WO2006016475A1

WO2006016475A1 - 超解像顕微鏡

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Publication number: WO2006016475A1
Application number: PCT/JP2005/013584
Authority: WO
Inventors: Yoshinori Iketaki; Masaaki Fujii; Takeshi Watanabe
Original assignee: Olympus Corp; Tokyo Institute of Technology NUC
Current assignee: Olympus Corp; Tokyo Institute of Technology NUC
Priority date: 2004-08-09
Filing date: 2005-07-25
Publication date: 2006-02-16
Anticipated expiration: 2007-02-09
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Description

明細書

超解像顕微鏡

技術分野

[0001] 本発明は、顕微鏡、特に染色した試料を機能性の高いレーザ光源力ゝらの複数の波長の光により照明して、高い空間分解能を得る高性能かつ高機能の超解像顕微鏡に関するものである。

背景技術

[0002] 光学顕微鏡の技術は古ぐ種々のタイプの顕微鏡が開発されてきた。また、近年では、レーザ技術および電子画像技術をはじめとする周辺技術の進歩により、さらに高機能の顕微鏡システムが開発されている。

[0003] このような背景の中、複数波長の光で試料を照明することにより発する二重共鳴吸収過程を用いて、得られる画像のコントラストの制御のみならずィ匕学分析も可能にした高機能な顕微鏡が提案されている (例えば、特許文献 1参照)。

[0004] この顕微鏡は、二重共鳴吸収を用いて特定の分子を選択して、特定の光学遷移に起因する吸収および蛍光を観測するものである。この原理について、図 12〜図 15を参照して説明する。図 12は、試料を構成する分子の価電子軌道の電子構造を示すもので、先ず、図 12に示す基底状態 (S状態)の分子力もつ価電子軌道の電子を波

0

長 λ 1の光により励起して、図 13に示す第 1電子励起状態 (S状態）とする。次に、別の波長 λ 2の光により同様に励起して、図 14に示す第 2電子励起状態 (S状態）とす

2 る。この励起状態により、分子は蛍光あるいは燐光を発光して、図 15に示すように基底状態に戻る。

[0005] 二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、図 13の吸収過程や図 15の蛍光や燐光の発光を用いて、吸収像や発光像を観察する。この顕微鏡法では、最初にレーザ光等により共鳴波長 λ 1の光で図 13のように試料を構成する分子を S状態に励起させるが、この際、単位体積内での S状態の分子数は、照射する光の強度が増加するに従って増加する。

[0006] ここで、線吸収係数は、分子一個当りの吸収断面積と単位体積当たりの分子数との積で与えられるので、図 14のような励起過程においては、続いて照射する共鳴波長 λ 2に対する線吸収係数は、最初に照射した波長 λ 1の光の強度に依存することになる。すなわち、波長 λ 2に対する線吸収係数は、波長 λ 1の光の強度で制御できることになる。このことは、波長 λ 1および波長 λ 2の 2波長の光で試料を照射し、波長 λ 2による透過像を撮影すれば、透過像のコントラストは波長 λ 1の光で完全に制御できることを示している。

[0007] また、図 14の励起状態での蛍光または燐光による脱励起過程が可能である場合には、その発光強度は S状態にある分子数に比例する。したがって、蛍光顕微鏡として利用する場合にも画像コントラストの制御が可能となる。

[0008] さらに、二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、上記の画像コントラストの制御のみならず、化学分析も可能にする。すなわち、図 12に示される最外殻価電子軌道は、各々の分子に固有なエネルギー準位を持つので、波長 λ 1は分子によって異なることになり、同時に波長え 2も分子固有のものとなる。

[0009] ここで、従来の単一波長で照明する場合でも、ある程度特定の分子の吸収像あるいは蛍光像を観察することが可能である力一般にはいくつかの分子における吸収帯の波長領域は重複するので、試料の化学組成の正確な同定までは不可能である

[0010] これに対し、二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、波長 λ 1および波長 λ 2 の 2波長により吸収ある!/ヽは発光する分子を限定するので、従来法よりも正確な試料の化学組成の同定が可能となる。また、価電子を励起する場合、分子軸に対して特定の電場ベクトルをもつ光のみが強く吸収されるので、波長 λ 1および波長 λ 2の偏光方向を決めて吸収または蛍光像を撮影すれば、同じ分子でも配向方向の同定まで可能となる。

[0011] また、最近では、二重共鳴吸収過程を用いて回折限界を超える高い空間分解能をもつ蛍光顕微鏡も提案されている (例えば、特許文献 2参照)。

[0012] 図 16は、分子における二重共鳴吸収過程の概念図で、基底状態 Sの分子が、波

0

長 λ 1の光で第 1電子励起状態である Sに励起され、さらに波長 λ 2の光で第 2電子励起状態である Sに励起されている様子を示している。なお、図 16はある種の分子の s力の蛍光が極めて弱いことを示している。

2

[0013] 図 16に示すような光学的性質を持つ分子の場合には、極めて興味深い現象が起きる。図 17は、図 16と同じく二重共鳴吸収過程の概念図で、横軸の X軸は空間的距離の広がりを表わし、波長 λ 2の光を照射した空間領域 Αと波長 λ 2の光が照射されない空間領域 Αとを示している。

0

[0014] 図 17において、空間領域 Aでは波長 λ 1の光の励起により S状態の分子が多数

0 1

生成され、その際に空間領域 Α力は波長え 3で発光する蛍光が見られる。しかし、

0

空間領域 Aでは、波長え 2の光を照射したため、 S状態の分子のほとんどが即座に高位の S状態に励起されて、 S状態の分子は存在しなくなる。このような現象は、幾

2 1

つかの分子により確認されている。これにより、空間領域 Aでは、波長え 3の蛍光は完全になくなり、しかも S状態力の蛍光はもともとないので、空間領域 Aでは完全

2 1 に蛍光自体が抑制され (蛍光抑制効果)、空間領域 Aからのみ蛍光が発することに

0

なる。

[0015] このことは、顕微鏡の応用分野から考察すると、極めて重要な意味を持って、る。

すなわち、従来の走査型レーザ顕微鏡等では、レーザ光を集光レンズによりマイクロビームに集光して観察試料上を走査するが、その際のマイクロビームのサイズは、集光レンズの開口数と波長とで決まる回折限界となり、原理的にそれ以上の空間分解能は期待できない。

[0016] ところ力図 17の場合には、波長 λ 1と波長 λ 2との 2種類の光を空間的に上手く重ね合わせて、波長え 2の光の照射により蛍光領域を抑制することで、例えば波長 λ 1の光の照射領域に着目すると、蛍光領域を集光レンズの開口数と波長とで決まる回折限界よりも狭くでき、実質的に空間分解能を向上させることが可能となる。以下、波長 λ 1の光をポンプ光、波長 λ 2の光をィレース光と呼ぶ。したがって、この原理を利用することで、回折限界を超える二重共鳴吸収過程を用いた超解像顕微鏡、例えば超解像蛍光顕微鏡を実現することが可能となる。

特許文献 1 :特開平 8— 184552号公報

特許文献 2：特開 2001— 100102号公報

発明の開示発明が解決しょうとする課題

[0017] ところで、超解像蛍光顕微鏡において、その性能を有効に発現させるためには、分子の光学物性を十分に考慮して、ポンプ光とィレース光との照射強度を十分注意して最適化する必要がある。特に、ィレース光のレーザ強度は、超解像性の発現に大きく影響を与える。さらに、本発明者らの実験検討によると、超解像顕微鏡で得られる 2次元点像分布関数すなわち蛍光スポットの強度プロファイルは、従来の光学顕微鏡のそれとは大きく異なることが判明した。

[0018] ここで、光学顕微鏡の光学性能を評価する最も基本的な物理量として、点像分布関数 (PSF)がある。これが判明すると、顕微鏡の分解能を決定する 2点分解能や画質を総合評価するのに不可欠な光学伝達関数 (OTF)を算出することができる。

[0019] 一般の顕微鏡システムでは、円形開口をもつレンズや絞り等を組み合わせた光学系が用いられており、このような光学系の PSFは、良く知られた円形開口の場合のフラウンホーファー回折像で与えられる。ここで、光源波長を（λ ρ)、光学系の開口数を (ΝΑ)とすると、光軸力の像面内の距離 (r)における強度すなわち点像分布関数（ H(r))は、下記の式（1)で与えられる。

[0020] [数 1]

[0021] ここで、（Jl(z))は 1次のベッセル関数であり、 (Cpo)は中心強度、 keは光源の波数を示す。大体の顕微鏡システムの場合、式（1)の PSFを基本とした結像理論が構築され、その性能評価が行われている。蛍光顕微鏡の場合にも、試料からの蛍光強度が励起光源の照射強度に比例するものとして、式（1)を用いた同様の評価がなされている。

[0022] しカゝながら、超解像顕微鏡の場合、試料に異なる 2波長の光を共鳴吸収させるため

、もはや光源の照射強度と蛍光強度との比例関係は成り立たない。

[0023] 仮に、ポンプ光の照射強度が一定であっても、ィレース光の照射強度を増力!]させると蛍光強度が非線形的に減衰することが報告されている。このような、試料の光応答特性は、当然、 PSFに強い影響を与える。事実、最近の文献 (Opt.Express 11(2003)

3271)によれば、超解像顕微鏡における PSFは、上記式（1)が与える強度分布とは大きく異なったローレンチアン型に近い形状を持っている。一般の光学システムでは

、このよう形が現れることは極めて稀である。

[0024] このような理由で、従来は、超解像顕微鏡システムを具現ィ匕するときのポンプ光およびィレース光の最適な条件が不明であったため、ポンプ光およびィレース光の光源選定が困難となっていた。

[0025] したがって、力かる事情に鑑みてなされた本発明の目的は、ポンプ光およびィレース光の光源選定を容易にでき、簡単かつ安価な構成で超解像性を確実に発現できる超解像顕微鏡を提供することにある。

課題を解決するための手段

[0026] 上記目的を達成する請求項 1に係る発明は、少なくとも基底状態を含む 3つの電子状態を有する分子を含む試料に対して、上記分子を基底状態から励起寿命てをもつ第 1電子励起状態に励起する第 1のコヒーレント光を出射する第 1の光源と、上記分子を上記第 1電子励起状態から、よりエネルギー準位の高い第 2電子励起状態に励起する第 2のコヒーレント光を出射する第 2の光源と、

上記第 1のコヒーレント光と上記第 2のコヒーレント光とを一部重ね合わせて上記試料に集光する光学系と、

上記光学系により集光される光と上記試料とを相対的に移動させて上記試料を走查する走査手段と、

上記光学系からの光照射により上記試料から発生する光応答信号を検出する検出手段とを有する超解像顕微鏡にぉヽて、

上記第 1のコヒーレント光の波長を λ ρ、上記第 2のコヒーレント光の波長を e、上記第 1のコヒーレント光の上記試料面における最大フォトンフラックスを Ip、上記第 2のコヒーレント光の上記試料面における最大フォトンフラックスを Ie、上記分子が基底状態から上記第 1電子励起状態に励起するときの吸収断面積を σ 、および蛍光抑制

01

断面積を σ とするとき、 σ ₀₁ I p τ < 1、 0. 65 ( λ e/ λ p) < t σ _{d i p} I e

を満足するように構成したことを特徴とするものである。

[0027] 請求項 2に係る発明は、請求項 1に記載の超解像顕微鏡において、さらに、

τ σ _{dl p} I e > 1

を満足するように構成したことを特徴とするものである。

発明の効果

[0028] 本発明によれば、上記の条件を満たすようにすることで、ポンプ光およびィレース光の光源選定を容易にでき、例えば取り扱ヽが難、短パルスレーザ光源を用いることなぐ信頼性の高い CWレーザを用いることができるなど、簡単かつ安価な構成で超解像性を確実に発現できる超解像顕微鏡を容易に実現することができる。

図面の簡単な説明

[0029] [図 1]本発明の一実施の形態に係る超解像顕微鏡のシステム構成を示す図である。

[図 2]図 1に示す位相板の構成を示す図である。

[図 3]ィレース光およびポンプ光のビーム形状と、試料面における蛍光領域および蛍光消失領域とを模式的に示す図である。

[図 4]ィレース光のビーム断面における位相分布を示す図である。

[図 5]ポンプ光およびィレース光の試料面上での強度分布を示すグラフである。

[図 6]2波長蛍光 Dip分光法の励起ダイヤグラムを示す図である。

[図 7]ローダミン 6Gを用いた場合の dip ratioとィレース光のフォトンフラックスとの関係を示すグラフである。

[図 8]ィレース光のピーク値のフォトンフラックスが 2. 1 X 10²⁵photonsZsecZcm²の場合の PSFを示すグラフである。

[図 9]直径 175 μ mの蛍光ビーズを用いて超解像顕微鏡法の蛍光スポット像を測定した場合の PSFを示すグラフである。

[図 10]ィレース光のフォトンフラックスのプロファイルを示すグラフである。

[図 11]同じぐその半値幅を示すグラフである。

[図 12]試料を構成する分子の価電子軌道の電子構造を示す概念図である。

[図 13]図 12の分子の第 1励起状態を示す概念図である。 [図 14]同じぐ第 2励起状態を示す概念図である。

[図 15]同じぐ第 2励起状態力基底状態に戻る状態を示す概念図である。

[図 16]分子における二重共鳴吸収過程を説明するための概念図である。

[図 17]同じぐ二重共鳴吸収過程を説明するための概念図である。

発明を実施するための最良の形態

[0030] 以下、本発明に係る超解像顕微鏡の一実施の形態について説明する。

[0031] 図 1は、本発明の一実施の形態に係る超解像顕微鏡のシステム構成を示す図である。この超解像顕微鏡は、通常のレーザ走査型蛍光顕微鏡を前提としたもので、主に 3つの独立したユニット、すなわち、光源ユニット 30、スキャンユニット 40および顕微鏡ユニット 50からなつて、る。

[0032] 光源ユニット 30は、第 1のコヒーレント光として例えば波長 532nmのポンプ光を出射する第 1の光源である LD励起型モードロック Nd:YAGレーザ 2と、第 2のコヒーレント光として例えば波長 647nmのィレース光を出射する第 2の光源である Krレーザ 1 と、ィレース光空間変調用の位相板 3と、ィレース光およびポンプ光を融合させるためのビームコンパイナ 4とを有している。位相板 3は、図 2に示すように、光軸対称の位置で通過したィレース光の位相が反転するように調整された光学薄膜が蒸着されている。図 2では、光軸の周りに独立した 4領域を有し、ィレース光波長に対して 4分 1 ずつ位相が異なっている。この位相板 3を通過した光を集光すれば、光軸上で電場が相殺され中空状のィレース光が生成される。

[0033] スキャンユニット 40は、光源ユニット 30から供給される同じ光学軸を共有するポンプ光とィレース光とを、ハーフミラー 5を通過させた後、走査手段である 2枚のガルバノミラー 6および 7により 2次元方向に揺動走査して、後述の顕微鏡ユニット 50に出射するようになっていると共に、顕微鏡ユニット 50で検出された蛍光を、往路と逆の経路を迪つてハーフミラー 5で分岐し、その分岐された蛍光を投影レンズ 12、ピンホール 13 、ノッチフィルタ 14および 15を経て検出手段である光電子増倍管 16で受光するようになっている。図 1では、図面を簡略ィ匕するため、ガルバノミラー 6, 7を同一平面内で揺動可能に示している。なお、ノッチフィルタ 14および 15は、蛍光に混入したボンプ光およびィレース光を除去するものである。また、ピンホール 13は、共焦点光学系を成す重要な光学素子で、観察試料内の特定の断層面で発光した蛍光のみを通過さ ·¾：るちのである。

[0034] 顕微鏡ユニット 50は、、わゆる通常の蛍光顕微鏡で、スキャンユニット 40から入射するポンプ光およびィレース光をハーフミラー 8で反射させて、対物レンズ 9により少なくとも基底状態を含む 3つの電子状態を有する分子を含む観察試料 10上に集光させると共に、観察試料 10で発光した蛍光を、再び対物レンズ 9でコリメートしてハーフミラー 8で反射させることにより、再び、スキャンユニット 40に戻すと同時に、ハーフミラ一 8を通過する蛍光の一部を接眼レンズ 11に導、て、蛍光像として目視観察できるようになっている。

[0035] ここで、位相板 3、ビームコンパイナ 4および対物レンズ 9は、ポンプ光とィレース光とを一部重ね合わせて観察試料 10に集光する光学系を構成している。

[0036] 本実施の形態では、図 1に示す超解像顕微鏡において、観察試料 10に含まれる分子を基底状態から励起寿命てをもつ第 1電子励起状態に励起するポンプ光の波長を λ ρ、上記分子を第 1電子励起状態から、よりエネルギー準位の高い第 2電子励起状態に励起するィレース光の波長を λ e、ポンプ光の観察試料面における最大フオトンフラックスを Ip、ィレース光の観察試料面における最大フオトンフラックスを Ie、上記分子が基底状態から第 1電子励起状態に励起するときの吸収断面積を σ 、およ

01 び蛍光抑制断面積を σ とするとき、

σ I p て < 1

および

0. 65 ( λ e/ λ. ρ) < て σ _{d i p} I e、

さらに好ましくは

て σ d i p I e ≥ 1

を満足するように構成する。

[0037] このように構成すれば、観察試料 10の集光点上においてィレース光の強度がゼロとなる光軸近傍以外の蛍光が抑制されて、結果的にポンプ光の広がりより狭い領域（ Δ <0. 61 · λ 1ΖΝΑ、 ΝΑは対物レンズ 9の開口数）に存在する蛍光ラベラー分子のみが観察されることになり、結果的に超解像性が発現することになる。したがって、ポンプ光およびィレース光をスキャンユニット 40で走査しながら蛍光信号を測定すれば、超解像の 2次元蛍光像を得ることができる。

[0038] 以下、上記のように構成する根拠、すなわち本発明による超解像顕微鏡の原理について説明する。

[0039] 超解像顕微鏡法における PSFは、試料面上におけるポンプ光の強度分布 (H(r))と、ィレース光の強度分布 (G(r))と、ポンプおよびィレース光の同時照射時における試料の蛍光抑制特性すなわち dip ratio (P(Ie))とによって決定される。ここで、 Ieはィレース光のフォトンフラックスであり、 dip ratioとは具体的にはィレース光無照射時と照射時との蛍光強度比を示す。ポンプ光単独照射時の蛍光強度は H(r)に比例するので、ィレース光同時照射時における蛍光強度プロファイル (F(r))は、蛍光抑制特性とポンプ光強度との積すなわち下記の式（2)で与えられる。

[0040] [数 2]

F {r ) = P [G (r )] ( r ) ( 2 )

[0041] 実際の超解像顕微鏡法では、図 3に示すように、ィレース光として光軸上で光強度が存在しない中空状のベッセル 1次ビームを用いる。ここで、顕微鏡の対物レンズが無収差光学系であれば、ポンプ光の形状 H(r)は式（1)で与えられる。これに対し、ィレース光で用いるベッセルビームは、図 4に示すように、ビームの断面（瞳面）〖こおいて、ビームの中心軸に対して周回するように 0から 2 πまで連続的に変化する位相分布を持っている。したがって、すべての動径方向について中心軸に対して πだけ位相が異なっているため、集光すると光軸上で電場強度が相殺され、その強度分布は、ビーム最大強度値 (C )を用いて、式（3)に示すように表される。

e0

[0042] [数 3] (k_eNAr) ( 3 )

ke =—— NAr

[0043] ここで、 λおよび kは、ィレース光の波長および波数である。また、 Jn(z)は、 n次の e e

ベッセル関数で、 n > 2

で r²以上の次数を持っため、 r= 0で G(0) = Oとなることが容易に判る。式（3)を、極大値を 1とし、 λ ΖΝΑを 1にとつてプロットすると、図 5に太線で示すようになり、 r= 0で強度が 0となるィレース光として理想的な中空状のプロファイルが得られる。なお、図 5には、比較のために、均一波面のポンプ光を集光したときのビームプロファイルを細線でプロットしてある。図 5から明らかなように、ィレース光として理想的な中空状のプ口ファイルが得られれば、中心部分の蛍光強度を損なうことなぐドーナツの周辺部において効率的に蛍光抑制でき、回折限界より小さい蛍光スポットが形成できる。

[0044] ィレース光のビーム形状とならんで、 dip ratioも超解像効果の発現の程度を決める重要な要素である。これは、分子構造に起因するところの分子固有の光応答特性である。図 6に、 2波長蛍光 Dip分光法の励起ダイヤグラムを示す。一般に、図 6に示すように、ポンプ光で基底状態 (S )の分子を状態 Sに励起すると、分子は S状態より

0 1 1 蛍光を発して s状態に緩和する。ここで、ィレース光を照射すると、ィレース光により

0

分子は高い量子状態 (S )に励起されて、 Sや Tm3重項状態への無輻射緩和が起 n 0

こる。もし、ィレース光の波長が蛍光波長帯域に重複していれば誘導放出過程も起こる。したがって、ィレース光照射時に、この蛍光量が減少し、その変化が窪み (Dip)として観測される。

[0045] 一般に、蛍光強度は、 S状態のポピュレーションに比例するので、 dip ratioはこのポピュレーションを求めることにより解析することができる。すなわち、ポピュレーションを観測時間 (T)で積分した量が観測された蛍光強度であるので、 dip ratio P(Ie)は式 (4)で与えられる。

[0046] [数 4]

[0047] ここで、 n (t,Ie)は S状態のポピュレーションであり、ィレース光のフォトンフラックスと観測時間との関数となる。さらに、 n (t,Ie)は、 S状態 (n (t,Ie) )および S状態 (n

1 0 0 n 2

(t,Ie) )のポピュレーションを加えた 3準位のレート方程式により決定される。

[0048] [数 5] ^_"0 ，）

-+び Λ₂₀

dt

dn_x(t,I_e) " ）

び -<

dt f_fI_e—び _l2 ^Λ21 , (5)

び, 21 - 20

dt

[0049] ここで、使用した分光パラメータを図 6に示す。このレート方程式は、線形の 1回の微分方程式であり、一般に下記のような形式の解をもつ。

[0050] [数 6] n_l(t,I_e) = D₂y^t ₊ D₂₂e^ ₊ D₂₃e^^t, (6)

n₂(t,I_e) = D₃y' + D₃₂e^r2' + D₃₃e '

[0051] ここで、 D應は初期条件力決まる係数であり、 γ は式（5)の 3 X 3係数行列の

1,2,3

固有値であり、具体的には下記の根をもつ。

[0052] [数 7] ρ土 β² _4ϋ

2 = (7)

,3=0

1

Q =—[び ₀₁·^ + +び 12 ) + _ + ^21 + ^k20

1 1

R = (0> + -) (k₂ ― ^<J0l^I _P ) + ^k2l (び。 ^+(Jf +-) + *20 (び ₁₂ + ^a p )

[0053] したがって、式（6)は、以下のように表される。

[0054] [数 8]

η,(ί,Ι_β) = 0₂₁€"¹ +D₂₁e^ +D₂₃, (8)

[0055] 式 (8)の指数部の成分は、ポンプ光およびィレース光照射開始直後の過渡的な遷移によるポピュレーションの変化を示し、それ以外の D は光照射が続き定常状態に n3

至った場合の各状態のポピュレーションを示す。ここで、根 γ

1,2は負の値持ち、下記の関係が成り立つ。 [0056] [数 9]

[0057] ここで、 I γ Iの逆数は過渡期が終了する時間に対応し、大体の分子では lnsec

1,2

以内で定常状態になる。したがって、多くの場合、ナノ秒のレーザ光源を用いた蛍光抑制過程の場合、式 (8)おける指数項を無視でき、以下のように表すことができる。

[0058] [数 10]

"。，） ^¾ ^ !3

，） - D₂₃ , (10 )

n₂(t,I_e) * D₃₃

[0059] したがって、 S状態のポピュレーションは、下記のような具体的な形で表すことができる。

[0060] [数 11] n,it = - ^σ°¹'^Ρ _{k +σ} j ^ , り

1 , 20 十び 01 >、 _r

- + σ_οιΙ_{ρ +}(σ_{/ +}σ_ι2 )/_e

τ^ft21 ^Λ20

[0061] この式（11)を式 (4)に代入すれば、超解像顕微鏡法で重要な dip ratioを算出することができる。

[0062] [数 12]

( ）

[0063] 蛍光抑制を効率的に誘起させるためには、式（12)の分子が分母に対してできるだけ小さい方が良ぐ S力 Sに励起させるのに要するフオトンフラックスが十分小さい

0 1

場合には、式（12)は、さらに簡単な下記の実用的な式（13)に近似できる。

[0064] [数 13]

[0065] ここで、式（13)の分母に注目すると、 k

20 Z(k +k )は分子が S状態より S状態を 21 20 n 1 迂回して基底状態に緩和する分岐比であることを考えると、 σ k / (k +k )は3

12 20 21 20 1 から s_nへの励起により無輻射過程で緩和する断面積と解釈できる。さらに、下記の式 (14)で定義されるような分光パラメータ（σ )すなわち「dip断面積」を定義する。この dip

量は、ィレース光照射時において蛍光過程以外で S状態から緩和する総断面積であり、すなわち蛍光寿命と並び、蛍光抑制の発現の程度を決定する大変重要な分光パラメータである。

[0066] [数 14]

^= σ₁₂ -^— (14)

[0067] 超解像顕微鏡の光源としては、汎用性の高い商業用のナノ秒パルスレーザを用いる。これらのレーザ光源は、 lOnsec前後のパルス幅をもっている。したがって、実用的には、式（14)の dip ratioの関係式を用いて顕微鏡システムを構築できる。顕微鏡の光学系が無収差であると仮定すれば、理論的に期待できる PSFは、式（1)、（2)、 (3)、（12)、（13)および（14)より、下記の式（15)から求められる。

[0068] [数 15]

(15) k NAr

2 ∞ _τ 1

¹ + 15.380) — _Α 2∑ ₊₁ ( _eNA ) +—― J₂ (k_e^Ar)

se

[0069] ここで、 ε および ε は、ポンプ光およびィレース光の光子エネルギーであり、ポン

P e

プ光およびィレース光の照射強度をそれぞれの光子エネルギーで割るとフォトンフラックスとなる。原理的には、ポンプ光とィレース光との照射条件および試料の分子が決まると、式（15)を用いて超解像顕微鏡法の PSFを決定できる。しかし、実用的には式（15)を近似して、さらに単純ィ匕できる。

[0070] 図 5から明らかなように、ベッセルビームは、空間変調されていない通常の集光ビームと比較すると、倍のサイズに広がっている。カロえて、実際の現場では、ィレース光の照射による蛍光発光を阻止するために、ポンプ光より長い波長帯域の光をィレース光として用いるので、その集光サイズはさらに大きくなる。したがって、ポンプ光とィレース光とを試料面に同軸で集光すると、ポンプ光の強度分布の大半はィレース光の穴の内側に存在することになる。そこで、式（3)を近似的に光軸近傍で rのべき乗に展開し、この穴の強度プロファイルを簡単な関数で近似すると、下記の式（16)が得られる。

[0071] [数 16]

C 1

G(JC) = 15.38 -^[-k„NAr k_eNAr Ϋ ₊0(r₅)]², (16)

ε。 6 385

[0072] 式（14)から明らかなように、第 1項と比較して r³以上の高次項は無視できる。事実、穴の内側のプロファイルは、図 5に示すように、 rに関する 2次関数でほぼ表現できる。この結果を用いれば、式（15)は下記の式（17)のように単純ィ匕することができる。

[0073] [数 17]

1 ^CPO

2J_x k_pNAr ) 2

(17 )

1 ^σ ώ_Ρ し ₆ k_pNAr

-(k_e-NAr)²

τ 2.34ε.

[0074] ここで、ローレンチアン関数 L(r)を式（18)で示すよう

[数 18] C_ P

て ^S P

(18 )

σ dip e 0

+ つ -( NA r)

T 2.34 ε _a とおくと、 F(r)はポンプ光の PSFを、下記の式（19)で表される半値幅（g)のローレンチアン関数 L(r)で変調したものに他ならな、。

[0075] [数 19]

[0076] 式（15)によれば、超解像顕微鏡法で得られる PSFの半値幅は、ィレース光の強度が増すにつれて、式（17)のようなローレンチアン関数に変化して行くことが分かる。よって、式（19)で示される蛍光スポットを小さくするための必要条件は、 σ C を大

dip e0 きくすればよいことが分かる。特に、実用性を鑑みると、ィレース光の強度はできるだけ小さいことが望ましいので、試料分子としては蛍光寿命ておよび dip断面積ができるだけ大きいものを選定することが有利であることが分かる。

[0077] ここで、式（12)に立ち戻って考察すると、蛍光抑制を効率的に誘起させるためには、式（12)において、分子が分母に対してできるだけ小さい方が有利である。一般に、蛍光寿命ては試料分子固有なものであるので、式（12)において、分子は必然的に

を満たす必要がある。すなわち、整理すると、下記の式（20)を満たす必要がある。

[0078] [数 20]

( 2 0 )

[0079] また、式（17)を考察すると、超解像顕微鏡法により分解能の向上が確認できるのは、式（18)で示される変調関数であるローレンチアン関数の半値幅 gが、式（1)で与えられるポンプ光の集光ビームサイズの半値幅よりも小さくなることが不可欠である。ここで、ポンプ光の集光ビームサイズの半値幅（Γ)は、一般にレイリーの規範式により、下記の式（21)で与えられる。

[0080] [数 21]

Γ = 0 .61 ( 21 )

NA

[0081] したがって、 gが Γより小さくなる条件は、式（21)および（19)から、下記の式（22) のようになる。

[0082] [数 22]

[0083] 具体的には、下記の式（23)を満たすことが条件となる。

[0084] [数 23]

0. 65 ( λ e/ X p) < τ σ _{d i p} I e ( 23 )

[0085] さらに、式（13)の分母は、分子に対してできるだけ大きいことが望ましいことから、ィレース光のフォントンフラックスに関しては、 τが試料分子固有であることを考えると di P断面積を用いて下記の式（24)を満たすようにするのが望ま、。

[0086] [数 24] 丄≤(び_{/ +}び〗₂ ^^) (24)

て +

[0087] この式（23)を整理すると、下記の式（25)が得られる。

[0088] [数 25]

τ σ _{d i p} I e > 1 ( 25 )

[0089] 以上の考察から、図 1に示す超解像顕微鏡を、式 (20)および (23)、さらに好ましくは式 (25)を満足するように構成することで、その性能を向上させることができる。

[0090] 次に、図 1に示す構成の超解像顕微鏡において、ポンプ光の波長を 532nm、ィレース光の波長を 599nmとして、ローダミン 6G分子を用いた実験結果にっ、て考察する。先ず、最初に、式（13)を用いて、メタノール溶液中のローダミン 6Gの dip ratio の測定に関する実験データの解析を行なった。

[0091] 図 7は、メタノール溶液中の蛍光寿命 τが 3. 75nsecのローダミン 6Gを用いた場合の dip断面積（ σ )をパラメータとする dip ratioとィレース光のフォトンフラックスとの関係を示すものである。図 7によれば、 σ を 0. 7 X 10—¹⁶cm²前後に選ぶと、実験結果

dip

をほぼ再現できることが分かる。ローダミン 6Gに関しては、波長 599nmの領域では S 力 Sへの吸収断面と誘導放出断面とが重複するので、正確な σ は不明である

I n dip

力 S力 Sへの吸収断面積および誘導放出断面積が 10—¹⁶cm²オーダーであることが報告されおり、本解析結果は妥当なものであると判断できる。

[0092] 次に、本発明者らは、 σ を 0. 7 X 10— 16cm²、 τを 3. 75nsecと仮定して、式（15) およびその近似系である式（17)により超顕微鏡法における PSFを求めた。図 8は、ィレース光のピーク値のフオトンフラックスが². 1 X 10²⁵photons/sec/cm²すなわち電場強度にして 7MWZcm²の場合の PSFを示す。実線の細線および太線は、それぞれ式（15)および（17)の PSFであり、近似式ではサイドローブの部分で僅かな解離が見られるが、プロファイルの一致は良い。図 8によれば、フオトンフラックスが 10²⁵ photons/sec/cm²のオーダーで顕著な超解像性が発現し、本計算の場合には蛍光プロファイルの半値幅は、ポンプ光の回折限界の 1Z3サイズである 200nmに収縮する。

[0093] 以上の条件を考察してみると、ポンプ光のフォトンフラックス Ipを 10²³photonsZcm² Zsecとすると、これは十分に蛍光発生できる光量である。例えば、 E. Sahara and D. Treves, IEEE. J. Quantum Electron. 13, 962 (1977)のデータ、 σ =4 X 10— ¹⁶cmお

01

よび τ = 3. 75nsecを用いれば、 Ιρ σ τ = 0. 15となり、式（20)を満たしている。ま

01

た、 Ie = 10²⁵photons/cm²/sec、 σ = 0. 6 X 10— ¹⁶cm²とすれば、 Ie σ τ = 2. 6

dipl dip

となり、式（23)および（25)を同時に満たし、請求項の条件を具体的に満たしていることが確認できる。

[0094] 図 9は、直径 175 μ mの蛍光ビーズを用いて同じ条件で超解像顕微鏡法の蛍光スポット像を測定した場合の PSFを示すものである。図 9において、太線で示す測定したプロファイルも、理論解析で予想されたようにサイドローブが広がったローレンチアン型をしている。なお、図 9において、細線は、図 8で得られた理論式による PSFをビーズサイズでコンボリューシヨンした結果を示す。この理論的計算は、実験結果をほぼ再現している。この結果、近似式（17)は、 PSFを表現する合理的な関数であると同時に、物理的なモデルがきわめて明快な、実用的な式であることが分かる。

[0095] さらに、ローダミン 6Gを用いた場合の PSFの結像特性を考察するため、式（17)を用いて、ィレース光のフォトンフラックスに関する依存性を計算した。図 10および図 1 1は、計算したプロファイルおよびその半値幅を示す。図 10および図 11から明らかなように、集光したィレース光の先頭値のフォトンフラックスが 5 X 10²⁵photons/secとなると、回折限界サイズの 1Z4まで収縮することが分かる。例えば、開口数 1. 4の油浸対物レンズを用いた場合、その半値幅は 70nmとなり、従来の光学顕微鏡では不可能あった lOOnmを上回る空間分解能が期待できる。その時の、ィレース光のエネルギ一時間平均強度を計算すると、ほぼ 20mW程度となる。このことは、低出力のレーザ光源で対応できることを意味しており、取り扱いが難しい短パルスレーザ光源を用いることなぐ信頼性の高い CWレーザをベースに、複雑な構成をとらない顕微鏡システムが構成できる可能性を示して、る。このような簡単なレーザを用いてシステムを構成できることは、システムの価格の低減、また本技術特有のレーザ波面の管理といつた実用化に伴う発明の効果が期待できる。

産業上の利用可能性

この超解像顕微鏡は、光学系の回折限界を超える空間分解能で試料を観察するのに用いることができる。

Claims

請求の範囲

[1] 少なくとも基底状態を含む 3つの電子状態を有する分子を含む試料に対して、上記分子を基底状態から励起寿命てをもつ第 1電子励起状態に励起する第 1のコヒーレント光を出射する第 1の光源と、

上記分子を上記第 1電子励起状態から、よりエネルギー準位の高い第 2電子励起状態に励起する第 2のコヒーレント光を出射する第 2の光源と、

01

断面積を σ とするとき、

αιρ

σ 01 I ρ τ≤ 1 、

0. 65 ( λ e λ p) < て σ _{d i p} I e

を満足するように構成したことを特徴とする超解像顕微鏡。

[2] 請求項 1に記載の超解像顕微鏡において、

さらに、

τ σ _{d i p} I e > 1

を満足するように構成したことを特徴とする超解像顕微鏡。要約書

[課題]ポンプ光およびィレース光の光源選定を容易にでき、簡単かつ安価な構成で超解像性を確実に発現できる超解像顕微鏡を提供する。

[解決手段]第 1の光源 2からの第 1のコヒーレント光と第 2の光源 1からの第 1のコヒーレント光とを、光学系 3 4, 9により一部重ね合わせて試料 10に集光して走査手段 6, 7により走査し、試料 10からの光応答信号を検出手段 16で検出する超解像顕微鏡において、第 1のコヒーレント光の波長を l p、第 2のコヒーレント光の波長を； e、第 1のコヒーレント光の試料面における最大フオトンフラックスを Ip、第 2のコヒーレント光の試料面における最大フオトンフラックスを l_e、分子が基底状態力ゝら第 1電子励起状態に励起するときの吸収断面積を σ 、および蛍光抑制断

01

面積を σ とするとき、

dip

σ I P 1

および

を満足するように構成する。