WO2005121791A1 - Sorptionsmittel für nukleinsäuren, enthaltend säureaktiviertes schichtsilicat - Google Patents

Sorptionsmittel für nukleinsäuren, enthaltend säureaktiviertes schichtsilicat Download PDF

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    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Definitions

  • the invention relates to a method for enriching, depleting, removing, obtaining or separating nucleic acid molecules with the aid of a sorbent, the sorbent comprising at least one acid-activated layered silicate. Preferred uses of such a sorbent are also disclosed.
  • Another field of application for such separation processes and the adsorbents used for this is the depletion of DNA in waste water, especially in production processes with genetically modified organisms, such as e.g. Bacteria or fungi.
  • adsorbents are already known in the prior art, in particular those based on silanized silicate particles (silica gel) or functionalized celluloses.
  • ÜS-A 4,029,583 describes a chromatographic carrier material made of silica gel which is suitable for the separation of proteins, peptides and nucleic acids and which has a cavity diameter of up to 50 nm and on which a stationary phase with an anion or cation exchanger is formed by means of a silanization reagent Groups are bound, which interact with the substances to be separated.
  • the silanized silica gel is brought into contact with water, with the risk that the stationary phase polymerizes and closes the pores of the carrier material.
  • nucleic acid mixtures can be separated into their constituents with high resolution and at high throughput speed if a chromatographic support material is used in which the diameter of the cavities is one to twenty times the largest dimension of the nucleic acid to be isolated in each case or the largest dimension of the largest of all nucleic acids contained in the mixture.
  • a chromatographic support material is used in which the diameter of the cavities is one to twenty times the largest dimension of the nucleic acid to be isolated in each case or the largest dimension of the largest of all nucleic acids contained in the mixture.
  • a silanizing reagent which has a flexible chain group, which in turn is converted to the finished support material by reaction with a reagent which forms an anion or cation exchanger.
  • EP 0 496 822 (WO 91/05606, DE 393 50 98) describes a chromatographic support material, the cavities of which are one to twenty times the size of the largest dimension of the nucleic acids to be separated, which can be obtained by using a starting support material with a cavity size of 10 up to 1000 nm, a specific surface area of 5 to 800 m 2 / g and a grain size of 3 to 500 ⁇ m is reacted with a silanizing reagent, which is characterized in that the silanizing reagent has at least one reactive one already reacted with a primary or secondary hydroxyalkylamine Has group or contains a reactive group which can be reacted with a hydroxyalkylamine, such as an epoxy group or halogen atoms, which is reacted with a hydroxyalkylamine in a further reaction step.
  • a disadvantage of the prior art sorption systems is that they are either relatively expensive or do not meet the requirements in terms of the binding capacity, the binding kinetics and / or the recovery rate of the absorbed nucleic acid (s). Due to the increasing importance of separating or purifying nucleic acids from different media, there is a constant need for improved sorbents for nucleic acids.
  • the present invention was therefore based on the object of providing an improved sorbent for nucleic acids which can be used advantageously in a process for enrichment or depletion, for removal or extraction or for the separation of nucleic acids and which avoids the disadvantages of the prior art.
  • sorbents which comprise at least one acid-activated phyllosilicate can be used particularly advantageously to achieve this object.
  • Such acid-activated phyllosilicates show a surprisingly high binding capacity for nucleic acids, which exceeds that of commercial adsorption systems of the prior art. They also show a special the rapid binding kinetics. It is also advantageous that the bound nucleic acid can be removed again virtually quantitatively from the sorbent.
  • One aspect of the present invention thus relates to a method for sorption, enrichment or depletion, removal, recovery or separation of at least one nucleic acid molecule, preferably from a polar, in particular an aqueous or alcoholic medium with the aid of a sorbent, the sorbent at least one comprises acid-activated layered silicate.
  • the sorbents disclosed here are therefore suitable for separating nucleic acids as well as enriching or enriching them from appropriate solutions / media in order to obtain or remove them:
  • the almost quantitative recovery rate when eluted with suitable, usually high-salt buffers shows that it also it is possible to recover the bound nucleic acid.
  • the areas of application for such sorbents are diverse. Without restricting this invention to the following examples, some possible applications are to be mentioned: For example, it is conceivable to separate nucleic acids from a multicomponent mixture or to deplete DNA from waste water from biotechnological production residues with genetically modified organisms.
  • the sorbent according to the invention can also be used for all molecular biological, microbiological or biotechnological methods in connection with nucleic acids, in particular their enrichment or depletion, separation, transient or permanent immobilization or other use. Exemplary methods and processes can be found in relevant textbooks such as Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press 2001 and are known to the person skilled in the art common.
  • the present sorbent can also be used in the chromatographic separation of nucleic acids. be used. Nucleic acids are primarily to be understood as meaning DNA and RNA species, including genomic DNA and cDNA and their fragments, mRNA, tRNA, rRNA and other nucleic acid derivatives of natural or synthetic origin of any length.
  • nucleic acid mixtures for example via a matrix (carrier) containing the sorbent according to the invention.
  • adsorbents according to the invention are in principle also suitable for the separation or purification of proteins and other biomolecules.
  • biomolecule is understood to mean a molecule which has, as building blocks, nucleotides or nucleosides (nucleobases), amino acids, monosaccharides and / or fatty acids.
  • nucleic acid (molecule) also includes other biomolecules.
  • use for the sorption of nucleic acids is particularly preferred.
  • All natural or synthetic layered silicates or mixtures thereof which can be activated by an acid, ie in which cations in the intermediate layers can be exchanged for protons, can be used as starting materials for the layered silicates used according to the invention.
  • Two-layer and in particular three-layer silicates are preferred.
  • Acid-activatable sheet silicates are known to the person skilled in the art and include in particular the smectic or montmorillonite-containing sheet silicates, such as bentonite.
  • both so-called nature-active and non-nature-active sheet silicates can be used, in particular di- and trioctahedral sheet silicates of the serpentine, Kaolin and talc pyrophylite groups, smectites, vermiculites, 11-lites and chlorites as well as those of the sepiolite-palygorskite group, such as montmorillonite, natronite, saponite and vermiculite or hectorite, beidellite, palygorskite and alternating bearing minerals (mixed layer mineral). Mixtures of two or more of the above materials can of course also be used.
  • the layered silicate used in accordance with the invention may also contain further constituents (including, for example, non-acid-activated layered silicates) which do not impair the intended use of the acid-activated clay, in particular its sorption capacity, or even have useful properties.
  • further constituents including, for example, non-acid-activated layered silicates
  • Layered silicates from the montmorillonite / beidellite series such as e.g. Montmorillonite, bentonite, natronite, saponite and hectorite. Bentonites are most preferred, since surprisingly particularly advantageous binding capacities and kinetics for nucleic acids are achieved here.
  • Weathering products of clays with a specific surface area of more than 200 m / g, a pore volume of more than 0.5 ml / g and an ion exchange capacity of more than 40 meq / lOOg in acid-activated form have also proven to be particularly useful.
  • particular preference is given to raw clays for acid activation, the ion exchange capacity of which is above 50 meq / 100 g, preferably in the range from 55 to 85 meq / 100 g.
  • the specific BET surface area is particularly preferably in the range from 200 to 280 ⁇ n 2 ./g, in particular between 200 and 260 m / g.
  • the pore volume is preferably in the range from 0.7 to 1.0 ml / 100 g, in particular in the range from 0.80 to 1.0 ml / 100 g.
  • Acid activation of such raw clays can be carried out as specified herein. Such clays are described, for example, in DE 103 56 894.8 by the same applicant, which in this regard is expressly incorporated by reference into the present description.
  • the two-layer and the three-layer layer silicates can be used advantageously for the sorption of nucleic acids and other biomolecules even without acid activation.
  • the smectitic layered silicates such as bentonite are particularly preferred.
  • a non-activated layered silicate can be used instead of the acid-activated layered silicate, or a mixture of both as the sorbent according to the invention. Otherwise, the information given in relation to the method and the use of the sorbent in the present description apply accordingly.
  • the sorbent used in the invention is based on at least one acid-activated layer silicate, • ie at least 50 wt .-%, preferably at least 75 wt .-%, more preferably at least 90 wt .-%, in particular at least 95 wt .-% or even at least 98% by weight of the sorbent according to the invention consists of one (or more) acid-activated layered silicate (s) as defined herein.
  • no silica or silica gel is used.
  • the sorbent according to the invention essentially or completely consists of at least one acid-activated layered silicate.
  • the sorbent used according to the invention can also be used together with other sorbents or other components that appear suitable to the person skilled in the art, for example in the context of the method according to the invention.
  • the acid-activated layered silicate has an average pore diameter, determined by the BJH method (DIN 66131), between approximately 2 nm and 25 nm, in particular between approximately 4 and approximately 10 nm.
  • the pore volume, determined by the CCl 4 method according to the method part, of pores up to 80 nm in diameter is between approximately 0.15 and 0.80 ml / g, in particular between approximately 0.2 and 0.7 ml / G.
  • the corresponding values for pores up to 25 nm in diameter are in the range between approximately 0.15 and 0.45 ml / g, in particular 0.18 to 0.40 ml / g.
  • the corresponding values for pores up to 14 nm are in the range between approximately 0.10 and 0.40 ml / g, in particular approximately 0.12 to 0.37 ml / g.
  • the pore volumes for pores between 14 and 25 nm in diameter can be, for example, between 0.02 and 0.3 ml / g.
  • the pore volume of pores with 25 to 80 nm can be in the same range, for example.
  • the porosimetry of the acid-activated layered silicates can also be influenced in a targeted manner via the conditions in the acid activation of the layered silicates, ie in particular the amount or concentration of the acid used, the temperature and the duration of the acid treatment. For example, greater acid activation with an increased amount of acid or at an elevated temperature over a longer period of time can cause a greater porosity of the layered silicates, especially in the region of the smaller pores with a diameter of less than 50 nm, in particular less than 10 nm. determined according to the CC1 4 method according to the method part. By increasing the amount of acid used to activate the acid, the micropore volume of the layered silicate can be increased. At the same time, the Cation exchange capacity.
  • the sorption capacity of the acid-activated layered silicate or its absorption and desorption rate via the acid activation in individual cases can be optimized on the basis of routine examination of a number of differently acid-activated layered silicates.
  • the pores / cavities in the sorbents according to the invention can be modified in the manner provided in accordance with EP 0 104 210 or US 4,029,583 (see above).
  • the acid-activated sheet silicates used according to the invention are generally produced by treating sheet silicates with at least one acid.
  • the layered silicates are brought into contact with the acid (s).
  • any method for the acid activation of layered silicates which is familiar to the person skilled in the art can be used here, including the methods described in WO 99/02256, US Pat. No. 5,008,226 and US Pat. No. 5,869,415, which are so far expressly incorporated by reference into the description.
  • any organic or inorganic acids or mixtures thereof can be used.
  • acid can be sprayed on using a so-called SMBE process (Surface Modified Bleaching Earth).
  • SMBE process Surface Modified Bleaching Earth
  • the activation of the layered silicate is thus carried out in the aqueous phase.
  • the acid is brought into contact with the layered silicate as an aqueous solution.
  • the procedure can be such that the layered silicate, which is preferably provided in the form of a powder, is first slurried in water. The acid (eg in a concentrated form) is then added.
  • the Layered silicate can, however, also be suspended directly in an aqueous solution of the acid, or the aqueous solution of the acid can be applied to the layered silicate.
  • the aqueous acid solution can, for example, be sprayed onto a preferably broken or powdered layered silicate, the amount of water preferably being chosen to be as small as possible and, for example, a concentrated acid or acid solution being used.
  • the amount of acid can preferably be selected between 1 and 10% by weight, particularly preferably between 2 and 6% by weight, of an acid, in particular a strong acid, for example a mineral acid such as sulfuric acid, based on the anhydrous layered silicate (atro). If necessary, excess water can be evaporated and the activated layered silicate can then be ground to the desired fineness. As already explained above, no washing step is required in this embodiment of the method according to the invention, but is possible.
  • the water content of the acid-activated layered silicate obtained is usually adjusted to a proportion of less than 20% by weight, preferably less than 15% by weight.
  • the acid itself can be chosen as desired. Both mineral acids and organic acids or mixtures of the above acids can be used. Conventional mineral acids can be used, such as hydrochloric acid, phosphoric acid or sulfuric acid, with sulfuric acid being preferred. Concentrated or diluted acids or acid solutions can be used. Solutions of, for example, citric acid or oxalic acid can be used as organic acids.
  • a further preferred activation option is the boiling of the layered silicates in an acid, in particular hydrochloric or sulfuric acid. Different degrees of activation can be set here by the appropriate concentrations of acid and cooking times, and the pore volume distribution can be set in a targeted manner. Such activated layered silicates are often referred to as bleaching earths. After the materials have dried, they are ground using standard methods.
  • HBPE process In “classic” activation, which is preferred in many cases according to the invention, activation is carried out at temperatures around 100 ° C. up to the boiling point (boiling point). In contrast, the SMBE process is usually carried out at room temperature, with elevated temperatures allowing better acid activations in individual cases. However, the influence of temperature is far less with the SMBE process than with the "classic" activation (so-called HBPE process).
  • the dwell time (duration of acid activation) in the HBPE process is, for example, between about 8 hours, for example when using hydrochloric acid, and 12 to 15 hours, for example when using sulfuric acid.
  • the HBPE process attacks the layer structure, which results in areas with silica, in addition to structurally largely unchanged areas.
  • 3% by weight of H 2 S0 4 are added (100 + 3).
  • the analysis of the processed material then usually shows acid contents in the range of 0.4 to 1.0%, ie a large part of the acid is consumed (exchange of H + ions for other cations etc.). A small part may be consumed by the lime it contains.
  • the contact times with the acid are often around 15 minutes in the laboratory. It has been found that, depending on the layered silicate used, activation with small amounts of acid may already be sufficient to obtain surprisingly good sorbents.
  • the layered silicate is activated in such a way that the cation exchange capacity (CEC) of the acid-activated layered silicate used is less than 50 meq / 100 g, in particular less than 40 meq / 100 g.
  • Activation is particularly preferably carried out by means of an at least 1 molar, in particular at least 2 molar acid solution at elevated temperature, in particular at more than 30 ° C., more preferably more than 60 ° C.
  • an acid with a pKa value of less than 4, in particular less than 3, more preferably less than 2.5 is used for the advantageous activation of the layered silicates.
  • strong mineral acids in particular hydrochloric acid, sulfuric acid or nitric acid or mixtures thereof, in particular in a concentrated form.
  • the preferred amount of acid is more than 1% by weight, in particular more than 2% by weight, particularly preferably at least 3% by weight of acid, more preferably at least 4% by weight of acid, based on the amount of layered silicate to be activated (determined from Drying at 130 ° C).
  • the exchangeable (metal) cations are essentially completely exchanged for protons by the acid activation of the layered silicate, i.e. more than 90%, in particular more than 95%, particularly preferably more than 98%. This can be determined on the basis of the CEC and its ion proportions before and ⁇ after the acid activation.
  • the acid activation it is not necessary for the acid activation that the excess acid and that in the acti- resulting salts are washed out. Instead, after the acid has been fed in, as is customary for acid activation, no washing step is carried out, but the treated layered silicate is dried and then ground to the desired particle size. A typical bleaching earth fineness is usually set when grinding.
  • the dry sieve residue on a sieve with a mesh size of 63 ⁇ m is in the range from 20 to 40% by weight.
  • the dry sieve residue on a sieve with a mesh size of 25 ⁇ m is in the range from 50 to 65% by weight.
  • the sorbent used according to the invention can be used in the form of a powder, granules or any shaped body.
  • powders use in the form of suspensions of the sorbent in the media containing the at least one nucleic acid molecule is appropriate.
  • coarser grinding can also be used to set particles which show the grain size distribution customary in chromatography, so that the materials can also be packed into gravity columns or chromatography columns.
  • the sorbents can be used in any form, including supported or immobilized forms. For example, use in the separation of different nucleic acid components on the basis of their molecular weight is also conceivable.
  • the form of application of the adsorbents according to the invention is not limited to the examples given.
  • the grain or shaped body size of the acid-activated layered silicate used according to the invention as a sorbent will therefore depend on the particular application. All grain sizes and agglomerate sizes are possible here.
  • the acid-activated layered silicate can be used in powder form, in particular with a D 50 value of 1 to 1,000 ⁇ m, in particular 5 to 500 ⁇ m. Typical useful granules are in the range (D 50 ) between 100 ⁇ m to 5,000 ⁇ m, in particular 200 to 2,000 ⁇ m particle size.
  • it is advantageous to use moldings made from or with the acid-activated layered silicates for example in the case of chromatography columns, including gravity or centrifugation columns, solid-phase chromatography, filter cartridges, membranes, etc.
  • the sorbent used according to the invention can be in immobilized form.
  • the sorbent can be embedded in a filter cartridge, an HPLC cartridge or a comparable administration form.
  • gels e.g. Agarose gels or other gel-like or matrix-like structures are preferably possible.
  • Such applications are often sold as part of so-called kits for purifying nucleic acid molecules, such as the products of the Quiagen company, such as' Quiagen genomic tip or the like.
  • the medium containing the nucleic acid molecules of interest is generally sent through a column or filter cartridge or the like containing the sorbent. It can then be washed with suitable buffers to remove adhering impurities. Finally, an elution step follows to obtain the nucleic acid molecules of interest.
  • the acid-activated layered silicate has a BET surface area (determined according to DIN 66131) of at least 50 to 800 m / g, in particular at least 100 to 600 m 2 / g, particularly preferably of at least 130 to 500 m 2 / g, on.
  • BET surface area determined according to DIN 66131
  • the high surface clearly shows the interaction with the nucleic acid relieved, the possibility of desorption is surprisingly retained.
  • the nucleic acids are DNA or RNA molecules in double-stranded or single-stranded form with one or more nucleotide units.
  • nucleic acids the method according to the invention is particularly advantageous in the case of media which contain oligonucleotides or. Contain nucleic acids with at least 10 bases (pairs), preferably with at least 100 bases (pairs), in particular at least 1000 bases (pairs).
  • the method according to the invention can also be used or used for nucleic acids between 1 and 10 bases (pairs).
  • nucleic acid molecules such as plasmids or vectors with, for example, 1 to 50 kB or longer genomic or c-DNA fragments. Restriction-digested DNA and RNA fragments, synthetic or natural oligo- and polymers from nucleic acids, cosmids, etc. are also included.
  • the method according to the invention can surprisingly achieve an improved resolution at a high throughput rate.
  • the carrier materials used can be used in a wide temperature range and are highly loadable.
  • the carrier material also shows high pressure resistance and a long service life.
  • the sorbent according to the invention can be used in any media.
  • Polar media are preferred, in which the biomolecules or nucleic acid of interest are generally contained.
  • the particularly preferred aqueous or alcoholic media are understood to mean all media containing water or alcohol, including aqueous-alcoholic media.
  • all media are also included in which water is completely miscible or completely mixed with other solvents.
  • alcohols such as methanol, ethanol and C 3 - to C 10 -alcohols with one or more OH groups or acids are to be mentioned.
  • Solvents that are completely miscible with water and their mixtures with water and alcohol are also conceivable. In practice, these are in particular aqueous, aqueous-alcoholic or alcoholic media in connection with a solution, suspension, dispersion, colloidal solution or emulsion.
  • Typical examples are aqueous or alcoholic buffer systems as used in science and industry, industrial or non-industrial waste water, process waste water, fermentation residues or media, measuring services from medical or biological research, liquid or fluid contaminated sites and the like.
  • the sorbent according to the invention can contain further components as long as these do not unacceptably impair the adsorption of the nucleic acids and, if provided, their desorption.
  • additional components can include, but are not limited to, organic or inorganic binders (see below), other sorbents for biomolecules or other inorganic or organic substances of interest from the medium which are known to the person skilled in the art, or also carriers such as glass, plastic or ceramic materials or the like include.
  • the sorbent particles can be connected to larger agglomerates, granules or moldings by means of a suitable binder or applied to a carrier.
  • the shape and size of such superordinate structures, which contain the primary sorbent or layered silicate particles, depends on the particular application desired. It is therefore possible to use all shapes and sizes familiar to the person skilled in the art and suitable in individual cases. For example, in many cases agglomerates with a diameter of more than 10 ⁇ m, in particular more than 50 ⁇ m, may be preferred. In the case of a bed for chromatography columns and the like, a spherical shape of the agglomerates can be advantageous.
  • Possible carriers are, for example, calcium carbonate, plastics or ceramic materials.
  • binder Any binder familiar to the person skilled in the art can also be used, as long as the attachment or incorporation of the biomolecules in or onto the sorbent is not impaired too much or the status required for the respective application. bility of particle agglomerates or moldings is guaranteed.
  • a binder ' agar-agar, alginates, sane chitosan, pectins, gelatins, Lupinenproteinisolate or gluten.
  • the acid-activated phyllosilicates themselves already provide particularly favorable surfaces for the sorption of nucleic acids. According to the invention, there is therefore preferably no (additional) use or treatment of the layered silicate with cationic polymers and / or polycations (multivalent cations). Furthermore, according to the invention, preferably no other polymers (e.g. polysaccharides), polyelectrolytes, polyanions and / or complexing agents (for modifying the layered silicate) are used. According to a particularly preferred embodiment according to the invention, in particular no cationic polymer such as e.g. an aminated polysaccharide polymer or polycation is used. In particular, according to a further preferred embodiment of the invention, the acid-activated phyllosilicate used in accordance with the invention is not modified or treated with a (cationic) polymer or a polycation.
  • the invention relates to a method which comprises the following steps:
  • the method according to the invention for the attachment or incorporation of nucleic acids onto or into the sorbent can be used both for enrichment. (i.e. increasing the concentration of the desired nucleic acid molecule (s)) as well as depletion (i.e. reducing the concentration of the desired nucleic acid molecule (s)) or separation of several different nucleic acid molecules.
  • the sorbent containing the nucleic acid molecules can be disposed of in a further step.
  • the disposal can be carried out, for example, by thermal treatment to remove the layered silicate containing the biomolecules, it being possible to dispose of the layered silicate after the thermal disintegration of the nucleic acid molecules.
  • nucleic acids it is possible to specifically remove nucleic acids from media. This plays a major role in wastewater treatment, for example, since most states have strict legal regulations for removing nucleic acids and other biomolecules from wastewater.
  • the depletion or removal of nucleic acid molecules are carried out from culture media.
  • an undesirable increase in viscosity can occur in bioreactors due to the high concentration of nucleic acid molecules, in particular high-molecular nucleic acids, contained in the medium.
  • the method according to the invention can be used to remove the disruptive nucleic acid molecules from the culture medium in an efficient and biologically compatible manner.
  • the viscosity can also be adjusted to a desired level by adding the sorbent according to the invention to the culture medium.
  • nucleic acid molecules in many cases it is desirable to increase the concentration of nucleic acid molecules in a medium or to obtain these nucleic acid molecules as pure as possible.
  • the extraction or purification of desired nucleic acids from solutions is one of the standard procedures in biological and medical research.
  • the nucleic acid molecule can be desorbed or recovered from the sorbent in a further step, whereby the sorbent can also be used again, if appropriate after renewed acid activation of the layered silicate.
  • compositions with a sorbent and at least one nucleic acid molecule as defined in the present description preferably in a polar, in particular in an aqueous or alcoholic medium.
  • Another aspect of the present invention relates to the use of the sorbents according to the invention as inorganic vectors for introducing biomolecules into cells or as a pharmaceutical composition, in particular as a reservoir for the storage and controlled release of Biomolecules, preferably nucleic acids.
  • the sorbents according to the invention are also suitable for efficiently introducing these biomolecules into prokaryotic or eukaryotic cells.
  • biomolecules, in particular nucleic acids can be “packaged” in a particularly advantageous manner for introduction into cells. The basic mechanism of such an introduction using the example of DNA-LDH nanohybrids is described, for example, in the reference Choy et al. , Appl.
  • the stated (average) pore diameters, volumes and areas were determined using a fully automatic nitrogen adsorption measuring device (ASAP 2000, company Micretrics) according to the manufacturer's standard program (BET, BJH, t-plot and DFT).
  • the percentages of the proportion of certain pore sizes relate to the total pore volume of pores between 1.7 and 300 nm in diameter (BJH Adsorption Pore Distribution Report).
  • BJH Adsorption Pore Distribution Report As far as indicated, the porosimetry was carried out according to the CCl 4 method as follows:
  • the desiccator connected to the graduated cold trap, manometer and vacuum pump is now evacuated until the contents boil. 10 ml of carbon tetrachloride are evaporated and collected in the cold trap.
  • the contents of the desiccator are then left to balance for 16 to 20 hours at room temperature, and then air is slowly let into the desiccator. After removing the desiccator lid the weighing bottle is closed immediately and weighed back on the analytical balance.
  • Pore volume in ml / g substance Pore volume in ml / g substance.
  • an aqueous suspension with dist. Water was adjusted to pH 7 in each case.
  • the zeta potential of the particles was determined using the Zetaphoremeter II from Particle Metrix according to the principle of microelectrophoresis.
  • the speed of migration of the particles was measured in a known electric field.
  • the particle movements that take place in a measuring cell are observed with the aid of a microscope.
  • the direction of migration gives information about the type of charge (positive or negative) and the particle velocity is directly proportional to the electrical interfacial charge of the particles or to the zeta potential.
  • the particle movements in the measuring cell are captured by means of image analysis and After the measurement, the particle trajectories are calculated and the resulting particle velocity is determined.
  • a Mastersizer from Malvern was used according to the manufacturer's instructions. To determine the air, approx. 2-3 g (1 teaspoon) of the . Put the sample to be examined in the "dry powder feeder” and set it to the correct measuring range depending on the sample (the coarser the sample, the higher the weight).
  • a sample (approx. 1 knife tip) is placed in the water bath until the measuring range is reached (the coarser the higher the weight), and stirred for 5 minutes in an ultrasonic bath. The measurement is then carried out.
  • CEC Cation exchange capacity
  • strainer 63 ⁇ m
  • Erlenmeyer ground flasks 300 ml
  • Analytical balance Membrane filter, 400 ml
  • Cellulose nitrate filter 0.15 ⁇ m (from Sartorius); Drying oven; Reflux condenser; hot plate; Distillation unit, VAPODEST-5 (Gerhardt, No. 6550); Volumetric flask, 250 ml; Flame AAS
  • the NH 4 + bentonite is filtered off through a membrane filter and washed with deionized water (approx. 800 ml) until it is largely free of ions.
  • deionized water approximately 800 ml
  • Evidence of the freedom from ions in the wash water is carried out on NH 4 + ions using the sensitive Neßlers reagent.
  • the number of washes can vary between 30 minutes and 3 days depending on the key.
  • the washed-out NH 4 + clay is removed from the filter, dried at 110 ° C. for 2 hours, ground, sieved (63 ⁇ m sieve) and dried again at 110 ° C. for 2 hours.
  • the NH 4 + content of the clay is then determined by elemental analysis.
  • the CEC of the clay was determined in a conventional manner via the NH 4 + content of the NH 4 + clay, which was determined by elemental analysis of the N content.
  • the Vario EL 3 device from Elementar-Heraeus, Hanau, DE was used according to the manufacturer's instructions. The information is given in meq / 100 g clay (meq / lOOg).
  • a raw clay with a montmorillonite content between 70 to 80% is slurried in water and purified by centrifugation.
  • the slurry obtained is then subjected to acid activation.
  • the concentrations are adjusted so that 56% bentonite is mixed with 44% 36% by weight hydrochloric acid and boiled for 8 hours at a temperature of 95 to 99 ° C.
  • the mixture is then washed with water until the residual chloride content is less than or equal to 5%, based on the solid.
  • 10 g of solid are boiled in 100 ml of distilled water and . filtered through a pleated filter.
  • the filtrate is titrated with silver nitrate solution to determine the residual chloride content.
  • drying to a residual moisture of 8 to 10% by weight takes place.
  • the final product has a weight of 430 to 520 g / 1. By sieving or additional grinding can be particularly preferred. Set particle sizes.
  • Adsorbent 1 was characterized according to the BJH method and BET method (DIN 66131) with regard to the average pore diameter and the BET surface area. The following values resulted:
  • the DNA concentration was determined photometrically to determine the concentration in the adsorption experiments. A wavelength of 260 nm was set for the measurement. To calibrate the method with the DNA salt used, a measurement was carried out with a series of concentrations. The calibration line obtained was used for the photometric determination of the DNA concentration in the adsorption experiments.
  • a herring sperm DNA solution with a concentration of 1 mg / ml, 2 mg / ml, 5.63 mg / ml and 9.9 mg / 1 was prepared and adjusted to pH 8 using 10MM Tris / HCl and ImM EDTA , Then 0.1 g of the adsorbents were each mixed with 5 ml of the DNA solution and shaken for 1 hour at room temperature. The mixture was then centrifuged at 2500 rpm for 15 minutes and the supernatant was sterile filtered. Finally the DNA concentration in the supernatant was measured and from this the binding capacity for DNA was calculated. The results are summarized in the following table and in the following graphic: Table 5: DNA binding capacities
  • BK binding capacity -> converted into mg DNA based on 1 g of the adsorbents
  • elution is carried out with 1.5 molar sodium chloride solution in 10 M Tris HCL pH 8.5 for 1 hour (elution volume: 100 ml), 15 min. Centrifuged at 2000 rpm, the supernatant sterile filtered and the absorption measured.
  • the adsorbent type according to the invention has a significantly higher binding capacity than the comparison anion exchanger. Binding capacities of adsorbents which are commercially available according to the prior art are thus achieved or exceeded.
  • the adsorbents according to the invention have a much faster DNA binding because the corresponding amounts of DNA are already bound after 1 hour compared to the adsorption time of 16 hours for the comparison material.
  • the NIH-3T3 cell line is used for the transfection experiments. These are adherently growing mouse embryo fibroblasts. The doubling time is approximately 20 hours.
  • the cells are cultivated in the standard medium DMEM (with 4.5 g-1 "1 glucose) with 10% NCS. The cultivation takes place in an incubator at 37 ° C. under a humidified 5% CO 2 atmosphere.
  • the thawed cell suspension is placed in a monolayer bottle (25 cm 2 ) with 10 ml medium.
  • a direct cell number determination is not possible with adherently growing cells; the growth rate is controlled via the degree of coverage of the culture vessel.
  • the medium is decanted off, trypsin solution is added and incubated in the incubator for 10 min.
  • the detached cell suspension is mixed with approx. 15 ml serum-containing medium to block the trypsin.
  • the centrifuged cells are resuspended in fresh medium and reseeded in a dilution of 1:10.
  • the adsorbent-1 samples specified at the outset were "loaded" with the plasmid pQBI25-fCl (Quiagen, Heidelberg) before the transfection. For this, 10 mg of the respective adsorbent-1 sample were weighed out and washed with ethanol for sterilization. Then 2 ml of sterile, distilled. Water is added, vortexed briefly and centrifuged for 3 minutes at 5000 rpm. 1.5 ml of sterile plasmid DNA with a concentration of 1.45 ml-ml -1 were added to the residue and shaken at 250 rpm for 16 h at room temperature.
  • the DNA-Adsorbent-1 hybrid was suspended in 10 ml of distilled, sterile water.
  • the transfection with adsorbent-1 as a vector was carried out with two different concentrations of DNA adsorbent-1 hybrid performed.
  • the NIH-3T3 cells were sown 24 h before the transfection with a density of 1-2-10 5 cell-cm "2 in 6-hole plates and in the incubator at 37 ° C under humidified 5% CO 2 - The amounts given relate to one hole in the 6-hole plate and were analyzed 48 hours after the start of the transfection with the fluorescence microscope.
  • Transfected cells can be recognized by the GFP production, when illuminated with 474 nm they light up Viewing in a fluorescent microscope green.
  • the medium was removed immediately before the experiment and 1.5 ml of new medium were added. 25 and 100 ⁇ l of the DNA adsorbent 1 suspension were added and incubation was carried out for 3 hours. The medium was then changed and incubated for a further 45 h.
  • the medium was removed immediately before the experiment and 1.5 ml of new medium was added. 25 and 100 ⁇ l of the suspension were added and incubation was carried out for 24 hours. The medium was then changed and incubated for a further 24 h.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Entfernung oder Gewin­nung von mindestens einem Nukleinsäuremolekül aus einem wässri­gen oder alkoholischen Medium mit Hilfe eines Sorptionsmittels, wobei das Sorptionsmittel mindestens ein säureaktiviertes Schichtsilicat umfasst, eine Zusammensetzung enthaltend das vorstehende Sorptionsmittel sowie dessen bevorzugte Verwendun­gen.

Description

PATENTANMELDUNG
SORPTIONSMITTEL FÜR NUKLEINSÄUREN, ENTHALTEND SAUREAKTIVIERTES S CH I CHTS I L I CAT
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Anreicherung, Abrei- cherung, Entfernung, Gewinnung oder Auftrennung von Nukleinsäu- remolekülen mit Hilfe eines Sorptionsmittels, wobei das Sorptionsmittel mindestens ein säureaktiviertes Schichtsilicat um- fasst. Bevorzugte Verwendungen eines solchen Sorptionsmittels werden ebenfalls offenbart.
Die Abtrennung bzw. Aufreinigung von Biomolekülen hat eine immer weiter steigende technische und wissenschaftliche Bedeutung. So sind Trennprozesse zur Aufreinigung oder Abrei- cherung von DNA einerseits für die Grundlagenforschung von Bedeutung, wobei genetisches Material z.B. isoliert und gereinigt werden muss, um genetisch modifizierte Organismen zu erzeugen. Dies wird derzeit aber auch immer mehr in industrieller Anwendung durchgeführt. So werden bereits einige in der Medizin verwendete Wirkstoffe gentechnisch hergestellt.
Ein weiteres Anwendungsfeld für solche Trennprozesse bzw. die dazu eingesetzten Adsorbentien stellt die Abreicherung von DNA in Abwässern dar, insbesondere bei Produktionsprozessen mit genetisch modifizierten Organismen, wie z.B. Bakterien oder Pilzen.
Im Stand der Technik sind bereits eine Vielzahl von Adsorbentien bekannt, insbesondere solche, die auf silanisierten Si- licatpartikeln (Kieselgel) oder funktionalisierten Cellulosen basieren.
In der ÜS-A 4,029,583 wird ein zur Trennung von Proteinen, Peptiden und Nukleinsäuren geeignetes chromatographisches Trägermaterial aus Silicagel beschrieben, welches einen Hohlraumdurchmesser von bis zu 50 nm aufweist, und an das mittels eines Silanisierungsreagenzes eine stationäre Phase mit Anio- nen- oder Kationenaustauscher bildenden Gruppen gebunden ist, die mit den zu trennenden Substanzen in Wechselwirkung treten. Das silanisierte Silicagel wird mit Wasser in Berührung gebracht, wobei die Gefahr besteht, dass die stationäre Phase polymerisiert und die Poren des Trägermaterials schließt.
Ge äss der EP-B 0 104 210 können Nukleinsäuregemische mit hoher Auflösung und bei hoher Durchsatzgeschwindigkeit in ihre Bestandteile aufgetrennt werden, wenn ein chromatographisches Trägermaterial verwendet wird, bei dem der Durchmesser der Hohlräume das ein- bis zwanzigfache der größten Abmessung der jeweils zu isolierenden Nukleinsäure oder der größten Abmessung der größten aller im Gemisch enthaltenen Nukleinsäuren beträgt. Zur Herstellung des chromatographischen Trägermaterials wird dieses zunächst mit einem Silani- sierungsreagenz umgesetzt, welches eine flexible Kettengruppe aufweist, die ihrerseits wiederum durch Reaktion mit einem Anionen- oder Kationenaustauscher bildenden Reagenz zum fertigen Trägermaterial umgewandelt wird.
Die EP 0 496 822 (WO 91/05606, DE 393 50 98) beschreibt ein chromatographisches Trägermaterial, dessen Hohlräume die ein- bis zwanzigfache Größe der größten Abmessung der zu trennenden Nukleinsäuren aufweisen, welches dadurch erhältlich ist, dass ein Ausgangsträgermaterial einer Hohlraumgröße von 10 bis 1000 nm, einer spezifischen Oberfläche von 5 bis 800 m2/g und einer Korngröße von 3 bis 500 μm mit einem Silanisie- rungsreagenz umgesetzt wird, das dadurch gekennzeichnet ist, dass das Silanisierungsreagenz mindestens eine bereits mit einem primären oder sekundären Hydroxyalkylamin umgesetzte reaktive Gruppe aufweist oder eine mit einem Hydroxyalkylamin umsetzbare reaktionsfähige Gruppe wie eine Epoxygruppe oder Halogenatome enthält, die in einer weiteren Reaktionsstufe mit einem Hydroxyalkylamin zur Reaktion gebracht wird.
Der Artikel von T. G. Lawson et al . , "Separation of synthetic oligonucleotides on columns of microparticulate", Analytical Biochemistry (1983), 133(1), 85-93, beschreibt die Trennung von synthetischen Oligonukleotiden an Säulen basierend auf mikropartikulärem Siliciumdioxid oder Kieselgel, welches mit vernetztem Polyethylenimin beschichtet wurde. Die Beschichtung wurde hierbei durch ein Durchpumpen der Polyethylenimin- lösung durch die Kieselgelsäule erzielt. Das in diesem Artikel beschriebene Verfahren lässt sich nur für Kleinmengen einsetzen. Weiterhin bezieht sich dieser Artikel nur auf mit Polyethylenimin modifizierte Kieselgelpartikel. Weitere Adsorbentiensysteme sind in der US 2003003272, der EP 1 162 459 und der EP 281 390 beschrieben. Der Artikel "Nuk- leinsäureaufreinigung durch Kationen-Komplexierung" von Prof. Dr. Michael Lorenz, Molzym GmbH & Co. KG, Bremen in Laborwelt Nr. 4/2003, Seite 40, beschreibt ein neues Verfahren zur Nuk- leinsäureaufreinigung mit speziellen Mini Spin Säulen. Lt. Angaben des Artikels beruhen diese auf einer Matrix, in der ein Tonmineral mit Sand vermischt wurde. Zur Art der Tonminerale ist nichts ausgesagt.
Nachteilig an den Sorptionssystemen des Standes der Technik ist, dass sie entweder verhältnismäßig teuer sind oder in der Bindungskapazität, der Bindungskinetik und/oder der Wiedergewinnungsrate der absorbierten Nukleinsäure (n) nicht den Anforderungen entsprechen. Aufgrund der steigenden Bedeutung der Abtrennung oder Aufreinigung von Nukleinsäuren aus unterschiedlichen Medien besteht ein ständiger Bedarf nach verbesserten Sorptionsmitteln für Nukleinsäuren.
Der vorliegenden Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Sorptionsmittel für Nukleinsäuren bereitzustellen, das in einem Verfahren zur An- oder Abreicherung, zur Entfernung oder Gewinnung, oder zur Auftrennung von Nukleinsäuren vorteilhaft eingesetzt werden kann und die Nachteile des Standes der Technik vermeidet .
Erstaunlicherweise wurde nun gefunden, dass sich zur Lösung dieser Aufgabe besonders vorteilhaft Sorptionsmittel verwenden lassen, die mindestens ein säureaktiviertes Schichtsili- cat umfassen. Solche säureaktivierten Schichtsilicate zeigen eine überraschend hohe Bindekapazität für Nukleinsäuren, die diejenige von kommerziellen Adsorptionssystemen des Standes der Technik noch übertrifft . Weiterhin zeigen sie eine beson- ders rasche Bindungskinetik. Vorteilhaft ist außerdem, dass sich die gebundene Nukleinsäure praktisch quantitativ wieder von dem Sorptionsmittel entfernen lässt .
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Sorption, An- oder Abreicherung, Entfernung, Gewinnung oder Auftrennung von mindestens einem Nukleinsäuremo- lekül, vorzugsweise aus einem polaren, insbesondere einem wässrigen oder alkoholischen Medium mit Hilfe eines Sorptionsmittels, wobei das Sorptionsmittel mindestens ein säureaktiviertes Schichtsilicat umfasst.
Die hier offenbarten Sorptionsmittel sind somit sowohl geeignet Nukleinsäuren aufzutrennen, als auch aus entsprechenden Lösungen/Medien an- oder abzureichern, um sie zu gewinnen oder zu entfernen: Die fast quantitative Widerfindungsrate bei Elution mit geeigneten, in der Regel hochsalzhaltigen Puffern zeigt, dass es auch möglich ist, die gebundene Nukleinsäure wieder zurückzugewinnen. Die Einsatzgebiete für solche Sorptionsmittel sind vielfältig. Ohne dass diese Erfindung auf die folgenden Beispiele beschränkt ist, sollen einige möglichen Anwendungen angeführt werden: Denkbar ist z.B. eine Abtrennung von Nukleinsäuren aus einem Vielstoffge- misch oder die Abreicherung von DNA aus Abwässern aus biotechnologischen Produktionsrückständen mit genetisch modifizierten Organismen. Allgemein kann das erfindungsgemäße Sorptionsmittel auch für alle molekularbiologischen, mikrobiologischen oder biotechnologischen Methoden im Zusammenhang mit Nukleinsäuren, insbesondere deren An- oder Abreicherung, Auftrennung, transienter oder permanenter Immobilisierung oder sonstiger Verwertung eingesetzt werden. Beispielhafte Methoden und Verfahren finden sich in einschlägigen Lehrbüchern wie Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbour Press 2001 und sind dem Fachmann geläufig. Auch im Rahmen der chromatographischen Auftrennung von Nukleinsäuren kann das vorliegende Sorptionsmittel. eingesetzt werden. Unter Nukleinsäuren sind dabei in erster Linie DNA- und RNA-Spezies zu verstehen, einschließlich von genomischer DNA und cDNA sowie deren Fragmente, mRNA, tRNA, rRNA sowie weitere Nukleinsäurederivate natürlichen oder synthetischen Ursprungs mit beliebiger Länge.
Ein weiterer Bereich stellt die Auftrennung von Nukleinsäure- Gemischen, beispielsweise über eine das erfindungsgemäße Sorptionsmittel enthaltende Matrix (Träger) , dar. Die erfindungsgemäßen Adsorbentien sind jedoch prinzipiell auch geeignet für die Abtrennung oder Aufreinigung von Proteinen und anderen Biomqlekülen. Unter Biomolekül wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Molekül verstanden, das als Bausteine Nukleotide bzw. Nukleoside (Nukleobäsen) , Aminosäuren, Monosaccharide und/oder Fettsäuren aufweist. Nach einem Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst die Bezugnahme in der Beschreibung auf "Nukleinsäure(molekül) " also auch andere Biomoleküle. Besonders bevorzugt ist jedoch die Verwendung zur Sorption von Nukleinsäuren.
Als Ausgangsstoffe für die erfindungsgemäß eingesetzten Schichtsilicate können alle natürlichen oder synthetischen Schichtsilicate oder deren Mischungen verwendet werden, die sich durch eine Säure aktivieren lassen, d.h. in denen Kationen in den Zwischenschichten gegen Protonen ausgetauscht werden können. Bevorzugt sind Zwei-, und insbesondere Drei- schichtsilicate. Säureaktivierbare Schichtsilicate sind dem Fachmann geläufig und umfassen insbesondere die smektitischen oder montmorillonithaltigen Schichtsilicate, wie Bentonit. Allgemein können sowohl sogenannte naturaktive als auch nicht-naturaktive Schichtsilicate verwendet werden, insbesondere di- und trioktaedrische Schichtsilicate der Serpentin-, Kaolin- und Talkpyrophylitgruppe, Smektite, Vermiculite, 11- lite und Chlorite sowie solche der Sepiolith-Palygorskit- Gruppe, wie z.B. Montmorillonit, Natronit, Saponit und Vermi- culit oder Hectorit, Beidellit, Palygorskit sowie Wechsellagerungsminerale (mixed layer mineral) . Natürlich können auch Gemische aus zwei oder mehreren der vorstehenden Materialien eingesetzt werden. Weiterhin kann das erfindungsgemäß eingesetzte Schichtsilicat auch noch weitere Bestandteile enthalten (auch z.B. nicht säureaktivierte Schichtsilicate), welche die vorgesehene Verwendung des säureaktivierten Tones, insbesondere dessen Sorptionsfähigkeit nicht beeinträchtigen oder sogar nützliche Eigenschaften aufweisen.
Besonders bevorzugt sind Schichtsilicate aus der Montmorillo- nit/Beidellit Reihe wie z.B. Montmorillonit, Bentonit, Natronit, Saponit und Hectorit. Am meisten bevorzugt sind Bentoni- te, da hier überraschend besonders vorteilhafte Bindungskapazitäten und -kinetiken für Nukleinsäuren erzielt werden.
Als besonders brauchbar haben sich auch Verwitterungsprodukte von Tonen mit einer spezifischen Oberfläche von mehr als 200 m/g, einem Porenvolumen von mehr als 0,5 ml/g und einer Ionenumtauschfähigkeit von mehr als 40 meq/lOOg in säureaktivierter Form erwiesen. Besonders bevorzugt werden nach dieser speziellen Ausführungsform zur Säureaktivierung Rohtone, deren Ionenumtauschfähigkeit über 50 meq/lOOg, vorzugsweise- im Bereich von 55 bis 85 meq/lOOg liegen. Die spezifische BET- Oberflache liegt besonders bevorzugt im Bereich von 200 bis 280 τn2./g, insbesondere zwischen 200 und 260 m/g. Das Porenvolumen liegt vorzugsweise im Bereich von 0,7 bis 1,0 ml/lOOg, insbesondere im Bereich von 0,80 bis 1,0 ml/lOOg. Die Säureaktivierung solcher Rohtone kann wie hierin näher spezifiziert durchgeführt werden. Solche Tone sind beispielsweise in der DE 103 56 894.8 der gleichen Anmelderin beschrieben, die diesbezüglich ausdrücklich durch Bezugnahme in die vorliegende Beschreibung aufgenommen wird.
Es wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch gefunden, dass insbesondere die zweischichtigen und die dreischichtigen Schichtsilicate bereits ohne Säureaktivierung vorteilhaft zur Sorption von Nukleinsäuren und anderen Biomolekülen verwendet werden können. Besonders bevorzugt sind dabei die smektitischen Schichtsilicate (s.o.) wie Bentonit. Nach einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung kann also ein nicht aktiviertes Schichtsilicat anstelle des säureaktivierten Schichtsilicats, oder eine Mischung aus beiden als erfindungsgemäßes Sorptionsmittel eingesetzt werden. Ansonsten gelten die in Bezug auf das Verfahren und die Verwendung des Sorptionsmittels genannten Angaben in der vorliegenden Beschreibung entsprechend.
Nac einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform basiert das erfindungsgemäß eingesetzte Sorptionsmittel jedoch auf mindestens einem säureaktivierten Schichtsilicat, • d.h. mindestens 50 Gew.-%, vorzugsweise mindestens 75 Gew.-%, weiter bevorzugt mindestens 90 Gew.-%, insbesondere mindestens 95 Gew.-% oder sogar mindestens 98 Gew.-% des erfindungsgemäßen Sorptionsmittels bestehen aus einem (oder mehreren) säureaktivierten Schichtsilicat (en) , wie hierin definiert. Nach einer bevorzugten Ausführungsform wird kein Silica oder Silicagel verwendet. Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungs- form besteht das erfindungsgemäße Sorptionsmittel im Wesentlichen oder vollständig aus mindestens einem säureaktivierten Schichtsilicat. Das erfindungsgemäß eingesetzte Sorptionsmittel kann jedoch auch mit anderen dem Fachmann geeignet erscheinenden Sorptionsmitteln oder weiteren Komponenten zusammen eingesetzt werden, beispielsweise im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens gemäß Anspruch 1. Nach einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform weist das säureaktivierte Schichtsilicat einen durchschnittlichen Porendurchmesser, bestimmt nach der BJH-Methode (DIN 66131) , zwischen etwa 2 nm und 25 nm, insbesondere zwischen etwa 4 und etwa 10 nm auf.
Nach einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform liegt das Porenvolumen, bestimmt nach der CCl4-Methode gemäß Methodenteil, von Poren bis 80 nm Durchmesser zwischen etwa 0,15 und 0,80 ml/g, insbesondere zwischen etwa 0,2 und 0,7 ml/g. Die entsprechenden Werte für Poren bis zu 25 nm Durchmesser liegen im Bereich zwischen etwa 0,15 und 0,45 ml/g, insbesondere 0,18 bis 0,40 ml/g. Die entsprechenden Werte für Poren bis zu 14 nm liegen im Bereich zwischen etwa 0,10 und 0,40 ml/g, insbesondere etwa 0,12 bis 0,37 ml/g. Die Porenvolumina für Poren zwischen 14 und 25 nm Durchmesser können beispielsweise zwischen 0,02 und 0,3 ml/g liegen. Das Porenvolumen von Poren mit 25 bis 80 nm kann beispielsweise im gleichen Bereich liegen.
Über die Bedingungen bei der Säureaktivierung der Schichtsilicate, d.h. insbesondere die Menge bzw. Konzentration der eingesetzten Säure, der Temperatur und der Dauer der Säurebehandlung, kann auch die Porosimetrie der säureaktivierten Schichtsilicate gezielt beeinflusst werden kann. So kann z.B. durch eine stärkere Säureaktivierung mit einer erhöhten Säuremenge oder bei einer erhöhten Temperatur über eine längere Zeitdauer eine größere Porosität der Schichtsilicate bewirkt werden, vor allem im Bereich der kleineren Poren mit einem Durchmesser von weniger als 50 nm, insbesondere weniger als 10 nm, bestimmt nach der CC14- Methode gemäß Methodenteil. So kann durch eine Erhöhung der zur Säureaktivierung verwendeten Säuremenge das Mikroporenvolumen des Schichtsilicats gesteigert werden. Gleichzeitig nimmt die Kationenaustauschkapazität ab. Somit kann für die jeweils interessierende Nukleinsäurespezies die Sorptionsfähigkeit des säureaktivierten Schichtsilicats bzw. dessen Ab- und Desorptionsra- te über die Säureaktivierung im Einzelfall, anhand routinemäßiger Untersuchung einer Reihe unterschiedlich säureaktivierter Schichtsilicate, optimiert werden. Beispielsweise können über die Säureaktivierung die Poren/Hohlräume in den erfindungsgemäßen Sorptionsmitteln in der gemäß EP 0 104 210 oder US 4,029,583 (s.o.) vorgesehenen Weise modifiziert werden.
Die erfindungsgemäß eingesetzten säureaktivierten Schichtsilicate werden allgemein dadurch hergestellt, dass man Schichtsilicate mit mindestens einer Säure behandelt. Dazu werden die Schichtsilicate mit der (den) Saure (n) in Kontakt gebracht. Im Prinzip kann dabei jedes dem Fachmann geläufige Verfahren zur Säureaktivierung von Schichtsilicaten verwendet werden, einschließlich der in der WO 99/02256, der US- 5,008,226 und der US-5,869,415 beschriebenen Verfahren, die insoweit ausdrücklich durch Bezugnahme in die Beschreibung aufgenommen werden. Es können allgemein beliebige organische oder anorganische Säuren oder deren Gemische verwendet werden. Beispielsweise kann ein Aufsprühen von Säure nach einem sogenannten SMBE Prozess (Surface Modified Bleaching Earth) erfolgen. Hier findet die Aktivierung an der Oberfläche der Schichtsilicate statt, ohne dass in einer Lösung bzw. Dispersion gearbeitet wird.
Bei einer ersten Ausführungsform wird somit die Aktivierung des Schichtsilicats in wässriger Phase durchgeführt. Dazu wird die Säure als wässrige Lösung mit dem Schichtsilicat in Kontakt gebracht. Es kann dabei so vorgegangen werden, dass zunächst das Schichtsilicat, welches vorzugsweise in Form eines Pulvers bereitgestellt wird, in Wasser aufgeschlämmt wird. Anschließend wird die Säure (z.B. in. konzentrierter Form) zugegeben. Das Schichtsilicat kann jedoch auch direkt in einer wässrigen Lösung der Säure aufgeschlämmt werden, oder die wässrige Lösung der Säure auf das Schichtsilicat aufgegeben werden. Nach einer vorteilhaften Ausführungsform kann die wässrige Säurelδsung beispielsweise auf ein vorzugsweise gebrochenes oder pulverförmiges Schichtsilicat aufgesprüht werden, wobei die Wassermenge bevorzugt möglichst gering gewählt wird und z.B. eine konzentrierte Säure bzw. Säurelösung eingesetzt wird. Die Säuremenge kann vorzugsweise zwischen 1 und 10 Gew.-%, besonders bevorzugt zwischen 2 und 6 Gew.-% einer Säure, insbesondere einer starken Säure, z.B. einer Mineralsaure wie Schwefelsäure, bezogen auf das wasserfreie Schichtsilicat (atro) , gewählt werden. Soweit erforderlich, kann überschüssiges Wasser abgedampft und das aktivierte Schichtsilicat dann bis zur gewünschten Feinheit gemahlen werden. Wie bereits oben erläutert, ist auch bei dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kein Waschschritt erforderlich, aber möglich. Nach Aufgabe der wässrigen Lösung der Säure wird lediglich, soweit erforderlich, bis zum Erreichen des gewünschten Feuchtigkeitsgehalts getrocknet. Meist wird der Wassergehalt des erhaltenen säureaktivierten Schichtsilicats auf einen Anteil von weniger als 20 Gew.-%, bevorzugt weniger als 15 Gew.-%, eingestellt.
Für die oben beschriebene Aktivierung mit einer wässrigen Lösung einer Säure bzw. einer konzentrierten Säure kann die Säure an sich beliebig gewählt werden. Es können sowohl Mineralsäuren, als auch organische Säuren oder Gemische der vorstehenden Säuren verwendet werden. Es können übliche Mineralsäuren verwendet werden, wie Salzsäure, Phosphorsäure oder Schwefelsäure, wobei Schwefelsäure bevorzugt ist. Es können konzentrierte oder verdünnte Säuren bzw. Säurelösungen verwendet werden. Als organische Säuren können Lösungen von z.B. Citronensäure oder Oxalsäure verwendet werden. Eine weitere bevorzugte Aktivierungsmöglichkeit stellt das Kochen der Schichtsilicate in einer Säure, insbesondere Salzoder Schwefelsäure, dar. Hierbei lassen sich durch die geeigneten Konzentrationen an Säure und Kochzeiten unterschiedliche Aktivierungsgrade einstellen und die Porenvolumenvertei- lung lässt sich gezielt einstellen. Solche aktivierten Schichtsilicate werden häufig auch als Bleicherden bezeichnet. Nach dem Trocknen der Materialien werden diese nach gängigen Verfahren gemahlen.
Bei der "klassischen" Aktivierung, die erfindungsgemäß in vielen Fällen bevorzugt wird, wird bei Temperaturen um etwa 100 °C bis zum Kochpunkt (Siedepunkt) aktiviert. Demgegenüber wird bei dem SMBE-Verfahren üblicherweise bei Raumtemperatur gearbeitet, wobei erhöhte Temperaturen in Einzelfällen bessere Säureaktivierungen ermöglichen. Der Einfluss der Temperatur ist jedoch beim SMBE-Verfahren weit geringer als bei der "klassischen" Aktivierung (sogenanntes HBPE-Verfahren) . Die Verweilzeit (Dauer der Säureaktivierung) liegt beim HBPE- Verfahren z.B. zwischen ca. 8 Stunden, z.B. bei Verwendung von Salzsäure, und 12 bis 15 Stunden z.B. bei Verwendung von Schwefelsäure. Im Unterschied zum SMBE-Verfahren wird beim HBPE-Verfahren die Schichtstruktur angegriffen, woraus Bereiche mit Kieselsäure resultieren, neben strukturell weitgehend unveränderten Arealen. Beim SMBE-Verfahren werden beispielsweise 3 Gew.-% H2S04 aufgegeben (100 + 3). Die Analyse des aufgearbeiteten Materials ergibt dann üblicherweise Säuregehalte im Bereich von 0,4 bis 1,0%, d.h. ein Großteil der Säure wird verbraucht (Austausch H+-Ionen gegen andere Kationen etc.). Ein geringer Teil wird gegebenenfalls durch enthaltenen Kalk verbraucht. Beim SMBE-Verfahren liegen die Kontaktzeiten mit der Säure labormäßig häufig bei etwa 15 Minuten. Es wurde gefunden, dass je nach verwendetem Schichtsilicat eine Aktivierung mit geringen Säuremengen bereits ausreichen kann, um überraschend gute Sorptionsmittel zu erhalten.
Nach einer besonders bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungs- form wird das Schichtsilicat in einer Weise aktiviert, dass die Kationenaustauschkapazität (Cation Exchange Capacity, CEC) des eingesetzten säureaktivierten Schichtsilicats bei weniger als 50 meq/100 g, insbesondere bei weniger als 40 meq/ 100 g liegt. Besonders bevorzugt erfolgt dabei die Aktivierung mittels einer mindestens 1 molaren, insbesondere mindestens 2 molaren Säurelösung bei erhöhter Temperatur, insbesondere bei mehr als 30°C, weiter bevorzugt mehr als 60°C. Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird zur vorteilhaften Aktivierung der Schichtsilicate eine Säure mit einem pKs-Wert von weniger als 4, insbesondere weniger als 3, weiter bevorzμgt weniger als 2,5 eingesetzt. Bevorzugt werden z.B. starke mineralische Säuren, insbesondere Salzsäure, Schwefelsäure oder Salpetersäure bzw. deren Mischungen, insbesondere in konzentrierter Form eingesetzt. Die bevorzugte Säuremenge liegt bei mehr als 1 Gew.-%, insbesondere mehr als 2 Gew.-%, besonders bevorzugt mindestens 3 Gew.-% Säure, weiter bevorzugt mindestens 4 Gew.-% Säure bezogen auf die zu aktivierende Schichtsilicatmenge (bestimmt nach Trocknung bei 130°C) . Nach einer besonders bevorzugten erfindungsgemäßen Aus- führungsform werden durch die Säureaktivierung des Schichtsilicats die austauschbaren (Metall-) Kationen .(Zwischenschicht- Kationen) im wesentlichen vollständig gegen Protonen ausgetauscht, d.h. zu mehr als 90%, insbesondere mehr als 95%, besonders bevorzugt mehr als 98%. Dies kann anhand der CEC und deren Ionenanteilen vor bzw< nach der Säureaktivierung bestimmt werden.
Nach einer Ausführungsform ist es bei der Säureaktivierung nicht erforderlich, dass die überschüssige Säure und die bei der Akti- vierung entstehenden Salze ausgewaschen werden. Vielmehr wird nach Aufgabe der Säure, wie bei der Säureaktivierung üblich, kein Waschschritt durchgeührt, sondern das behandelte Schichtsilicat getrocknet und dann auf die gewünschte Korngröße vermählen. Beim Vermählen wird meist eine typische Bleicherdefeinheit eingestellt. Dabei liegt der Trockensiebrückstand auf einem Sieb mit einer Maschenweite von 63 μm im Bereich von 20 bis 40 Gew.- %. Der Trockensiebrückstand auf einem Sieb mit einer Maschenweite von 25 μm liegt im Bereich von 50 bis 65 Gew.-%.
Das er indungsgemäß eingesetzte Sorptionsmittel kann in Form eines Pulvers, Granulats oder eines beliebig geformten Formkörpers eingesetzt werden. Bei Pulvern bietet sich der Einsatz in Form von Suspensionen des Sorptionsmittels in den das mindestens eine Nukleinsäuremolekül enthaltenden Medien an. Andererseits lassen sich durch eine gröbere Vermahlung auch Partikel einstellen, die die in der Chromatographie übliche Korngrößenverteilung zeigen, so dass sich die Materialien auch zu Schwerkraftsäulen oder Chromatographiesäulen packen lassen. Generell kann die Verwendung der Sorptionsmittel in jeder beliebigen Form einschließlich von geträgerten bzw. immobilisierten Formen erfolgen. Beispielsweise ist auch ein Einsatz bei der Auftrennung von verschiedenen Nukleinsäure- komponenten anhand ihres Molekulargewichts denkbar. Die Anwendungsform der er indungsgemäßen Adsorbentien ist dabei nicht auf die angeführten Beispiele beschränkt .
Allgemein wird die Korn- bzw. Formkörpergröße des erfindungsgemäß als Sorptionsmittel verwendeten säureaktivierten Schichtsilicats also von der jeweiligen Anwendung abhängen. Alle Korngrößen bzw. Agglomeratgroßen sind hier möglich. Beispielsweise kann das säureaktivierte Schichtsilicat in Pulverform, insbesondere mit einem D50-Wert von 1 bis 1.000 μm insbesondere von 5 bis 500 μm eingesetzt werden. Typische brauchbare Granulate liegen im Bereich (D50) zwischen 100 μm bis 5.000 μm, insbesondere 200 bis 2.000 μm Teilchengröße . Bei vielen Anwendungen kann vorteilhaft auf Formkörper aus bzw. mit den säureaktivierten Schichtsilicaten zurückgegriffen werden, beispielsweise bei Chromato- graphiesäulen, einschließlich von Schwerkraft- oder Zentrifuga- tionssäulen, Festphasenchromatographien, Filterpatronen, Membranen etc..
Nach einer besonders bevorzugten, erfindungsgemäßen Ausführungsform kann, wie vorstehend erwähnt, das erfindungsgemäß eingesetzte Sorbens in immobilisierter Form vorliegen. Beispielsweise kann das Sorbens in eine Filterpatrone, eine HPLC-Patrone oder eine vergleichbare Darreichungsform eingebettet sein. Auch eine Einbettung in Gele, wie z.B. Agarose- gele oder andere gelartige oder matrixartige Strukturen ist bevorzugt möglich. Solche Applikationen werden häufig im Rah-r- men von sogenannten Kits zur Au reinigung von Nukleinsäure o- lekülen verkauft, wie z.B. die Produkte der Firma Quiagen, wie' Quiagen genomic tip oder dergleichen. Dabei wird allgemein das die interessierenden Nukleinsäuremoleküle enthaltende Medium durch eine das Sorbens enthaltende Säule bzw. Filterpatrone oder dergleichen geschickt. Anschließend kann mit geeigneten Puffern gewaschen werden, um' anhaftende Verunreinigungen zu entfernen. Es folgt schließlich ein Elutions- schritt zur Gewinnung der interessierenden Nukleinsäuremoleküle .
Nach einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausfüh- rungsform weist das säureaktivierte Schichtsilicat eine BET- Oberfläche (bestimmt nach DIN 66131) von mindestens 50 bis 800 m/g, insbesondere mindestens 100 bis 600 m2/g, besonders bevorzugt von mindestens 130 bis 500 m2/g, auf. Durch die hohe Oberfläche wird offenbar die Interaktion mit der Nukleinsäure erleichtert, wobei die Desorptionsmöglichkeit überraschend erhalten bleibt .
Nach einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform handelt es sich bei den Nukleinsäuren um DNA- oder RNA-Moleküle in doppelstrangiger oder einsträngiger Form mit einem oder mehreren Nukleotidbaust einen.
In Bezug auf- Nukleinsäuren ist das erfindungsgemäße Verfahren besonders vorteilhaft bei Medien, die Oligonukleotide bzw . Nukleinsäuren mit mindestens 10 Basen (paaren) , vorzugsweise mit mindestens 100 Basen (paaren) , insbesondere mindestens 1000 Base (paaren) enthalten. Natürlich lässt sich dass erfindungsgemäße Verfahren auch bei Nukleinsäuren zwischen 1 und 10 Basen (paaren) einsetzen bzw . bei recht großen Nuklein- säuremolekülen, wie Plasmiden oder Vektoren mit beispielsweise 1 bis 50 kB oder längeren genomischen oder c-DNA-Frag- menten . Genauso umfasst sind Restriktionsverdaute DNA- und RNA- Fragmente, synthetische oder natürliche Oligo- und Polymere aus Nukleinsäuren, Cosmide etc .
Von Interesse ist z . B . die chromatographische Trennung von biologischen Makromolekülen wie langkettigen Oligonukleotiden, hochmolekularen Nukleinsäuren, tRNA, 5S-rRNA, anderen rRNA- Spezies , einsträngiger DNA, doppelstrangiger DNA (z .B . Plasmide oder Bruchstücke genomischer DNA) etc . . Dabei kann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren überraschend eine verbesserte Auflösung bei hoher Durchsatzgeschwindigkeit erzielt werden. Die verwendeten Trägermaterialien sind dabei in einem weiten Temperaturbereich einsetzbar und zeigen eine hohe Beladbarkeit . Auch zeigt das Trägermaterial eine hohe Druckbeständigkeit und eine lange Lebensdauer. Auch steigt der Bedarf an hochreinen Nukleinsäuren, wie z.B. hochreine Plasmid DNA für moderne biotechnologische, aber auch medizinische Entwicklung, wie z.B. auf dem Gebiet der Gentherapie. Die im Stand der Technik bekannten Protokolle zur hochreinen Aufreinigung von Nukleinsäuren sind dabei häufig kosten- und/oder zeitintensiv, nicht geeignet zum Einsatz im Großmaßstab oder für therapeutische Zwecke nicht sicher genug, da toxische Lösungsmittel oder Enzyme tierischer Herkunft, wie z.B. RNAse verwendet werden.
Allgemein kann das erfindungsgemäße Sorptionsmittel in jeglichen Medien eingesetzt werden. Bevorzugt sind polare Medien, in denen die interessierenden Biomoleküle bzw. Nukleinsäure in der Regel enthalten sind.
Unter den besonders bevorzugten wässrigen oder alkoholischen Medien werden erfindungsgemäß alle wasser- oder alkoholhaltigen Medien, einschließlich wässrig-alkoholische Medien, verstanden. Allgemein sind auch alle Medien umfasst, in denen Wasser mit anderen Lösungsmitteln vollständig mischbar bzw. vollständig gemischt ist. Anzuführen sind, insbesondere Alkohole, wie Methanol, Ethanol sowie C3- bis C10-Alkohole mit einer oder mehreren OH-Gruppen oder auch Säuren. Denkbar sind also auch mit Wasser vollständig mischbare Lösemittel sowie deren Mischungen mit Wasser und Alkohol. Insbesondere handelt es sich in der Praxis hierbei um wässrige, wässrig-alkoholische oder alkoholische Medien im Zusammenhang mit einer Lösung, Suspension, Dispersion, kolloidalen Lösung oder Emulsion.
Typische Beispiele sind wässrige oder alkoholische Puffersysteme, wie sie in der Wissenschaft und Industrie verwendet werden, industrielle oder nicht-industrielle Abwässer, Prozessbrauchwässer, Fermentationsrückstände bzw. -medien, Me- dien aus der medizinischen oder biologischen Forschung, flüssige oder fluide Altlasten und dergleichen.
Das erfindungsgemäße Sorptionsmittel kann weitere Komponenten enthalten, solange diese die Adsorption der Nukleinsäuren, und soweit vorgesehen, auch deren Desorption nicht inakzeptabel beeinträchtigt. Solche zusätzlichen Komponenten können, ohne hierauf beschränkt zu sein, organische oder anorganische Bindemittel (siehe unten), weitere dem Fachmann geläufige Sorptionsmittel für Biomoleküle oder andere interessierende anorganische oder organische Substanzen aus dem Medium, oder auch Trägerstoffe wie Glas, Kunststoff- oder keramische Materialien oder dergleichen umfassen.
So können nach einer vorteilhaften erfindungsgemäßen Ausführungsform die Sorptionsmittelteilchen über ein geeignetes Bindemittel zu größeren Agglomeraten, Granulaten bzw. Formkörpern verbunden oder auf einen Träger aufgebracht werden. Die Form und Größe solcher übergeordneter Strukturen, die die primären Sorptionsmittel- oder Schichtsilicatteilchen enthalten, richtet sich nach der jeweils gewünschten Anwendung. Es können somit alle dem Fachmann geläufigen und im Einzelfall geeigneten Formen und Größen eingesetzt werden. Beispielsweise können in vielen Fällen Agglomerate mit einem Durchmesser von mehr als 10 μm, insbesondere mehr als 50 μm bevorzugt sein. Bei einer Schüttung für Chromatographiesäulen und dergleichen kann dabei eine Kugelform der Agglomerate vorteilhaft sein. Mögliche Träger sind beispielsweise Calciumcarbo- nat, Kunststoffe oder keramische Materialien.
Auch kann jedes dem Fachmann geläufige Bindemittel verwendet werden, solange die An- bzw. Einlagerung der Biomoleküle in bzw. an das Sorptionsmittel nicht zu stark beeinträchtigt wird bzw. die für die jeweilige Anwendung zu erfordernde Sta- bilität der Teilchenagglomerate bzw. Formkörper gewährleistet ist. Beispielsweise, ohne hierauf beschränkt zu sein, können als Bindemittel verwendet' werden: Agar-Agar, Alginate, Chito- sane, Pektine, Gelatinen, Lupinenproteinisolate oder Gluten.
Wie vorstehend bereits ausgeführt, wurde nach einem erfindungsgemäßen Aspekt überraschend gefunden, dass die säureaktivierten Schichtsilicate selbst bereits besonders günstige Oberflächen zur Sorption von Nukleinsäuren bereitstellen. Bevorzugt erfolgt erfindungsgemäß somit keine (zusätzliche)- Verwendung bzw. Behandlung des Schichtsilicats mit kationischen Polymeren und/oder Polykationen (multivalenten Kationen) . Weiterhin werden erfindungsgemäß vorzugsweise keine sonstigen Polymere (z.B. Polysaccharide) , Polyelektrolyte, Polyanionen und/oder komplexbildende Agentien (zur Modifikation des- Schichtsilicats) verwendet. Nach einer besonders bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform wird insbesondere kein kationisches Polymer wie z.B. ein aminiertes Poly- saccharidpolymer oder Polykation eingesetzt. Insbesondere wird nach einer weiter bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform das erfindungsgemäß verwendete säureaktivierte Schichtsilicat nicht mit einem (kationischen) Polymer oder einem Polykation modifiziert bzw. behandelt.
Nach einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren, das die folgenden Schritte umfasst:
a) in Kontakt bringen des vorzugsweise wässrigen oder alkoholischen Mediums, das das mindestens eine Nukleinsäure- molekül enthält, mit dem Sorptionsmittel,
b) Ermöglichen der Sorption des mindestens einen Nukleinsäu- remoleküls an bzw. in das Sorptionsmittel, c) Abtrennen des sorbierten bzw. an das Sorptionsmittel gebundenen Nukleinsäuremoleküls zusammen mit dem Sorptionsmittel aus dem vorzugsweise wässrigen oder alkoholischen Medium,
d) gegebenenfalls Abtrennung bzw. Desorption des mindestens einen Nukleinsäuremoleküls von dem Sorptionsmittel.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur An- bzw. Einlagerung von Nukleinsäuren an bzw. in das Sorptionsmittel kann sowohl zur Anreicherung. (d.h. Erhöhung der Konzentration des/der gewünschten Nukleinsäuremoleküle) als auch Abreicherung (d.h. Verringerung der Konzentration des/der gewünschten Nukleinsäuremoleküle) oder Auftrennung mehrerer unterschiedlicher Nukleinsäuremoleküle genutzt werden.
Wenn das erfindungsgemäße Verfahren auf eine Entfernung oder Entsorgung von Nukleinsäuremolekülen abzielt, kann in einem weiteren Schritt das die Nukleinsäuremoleküle enthaltende Sorptionsmittel entsorgt werden. Die Entsorgung kann dabei beispielsweise durch thermische Behandlung zur Entfernung des die Biomoleküle enthaltenden Schichtsilicats erfolgen, wobei nach der thermischen Desintegration der Nukleinsäuremoleküle das Schichtsilicat entsorgt werden kann.
So ist es nach .einem ersten erfindungsgemäßen Aspekt möglich, Nukleinsäuren gezielt aus Medien zu entfernen. Dies spielt beispielsweise bei der Abwasseraufbereitung eine große Rolle, da hier in den meisten Staaten strenge gesetzliche Vorschriften zur Entfernung von Nukleinsäuren und anderen Biomolekülen aus Abwässern bestehen.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann auch die Abreicherung bzw. Entfernung von Nukleinsäure- molekülen aus Kulturmedien durchgeführt werden. So kann es beispielsweise in Bioreaktoren aufgrund der im Medium enthaltenen hohen Konzentration an Nukleinsäuremolekülen, insbesondere hochmolekularen Nukleinsäuren, zu einem unerwünschten Anstieg der Viskosität kommen. Hier kann über das erfindungs- gemäße Verfahren eine effiziente und biologisch verträgliche Entfernung der störenden Nukleinsäuremoleküle aus dem Kulturmedium erfolgen. Durch die Zugabe des erfindungsgemäßen Sorptionsmittels zu dem Kulturmedium kann die Viskosität auch auf ein gewünschtes Maß eingestellt werden.
Genauso ist es in vielen Fällen erwünscht, die Konzentration an Nukleinsäuremolekülen in einem Medium zu erhöhen bzw. diese Nukleinsäuremoleküle möglichst in reiner Form zu gewinnen. Beispielsweise gehört die Gewinnung bzw. Aufreinigung gewünschter Nukleinsäuren aus Lösungen zu den Standardprozeduren in der biologischen und medizinischen Forschung. Dabei kann erfindungsgemäß in einem weiteren Schritt das Nukleinsäu- remolekül von dem Sorptionsmittel wieder desorbiert bzw. gewonnen werden, wodurch das Sorptionsmittel auch erneut eingesetzt werden kann, gegebenenfalls nach erneuter Säureaktivierung des Schichtsilicats.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Zusammensetzung mit einem Sorptionsmittel und mindestens einem Nukleinsäuremolekül wie in der vorliegenden Beschreibung definiert, vorzugsweise in einem polaren, insbesondere in einem wässrigen oder alkoholischen Medium.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen Sorptionsmittel als anorganische Vektoren zum Einbringen von Biomolekülen in Zellen oder als pharmazeutische Zusammensetzung, insbesondere als Reservoir zur Speicherung und kontrollierten Freisetzung von Biomolekülen, bevorzugt von Nukleinsäuren. So wurde überraschenderweise gefunden, dass sich die erfindungsgemäßen Sorptionsmittel auch zu einer effizienten Einschleusung dieser Biomoleküle in prokaryontische oder eukaryontische Zellen eignen. Offenbar lassen sich nach dem erfindungsgemäßen Verfahren Biomoleküle, insbesondere Nukleinsäuren, in besonders vorteilhafter Weise zur Einschleusung in Zellen "verpacken" . Der prinzipielle Mechanismus einer solchen Einschleusung am Beispiel von DNA-LDH-Nanohybriden ist beispielsweise in der Literaturstelle Choy et al . , Angew. Chem. 2000, 112 (22), Seiten 4207-4211, sowie. in der EP .0 987 328 A2 beschrieben, auf die diesbezüglich verwiesen wird und die hiermit durch Bezugnahme im Hinblick ' auf das Verfahren in die Beschreibung aufgenommen werden. Die Verwendung als pharmazeutische Zusammensetzung, insbesondere als Reservoir zur Speicherung und kontrollierten Freisetzung von Biomolekülen, bevorzugt von Nukleinsäuren, ist als solche in der WO 01/49869 beschrieben, auf die diesbezüglich verwiesen und die hiermit durch Bezugnahme in die Beschreibung aufgenommen wird.
Methodenteil
Die vorliegend angegebenen BET-Oberflachen wurden nach DIN 66131 bestimmt.
Die angegebenen (mittleren) Porendurchmesser, -volumina nd -flächen wurden unter Verwendung eines vollautomatischen Stickstoff-Adsorptionsmessgerätes (ASAP 2000, Firma Micro- metrics) nach dem Standardprogramm des Herstellers (BET, BJH, t-plot und DFT) bestimmt. Die prozentualen Angaben zum Anteil bestimmter Porengrößen beziehen sich auf das Gesamtporenvolu- en an Poren zwischen 1,7 und 300 nm Durchmesser (BJH Adsorption Pore Distribution Report) . Soweit angegeben, wurde die Porosimetrie nach der CCl4-Methode wie folgt durchgeführt:
Reagenzien:
Tetrachlorkohlenstoff (CC14)
Paraffin (flüssig), Fa. Merck, (Best.Nr. 7160.2500)
Durchführung:
1 bis 2 g des zu prüfenden Materials werden in einem kleinen Wägegläschen bei 130°C im Trockenschrank getrocknet. Anschließend wird im Exsikkator abgekühlt, genau gewogen und das Gläschen in einen Vakuum-Exsikkator gestellt, der je nach dem zu messenden Mikroporenvolumen die folgenden Paraffin/ Tetrachlorkohlenstoff-Mischungsverhältnisse enthält :
Paraffin (ml) CCI4 (ml) Mi roporen (A) 26 184 800 47,9 162,1 390 66,5 143,5 250 82,5 127,5 180 96,4 113,6 140 108,7 101,3 115
Der mit graduierter Kühlfalle, Manometer und Vakuumpumpe verbundene Exsikkator wird nun bis zum Sieden des Inhalts evakuiert. 10 ml Tetrachlorkohlenstoff werden verdampft und in der Kühlfalle aufgefangen.
Sodann lässt man den Exsikkatorinhalt 16 bis 20 Stunden bei Raumtemperatur ausgleichen, anschließend lässt man langsam Luft in den Exsikkator. Nach Abnehmen des Exsikkatordeckels wird das Wägegläschen sofort verschlossen und auf der Analysenwaage zurückgewogen.
Auswertung:
Die Werte werden in Milligramm Tetrachlorkohlenstoff- Adsorption pro Gramm Substanz durch Gewichtszunahme errechnet. Durch Dividieren mit der Dichte des Tetrachlorkohlenstoffs ergeben sich die
Porenvolumen in ml/g Substanz.
Auswaage - • Einwaage = Gewichtszunahme g Substanz x Einwaage x Dichte CC14 = ml/g Substanz .
(Tetrachlorkohlenstoff bei 20°C, d = 1,595 g/cm3)
Messung des Zeta-Potentials
Von den zu untersuchenden Adsorbentien wurde jeweils eine wässrige Suspension mit dest. Wasser hergestellt. Die zu messende Suspension wurde jeweils auf pH 7 eingestellt. Das Zeta-Potential der Teilchen wurde mittels des Zetaphoremeters II der Firma Particle Metrix nach dem Prinzip der Mikro- elektrophorese bestimmt. Dabei wurde die Wanderungsgeschwin- digkeit der Teilchen in einem bekannten elektrischen Feld gemessen. Die Partikelbewegungen, die in einer Messzelle stattfinden, werden mit Hilfe eines Mikroskops beobachtet. Die Wanderungsrichtung gibt Aussage über die Art der Ladung (positiv oder negativ) und die Teilchengeschwindigkeit ist direkt proportional zur elektrischen Grenzflächenladung der Teilchen bzw. zum Zeta- otential. Die Partikelbewegungen in der Messzelle werden mittels Bildanalyse festgehalten und nach Ablauf der Messung werden die zurückgelegten Partikelbahnen berechnet und die daraus resultierende Teilchengeschwindigkeit ermittelt.
Unter Berücksichtung der Suspensionstemperatur und der elektrischen Leitfähigkeit wurde hieraus das Zeta-Potential (angegeben in mV) errechnet.
Überraschenderweise wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung gefunden, dass gute Ergebnisse auch mit Schichtsilicaten mit negativem Zeta-Potential erzielt werden können.
Bestimmung der Teilchengrößenverteilung
Hierzu wurde ein Mastersizer der Fa. Malvern nach den Angaben des Herstellers eingesetzt. Zur Bestimmung der Luft werden ca. 2-3 g (1 Kaffeelöffel) von der. zu untersuchenden Probe in den „Dry powder feeder" gegeben und je nach Probe auf den richtigen Messbereich eingestellt (je gröber die Probe, desto höher die Einwaage) .
Zur Bestimmung, in Wasser wird eine Probe (ca. 1 Messerspitze) ins Wasserbad gegeben bis Messbereich erreicht ist (je gröber desto höher die Einwaage) , und 5 Min. im Ultraschallbad gerührt. Anschließend erfolgt die Messung.
Die Erfindung wird nun anhand der nachstehenden nicht-beschränkenden Beispiele näher erläutert .
Kationenaustauschkapazität (CEC)
Prinzip:- Der Ton wird mit einem großen Überschuss an wässriger NH4C1-Lösung behandelt, ausgewaschen und die auf dem Ton verbliebene NH+-Menge mittels Elementaranalyse bestimmt . Me+ (Ton) ~+ NH4 + NH4 + (Ton) ~+Me +
(Me+ = H+, K+, Na+, 1/2 Ca2+, 1/2 Mg2+.... )
Geräte: Sieb, 63 um; Erlenmeyer-Schliffkolben, 300 ml; Analysenwaage; Membranfilternutsche, 400 ml; Cellulose-Nitrat-Filter, 0,15 μm (Fa. Sartorius) ; Trockenschrank; Rückflusskühler; Heizplatte; Destillationseinheit, VAPODEST-5 (Fa. Gerhardt, No. 6550); Messkolben, 250 ml; Flammen-AAS
Chemikalien: 2N NH4C1-Lösung; Neßlers-Reagens (Fa. Merck, Art. r. 9028); Borsäure-Lösung, 2 %-ig; Natronlauge, 32 %-ig; 0,1 N Salzsäure; NaCl-Lösung, 0,1 %-ig; KCl-Lösung, 0,1 %-ig.
Durchführung: 5 g Ton werden durch ein 63 μm-Sieb gesiebt und bei 110 °C getrocknet. Danach werden genau 2 g auf der Analysenwaage in Differenzwägung in den Erlenmeyer-Schliffkolben eingewogen und mit 100 ml 2N NH4C1-Lösung versetzt. Die Suspension wird unter Rückfluss eine Stunde lang gekocht. Bei stark CaC03- haltigen Bentoniten kann es zu einer Ammoniak-Entwicklung kommen. In diesen Fällen muss solange NH4C1-Lösung zugegeben werden, bis kein Ammoniak-Geruch mehr wahrzunehmen ist. Eine zusätzliche Kontrolle kann mit einem feuchten Indikator-Papier durchgeführt werden. Nach einer Standzeit von ca. 16 h wird der NH4 +-Bentonit über eine Membranfilternutsche abfiltriert und bis zur weitgehenden Ionenfreiheit mit vollentsalztem Wasser (ca. 800 ml) gewaschen. Der Nachweis der Ionenfreiheit des Waschwassers wird auf NH4 +-Ionen mit dem dafür empfindlichen Neßlers- Reagens durchgeführt. Die Waschzahl kann je nach Tonart zwischen 30 Minuten und 3 Tagen variieren. Der ausgewaschene NH4 +-Ton wird vom Filter abgenommen, bei 110 °C 2 h lang getrocknet, gemahlen, gesiebt (63 μm-Sieb) und nochmals bei 110 °C 2 h lang getrocknet. Danach wird der NH4 +-Gehalt des Tons mittels Elementaranalyse bestimmt. Berechnung der CEC: Die CEC des Tons wurde in herkömmlicher Weise über den NH4 +-Gehalt des NH4 +-Tons, der über Elementaranalyse des N-Gehalts ermittelt wurde, bestimmt. Hierzu wurde das Gerät Vario EL 3 der Firma Elementar- Heraeus, Hanau, DE, nach den Angaben des Herstellers eingesetzt. Die Angaben erfolgen in mval/100 g Ton (meq/lOOg) .
Beispiel: Stickstoff-Gehalt = 0,93 %; Molekulargewicht: N = 14,0067 g/mol
Figure imgf000028_0001
14,0067
CEC = 66 , 4 meq/100 g NH4 +-Bentonit
Beispiele
1. Herstellung eines Sorptionsmittels
Ein Rohton mit einem Montmorillonitgehalt zwischen 70 bis 80% wird in Wasser aufgeschlämmt und über Zentrifugation aufgereinigt. Die erhaltene Slurry wird dann einer Säureaktivierung unterworfen. Hierbei werden die Konzentrationen so eingestellt, dass 56% Bentonit mit 44% 36 Gew.-%iger Salzsäure versetzt werden und 8 Stunden bei einer Temperatur von 95 bis 99°C gekocht wird. Anschließend wird mit Wasser so lange gewaschen, bis der Restchloridgehalt bei kleiner oder gleich 5%, bezogen auf den Feststoff liegt. Zur Analyse des Restchloridgehalts wird 10g Feststoff in 100 ml destilliertem Wasser gekocht und.über einen Faltenfilter abfiltriert. Das Filtrat wird zur Bestimmung- des Restchloridgehaltes mit Silbernitrat-Lösung titriert. Schließlich erfolgt eine Trocknung auf eine Restfeuchte von 8 bis 10 Gew.-%. Das erhaltene End- produkt hat ein Gewicht von 430 bis 520 g/1. Durch ein Absiebe bzw. zusätzliche Vermahlung lassen sich besonders bevorzugte. Partikelgrößen einstellen.
2. Charakterisierung des Sorptionsmittels
Die charakteristischen Daten dieses Sorptionsmittels (Adsor- bens 1) und des entsprechenden Mahlgrads sind in den folgenden Tabellen angeführt. Die Charakterisierung der Oberfläche zeigt, dass in Lösungen ein negatives Zeta-Potential vorliegt. Die Oberflächenladungsdichte ist jedoch relativ klein. Hier können bei speziellen modifizierten Materialien Werte über 200 μeq/g erzielt werden.
Tabelle 1: Oberflächenladungsdichte und Zeta-Potential
Figure imgf000029_0001
Tabelle 2 : Teilchengrößenverteilung
Figure imgf000030_0001
Das Adsorbens 1 wurde nach der BJH-Methode und BET-Methode (DIN 66131) bezüglich des durchschnittlichen Porendurchmessers und der BET-Oberflache charakterisiert. Es ergaben sich folgende Werte :
Tabelle 3: BET-Oberflache und Porendurchmesser
Figure imgf000030_0002
Nach der CCl4-Methode (vgl. oben) ergaben sich folgende Werte Tabelle 4 : Porendurchmesser und Poren olumen
Figure imgf000031_0001
Um die Eignung des neuen Adsorbenstyps für eine Bindung von DNA zu testen, wurden Adsorptionsexperimente von Heringssperma DNA (Aldrich) durchgeführt.
Zur Konzentrationsbestimmung bei den Adsorptionsexperimenten wurde die DNA-Konzentration photometrisch bestimmt. Dabei wurde zur Messung eine Wellenlänge von 260 nm eingestellt. Zur Kalibration des Verfahrens mit dem eingesetzten DNA-Salz wurde eine Messung mit einer Konzentrationsreihe durchgeführt. Die erhaltene Kalibrationsgerade wurde zur photometrischen Bestimmung der DNA-Konzentration bei den Adsorptionsexperimenten eingesetzt.
Für die Adsorptionsexperimente wurde eine Heringssperma DNA- Lösung mit einer Konzentration von 1 mg/ml, 2 mg/ml, 5,63 mg/ml und 9,9 mg/1 hergestellt und mittels lOmM Tris/HCl und ImM EDTA auf pH 8 eingestellt. Anschließend wurden 0,1 g der Adsorbentien jeweils mit 5 ml der DNA-Lösung versetzt und 1 Stunde bei Raumtemperatur geschüttelt. Anschließend wurde 15 Minuten mit 2500 rpm zentrifugiert und der Überstand wurde steril filtriert. Schließlich wurde die DNA-Konzentration im Überstand gemessen und daraus die Bindungskapazität für DNA berechnet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle sowie in der folgenden Graphik zusammengestellt: Tabelle 5 : DNA-Bindungskapazitäten
Figure imgf000032_0001
BK = Bindungskapazität -> umgerechnet in mg DNA bezogen auf 1 g der Adsorbentien
Um die gebundene DNA aus den Adsorbentien zurück zu gewinnen, wird mit 1,5 molarer Natriumchloridlösung in 10 M Tris HCL pH 8,5 1 Std. eluiert (Elutionsvolumen: 100 ml), 15 min. bei 2000 rpm zentrifugiert, der Überstand steril filtriert und die Absorption gemessen.
Tabelle 4 : Elution der gebundenen DNA
Figure imgf000032_0002
Dabei wurde gefunden, dass die gebundene DNA nahezu quantitativ aus den Adsorbentien wieder zurückgewonnen werden kann. Dies zeigt den potentiellen Einsatz der neuen Adsorbentien sowohl beim Abtrennen als auch zum Aufreinigen von DNA.
Um die Bindungskapazität der erfindungsgemäßen Adsorbentien für DNA im Vergleich zum Stand der Technik einordnen zu können, wurden analoge Bindungsversuche mit einem kommerziell erhältlichen Anionenaustauscher (Quiagen , genomic Tip) durchgeführt. Die Matrix wurde aus der Säule entnommen und auf vergleichbare Korngröße wie das erfindungsgemäße Material vermählen. Die Vergleichsergebnisse sind in der folgende Tabelle aufgelistet.
Tabelle 5: Vergleichsergebnisse zur DNA-Bindungskapazität mit kommerziell erhältlichem Adsorbens
Figure imgf000033_0001
Wie der Vergleich der Tabelle 3 und Tabelle 4 zeigt, weist der erfindungsgemäße Adsorbenstyp eine wesentlich höhere Bindekapazität auf als der Vergleichs-Anionentauscher. Somit werden Bindekapazitäten von Adsorbentien, die nach dem Stand der Technik komerziell erhältlich sind, erreicht bzw. übertroffen. Hinzu kommt, dass die erfindungsgemäßen Adsorbentien eine wesentlich schnellere DNA-Bindung aufweisen, weil die entsprechenden DNA Mengen bereits nach 1 Stunde gebunden sind im Vergleich zur Adsorptionszeit von 16 Stunden bei dem Vergleichsmaterial .
Die Daten legen nahe, dass bei den erfindungsgemäßen Adsorbentien insbesondere für große Biomoleküle die Bindestellen wesentlich besser zugänglich sind als für das Vergleichs- adsorbens .
4. Transfektion von NIH-3T3-Zellen mit säureaktiviertem Schichtsilicat als anorganischem Vektor a) Zellkultivierung:
Für die Transfektionsexperimente wird die Zelllinie NIH-3T3 verwendet. Hierbei handelt es sich um adhärent wachsende Maus- embryo-Fibroblasten. Die Verdoppelungszeit beträgt ca. 20 h. Die Zellen werden in dem Standardmedium DMEM (mit 4,5 g-1"1 Glukose) mit 10% NCS kultiviert. Die Kultivierung erfolgt in einem Brutschrank bei 37°C unter humidifizierter 5%-iger C02-Atmosphäre.
Zum Ansetzen der Stammkultur wird die aufgetaute Zellsuspension in eine Monolayerflasche (25 cm2) mit 10 ml Medium gegeben. Eine direkte Zellzahlbestimmung ist bei adhärent wachsenden Zellen nicht möglich, eine Kontrolle der Wachstumsrate erfolgt über den Bedeckungsgrad des Kulturgefäßes. Bei ca. 90%iger Konfluenz - i.d.R. nach 3-4 Tagen - wird die Kultur umgesetzt, um das Überwachsen der Zellen (Fokibildung) zu vermeiden. Dazu wird das Medium abdekantiert, Trypsin-Lösung hinzugegeben und 10 min im Brutschrank inkubiert. Die abgelöste ZeilSuspension wird mit ca. 15 ml serumhaltigen Medium vermischt, um das Trypsin zu blockieren. Die abzentrifugierten Zellen werden in frischem .Medium resuspendiert und in einer Verdünnung von 1: 10 neu ausgesät .
b) Transfektion:
Als anorganischer Vektor für die Transfektion von NIH-3T3-Zellen wurden die eingangs angegebenen Adsorbens-1-Proben vor der Transfektion mit dem Plasmid pQBI25-fCl (Firma Quiagen, Heidelberg) "beladen". Dafür wurden 10 mg der jeweiligen Adsorbens-1- Probe eingewogen und zum Sterilisieren mit Ethanol gewaschen. Anschließend wurden 2 ml steriles, destilliertes. Wasser hinzugegeben, kurz gevortext und 3 min bei 5000 UpM• zentrifugiert . Zu dem Rückstand wurde 1,5 ml sterile Plasmid-DNA der Konzentration 1,45 ml-ml-1 gegeben und 16 h bei Raumtemperatur mit 250 UpM geschüttelt .
Das DNA-Adsorbens-1-Hybrid wurde in 10 ml destilliertem, sterilen Wasser suspendiert. Die Transfektion mit Adsorbens-1 als Vektor wurde jeweils mit zwei verschiedenen Konzentrationen von DNA-Adsorbens-1-Hybrid durchgeführt. Die NIH-3T3-Zellen wurden 24 h vor der Transfektion mit einer Dichte von 1-2-105 Zellen-cm"2 in 6-Loch-Platten ausgesät und im Brutschrank bei 37°C unter humidifizierter 5%-iger C02-Atmosphäre inkubiert. Die angegebenen Mengen beziehen sich jeweils auf ein Loch der 6- Loch-Platte. Die Analyse erfolgte 48 h nach Beginn der Transfektion mit dem Fluoreszenzmikroskop. Transfizierte Zellen erkennt man an der GFP-Produktion, bei Anregung mit 474 nm leuchten sie bei Betrachtung im Fluroreszenzmikroskop grün.
Variante 1 :
Direkt vor dem Versuch wurde das Medium abgenommen und 1 , 5 ml neues Medium hinzugegeben. 25 bzw. 100 μl der DNA-Adsorbens- 1-Suspension wurden hinzugefügt und es wurde 3 h im Brutschrank inkubiert. Anschließend wurde das Medium gewechselt und weitere 45 h inkubiert.
Variante 2 :
Direkt vor dem Versuch wurde das Medium abgenommen und 1,5 ml neues Medium hinzugegeben. 25 bzw. 100 μl der Suspension wurden hinzugegeben und es wurde 24 h inkubiert. Anschließend wurde das Medium gewechselt und weitere 24 h inkubiert.
Bei Verwendung des erfindungsgemäßen Hybrids mit dem Adsorbens-1 konnten zahlreiche erfolgreich transfizierte Zellen anhand der Fluoreszenz nachgewiesen werden, so dass sich die erfindungsgemäßen DNA-Adsorbens-1-Hybride als anorganische Vektoren eignen.

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Sorption, An- oder Abreicherung, Entfernung oder Gewinnung oder Auftrennung von mindestens einem Nukleinsäu- remolekül aus einem vorzugsweise wässrigen oder alkoholischen Medium mit Hilfe eines Sorptionsmittels, wobei das Sorptionsmittel mindestens ein säureaktiviertes Schichtsilicat umfasst.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Schichtsilicat ausgewählt ist aus der Gruppe der natürlichen oder synthetischen Schichtsilicate.
3. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Schichtsilicat nicht mit einem kationischen Polymer oder Polykation behandelt ist .
4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Kationenaustauschkapazitat des säureaktivierten Schichtsilicats bei weniger als 50 meq/100 g, insbesondere bei weniger als 40 meq/100 g liegt.
5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das säureaktivierte Schichtsilicat eine BET-Oberflache von mindestens 50 m/g, insbesondere mindestens 100 m2/g, besonders bevorzugt von mindestens 130 m2/g, aufweist.
6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das säureaktivierte Schichtsilicat, vorzugsweise in Pulverform, eine Korngröße (D50) von 1 bis 1.000 μm, insbesondere von 5 bis 500 μm, aufweist.
7. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das säureaktivierte Schichtsilicat, vor- zugsweise in Granulatform, eine Korngröße (D50) von 100 bis 500 μm, insbesondere von 200 bis 2.000 μm, aufweist.
8. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das säureaktivierte Schichtsilicat eine Porosimetrie wie folgt aufweist: Poren bis 80 nm Durchmesser zwischen etwa 0,15 und 0,80 ml/g, insbesondere zwischen etwa 0,2 und 0,7 ml/g; Poren bis zu 25 nm Durchmesser zwischen etwa 0,15 und 0,45 ml/g, insbesondere 0,18 bis 0,40 ml/g; Poren bis zu
14 nm zwischen etwa 0,10 und 0,40 ml/g, insbesondere etwa 0,12 bis 0,37 ml/g, jeweils bestimmt nach der CCl4-Methode.
9. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der mittlere Porendurchmesser nach der BJH- Methode des säureaktivierten Schichtsilicats zwischen 2 und
25 nm, insbesondere zwischen 4 und 20 nm, liegt.
10. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Nukleinsäuremolekül ausgewählt ist aus Mono-, Oligo- und Polynukleotiden oder deren Mischungen.
11. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Nukleinsäuremolekül ausgewählt ist aus Ribonukleinsäuren (RNA) und Desoxyribonukleinsäuren (DNA) oder deren Mischungen.
12. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Nukleinsäuremolekül mindestens 10 Nukleotidbausteine, vorzugsweise mindestens 100 Nukleotidbausteine und besonders bevorzugt mindestens 1000 Nukleotidbausteine aufweist.
13. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem vorzugsweise wässrigen oder alkoholischen Medium mit dem mindestens einen Nukleinsäuremolekül um eine kolloidale Lösung, Suspension, Dispersion, Lösung oder Emulsion handelt.
14. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst:
a) in Kontakt bringen des vorzugsweise wässrigen oder alkoholischen Mediums, das das mindestens eine Nukleinsäuremolekül enthält, mit dem Sorptionsmittel,
b) Ermöglichen der Sorption des mindestens einen Nukleinsäuremoleküls an bzw. in das Sorptionsmittel,
c) Abtrennen des sorbierten bzw. an das Sorptionsmittel gebundenen Nukleinsäuremoleküls zusammen mit dem Sorptionsmittel aus dem vorzugsweise wässrigen oder alkoholischen Medium,
d) gegebenenfalls Abtrennung bzw. Desorption des mindestens einen Nukleinsäuremoleküls von dem Sorptionsmittel.
15. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Sorptionsmittel im wesentlichen aus mindestens einem säureaktivierten Schichtsilicat besteht.
16. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Säureaktivierung des Schichtsilicats mit einer anorganischen oder organischen Säure erfolgt .
17. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Säureaktivierung des Schichtsilicats mit einer Säuremenge (wasserfrei) von 1 bis 35 Gew.-%, bezogen auf das Schichtsilicat, vorzugsweise bei erhöhter Temperatur erfolgt .
18. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem wässrigen oder alkoholischen Medium um eine DNA- oder RNA-Lösung, ein Fermentationsmedium, einen Fermentationrückstand aus der Zellkultur, Brauchwasser oder ein Abwasser handelt.
19. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in einem weiteren Schritt das Sorptionsmittel zusammen mit dem. Nukleinsäuremolekül entsorgt wird.
20. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in einem weiteren Schritt das mindestens eine Nukleinsäuremolekül von dem Sorptionsmittel wieder desor- biert bzw. wieder gewonnen wird, wodurch das Sorptionsmittel gegebenenfalls erneut eingesetzt werden kann.
21. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Desorption oder Wiedergewinnung des mindestens einen Nukleinsäuremoleküls in einer Hochsalz- Pufferlösung, vorzugsweise mit mehr als 1 M NaCl erfolgt.
22. Zusammensetzung mit einem Sorptionsmittel wie in einem der vorstehenden Ansprüche definiert und mindestens einem Nukleinsäuremolekül wie in einem der vorstehenden Ansprüche definiert in einem vorzugsweise- wässrigen oder alkoholischen Medium, enthaltend mindestens ein Nukleinsäuremolekül .
23. Verwendung von mindestens einem säureaktivierten Schichtsilicat wie in einem der vorstehenden Ansprüche definiert als Sorptionsmittel für Nukleinsäuren.
2 . Verwendung eines Sorptionsmittels wie in einem oder mehreren der Ansprüche 1-9, 15-17 definiert, oder der Zusammensetzung gemäß Anspruch 22 als anorganischer Vektor zur Einbringung von Nukleinsäuremolekülen in Zellen, oder als pharmazeutische Zusammensetzung, insbesondere als Reservoir zur Speicherung und kontrollierten Freisetzung von Nukleinsäuren.
25. Verwendung eines Sorptionsmittels wie in einem oder mehreren der Ansprüche 1-9, 15-17 definiert als Sorptionsmittel zur An- bzw. Abreicherung von Nukleinsäuremolekülen, insbesondere zur Entfernung oder Aufreinigung von Nukleinsäuren aus wässrigen oder alkoholischen Medien.
26. Verwendung gemäß Anspruch 25 zur Senkung oder Einstellung der Viskosität des Mediums .
27. Verwendung gemäß Anspruch 25 oder 26 bei der Herstellung bzw. Aufreinigung von biotechnologisch hergestellten Stoffen und Wirkstoffen.
28. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 23 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass das Sorptionsmittel teilchenförmig vorliegt und gegebenenfalls mit einem Bindemittel zu Teilchenaggregaten oder Formkδrpern verbunden oder auf einen Träger aufgebracht ist.
29. Verwendung gemäß Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Bindemittel um Alginat, Agar-Agar, Chitosane, Pektine, Gelatinen, Lupinenproteinisolate oder Gluten handelt.
30. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Sorptionsmittel teilchenförmig vorliegt und gegebenenfalls mit einem Bindemittel zu Teilchenaggregaten oder Formkörpern verbunden oder auf einen Träger aufgebracht ist .
31. Verfahren gemäß Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Bindemittel um Alginat, Agar-Agar, Chitosane, Pektine, Gelatinen, Lupinenproteinisolate oder Gluten handelt.
32. Zusammensetzung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Sorptionsmittel teilchenförmig vorliegt und gegebenenfalls mit einem Bindemittel zu Teilchenaggregaten oder Formkörpern verbunden oder auf einen Träger aufgebracht ist .
33. Zusammensetzung gemäß Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass das Bindemittel Alginat, Agar-Agar, Chitosane, Pektine, Gelatinen, Lupinenproteinisolate oder Gluten ist .
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