünscht einzuarbeiten.
In einer besonderen Ausführungsform dieses Verfahrens zur Herstellung der erfindungsgemäßen Zubereitungen handelt es sich bei den zusätzlichen Komponenten um fettlösliche Substanzen und/oder um Substanzen, die in Anwesenheit eines basischen Metallsalzes eine wasserunlösliche Seife bilden und oder um Substanzen, die von einer Metallseife gebunden werden.
Die Begriffe zusätzliche Komponenten oder Substanzen werden im Sinne der Erfindung synonym verwendet. Es ist erfindungsgemäß möglich die zusätzlichen Komponenten vor oder während der enzymatischen Umsetzung dem Reaktionsgemisch enthaltend Wasser und/oder organisches Lösungsmittel, Metallsalz, Hydrolase und erfindungsgemäß zudo- sierteni Carbonsäureester zudosieren, wobei eine kontinuierliche Dosierung oder eine in mehreren Schritten vorzunehmende Dosierung möglich ist.
Besonders bevorzugt ist ein Verfahren, bei dem die fettlöslichen Substanzen vor der enzymatischen Umsetzung zu den Metallseifen im Carbonsäureester gelöst oder suspendiert und gleichmäßig verteilt werden und dass die wasserlöslichen Substanzen vor der Umsetzung zu Metallseifen im Reaktionsmedium enthaltend Wasser und Metallsalz in Form der Hydroxide oder Oxide gelöst oder suspendiert und gleichmäßig verteilt werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Zubereitungen als Nahrangsergänzungsmittel und/oder als Futtermitteladditiv und/oder als pharmazeutisches Fettsäurederivat.
Beispiele
A) Beispiele zur enzymatischen Herstellung
1. Enzymatische Synthese von Ca-CLA aus CLA-Methylester ex Sonnenblumenöl
In 4 Ansätze in verschließbaren Flaschen wurden 5 g CLA-Methylester und 45 g Wasser eingewogen. Zu den Ansätzen 1 und 2 wurden 0,75 g Ca(OH)2 gegeben, zum Ansatz 3 wurde 1,2 g CaCl2 gegeben. Zu allen Ansätzen werden 150 μl einer technischen Lipolase- Präparation (Novozymes A/S) pipettiert. Die Ansätze wurden bei 30 °C auf einem Laborschüttler inkubiert. Nach 5 h wurden zu den Ansätzen 1 und 2 jeweils 0,15 g Ca(OH)2 und zum Ansatz 3 0,24 g Ca Cl gegeben. Zu allen Ansätzen wurden erneut 150 μl einer technischen Lipolase-Präparation pipettiert. Die Ansätze wurden für insgesamt 24 h bei 30 °C auf dem Laborschüttler inkubiert. Nach 24 h wurde die Inkubation beendet. Von Ansatz 2 wurde die unlösliche Calziumseife über eine Nutsche abfiltriert und eingefroren. Die Ansätze 1, 3 und 4 wurden komplett ohne Produktabfrennung eingefroren. Alle Ansätze wurden lyophilisiert und die erhaltenen Produkte nach Sylilierung der gebildeten freien Fettsäuren gaschromatographisch analysiert. Die Umsätze der enzymatischen Hydrolysen wurden über Vergleich der Peakflächen der gebildeten freien Säuren zu den nicht umgesetzten CLA-Methylestem bestimmt. Zur Analyse wurden die drei Hauptbestandteile Öl- säure, 9cis,lltrans-CLA und 10trans,12cis-CLA herangezogen. Die Fettsäureverteilung der Produkte wurde gegen einen enzymatisch unter milden Bedingungen hydrolysierten CLA-Methylester verglichen. Die Bildung von neuen CLA-Isomeren während Reaktion und Aufreinigung lag unter 1 %. Die Ergebnisse zu Umsatz und Isomerenverteilung sind in der folgenden Tabelle aufgeführt:
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Ohne Zusatz eines basischen Metallsalzes läuft die enzymatische Hydrolyse bei einem Umsatz von etwa 50 % in ihr Gleichgewicht. Der Zusatz von nicht basischem CaCl2 führt nicht zu einer kompletten Verschiebung des Reaktionsgleichgewichtes zur freien Säure. Der Zusatz von basischem Ca(OH)2 bewirkt eine Verschiebung des Reaktionsgleichgewichtes zur vollständigen Hydrolyse durch Bildung einer Calziumseife. Über die Seifenbildung wird das Reaktionsprodukt CLA-Fettsäure kontinuierlich entfernt. Die Art der Aufarbeitung hat keinen signifikanten Einfluss auf die Verteilung der Fettsäuren im Produkt.
2. Enzymatische Synthese von Ca-CLA aus CLA-Ethylester ex Distelöl
In 4 Ansätze in verschließbaren Flaschen wurden 5 g CLA-Ethylester und 45 g Wasser eingewogen. Zu den Ansätzen 1 und 2 wurden 0,75 g Ca(OH) 2 gegeben, zum Ansatz 3 wurde 1,2 g CaCl gegeben. Zu allen Ansätzen wurden 150 μl einer technischen Lipolase- Präparation (Novozymes A/S) pipettiert. Die Ansätze wurden bei 30 °C auf einem Laborschüttler inkubiert. Nach 5 h wurden zu den Ansätzen 1 und 2 jeweils 0J5 g Ca(OH) 2 und zum Ansatz 3 0,24 g CaCl2 gegeben. Zu allen Ansätzen wurden erneut 150 μl einer technischen Lipolase-Präparation pipettiert. Die Ansätze wurden für insgesamt 24 h bei 30 °C auf dem Laborschüttler inkubiert. Nach 24 h wurde die Inkixbation beendet. Von Ansatz 2 wird die unlösliche Calziumseife über eine Nutsche abfiltriert und eingefroren. Die Ansätze 1, 3 und 4 wurden komplett ohne Produktabfrennung eingefroren. Alle Ansätze wurden lyophilisiert und die erhaltenen Produkte wurden nach Sylilierung der gebildeten freien Fettsäuren gaschromatographisch analysiert. Die Umsätze der enzymatischen Hydrolysen wurden über Vergleich der Peakflächen der gebildeten freien Säuren zu den nicht umgesetzten CLA-Methylestern bestimmt. Zur Analyse wurden die drei Hauptbestandteile Ölsäure, 9cis,lltrans-CLA und 10transJ2cis-CLA herangezogen. Die Fettsäureverteilung der Produkte wurde direkt gegen das Substrat CLA-Ethylester verglichen. Die Bildung von neuen CLA-Isomeren während Reaktion und Aufreinigung lag unter 1 %. Die Ergebnisse zu Umsatz und Isomerenverteilung sind in der folgenden Tabelle aufgeführt:
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Ohne Zusatz eines basischen Metallsalzes läuft die enzymatische Hydrolyse bei einem Umsatz von etwa 50 % in ihr Gleichgewicht. Der Zusatz von nicht basischem CaCl2 führt nicht zu einer kompletten Verschiebung des Reaktionsgleichgewichtes zur freien Säure. Der Zusatz von basischem Ca(OH)2 bewirkt eine Verschiebung des Reaktionsgleichgewichtes zur vollständigen Hydrolyse durch Bildung einer Calziumseife. Über die Seifenbildung wird das Reaktionsprodukt CLA-Fettsäure kontinuierlich entfernt. Die Art der Aufarbeitung hat keinen signifikanten Einfluss auf die Verteilung der Fettsäuren im Produkt.
3. Enzymatische Synthese von Mg-CLA aus CLA-Ethylester ex Distelöl
In 4 Ansätze in verschließbaren Flaschen wurden 5 g CLA-Ethylester und 45 g Wasser eingewogen. Zu den Ansätzen 1 und 2 wurden 0,65 g Mg(OH)2 gegeben, zum Ansatz 3 wurde 2,1 g MgCl2 x 6 H O gegeben. Zu allen Ansätzen wurden 150 μl einer technischen Lipolase-Präparation (Novozymes A/S) pipettiert. Die Ansätze wurden bei 30 °C auf einem Laborschüttler inkubiert. Nach 5 h wurden zu den Ansätzen 1 und 2 jeweils 0,13 g Mg(OH)2 und zum Ansatz 3 0,42 g MgCl gegeben. Zu allen Ansätzen wurden erneut 150 μl einer technischen Lipolase-Präparation pipettiert. Die Ansätze wurden für insgesamt 24 h bei 30 °C auf dem Laborschüttler inkubiert. Nach 24 h wurde die Inkubation beendet. Von Ansatz 2 wurde die unlösliche Magnesiumseife über eine Nutsche abfiltriert und eingefroren. Die Ansätze 1, 3 und 4 wurden komplett ohne Produktabtrennung eingefroren. Alle Ansätze wurden lyophilisiert und die erhaltenen Produkte wurden nach Sylilierung der gebildeten freien Fettsäuren gaschromatographisch analysiert. Die Umsätze der enzymatischen Hydrolysen wurden über Vergleich der Peakflächen der gebildeten freien Säuren zu den nicht umgesetzten CLA-Methylestern bestimmt. Zur Analyse wurden die drei Hauptbestandteile Ölsäure, 9cis,lltrans-CLA und 10trans,12cis-CLA herangezogen. Die Fettsäureverteilung der Produkte wurde direkt gegen das Substrat CLA-Ethylester verglichen. Die Bildung von neuen CLA-Isomeren während Reaktion und Aufreinigung lag unter 1 %. Die Ergebnisse zu Umsatz und Isomerenverteilung sind in der folgenden Tabelle aufgeführt:
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Ohne Zusatz eines basischen Metallsalzes läuft die enzymatische Hydrolyse bei einem Umsatz von etwa 50 % in ihr Gleichgewicht. Der Zusatz von nicht basischem MgCl führt nicht zu einer Verschiebung des Reaktionsgleichgewichtes zur freien Säure. Der Zusatz von basischem Mg(OH) bewirkt eine Verschiebung des Reaktionsgleichgewichtes zur vollständigen Hydrolyse durch Bildung einer Magnesiumseife. Über die Seifenbildung wird das Reaktionsprodukt CLA-Fettsäure kontinuierlich entfernt. Die Art der Aufarbeitung hat keinen signifikanten Einfluss auf die Verteilung der Fettsäuren im Produkt.
4. Enzymatische Synthese von Zn-CLA aus CLA-Methylester ex Sonnenblumenöl
In 4 Ansätze in verschliessbaren Flaschen wurden 5 g CLA-Methylester und 45 g Wasser eingewogen. Zu den Ansätzen 1 und 2 wurden 0,85 g ZnO gegeben, zum Ansatz 3 wird 1,4 g ZnCl2 gegeben. Zu Ansatz 1 wurden 300 μl Lipolase pipettiert, zu den Ansätzen 2, 3 und 4 wurden 150 μl einer technischen Lipolase-Präparation (Novozymes A/S) pipettiert. Die Ansätze wurden bei 30 °C auf einem Laborschüttler inkubiert. Nach 5 h wurden zu den Ansätzen 1 und 2 jeweils 0,17 g ZnO und zum Ansatz 3 0,28 g ZnCl2 gegeben. Zu Ansatz 1 wurden 300 μl Lipolase pipettiert, zu den Ansätzen 2, 3 und 4 wurden emeut 150 μl einer technischen Lipolase-Präparation pipettiert. Die Ansätze wurden für insgesamt 24 h bei 30 °C auf dem Laborschüttler inkubiert. Nach 24 h wurde die Inkubation beendet. Von Ansatz 2 wurde die unlösliche Zinkseife über eine Nutsche abfiltriert und eingefroren. Die Ansätze 1, 3 und 4 wurden komplett ohne Produktabtrennung eingefroren. Alle Ansätze werden lyophilisiert und die erhaltenen getrockneten Produkte wurden nach Sylilierung der gebildeten freien Fettsäuren gaschromatographisch analysiert. Die Umsätze der enzymatischen Hydrolysen wurden über Vergleich der Peakflächen der gebildeten freien Säuren zu den nicht umgesetzten CLA-Methylestern bestimmt. Zur Analyse wurden die drei Hauptbestandteile Ölsäure, 9cisJltrans-CLA und 10trans,12cis-CLA herangezogen. Die Fettsäureverteilung der Produkte wurde gegen einen enzymatisch unter milden Bedingungen hydrolysierten CLA-Methylester verglichen. Die Bildung von neuen CLA-Isomeren während Reaktion und Aufreinigung lag unter 1 %. Die Ergebnisse zu
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Ohne Zusatz eines basischen Metallsalzes läuft die enzymatische Hydrolyse bei einem Umsatz von etwa 50 % in ihr Gleichgewicht. Der Zusatz von nicht basischem ZnCl2 führt nicht zu einer Verschiebung des Reaktionsgleichgewichtes zur freien Säure. Der Zusatz von basischem ZnO bewirkt eine Verschiebung des Reaktionsgleichgewichtes zur vollständigen Hydrolyse durch Bildung einer Zinkseife. Über die Seifenbildung wird das Reaktionsprodukt CLA-Fettsäure kontinuierlich entfernt. Die Art der Aufarbeitung hat keinen signifikanten Einfluss auf die Verteilung der Fettsäuren im Produkt.
5. Enzymatische Synthese von Al-CLA aus CLA-Methylester ex Sonnenblumenöl hi 3 Ansätze in verschließbaren Flaschen wurden 5 g CLA-Methylester und 45 g Wasser eingewogen. Zum Ansatz 1 wurden 0,55 g Al(OH)3 und zum Ansatz 2 0,9 g A1C13 gegeben. Zu den Ansätzen 1 und 2 wurden 300 μl Lipolase pipettiert, zum Ansatz 3 wurden 150 μl einer technischen Lipolase-Präparation (Novozymes A/S) pipettiert. Die Ansätze wurden bei 30 °C auf einem Laborschüttler inkubiert. Nach 5 h wurden zum Ansatz 1 0,11 g Al(OH)3 und zum Ansatz 2 0,18 g A1C13 gegeben. Zu den Ansätzen 1 und 2 wurden 300 μl Lipolase pipettiert, zum Ansatz 3 werden emeut 150 μl einer technischen Lipolase-Präparation pipettiert. Die Ansätze wurden für insgesamt 24 h bei 30 °C auf dem Laborschüttler inkubiert. Nach 24 h wurde die Inkubation beendet. Die Ansätze wurden komplett ohne Produktabtrennung eingefroren. Alle Ansätze wurden lyophilisiert und die erhaltenen getrockneten Produkte wurden nach Sylilierung der gebildeten freien Fettsäuren gaschromatographisch analysiert. Die Umsätze der enzymatischen Hydrolysen wurden über Vergleich der Peakflächen der gebildeten freien Säuren zu den nicht umgesetzten CLA-Methylestern bestimmt. Zur Analyse wurden die drei Hauptbestandteile Ölsäure, 9cis,lltrans-CLA und 10trans,12cis-CLA herangezogen. Die Fettsäureverteilung der Produkte wurde gegen einen enzymatisch unter milden Bedingungen hydrolysierten CLA- Methylester verglichen. Die Bildung von neuen CLA-Isomeren während Reaktion und Aufreinigung lag unter 1 %. Die Ergebnisse zum Umsatz sind in der folgenden Tabelle aufgeführt:
Figure imgf000024_0001
Ohne Zusatz eines basischen Metallsalzes läuft die enzymatische Hydrolyse bei einem Umsatz von etwa 50 % in ihr Gleichgewicht. Der Zusatz von nicht basischem A1C13 führt zu einer Hemmung der enzymatischen Reaktion. Der Zusatz von basischem Al(OH)3 hebt diese Hemmung auf und eine Hydrolyse von > 60 % kann erreicht werden. Über die Seifenbildung wird das Reaktionsprodukt CLA-Fettsäure kontinuierlich entfernt.
6. Enzymatische Synthese von Ca-CLA und Mg-CLA aus CLA-Triglycerid
In 2 Ansätze in verschließbaren Flaschen wurden 5 g CLA-Triglycerid und 45 g Wasser eingewogen. Zum Ansatz 1 wurden 0,75 g Ca(OH)2 und zum Ansatz 2 wurden 0,65 g Mg(OH)2 gegeben. Zu allen Ansätzen wurden 300 μl einer technischen Lipolase- Präparation (Novozymes A/S) pipettiert. Die Ansätze wurden bei 30 °C auf einem Laborschüttler inkubiert. Nach 5 h wurden zum Ansatz 1 0,15 g Ca(OH)2 und zum Ansatz 2 0,13 g Mg(OH)2 gegeben. Zu allen Ansätzen wurden emeut 300 μl einer technischen Lipolase-Präparation pipettiert. Die Ansätze wurden für insgesamt 24 h bei 30 °C auf dem Laborschüttler inkubiert. Nach 24 h wurde die Inkubation beendet. Die Ansätze wurden komplett ohne Produktabtrennung eingefroren. Alle Ansätze wurden lyophilisiert und die erhaltenen Produkte wurden nach Sylilierung der gebildeten freien Fettsäuren gaschromatographisch analysiert. Die Umsätze der enzymatischen Hydrolysen wurden über Vergleich der Peakflächen der gebildeten freien Säuren zu noch vorhandenen Mono-, di- und Triglyceriden bestimmt. Die Fettsäureverteilung der Produkte wurde direkt gegen das mit Methylierungsreagenz bei Raumtemperatur umgeesterte CLA-Triglycerid verglichen. Die Bildung von neuen CLA-Isomeren während Reaktion und Aufreinigung lag unter 1 %. Die Ergebnisse zu Umsatz sind in der folgenden Tabelle aufgeführt:
Figure imgf000025_0001
Der Zusatz von basischem Ca(OH) und Mg(OH)2 bewirkt eine Verschiebung des Reaktionsgleichgewichtes zur vollständigen Hydrolyse durch Bildung einer Calzium oder Magnesiumseife. Über die Seifenbildung wird das Reaktionsprodukt CLA-Fettsäure kontinuierlich entfernt.
7. Enzymatische Synthese von Ca-CLA aus CLA-Ethylester in Lösungsmittel
In 2 Ansätze in verschließbaren Flaschen wurden 5 g CLA-Ethylester und 5 g Wasser eingewogen. Zu den Ansätzen wurden 0,75 g Ca(OH)2 gegeben. Zu Ansatz 1 wurden 40 g Hexan und zu Ansatz 2 wurden 40 g Aceton gegeben. Zu allen Ansätzen wurden 300 μl einer technischen Lipolase-Präparation (Novozymes A/S) pipettiert. Die Ansätze wurden bei 30 °C auf einem Laborschüttler inkubiert. Nach 5 h wurden zu den Ansätzen jeweils 0J5 g Ca(OH)2 und e eut 300 μl einer technischen Lipolase-Präparation pipettiert. Die Ansätze wurden für insgesamt 24 h bei 30 °C auf dem Laborschüttler inkubiert. Nach 24 h wird die Inkubation beendet. Das Lösungsmittel wurde in einem Rotationsverdampfer abgezogen und die noch feuchten Proben wurden eingefroren. Alle Ansätze wurden lyophilisiert und die erhaltenen Produkte wurden nach Sylilierung der gebildeten freien Fettsäuren gaschromatographisch analysiert. Die Umsätze der enzymatischen Hydrolysen wurden über Vergleich der Peakflächen der gebildeten freien Säuren zu den nicht umgesetzten CLA-Methylestern bestimmt. Zur Analyse wurden die drei Hauptbestandteile Ölsäure, 9cis,Htrans-CLA und 10transJ2cis-CLA herangezogen. Die Fettsäureverteilung der Produkte wurde direkt gegen das Substrat CLA-Ethylester verglichen. Die Bildung von neuen CLA-Isomeren während Reaktion und Aufreinigung lag unter 1 %. Die Ergebnisse zu Umsatz und Isomerenverteilung sind in der folgenden Tabelle aufgeführt:
Figure imgf000025_0002
Figure imgf000026_0001
Der Zusatz von basischem Ca(OH)2 bewirkt eine Verschiebung des Reaktionsgleichgewichtes zur vollständigen Hydrolyse durch Bildung einer Calziumseife. Über die Seifenbildung wird das Reaktionsprodukt CLA-Fettsäure kontinuierlich entfernt. Die enzymatische Umsetzung funktioniert sowohl im hydrophilen Lösungsmittel Aceton als auch im hydrophoben Lösungsmittel Hexan.
8. Enzymatische Synthese von Mg-CLA aus CLA-Ethylester in Lösungsmittel
In 2 Ansätze in verschließbaren Flaschen wurden 5 g CLA-Ethylester und 5 g Wasser eingewogen. Zu den Ansätzen wurden 0,65 g Mg(OH)2 gegeben. Zu Ansatz 1 wurden 40 g Hexan und zu Ansatz 2 wurden 40 g Aceton gegeben. Zu allen Ansätzen wurden 300 μl einer technischen Lipolase-Präparation (Novozymes A/S) pipettiert. Die Ansätze wurden bei 30 °C auf einem Laborschüttler inkubiert. Nach 5 h wurden zu den Ansätzen jeweils 0J3 g Mg(OH)2 und emeut 300 μl einer technischen Lipolase-Präparation pipettiert. Die Ansätze wurden für insgesamt 24 h bei 30 °C auf dem Laborschüttler inkubiert. Nach 24 h wurde die Inkubation beendet. Das Lösungsmittel wurde in einem Rotationsverdampfer abgezogen und die noch feuchten Proben wurden eingefroren. Alle Ansätze wurden lyophilisiert und die erhaltenen Produkte wurden nach Sylilierung der gebildeten freien Fettsäuren gaschromatographisch analysiert. Die Umsätze der enzymatischen Hydrolysen wurden über Vergleich der Peakflächen der gebildeten freien Säuren zu den nicht umgesetzten CLA-Methylestern bestimmt. Zur Analyse wurden die drei Hauptbestandteile Ölsäure, 9cis,Htrans-CLA und 10trans,12cis-CLA herangezogen. Die Fettsäureverteilung der Produkte wurde direkt gegen das Substrat CLA-Ethylester verglichen. Die Bildung von neuen CLA-Isomeren während Reaktion und Aufreinigung lag unter 1 %. Die Ergebnisse zu Umsatz und Isomerenverteilung sind in der folgenden Tabelle aufgeführt:
Figure imgf000026_0002
Figure imgf000027_0001
Der Zusatz von basischem Mg(OH)2 bewirkt eine Verschiebung des Reaktionsgleichgewichtes zur vollständigen Hydrolyse durch Bildung einer Magnesiumseife. Über die Seifenbildung wird das Reaktionsprodukt CLA-Fettsäure kontinuierlich entfernt. Die enzymatische Umsetzung funktioniert sowohl im hydrophilen Lösungsmittel Aceton als auch im hydrophoben Lösungsmittel Hexan.
9. Enzymatische Synthese von Zn-CLA und Al-CLA aus CLA--Methylester in Ace- ton
In 2 Ansätze in verschließbaren Flaschen wurden 5 g CLA-Methylester und 5 g Wasser eingewogen. Zu Ansatz 1 wurden 0,85 g ZnO und zu Ansatz 2 werden 0,55 g Al(OH)3 gegeben. Zu beiden Ansätzen wurden 40 g Aceton gegeben und die Reaktion wurde durch Zugabe von jeweils 300 μl einer technischen Lipolase-Präparation (Novozymes A/S) gestartet. Die Ansätze wurden bei 30 °C auf einem Laborschüttler inkubiert. Nach 5 h wurden zu Ansatz 1 0J7 g ZnO und zu Ansatz 2 0J1 g Al(OH)3 und jeweils emeut 300 μl einer technischen Lipolase-Präparation zupipettiert. Die Ansätze wurden für insgesamt 24 h bei 30 °C auf dem Laborschüttler inkubiert. Nach 24 h wurde die Inkubation beendet. Das Lösungsmittel wurde in einem Rotationsverdampfer abgezogen und die noch feuchten Proben wurden eingefroren. Alle Ansätze wurden lyophilisiert und die erhaltenen Produkte wurden nach Sylilierung der gebildeten freien Fettsäuren gaschromatographisch analysiert. Die Umsätze der enzymatischen Hydrolysen wurden über Vergleich der Peakflächen der gebildeten freien Säuren zu den nicht umgesetzten CLA-Methylestern bestimmt. Zur Analyse wurden die drei Hauptbestandteile Ölsäure, 9cis,lltrans-CLA und 10trans,12cis-CLA herangezogen. Die Fettsäureverteilung der Produkte wurde gegen einen enzymatisch unter milden Bedingungen hydrolysierten CLA-Methylester verglichen. Die Bildung von neuen CLA-Isomeren während Reaktion und Aufreinigung lag unter 1 %. Die Ergebnisse zu Umsatz und Isomerenverteilung sind in der folgenden Tabelle aufgeführt:
Figure imgf000027_0002
Figure imgf000028_0001
Der Zusatz von basischem ZnO und Al(OH)3 bewirkt eine Verschiebung des Reaktionsgleichgewichtes zur vollständigen bzw. nahezu vollständigen Hydrolyse durch Bildung einer Seife. Über die Seifenbildung wird das Reaktionsprodukt CLA-Fettsäure kontinuierlich entfernt. Die enzymatische Umsetzung funktioniert im hydrophilen Lösungsmittel Aceton.
10. Enzymatische Synthese von Ca- und Mg-Seifen aus Fischöl
In 2 Ansätze in verschließbaren Flaschen wurden 5 g Fischöl und 45 g Wasser eingewogen. Zum Ansatz 1 wurden 0,75 g Ca(OH)2 und zum Ansatz 2 wurden 0,65 g Mg(OH)2 gegeben. Zu allen Ansätzen wurden 300 μl einer technischen Lipolase-Präparation (Novozymes A/S) pipettiert. Die Ansätze wurden bei 30 °C auf einem Laborschüttler inkubiert. Nach 5 h wurden zum Ansatz 1 0,15 g Ca(OH)2 und zum Ansatz 2 0,13 g Mg(OH)2 gegeben. Zu allen Ansätzen wurden emeut 300 μl einer technischen Lipolase-Präparation pipettiert. Die Ansätze wurden für insgesamt 24 h bei 30 °C auf dem Laborschüttler inkubiert. Nach 24 h wurde die Inkubation beendet.Die Ansätze wurden komplett ohne Produktabtrennung eingefroren. Alle Ansätze wurden lyophilisiert, die gebildeten Seifen werden sauer aufgeschlossen und die freigesetzten Fettsäuren wurden mit Isooktan extrahiert. Die erhaltenen Fettsäuren wurden nach Sylilierung gaschromatographisch analysiert. Die Umsätze der enzymatischen Hydrolysen wurden über Vergleich der Peakflächen der gebildeten freien Säuren zu noch vorhandenen Mono-, Di- und Triglyceriden bestimmt.
Figure imgf000028_0002
11. Enzymatische Synthese von Ca- und Mg-Seifen aus Leinsamenöl
In 2 Ansätze in verschließbaren Flaschen werden 5 g Leinsamenöl und 45 g Wasser eingewogen. Zum Ansatz 1 werden 0,75 g Ca(OH)2 und zum Ansatz 2 werden 0,65 g Mg(OH)2 gegeben. Zu allen Ansätzen werden 300 μl einer technischen Lipolase- Präparation (Novozymes A/S) pipettiert. Die Ansätze werden bei 30 °C auf einem Laborschüttler inkubiert. Nach 5 h werden zum Ansatz 1 0,15 g Ca(OH)2 und zum Ansatz 2 0,13 g Mg(OH)2 gegeben. Zu allen Ansätzen werden emeut 300 μl einer technischen Lipolase-Präparation pipettiert. Die Ansätze werden für insgesamt 24 h bei 30 °C auf dem Laborschüttler inkubiert. Nach 24 h wird die Inkubation beendet. Die Ansätze werden komplett ohne Produktabtrennung eingefroren. Alle Ansätze werden lyophilisiert, die gebildeten Seifen werden sauer aufgeschlossen und die freigesetzten Fettsäuren werden mit Isooktan extrahiert. Die erhaltenen Fettsäuren werden nach Sylilierung gaschromatographisch analysiert. Die Umsätze der enzymatischen Hydrolysen werden über Vergleich der Peakflächen der gebildeten freien Säuren zu noch vorhandenen Mono-, Di- und Triglyceriden bestimmt.
Figure imgf000029_0001
12. Enzymatische Synthese von Ca- und Mg-Seifen aus Borretschöl
In 2 Ansätze in verschließbaren Flaschen wurden 5 g Borretschöl und 45 g Wasser eingewogen. Zum Ansatz 1 wurden 0,75 g Ca(OH)2 und zum Ansatz 2 wurden 0,65 g Mg(OH)2 gegeben. Zu allen Ansätzen wurden 300 μl einer technischen Lipolase-Präparation (Novozymes A/S) pipettiert. Die Ansätze wurden bei 30 °C auf einem Laborschüttler inkubiert. Nach 5 h wurden zum Ansatz 1 0,15 g Ca(OH)2 und zum Ansatz 2 0,13 g Mg(OH)2 gegeben. Zu allen Ansätzen wurden emeut 300 μl einer technischen Lipolase-Präparation pipettiert. Die Ansätze wurden für insgesamt 24 h bei 30 °C auf dem Laborschüttler inkubiert. Nach 24 h wurde die Inkubation beendet. Die Ansätze wurden komplett ohne Pro- duktabfrennung eingefroren. Alle Ansätze wurden lyophilisiert, die gebildeten Seifen wurden sauer aufgeschlossen und die freigesetzten Fettsäuren wurden mit Isooktan extrahiert. Die erhaltenen Fettsäuren wurden nach Sylilierung gaschromatographisch analysiert. Die Umsätze der enzymatischen Hydrolysen wurden über Vergleich der Peakflächen der gebildeten freien Säuren zu noch vorhandenen Mono-, Di- und Triglyceriden bestimmt.
Figure imgf000030_0001
13. Enzymatische Synthese von Ca- und Mg-Seifen aus Single Cell Öl
In 2 Ansätze in verschließbaren Flaschen werden 5 g Single Cell Öl aus Morteriella alpina und 45 g Wasser eingewogen. Zum Ansatz 1 werden 0,75 g Ca(OH)2 und zum Ansatz 2 werden 0,65 g Mg(OH)2 gegeben. Zu allen Ansätzen werden 300 μl einer technischen Lipolase-Präparation (Novozymes A/S) pipettiert. Die Ansätze werden bei 30 °C auf einem Laborschüttler inkubiert. Nach 5 h werden zum Ansatz 1 0J5 g Ca(OH)2 und zum Ansatz 2 0,13 g Mg(OH)2 gegeben. Zu allen Ansätzen werden emeut 300 μl einer technischen Lipolase-Präparation pipettiert. Die Ansätze werden für insgesamt 24 h bei 30 °C auf dem Laborschüttler inkubiert. Nach 24 h wird die Inkubation beendet. Die Ansätze werden komplett ohne Produktabtrennung eingefroren. Alle Ansätze werden lyophilisiert, die gebildeten Seifen werden sauer aufgeschlossen und die freigesetzten Fettsäuren werden mit Isooktan extrahiert. Die erhaltenen Fettsäuren werden nach Sylilierung gaschromatographisch analysiert. Die Umsätze der enzymatischen Hydrolysen werden über Vergleich der Peakflächen der gebildeten freien Säuren zu noch vorhandenen Mono-, Di- und Triglyceriden bestimmt.
Figure imgf000030_0002
14. Enzymatische Synthese von Ca- und Mg-Arachidonat aus Arachidonsäuremethylester
In 2 Ansätze in verschließbaren Flaschen werden 200 mg Arachidonsäuremethylester und 1,8 g Wasser eingewogen. Zum Ansatz 1 werden 30 mg Ca(OH)2 und zum Ansatz 2 werden 30 mg Mg(OH)2 gegeben. Zu allen Ansätzen werden 300 μl einer technischen Lipolase-Präparation (Novozymes A/S) pipettiert. Die Ansätze werden bei 30 °C auf einem La- borschüttler inkubiert. Nach 5 h werden zum Ansatz 1 6 mg Ca(OH)2 und zum Ansatz 2 6 mg Mg(OH)2 gegeben. Zu allen Ansätzen werden emeut 300 μl einer technischen Lipolase-Präparation pipettiert. Die Ansätze werden für insgesamt 24 h bei 30 °C auf dem Laborschüttler inkubiert. Nach 24 h wird die Inkubation beendet. Die Ansätze werden komplett ohne Produktabtrennung eingefroren. Alle Ansätze werden lyophilisiert, die gebildeten Seifen werden sauer aufgeschlossen und die freigesetzten Fettsäuren werden mit I- sooktan extrahiert. Die erhaltenen Fettsäuren werden nach Sylilierung gaschromatographisch analysiert. Die Umsätze der enzymatischen Hydrolysen werden über Vergleich der Peakflächen der gebildeten freien Säuren zu noch vorhandenem Methylester bestimmt.
Figure imgf000031_0001
15. Enzymatische Synthese von Ca- und Mg-Linolenat aus Linolensäureethylester
In 2 Ansätze in verschliessbaren Flaschen werden 200 mg Linolensäureethylester und 1,8 g Wasser eingewogen. Zum Ansatz 1 werden 30 mg Ca(OH)2 und zum Ansatz 2 werden 30 mg Mg(OH)2 gegeben. Zu allen Ansätzen werden 300 μl einer technischen Lipolase- Präparation (Novozymes A/S) pipettiert. Die Ansätze werden bei 30 °C auf einem Laborschüttler inkubiert. Nach 5 h werden zum Ansatz 1 6 mg Ca(OH)2 und zum Ansatz 2 6 mg Mg(OH)2 gegeben. Zu allen Ansätzen werden emeut 300 μl einer technischen Lipolase-Präparation pipettiert. Die Ansätze werden für insgesamt 24 h bei 30 °C auf dem Laborschüttler inkubiert. Nach 24 h wird die Inkubation beendet. Die Ansätze werden komplett ohne Produktabtrennung eingefroren. Alle Ansätze werden lyophilisiert, die gebildeten Seifen werden sauer aufgeschlossen und die freigesetzten Fettsäuren werden mit I- sooktan extrahiert. Die erhaltenen Fettsäuren werden nach Sylilierung gaschromatographisch analysiert. Die Umsätze der enzymatischen Hydrolysen werden über Vergleich der Peakflächen der gebildeten freien Säuren zu noch vorhandenem Ethylester bestimmt.
Figure imgf000031_0002
16. Enzymscreening - Identifizierung geeigneter Lipasen und Esterasen
In 16 Eppendorf-Cups werden jeweils 100 mg CLA-Methylester, 0,9 ml Wasser und 15 mg Mg(OH)2 eingewogen. Die Umsetzungen werden jeweils durch Zugabe einer Lipase bzw. Esterase, wie in der Tabelle aufgelistet, gestartet. Die Proben werden bei 30 °C auf einem Schüttler inkubiert. Nach 5 h werden jweils 3 mg Mg(OH)2 und emeut Lipase zugegeben. Die Ansätze werden für insgesamt 24 h bei 30 °C auf dem Laborschüttler inkubiert. Nach 24 h wird die Inkubation beendet. Die Ansätze werden komplett ohne Produktabtrennung eingefroren. Alle Ansätze werden lyophilisiert, die gebildeten Seifen werden sauer aufgeschlossen und die freigesetzten Fettsäuren werden mit Isooktan extrahiert. Die erhaltenen Fettsäuren werden nach Sylilierung gaschromatographisch analysiert. Die Umsätze der enzymatischen Hydrolysen werden über Vergleich der Peakflächen der gebildeten freien Säuren zu noch vorhandenen Mono-, di- und Triglyceriden bestimmt.
Figure imgf000033_0001
Fazit: Alle Lipasen haben unter den alkalischen Reaktionsbedingungen Aktivität gezeigt. Die meisten der getesteten Lipasen erreichten einen Spaltgrad von > 80 %.
B) Beispiele zur enzymatischen Herstellung und gleichzeitigen Konfektionierung
17. Enzymatische Synthese von Ca-CLA mit Dosierung von CLA-Methylester
In ein Becherglas wurden 2 Liter Wasser und 40 g Ca(OH)2 vorgelegt. Unter Rühren wurden zu der Suspension 3 ml Lipolase (Novozymes A/S) zupipettiert. Bei Raumtemperatur wurden 326 g CLA-Methylester ex Sonnenblumenöl über einen Zeitraum von 6 h kontinuierlich zudosiert, wobei die Dosierung über eine Glaskapillare direkt in die wässrige Ca(OH)2 Suspension erfolgt. Während dieser Zeit wird die Reaktionslösung kontinuierlich mit einem dreiblättrigen Flügelrührer gerührt. Nach 2 h und nach 4,5 h wurden jeweils 1 ml Lipolase nachdosiert. Die Reaktion wurde für insgesamt 24 h unter Rühren inkubiert. Anschliessend wurde die ausgefallene Calziumseife abfiltriert. Die Umsätze der enzymatischen Hydrolysen wurden über Vergleich der Peakflächen der gebildeten freien Säuren zu den nicht umgesetzten CLA-Methylestern bestimmt. Zur Analyse wurden die drei Hauptbestandteile Ölsäure, 9cis,l ltrans-CLA und 10trans,12cis-CLA herangezogen. Ergebnis:
Der Umsatz der enzymatischen Reaktion beträgt 100 %.
Die Zudosierung des CLA-Methylesters bewirkt die Bildung von gut ausgehärteten leicht filtrierbaren Ca-CLA Partikeln in einem Größenbereich von 0,2 - 2 cm. Die Reaktion war über die gesamte Reaktionsdauer rührbar. Vergleichende Untersuchungen mit kompletter
Zugabe des Methylesters am Anfang der Reaktion führten zur Bildung von sehr großen
Klumpen und zur Verblockung des Rührers.
18. Enzymatische Synthese von Ca-CLA mit Dosierung von CLA-Methylester - Einfluß von Zusätzen auf die Produktkonfektionierung
In 5 1 Bechergläser wurden 4 Ansätze bestehend aus 2 1 Wasser und 30 g Ca(OH)2 eingewogen. Alle Ansätze wurden bei einer Temperatur von 35 °C mit einem Flügelrührer gerührt. Zu allen Ansätzen wurden 2 ml Lipolase zupipettiert. Zum Ansatz 1 wurden 20 g Kartoffelstärke, zum Ansatz 2 20 g Weizenmehl, zum Ansatz 3 20 g Polyvinylalkohol und zum Ansatz 4 20 g 1,2-Propylenglykol gegeben. 200 g CLA-Methylester ex Sonnenblumenöl wurden über einen Zeitraum von 4 h kontinuierlich zudosiert, wobei die Dosierung über eine Glaskapillare direkt in die wässrige Ca(OH) Suspension erfolgte. Während dieser Zeit wurde die Reaktionslösung kontinuierlich mit einem dreiblättrigen Flügelrührer gerührt. Die Reaktion wurde für insgesamt 24 h unter Rühren inkubiert. Anschliessend wurde die ausgefallene Calziumseife abfiltriert. Die Umsätze der enzymatischen Hydrolysen wurden über Vergleich der Peakflächen der gebildeten freien Säuren zu den nicht umgesetzten CLA-Methylestern bestimmt. Zur Analyse wurden die drei Hauptbestandteile Ölsäure, 9cis,lltrans-CLA und 10trans,12cis-CLA herangezogen.
Ergebnis:
Durch Kombination aus Dosierung von CLA-Methylester und Zugabe von Stärke wird ein gut konfektioniertes Produkt mit kleiner Partikelgröße erhalten. Die Zugabe von Stärke führt unter obigen Reaktionsbedingungen zur Bildung von runden Partikeln mit einer Teilchengröße von 2 - 5 mm. Die Teilchen sind gut ausgehärtet und leicht zu filtrieren. Das getrocknete Produkt ist ein leicht rieselfähiges Material. Die Umsetzung beträgt 100 %.
Alle anderen Zusätze bewirkten keine Verbesserung in der Produktkonfektionierung, verglichen mit dem Produkt aus Beispiel 10. Die Umsetzung mit Propylenglykol erreicht 100 %, wogegen die Umsetzungen mit Mehl und Polyvinylalkohol unter identischen Reakti- onsbedingungen noch einen Rest nicht umgesetzten Methylesteranteil von >/= 10 % enthalten.
19. Enzymatische Synthese von Mg-CLA mit Dosiemng von CLA-Methylester l ein Becherglas werden 2 Liter Wasser und 10,9 g Mg(OH)2 vorgelegt. Unter Rühren werden zu der Suspension 2 ml Lipolase (Novozymes A/S) zupipettiert. Bei einer Reaktionstemperatur von 35 °C werden 100 g CLA-Methylester ex Sonnenblumenöl über einen Zeifraum von 4 h kontinuierlich zudosiert, wobei die Dosiemng über eine Glaskapillare direkt in die wässrige Mg(OH)2 Suspension erfolgt. Während dieser Zeit wird die Reakti- onslösung kontinuierlich mit einem dreiblättrigen Flügelrührer gerührt. Die Reaktion wird für insgesamt 24 h unter Rühren inkubiert. Anschliessend wird die ausgefallene Magnesiumseife abfiltriert. Die Umsätze der enzymatischen Hydrolysen werden über Vergleich der Peakflächen der gebildeten freien Säuren zu den nicht umgesetzten CLA-Methylestern bestimmt. Zur Analyse wurden die drei Hauptbestandteile Ölsäure, 9cis,Htrans-CLA und 1 Otrans, 12cis-CLA herangezogen.
Ergebnis:
Der Umsatz der enzymatischen Reaktion beträgt 91 %.
Die Zudosierung des CLA-Methylesters bewirkt die Bildung von weichen runden Mg- CLA Partikeln in einem Größenbereich von 2 - 5 mm. Die Reaktion war über die gesamte Reaktionsdauer gut rührbar. Das Produkt ist leicht filtrierbar.
Das Produkt ist weniger gut rieselfähig als Ca-Seifen entsprechender Partikelgröße. Die Zugabe von Stärke zur Reaktion führt zur Bildung eines weichen pulverförmigen Produktes.
20. Enzymatische Synthese von Ca-CLA im Pilotmaßstab - Einfluß von Rührergeschwindigkeit auf Prodüktkonfiguration
In einem 60 1 Reaktor ausgerüstet mit einem doppelstöckigen zweiflügeligen Schrägblattrührer werden 40 1 Wasser vorgelegt. Unter Rühren werden 660 g gemahlenes Ca(OH)2, 400 g Kartoffelstärke und zuletzt 80 g Lipozym TL 1001 (Novozym A/S) zugegeben. Bei einer konstanten Temperatur von 30 °C werden über einen Zeitraum von 4 h 4 kg CLA-Methylester über eine am Reaktorboden montierte Ringdüse unter Druck eingeleitet. Nach 3 h Reaktionszeit werden noch einmal 220 g festes gemahlenes Ca(OH)2 in den Reaktor gegeben. Nach Beendigung der CLA-Methylester Dosierung wird die Reaktion noch für 2 h weitergerührt und dabei mit Kaltwasser auf etwa 15 °C abgekühlt. Die gebildeten Ca-CLA Kügelchen werden über eine Nutsche abfiltriert und unter Vakuum getrocknet.
In der Pilotanlage wurden zwei Versuche nacheinander gefahren, wobei im ersten Ansatz eine Rührerdrehzahl von 100 Upm und im zweiten Ansatz eine Rührerdrehzahl von 50 Upm eingestellt wurde.
Die Umsätze der enzymatischen Hydrolysen werden über Vergleich der Peakflächen der gebildeten freien Säuren zu den nicht umgesetzten CLA-Methylestern bestimmt. Zur Analyse wurden die drei Hauptbestandteile Ölsäure, 9cis,Htrans-CLA und 10transJ2cis-CLA herangezogen. Die Fettsäureverteilung der Produkte wurde gegen einen enzymatisch unter milden Bedingungen hydrolysierten CLA-Methylester verglichen. Die Korngröße der gebildeten CLA-Seifen wurde über Siebanalyse analysiert.
Ergebnisse:
Nach Filtration und Trocknung wurden gut ausgehärtete und rieselfahige Produkte erhalten. Die Korngröße der Produkte ist kleiner bei Dosiemng des Methylesters über eine Düse als bei Eintropfen des Esters wie in Beispiel 12 beschrieben. Die Korngröße des Produktes kann über die Rührerdrehzahl eingestellt werden.
Figure imgf000037_0001
21. Enzymatische Synthese von Ca-CLA im Pilotmaßstab
In einem 60 1 Reaktor ausgerüstet mit einem doppelstöckigen zweiflügeligen Schrägblattrührer werden 40 1 Wasser vorgelegt. Unter Rühren werden 1320 g gemahlenes Ca(OH)2, 800 g Kartoffelstärke und zuletzt 160 g Lipozym TL 1001 (Novozym A/S) zugegeben. Bei einer konstanten Temperatur von 30 °C werden über einen Zeitraum von 4 h 8 kg CLA-Methylester über eine am Reaktorboden montierte Ringdüse unter Druck eingeleitet. Die Reaktion wird kontinuierlich bei einer Rührerdrehzahl von 100 Upm gerührt. Nach 3 h Reaktionszeit werden noch einmal 440 g festes gemahlenes Ca(OH)2 in den Reaktor gegeben. Nach Beendigung der CLA-Methylester Dosierung wird die Reak- tion noch für 2 h weitergerührt und dabei mit Kaltwasser auf etwa 15 °C abgekühlt. Die gebildeten Ca-CLA Kügelchen werden über eine Nutsche abfiltriert und unter Vakuum getrocknet. Die Umsätze der enzymatischen Hydrolysen werden über Vergleich der Peakflächen der gebildeten freien Säuren zu den nicht umgesetzten CLA-Methylestern bestimmt. Zur Analyse wurden die drei Hauptbestandteile Ölsäure, 9cis,l ltrans-CLA und 10trans,12cis-CLÄ herangezogen. Die Fettsäureverteilung der Produkte wurde gegen einen enzymatisch unter milden Bedingungen hydrolysierten CLA-Methylester verglichen. Die Korngröße der gebildeten CLA-Seifen wurde über Siebanalyse analysiert.
Ergebnisse: Die Dosierung der doppelten Menge CLA-Methylester im Vergleich zu Beispiel 14 führt ebenfalls zu gut ausgehärteten leicht rieselfähigen Ca-CLA Kügelchen. Die Korngrößen der Produkte sind vergleichbar.
Figure imgf000038_0001
22. Enzymatische Synthese von Ca-CLA nach Membranverfahren
Apparatur bestehend aus: Vorlagebehälter für wässrige Phase, Druckbehälter CLA- Methylester bis 2 bar, Membranmodul mit keramischer Membran (Membranmudul 100 my Einkanalmembran Typ C), Nachreaktionsbehälter, Schlauchpumpe Die wässrige Phase bestehend aus 500 ml VE- Wasser, 55 g Calciumhydroxid, 25 g Stärke und 5 ml Lipozym TL 100 L wird mittels Ulfra-Turrax gemischt und in den Vorlagebehälter gefüllt. 100 g CLA-methylester werden in den Druckbehälter gefüllt. Die Schlauchpumpe wird eingeschaltet (6,7 1/h) und der Drackbehälter mit 2 bar beaufschlagt. Nach 7 Minuten ist der Vorlagebehälter leer, das Produkt rührt im Nachreaktionsbehälter 30 min nach. Inseg- samt wurden 22 g CLA-Methylester eindosiert, hn Nachrührbehälter haben sich 2 mm lange stäbchenformige Partikel gebildet, die sich sehr leicht trocknen lassen.
Figure imgf000039_0001
23. Enzymatische Synthese von Ca-CLA nach Dispergierverfahren
Apparatur bestehend aus: IKA Process-Pilot 2000/4 Generator Mittel 4 M, mit pumpen- seitiger Dosierungseinrichtung für CLA-Methylester Dosiemng. Als weitere Alternative zur Ca-CLA Herstellung wurde das Dispergierverfahren untersucht. Dabei wurde zur Ca-CLA Partikel Herstellung als Versuchsapparatur der IKA Process- Pilot eingesetzt, fri den Vorlage Behälter wurden 200 g VE- Wasser, 10 g Stärke, 22 g Calciumhydroxid und 2 g Lipozym TL 100 1 vorgelegt und vermischt. Anschließend wurde das Gerät mit 6500 U/min in Betrieb genommen. Innerhalb 3 min wurden 100 ml CLA- Methylester dosiert. Danach wurde ca. 5 g Calciumhydroxid nachdosiert und nach 3 weiteren Minuten der Versuch beendet. Es bildeten sich Partikel-Agglomerate von bis zu 1 cm Durchmesser.
Figure imgf000039_0002
24. Untersuchung der Lipase- Aktivität in Produkt und Überstand
hi einem Eppendorf-Cup werden 100 mg CLA-Methylester, 0,9 ml Wasser und 15 mg Mg(OH)2 eingewogen. Die Umsetzung wird durch Zugabe von 10 μl Lipolase gestartet. Die Proben werden bei 30 °C auf einem Schüttler inkubiert. Nach 5 h werden jweils 3 mg Mg(OH)2 und 10 μl Lipolase zugegeben. Die Ansätze werden für insgesamt 24 h bei 30 °C auf dem Laborschüttler inkubiert. Nach 24 h wird die Inkubation beendet und der Ü- berstand wird durch Zentrifugation von der Mg-Seife getrennt. Die Seife wird einmal mit 1 ml Wasser gewaschen, eingefroren und lyophilisiert. Die Lipolaseaktivität in Überstand und Seife wird über Hydrolyse von Sonnenblumenöl bestimmt. Dazu werden in kleine Fläschchen 50 mg der lyophilisierten Seife bzw. 0,5 ml des Überstandes gegeben. Zum Lyophihsat werden 2 ml Wasser und zum Überstand werden 1,5 ml Wasser pipettiert. Anschliessend werden 2 g Sonnenblumenöl und 200 mg Laurinsäure als interner Standard zugegeben . Als Vergleichsstandard werden 10 μl Lipolase mit 1,5 ml Wasser, 0,5 ml gesättigter Mg(OH)2-Lösung , 2 g Sonnenblumenöl und 200 mg Laurinsäure gemischt. Die 3 Ansätze werden auf einem Schüttler bei 30 °C inkubiert. Nach 30 min, 3 h und 24 h werden jeweils Proben entnomen, die Ölphase wird abgewtrennt, syliliert und gaschromatographisch auf die Bildung von Partialglyceriden und Fettsäuren analysiert. Als Maß für die hydrolytische Aktivität wurde die Bildung von Diglyceriden pro Stunde aus Sonnenblumenöl gewählt. Die eingesetzten Mengen an Lyophihsat und Überstand entsprechen einer Maximalmenge von 10 μl Lipolase, die im Vergleich eingesetzt wurden.
Ergebnis: Im Lyophihsat wurde eine Lipolaseaktivität detektiert, die 100 % der Lipolaseaktivität des Standards entspricht. Im Überstand wurden 4 % der Enzymaktivität des Standards detektiert. Die Wiederfindungsrate beträgt 104 %. Etwa 96 % der eingesetzten Lipolaseaktivität befinden sich im Produkt.
Fazit: Die CLA-Seife ist als Enzymcarrier für hydrophobe Enzyme geeignet. Lipaseaktivi- tät findet sich zum größten Teil im Produkt. Vergleiche zum Standard zeigen, dass während der Produktaufarbeitung keine Deaktivierung des Enzyms stattgefunden hat.
25. Deaktivierung der Lipase- Aktivität
In fünf Eppendorf-Cup werden 100 mg CLA-Methylester, 0,9 ml Wasser und 15 mg Mg(OH)2 eingewogen. Die Umsetzung wird durch Zugabe von 10 μl Lipolase gestartet. Die Proben werden bei 30 °C auf einem Schüttler inkubiert- Nach 5 h werden jweils 3 mg Mg(OH)2 und 10 μl Lipolase zugegeben. Die Ansätze werden für insgesamt 24 h bei 30 °C auf dem Laborschüttler inkubiert. Nach 24 h wird die Inkubation beendet. Die Probe 2 wird für 10 min auf 95 °C erhitzt und die Probe 4 wird für 60 min auf 95 °C erhitzt. Anschließend werden jeweils die Überstande durch Zentrifugation von der Mg-Seife getrennt. Die Seifen werden einmal mit 1 ml Wasser gewaschen, eingefroren und lyophilisiert. Das Lyophihsat der Probe 4 wird für 10 min auf 95 °C erhitzt und das Lyophihsat der Probe 5 wird für 60 min auf 95 °C erhitzt. Die Lipolaseaktivität in den Überständen und Seifen werden über Hydrolyse von Sonnenblumenöl bestimmt. Dazu werden in kleine Fläschchen 50 mg der lyophilisierten Seifen bzw. 0,5 ml der Überst nde gegeben. Zu den Lyophilisaten werden 2 ml Wasser und zu den Überständen werden 1,5 ml Wasser pipettiert. Anschliessend werden 2 g Sonnenblumenöl und 200 mg Laurinsäure als interner Standard zugegeben . Die Ansätze werden auf einem Schüttler bei 30 °C inkubiert. Nach 30 min, 3 h und 24 h werden jeweils Proben entnomen, die Ölphase wird abgetrennt, syli- liert und gaschromatographisch auf die Bildung von Partialglyceriden und Fettsäuren analysiert. Als Maß für die hydrolytische Aktivität wurde die Bildung von Diglyceriden pro Stunde aus Sonnenblumenöl gewählt. Die eingesetzten Mengen an Lyophihsat und Überstand entsprechen einer Maximalmenge von 10 μl Lipolase.
Figure imgf000041_0001
Fazit: Eine Erhitzung der Proben vor der Trocknung führt zu einer schnellen Deaktivierung des Enzyms. Nach 10 min ist nur noch eine sehr schwache Enzymaktivität detektier- bar, nach 60 min Inkubation bei 95 °C liegt die Restaktivität auch nach 24 h Reaktionszeit unter der Nachweisgrenze, die bei etwa 0,05 - 0,1 % der Referenzaktivität liegt. Eine thermische Deaktivierung der getrockneten Proben ist deutlich langsamer. C) Vergleichende Untersuchung: Direkte chemische Umsetzung des CLA-Esters mit Ca(OH)2
26. Versuche zur chemischen Bildung einer Ca-CLA Seife aus CLA Methylester ex Sonnenblumenöl
Der CLA-Methylester wird im Rundkolben vorgelegt und Calciumhydroxid (96%>ig) eingerührt. Nach zweistündigem Rühren der Reaktionslösung bei 130 °C wird für 1.5 Stunden auf 140-150 °C erhitzt. Auch anschließendes Rühren im Wasserstrahlvakuum bei 150 °C führt nicht zur Umsetzung des Methylesters. Da bereits Temperaturen von über 130 °C die Bildung unerwünschter CLA-Isomere begünstigen, erscheint die Wahl höherer Reaktionszeiten und Temperaturen nicht sinnvoll.
D) Untersuchungen zur Bioverfügbarkeit der CLA-Seifen
27. Untersuchungen zur Bioverfügbarkeit von Ca-CLA
4 Kolben mit jeweils 50 ml Magensaftflüssigkeit (70 mM HC1) werden für 30 min bei 37 °C vorinkubiert. Zu zwei Ansätzen werden jeweils 250 mg getrocknete Ca-CLA und 75 mg Myristinsäuremethylester gegeben. Zu zwei Vergleichsansätzen werden jeweils 250 mg technisches Ca-Stearat und 75 mg Myristinsäuremethylester gegeben. Myristinsäuremethylester dient dabei als interner Standard. Jeweils eine der Ca-Stearat und Ca-CLA Proben werden für 10 min bei 37 °C auf einem Schüttler inkubiert, die anderen beiden Proben werden für 2 h bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubation wird sofort 10 g Isooktan zugegeben. Die fettlöslichen Bestandteile (hydrolytisch freigesetzte Fettsäure und Myristinsäuremethylester) werden für 60 Sekunden mit einem Ultraturrax extrahiert, die organische Phase wird separiert und sofort abgetrennt. Die organische Phase wird syliliert und gaschromatographisch analysiert. Der Hydrolysegrad wird gegen eine in 1 M HC1 bei 60 °C komplett aufgeschlossene Probe bestehend aus 250 mg Seife und 75 mg Myristinsäuremethylester bestimmt.
Figure imgf000042_0001
Fazit: Die Ca-CLA ist bereits nach 10 min fast komplett in Magensaftflüssigkeit bei 30 °C aufgelöst, so dass die freie CLA vorliegt. Die Ca-CLA ist demnach sehr gut bioverfügbar. Die Hydrolysegeschwindigkeit ist höher als die von Ca-Stearat.
28. Untersuchungen zur Bioverfügbarkeit von Mg-CLA
4 Kolben mit jeweils 50 ml Magensaftflüssigkeit (70 mM HC1) werden für 30 min bei 37 °C vorinkubiert. Zu zwei Ansätzen werden jeweils 250 mg getrocknete Mg-CLA und 75 mg Myristinsäuremethylester gegeben. Zu zwei Vergleichsansätzen werden jeweils 250 mg technisches Mg-Stearat und 75 mg Myristinsäuremethylester gegeben. Myristinsäuremethylester dient dabei als interner Standard. Jeweils eine der Mg-Stearat und Mg-CLA Proben werden für 10 min bei 37 °C auf einem Schüttler inkubiert, die anderen beiden Proben werden für 2 h bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubation wird sofort 10 g Isooktan zugegeben. Die fettlöslichen Bestandteile (hydrolytisch freigesetzte Fettsäure und Myristinsäuremethylester) werden für 60 Sekunden mit einem Ultraturrax extrahiert, die organische Phase wird separiert und sofort abgetrennt. Die organische Phase wird syliliert und gaschromatographisch analysiert. Der Hydrolysegrad wird gegen eine in 1 M HC1 bei 60 °C komplett aufgeschlossene Probe bestehend aus 250 mg Seife und 75 mg Myristinsäuremethylester bestimmt.
Figure imgf000043_0001
Fazit: Die Mg-CLA ist bereits nach 10 min komplett in Magensaftflüssigkeit bei 30 °C aufgelöst, so dass die freie CLA vorliegt. Die Mg-CLA ist demnach sehr gut bioverfügbar. Die Hydrolysegeschwindigkeit ist vergleichbar mit der von Mg-Stearat.
29. Untersuchungen zur Bioverfügbarkeit von Zn-CLA
4 Kolben mit jeweils 50 ml Magensaftflüssigkeit (70 mM HC1) werden für 30 min bei 37 °C vorinkubiert. Zu zwei Ansätzen werden jeweils 250 mg getrocknete Zn-CLA und 75 mg Myristinsäuremethylester gegeben. Zu zwei Vergleichsansätzen werden jeweils 250 mg technisches Zn-Stearat und 75 mg Myristinsäuremethylester gegeben. Myristinsäure- methylester dient dabei als interner Standard. Jeweils eine der Zn-Stearat und Zn-CLA Proben werden für 10 min bei 37 °C auf einem Schüttler inkubiert, die anderen beiden Proben werden für 2 h bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubation wird sofort 10 g Isooktan zugegeben. Die fettlöslichen Bestandteile (hydrolytisch freigesetzte Fettsäure und Myristinsäuremethylester) werden für 60 Sekunden mit einem Ultraturrax extrahiert, die organische Phase wird separiert und sofort abgetrennt. Die organische Phase wird syliliert und gaschromatographisch analysiert. Der Hydrolysegrad wird gegen eine in 1 M HC1 bei 60 °C komplett aufgeschlossene Probe bestehend aus 250 mg Seife und 75 mg Myristinsäuremethylester bestimmt.
Figure imgf000044_0001
Fazit: Die Zn-CLA ist bereits nach 10 min komplett in Magensaftflüssigkeit bei 30 °C aufgelöst, so dass die freie CLA vorliegt. Die Zn-CLA ist demnach sehr gut bioverfügbar. Die Hydrolysegeschwindigkeit ist vergleichbar mit der von Zn-Stearat.
E) Verwendung der CLA-Seifen als Trägermaterial
30. Einarbeitung von nahrungsmittelzugelassenen Antioxidantien und Konservierungsmitteln in Ca-CLA
In 7 Eppendorf-Cup werden 100 mg CLA-Methylester, 0,9 ml Wasser und 15 mg Ca(OH)2 eingewogen. Zu den Ansätzen werden jeweils 10 mg nahrungsmittelzugelassenen Antioxidantien und Konservierungsmittel wie unten aufgeführt zugegeben. Die Umsetzung wird durch Zugabe von 5 μl Lipolase gestartet. Die Proben werden bei 30 °C auf einem Schüttler inkubiert. Nach 5 h werden jweils 3 mg Ca(OH)2 und 5 μl Lipolase zugegeben. Die Ansätze werden für insgesamt 24 h bei 30 °C auf dem Laborschüttler inkubiert. Nach 24 h wird die Inkubation beendet. Dann werden die Überstande durch Zentrifugation von den Ca-Seifen getrennt. Die Seifen werden einmal mit 1 ml Wasser gewaschen, anschließend werden die Seifen und die Überstände eingefroren und lyophilisiert. Die Überstände werden direkt in Sylilierungsmittel aufgenommen und gaschromatographisch untersucht. Die getrockneten Seifen werden sauer aufgeschlossen, syliliert und anschliessend gaschromatographisch untersucht. Als Standards werden die sylilierten Zusätze parallel analysiert.
Figure imgf000045_0001
Fazit: Die hydrophoben Zusätze finden sich komplett oder zum größten Teil in der Seife wieder. Somit können diese Zusätze alle direkt während der Synthese in das Produkt einformuliert werden. Die Wiederfindungsrate von Vitamin C und Ascorbylpalmitat ist gering, da das meiste Produkt ungelöst als Ca-Seife zurückbleibt und nicht mit der Analysenmethode erfasst wird. Daher ist der Anteil an Vitamin C höher als der gaschromatographisch ermittelte Wert. 31. Einarbeitung von Vitaminen und Vitaminderivaten in Ca-CLA
In 11 Eppendorf-Cups werden 100 mg CLA-Methylester, 0,9 ml Wasser und 15 mg Ca(OH)2 eingewogen. Zu den Ansätzen werden jeweils 10 mg Vitamine oder Vitaminderivate wie unten aufgeführt zugegeben. Die Umsetzung wird durch Zugabe von 5 μl Lipolase gestartet. Die Proben werden bei 30 °C auf einem Schüttler inkubiert. Nach 5 h werden jweils 3 mg Ca(OH)2und 5 μl Lipolase zugegeben. Die Ansätze werden für insgesamt 24 h bei 30 °C auf dem Laborschüttler inkubiert. Nach 24 h wird die Inkubation beendet. Dann werden die Überstande durch Zentrifugation von den Ca-Seifen getrennt. Die Seifen werden einmal mit 1 ml Wasser gewaschen, anschliessend werden die Seifen und die Ü- berstände eingefroren und lyophilisiert. Die Überstände werden direkt in Sylilierungsmit- tel aufgenommen und gaschromatographisch untersucht. Die gefrockneten Seifen werden sauer aufgeschlossen, syliliert und anschliessend gaschromatographisch untersucht. Als Standards werden die sylilierten Zusätze parallel analysiert. Die Substanzen Riboflavin, Retinylpropionat und Thiamin werden photospekfrometrisch analysiert. Dazu werden die Seifen sowie die Überstände in DMSO aufgenommen. Die Adsorptionen der Substanzen werden jeweils an ihrem Adso tionsmaximum gegeneinander verglichen.
Figure imgf000046_0001
Fazit: Die fettlöslichen Vitamine werden komplett oder nahezu komplett in die Ca-CLA eingebaut. Die wasserlöslichen Vitamine finden sich dagegen zum größten Teil im Überstand, mit Ausnahme von Vitamin C und Ascorbylpalmitat, die unlösliche Calciumseifen bilden. Die Wiederfindungsrate von Vitamin C und Ascorbylpalmitat ist gering, da das meiste Produkt ungelöst als Ca-Seife zurückbleibt und nicht mit der Analysenmethode erfasst wird. Daher ist der Anteil an Vitamin C höher als der gaschromatographisch ermittelte Wert. Zur Formulierung in Seifen eignen sich daher die Vitamine und Vitaminderivate der Klassen A, C, D, E und K.
32. Einarbeitung von weiteren Zusätzen in Ca-CLA
In 5 Eppendorf-Cups werden 100 mg CLA-Methylester, 0,9 ml Wasser und 15 mg Ca(OH)2 eingewogen. Zu den Ansätzen werden jeweils 10 mg Zusätze wie unten aufgeführt zugegeben. Die Umsetzung wird durch Zugabe von 5 μl Lipolase gestartet. Die Proben werden bei 30 °C auf einem Schüttler inkubiert. Nach 5 h werden jeweils 3 mg Ca(OH)2 und 5 μl Lipolase zugegeben. Die Ansätze werden für insgesamt 24 h bei 30 °C auf dem Laborschüttler inkubiert. Nach 24 h wird die Inkubation beendet. Dann werden die Überstande durch Zentrifugation von den Ca-Seifen getrennt. Die Seifen werden einmal mit 1 ml Wasser gewaschen, anschliessend werden die Seifen und die Überstände eingefroren und lyophilisiert. Die Überstände werden direkt in Sylilierungsmittel aufgenommen und gaschromatographisch untersucht. Die getrockneten Seifen werden sauer aufgeschlossen, syliliert und anschliessend gaschromatographisch mitersucht. Als Standards werden die sylilierten Zusätze parallel analysiert. Die Substantzen Carotin und Astaxanthin werden photospektrometrisch analysiert. Dazu werden die Seifen sowie die Überstände in DMSO aufgenommen. Die Adsorptionen der Substanzen werden jeweils an ihrem Adsorptionsmaximum gegeneinander verglichen.
Figure imgf000047_0001
Fazit: Alle getesteten Zusätze finden sich komplett oder nahezu komplett in den Seifen wieder. Demnach eignen sich Metallseifen von Fettsäuren als Träger für Carotenoide, Sterole, Sterine, Flavonverbindungen und Fettsäurederivate. 33. Einarbeitung von Enzymen in Ca-CLA
In ein Eppendorf-Cup • werden 100 mg CLA-Methylester, 0,9 ml Wasser und 15 mg Ca(OH)2 eingewogen. Zu dem Ansatz werden 5 mg einer technischen Cellulase Lösung zugegeben. Die Umsetzung wird durch Zugabe von 5 μl Lipolase gestartet. Die Probe wird bei 30 °C auf einem Schüttler inkubiert. Nach 5 h werden emeut 3 mg Ca(OH)2 und 5 μl Lipolase zugegeben. Der Ansatz wird für insgesamt 24 h bei 30 °C auf dem Laborschüttler inkubiert. Nach 24 h wird die Inkubation beendet. Dann wird der Überstand durch Zentrifugation von der Ca-Seife getrennt. Die Seife wird einmal mit 1 ml Wasser gewaschen, anschliessend wird die Seife und der Überstand eingefroren und lyophilisiert. 200 μl Überstand und 20 mg Seife werden in 1 ml Citratpuffer, pH 5,0 aufgenommen und photometrisch auf Enzymaktivität analysiert.
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Fazit: Cellulaseaktivität wurde zum größten Teil in der Seife detektiert, was auch schon für die Lipaseaktivität (Beispiel 24) gezeigt wurde. Dass bedeutet, dass die granulierte Calcium-CLA als Trägermaterial für Enzyme gut geeignet ist.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung von Metallseifen dadurch gekennzeichnet, dass Alkylester von mehrfach ungesättigten Carbonsäuren in Anwesenheit eines basischen Metallsalzes mit einer Hydrolase enzymatisch umgesetzt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den zu verseifenden Carbonsäuren um mehrfach ungesättigte Fettsäuren mit einer Kettenlänge von 16 bis 24 C-Atomen handelt oder um Mischungen aus Fettsäuren handelt, die einen Anteil von > 10 % einer der mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit einer Kettenlänge von 16 bis 24 C-Atomen enthalten.
3. Verfahren nach Ansprach 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Carbonsäuren um Säuren handelt, ausgewählt aus der Gruppe, die gebildet wird von Arachidonsäure, Docosahexanoic acid (DHA), Eicosapentanoic acid (EPA), alpha- und gamma Linolensäure, konjugierte Linolsäuren (CLA) sowie deren Gemische.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den konjugierten Linolsäuren um cis9,trans 11 -Linolsäure und/oder transl0,cisl2- Linolsäure handelt oder um Gemische konjugierter Linolsäuren, die einen Anteil von mindestens 25 % der cis9,trans 11 -Linolsäure und der frans 10,cisl2-Linolsäure enthalten.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Alkylestern der Carbonsäuren um Alkylester mit einem Alkyhest einer Kettenlänge von 1 bis 4 C-Atomen handelt.
6. Verfahren nach Ansprach 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Estem der Carbonsäuren um Methyl- oder Ethylester handelt.
7. Verfahren nach Ansprach 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Estem der Carbonsäuren um Glyceride handelt.
8. Verfahren nach Ansprach 7, dadurch gekennzeichnet, dass natürlich vorkommende Triglyceride eingesetzt werden, insbesondere Borretschöl, Leinsamenöl, Nachtkerzen- öl, Walnussöl, Shrimp- und Fischöl, Single Cell Öl insbesondere aus Pilzen und Mikroalgen.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den basischen Metallsalzen um Salze von Calzium, Magnesium, Zink oder Aluminium handelt, insbesondere um die Hydroxide und/oder Oxide.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Metallseifen direkt während der enzymatischen Umsetzung zu einem Granulat konfektioniert werden, wobei die Partikel oder Granulate eine mittlere Teilchengröße von 0,05 mm bis 3 cm aufweisen.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die enzymatische Umsetzung mit integrierter Konfektionierung der Metallseife in einem wässrigen Medium oder in einem organischen Medium welches einen Wasseranteil von 5 - 50 % enthält durchgeführt wird bei einer Temperatur zwischen 15 und 60 °C.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Anteil der wässrigen und/oder organischen Phase zwischen 50 und 90 Gewichts % beträgt.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Carbonsäureester während der enzymatischen Umsetzung zudosiert wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Carbonsäureester dem Reaktionsmedium, enthaltend Wasser und/oder Lösungsmittel, Hydrolase und Metallsalz, über ein Düsenverfahren zudosiert wird.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Carbonsäureester mit dem Reaktionsmedium, welches Wasser und/oder Lösungsmittel und Metallsalz enthält, über Membranverfahren oder Dispergierverfahren emulgiert wird, wobei die Hydrolase durch Rühren untergemischt wird
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung unter kontinuierlichem Rühren in einem Batch-Reaktor erfolgt.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung in einem Rohr- oder Säulenreaktor erfolgt.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass durch Zugabe einer Kristallisierhilfe die Produktkonfektionierung während der Umsetzung verbessert wird.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Kristallisierhilfe um Stärke und/oder Cellulose handelt.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Hydrolasen um Lipasen, Esterasen oder Phospholipasen handelt, die bei einer Temperatur zwischen 15 und 60 °C aktiv sind.
21. Verfahren nach Ansprach 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Hydrolasen eine lipolytische Aktivität unter basischen Bedingungen aufweisen.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Hydrolasen aus Organismen stammen, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die gebildet wird von Thermomyces, Candida antarctica A, Candida antarctica B, Rhizomucor miehei, Candida cylindracea, Rhizopus javanicus, Porcine pancreas, Aspergillus ni- ger, Candida rugosa, Mucor javanicus, Pseudomonas fluorescens, Rhizopus oryzae, Pseudomonas sp., Chromobacterium viscosum, Fusarium oxysporum und Penicilium camenberti.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass bevorzugt alkaline Lipase / Esterase isoliert aus dem Organismus Thermomyces eingesetzt wird.
24. Verwendung von Metallseifen mehrfach ungesättigter Carbonsäuren hergestellt nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 23 als Nahrungserganzungsmittel und/oder als Futtermitteladditiv und/oder als pharmazeutisches Fettsäurederivat.
25. Verwendung von Metallseifen mehrfach ungesättigter Carbonsäuren nach Ansprach 23 als Futtermitteladditiv insbesondere zur Anwendung bei Wiederkäuern.
26. Zubereitungen enthaltend Metallseifen mehrfach ungesättigter Carbonsäuren in Form von Granulat hergestellt nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 23 als Träger- oder Kapselmaterial und eine oder mehrere zusätzliche Komponenten die ausgewählt sind aus der Gmppe, die gebildet wird von Enzymen, Vitaminen, Antioxidantien, Konservierungsmitteln, Farbstoffen, Carotinoiden, Sterolen, Flavon- und Isofla- vonverbindungen und Fettsäurederivaten.
27. Zubereitungen nach Ansprach 26, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Enzymen um Enzyme handelt, ausgewählt aus der Gruppe, die gebildet wird von Protea- sen, Glykosidasen, Lipasen, Esterasen, Amidasen und Phytasen.
28. Zubereitungen nach Ansprach 26, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Vitaminen um Vitamine ausgewählt aus der Gruppe die gebildet wird von fettlöslichen Vitaminen der Klassen A, D, E und K sowie deren Derivate und/oder um wasserlösliches Vitamin C sowie dessen Derivate handelt.
29. Zubereitungen nach Ansprach 26, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Antioxidantien um die lebensmittelzugelassenen Stoffe ausgewählt aus der Gruppe die gebildet wird von Ascorbinsäure E300, Calciumascorbat E302, Natriumascorbat E301, Ascorbylpalmitat E304, Vitamin E (Mischung von Tocopherolen E306 — E309), Pro- pylgallat E310, Octylgallat E311, Dodecylgallat E312, Isoascorbinsäure E315, Natri- umisoascorbat E316, Butyl-4-hydroxyanisol E320 und Butylhydroxytyrosol E321 handelt.
30. Zubereitungen nach Ansprach 26, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Konservierungsmitteln um die lebensmittelzugelassenen Stoffe ausgewählt aus der Gruppe die gebildet wird von E200 - E203 (Sorbinsäure, Natriumsorbat, Kaliumsorbat, Calciumsorbat), E210 - E219 (Benzoesäure, Natriumbenzoat, Kaliumbenoat, Calciumbenzoat E214 - E219: Parahydroxybenzoeester), E236 - E238 (Ameisensäure, Natriumformiat, Calciumformiat), E260 - E263 (Essigsäure, Kaliumacetat, Natriumacetat, Calciumacetat), E270 (Milchsäure) und E280 - E283 (Propionsäure, Natriumpropionat, Calciumpropionat, Kaliumpropionat) handelt.
31. Zubereitungen nach Ansprach 26, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Carotenoiden insbesondere um Carotinoide ausgewählt aus der Gruppe die gebildet wird von Carotin, Lycopen, Lutein, Astaxanthin, Zeaxanthin und Canthaxantin handelt.
32. Zubereitungen nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Stefo- len insbesondere um Sterole handelt, die aus pflanzlichen Quellen isoliert werden wie Sitosterol, Campesterol oder Stigmasterol.
33. Zubereitungen nach Ansprach 26, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Fettsäurederivaten insbesondere um Liponsäure und dessen Derivate handelt.
34. Verfahren zur Herstellung von Zubereitungen nach einem der Ansprüche 26 bis 33, dadurch gekennzeichnet, dass eine oder mehrere der zusätzlichen Komponenten direkt während der enzymatischen Umsetzung in das Granulat aus Metallseifen mehrfach ungesättigter Carbonsäuren eingearbeitet werden.
35. Verfahren nach Ansprach 34, dadurch gekennzeichnet dass die zusätzlichen Komponenten fettlösliche Substanzen sind und/oder Substanzen, die in Anwesenheit eines basischen Metallsalzes eine wasserunlösliche Seife bilden und/oder Substanzen, die von einer Metallseife gebunden werden.
36. Verfahren nach den Ansprüchen 34 und 35, dadurch gekennzeichnet, dass die fettlöslichen Substanzen vor der Umsetzung im Carbonsäureester gelöst oder suspendiert und gleichmäßig verteilt werden und dass die wasserlöslichen Substanzen vor der Umsetzung im Medium enthaltend Wasser und Metallsalz gelöst oder suspendiert und gleichmäßig verteilt werden.
37. Verwendung der Zubereitungen, gemäß Ansprüche 26 bis 33 als Nahrungserganzungsmittel und/oder als Futtermitteladditiv und/oder als pharmazeutisches Fettsäurederivat.
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