WO2005116201A1 - TYROSINKINASE TNK ALS INHIBITOR FÜR DEN NUKLEÄREN TRANSKRIPTIONSFAKTOR KAPPA B (NFκB) - Google Patents

TYROSINKINASE TNK ALS INHIBITOR FÜR DEN NUKLEÄREN TRANSKRIPTIONSFAKTOR KAPPA B (NFκB) Download PDF

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Thomas Seufferlein
Guido Adler
Andreas Brey
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Universitaet Ulm
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Universitaet Ulm
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases

Definitions

  • the invention relates to an inhibitor for the nuclear transcription factor kappa B (NFKB).
  • NFKB nuclear transcription factor kappa B - NFKB for short - promotes tumor growth and metastasis, plays a role in the pathogenesis of inflammatory bowel diseases, ischemic diseases, cachexia, as well as in autoimmune diseases and in regulating the expression of the HIV-1 gene.
  • NFKB is a heterodimer consisting of the protein subunits p50 and p65.
  • I-AB inhibitory protein complex
  • I-AB is degraded after phosphorylation by IKB kinase complexes (IKK) using the 26-S proteasome and NFKB is released.
  • NFKB then enters the cell nucleus, where it binds to the DNA and activates transcription.
  • genes are predominantly expressed which code for the formation of pro-inflammatory cytokines (TNF- ⁇ , interleukins), inducible nitrogen monoxide synthase (iNOS), adhesion molecules and for proteins with an anti-apoptotic effect (so-called anti-apoptotic mediators).
  • Anti-apoptotic mediators play a role in the development of apoptosis resistance and the associated development of certain tumors.
  • the present invention is therefore based on the object of providing a new NFKB inhibitor which specifically and effectively inhibits NFKB activation and / or NF ⁇ B activity.
  • TNK1 substance tyrosine kinase TNK1 for use as an inhibitor of the transactivation of NFKB in eukaryotic cells.
  • TNK1 is a tyrosine kinase that was originally isolated from fetal CD34 + Lin / CD38-B cell precursors (Hoehn et al. 1996). TNK1 is predominantly expressed in embryonic tissues as part of organogenesis / differentiation, as well as in some tumor cells and fetal blood (Hoehn et al., 1996, Brey,
  • TNK1 has a molecular weight of 72 kDa and is grouped into the ACK family of tyrosine kinases.
  • the kinase has the typical arrangement of subdomains for this family, in which the
  • Kinase domain is located at the N-terminus.
  • there are two putative protein interaction domains at the C-terminal src homology domain 3 and proline rieh stretch domes, sequence see Appendix 2).
  • the activation / autophosphorylation of TNK1 occurs as soon as they are expressed.
  • the SH3 domain of PLCgammal has so far been established as an interaction partner of TNK1 (Felschow et al., 2000).
  • the invention is based on the surprising finding that the transcription factor NFKB can be inhibited in its action by this tyrosine kinase TNK1.
  • TNK1 tyrosine kinase
  • An in vitro model could be established which essentially consists of human embryonic kidney cells HEK293 in which TNK1 is inducibly expressed by tetracycline , (Since TNK1 is normally hardly expressed in HEK293 cells, this induced expression of TNK1 corresponds almost to a de novo expression).
  • TNK1 When TNK1 is expressed, the cells show a slower cell growth and a decrease in the number of cells.
  • TNKl inhibits by phosphorylation of tyrosine residues of the p65 subunit of the NF ⁇ B dimer
  • TNK1 does not inhibit the binding of NFKB to the DNA.
  • a high specificity of effects of TNKl was also found, namely a selective effect on NFKB, while other transcription factors are not affected by TNKl.
  • TNKl as an inhibitor of the transcription factor NFKB according to the invention opens up a completely new principle for the therapy of diseases which are associated with increased NF ⁇ B activation, i.e. that are associated with an increased NFKB activation and / or are decisively influenced by this increased NFkB activation.
  • diseases which are associated with increased NF ⁇ B activation, i.e. that are associated with an increased NFKB activation and / or are decisively influenced by this increased NFkB activation.
  • diseases which are associated with increased NF ⁇ B activation i.e. that are associated with an increased NFKB activation and / or are decisively influenced by this increased NFkB activation.
  • diseases which are associated with increased NF ⁇ B activation i.e. that are associated with an increased NFKB activation and / or are decisively influenced by this increased NFkB activation.
  • diseases which are associated with increased NF ⁇ B activation, i.e. that are associated with an increased NFKB activ
  • TNK1 as an inhibitor of the transcription factor NFKB according to the invention is therefore also suitable for enhancing the effect of chemotherapy or radiation therapy, which leads to a counterregulatory upregulation of NFKB in the tumor tissue.
  • TNKl as an inhibitor of the transcription factor NFKB is also suitable for facilitating cellular apoptosis. This means that cell-specific programs that naturally trigger apoptosis, but in specific cases are blocked in their effects by a high level of NFKB activation (which is always caused by this), can be run as planned again by TNKI-induced inhibition of NFKB activation.
  • the inhibition of NFKB by expression of TNKl is sufficient to mRNA expression of NF ⁇ B-regulated anti-apoptotic target genes such as e.g. Inhibit XIAP.
  • a preferred embodiment of the use according to the invention is characterized in that the TNK 1 is introduced into the cells expressing NFkB by means of gene transfer.
  • This gene transfer is preferably inducible and / or constitutive, more preferably either transient or permanent and further preferably either viral or non-viral.
  • Fig. 1 Domain structure of TNK1: an N-terminal kinase domain, followed by an SH3 domain and a C-terminal proline-rich domain.
  • Fig. 2 Cell growth of HEK293 cells in the presence / absence of TNKl and with stimulation with TNF ⁇ in the presence / absence of TNKl. Cells that express TNK1 are no longer detectable on day 7 if they were additionally incubated with TNF ⁇ .
  • A Concentration of the enzyme effector caspase 3 involved in the apoptosis process after 6 and 12 hours [h] incubation with TNF ⁇ in cells with increased TNK 1 expression as a result of incubation with tetracycline (traces "TNK”) and in cells without (significantly detectable ) TNK 1 expression as a result of incubation without tetracycline (lanes "-")
  • PARP poly ADP-ribose polymerase
  • Track “TNK1” cells that express TNK1 without TNF ⁇ stimulation.
  • Track “TNF ⁇ ” cells that were only stimulated with 400U / ml TNF ⁇ .
  • Track “TNKl / TNF ⁇ ” cells that express TNK1 and with 400U / ml TNF ⁇ were stimulated C: concentration of the free nucleosomes (DNA-histone complexes) in the cytosol due to the degradation of the genomic DNA.
  • Lane “TNKl- / TNF ⁇ -” cells that neither express TNKl nor were treated with TNF ⁇ .
  • Lane “TNK1 + / TNF ⁇ -” cells that express TNKl without TNF ⁇ stimulation.
  • Fig. 4 Luciferase activity or NF ⁇ B activity of HEK293 cells, which are transfected with the plasmid pcDNA4-TO-TKNl, of HEK293 cells, which are transfected with the kinase-deficient plasmid mutant K148R-TNKl-pcDNA3 , and HEK293 cells transfected with a GAL-p65 fusion plasmid with an integrated GAL4 luciferase reporter system.
  • HEK293 cells were treated with 0.1 ⁇ g / ml of a 6x HIV-NF- ⁇ B reporter construct, 50 ng / ml of a Renilla plasmid and 1 ⁇ g / ml wild-type or K148R-TNK1 pcDNA3 plasmids (under the control of the CMV promoter) for 24 h using FuGene, Röche, according to the manufacturer's instructions. 4 hours before cell lysis, the cells were incubated with 400 U / ml TNF ⁇ . The dual luciferase assay kit (Promega) was used to measure the NF- ⁇ B activity.
  • HEK293 cells were treated with 0.1 ⁇ g / ml of an NF- ⁇ B2 reporter construct, 50 ng / ml of a Renilla plasmid and 1 ⁇ g / ml wild-type or K148R-TNK1 pcDNA3 plasmid (under the control of the CMV promoter) for 24 h using FuGene, Röche, transfected according to the manufacturer's instructions. 4 hours before cell lysis, the cells were incubated with 400 U / ml TNF ⁇ . The dual luciferase assay kit (Promega) was used to measure the NF- ⁇ B activity.
  • HEK293 cells were treated with 0.1 ⁇ g / ml of a pFR-Luc reporter construct, 50 ng / ml of a Renilla plasmid, 1 ⁇ g / ml wild-type or K148R-TNK1 pcDNA3 plasmid (under the control of the CMV promoter) and 0.1 ⁇ g / ml a Galp65 construct for 24 h using FuGene, Röche, transfected according to the manufacturer's instructions.
  • the dual luciferase assay kit (Promega) was used to measure the activity of the Gal promoter.
  • Example 1 Detection of tyroxine kinase TNKl as an inhibitor of the activity of the transcription factor NFKB in the cell culture model
  • the cell model consists of human embryonic kidney cells HEK293, which are stably transfected with a tetracycline repressor pcDNA6-TR plasmid.
  • a transfection of these cells with the "gene of interest" - in the present case: flag-tagged TNK1 - in a pcDNA4-TO plasmid allows the expression of this gene after addition of tetracycline, since the repressor encoded by the ⁇ cDNA6-TR plasmid
  • the integrity of both plasmids up to chromosomal recombination is ensured by adding selective antibiotics according to the manufacturer's instructions.
  • HEK293 cells stably transfected with the repressor are commercially available from Invitrogen (T-Rex HEK293 system. Cat. No: R710-07),
  • the TNK1 protein isolated from a human embryonic kidney cell line and cloned into the pcDNA4-TO plasmid (see FIG. 1) with the amino acid sequence shown in the sequence listing SEQ ID NO: 1 was introduced into the HEK293 cells.
  • these HEK293 cells were transfected with a pcDNA4-TO plasmid which comprises the c-DNA shown in the sequence listing SEQ ID NO, 2 and which codes for the TNK1 protein with the amino acid sequence shown in the sequence listing SEQ ID NO: 1.
  • the HEK293 cells were preferably transfected with the lipid-based transfection reagent FuGene (Röche) according to the manufacturer's instructions with 1 ⁇ g / ml pcDNA4-TO-TNKl.
  • TNK1 expression is induced by adding tetracycline to the culture medium (final concentration: 1 ⁇ g / ml). Since TNKl is normally hardly expressed in HEK293 cells, this induced significantly strong expression of TNKl almost corresponds to a de novo expression.
  • the successfully induced expression of TNKl is via the detection of the N-terminal flag tag (Flag-TNKl) by means of a commercially available anti Flag antibody (Sigma) detectable, the significantly strongly expressing TNK1 cells show a slower cell growth and a decrease in the cell number (see FIG. 2).
  • TNK1-expressing cells When these (tetracycline-induced and consequently) TNK1-expressing cells are incubated with the cytokine TNF ⁇ at the same time, cell death / apoptosis (programmed cell death) is significantly increased, whereas when incubating non-induced cells there is no (significant) TNK 1 expression TNF ⁇ no cell death (programmed cell death) / no apoptosis is detectable (see Fig. 2).
  • the induction of apoptosis was identified as the cause of cell death after incubation and thus stimulation with TNF ⁇ , namely (A) on the basis of the increase in the concentration or the activity of the enzyme effector caspase 3 involved in the apoptosis process, (B) on the extent of the cleavage of the DNA repair enzyme PARP (poly ADP-ribose polymerase) by the effector caspase 3, which the 116 kDa large protein splits into two fragments of 89 kDa and 24 kDa and thereby inactivated and (C) based on the degradation or fragmentation of genomic DNA or the resulting increase in free nucleosomes in the cytosol.
  • A on the basis of the increase in the concentration or the activity of the enzyme effector caspase 3 involved in the apoptosis process
  • B on the extent of the cleavage of the DNA repair enzyme PARP (poly ADP-ribose polymerase) by the effector caspase 3, which the
  • the apoptosis process is controlled by hierarchically arranged factors which, through the activation of specific nucleases and proteases, including the effector caspase 3, cause the cells to degrade.
  • the increase in the concentration of active and thus cleaved caspase 3 in the cells was detected by means of the SDS-polyacrylamide gel electrophoresis method known and known to the person skilled in the art. From the results shown in FIG. 3A, it can be seen that the concentration / activity of the effector caspase 3 in the tetracycline-induced and thus TNK1-expressing cells was significantly higher after 6 - 8 hours than in the control cells without tetracycline induction.
  • the cleavage of the PARP was detected on the basis of the cleavage products, namely the 89 kDa fragment of the antibody known and familiar to the person skilled in the art using PARP-specific antibodies (commercially available) (FIG. 3B). From FIG. 3B it can be seen that in the cells in which an increase in the effector caspase 3 concentration / activity can be observed, a cleavage of the DNA repair enzyme PARP into its subunits also occurs.
  • the fragmentation of the genomic DNA in free nucleosomes was detected by means of the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method known to the person skilled in the art and using specific antibodies against DNA / histone complexes (FIG. 3C).
  • 3 C shows how the concentration of the free nucleosomes (DNA-histone complexes) in the cytosol in those cells that express TNK1 without TNF ⁇ stimulation (trace "TNK1 + / TNF ⁇ -”) is approximately twice as large as cells that neither express TNKl nor were treated with TNF ⁇ (trace "TNKl- / TNF ⁇ -").
  • the concentration of free nucleosomes (DNA-histone complexes) in the cytosol is about 8 times as large as in those cells neither express TNKl nor were treated with TNF ⁇ (trace "TNKl- / TNF ⁇ -”), and in those cells that TNKl were expressed and stimulated with 400U / ml TNF ⁇ (trace "TNK1 + / TNF ⁇ +”) about 15 times as large.
  • the apoptosis in cells that express TNK1 i.e. are transfected with the plasmid pcDNA4-TO and are / were incubated in the presence of tetracycline
  • TNK1 i.e. are transfected with the plasmid pcDNA4-TO and are / were incubated in the presence of tetracycline
  • the control cells without (increased) induction of TNK 1 expression i.e. Cells which are transfected with the plasmid pcDNA4-TO, but are / were incubated in the presence of tetracycline.
  • TNKl alone does not induce cellular apoptosis per se but is a modulator of the TNFa-dependent pro- and anti-apoptotic signaling pathways, it follows from the findings presented that TNF ⁇ induces apoptosis by TNK1-mediated NF ⁇ B blocking.
  • a GAL-p65 fusion plasmid with an integrated GAL4 luciferase reporter system was constructed as a control (II), transiently transfected in HEK293 cells and examined.
  • the commercially available dual luciferase assay kit (Promega) was preferably used for this.
  • promoter activation bypassing the NFKB-specific co-factors by interacting with a GAL4 DNA binding domain fused to the p65 subunit of NFKB with a GAL4 binding element on the reporter.
  • the NFKB transcription complex is bypassed in this system, since the protein / DNA interaction takes place via the GAL4 / Gal promoter system.
  • FIG. 4 A shows the luciferase activity and thus the motor activity of those HEK293 cells which were treated with 0.1 ⁇ g / ml of a 6x HTV-NF- ⁇ B reporter-promoter construct, 50 ng / ml of a Renilla plasmid and 1 ⁇ g / ml wild-type or K148R-TNK1 pcDNA3 plasmids (under the control of the CMV promoter) were transfected and incubated with 400 U / ml TNF ⁇ 4 h before cell lysis.
  • FIG. 4 B shows the luciferase activity and thus the motor activity of those HEK293 cells which contain 0.1 ⁇ g / ml of an NF- ⁇ B2 reporter-promoter construct, 50 ng / ml of a Renilla plasmid and 1 ⁇ g ml wild-type or K148R-TNK1 ⁇ cDNA3 plasmids (under the control of the CMV promoter) were transfected and incubated 4 h before cell lysis with 400 U / ml TNF ⁇ .
  • FIG. 4C shows the luciferase activity and thus the motor activity of those HEK293 cells which were treated with 0.1 ⁇ g / ml of a pFR-Luc reporter construct, 50 ng / ml of a Renilla plasmid, 1 ⁇ g / ml wild-type or K148R-TNK1 ⁇ cDNA3 Plasmids (under the control of the CMV promoter) and 0.1 ⁇ g / ml of a Galp65 construct were transfected.
  • FIGS. 4A and 4B it can be seen from FIGS. 4A and 4B that, as a result of the increased TNK1 expression, the TNF ⁇ -dependent, NF ⁇ B-mediated transactivation of the artificial (6x HIV reporter; FIG. A) and the endogenous promoter (NF ⁇ B2 promoter; FIG B) is deregulated (negatively regulated, inhibited) or the transcriptional activity of NFKB is repressed, ie inhibited or completely suppressed.
  • the lipid-based transfection of TNK1 in HEK293 cells leads to a significant inhibition of the luciferase activity of both an artificial (6x HIVV promoter; FIG.
  • NF ⁇ B2 promoter NF ⁇ B2 promoter
  • Fig. 4 B a natural NFKB promoter reporter system
  • the kinase-deficient mutant K148R has a significantly lower or undetectable negative regulatory effect. This indicates a functional importance of the kinase activity of TNKl for the negative regulation of the TNF ⁇ -induced NF- ⁇ B activity.
  • NFKB signaling pathway is thus inhibited directly by modulating the transcriptional / transactivating properties and not by modulating activatory / inhibitory events in the cytoplasm prior to the release of NFKB from the retiring IkB complex.
  • Fig. 4C further show that the negative regulatory (repressing) effect due to tetracycline-induced and thus onset expression of TNK1 is also detectable in the GAL-p65 fusion plasmid, i.e. So even if the native components of the NFKB transcription complex are bypassed (control II), the involvement of co-factors of the NFKB transcription complex in the inhibitory effect of TNK1 on NFKB can be excluded.
  • HEK293 cells transfected with the kinase-deficient plasmid mutant K148R-TNK1 no significant repressing influence on the transcriptional activity of NFKB was detectable. It follows that the tyrosine kinase activity of TNKl is necessary for the NF ⁇ B-inhibiting effect, especially since several tyrosines are present in the transactivation domain of p65.
  • HEK293 cells that express TNKl show massive tyrosine phosphorylation of endogenous NFKB p65, as well as of co-transfected p65-YFP and a p65-YFP deletion mutant, which only consists of the transactivation domain. For this purpose, an immunoprecipitation was carried out with an anti-p65 or anti-GFP antibody and the tyrosine phosphorylation was then detected using an anti-pY antibody (Upstate, anti-pY, clone 4G10),
  • the composition of the heterodimeric NF-DB transcription factor complex remains constant when TNKl is expressed.
  • the data determined and given here on the functional relevance of the tyrosine kinase activity of TNKl for TNF ⁇ -induced NF- ⁇ B activation and the fact that TNK1 induces tyrosine phosphorylation of p65 indicate that an inhibition of transcriptional activity by p65 by mutagenesis of specific tyrosine residues of the transcription factor NF- ⁇ B can be achieved.
  • Example 2 Use of TNKl as a new principle for the therapy of diseases which are associated with increased NFKB activation or are maintained by increased NFKB activation
  • TNKl tumor growth and metasta
  • TNKl d. H.
  • the implementation of an inducible, constitutive, transient or permanent, viral or non-viral gene transfer of TNK1 is also suitable for enhancing the effect of chemotherapy or radiation therapy, which leads to a counterregulatory upregulation of NFKB in the tumor tissue.
  • Tnkl a novel intracellular tyrosine kinase gene isolated from human umbilical cord blood CD34 + / Lin- / CD38- stem / progenitor cells. Oncogene. 1996; 12: 903-13.

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Abstract

Als Inhibitor für den nukleären Transkriptions faktor Kappa B (NFκB) in eukaryontischen Zellen ist das Enzyms Tyrosinkinase TNK 1 geeignet.

Description

TYROSINKINASE TNK ALS INHIBITOR FÜR DEN NUKLAREN TRANSKRI PTIONSFAKTOR KAPPA B (NF-B)
B e s c h r e i b u n g Die Erfindung betrifft einen Inhibitor für den nuklearen Transkriptionsfaktor kappa B (NFKB).
Der nukleare Transkriptionsfaktor kappa B - kurz NFKB - fördert Tumorwachstum und Metastasierung, spielt eine Rolle in der Pathogenese chronisch entzündlicher Darmerkrankungen, ischämischer Erkrankungen, Kachexie, sowie bei Autoimmunerkrankungen und bei der Regulation der Expression des HIV-1 Gens. NFKB ist ein Heterodimer, bestehend aus den Proteinuntereinheiten p50 und p65. Im inaktiven Zustand liegt NFkB gebunden an seinen inhibierenden Proteinkomplex I-AB im Cytosol vor. Zur Aktivierung von NFkB wird I-AB nach Phosphorylierung durch IKB Kinase-Komplexe (IKK) mittels des 26-S Proteasoms abgebaut und NFKB wird freigesetzt. Anschließend gelangt NFKB in den Zellkern, wo es an die DNA bindet und die Transkription aktiviert. Auf diese Weise werden überwiegend Gene exprimiert, welche für die Bildung von proinflammatorischen Zytokinen (TNF-α, Interleukine), induzierbarer Stickstoffmonoxidsynthase (iNOS), Adhäsionsmolekülen und für Proteine mit anti-apoptotischer Wirkung (sogenannte antiapoptotische Mediatoren) kodieren. Antiapoptotische Mediatoren spielen eine Rolle bei der Ausbildung von Apoptoseresistenz und der damit verbundenen Entstehung bestimmter Tumoren.
Im Stand der Technik werden bereits verschiedene Substanzen zur Hemmung der NFKB Aktivierung eingesetzt. Diese Substanzen hemmen entweder die Translokation von NFKB in den Zellkern, oder die DNA-Bindung oder die Transaktivierung von NFKB, ihre Wirkung ist jedoch insbesondere hinsichtlich der Spezifität nicht (voll) zufriedenstellend. Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, einen neuen NFKB- Inhibitor bereitzustellen, der spezifisch und effektiv die NFKB- Aktivierung und/oder NFκB-Aktivität hemmt.
Eine Lösung dieser Aufgabe besteht in der Angabe der Substanz Tyrosinkinase TNK1 zur Verwendung als Inhibitor der Transaktivierung von NFKB in eukaryontischen Zellen.
Die Tyrosinkinase TNK1 ist eine Tyrosinkinase, die urprünglich aus foetalen CD34+ Lin-/CD38-B-Zell Vorläufern isoliert wurde (Hoehn et al. 1996). TNK1 ist überwiegend in embryonalen Geweben im Rahmen der Organogenese/-differenzierung exprimiert, sowie in einigen Tumorzellen und fetalem Blut (Hoehn et al., 1996, Brey,
A., Adler G., Seufferlein T., unveröffentlichte Daten). TNK1 hat ein Molekulargewicht von 72 kDa und wird in die ACK Familie der Tyrosinkinasen eingruppiert. Die Kinase besitzt die für diese Familie typische Anordnung von Subdomänen, bei der die
Kinasedomäne am N-Terminus lokalisiert ist. Darüber hinaus befinden sich C-terminal zwei putative Proteininteraktionsdomänen (src homology domain 3 und proline rieh stretch-Dom en, Sequenz siehe Anhang 2), Die Aktivierung/Autophosphorylierung von TNK1 erfolgt bereits bei deren Expression. Als Interaktionspartner von TNK1 wurde bislang die SH3 Domäne von PLCgammal etabliert (Felschow et al., 2000). Die
Aktivität der Kinase wird durch endogene Faktoren nicht wesentlich moduliert (Hoehn et al, 1996).
Die Erfindung basiert auf der überraschenden Erkenntnis, daß der Transkriptionsfaktor NFKB durch diese Tyrosinkinase TNK1 in seiner Wirkung gehemmt werden kann, Es konnte ein in vitro Modell etabliert werden, das im wesentlichen aus humanen embryonalen Nierenzellen HEK293 besteht, in denen TNK1 durch Tetrazyklin induzierbar exprimiert wird. (Da TNK1 normalerweise kaum in HEK293 Zellen exprimiert wird, entspricht diese induzierte Expression von TNK1 quasi einer de novo Expression). Die Zellen zeigen bei Expression von TNK1 ein verlangsamtes Zellwachstum und eine Abnahme der Zellzahl. Als Target für die TNK1 Wirkung wurde der NFkB Signalweg identifiziert: TNKl hemmt durch Phosphorylierung von Tyrosinresten der p65-Untereinheit des NFκB-Dimers dessen
Transaktivierungseigenschaften. Die Bindung von NFKB an die DNA wird durch TNKl dagegen nicht gehemmt. Es wurde zudem eine hohe Wirkungsspezifität der TNKl festgestellt, nämlich eine selektive Wirkung auf NFKB, während andere Transkriptionsfaktoren von TNKl in ihrer Wirkung nicht beeinflußt werden.
Die erfindungsgemäße Verwendung von TNKl als Inhibitor des Transkriptionsfaktors NFKB eröffnet ein völlig neues Prinzip zur Therapie von Erkrankungen, die mit erhöhter NFκB-Aktivierung verbunden sind, d.h. die mit einer erhöhten NFKB Aktivierung einhergehen und/oder durch diese erhöhte NFkB Aktivierung entscheidend beeinflusst werden. Hierzu gehören beispielsweise Tumorwachstum und Metastasierung, chronisch entzündliche Darmerkrankungen, ischämische Erkrankungen, Kachexie, Autoimmunerkrankungen und die Regulation der Expression des HIV-1 Gens.
Die erfindungsgemäße Verwendung von TNKl als Inhibitor des Transkriptionsfaktors NFKB ist daher außerdem dazu geeignet, die Wirkung einer Chemo- oder Strahlentherapie, die zu einer gegenregulatorischen Hochregulation von NFKB im Tumorgewebe führt, zu verstärken. Desweiteren ist die Verwendung von TNKl als Inhibitor des Transkriptionsfaktors NFKB auch zur Facilitierung von zellulärer Apoptose geeignet. Das heißt: zelleigene Programme, die natürlicherweise eine Apoptose auslösen, im konkreten Fall jedoch durch eine (wodurch auch immer bedingte) hohe NFKB -Aktivierung in ihrer Wirkung blockiert sind, können durch eine TNKl -induzierte Hemmung der NFKB -Aktivierung wieder planmäßig ablaufen. Die Hemmung von NFKB durch Expression von TNKl ist ausreichend, um die mRNA-Expression von NFκB-regulierten anti-apoptotischen Zielgenen wie z.B. XIAP zu inhibieren.
Eine bevorzugte Ausführungsform der erfmdungsgemäßen Verwendung ist dadurch gekennzeichnet, daß die TNK 1 mittels Gentransfer in die NFkB exprimierenden Zellen eingebracht wird. Dieser Gentransfer ist vorzugsweise induzierbaren und/oder konstitutiv, weiter vorzugsweise entweder transient oder dauernd und weiter vorzugsweise entweder viral oder nicht viral.
Die Erfindung wird im folgenden anhand von Figuren und Ausführungsbeispielen näher erläutert. Bei den Figuren zeigen:
Fig. 1: Domänenstruktur von TNKl: Eine N-terminale Kinasedomäne, gefolgt von einer SH3 Domäne und einer C-terminalen Prolin-reichen Domäne.
Fig, 2: Zellwachstum von HEK293 Zellen in An-/ Abwesenheit von TNKl und unter Stimulation mit TNFα in An-/ Abwesenheit von TNKl. Zellen, die TNKl exprimieren, sind an Tag 7 nicht mehr nachweisbar, wenn sie zusätzlich mit TNFα inkubiert wurden.
Fig. 3: A: Konzentration des in den Apoptoseprozeß involvierten Enzyms Effektorcaspase 3 nach 6 und 12 Stunden [h] Inkubation mit TNFα in Zellen mit verstärkter TNK 1 Expression infolge Inkubation mit Tetracylin (Spuren "TNK") und in Zellen ohne (signifikant nachweisbare) TNK 1 Expression infolge Inkubation ohne Tetracylin (Spuren "-") B: Konzentration des 89 kDa-Fragments des DNA Reparaturenzyms PARP (Poly ADP-Ribose Polymerase) infolge Spaltung durch die Effektorcaspase 3. Spur "-" = Zellen, die weder TNKl exprimieren, noch mit TNFα behandelt wurden Spur "TNKl" = Zellen, die TNKl exprimieren ohne TNFα Stimulation Spur "TNFα" = Zellen, die nur mit 400U/ml TNFα stimuliert wurden Spur "TNKl/ TNFα" = Zellen, die TNKl exprimieren und mit 400U/ml TNFα stimuliert wurden C: Konzentration der feien Nukleosomen (DNA-Histon-Komplexe) im Zytosol infolge des Abbaus der genomischen DNA. Spur "TNKl-/ TNFα-" = Zellen, die weder TNKl exprimieren, noch mit TNFα behandelt wurden Spur "TNK1+/ TNFα-" = Zellen, die TNKl exprimieren, ohne TNFα Stimulation Spur "TNKl-/ TNFα+" = Zellen, die nur mit 400U/ml TNFα stimuliert wurden Spur "TNK1+/ TNFα+" = Zellen, die TNKl exprimieren und mit 400U/ml TNFα stimuliert wurden
Fig. 4: Luziferase-Aktivität bzw. NFκB-Aktivität von HEK293 -Zellen, die mit dem Plasmid pcDNA4-TO-TKNl transfiziert sind, von HEK293 -Zellen, die mit der Kinase-defizienten Plasmid-Mutante K148R-TNKl-pcDNA3 transfiziert sind, und von HEK293 -Zellen, die mit einem GAL-p65-Fusionsplasmid mit inregriertem GAL4 Luciferase Reportersystem transfiziert sind A: HEK293 Zellen wurden mit 0.1 μg/ml eines 6x HIV-NF-κB Reporter Konstrukts, 50 ng/ml eines Renilla-Plasmids und 1 μg/ml Wildtyp- bzw. K148R-TNK1 pcDNA3 Plasmids (unter der Kontrolle des CMV Promotors) für 24 h unter Verwendung von FuGene, Röche, nach Herstellerangaben transfiziert. 4h vor Zelllyse wurden die Zellen mit 400 U/ml TNFα inkubiert. Zur Messung der NF-κB Aktivität wurde der Dual-Luciferase Assay Kit (Promega) eingesetzt. B: HEK293 Zellen wurden mit 0.1 μg/ml eines NF-κB2 Reporter Konstrukts, 50 ng/ml eines Renilla-Plasmids und 1 μg/ml Wildtyp- bzw. K148R-TNK1 pcDNA3 Plasmids (unter der Kontrolle des CMV Promotors) für 24 h unter Verwendung von FuGene, Röche, nach Herstellerangaben transfiziert. 4h vor Zelllyse wurden die Zellen mit 400 U/ml TNFα inkubiert. Zur Messung der NF-κB Aktivität wurde der Dual-Luciferase Assay Kit (Promega) eingesetzt. C: HEK293 Zellen wurden mit 0, 1 μg/ml eines pFR-Luc Reporter Konstrukts, 50 ng/ml eines Renilla-Plasmids, 1 μg/ml Wildtyp- bzw. K148R-TNK1 pcDNA3 Plasmids (unter der Kontrolle des CMV Promotors) sowie 0,1 μg/ml eines Galp65 Konstruktes für 24 h unter Verwendung von FuGene, Röche, nach Herstellerangaben transfiziert. Zur Messung der Aktivität des Gal- Promoters wurde der Dual-Luciferase Assay Kit (Promega) eingesetzt.
Beispiel 1: Nachweis von Tyroxinkinase TNKl als Inhibitor der Aktivität des Transkriptionsfaktor NFKB im Zellkulturmodell
A) Etablierung eines in vitro Zellkulturmodells mit humanen embryonalen Nierenzellen
Das Zellmodell besteht aus humanen embryonalen Nierenzellen HEK293, die stabil mit einem Tetrazyklin Repressor pcDNA6-TR Plasmid transfiziert sind. Eine Transfektion dieser Zellen mit dem „gene of interest" - im vorliegenden Fall: Flag-getaggte TNKl - in einem pcDNA4-TO-Plasmid erlaubt die Expression dieses Gens nach Zugabe von Tetrazyklin, da der durch das ρcDNA6-TR-Plasmid codierte Repressor des Genpromotors verdrängt wird. Die Integrität beider Plasmide bis zur chromosomalen Rekombination wird durch Zugabe selektiver Antibiotika gemäß den Angaben des Herstellers gewährleistet. Stabil mit dem Repressor transfizierte HEK293 Zellen sind kommerziell bei der Fa. Invitrogen erhältlich (T-Rex HEK293 System. Cat. No: R710- 07),
In die HEK293 Zellen wurde das aus einer humanen embryonalen Nierenzelllinie isolierte und in das pcDNA4-TO Plasmid klonierte TNKl-Protein (vgl. Fig. 1) mit der im Sequenzprotokoll SEQ ID NO: l dargestellten Aminosäuresequenz eingeschleust. Mit anderen Worten: diese HEK293 Zellen wurden mit einem pcDNA4-TO Plasmid transfiziert, das die im Sequenzprotokoll SEQ ID NO, 2 dargestellte c-DNA umfaßt und für das TNKl- Protein mit der im Sequenzprotokoll SEQ ID NO:l dargestellten Aminosäuresequenz kodiert. Anstelle der konkret genannten Aminosäuresequenz bzw. Nukleotidsequenz eignen sich auch solche Aminosäuresequenzen bzw. Nukleotidsequenzen, die zu der genannten Sequenz SEQ ID NO. 1 bzw, SEQ ID. NO. 2 wenigstens 90 % Homologie im Bereich der Kinasedomäne aufweisen und ein fünktionelles Protein hervorbringen (bilden), das hinsichtlich seiner physiologischen Funktion und Wirkung mit der Tyroxinkinase TNK 1 übereinstimmt. Die Transfektion erfolgte mit den im Stand der Technik bekannten Verfahren der Lipid-basierten Transfektion. Vorzugsweise wurden die HEK293 Zellen mit dem Lipid-basierten Transfektionsreagenz FuGene (Röche) nach den Angaben des Herstellers mit 1 μg/ml pcDNA4-TO-TNKl transfiziert.
Durch Zugabe/Verabreichung von Tetrazyklin war in diesen Zellen die Expression der TNKl induzierbar,
B Wirkung der TNKl -Expression
In dem unter (A) beschriebenen Zellkulturmodell wird die TNKl-Expression durch die Zugabe von Tetrazyklin zum Kulturmedium (Endkonzentration: 1 μg/ml) induziert. Da TNKl normalerweise kaum in HEK293 Zellen exprimiert wird, entspricht diese induzierte signifikant starke Expression von TNKl quasi einer de novo Expression Die erfolgreich induzierte Expression von TNKl ist über die Detektion des N-terminalen Flag-Tags (Flag-TNKl) mittels eines kommerziell erhältlichen anti-Flag Antikörpers (Sigma) nachweisbar, Die signifikant stark TNKl exprimierenden Zellen zeigen ein verlangsamtes Zellwachstum und eine Abnahme der Zellzahl (siehe Fig. 2). Bei gleichzeitiger Inkubation dieser (Tetracyclin-induzierten und infolgedessen) stark TNKl exprimierenden Zellen mit dem Zytokin TNFα kommt es zu einem wesentlich verstärkten Zelluntergang /Apoptose ( programmierten Zellsterben), während bei einer Inkubation von nicht induzierten Zellen ohne (signifikante) TNK 1 -Expression mit TNFα kein Zelluntergang (programmiertes Zellsterben)/ keine Apoptosse feststellbar ist (siehe Fig. 2).
Als Ursache für den Zelluntergang nach Inkubation und damit Stimulation mit TNFα wurde die Induktion von Apoptose identifiziert, und zwar (A) anhand des Anstiegs der Konzentration bzw. der Aktivität des in den Apoptoseprozeß involvierten Enzyms Effektorcaspase 3, (B) anhand des Ausmaß der Spaltung des DNA Reparaturenzyms PARP (Poly ADP-Ribose Polymerase) durch die Effektorcaspase 3, die das 116 kDa große Protein in zwei Fragmente von 89 kDa und 24 kDa spaltet und dadurch inaktiviert und (C) anhand des Abbaus bzw. der Fragmentierung genomischer DNA bzw. des daraus resultierenden Anstiegs freier Nukleosomen im Zytosol.
Der Apoptoseprozess wird von hierarchisch angeordneten Faktoren gesteuert, die über die Aktivierung von spezifischen Nukleasen und Proteasen, darunter auch die Effektorcaspase 3, den Abbau der Zellen bewirkt. Der Anstieg der Konzentration aktiver und damit gespaltener Caspase 3 in den Zellen (als Maß für die Aktivität dieses Enzyms) wurde mittels der dem Fachmann bekannt und geläufigen Methodik der SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese nachgewiesen. Aus den in Fig. 3 A dargestellten Ergebnissen ist ersichtlich, daß die Konzentration/ Aktivität der Effektorcaspase 3 in den Tetrazyklin-induzierten und damit verstärkt TNKl -exprimierenden Zellen bereits nach 6 - 8 h deutlich höher war als in den Kontrollzellen ohne Tetrazyklin-Induktion. Die Spaltung der PARP wurde anhand der Spaltprodukte, nämlich des 89 kDa- Fragments der mit der dem Fachmann bekannten und geläufigen Western-Blot- Analyse unter Einsatz (im Handel erhältlicher) PARP-spezifischer Antikörper nachgewiesen Fig. 3 B). Aus Fig. 3 B ist ersichtlich, daß in den Zellen, in denen ein Anstieg der Effektorcaspase-3 -Konzentration/Aktivität zu beobachten ist, auch eine Spaltung des DNA Reparaturenzyms PARP in seine Untereinheiten auftritt. Die Fragmentierung der genomischer DNA in frei Nukleosomen (DNA-Histon- Komplexe) wurde mittels der dem Fachmann bekannt und geläufigen Methodik des Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) unter Verwendung spezifischer Antikörper gegen DNA/Histon-Komplexe nachgewiesen (Fig, 3 C). Aus Fig. 3 C ist ersichtlich, wie die Konzentration der freien Nukleosomen (DNA-Histon-Komplexe) im Zytösol in denjenigen Zellen, die ohne TNFα-Stimulation TNKl exprimieren (Spur "TNK1+/ TNFα-") etwa doppelt so groß ist wie Zellen, die weder TNKl exprimieren, noch mit TNFα behandelt wurden (Spur "TNKl-/ TNFα -"). In denjenigen Zellen, die nur mit 400U/ml TNFα stimuliert wurden (Spur "TNKl-/ TNFα+"), ist die Konzentration der freien Nukleosomen (DNA-Histon-Komplexe) im Zytosol etwa 8 mal so groß wie in denjenigen Zellen, die weder TNKl exprimieren, noch mit TNFα behandelt wurden (Spur "TNKl-/ TNFα -"), und in denjenigen Zellen, die TNKl exprimieren und mit 400U/ml TNFα stimuliert wurden (Spur "TNK1+/ TNFα+") etwa 15 mal so groß.
In allen Fällen ist die Apoptose in Zellen, die TNKl exprimieren (also mit dem Plasmid pcDNA4-TO transfiziert sind und in Anwesenheit von Tetracyclin inkubiert werden/wurden), deutlich höher als in den Kontrollzellen ohne (verstärkte ) Induktion der TNK 1 Expression (also Zellen, die zwar mit dem Plasmid pcDNA4-TO transfiziert sind, jedoch in Anwesenheit von Tetracyclin inkubiert werden/wurden).
Da TNKl alleine per se keine zelluläre Apoptose induziert sondern ein Modulator der TNFa-abhängigen pro- und anti-apoptotischen Signalwege ist, folgt aus den dargestellten Befunde, daß die Induktion der Apoptose durch TNFα über eine TNKl vermittelte NFκB-Blockierung erfolgt.
C) Nachweis des NFKB Signalwegs als Target für die TNKl Wirkung
In dem unter (A) beschriebenen und gemäß (B) zur verstärkten TKNl -Expression induzierten Zellkulturmodell wurden die HEK293 Zellen mit 0.1 μg/ml eines 6x HIV- NFKB Reporter-Promotor-Konstrukts (= artifizieller 6x HIV- bzw. NFκB-Promotor, dessen Aktivität direkt mit dem "Report" - hier der Aktivität der Luciferase - korreliert) 50 ng/ml eines Renilla-Plasmids und 1 μg/ml des TNKl-pcDNA3 Plasmids (unter der Kontrolle des CMV Promotors) transfiziert (FuGene, Röche). Parallel dazu wurden als Kontrolle (I) HEK293 Zellen mit 0.1 μg/ml eines 6x FflV- NFKB Reporter Konstrukts (artifizieller Promotor), 50 ng/ml eines Renilla-Plasmids und 1 μg/ml der Kinase-defizienten Plasmid-Mutante K148R-TNKl-pcDNA3 transfiziert,
Ebenfalls parallel dazu wurde als Kontrolle (II) ein GAL-p65-Fusionsplasmid mit inregriertem GAL4 Luciferase Reportersystem konstruiert, in HEK293 Zellen transient transfiziert und untersucht. Vorzugsweise wurde hierfür das im Handel erhältliche Dual- Luciferase Assay Kit (Promega) eingesetzt. Bei diesem System bzw. Konstrukt erfolgt die Promotoraktivierung unter Umgehung der NFKB spezifischen Ko-Faktoren, indem eine an die p65-Untereinheit von NFKB fusionierte GAL4-DNA-Bindungsdomäne mit einem GAL4 Bindungselement auf dem Reporter in Interaktion tritt. Mit anderen Worten: in diesem System wird der NFKB Transkriptionskomplex umgangen, da die Protein/DNA Interaktion über das GAL4/Gal-Promotor System erfolgt. Die beobachteten Effekte sind folglich auf die Modifikation der Transaktivierungsdomäne von p65 zurückzuführen und nicht auf eine Änderung der Zusammensetzung des NFKB Transkriptionskomplexes, die die Protein/DNA Interaktion beeinträchtigt. Zur Messung der NFKB Aktivität wurde der Dual-Luciferase Assay Kit (Promega) eingesetzt. Die Ergebnisse dieses Luciferase Assays sind in Fig.4 graphisch dargestellt. Fig. 4 A zeigt die Luciferaseaktivität und damit die Pomotoraktivität derjenigen HEK293 Zellen, die mit 0.1 μg/ml eines 6x HTV-NF-κB Reporter-Promotor- Konstrukts, 50 ng/ml eines Renilla-Plasmids und 1 μg/ml Wildtyp- bzw. K148R-TNK1 pcDNA3 Plasmids (unter der Kontrolle des CMV Promotors) transfiziert und 4h vor der Zelllyse mit 400 U/ml TNFα inkubiert wurden.
Fig. 4 B zeigt die Luciferaseaktivität und damit die Pomotoraktivität derjenigen HEK293 Zellen, die mit 0.1 μg/ml eines NF-κB2 Reporter-Promotor-Konstrukts, 50 ng/ml eines Renilla-Plasmids und 1 μg ml Wildtyp- bzw. K148R-TNK1 ρcDNA3 Plasmids (unter der Kontrolle des CMV Promotors) transfiziert und 4h vor der Zelllyse mit 400 U/ml TNFα inkubiert wurden.
Fig, 4 C zeigt die Luciferaseaktivität und damit die Pomotoraktivität derjenigen HEK293 Zellen, die mit 0.1 μg/ml eines pFR-Luc Reporter-Konstrukts, 50 ng/ml eines Renilla-Plasmids, 1 μg/ml Wildtyp- bzw. K148R-TNK1 ρcDNA3 Plasmids (unter der Kontrolle des CMV Promotors) sowie 0,1 μg/ml eines Galp65 Konstruktes transfiziert wurden.
Aus Fig. 4 A und Fig. 4 B ist ersichtlich, daß infolge der verstärkten TNKl Expression die TNFα-abhängige, NFκB-vermittelte Transaktivierung des artifiziellen (6x HIV- Reporter; Fig. A) und des endogenen Promoters (NFκB2-Promotor; Fig. B) dereguliert (negativ reguliert, gehemmt) ist bzw. die transkriptionelle Aktivität von NFKB reprimiert, d.h. gehemmt oder ganz unterdrückt ist. Mit anderen Worten: Die Lipid-basierte Transfektion von TNKl in HEK293 Zellen fuhrt nach TNFα Stimulation zu einer signifikanten Hemmung der Luciferaseaktivität sowohl eines artifiziellen (6x HlV-Promotor; Fig. 4 A) als auch eines natürlichen NFKB Promotor-Reportersystems (NFκB2-Promotor; Fig. 4 B). In allen Fällen zeigt die Kinase-defiziente Mutante K148R einen deutlich geringeren oder nicht nachweisbaren negativ-regulatorischen Effekt. Dies weist auf eine funktioneile Bedeutung der Kinaseaktivität von TNKl für die negative Regulation der TNF α-induzierten NF-κB Aktivität hin.
Stromaufwärts im NFKB Signalweg liegende Ereignisse wie z.B. die Ubiquitinierung von IkappaB alpha werden dagegen gemäß der ermittelten Daten durch die Expression von TNKl nicht gehemmt. Die Hemmung des NFKB Signalwegs erfolgt somit direkt durch Modulation der transkriptioneilen/transaktivierenden Eigenschaften und nicht durch Modulation an aktivatorischen/inhibitorischen Ereignissen im Zytoplasma vor der Freisetzung von NFKB aus dem retendierenden IkB Komplex.
Die in Fig. 4 C dargestellten Ergebnisse zeigen weiter, daß der negativ regulatorische (reprimierende) Effekt infolge Tetrazyklin-induzierter und damit einsetzender Expression von TNKl auch bei dem GAL-p65-Fusionsplasmid nachweisbar ist, d.h. also auch dann, wenn die nativen Bestandteile des NFKB Transkriptionskomplexes umgangen werden (Kontrolle II), Damit kann eine Beteiligung von Ko-Faktoren des NFKB Transkriptionskomplexes bei der Inhibitor-Wirkung von TNKl auf NFKB ausgeschlossen werden.
Bei den mit der Kinase-defizienten Plasmid-Mutante K148R-TNK1 transfizierten HEK293 Zellen war kein negativer regulatorischer Effekt zu nachweisbar. Die Kinase- Aktivität ist folglich essentiell für die inhibitorischeWirkung von TNKl auf NFKB. Mit anderen Worten: Der reprimierende Effekt von TNKl auf NFKB ist auf die Tyrosinkinase-Aktivität zurückzuführen, wobei eine Phosphorylierung von Tyrosinresten potentieller Substrate besonders in Betracht kommt (D) Nachweis der inhibitorischen Wirkung von TNKl auf die p65-Untereinheit des NFκB-Dimers vermittels Tyrosinphosphorylierung Die gewonnen Ergebnisse zeigen, daß TNKl nicht die Bindung von NFKB an die DNA hemmt. Daraus folgt, daß die Repression der transkriptioneilen Aktivität von NFKB durch TNKl nicht über eine verminderte Bindung des Transkriptionsfaktors an die DNA vermittelt, sondern sehr wahrscheinlich über eine Modifikation der Transaktivierungsdomäne von p65 herbeigeführt wird.
Bei den mit der Kinase-defizienten Plasmid-Mutante K148R-TNK1 transfizierten HEK293 Zellen war kein wesentlicher reprimierender Einfiuss auf die transkriptionelle Aktivität von NFKB nachweisbar. Daraus folgt, dass die Tyrosinkinaseaktivität von TNKl für den NFκB-inhibierenden Effekt erfoderlich ist, zumal in der Transaktivierungsdomäne von p65 mehrere Tyrosine vorhanden sind. HEK293 Zellen, die TNKl exprimieren zeigen eine massive Tyrosinphosphorylierung von endogenem NFKB p65, sowie von ko-transfiziertem p65-YFP und einer p65-YFP- Deletionsmutante, die nur noch aus der Transaktivierungsdomäne besteht. Hierfür wurde eine Immunpräzipitation mit einem anti-p65 bzw. anti-GFP Antiörper durchgeführt und anschließend die Tyrosinphosphorylierung mittels eines anti-pY Antikörpers detektiert (Upstate, anti-pY, Klon 4G10),
Die Zusammensetzung des heterodimeren NF- DB Transkriptionsfaktorkomplexes bleibt unter Expression von TNKl konstant. Die ermittelten und hier angegebenen Daten zur funktionellen Relevanz der Tyrosinkinaseaktivität von TNKl für die TNFα- induzierte NF-κB Aktivierung sowie die Tatsache, dass TNKl eine Tyrosinphosphorylierung von p65 induziert, weisen darauf hin, dass durch Mutagenese spezifischer Tyrosinreste an p65 eine Hemmung der transkriptionellen Aktivität des Transkriptionsfaktors NF-κB erzielt werden kann. Beispiel 2: Einsatz von TNKl als neues Prinzip zur Therapie von Erkrankungen, die mit erhöhter NFKB Aktivierung einhergehen bzw. durch erhöhte NFKB Aktivierung unterhalten werden
Es sind zahlreiche Erkrankungen bekannt, die mit einer erhöhten NFKB Aktivierung einhergehen und durch diese erhöhte NFKB Aktivierung entscheidend beeinflusst werden. Hierzu gehören Tumorwachstum und Metastasierung, chronisch entzündliche Darmerkrankungen, ischämische Erkrankungen, Kachexie, Autoimmunerkrankungen und die Regulation der Expression des HIV- 1 -Gens. Diese Krankheiten können durch einen induzierbaren, konstitutiven, transienten oder dauernden, viralen oder nicht viralen Gentransfer von TNKl beeinflusst werden, d.h. die erfindungsgemäße Verwendung von TNKl ermöglicht eine Therapie dieser Krankheiten. Durch den Einsatz von TNKl und die damit induzierte NFκB-Blockierung können zelleigene Programme, die eigentlich Apoptose auslösen, jedoch durch eine begleitende hohe NFκB-Aktivierung in ihrer Wirkung gehemmt sind, wieder in Gang gebracht, d.h. proapoptotisch wirksam gemacht werden.
Die erfindungsgemäße Verwendung von TNKl, d,h. die Durchführung eines induzierbaren, konstitutiven, transienten oder dauernden, viralen oder nicht viralen Gentransfers von TNKl ist außerdem dazu geeignet, die Wirkung einer Chemo- oder Strahlentherapie, die zu einer gegenregulatorischen Hochregulation von NFKB im Tumorgewebe führt, zu verstärken.
Ferner haben weitergehende Experimente in unterschiedlichen Tumorzellmodellen gezeigt, dass die Expression von TNKl zur Hemmung der in zahlreichen Tumorzellen zu beobachtenden konstitutiven NFKB Aktivierung führt und die betreffenden Zellen susceptibel für zytotoxische Therapieansätze macht. Literatur:
Felschow DM, Civin CI, Hoehn GT, Characterization of the tyrosine kinase Tnkl and its binding with phospholipase C-gammal. Biochem Biophys Res Commun. 2000;273:294-301.
Hoehn GT, Stokland T, Amin S, Ramirez M, Hawkins AL, Griffin CA, Small D, Civin CI. Tnkl: a novel intracellular tyrosine kinase gene isolated from human umbilical cord blood CD34+/Lin-/CD38- stem/progenitor cells. Oncogene. 1996;12:903-13.

Claims

A n s p r ü c h e
1. Verwendung des Enzyms Tyrosinkinase TNK 1 als Inhibitor für den nuklearen Transkriptionsfaktor kappa B (NFKB) in eukaryontischen Zellen.
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß TNKl zur Inhibierung der Transaktivierungseigenschaften von NFKB geeignet und vorgesehen ist.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß daß TNKl zur Inhibierung der p65 Untereinheit von NFkB geeignet und vorgesehen ist.
4. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Inhibierung durch Phosphorylierung von wenigstens einem Tyrosinmolekül der p65 Untereinheit von NFKB realisiert ist,
5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die TNKl mit Methoden des Gentransfers in die eukaryontischen Zellen eingebracht wird.
6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß eine für TNKl kodierende Gensequenz in die eukaryontischen Zellen eingeschleust wird und in den Zellen zur Expression bringbar ist, wobei diese Expression durch die Einwirkung von Tetrazyklin induzierbar ist,
1. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Tyroxinkinase TNKl die Aminosäuresequenz gemäß Sequenzprotokoll SEQ ID NO.l aufweist.
8, Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Tyroxinkinase TNKl eine Aminosäuresequenz aufweist, die von einer DNA mit der im Sequenzprotokoll SEQ ID NO.2 dargestellten Nukleotidsequenz oder mit einer im Bereich der Kinasedomäne wenigstens 90 % zu dieser homologen Nukleotidsequenz kodiert wird.
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AL Designated countries for regional patents

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121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
122 Ep: pct application non-entry in european phase