WO2005124362A2 - Verfahren und testkit zur diagnose einer ischämischen herzschädigung, insbesondere der latenten chronischen formen, durch serologischen nachweis der myosin lechtkette-1 - Google Patents

Verfahren und testkit zur diagnose einer ischämischen herzschädigung, insbesondere der latenten chronischen formen, durch serologischen nachweis der myosin lechtkette-1 Download PDF

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    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders
    • G01N2800/325—Heart failure or cardiac arrest, e.g. cardiomyopathy, congestive heart failure

Definitions

  • the invention relates to a method for the diagnosis of ischemic heart damage, in particular the latent and chronic forms, by serological detection of the myosin light chain I.
  • the method relates to a method for the diagnosis of ischemic heart damage, in particular the latent and chronic forms (Myosin Light Chain 1, MLC 1) as a diagnostic marker in the blood of affected patients and an enzyme immunoassay for the detection of MLC 1.
  • MLC 1 Myosin Light Chain 1, MLC 1
  • the field of application of the invention is medicine and here in particular medical diagnostics.
  • Circulatory disorder emerge from the heart muscle cell and, depending on the biological half-life, can be measured in the peripheral blood for a certain time. Their appearance, increase or decrease therefore indicate the occurrence, expansion and regression of an acute ischemic event.
  • cardiac troponins with whose help the existence of myocardial necrosis has been proven can be reliably recognized, but it is not possible to determine myocardial ischemia without necrosis [24]) and the fact that examinations under stress (e.g. stress tests, perfusion scintigraphy of the myocardium, etc.) must be carried out, which is time-consuming and economically expensive are [10, 11, 15, 24].
  • the object of the present invention was to provide a diagnostic marker for the detection of ischemic heart damage, in particular the latent and chronic forms, preferably by the diagnostic significance of the marker for patients with suspected myocardial ischemia, the use of the marker in Diagnostics to verify ischemic heart damage, especially latent myocardial ischemia, and a test kit to detect the marker.
  • the invention relates to a method for the diagnosis of ischemic heart damage, in particular the latent and chronic forms, by serological detection of the myosin light chain I (myosin light chain 1, MLC 1) as a diagnostic marker in the blood of affected patients, and an enzyme immunoassay for the detection of MLC
  • myosin light chain I myosin light chain 1, MLC 1
  • the enzyme immunoassay for the determination of MLC I in blood for the diagnosis of ischemic heart damage, especially of the latent and chronic forms comprises in separate packaging at least: a) a solid support with antibodies bound to it, which bind MLC I sensitively and specifically; b) MLC I as a standard for the quantitative determination of this marker; c) at least one buffer for making a standard series of MLC I; d) a buffer for diluting the sample to be examined; e) a wash buffer; f) a detectably labeled conjugate that binds to MLC I; g) and a substrate that marked the visualization of the detectable. , Conjugate allowed.
  • the antibodies which are bound to the solid support are preferably monoclonal antibodies.
  • Solid carriers microtiter plates are mainly used, and as the detectably labeled conjugate is a conjugate antibody, preferably a monoclonal antibody which binds to the MLC I.
  • Immunological standard methods for the detection of analytes from test solutions are particularly suitable for the invention, preferably if they are implemented as an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • Monoclonal antibodies that bind specifically to MLC 1 were conjugated to horseradish peroxidase (HRP) using the periodate method. Various combinations of antibodies were then tested. Both the antibodies that were bound to the microtiter plate and the conjugated antibodies were varied. It was shown that the combination of a monoclonal antibody for plate coating with an HRP-conjugated monoclonal antibody gives the best results.
  • HRP horseradish peroxidase
  • the concentration of the coating antibodies, the conjugate dilution, the buffer components, the incubation times and temperatures, as well as the stability of the reagents and components of the test kit were optimized according to known methods.
  • the MTP is incubated for 2 hours at room temperature (approx. 25 ° C) and shaken at about 300 rpm using an orbital MTP shaker. 3.. The wells are washed 3 times with 350 ⁇ l washing buffer each.
  • the MTP is incubated for 1 hour at room temperature (approx. 25 ° C.) and shaken at about 300 rpm using an orbital MTP shaker.
  • the MTP is incubated for 15 min at room temperature (approx. 25 ° C).
  • the color development is stopped by adding 100 ⁇ l stop solution.
  • the optical density is measured with a photometer at a wavelength of 450 nm.
  • MLC I was added to two sera in different concentrations and examined.
  • Serum samples with different concentrations were diluted and measured.
  • the sample recovery rate ranged from 97.5% to 117.2%.
  • a group of 80 subjects was tested.
  • the group consisted of three sub-groups.
  • Echocardiography and exercise tests All subjects were tested echocardiographically (calculation of the left ventricular ejection fraction - LVEF - according to Simpson), followed by an examination using bicycle ergometry. Ergometry was carried out according to the recommendation of the Czech Cardiological Society (Chaloupka, 2000). The initial load was 50 W, increased by 25 W every minute until the subject felt a maximum load.
  • SPECT Single SPECT was performed in all subjects.
  • Stress tests Physical stress was achieved using a bicycle ergometer. Radiopharmaceuticals were administered after 85% of maximum aerobic capacity was reached, or when angina pectoris resilience, ischemic changes on the ECG, severe arrhythmia, low blood pressure, etc. were limited the patient was not physically resilient, pharmacological exposure to dipyridamole (0.56 mg / kg body weight over 4 min) was generated.
  • Gated SPECT The gated SPECT was reached 15 minutes after the administration of 740 MBq 99tn Tc-MIBI at the highest load. With heterogeneous perfusion, the resting examination was carried out on another day (gated SPECT 1 hour after administration of 99m Tc-MIBI). 8-frame gating was used to record data on a double detection scintillation camera Siemens e.cam (Siemens Medical Solutions, Erlangen, Germany) equipped with a parallel collimator of the LEHR type, rotation angle 180 °, a total of 64 projections in a 64 x 64 matrix the right anterior oblique projection of 45 ° to the left posterior oblique projection of 45 °.
  • Coronary angiography In people with typical CAD findings or unclear findings, a freely selectable coronary chart was performed through the femoral with a 6 or 7F instrumentation. Obliteration of the coronary artery and stenosis was assessed by an invasive cardiologist who was not informed about the patient's other risks. "An angiographically positive result was considered when at least one stenosis narrowed the lumen of a major coronary artery or one of its branches by more than 60%.
  • the entire group was divided into subgroups according to the SPECT results (persons with signs of myocardial ischemia in the SPECT examination). Patients with a positive SPECT result were compared with patients with a positive ergometric result, regardless of the SPECT result. The division into the above Groups were also used to plot the ROC curve for diagnostic validity of MLC-1, considering the presence of myocardial ischemia under stress.
  • MLC-1 Laboratory determination of MLC-1 - The removal for MLC-1 was carried out from peripheral venous blood, the determination was carried out from the serum. After sampling, each sample was kept at room temperature for 60 minutes. The samples were then centrifuged (10 min, 1100 g at 4 ° C) and frozen at -80 ° C.
  • MLC-1 was determined 3 months after collection after the samples were warmed to room temperature (25 ° C). All samples were run twice examined.
  • the data was processed using the Medcalc software. Unless otherwise indicated, related content was expressed by mean ⁇ standard deviation and median.
  • the MLC-1 concentration in the subgroups was compared by analysis of variance (ANOVA, Kruskal-Wallis according to the distribution type) and ROC analysis. The concentration of MLC-1 and other values were compared with the Spearmann correlation coefficient. Category data were compared using the x 2 test. A value of p ⁇ 0.05 was considered to be statistically significant. Normal values were determined using the x 2 test.
  • Table 1 shows the statistical course of the entire group. It shows an abnormal distribution of most parameters.
  • the MLC-1 concentrations in the initially determined subgroups (A, B, C) did not show any significant differences with no withdrawal.
  • Figure 1 shows a 91% sensitivity and 98% specificity when diagnosing myocardial ischemia for MLC-1 above its determinability limit shown in Figure 2 (AUC 0.94; 95% CI 0.86-0.98; LR + 36.3; PPV + in the group with one Prevalence of 44.4% 96.7% and NPV- 93%).
  • Myosin is a contractile protein consisting of two heavy chains (MW 200 kD) and two light chains. Light chains are designated MLC-1 (MW 25 kD) and MLC-2 (MW 19 kD).
  • MLC-1 MW 25 kD
  • MLC-2 MW 19 kD
  • MLC-1 MW 25 kD
  • MLC-2 MW 19 kD
  • MLC-1 MW 25 kD
  • MLC-2 MW 19 kD
  • MLC-1 MW 25 kD
  • MLC-2 MW 19 kD
  • MLC-1 MW 25 kD
  • MLC-2 MW 19 kD
  • MLC-1 MW 25 kD
  • MLC-2 MW 19 kD
  • There are different types of MLC in the organism e.g. skeletal muscle MLC - sMLC, ventricular MLC - vMLC, atrial MLC - aMLC
  • a disturbed cardiomyocyte integrity e.g. myocardial necros
  • MLC-1 occurs mainly in the ventricular myocardium, it is not myocardial-specific (it also occurs in skeletal muscle) (2, 4, 7). An increased MLC-1 value has also been described in other cases of myocardial involvement, in addition to ischemic necrosis (myocarditis). (1).
  • Structural damage is a prerequisite.
  • MLC-1 is also a substrate of caspase-3, which is activated after the apoptotic cascade has been triggered. Activated caspase-3 cleaves vMLC-1, destroying the biologically active vMLC-1, which leads to reduced contractility of the myocardium.
  • a direct cleavage of vMLC-1 by caspase-3 can cause a restriction of the myocardial function by changing the cross-linking contacts between actin and myosin molecules. It is possible that the activation of apoptosis in the heart leads to contractile dysfunction even before cell death. (4, 6).
  • a group of 176 high-risk subjects was evaluated, who were divided into two subgroups based on the result of myocardial SPECT (single-photon emission computed tomography): people with and people without myocardial ischemia.
  • a stress test and a myocardial SPECT (99mTc-MIBI) were carried out in all subjects. Subsequently, the subjects who had shown relevant SPECT results were subjected to an elective coronary angiography.
  • the laboratory markers in the venous blood were examined several times in all subjects: a) immediately before the stress test: C-reactive protein (CRP), hemoglobin (Hb), hematocrit (Htk), lactate, MLC-1; b) on the subjective maximum: Hb, Htk, lactate, MLC-1; c) 30 min after reaching the maximum load: MLC-1 and d) 60 min after the maximum load: MLC-1.
  • CRP C-reactive protein
  • Hb hemoglobin
  • Htk hematocrit
  • lactate lactate
  • MLC-1 a) on the subjective maximum: Hb, Htk, lactate, MLC-1
  • the ROC for diagnostic efficacy of MLC-1 was established from the point of view of myocardial ischemia under stress.
  • the subgroups differed in their MLC-1 concentrations in all 4 blood samples (median in mg / 1; 3.1 versus 0.5 for blood sample 1; 3.1 versus 1.1 for blood sample 2; 2.9 versus 0, 5 for blood sample 3; 3.4 versus 0.5 for blood sample 4) and their gender distribution (a positive SPECT result was more common in men).
  • MLC-1 values did not change either during the exercise test or 60 minutes after, i.e. H. taking into account the changes in blood volume during the stress test, no changes were recorded.
  • latent myocardial ischemia individuals with numerous risk factors and a risk of> 20% / 10 years according to the Framingham algorithm or> 5% / 10 years according to the Cardioscore algorithm
  • IVS ischemic heart disease
  • Myocardial SPECT Stress tests: The physical stress was exerted on a bicycle ergometer, the radiopharmaceutical was applied when 85% of the maximum aerobic capacity was exceeded or when the stress was caused by more pronounced angina pectoris, ischemic changes in the ECG, more serious rhythm, a drop in blood pressure etc. was limited. The applicable international and Czech recommendations were used for the approach used [10, 11].
  • Gated SPECT The gated SPECT examination (synchronized recording of ECG and SPECT) was carried out 15 min after the application of 740 MBq 99mTc-MIBI at the peak of the load, if there was a heterogeneity of perfusion, supplemented by an examination at rest the next day (gated SPECT 1 after the application of 99mTc-MIBI).
  • the data was recorded via 8-frame gating using the e.cam double-head scintillation camera from Siemens (Siemens Medical Solutions, Erlangen, Germany), equipped with parallel LEHR collimators (collimators with low energy consumption and high resolution), rotation angle 180 ° , a total of 64 projections with a matrix of 64x64 from 45 ° oblique projection from right to 45 ° oblique projection behind left.
  • the summary stress score (SSS, Summed Stress Score) was evaluated from the parameters, which represents the extent of the perfusion defect after exercise. The higher the SSS value, the worse the patient prognosis, regardless of whether the defect is manifest (scar) or reversible (ischemia) [15]. Values of ⁇ 3 are considered normal, values between 4 and 8 indicate a moderate defect, values between 9 and 13 indicate a moderate defect, and values> 13 indicate a severe defect.
  • SDS Summed Difference Score
  • LK defect area of the left chamber
  • TID Transient Ischemic Dilatation
  • the ejection fraction of the left chamber was evaluated at the peak of the stress and after calming down (in the gated-SPECT examination). If the ejection fraction of the left ventricle decreased by more than 5% after exercise, the finding was interpreted as transient dilatation of the left ventricle after exercise, which is a symptom of anesthesia of the left ventricle after exercise [15-18, 20-23].
  • the specified data were determined using 4D-MSPECT, software for automatic quantification (University of Michigan, Ann Arbor, USA) [16]. The SPECT results were assessed as decisive for ICHS diagnostics.
  • latent myocardial ischemia was defined as the positivity of myocardial SPECT for the detection of ischemia (SSS> 3) with a negative ECG result and absence of ICHS symptoms [15].
  • Laboratory examination and blood sampling technique To examine the biological material, vein samples of non-clotting blood (for serum extraction) and blood with a solution of the salt of " ethylenediaminetetraacetic acid (EDTE) as an anticoagulant (for the examination of the blood picture and plasma extraction) were used.
  • EDTE ethylenediaminetetraacetic acid
  • MLC- 1 All parameters except MLC- 1 were determined within 120 min from the blood collection. All subjects were given the following laboratory tests with venous blood: a) immediately after the stress test: C-reactive protein (CRP - Advia 1650 analyzer, immunoturbidimetry, manufacturer of the Diasys system), hemoglobin (Hb .
  • CRP - Advia 1650 analyzer C-reactive protein
  • Hb hemoglobin
  • MaxM Coulter analyzer manufacturer of the Beckman Coulter system
  • hematocrit Htk, MaxM Coulter analyzer, manufacturer of the Beckman Coulter system
  • lactate Advanced 1650 analyzer, enzymatic determination, manufacturer of the Biovendor system
  • MLC-1 Marc + ELISA line
  • MaxM Coulter analyzer manufacturer of the Beckman Coulter system
  • MLC-1 peripheral venous blood was drawn using the serum. The blood sample was kept at room temperature for 60 minutes after collection. It was then centrifuged (10 min at 1100 g and 4 ° C) and frozen at a temperature of -80 ° C. The MLC-1 determination took place within 3 months from the removal of the material, namely after it had been tempered to room temperature (25 ° C.). All samples were examined twice.
  • the ventricular shape of the MLC-1 (vMLC-1) was determined using the ELISA technique (Biovendor GmbH) in a sandwich structure. A "combination of monoclonal mouse and chicken antibodies was used for the determination.
  • the MLC-1 values were determined between the two subgroups using the scatter analysis method (ANOVA, Kruskal-Wallis according to the type of distribution) and by
  • the MLC-1 concentration and other quantities were correlated with the Spearmann correlation coefficient with regard to the data distribution.
  • the categorical data were compared using the ⁇ 2 test. A value of p ⁇ 0.05 was considered statistically significant.
  • the normality was also assessed using the ⁇ 2 test.
  • Table 4 shows the basic statistical properties of the entire group. As can be seen from this table, the majority of the parameters have an abnormal distribution. Table 4: - Basic characteristics of the study group, 176 subjects
  • DeltaPV - change in plasma volume SSS - summary stress score; SDS - summary diff. Score; StressEF - left ventricular ejection fraction at auxiliary; RestEF - left ejection fraction
  • Myocardial ischemia in the SPECT were 37 patients (27%) as individuals with
  • Table 7 MLC-1 values before the start of exercise in patients after the appearance of a manifest or reversible defect in SPECT
  • Table 8 Differences in the MLC-1 values before the start of exercise after the appearance of symptoms of a manifest or reversible defect in SPECT
  • the area under the ROC curve (AUC) was 0.81 with a 95% confidence interval 0.72-0.88.
  • the positive test result (LR +) was 5.9; the positive predictor value (PPV +) in the group examined (with a prevalence of 27%) was 68% and the negative predictor value (NPV-) 87% ( Figure 4, Figure 5).
  • myocardial ischemia ischemic heart disease
  • SPECT single-photon emission computer tomography
  • Recent work confirms the increasing number of SPECT for myocardial perfection and its importance both in the diagnosis of myocardial ischemia and in the risk stratification and planning of a possible therapy [15, 20].
  • Patients with normal myocardial perfection after exercise have from
  • Symptoms of post-ischemic myocardial anesthesia appear), which are characterized by SSS values of 4-8, a defect of ⁇ 10% of the area of the left ventricle, a TLD value of ⁇ 1.17 and no decrease in the ejection fraction of the left chamber at maximum load is defined; if these conditions are met, drug therapy can be preferred.
  • Myosin is a contractile structural protein (heteropolymer), which consists of two heavy amino acid chains (relative molecular weight about 200 kDa) and two pairs of light amino acid chains.
  • the pairs of light amino acid chains are called MLC-1 (rel. Mol. Wt. 25 kDa) and MLC-2 (rel. Mol. Wt. 19 kDa).
  • the MLC-1 is also referred to as an essential chain, and although its complete
  • MLC-1 myocardial necrosis
  • MLC-1 myocardial stress besides ischemic necrosis (myocarditis) [1, 2, 4, 7].
  • Another possible reason could be, for example, excessive gene expression for MLC-1, which would cause excessive stress (e.g. by stimulation, etc.) of the cardiomyocytes. This phenomenon could lead to an excessive synthesis of the protein in the myocardial cells with its passage into the circulation (e.g. via a slightly disturbed cell membrane). Of course, the question remains to some extent whether this transfer is associated with a disruption of the cardiac myocyte structure (whether a disruption of the structure is a condition at all).
  • the programmed cell death includes the activation of the prosthease (caspase), which leads to a cleavage of the vital proteins of the cytoskeleton. It has been described that there is activation of caspase-3 (associated with a decrease in contractile performance) in failing myocytes.
  • caspase-3 associated with a decrease in contractile performance
  • the activated caspase-3 cleaves vMLC-1, which leads to an interruption of the biologically active vMLC-1, which is associated with a reduction in the contractile performance of the myocardium.
  • IHK ischemic heart disease
  • HN hypertension
  • 252 subjects were examined, including 240 asymptomatic subjects with a high risk of ischemic heart disease (Framingham or Score Algorithm) or subjects with a history of IHK, and 12 healthy volunteers. None of the subjects examined showed signs of acute coronary syndrome or heart failure (medical history, heart and lung Rtg, EKG, NT-proBNP and troponin I level).
  • ECG Ergometric examinations with an ECG recording (exercise ECG) were carried out on the test subjects (50 W with an increase of 10 W per minute until exhaustion), 15 minutes after reaching 85% of the aerobic capacity or after the appearance of ischemic symptoms ( angina pectoris, EKG) 740 MBq 99Tc-MIBI administered intravenously and a SPECT examination was carried out. 38 subjects had a circulatory defect, determined with the help of both SPECT and exercise ECG. The SPECT analysis showed that in 14 cases it was a fixed and in 27 cases a temporary circulatory defect.
  • the basal MLC-1 determination can be used to predict a latent
  • Cardiac ischemia can be used, with negative predictive values of 88% (fixed and temporary circulatory defects) and 92% (transient circulatory defects) being achieved (Table 9, Figures 8A, 8B, 9A and 9B).
  • Transient ischemic dilation ratio of the left ventricle is a significant predictor of future cardiac events in patients with otherwise normal myocardial perfusion.
  • SPECT. JACC. 2003; 42: 1818 - 1825. 15 Kammek M, Myslivecek M, Husäk V. Kvantitativni hodnoceni myokardiälni perfuze, funkce a viability pomoci jednofotonove emisni vypocetai tomography. Interv acute cardiol. 2003; 2: 190-197. 16) Kaminek M, Skvarilovä M, Ostransky J et al.
  • Illustration 1
  • the ROC analysis showed a diagnostic sensitivity of 91% with a specificity of 86% for values above "0".
  • FIG. 5 Graphical comparison of the MLC-1 values at rest before the start of exercise (the median is given at a 95% confidence interval) in patients after the occurrence of mocardial ischemia in SPECT.
  • Figure 6 Graphical comparison of the MLC-1 values at rest before the start of exercise (the median is given at a 95% confidence interval) in patients after the occurrence of mocardial ischemia in SPECT.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnose von ischämischen Herzschädigungen, insbesondere der latenten und chronischen Formen, durch serologischen Nachweis der Myosin-Leichtkette I (Myosin Light Chain 1, MLC 1) als diagnostischen Marker im Blut betroffener Patienten sowie ein Enzymimmunoassay zum Nachweis von MLC 1. Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Medizin und hier insbesondere die medizinische Diagnostik.

Description

Verfahren und Testkit zur Diagnose einer ischämischen Herzschädigung, insbesondere der latenten und chronischen Formen, durch serologischen Nachweis der Myosin Leichtkette-1 Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnose von ischämischen Herzschädigungen, insbesondere der latenten und chronischen Formen, durch serologischen Nachweis der Myosin-Leichtkette I (Myosin Light Chain 1, MLC 1) als diagnostischen Marker im Blut betroffener Patienten sowie einen Enzymimmunoassay zum Nachweis von MLC 1. Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Medizin und hier insbesondere die medizinische Diagnostik.
Stand der Technik In den vergangenen zehn Jahren wurde mehrfach darauf hingewiesen, dass es angezeigt wäre, einen effektiven Labormarker für Myokardischämie zu finden. Zur biochemischen Diagnostik der ischämischen Herzschädigung wurden verschiedene Methoden zur Bestimmung einer ganzen Reihe von Parametern, die sich während und kurz nach dem akuten Eintreten einer Durchblutungsstörung nachweisen lassen, entwickelt. Zu den herkömmlichen Parametern gehören Isoenzyme der Laktatdehydrogenase (LDH) und der Kreatinphosphokinase (CPK) sowie das Myoglobin. In den letzten Jahren hat sich das herzspezifische Troponin I und T etabliert. Experimentell wurden auch noch das herzspezifische Fatty Acid Binding Protein und Glyzeraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase verwendet. In jüngster Zeit wurde noch die Cobalt-bindende Kapazität des Serumalbumin verwendet.
Allen oben genannten Parametern ist gemeinsam, dass sie während einer
' Durchblutungsstörung aus der Herzmuskelzelle austreten und, je nach biologischer Halbwertzeit, für eine gewisse Zeit im peripheren Blut meßbar sind. Ihr Erscheinen, Anstieg bzw. Abfall lassen also auf das Auftreten, die Ausdehnung und Rückbildung eines akuten ischämischen Ereignisses schließen.
Zur Zeit gibt es keine biochemische Kenngröße, mit der sich latente oder chronische Formen von ischämische Herzschädigungen nachweisen lassen. Es gibt also keinen diagnostischen Marker, mit dessen Hilfe man bei einem Patienten eine ischämische Herzschädigung feststellen kann, ohne das der Patient unmittelbar an einer akuten Durchblutungsstörung wie Angina pectoris oder Herzinfarkt leidet. Diese latenten oder chronischen Fälle der ischämische Herzschädigung sind jedoch sehr zahlreich und resultieren aus der koronaren Herzerkrankung, die nicht mit Infarkt- und Angina- Symptomatik einhergeht.
Für den Nachweis einer latenten, stillen bzw. chronischen Herzschädigung greift man nach zwei nichtbiochemischen bildgebenden Verfahren - Thallium-Szintigrafϊe bzw. SPECT und Belastungs-Echokardiografie. Die erstgenannte Methode beruht auf besonderen Eigenschaften der beschädigten Zellen, die gewisse radioaktive Mittel anreichern. Die Belastungs-Echokardiografie nutzt die verminderte Beweglichkeit der betroffenen Herzregion aus. Beide Verfahren sind sehr teuer und zeitraubend. In der Literatur der vergangenen zehn Jahre finden sich wiederholt Hinweise, dass neue, sensible und vor allem früh anzeigende Tests für eine Myokardischämie gesucht werden müssten, die ein rechtzeitiges und wirksames therapeutisches bzw. diagnostisches Eingreifen ermöglichen würden. Der Grund, warum weitere diagnostische Tests für den Problemkreis Myokardischämie gefunden werden sollen, besteht vor allem in den allgemein bekannten Nachteilen der routinemäßig verwendeten Laborkennwerte für die myokardiale Belastung (z. B. der Herztroponine, mit deren Hilfe sich zwar nachweislich das Bestehen einer myokardialen Nekrose zuverlässig erkennen lässt, es jedoch nicht möglich ist, eine Myokardischämie ohne Nekrose festzustellen [24]) sowie darin, dass Untersuchungen unter Belastung (z. B. Belastungstests, Perfusionsszintigraphie des Myokards u. Ä.) durchgeführt werden müssen, die zeitlich und ökonomisch aufwendig sind [10, 11, 15, 24].
■ Aufgabe Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Bereitstellung eines diagnostischen Markers für den Nachweis von ischämischen Herzschädigungen, insbesondere der latenten und chronischen Formen, vorzugsweise durch die diagnostische Bedeutung des Markers für Patienten mit Verdacht auf Myokardischämie, den Einsatz des Markers in der Diagnostik zur Verifizierung von ischämischen Herzschädigungen, insbesondere einer latenten Myokardischämie, sowie eines Testkits zum Nachweis des Markers.
Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen realisiert.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Diagnose von ischämischen Herzschädigungen, insbesondere der latenten und chronischen Formen, durch serologischen Nachweis der Myosin-Leichtkette I (Myosin Light Chain 1, MLC 1) als diagnostischen Marker im Blut betroffener Patienten sowie ein Enzymimmunoassay zum Nachweis von MLC
Der Enzymimmunoassay zur Bestimmung von MLC I im Blut für die Diagnose von ischämischen Herzschädigungen, msbesondere der latenten und chronischen Formen, umfasst in separater Verpackung wenigstens: a) einen festen Träger mit daran gebundenen Antikörpern, die sensitiv und spezifisch MLC I binden; b) MLC I als Standard zur quantitativen Bestimmung dieses Markers; c) mindestens einen Puffer zum Herstellen einer Standardreihe des MLC I; d) einen Puffer zum Verdünnen der zu untersuchenden Probe; e) einen Waschpuffer; f) ein detektierbar markiertes Konjugat, das an MLC I bindet; g) und ein Substrat, das die Sichtbarmachung des detektierbar markierten . . Konjugats erlaubt. Bei den Antikörpern, die an den festen Träger gebunden sind, handelt es sich bevorzugt um monoklonale Antikörper. ■ Als feste Träger werden vorwiegend Mikrotiterplatten eingesetzt und als detektierbar markiertes Konjugat ein konjugierter Antikörper, vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper, der an das MLC I bindet.
Geeignet für die Erfindung sind insbesondere immunologische Standarverfahren zum Nachweis von Analyten aus Testlösungen, vorzugsweise wenn sie als Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) realisiert werden. Im Folgenden wird der ELISA näher beschrieben.
Optimierung der Komponenten und Bedingungen
Monoklonale Antikörper, die spezifisch an MLC 1 binden, wurden mit Meerrettichperoxidase (horseradish peroxidase, HRP) unter Anwendung der Perjodat- Methode konjugiert. Anschließend wurden verschiedene Kombinationen von Antikörpern getestet. Sowohl die Antikörper, die an die Mikrotiterplatte gebunden wurden als auch die konjugierten Antiköφer wurden variiert. Es zeigte sich, dass die Kombination eines monoklonalen Antikörpers für die Plattenbeschichtung mit einem HRP-conjugierten monoklonalen Antikörper die besten Ergebnisse liefert.
Des weiteren erfolgte die Optimierung der Konzentration der Beschichtungsantikörper, der Konjugatverdünnung, der Pufferbestandteile, der Inkubationszeiten und -temperaturen, sowie der Stabilität der Reagenzien und Bestandteile des Testkits nach bekannten Methoden.
Testdurchführung:
1. 100 μl der Standardlösungen, der Kontrollen und der Proben, die 1 :4 mit Probenpuffer verdünnt wurden, werden in die entsprechenden Vertiefungen pipettiert.
2. Die MTP wird 2h bei Raumtemperatur (ca. 25 °C) inkubiert und dabei mit Hilfe eines orbitalen MTP-Schüttlers bei ca. 300 rpm geschüttelt. 3. . Die Vertiefungen werden 3x mit je 350 μl Waschpuffer gewaschen.
4. Es erfolgt die Hinzugabe von 100 μl Konjugatlösung.
5. Die MTP wird lh bei Raumtemperatur (ca. 25°C) inkubiert und dabei mit Hilfe eines orbitalen MTP-Schüttlers bei ca. 300 rpm geschüttelt.
6. Die Vertiefungen werden 3x mit je 350 μl Waschpuffer gewaschen. 7. 100 μl der Substratlösung wird in jede Vertiefung pipettiert.
8. Die MTP wird 15 min bei Raumtemperatur (ca.25°C) inkubiert.
9. Die Farbentwicklung wird durch Hinzugabe von 100 μl Stoplösung gestoppt.
10. Die optische Dichte wird mit einem Photometer bei einer Wellenlänge von 450 nm gemessen. Intratestvarianz
Zwei Serumproben mit unterschiedlichen MLC I -Konzentrationen wurden mit einer Untersuchung (8fach-Bestimmung) gemessen. Die Varianz der 8 Ergebnisse je derselben Probe lag bei allen Konzentrationen unter 5,0%.
Figure imgf000006_0001
Intertestvarianz
Zwei Serumproben mit unterschiedlichen MLC I -Konzentrationen wurden mit 3 Untersuchung gemessen. Die Varianz der 3 Ergebnisse je derselben Probe lag bei allen Konzentrationen unter 6 %.
Figure imgf000006_0002
Wiederfindungsrate
MLC I wurde in verschiedenen Konzentrationen zu zwei Seren gegeben und untersucht.
Die Wiederfindungsrate des hinzugegebenen MLC I in den Serum Proben lag zwischen 86.8 % und 106,0 %.
Figure imgf000006_0003
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Linearität
Serumproben mit verschiedenen Konzentrationen wurden verdünnt und gemessen. Die Wiederfindungsrate der Proben lag zwischen 97.5 % und 117.2 %.
Figure imgf000007_0002
Ausführungsbeispiel 1
Es ^ wurden 22 Patienten mit szintigrafisch nachgewiesener Herzschädigung mit 21 Patienten verglichen, bei denen eine Herzschädigung mit Hilfe von Thallium-Szintigrafie sowie Belastungs-EKG ausgeschlossen wurde:
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Ausfuhrungsbeispiel 2
Methoden Patienten: Es wurde eine Gruppe von 80 Probanden getestet. Die Gruppe bestand aus drei Untergruppen. Die erste Gruppe bestand aus asymptomatischen Patienten mit einem hohen Risiko einer latenten Myokardischämie (Personen mit zahlreichen Risikofaktoren und einem Risiko nach der Framingham-Studie Algorithmus über 20 %/10 Jahre oder Algorithmus über 5 %/ 10 Jahre, n = 47). Die zweite Untergruppe bestand aus symptomatischen Personen mit einer stabilen Form von CAD (CCS I- CCS II, n = 21). Die dritte Gruppe setzte sich aus gesunden Freiwilligen (Mitarbeiter des Sternberk- Hospitals, n = 12) zusammen. Keine der Testpersonen zeigte Anzeichen von Herzinsuffizienz, akutem Koronarsyndrom, Nierenschädigungen oder entzündlichen Erkrankungen.
Echokardiografie und Belastungstests: Alle Probanden wurden echokardiografisch getestet (Berechnung der linksventrikulären Ejektionsfraktion - LVEF - nach Simpson), gefolgt von einer Untersuchung per Fahrrad- Ergometrie. Die Ergometrie wurde entsprechend der Empfehlung der Tschechischen Kardiologischen Gesellschaft (Chaloupka, 2000) durchgeführt. Die anfängliche Belastung betrug 50 W, minütlich um 25 W erhöht, bis der Proband eine maximale Belastung verspürt.
Innerhalb von 30 Tagen nach der Fahrrad-Ergometrie wurde bei allen Probanden eine • SPECT durchgeführt. SPECT: Belastungstests: Physische Belastung wurde erzielt durch ein Fahrrad-Ergometer. Nach Erreichen von 85% der maximalen aeroben Kapazität oder, wenn die Belastbarkeit durch Angina Pectoris, ischämische Veränderungen auf dem ECG, schwere Arrhythmie, niedrigen Blutdruck u. s. w. eingeschränkt war, wurden Radiopharmaka verabreicht Falls der Patient physisch nicht belastbar war, wurde pharmakolische Belastung mit Dipyridamol (0.56 mg/kg Körpergewicht während 4 Min) erzeugt.
Gated SPECT: Der Gated SPECT wurde 15 Minuten nach Verabreichung von 740 MBq 99tnTc-MIBI bei höchster Belastung erreicht. Bei heterogener Perfusion wurde die Ruheuntersuchung an einem anderen Tag durchgeführt (gated SPECT 1 Stunde nach Verabreichung von 99mTc-MIBI). 8-frame gating wurde benutzt, um Daten auf einer Doppeltdetektions-Szintillationskamera Siemens e.cam (Siemens Medical Solutions, Erlangen, Deutschland) ausgerüstet mit enem parallellen Kollimators vom LEHR Typus, Rotationswinkel 180°, insgesamt 64 Projektionen in einer 64 x 64 Matrix von der rechten anterioren schrägen Projektion von 45° bis zur linken posterioren schrägen Projektion von 45°, zu sammeln.
Bewertung der SPECT-Befunde: Tomografische Abschnitte myokardialer Perfusionen wurden visuell bewertet und in normale Befunde und Stress bedingte Perfusionsstörungen klassifiziert. Die quantitative Analyse der Perfusion wurde i Form einer Polar Map dargestellt. Additive Belastungspunkte (Summation stress score, SSS) der myokardialen Perrusion, nach der Belastung und im EF Ruhezustand wurden mittels eines automatischen quantitativen Programms 4D-MSPECT (University of Michigan, Arm Arbor, USA) erhalten. Die SPECT-Ergebnisse wurden zur Erstellung der CAD-Diagnose verwendet.
Koronare Angiographie Bei Personen mit typischen CAD-Befunden oder unklaren Befunden wurde eine frei zu wählende Koronarographie durch die Femoralis mit einer 6 oder 7F Instrumentation durchgeführt. Obliteration der koronaren Arterie und Stenose wurden durch einen Invasivkardiologen bewertet, der nicht über die anderen Risiken des Patienten informiert " war. Als angiographisch positiver Befund wurde betrachtet, wenn mindestens eine Stenose das Lumen einer konoraren Hauptarterie oder einer ihrer Verzweigungen um über 60 % verengte.
Laboruntersuchung und Blutentnahme: Die Untersuchung des biologischen Materials wurde an venösen Serumproben und EDTA- Blut durchgeführt. Es wurden alle Parameter außer MLC-1 innerhalb von 120 Minuten nach Entnahme bestimmt.
Bei allen Patienten wurden folgende Laboruntersuchungen des venösen Blutes durchgeführt: a) direkt vor der Ergometrie: CRP (Advia 1650, immunoturbidimetry), Hb, Htc (MaxM Coulter), Laktat (Advia 1650), MLC-1 (ELISA line Marc+Max), cTnl (Immulite Turbo, LEIA) b) bei maximaler Belastung: Hb, Htc, Laktat, MLC-1 c) 30 min nachdem der Belastungspegel den Höhepunkt erreicht hatte: MLC-1, Laktat d) 60 min nachdem der Belastungspegel den Höhepunkt erreicht hatte: MLC-1, Laktat
Bei allen Probanden wurden Veränderungen des Blutvolumens (Abschätzung des dynamischen Verhalten von Htc, Hb incl. der Berechnung der metabolischen MLC- 1 Veränderungen) (10).
Um die Dynamik von MLC-1 zu bewerten, wurde die gesamte Gruppe entsprechend den SPECT-Resultaten in Untergruppen aufgeteilt (Personen mit Anzeichen für Myokardischämie bei der SPECT-Untersuchung). Patienten mit positivem SPECT-Befύnd wurden mit Patienten mit positivem Ergometrie-Befund, unabhängig vom SPECT-Befund, verglichen. Die Einteilung in die o. g. Gruppen wurde, unter Berücksichtung des Vorhandenseins einer Myokardischämie unter Belastung, auch für das Einzeichnen der ROC-Kurve zur diagnostischen Validität von MLC-1 verwendet.
Laborbestimmung von MLC-1 - Die Entnahme für MLC-1 erfolgte aus peripherem venösem Blut, die Bestimmung erfolgte aus dem Serum. Nach der Entnahme wurde jede Probe 60 Minuten lang bei Zimmertemperatur aufbewahrt. Anschließend wurden die Proben zentrifugiert (10 min, 1100 g bei 4°C) und bei -80°C eingefroren.
MLC-1 wurde 3 Monate nach der Entnahme bestimmt, nachdem die Proben wieder auf Zimmertemperatur (25° C) erwärmt worden waren. Alle Proben wurden zweimal untersucht.
Die ventrikuläre Form von MLC-1 (vMLC-1) wurde mit der ELISA-Methode (Biovendor Ine) in Sandwich-Anordnung bestimmt. Es wurde eine Kombination zweier muriner monoklonaler Antiköφer zur Bestimmung benutzt. Basis-analytische Charakteristik der Methode: Variationskoeffizient in einer Reihe < 5%, Variationskoeffizient zwischen Reihen < 8% im Eichspektrum /Breite/, analytische Empfindlichkeit 0.3 mg/1, funktionale Empfindlichkeit 0.5 mg/1, Messbereich 0.3-40 mg/1. Analytische Spezifität: 10% Kreuzreaktivität gegen MLC-2 und 20% gegen MLC Skelettmuskulatur.
Statistische Datenverarbeitung
Die Daten wurden mit Hilfe der Medcalc Software bearbeitet. Zugehörige Inhalte wurden, wenn nicht anders angezeigt, durch Mittelwert ± Standartabweichung und Mediän ausgedrückt. Die MLC- 1 -Konzentration in den Untergruppen wurde per Varianzanalyse (ANOVA, Kruskal-Wallis entsprechend dem Verteilungstyp) und ROC-Analyse verglichen. Mit dem Spearmann Korrelationskoeffizienten wurden die Konzentration von MLC-1 sowie andere Werte gegenseitig ins Verhältnis gesetzt. Kategorie-Daten wurden mittels x2-Test verglichen. Als statistisch bedeutsam wurde ein Wert von p<0.05 betrachtet. Normalwerte wurden mit x2-Test bestimmt.
Ergebnisse
Tabelle 1 stellt den statistischen Verlauf der gesamten Gruppe dar. Sie zeigt eine abnorme Verteilung der meisten Parameter.
Tabelle 1:
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Normalwerte nach Chi-Quadrat-Test
Die Diagnosestellung einer Myokardischämie per SPECT unterschied sich nicht wesentlich zur Diagnosestellung einer CAD per Fahrradergometrie (Chi Quadrat, p~0.06).
Die MLC- 1 -Konzentrationen in den anfänglich bestimmten Untergruppen (A, B, C) ergab bei keiner Entnahme wesentliche Unterschiede.
Nach Aufteilung in 2 Untergruppen entsprechend SPECT auf das Vorhandensein einer Ischämie, unterschieden sich nur die MLC-1 Konzentrationen wesentlich bei allen 4 Entnahmen (median in mg 1; 2.5 vs 0 in Entnahme 1; 2.4 vs 0 in Entaahme 2; 2.3 vs 0 in Entnahme 3; 2.3 vs 0 in Entnahme 4). Da die Bewertungsrichtlinien für SPECT den SSS- Index umfassen, wird dort kein wesentlicher Unterschied festgestellt (Tabelle 2). Tabelle 2: Kruskal-Wallis Statistik, Unterschiede zwischen den unterteilten Untergruppen
Figure imgf000013_0001
„0": unterhalb der Meßgenauigkeit von 0,3 „NS": nicht signifikant, p>0,05
Bei der Bestimmung von bedeutenden Veränderungen der Parameter wurden, selbst bei
Berücksichtigung der Veränderung des Blutvolumens, keine erwähnenswerten
Unterschiede zwischen den einzelnen MLC- 1 -Konzentrationen unter Belastung festgestellt.
Tabelle 3 : Signifikante Korrelationen von MLC- 1 an der Grundlinie
Figure imgf000013_0002
Korrelations-Koeffizient nach Spearmann Eine Betrachtung der Korrelation zeigte eine signifikante Verbindung (Spearmann) zwischen MLC-1 vor der Ergometrie und dem SSS-Wert (0.33, p=0.025). Dies beweist die Signifikanz einer ischämischen Beteiligung bei SPECT sowie einer negativen Korrelation zwischen der Laktatkonzentration vor der Belastung und dem MLC-1-Wert (-0.25, p=0.049). Sehr enge Korrelationen wurden während Belastung zwischen MLC-1 festgestellt (0.92-0.97, p<0.0001). Weder unter normalen Bedingungen noch unter Belastung wurden zwischen MLC-1 und den anderen gemessenen Parametern weitere bedeutende Korrelationen beobachtet. Besonders interessant sind die festgestellten Serum- Kreatinin-Werte, LVEF, Belastungs-EF und Ruhe-EF, die entsprechend früherer Ergebnisse anderer Studien zu erwarten waren.
In Anbetracht der bedeutenden Veränderungen der MLC- 1 -Werte während wiederholter Entnahmen, wurde die Validität von MLC-1 zur Diagnose von Myokardischämie, festgestellt per SPECT, unter Normalbedingungen getestet. Abbildung 1 zeigt eine 91%ige Sensitivität und 98%ige Spezifität bei der Diagnose einer Myokardischämie für MLC-1 über seiner in Abbildung 2 dargestellten Bestimmbarkeitsgrenze (AUC 0.94; 95% CI 0.86-0.98; LR+36.3; PPV+ in der Gruppe mit einer Prävalenz von 44.4% 96.7% und NPV- 93%) auf. Diskussion
Myosin ist ein kontraktiles Protein, bestehend aus zwei schweren Ketten (MW 200 kD) und zwei Leichtketten. Leichtketten werden mit MLC-1 (MW 25 kD) und MLC-2 (MW 19 kD) bezeichnet. Im Organismus gibt es verschiedene Arten von MLC (z. B. MLC der Skelettmuskulatur - sMLC, MLC der Ventrikel - vMLC, Atrial-MLC - aMLC). Eine gestörte Integrität der Kardiomyocyten (z. B. Myokardnekrose) führt zu einer Freisetzung von vMLC-1 aus dem Myocardium in den Kreislauf. Schon 3 - 6 Stunden nach dem
' Ereignis steigt der MLC- Wert an und der Höchstwert wird am 1. bis 5. Tag nach Beginn der Nekrose erreicht (schwere Ketten erscheinen 2 - 10 Tage nach Einsetzen der Nekrose im Kreislaufund ihr Höchstwert wird nach 5 - 6 Tagen erreicht). Ein erhöhter MLC- Wert bleibt eine Woche lang im Kreislauf bestehen. Da MLC über die Nieren ausgeschieden wird, zeigen Probanden mit Nierenfunktionsstörungen höhere MLC-Werte und die Dynamik der Veränderungen sind nach einer Myokardnekrose beeinträchtigt. Wegen der hohen Sensivität und Spezifität (MLC-1 kommt im Herzen meist als vMLC-1 vor) wird MLC als Marker für Myokardnekrose angesehen. Leider wird von einer unbefriedigenden Qualität der Test-Kits berichtet.
Obwohl MLC-1 hauptsächlich im ventrikulären Myocardium vorkommt, ist es nicht myokard-spezifisch (es kommt auch im Skelettmuskel vor) (2, 4, 7). Ein erhöhter MLC- 1-Wert wurde auch in anderen Fällen myokardialer Beteiligung beschrieben, zusätzlich zur ischämischen Nekrose (Myokarditis). (1).
In mehreren in letzter Zeit erschienen Veröffentlichungen wurde beschrieben, dass ein erhöhter MLC- 1 -Wert die Diagnose bestätigt und dass die MLC- 1 -Konzentration sogar eine Abschätzung erlaubt, inwieweit eine Ausbreitung des nektrotischen Herdes kurz bzw. langfristig erfolgt. (Dies gilt sogar mit höherer Validität als bei der Troponin- Konzentration) (3, 6, 7).
In letzter Zeit wurde eine hohe diagnostische Validität von MLC-1 zur Diagnose minimaler myokardialer Ereignisse erwiesen (2, 3, 6). Der Nachteil der meisten Test-Kits ist ihre niedrige myokardiale Spezifität (3).
Mehrere Veröffentlichungen beschreiben einen erhöhten MLC- 1 -Wert bei stabilisierten Patienten mit kardialer Dysfunktion (NYHA UI); entsprechend der MLC- 1 -Konzentration konnte die Sterblichkeit dieser Patienten vorhergesagt werden (2, 4, 5, 7). Einer der
Gründe für einen erhöhten MLC- 1 -Wert im Blutkreislauf bei diesen Patienten könnte eine
Entartung der Myofibrillen mit anschließendem Freiwerden ihrer Bestandteile in den
Blutkreislauf sein, die oft mit einer kardialen Dysfunktion einhergeht. Diese strukturellen Veränderungen können die Dysfunktion der Ventrikel verstärken und den Füllungsdruck des Herzens erhöhen. (5). Ein anderer Grund könnte eine erhöhte MLC-1 Genexpression sein, die auf übermäßige Belastung der Kardiomyocyten zurückzuführen ist. Ein solches
Ereignis könnte einen erhöhten Proteinausstoß in die Herzmuskelzellen und in den
Blutkreislauf verursachen Es bleibt die Frage offen, ob solch eine Freisetzung in Zusammenhang mit geschädigten Strukturen der Kardiomyocyten steht, d. h., ob eine
Stukturschädigung Voraussetzung ist.
Eine erhöhte Sterblichkeit von Patienten mit erhöhten MLC- 1 -Werten könnte auf eine myozytären Streß, beeinträchtigte Integrität der myozytären Membran oder Strukturschädigungen der Kardiomyocaten hinweisen, die in Zusammenhang mit der Freisetzung von intrazellulären Proteinen in den Blutkreislauf stehen. Es ist auffallend, dass dieses Phänomen bei klinisch stabilisierten Patienten beobachtet wird (2). MLC-1 ist auch ein Substrat der Kaspase-3, die nach Auslösen der apoptotischen Kaskade aktiviert wird. Aktivierte Kaspase-3 spaltet vMLC-1, wodurch das biologische wirksame vMLC-1 zerstört, was zu einer reduzierten Kontraktilität des Myokardiums führt. Eine direkte Spaltung der vMLC-1 durch Kaspase-3 kann durch Veränderung der quervernetzenden Kontakte zwischen Actin- und Myosinmolekülen eine Einschränkung der myokardialen Funktion verursachen. So ist es möglich, dass die Aktivierung der Apoptose im Herz zu einer kontraktilen Dysfunktion bereits vor dem Zelltod führt. (4, 6).
Die Ergebnisse unterstützen die Hypothese, dass bei exzessiver Belastung der Kardiomyocyten MLC- 1 in den Blutkreislauf freigesetzt wird. Solch eine Belastung kann eine transitorische oder latente Myokardischämie sein. Es ist fast sicher, dass Apoptose (die Beziehung zu MLC-1 wurde oben beschrieben) eine wichtige Rolle bei der Pathogenese von CAD spielt. Es kann geschlossen werden, dass diese Ergebnisse einzigartig sind in Bezug auf eine hohe diagnostische Validität einer einzigen Messung von MLC-1 zur Diagnose einer latenten Myokardischämie. Das bedeutet, dass eine latente Ischämie mit einer über 90%igen Spezifität und Sensivität auf der Basis einer MLC- 1 -Untersuchung festgestellt werden kann. Dies kann unter technischen, ökonomischen und medizinischen Aspekten von entscheidender Bedeutung sein.
Das vorangehende Ausführungsbeispiel war zum Teil überlappend mit einer größer ' angelegten Studie (s. nachfolgendes Ausführungsbeispiel 2a), aus der in diesem Zusammenhang beispielhaft noch weitere vorteilhafte Merkmale der Erfindung ersichtlich werden. Ausfuhrungsbeispiel 2a)
Zusammenfassung der Studie:
Bewertet wurde eine Gruppe von 176 Hochrisikoprobanden, die nach dem Ergebnis einer Myokard-SPECT (Single-Photon-Emmissionscomputertomographie) in zwei Untergruppen eingeteilt wurden: Personen mit und Personen ohne Myokardischämie. Bei allen Probanden wurden ein Belastungstest und eine Myokard-SPECT (99mTc- MIBI) durchgeführt. Anschließend wurden die Probanden, die relevante SPECT- Ergebnisse gezeigt hatten, einer elektiven Koronarangiographie unterzogen. Bei allen Probanden wurden mehrmals die Labormarker im Venenblut untersucht: a) unmittelbar vor dem Belastungstest: C-reaktives Protein (CRP), Hämoglobin (Hb), Hämatokrit (Htk), Laktat, MLC-1; b) auf dem subjektiven Maximum: Hb, Htk, Laktat, MLC-1; c) 30 min nach Erreichen der Maximalbelastung: MLC-1 und d) 60 min nach der Maximalbelastung: MLC-1. Die ROC zur diagnostischen Wirksamkeit der MLC-1 wurde unter dem Gesichtspunkt des Auftretens einer Myokardischämie unter Belastung erstellt.
Ergebnisse: Die Patienten wurden je nachdem, ob ihr SPECT-Ergebnis positiv oder negativ war, in Untergruppen eingeteilt (positiv, n=37 / negativ, n=139). Die Untergruppen unterschieden sich hinsichtlich ihrer MLC- 1 -Konzentrationen in allen 4 Blutproben (Median in mg/1; 3,1 gegenüber 0,5 bei Blutprobe 1; 3,1 gegenüber 1,1 bei Blutprobe 2; 2,9 gegenüber 0,5 bei Blutprobe 3; 3,4 gegenüber 0,5 bei Blutprobe 4) sowie bezüglich ihrer Geschlechterverteilung (ein positives SPECT-Ergebnis trat häufiger bei Männern auf). Die MLC- 1 -Werte änderten sich weder während des Belastungstests noch 60 Minuten danach, d. h. unter Berücksichtigung der Blutvolumenänderungen während des Belastungstests waren keine Veränderungen zu verzeichnen. Es wurde eine signifikante positive Korrelation zwischen MLC-1 und SSS (0,27, p=0,01), SDS (c=0,26; p=0,02) sowie der Defektfläche des linken Ventrikels (c=0,27, p=0,01) festgestellt. Zwischen den MLC- 1 -Konzentrationen vor Belastung und der maximalen Herzfrequenz (c=-0,23; p=0,01) wurde eine negative Korrelation erkannt.
Eine erhöhte MLC-1 von über 2,2 mg/1 ergab 64 % Sensitivität und 88 % Spezifizität für das diagnostizierte Auftreten einer Myokardischämie (Fläche unter der Kurve (AUC) 0,81; 95 % Konfidenzintervall (CI) 0,72-0,88; positives Testergebnis (LR+) 5,9; positiver Prädiktorwert (PPV+) 68 % und negativer Prädiktorwert (NPV-) 87 %). Schlussfolgerung: Wie gezeigt wurde, besitzen nachweisbare MLC-1 einen hohen diagnostischen Aussagewert für die Diagnose einer latenten Myokardischämie. Es wird geschlussfolgert, dass sich mit Hilfe dieser Bestimmung die Zahl der Untersuchungen mit Belastungstests sowie SPECT senken lassen kann.
Studie im Detail:
Methoden
Untersuchungsgruppe Untersucht wurde eine Gruppe aus 176 Probanden, davon 84 Männer und 92 Frauen. Dabei handelte es sich um Personen mit einem hohen Risiko für das Bestehen einer latenten Myokardischämie (Individuen mit zahlreichen Risikofaktoren und einem Risiko von > 20 %/10 Jahre nach dem Framingham-Algorithmus bzw. > 5 %/10 Jahre nach dem Cardioscore- Algorithmus) oder um asymptomatische Patienten, deren Anamnese eine ischämische Herzkrankheit (ICHS) aufwies.
Keines der untersuchten Individuen zeigte Symptome eines Herzversagens oder akuten Koronarsyndroms (Anamnese, klinische Untersuchung, Herz- und Lungen-RTG, EKG, Konzentration des Herztroponins-I (cTn-I) und des N-terminalen Propeptids des natriuretischen Peptids vom Typ B (NT-proBNP), wurde wegen einer manifesten Nephropathie vorgestellt (als Ausscheidungskritermm galt ein Kreatininwert im Serum von > 150 μmol/1) oder wies Symptome einer signifikanten akuten Entzündung auf (beurteilt mittels klinischer Untersuchung, Anamnese, CRP-Wert und Leukozyten, wobei als Ausscheidungskriterien ein CRP-Wert im Serum von > 30 mg/1 und/oder eine Leukozytenzahl im Blut von > 109/1 festgelegt wurden). Alle Patienten unterzeichneten ein informiertes Einverständnis mit der ärztlichen
Untersuchung, das in der Klinik für Nuklearmedizin des Fakultätskrankenhauses (FN) Olomouc hinterlegt ist.
Belastungstest: Alle Probanden unterzogen sich einem Fahrradergometer-Belastungstest. Dieser wurde nach den Empfehlungen der Tschechischen Kardiologischen Gesellschaft durchgeführt. Die Eingangsbelastung betrug 1 Minute bei 50 W, anschließend wurde die Belastung jeweils nach einer Minute um 10 W erhöht, bis sich das subjektive Gefühl der Erschöpfung einstellte. Nach dem Belastungstest fand innerhalb von 30 Tagen eine Perfusionsszintigraphie des Myokards mittels Single-Photon-Emmissionscomputertomographie (SPECT) statt.
Myokard-SPECT: Belastungstests: Die physische Belastung wurde auf einem Fahrradergometer herbeigeführt, das Radiopharmakum wurde bei Überschreiten von 85 % der maximalen aeroben Kapazität appliziert oder wenn die Belastung durch eine ausgeprägtere Angina pectoris, ischämische Veränderungen im EKG, schwerwiegendere Arythmien, ein Absinken des Blutdrucks usw. begrenzt wurde. Bei dem angewendeten Ansatz wurde von den geltenden internationalen und tschechischen Empfehlungen ausgegangen [10, 11].
Gated SPECT: Die Gated-SPECT-Untersuchung (synchronisierte Aufnahme von EKG und SPECT) erfolgte 15 min nach der Applikation von 740 MBq 99mTc-MIBI auf dem Höhepunkt der Belastung, bei Befund einer Perfusionsheterogenität ergänzt durch eine Untersuchung in Ruhe am nächsten Tag (Gated SPECT 1 Smnde nach der Applikation von 99mTc-MIBI). Die Aufnahme der Daten per 8-Frame-Gating erfolgte mit der Doppelkopf-Szintilationskamera e.cam von Siemens (Siemens Medical Solutions, Erlangen, Deutschland), ausgestattet mit parallelen LEHR-Kollimatoren (Kollimatoren mit geringem Energiebedarf und hoher Auflösung), Rotationswinkel 180°, insgesamt 64 Projektionen mit einer Matrix von 64x64 von 45° Schrägprojektion vom rechts bis 45° Schrägprojektion hinten links.
Auswertung des SPECT-Befunds: Die tomographischen Schnitte der Myokardperfusion wurden optisch ausgewertet und entweder als Normalbefund oder eine durch Perfusionsdefekte bedingte Belastung klassifiziert. Die quantitative Analyse der -Perfusion erfolgte anhand von Polarmaps.
Von den Parametern wurde der summarische Stress-Score (SSS, Summed Stress Score) ausgewertet, der den Umfang des Perfusionsdefekts nach Belastung repräsentiert. Je höher der SSS-Wert ist, desto schlechter ist die Patientenprognose, und zwar unabhängig davon, ob der Defekt manifest (Narbe) oder reversibel (Ischämie) ist [15]. Werte von < 3 gelten als normal, Werte zwischen 4 und 8 zeugen von einem mäßigen Defekt, Werte zwischen 9 und 13 von einem mittelschweren Defekt und Werte von > 13 von einem schweren Defekt.
Des Weiteren wurde der summarische Differenzscore (SDS, Summed Difference Score) ausgewertet, welcher definiert ist als Differenz zwischen dem Belastungsscore und dem Ruhescore. Hierbei geht es um eine Art "Summe" der Ischämie; die Werte gelten bei einem SDS von > 2 als positiv. Eine weiterer Kennwert, die in die Bewertung einging, war der Prozentsatz der Defektfläche der linken Kammer (LK); Werte von < 10 % gelten als kleiner Defekt, Werte zwischen 10 und 20 % als mittlerer Defekt und Werte von > 20 % als großer Defekt (dies hängt selbstverständlich davon ab, ob ein oder mehr Einzugsgebiete der Gefäße betroffen sind). Ebenso wurde als Bewertungskennwerte das Bestehen einer transienten ischämischen Dilatation (TID, Transient Ischemic Dilatation) herangezogen, das bei Werten von > 1,17 als positiv gilt. Gleichzeitig wurde die Ejektionsfraktion der linken Kammer auf dem Höhepunkt der Belastung und nach Beruhigung (bei der Gated-SPECT- Untersuchung) ausgewertet. Sank die Ejektionsfraktion der linken Kammer nach der Belastung um mehr als 5 %, wurde der Befund als transiente Dilatation der linken Kammer nach Belastung gewertet, welche ein Symptom für eine Betäubung der linken Kammer nach Belastung darstellt [15-18, 20-23]. Ermittelt wurden die angegebenen Daten mit 4D-MSPECT, einer Software zur automatischen Quantifizierung (University of Michigan, Ann Arbor, USA) [16]. Die SPECT-Ergebnisse wurden als maßgebend für die ICHS-Diagnostik bewertet. [15, 16, 21, 22] Definition der latenten Myokardischämie Für den Bedarf der vorliegenden Arbeit wurde die latente Myokardischämie als Positivität der Myokard-SPECT zum Nachweis einer Ischämie (SSS > 3) bei negativem EKG-Befund und Abwesenheit von ICHS-Symptomen definiert [15]. Laboruntersuchung und Blutentnahmetechnik: Zur Untersuchung des biologischen Materials wurden Venenproben von nicht- gerinnendem Blut (zur Serumgewinnung) und Blut mit einer Lösung des Salzes der " Ethylendiamintetraessigsäure (EDTE) als Antikoagulans (zur Untersuchung des Blutbildes und Plasmagewinnung) verwendet. Sämtliche Parameter außer MLC-1 wurden innerhalb von 120 min ab der Blutentnahme ermittelt. Bei allen Probanden wurden folgende Laboruntersuchungen mit Venenblut durchgeführt: a) unmittelbar nach dem Belastungstest: C-reaktives Protein (CRP - Analysegerät Advia 1650, Immunoturbidimetrie, Hersteller des Systems Diasys), Hämoglobin (Hb, Analysegerät MaxM Coulter, Hersteller des Systems Beckman Coulter), Hämatokrit (Htk, Analysegerät MaxM Coulter, Hersteller des Systems Beckman Coulter), Laktat (Analysegerät Advia 1650, enzymatische Bestimmung, Hersteller des Systems Biovendor), MLC-1 (ELISA-Linie Marc+Max, ELISA, Hersteller des Systems Biovendor), cTnl (Immulite Turbo, LEIA, Hersteller des Systems DPC); für den Bedarf der Studie (Ausschlusskriterien) wurden zudem das Kreatinin (Analysegerät Advia 1650, enzymatische Bestimmung, Hersteller des Systems Biovendor) und die Leukozytenzahl (Analysegerät MaxM Coulter, Hersteller des Systems Beckman Coulter) ermittelt b) bei Erreichen des subjektiven Maximums: Hb, Htk, Laktat, MLC-1 c) 30 min nach Belastungsende: MLC-1 d) 60 min nach Belastungsende: MLC-1
Bei allen Probanden wurden die Blutvolumenänderungen berücksichtigt (Schätzung nach der Htk-, Hb-Dynamik mit Berechnung der metabolischen MLC- 1 -Änderungen) [12].
Laborbestimmung der MLC-1 Zur Bestimmung der MLC-1 wurde peripheres Venenblut entnommen, wobei das Serum verwendet wurde. Die Blutprobe wurde nach der Entnahme 60 min bei Zimmertemperatur aufbewahrt. Anschließend wurde sie zentrifugiert (10 min bei 1100 g und 4 °C) und bei einer Temperatur von -80 °C eingefroren. Die MLC- 1 -Bestimmung fand innerhalb von 3 Monaten ab der Entaahme des Materials, und zwar nach dessen Temperierung auf Zimmertemperatur (25 °C) statt. Alle Proben wurden zweimal untersucht. Es wurde die ventrikuläre Form der MLC-1 (vMLC-1) mittels ELISA-Technik (Biovendor GmbH) im Sandwichaufbau bestimmt. Zur Bestimmung wurde eine " Kombination aus monoklonalen Mäuse- und Hühnerantiköφern verwendet. Analytische Grundmerkmale der Methoden: Variationskoeffizient (CV) im Serum < 5 %, CV zwischen Seren < 8 % im Kalibrierspektrum, analytische Sensitivität 0,3 mg/1, funktioneile Sensitivität 0,5 mg/1, Messtoleranz 0,3-40 mg/1. Analytische Spezifizität: 10 % Kreuzreaktivität gegenüber MLC-2 und 20 % gegenüber den MLC der Skelettmuskulatur (Beipackzettel des Herstellers). Zur Bewertung der MLC- 1 -Konzentrationen wurde die gesamte Gruppe nach ihren SPECT-Ergebnissen in Untergruppen eingeteilt (Personen mit Symptomen einer Myokardischämie bei der SPECT gegenüber Personen ohne Ischämiesymptome). Die Gruppe der Patienten mit positivem SPECT-Befund (SSS > 3) wurde aus den gleichen Gründen noch einmal in Patienten mit einer manifesten und Patienten mit einer reversiblen Ischämieform unterteilt [15, 17].
Die Unterteilung in die genannten Untergruppen wurde auch bei der Erstellung der ROC-Kurve zur diagnostischen Wirksamkeit der MLC- 1 -Bestimmung unter dem Gesichtspunkt des Auftretens einer Myokardischämie bei Belastung herangezogen.
Statistische Datenverarbeitung
Die Daten wurden mit der Software Medcalc (Medcalc, Mariakerke, Belgien) verarbeitet.
Dabei wurden die MLC- 1 -Werte zwischen den beiden Untergruppen mit dem Verfahren der Streuanalyse (ANOVA, Kruskal-Wallis nach der Art der Verteilung) und mittels
ROC-Kurve verglichen.
Die MLC- 1 -Konzentration und weitere Größen wurden hinsichtlich der Datenverteilung mit dem Spearmann-Korrelationskoeffizient korreliert.
Die kategorialen Daten wurden per χ2-Test verglichen. Als statistisch signifikant galt ein Wert von p<0,05.
Die Normalität wurde ebenfalls mittels χ2-Test bewertet.
Die Unterschiede zwischen den MLC-I-Werten bei beiden Geschlechtem wurden mit einer Streuanalyse (Kruskal-Wallis hinsichtlich der Art der Verteilung) geprüft.
Die Relevanz der MLC- 1 -Änderungen im Testverlauf (MLCI 1-4) wurde mit einem paarigen nichtparametrischen Wilcoxon-Test (hinsichtlich der Art der Datenverteilung) geprüft.
Ergebnisse
In Tabelle 4 sind die grundlegenden statistischen Eigenschaften der gesamten Gruppe angegeben. Wie aus dieser Tabelle hervorgeht, weist die Mehrzahl der Parameter eine nicht normale Verteilung auf. Tabelle 4:- Grundlegende Merkmale der Untersuchungsgruppe, 176 Probanden
Figure imgf000023_0001
DF - Freiheitsgrad; χ2 - Chi-Quadrat; X - Durchschnitt; SD - Standardabweichung; Hb - Hämoglobin
Kennwerte X 1-4 - Probenahme vor, bei Maximalbelastung, nach 30 und 60 Minuten
Ruhe; Htk - Hämatokrit
DeltaPV - Änderung Plasmavolumen; SSS - summarischer Stress-Score; SDS - summarischer Diff.-Score; StressEF - Ejektionsfraktion linke Kammer bei Beiast.; RestEF - Ejektionsfraktion linke
Kammer nach Beruhig.
TID - transiente ischämische Dilatation; Defektfläche LK - Defektfläche linke Kammer in
%; ICHS - ischämische Herzkrankheit; MLC 1-2 erwartet - der auf Grund der festgestellten Plasmavolumenänderungen erwartete MLC- 1 -Wert bei Maximalbelastung
Die Auswertung zum Auftreten einer Myokardischämie nach der SPECT unterschied sich nicht wesentlich von der Auswertung zum Auftreten einer ICHS nach dem
Ergometer-Belastungstest (χ2=2,3; DF=1; p=0,13).
Bei der Aufteilung der Gruppe in zwei Untergruppen nach den bei der SPECT ermittelten Ergebnissen (Auftreten bzw. Nichtauftreten von Symptomen einer
Myokardischämie bei der SPECT) wurden 37 Patienten (27 %) als Personen mit
Myokardischämie eingeordnet; bei 139 Individuen (63 %) wurden in der SPECT keine typischen Symptome einer Myokardischämie festgestellt.
Beide Untergruppen unterschieden sich signifikant hinsichtlich der MLC-1- Konzentrationen in allen 4 Blutproben (Mediane in mg/1; 3,1 gegenüber 0,5 bei Blutprobe 1; 3,1 gegenüber 1,1 bei Blutprobe 2; 2,9 gegenüber 0,5 bei Blutprobe 3; 3,4 gegenüber 0,5 bei Blutprobe 4) sowie bezüglich ihrer Geschlechterverteilung (Männer wiesen häufiger eine positive SPECT auf; χ2=13,3; DF=1; p=0,0003).
Das Alter der Patienten in den beiden Untergruppen unterschied sich nicht signifikant.
Ebenso wenig unterschieden sich die beiden Gruppen hinsichtlich des Laktatwertes vor und nach Belastung, des CRP und der beim Belastungstest erreichten Leistung.
Die Patienten mit negativer SPECT erreichten statistisch signifikant höhere Werte bei der maximalen Pulsfrequenz und wiesen höhere Ejektionsfraktionswerte der linken
Herzkammer bei maximaler Belastung auf (Tabelle 5, Tabelle 6).
Tabelle 5: Unterschiede in den gemessenen Kennwerten nach dem Auftreten von S m tomen einer ischämischen Herzkrankheit (Myokardischämie) bei der SPECT
Figure imgf000024_0001
- Hämoglobin
Kennwert X 1-4 - Probenahme vor, bei Maximalbelastung, nach 30 und 60 Minuten Ruhe;
Htk - Hämatokrit
DeltaPV - Änderung Plasmavolumen; SSS - summarischer Stress-Score; SDS - summarischer Diff.-Score;
StressEF - Ejektionsfraktion linke Kammer bei Beiast.; RestEF - Ejektionsfraktion linke
Kammer nach Beruhig.
TID - transiente ischämische Dilatation; Defektfläche LK - Defektfläche linke Kammer in
%; ICHS - ischämische Herzkrankheit; MLC 1-2 erwartet - der auf Grund der festgestellten Plasmavolumenänderungen erwartete MLC- 1 -Wert bei Maximalbelastung
Legende zu Tabelle 5:
Ukazatel - Kennwert; MLC 1-2 ocekävanä - MLC 1-2 erwartet; Laktät - Laktat; Plocha defektu - Defektfläche; Vykon - Leistung; Vek - Alter; Pohlavi - Geschlecht; ICHS ANO - ICHS JA; ICHS NE - ICHS NEIN; Mediän - Median; Normalita - Normalität; Ne - nein; Ano - ja; ... muzύ a ... zen - ... Männer und ... Frauen
Tabelle 6: Unterschiede in den gemessenen Kennwerten nach dem Auftreten von Symptomen einer ischämischen Herzkrankheit (Myokardischämie) bei der SPECT
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* - statistisch signifikante Änderung; DF - Freiheitsgrad; FR - F-Verhältnis beim ANOVA-Test
Hinsichtlich der Kennwerte SSS, SDS, TID und betroffene Fläche der linken Kammer, die zu den Auswertungskriterien der SPECT gehören, wird an dieser Stelle kein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Untergruppen erwähnt. Tabelle 5, Tabelle 6 Die MLC-I-Werte der beiden Geschlechter unterschieden sich nicht wesentlich (p=0,81, ■ DF=1). Bei der Suche nach signifikanten Änderungen in der Dynamik der Parameter bei den definierten Blutentnahmen waren keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen MLC- 1 -Konzentrationen bei Belastung konstatierbar (MLC1-1/MLC1-2: p=0,68, Z=0,3; MLCl-2/MLCl-3: p=0,27, Z=-l,l; MLCl-3/MLCl-4: p=0,32, Z=- 0,99, MLC1-1/MLC1-4: p=0,32; Z=-0,99; MLCl-l/MLCl-3:p=0,14, Z=-l,5, MLC1- 2 MLC1-4: p=0,56, Z=-0,57). Bei der detaillierteren Einteilung der positiven SPECT-Befunde in solche mit einem manifesten und solche mit einem reversiblen Defekt wurde festgestellt, dass Patienten mit einem reversiblen Defekt bei der SPECT einen wesentlich höheren basalen MLC-1- Wert aufweisen; die MLC-1 von Personen mit einem manifesten Defekt dagegen unterscheiden sich nicht von Patienten mit Normalbefund bei der SPECT (Tabelle 7).
Tabelle 7: MLC-1-Werte vor Belastungsbeginn bei Patienten nach dem Auftreten eines manifesten oder reversiblen Defekts bei der SPECT
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X - Durchschnitt SD - Standardabweichung
Tabelle 8: Unterschiede in den MLC- 1 -Werten vor Belastungsbeginn nach dem Auftreten von Symptomen eines manifesten oder reversiblen Defekts bei der SPECT
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* - statistisch signifikante Änderung; DF - Freiheitsgrad
Bei der Suche nach Abhängigkeiten wurden signifikante positive Korrelationen (Spearman) zwischen der MLC-1 vor Beginn des Belastungstests und dem SSS-Wert (c= 0,27; p=0,01), dem SDS-Wert (c=0,26; p=0,02) sowie der betroffenen Fläche der linken Kammer (c=0,27; p=0,01) ermittelt; gleichzeitig wurde eine negative Abhängigkeit zwischen der MLC-1 und dem Wert der maximalen Pulsfrequenz (-0,23, p=0,01) gefunden. Zudem wurden sehr enge Abhängigkeiten zwischen der MLC-1 bei Belastung (c= 0,92- 0,97; p<0,0001) ermittelt. Unter basalen Bedingungen wurden auch bei Belastung keine weiteren signifikanten Abhängigkeiten zwischen der MLC-1 und anderen Messkennwerten festgestellt. In Anbetracht der unwesentlichen Differenzen zwischen den bei den wiederholten Blutentnahmen ermittelten MLC-1 wurde die diagnostische Wirksamkeit der MLC-1- Bestimmung unter basalen Bedingungen für die Diagnose einer per SPECT festgestellten Myokardischämie geprüft. Aus dem nachstehenden Diagramm gehen 64 % Sensitivität und 88 % Spezifizität der MLC- 1 -Bestimmung für die Diagnose einer bestehenden Myokardischämie bei einem MLC- 1 -Wert von > 2,2 mg/1 hervor.
Die Fläche unter der ROC-Kurve (AUC) betrug 0,81 bei 95 % Konfidenzintervall 0,72- 0,88. Das positive Testergebnis (LR+) lautete 5,9; der positive Prädiktorwert (PPV+) bei der untersuchten Gruppe (mit einer Prävalenz von 27 %) betrug 68 % und der negative Prädiktorwert (NPV-) 87 % (Abbildung 4, Abbildung 5).
Bedeutung
Die Diagnostik der Myokardischämie (ischämischen Herzkrankheit) stützt sich auf eine Kombination aus Ergebnissen einer Reihe von Untersuchungen. Einen goldenen Standard für diese Diagnostik gibt es derzeit nicht. Als eventuelles diagnostisches Verfahren der Wahl (vor allem für die Diagnostik der latenten Myokardischämie) kann die Untersuchung mittels Single-Photon- Emmissi onscomputertomographie (SPECT) angesehen werden [10, 11]. Jüngere Arbeiten bestätigen die steigende Zahl von SPECT zur Myokardperfiision und ihre Bedeutung sowohl in der Diagnostik der Myokardischämie als auch für die Risikostratifizierung und Planung einer eventuellen Therapie [15, 20]. Patienten mit einer normalen Myokardperfiision nach Belastung besitzen vom
Standpunkt kardiovaskulärer Komplikationen aus betrachtet durchaus eine positive Prognose und können je nachdem, ob bei ihnen eine transiente ischämische Dilatation festgestellt wird, weiter klassifiziert werden [14, 15]. Eine relativ gute Prognose haben auch Individuen mit einer gemäßigten Ischämie (sofern es sich um eine gemäßigte Abnormität der Perfusion handelt und keine
Symptome einer postischämischen Myokard-Betäubung auftreten), welche durch SSS- Werte von 4-8, einen Defekt von < 10 % der Fläche der linken Herzkammer, einen TLD- Wert von < 1,17 und keine Abnahme der Ejektionsfraktion der linken Kammer bei Maximalbelastung definiert ist; sind diese Bedingungen erfüllt, kann eine medikamentöse Therapie bevorzugt werden.
Bei SSS-Werten von > 9 hingegen müsste ein invasiver Eingriff präferiert werden, ebenso wie beispielsweise in dem Fall, dass bei einem SSS-Wert von 4-8 Symptome einer Myokard-Betäubung (TID > 1,17 oder Abnahme der Ejektionsfraktion der linken Kammer bei Maximalbelastung) vorliegen [13-23]. Obwohl die Zahl der Untersuchungen mittels Myokard-SPECT in der Vergangenheit gestiegen ist und sich die Inteφretation der Ergebnisse unter dem Gesichtspunkt der Myokardischämie (vor allem ihrer latenten Form) und des kardiovaskulären Risikos verbessert hat, handelt es sich hier doch um eine technisch und finanziell anspruchsvolle Untersuchung, die das Risiko für den Patienten zudem noch erhöht (Belastungstest). Deshalb wird weiterhin nach anderen nichtinvasiven Verfahren gesucht, die eventuell für die Diagnostik der Myokardischämie in Frage kommen. Eine dieser Möglichkeiten besteht in der Untersuchung bestimmter Proteine, deren Expression sich unter dem Einfluss der Herzbelastung ändert. In diesem Kontext wurde in der Literatur auch MLC-1 erwähnt.
Myosin ist ein kontraktiles Struktaφrotein (Heteropolymer), das aus zwei schweren Aminosäureketten (relatives Molekulargewicht etwa 200 kDa) und zwei Paaren leichter Aminosäureketten besteht. Die Paare leichter Aminosäureketten heißen MLC-1 (rel. Mol.-gew. 25 kDa) und MLC-2 (rel. Mol.-gew. 19 kDa). Die MLC-1 wird auch als essentielle Kette bezeichnet, und obwohl ihre vollständige
Funktion noch nicht bekannt ist, scheint sie zumindest die schweren Ketten des Myosins zu stabilisieren.
Im Organismus findet man verschiedene MLC-Typen (z. B. die MLC der Skelettmuskulatur - sMLC, die MLC der Herzkammern - vMLC, die MLC der Herzvorhöfe - aMLC usw.). Wird die Integrität der Kardiomyozyten gestört (z. B. beim Auftreten einer Myokardnekrose), kommt es zur Abgabe von vMLC-1 aus dem Myokard in den Kreislauf; der MLC- Anstieg lässt sich bereits 3-6 Stunden nach diesem Ereignis feststellen, wobei der Höchstwert zwischen dem 1. und 5. Tag nach dem Eintreten der Nekrose erreicht wird (die schweren Ketten wurden erst zwischen dem 2. und 10. Tag nach dem Eintreten der Nekrose gefunden, mit dem Maximum am 5.-6. Tag). Der MLC-Anstieg im Kreislauf hält etwa eine Woche an. Da die MLC von den Nieren ausgeschieden wird, ist bei Individuen mit gestörter Nierenfunktion ein höherer MLC-Wert zu finden und die Dynamik der Änderungen nach einer Myokardnekrose gestört. Der MLC-Gehalt im Kreislauf sinkt nicht nur dank des Nierenstoffwechsels, sondern auch auf Grund des Stoffwechsels in den Myofilamenten des Infarktherdes. Es handelt sich hier um einen Marker, der unter dem Aspekt der Myokardnekrose als relativ empfindlich und spezifisch gilt (MLC-1 tritt vorwiegend im Herzen auf, und zwar als vMLC-1). An dieser Stelle muss auch angeführt werden, dass MLC- 1 zwar vorwiegend im Kammermyokard auftritt, aber nicht myokardspezifisch ist (Vorkommen zum Beispiel in der Skelettmuskulatur).
Ein MLC- 1 -Anstieg wurde auch in anderen Fällen einer Myokardbelastung neben der ischämischen Nekrose (Myokarditis) beschrieben [1, 2, 4, 7].
Aus den in einigen jüngeren Arbeiten vorgestellten Informationen geht hervor, dass sich mit einem MLC-1-Anstieg nicht nur die Diagnose bestätigen, sondern je nach der MLC- 1 -Konzentration auch die Größe des Nekroseherdes sowie die kurz- und langfristige Prognose des Patienten abschätzen lässt (sogar mit einer höheren Validität als bei der Troponinkonzentration) [3, 6, 7].
In der Vergangenheit erschienen Informationen darüber, dass eine MLC- 1 -Bestimmung von hoher diagnostischer Wirksamkeit für die Einschätzung minimaler Myokardschädigungen allgemein sein könnte. Für einen Nachteil hält man jedoch bei einigen Arten diagnostischer Systeme deren geringe Sensitivität für das Myokard [2, 3, 6].
Ebenso gab es in den vergangenen Jahren Arbeiten, die einen MLC- 1 -Anstieg bei Patienten mit Herzdysfunktionen (NYHA III) beschrieben; bei diesen Kranken ließ sich anhand der MLC- 1 -Konzentration die Mortalität prognostizieren. Einer der möglichen Gründe für den MLC- 1 -Anstieg im Kreislauf dieser Patienten könnte eine Degeneration der Myofibrillen unter Abgabe ihrer Komponenten an den Kreislauf sein, die die
Herzdysfunktion häufig begleitet. Diese strukturellen Veränderungen können zudem die
Dysfunktion der Herzkammern mit einem Ansteigen des Fülldrucks noch beschleunigen
[2, 4, 5, 7].
Ein weiterer möglicher Grund könnte beispielsweise eine übermäßige Genexpression für MLC-1 sein, die einen übermäßigen Stress (z. B. durch Stimulation usw.) der Kardiomyozyten bewirken würde. Diese Erscheinung könnte zu einer übermäßigen Synthese des Proteins in den Myokardzellen mit dessen Übertritt in den Kreislauf (z. B. über eine leicht gestörte Zellmembran) führen. Dabei bleibt natürlich in gewissem Maße die Frage bestehen, ob dieser Übertritt mit einer Störung der Herzmyozytenstruktur verbunden ist (ob eine Störung der Struktur überhaupt eine Bedingung ist).
Es ist möglich, dass die bei Patienten mit einem MLC- 1 -Anstieg beobachtete höhere Mortalität eine Belastung der Myozyten, eine gestörte Integrität der Myozytenmembran oder eine gestörte Struktur der Kardiomyozyten wiederspiegeln könnte, die von einem Entweichen intrazellularer Proteine in den Kreislauf begleitet wird; relevant ist vor allem die Information, dass diese Erscheinung bei Patienten gefunden wird, die klinisch stabil sind [2].
Im Zusammenhang mit dieser Hypothese bieten sich Informationen an, die aus einigen jüngeren Arbeiten zur Beschreibung der Bedeutung der MLC-1 im Rahmen der Apoptose gewonnen wurden. Der programmierte Zelltod umfasst die Aktivierung der Prothease (Kaspase), die zu einer Spaltung der Vitalproteine des Cytoskeletts führt. Es wurde beschrieben, dass man bei versagenden Myozyten eine Aktivierung der Kaspase- 3 (einhergehend mit einer Verringerung der kontraktilen Leistung) vorfindet. Dabei spaltet die aktivierte Kaspase-3 vMLC-1, wodurch es zu einer Unterbrechung der biologisch wirksamen vMLC-1 kommt, was mit einer Verringerung der kontraktilen Leistung des Myokards verbunden ist. Es ist möglich, dass die direkte Spaltung der vMLC-1 durch die Kaspase-3 zu einer Verringerung der Myokardfunktion durch Veränderung der Kreuzbrücken zwischen den Aktin- und Myosin-Molekülen fuhren kann. Es ist also wahrscheinlich, dass eine Aktivierung des apoptotischen Weges vor dem Zelltod zu einer kontraktilen Dysfunktion fuhren kann [4, 6].
Im Zusammenhang mit den völlig unerwarteten Ergebnissen, die im erfindungsgemäßen Kontext erzielt wurden, kann man über einen möglichen Einfluss von "übermäßigem Stress" der Kardiomyozyten auf ein Ansteigen des MLC- 1 -Wertes (und eventuell auch der Expression) bei Patienten mit Myokardischämie (und ihrer latenten Form) diskutieren. Der Befund höherer MLC- 1 -Werte bei Patienten mit reversibler Myokardischämie bestätigt diese Hypothese.
Ebenso ist fast sicher, dass in der Pathogenese einer ICHS die Apoptose eine wichtige Rolle spielt, deren Bedeutung im Kontext der MLC-1 oben ausgeführt wurde. Vollkommen überraschend war die Feststellung hinsichtlich der hohen diagnostischen Wirksamkeit einer einmaligen MLC- 1 -Bestimmung für die Diagnostik einer latenten Myokardischämie. Die erfindungsgemäße Feststellung bedeutet, dass man in der Lage ist, bei Testpersonen mit hohem Risiko mit einer hohen diagnostischen Wirksamkeit das Bestehen einer Myokardischämie abzuschätzen. Als Schlussfolgerung kann gesagt werden, dass sich mit Hilfe einer einmaligen MLC-1- Bestimmung hinreichend effektiv das Bestehen einer latenten Myokardischämie diagnostizieren und so das Ausmaß ihres kardiovaskulären Risikos einschätzen lässt. Ausführungsbeispiel 3
MLC-1 prospektive Screening-Studie
Es wurden 1000 Männer im Alter von 55-75 Jahren in einer epidemiologischen Studie untersucht. Die Diagnose einer ischämischen Herzerkrankung oder einer Hypertonie wurde im nachhinein durch Auswertung eines Fragebogens festgestellt, der durch den jeweiligen Hausarzt des Probanden ausgefüllt wurde.
Ergebnis:
Probanden mit einer ischämischen Herzkrankheit (IHK) oder Hypertonie (HN) wiesen erhöhte MLC-1 Werte auf (3,8 pg/ml gegenüber 0 pg/ml). Die Werte gesunder Personen unterschieden sich von solchen mit IHK/HN mit einer Sensitivität von 67 % und Spezifität von 84 % (+PPV 93%; LR+ 4,1; AUC 0,77; Abbildungen 6 und 7).
Ausfuhrungsbeispiel 4
Bestimmung von Myosin Light Chain-1
Es wurden 252 Probanden untersucht, davon 240 asymptomatische Probanden mit hohem, Risiko einer ischämischen Herzkrankheit (Framingham oder Score Algorithmus) oder Probanden mit einer IHK in der Anamnese, und 12 gesunde Freiwillige. Keine von den untersuchten Personen wies Anzeichen eines akuten koronaren Syndroms oder eines Herzversagens (Anamnese, Rtg des Herzens und der Lunge, EKG, NT-proBNP und Troponin I-Spiegel) auf.
An den Probanden wurden ergometrische Untersuchungen mit EKG- Aufnahme (Belastungs-EKG) durchgeführt (50 W mit einer Steigerung von 10 W pro Minute bis zur Erschöpfung), wobei 15 Minuten nach Erreichen von 85% der aeroben Kapazität oder nach Auftreten von ischämischer Symptomatik (angina pectoris, EKG) 740 MBq 99Tc- MIBI intravenös verabreicht und eine SPECT Untersuchung durchgeführt wurde. 38 Probanden hatten ein Durchblutungsdefekt, festgestellt mit Hilfe von sowohl SPECT als auch Belastungs-EKG. Die SPECT- Analyse ergab, dass es sich in 14 Fällen um einen fixen und in 27 Fällen um einen vorübergehenden Durchblutungsdefekt handelte.
Ergebnis: Die basale MLC-1 Bestimmung kann zur Vorhersage einer latenten
Herzischämie verwendet werden, wobei negative prädiktive Werte von 88 % (fixe und vorrübergehende Durchblutungsdefekte) und 92 % (vorübergehende Durchblutungsdefekte) erreicht wurden (Tabelle 9, Abbildungen 8A, 8B, 9A und 9B) .
Die in der vorstehenden Beschreibung, den Ansprüchen und den Zeichnungen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenn Ausgestaltungen von Bedeutung sein.
Literatur
1) Kaji M, Kuno H, Turu T et al. Elevated serum myosin light Chain - 1 in influenza patiens. SXY. 2004; 27: 12 - 27.
2) Hansen MS, Stanton EB, Gawad Y et al. Relation of Circulationg Cardiav Myposin Light Chain- 1 Isoform instable Severe Congestive Heart Failure to Survival and
Treatment With Flosequinan. The Am Journal of Cardiology. 2002; 90: 969 - 973.
3) Hillis GS, Zhao N, Dalsey WC et al. Utility of cardiac troponin I, creatine kinase-MB mass, myosin light chain 1, and myoglobin in the early in-hospital triage of "high risk" patients with ehest pain. Heart. 1999; 82: 614 - 320. 4) Sawada H, Nagata I, Shoraki K. Serum Concentration of MLC-1 and left ventricular shortening fraction of neonates. Yonago Acta Medica. 1999; 42: 69-78.
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Legenden zu den Abbildungen:
Abbildung 1 :
Die ROC-Analyse ergab für Werte über "0" eine diagnostische Sensitivität von 91% bei einer Spezifität von 86%.
Abbildung 2:
Die Verteilung der MLC 1 Werte bei den Patienten mit nachgewiesener Herzschädigung verglichen mit den negativ befundenen Patienten. - ■
Abbildung 3:
Eine repräsentative Standardkurve, die mit Hilfe des MLC 1 erstellt wurde, ist in Abbildung 3 dargestellt.
Abbildung 4:
Kennlinie des Abnahmeplans (ROC-Kurve) für MLC-1 vor Belastungsbeginn unter dem
Gesichtspunkt des Auftretens einer Myokardischämie bei der SPECT. Abbildung 5: Grafischer Vergleich der MLC- 1 -Werte in Ruhe vor Belastungsbeginn (angegeben ist der Median bei 95 % Konfidenzintervall) bei Patienten nach dem Auftreten einer Moykardischämie bei der SPECT. Abbildung 6:
Die ROC-Analyse ergab für Werte über „0" eine diagnostische Sensitivität von 67% bei einer Spezifität von 84%. Abbildung 7:
Die Verteilung der MLC-1 Werte bei den Patienten mit diagnostizierter ischämischer Herzerkrankung oder Hypertonie verglichen mit negativ befundenen Patienten. Tabelle 9:
Der einzige Parameter, der unterschiedliche Werte bei negativ und positiv befundenen Probanden aufwies, war MLC-1. Abbildungen 8A und 8B:
Bei einem optimierten cut-off Wert für MLC-1 von 2,2 ng/1 wurde eine Spezifität von 88% und eine Sensitivität von 61% erreicht. Die Fläche unter der ROC-Kurve betrug 0,79 (95%, CI 0,7-0,87).
Abbildungen 9A und 9B:
" Bei Probanden mit einem vorübergehenden Durchblutungsdefekt und einem optimierten cut-off Wert für MLC-1 von 2,8 ng/ml wurde eine Sensitivität von 46% und eine Spezifität von 92% erreicht, wobei der negative prädiktive Wert für die Diagnose der vorübergehenden Myokard-Durchblutungsstörung 92% war. Der AUC Wert betrug 0,76 (95% CI 0,61-0,81).

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Nachweis einer ischämischen Herzschädigung, insbesondere der latenten oder chronischen Form, dadurch gekennzeichnet, dass im Blut des Erkrankten ein erhöhter Gehalt an Myosin-Leichtketten 1 (MLC-1) Molekülen mit üblichen immunologischen Methoden nachgewiesen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis der MLC-1 Moleküle mit Hilfe eines ELISAs erfolgt.
3. Testkit zur Bestimmung von MLC-1 im Serum für die Diagnose von ischämischen Herzschädigungen, insbesondere der latenten oder chronischen Formen, umfassend in separater Veφackung wenigstens: a) einen festen Träger mit daran gebundenen Antiköφern, die sensitiv und spezifisch MLC-1 binden; b) MLC-1 als Standard; c) einen Puffer zum Herstellen einer Standardreihe des MLC- 1 ; d) einen Puffer zum Verdünnen der zu untersuchenden Probe; e) einen Waschpuffer; f) ein detektierbar markiertes Konjugat, das an Cathepsin K bindet; g) und ein Substrat, das die Sichtbarmachung des detektierbar markierten Konjugats erlaubt.
4. Testkit nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den - - Antiköφern, die an den festen Träger gebunden sind, um monoklonale Antiköφer handelt.
5. Testkit nach Anspruch 3 - 4, dadurch gekennzeichnet, dass als feste Träger vorwiegend Mikrotiteφlatten eingesetzt werden.
6. Testkit nach Anspruch 3 - 5, dadurch gekennzeichnet, dass als detektierbar markiertes Konjugat ein konjugierter Antiköφer eingesetzt wird, der an MLC-1 bindet.
7. Testkit nach Anspruch 3 - 6, dadurch gekennzeichnet, dass als konjugierter Antiköφer ein monoklonaler Antiköφer eingesetzt wird.
8. Testkit nach Anspruch 3 - 7, dadurch gekennzeichnet, dass die als Konjugate eingesetzten Substanzen mit den üblichen Substanzen konjugiert werden, vorzugsweise mit: Meerrettichperoxidase, oder alkalischer Phosphatase.
PCT/IB2005/002385 2004-06-17 2005-06-17 Verfahren und testkit zur diagnose einer ischämischen herzschädigung, insbesondere der latenten chronischen formen, durch serologischen nachweis der myosin lechtkette-1 Ceased WO2005124362A2 (de)

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